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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Química
CECÍLIA BUZATTO WESTIN
ADESÃO, CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS DENTÁRIAS EM SUPORTES POROSOS DE QUITOSANA-
XANTANA E PCL PROJETADOS PARA O TRATAMENTO DA OSTEOARTRITE
CAMPINAS - SP
2016
CECÍLIA BUZATTO WESTIN
ADESÃO, CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS DENTÁRIAS EM SUPORTES POROSOS DE QUITOSANA-
XANTANA E PCL PROJETADOS PARA O TRATAMENTO DA OSTEOARTRITE
Dissertação apresentada à Faculdade de
Engenharia Química da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do
título de Mestra em Engenharia
Química.
Orientadora: Ângela Maria Moraes
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA CECÍLIA BUZATTO WESTIN, E ORIENTADA
PELA PROFA. DRA. ÂNGELA MARIA MORAES
CAMPINAS - SP
2016
Dissertação de Mestrado defendida por Cecília Buzatto Westin e aprovada em 25 de fevereiro
de 2016 pela banca examidora constituída pelos doutores:
__________________________________
Profa. Dra. Ângela Maria Moraes
__________________________________
Profa. Dra. Everson Alves Miranda
__________________________________
Profa. Dra. João Ernesto de Carvalho
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica da aluna.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por me abençoar e proteger nas difíceis decisões tomadas durante esta
fase.
À minha família, especialmente aos meus pais, Fred e Márcia, por sempre acreditarem no meu
potencial e apoiarem minhas decisões.
Aos meus queridos irmãos, Daniel e Diego, pelas orientações de vida que indiretamente me
concedem.
Ao Caio Henrique Bos Loureiro, pelo apoio, compreensão e amor demonstrados.
À professora Dra. Ângela Maria Moraes, pela oportunidade concedida, pelos esclarecimentos
e orientação dedicada.
Aos meus prezados amigos de laboratório, Re, Fer, Lucas, Sérgio, Gisele, Rodrigo, Cris e
especialmente as minhas irmãzinhas Luizinha e Oxy pela amizade, auxílio e pelos momentos
alegres proporcionados.
Ao Rafael Trinca pela produção dos suportes de PCL.
Às amigas maravilhosas da república, que sempre me proporcionaram momentos de
felicidade e a todos os amigos que fizeram parte desta etapa da minha vida.
Ao LABMOCA, especialmente ao Dr. Ibsen, pelos ensinamentos e pela participação na banca
de qualificação, e as minhas queridas companheiras Carol e Ingrid, que me auxiliaram nas
diferentes técnicas desenvolvidas e me proporcionaram momentos de doçura.
Ao professor Dr. Everson Alves Miranda, também membro da banca de qualificação do
Mestrado.
À R-crio®, especialmente ao Rafael Maza, prezado amigo desde a Nanocore, pela cessão das
células-tronco dentárias.
À Acecil Central de Esterilização Comércio e Indústria Ltda pela esterilização dos suportes
utilizando-se o óxido de etileno.
À equipe do LRAC, principalmente ao Adilson Brandão, Lucélia Silva e Celso Camargo,
pelos ensaios realizados e esclarecimentos prestados.
Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica do IB, pelo auxílio na realização das microscopias
eletrônicas de varredura das amostras com células aderidas.
A todos os funcionários da Faculdade de Engenharia Química que, direta ou indiretamente,
colaboraram para a realização deste trabalho.
À CAPES e FAPESP, pelo apoio financeiro.
RESUMO
Neste trabalho visou-se desenvolver e avaliar o uso de suportes porosos produzidos
com xantana, quitosana e Poloxamer P188, perfurados (QXp) ou não (QX), e de
poli(caprolactona) (PCL) eletrofiada contendo ou não dexametasona (DEX) para adesão,
crescimento e diferenciação de células-tronco mesenquimais (CTM) dentárias, ainda pouco
exploradas com tal finalidade, em combinação com o fator de diferenciação kartogenina.
Foram analisados o aspecto, morfologia da superfície, absorção e perda de massa em
diferentes soluções aquosas, espessura, eficiência de incorporação e cinética de liberação da
dexametasona, comportamento térmico, cristalinidade e citotoxicidade indireta dos suportes.
O comportamento das CTM foi avaliado por determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento, microscopia eletrônica de varredura e análise histológica da diferenciação
celular. Os suportes QXp apresentaram interconectividade aumentada entre os poros. A matriz
de PCL exibiu aspecto macroscópico homogêneo e flexível, com distribuição aleatória de
fibras, e a presença de DEX não resultou em diferença macroscópica na morfologia dos
suportes. Maior absorção foi verificada para QXp, em água. Para os suportes de PCL, devido à
limitada absorção, notou-se menor perda de massa. As espessuras médias variaram de 887 a
969 µm para suportes QXp e de 286 a 395 µm para os de PCL. A impregnação de DEX nos
suportes QXp não foi efetiva. Porém, nos suportes de PCL, o fármaco foi adequadamente
incorporado por adição direta, notando-se liberação máxima em 72 h em concentração
apropriada para a diferenciação celular em condrócitos. A adição de DEX não alterou a
estabilidade do suporte de PCL de acordo com dados de análise termogravimétrica. A análise
de difração de raios X demonstrou estrutura amorfa para os suportes QXp e cristalina para os
de PCL. A velocidade específica máxima de crescimento das CTM dentárias foi de 0,036 h-1
,
e o tempo de duplicação, de 23,1 h. Baixa citotoxicidade foi verificada para todas as matrizes,
sendo as de PCL menos citotóxicas que as de QXp. A menor concentração de kartogenina
utilizada (100 nmol/L) foi a mais adequada para a indução da diferenciação celular, por
implicar em menor relação custo/benefício. Observou-se adesão, proliferação e diferenciação
apropriadas das células em condrócitos tanto nos suportes de QXp quanto nos de PCL com
dexametasona, concluindo-se que ambos são aplicáveis na área de Engenharia de Tecidos
cartilaginosos.
Palavras-chave: engenharia de tecidos; células-tronco mesenquimais dentárias; kartogenina;
dexametasona; quitosana; xantana; poli(caprolactona); osteoartrite; cartilagem
ABSTRACT
This study aimed the development and performance evaluation of porous scaffolds produced
with chitosan, xanthan gum (CX) and Poloxamer P188, perforated (CXp) or not (CX), and
with electrospun poly(caprolactone) (PCL) incorporating or not dexamethasone (DEX), for
adhesion, growth and differentiation of dental mesenchymal stem cells (MSC), yet unexplored
for such purpose, in association with kartogenin as a differentiation factor. Characterizations
regarding aspect, surface morphology, absorption and weight loss in different aqueous
solutions, thickness, dexamethasone incorporation efficiency and release kinetics,
thermogravimetric behavior, crystallinity, and indirect cytotoxicity were performed. The
behavior of MSC was evaluated by determining their growth kinetic parameters, scanning
electron microscopy and cell differentiation by histological analysis. The CXp scaffolds
showed improved pore interconnectivity. The PCL scaffolds showed to be homogeneous and
flexible, with randomic fiber distribution, and the presence of DEX did not result in
macroscopic differences in the morphology of the scaffolds. The highest absorption was
detected in water for CXp. Due to the limited liquid absorption, the PCL scaffolds showed low
mass loss. The mean thickness values ranged from 887 to 969 µm for CXp scaffolds and from
286 to 395 µm for PCL scaffolds. DEX impregnation in CXp scaffolds was not effective, but
in the PCL ones, it was successfully incorporated by direct addition, showing maximal release
in 72 h at a concentration suitable for cell differentiation in chondrocytes. The addition of
dexamethasone did not alter the stability and decomposition of the PCL scaffold according to
thermogravimetric analysis. The X-ray diffraction analysis showed amorphous structure for
CXp scaffolds and crystalline structure for those constituted of PCL. The maximum specific
growth rate of dental MSC was 0.03 h-1
, and cell doubling time was 23.1 h. Low cytotoxicity
was detected for all matrices, but those produced with PCL showed lower values the CXp
formulation. The lowest kartogenin concentration (100 nmol/L) was the most appropriate to
induce cell differentiation due to its lower cost/benefit ratio. Adequate adhesion, proliferation
and differentiation of the MSC cells into chondrocytes were observed both in the CXp matrix
and in the PCL scaffolds. Therefore, it was concluded that both types of matrices are suitable
as scaffolds for the application in cartilage Tissue Engineering.
Keywords: tissue engineering; dental mesenchymal stem cells; kartogenin; dexamethasone;
chitosan; xanthan; poly(caprolactone); osteoarthritis; cartilage.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
a0: raio inicial para esferas e cilindros ou metade da espessura para sistemas planos na
liberação de fármacos
Ab: capacidade máxima de absorção
ADAMTS: disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs
BMP: proteína morfogenética óssea
C: chitosan
C0: concentração inicial do fármaco na matriz
CBFβ: fator de transcrição da subunidade β do fator núcleo-ligante
CHO: ovário de hamster chinês (chinese hamster ovary)
CTM: célula-tronco mesenquimal
CX: chitosan and xanthan scaffold
DFSC: células-tronco do folículo dental (dental follicle progenitor cells)
DMEM: meio de eagle modificado por dulbecco (dulbecco´s modified eagle´s medium)
DMSO: dimetilsulfóxido
DPSC: células-tronco da polpa de dentes decíduos (dental pulp stem cells)
DRX: difração de raio-x
DEX: dexametasona
EDTA: ácido etileno-diamino-tetracetato-dissódico
FDA: food and drug administration
FGF: fator de crescimento de fibroblasto
GAG: glicosaminoglicano
H&E: hematoxilina e eosina
ITS: insulina, transferrina e selênio
k0: constante de erosão do suporte
KGN: kartogenina
KH: constante de liberação de higuchi
LABMOCA: laboratório de biologia molecular de cartilagem
LEBC: laboratório de engenharia de biorreações e colóides
LRAC: laboratório de recursos analíticos e de calibração
MEV: microscopia eletrônica de varredura
Mf: massa final
Mi: massa inicial
Ms: massa da amostra seca
MSC: mesenchimal stem cells
MTT: brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-ila)-2,5-difeniltetrazólio)
Mu: massa da amostra úmida
NaCl: cloreto de sódio
NaOH: hidróxido de sódio
NK: natural killer
OA: osteoartrite
OE: óxido de etileno
OMS: organização mundial da saúde
PBS: tampão fosfato salino
PCL: poli(caprolactona)
PCLd: suporte constituído de poli(caprolactona) contendo dexametasona
PDLSC: células-tronco do ligamento periodontal (periodontal ligament stem cells)
PEC: complexo polieletrólito
PEO: poli(oxi etileno)
PGA: poli(ácido glicólico)
PLA: poli(ácido láctico)
PLGA: poli(ácido lático-co-glicólico)
PLLA: poli(ácido lático)
Pm: perda de massa
PPO: poli(oxi propileno)
Q: quitosana
Qt/Q∞: fração do fármaco liberada ao longo do tempo
QX: suporte constituído por quitosana e xantana
QXp: suporte perfurado constituído por quitosana e xantana
RPM: rotações por minuto
SCAP: células-tronco da papila apical (stem cells from apical papilla)
SDS: dodecil sulfato de sódio
SFB: soro fetal bovino
SHED: células-tronco da esfoliação dos dentes decíduos humanos (stem cells
from human exfoliated deciduous teeth)
td: tempo de duplicação celular
Tg: transição vítrea
TGA: análise termogravimétrica
TGF-β: fator transformador de crescimento
TLR4: toll-like receptor 4
TPP: poliestireno
X: xantana, xanthan
α-MEM: meio essencial mínimo de eagle (minimum essential medium eagle)
μmáx: velocidade específica máxima de crescimento
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16
1.1 Objetivo ............................................................................................................................ 19
2. REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 21
2.1 Osteoartrite ...................................................................................................................... 21
2.1.1 Tratamentos padrões versus tratamentos atuais ...................................................... 23
2.2 Engenharia de tecidos e células-tronco mesenquimais ................................................ 25
2.2.1 Propriedades esperadas de scaffolds com aplicação na terapia de osteoartrite ...... 27
2.2.2 Células-tronco mesenquimais obtidas da polpa dentária ........................................ 31
2.2.3 Condrogênese ............................................................................................................ 33
2.2.4 Kartogenina ............................................................................................................... 35
2.2.5 Dexametasona............................................................................................................ 36
2.2.6 Mecanismos de liberação controlada de fármacos incorporados em matrizes
poliméricas ............................................................................................................................... 38
2.3 Polímeros com aplicação na produção de scaffolds ...................................................... 42
2.3.1 Poli(caprolactona) (PCL) .......................................................................................... 44
2.3.2 Quitosana ................................................................................................................... 46
2.3.3 Goma Xantana ........................................................................................................... 49
2.3.4 Complexo polieletrólito de quitosana-xantana......................................................... 50
2.3.5 Agentes porogênicos .................................................................................................. 52
2.3.5.1 Poloxamer 188 ........................................................................................................... 53
2.4 Colocação do problema ................................................................................................... 54
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 56
3.1 Reagentes .......................................................................................................................... 56
3.1.1 Polímeros ................................................................................................................... 56
3.1.2 Reagentes para cultivo e análise do comportamento celular................................... 56
3.1.3 Outros reagentes ........................................................................................................ 57
3.1.4 Células-tronco mesenquimais ................................................................................... 57
3.2 Métodos ............................................................................................................................ 58
3.2.1 Preparação dos suportes poliméricos de Quitosana-Xantana ................................. 58
3.2.2 Incorporação de dexametasona por impregnação em solução hidroetanólica nos
suportes de quitosana-xantana ............................................................................................... 59
3.2.2.1 Análise da eficiência de incorporação de dexametasona incorporada nos suportes de
QX e QXp .................................................................................................................................. 60
3.2.3 Preparação dos suportes poliméricos de poli(caprolactona) ................................... 60
3.2.4 Incorporação de dexametasona nos suportes de poli(caprolactona) ...................... 61
3.2.4.1 Estimativa da eficiência de incorporação de dexametasona por análise da perda por
evaporação do solvente ............................................................................................................ 61
3.2.5 Caracterização físico-química dos suportes poliméricos ......................................... 62
3.2.5.1 Aspecto e morfologia da superfície ............................................................................ 62
3.2.5.2 Espessura.................................................................................................................... 62
3.2.5.3 Capacidade de absorção e estabilidade em decorrência da exposição a soluções
aquosas.. ................................................................................................................................... 62
3.2.5.4 Análise Termogravimétrica (TGA) ............................................................................. 63
3.2.5.5 Determinação da Cristalinidade ................................................................................ 64
3.2.6 Metodologias de análise do comportamento biológico ............................................ 65
3.2.6.1 Reativação e preservação das células mesenquimais e obtenção do inóculo ........... 65
3.2.6.2 Caracterização dos parâmetros de crescimento das células mesenquimais ............. 65
3.2.6.3 Análise da citotoxicidade in vitro indireta dos suportes às células mesenquimais ... 66
3.2.6.4 Diferenciação das células mesenquimais dentárias em condrócitos ......................... 67
3.2.6.5 Análises histológicas .................................................................................................. 68
3.2.6.5.1 Tricrômico de Masson ................................................................................................ 69
3.2.6.5.2 Hematoxilina e Eosina (H&E) ................................................................................... 70
3.2.6.5.3 Azul de Alcian ............................................................................................................. 70
3.2.6.6 Análise das CTMs aderidas nas membranas por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) ...................................................................................................................... 71
3.3 Análise estatística dos resultados ................................................................................... 72
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 73
4.1 Caracterização físico-química dos suportes poliméricos ............................................. 73
4.1.1 Determinação da eficiência de incorporação de dexametasona nos suportes ........ 73
4.1.2 Aspecto e morfologia da superfície ........................................................................... 74
4.1.3 Espessura ................................................................................................................... 77
4.1.4 Capacidade de absorção e estabilidade durante a exposição a soluções aquosas .. 79
4.1.5 Liberação de dexametasona incorporada nos suportes de poli(caprolactona) ....... 81
4.1.6 Modelagem matemática dos dados de liberação de dexametasona ......................... 17
4.1.7 Análise Termogravimétrica (TGA) ........................................................................... 17
4.1.8 Determinação da cristalinidade ................................................................................ 21
4.2 Análise do comportamento biológico ............................................................................. 23
4.2.1 Caracterização dos parâmetros de crescimento das células mesenquimais ............ 23
4.2.2 Análise da citotoxicidade in vitro indireta dos suportes às células mesenquimais . 23
4.2.3 Diferenciação das células mesenquimais dentárias em condrócitos ....................... 25
4.2.3.1 Cultivo das células-tronco dentárias no sistema micromass ..................................... 25
4.3 Cultivo das células-tronco dentárias nos suporte poliméricos .................................... 31
4.3.1 Análise das CTMs aderidas nos suportes por microscopia eletrônica de varredura
(MEV)... .................................................................................................................................... 31
4.3.2 Análise das CTMs aderidas nos suportes por histologia ......................................... 35
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES ................................................................................... 45
5.1 Conclusões ........................................................................................................................ 45
5.2 Sugestões para trabalhos futuros ................................................................................... 46
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 48
16
1. INTRODUÇÃO
Osteoartrite (OA) é definida como uma insuficiência articular, sendo a forma mais
frequente das doenças designadas como "reumatismos", e lidera as causas de invalidez
crônica, em grande parte envolvendo joelhos e quadris. A análise dos dados dos EUA pela
Organização Mundial da Saúde (OMS) indica, por exemplo, que a OA causa invalidez em
10% da população que se encontra na faixa etária de 60 anos, afetando a vida de mais de 20
milhões de seus habitantes (SHARMA; KAPOOR, 2007). Esta doença é caracterizada por
mudanças no metabolismo dos condrócitos, o único tipo celular que compõe a cartilagem, que
levam a uma elevada produção de enzimas proteolíticas, deteriorando o tecido cartilaginoso e
causando a perda das funções articulares (GARCÍA-CARVAJAL et al., 2013).
Por meio das cirurgias reparativas atuais é realizada a substituição total da articulação,
gerando muitas vezes complicações musculoesqueléticas. A utilização de uma abordagem
biológica para reparar essas lesões e restaurar a cartilagem ou os ligamentos constituiria uma
solução ideal. Esta é a proposta da engenharia de tecidos, uma área relativamente nova que
tem como objetivo incorporar células específicas em suportes biodegradáveis e
biocompatíveis (denominados em inglês pelo termo scaffolds) que, quando implantados nas
lesões, regeneram gradualmente o tecido de forma semelhante ao original, restaurando suas
funções (KUO; LI; TUAN, 2013). Idealmente, o suporte deve sofrer degradação em uma taxa
compatível com o crescimento das células nele inoculadas, para que o tecido lesado possa ser
susbtituído pelo novo de maneira eficiente.
Diversos tipos de materiais vêm sendo testados na fabricação destes suportes, como
cerâmicas, metais, poliméricos sintéticos e de origem biológica, assim como compósitos.
Comparados aos materiais cerâmicos, os polímeros oferecem uma maior versatilidade no que
diz respeito ao processamento e à liberação controlada de drogas, podendo acelerar e
aumentar o processo de formação de cartilagem. Além disso, os polímeros se destacam devido
à biocompatibilidade, biodegradabilidade, à capacidade de mimetização de variadas
propriedades biológicas e ao abundante número de grupos funcionais que permitem a
funcionalização de sua superfície (HUANG; LEE; LOO, 2014).
Os suportes podem ser fabricados em diversos formatos ou estados físicos, como
micropartículas, hidrogéis, matrizes porosas, fibras e suas associações (HUANG; LEE; LOO,
2014).
A literatura reporta diversos polímeros naturais e sintéticos utilizados na preparação
17
dos suportes para a reparação de osso e cartilagem, como colágeno, fibroína de seda,
quitosana, alginato, goma xantana, poli(caprolactona) (PCL) e poli(ácido lático) (PLA)
(HUANG; LEE; LOO, 2014; LUO; WANG, 2014 e GARCIA-GIRALT et al.,2008).
A quitosana é o único polissacarídeo conhecido carregado positivamente facilmente
obtido de fontes naturais, sendo um dos biopolímeros mais frequentemente utilizados no
desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de drogas, devido às suas características
promissoras, como biocompatibilidade, excelente biodegradabilidade, baixa toxicidade, além
de ser extremamente abundante e de baixo custo de produção (HUANG; LEE; LOO, 2014).
Atenção especial tem sido dada à capacidade da quitosana de formar complexos
polieletrólitos (PEC) através de interação eletrostática com polímeros de carga oposta (LUO;
WANG, 2014), como a goma xantana.
A goma xantana é um polissacarídeo aniônico com uma produção anual que se
expande a uma taxa de 5 a 10% devido às suas características reológicas, o que lhe confere
variadas aplicações industriais. Sua baixa toxicidade e origem natural fez com que o FDA
(Food and Drug Administration) aprovasse a sua utilização nas indústrias farmacêuticas e de
alimentos sem limitações específicas de quantidade desde 1968 (LUO; WANG, 2014). O PEC
formado entre a xantana e a quitosana pode ter diversas estruturas, como hidrogéis,
membranas e partículas. Bellini e colaboradores (2012) desenvolveram membranas de
quitosana e xantana porosas em variadas proporções poliméricas, obtendo bons resultados na
utilização das mesmas como scaffolds para adesão celular e como curativos para pele. Veiga e
Moraes (2011) variaram a taxa de adição da quitosana à xantana, assim como a proporção dos
polissacarídeos na mistura e constataram a existência de uma taxa adequada (300 mL/h) para
resultar em membranas com propriedades mecânicas mais apropriadas. O aumento das
concentrações dos polissacarídeos ocasionou o aumento na absorção de água e a redução da
resistência à ruptura.
Dentre os polímeros de origem sintética, destaca-se na constituição de scaffolds a
PCL, que consiste em um material cristalino que possui propriedades mecânicas adequadas e
taxa de biodegradação inferior quando comparada a outros poliésteres, o que confere a este
polímero características superiores na engenharia de tecido cartilaginoso (GARCIA-GIRALT
et al.,2008). Garcia-Giralt e colaboradores (2008) demonstraram que suportes constituídos de
PCL também têm a capacidade de manter o fenótipo de condrócitos durante o cultivo, mesmo
que estes tenham se dediferenciado em fibroblastos durante o cultivo em monocamada.
Para propiciar o adequado crescimento celular na área de medicina regenerativa, com
18
frequência é também necessário o uso de fatores de promoção da reprodução e de estimulação
da diferenciação celular, funções nas quais se destacam a kartogenina e a dexametasona no
caso de diferenciação em condrócitos.
A kartogenina (KGN) é um composto recentemente descoberto capaz de acelerar o
processo de recuperação do tecido cartilaginoso. Trata-se de uma pequena molécula
heterocíclica que promove a diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em
condrócitos de maneira eficiente. Estes condrócitos proliferam rapidamente, produzindo a
matriz cartilaginosa no local lesionado (ZHANG; WANG, 2014).
Similarmente, a dexametasona pode ser também utilizada com sucesso na
diferenciação em condrócitos. No início do processo condrogênico, ocorre uma condensação
celular mediada por fatores de crescimento e por glicocorticoides análogos à dexametasona,
porém o mecanismo preciso da ação dos glicocorticoides na condrogênese ainda não é
conhecido (DERFOUL et al., 2006). Estes fatores de diferenciação podem tanto ser
adicionados no meio de cultivo quanto ser incorporados nos suportes que serão utilizados na
engenharia de tecido.
Diversas fontes de células-tronco podem ser utilizadas nesta diferenciação em
condrócitos, como as células embrionárias. Entretanto, o emprego destas células envolve
questões éticas, o que desfavorece sua utilização. Assim, fontes alternativas de células-tronco
se tornam imprescindíveis, como as provenientes de tecidos adultos. Dentre estas, as células-
tronco dentárias oferecem uma gama de vantagens, como alta plasticidade, criopreservação
por longos períodos sem perda da capacidade de diferenciação, boa interação com fatores de
crescimento e suportes, além de serem de fácil obtenção (SUNIL et al., 2012). Porém, ainda
são pouco utilizadas para esta finalidade.
Durante a fabricação dos suportes, atenção particular deve ser dada a suas
propriedades mecânicas, morfológicas e a sua porosidade, as quais devem idealmente
mimetizar o tecido a ser reparado. Cada tipo de célula se adapta de diferentes maneiras frente
a diversos tamanhos de poros em relação à adesão, crescimento e motilidade no suporte. No
caso da cartilagem, estudos demonstram que macroporos em torno de 150-300 µm altamente
conectados são propícios ao crescimento interno de tecido cartilaginoso (CHANG; WANG,
2011).
A liofilização é a técnica mais comum de obtenção de biomateriais porosos, a qual
retira, através de sublimação, água e outros solventes contidos no material, porém é um
método de custo relativamente elevado e laborioso. Uma alternativa para a obtenção de poros
19
é a adição de agentes porogênicos solubilizáveis, como glicose ou NaCl (BUENO; MORAES,
2011), no entanto, caso estes compostos não sejam removidos de maneira eficientemente,
podem causar aumento da osmolalidade do suporte e do meio de cultivo.
Também é possível obter suportes porosos através da incorporação de tensoativos
como o Tween 80 e Pluronic F-68 em complexos polieletrólitos de polissacarídeos,
propiciando a formação de poros e ainda facilitando a dispersão polimérica (BUENO;
MORAES, 2011; BELLINI et al., 2012). Uma forma alternativa ou adicional de se obter
materiais porosos seria através de perfurações mecânicas, utilizando, por exemplo, agulhas
hipodérmicas. Através deste método, pode-se aumentar a porosidade e a interconexão entre
poros já existentes, aumentando a probabilidade das células se alocarem no interior do
suporte, promovendo proteção enquanto cultivadas in vitro, além de tornar mais efetiva a
transferência de massa.
Outra alternativa para a obtenção de matrizes porosas é a eletrofiação. Esta técnica é
bastante útil para a produção de suportes com micro e nanoporos, apresentando extensa
aplicação na produção de curativos, suportes para engenharia de tecidos e outros materiais
biomédicos (Li et al., 2014). A técnica de eletrofiação consiste na aplicação de uma diferença
de potencial elétrico elevada entre um coletor e uma agulha da qual uma solução polimérica é
expelida a um fluxo constante (GARG; BOWLIN, 2011).
1.1 Objetivo
O presente trabalho, realizado como uma estreita colaboração entre o Laboratório de
Engenharia de Biorreações e Colóides (LEBC) da Faculdade de Egenharia Química da
UNICAMP e o Laboratório de Biologia Molecular de Cartilagem (LABMOCA) da Faculdade
de Ciências Médicas da mesma instituição, teve como objetivo analisar o potencial uso de
suportes porosos obtidos pela complexação de quitosana com xantana em fase aquosa e a
partir de poli(caprolactona) eletrofiada como base para adesão, crescimento e diferenciação de
células-tronco mesenquimais dentárias, através da adição de kartogenina ao meio de cultivo e
da incorporação de dexametasona nos suportes, visando à aplicação na terapia de lesões
cartilaginosas. O trabalho foi organizado nas seguintes etapas:
a) Obtenção e caracterização de suportes de quitosana-xantana porosos na presença
(QXp) e na ausência (QX) de perfuração, contendo ou não dexametasona;
b) Obtenção e caracterização de suportes de poli(caprolactona) contendo (PCLd) ou não
20
(PCL) dexametasona;
c) Caracterização dos suportes quanto ao aspecto e morfologia de sua superfície,
capacidade de absorção, espessura, estabilidade em diferentes soluções, cristalinidade
e comportamento térmico;
d) Seleção da concentração mais apropriada de kartogenina no meio de cultivo para
diferenciação das células-tronco em condrócitos;
e) Determinação dos parâmetros de crescimento das células-tronco mesenquimais
dentárias;
f) Avaliação da citotoxicidade dos suportes às células-tronco mesenquimais;
g) Cultivo e avaliação da diferenciação das células-tronco dentárias em condrócitos nos
suportes para o tratamento de osteoartrite.
21
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Osteoartrite
A osteoartrite (AO) é definida como uma desordem caracterizada pela perda lenta e
progressiva da cartilagem articular, sendo sua etiologia precisa ainda desconhecida, mas
intimamente relacionada a fatores de riscos como idade, sexo feminino, obesidade, fatores
geográficos, esforço físico, fatores genéticos, traumas, deficiência de vitamina D e
condrocalcinoses (DAS; FAROOQI, 2008).
A cartilagem é um tecido elástico que recobre as extremidades ósseas, amortece
impactos, auxilia no movimento articular, fornece suporte estrutural e conecta tecidos moles e
duros. Existem três tipos de cartilagem humana: hialina, elástica e fibrosa, as quais são
encontradas em diferentes partes do corpo (KUO; LI; TUAN, 2013). A cartilagem é composta
principalmente por condrócitos (sendo este o único tipo celular encontrado), água, colágeno
tipo II e por uma elevada quantidade de proteoglicanos agregados. A rede de colágeno é
responsável pela resistência à tração, e os proteoglicanos agregados (principalmente
agrecanos), com suas cadeias laterais de glicosaminoglicanos (GAG), são responsáveis por
determinar a rigidez da cartilagem (MOYER; RATNESWARAN; BIRMINGHAM, 2014). Na
Figura 1 faz-se a comparação, de forma esquemática, do aspecto uma articulação normal e
uma com osteoartrite, mostrando-se também a composição da cartilagem.
Os danos cartilaginosos são causados por mecanismos físicos, biológicos ou por uma
combinação de ambos. As causas físicas, como traumas, muitas vezes danificam a estrutura
do tecido e prejudicam as células do local, criando lesões permanentes na cartilagem. Por
outro lado, as causas biológicas, tais como doenças autoimunes e inflamação, desencadeiam
respostas bioquímicas e celulares que degradam o tecido cartilaginoso (KUO; LI; TUAN,
2013).
Segundo García-Carvajal e colaboradores (2013), mutações genéticas podem induzir a
deleção do aminoácido glicina no colágeno tipo II, desestabilizando a tripla hélice desta
proteína, tornando-o mais susceptível à degradação por metaloproteinases. Outras moléculas
relacionadas à OA são as enzimas ADAMTS-4 e ADAMTS-5, as quais degradam os
agrecanos, o proteoglicano mais abundante na cartilagem articular. Quando este evento
ocorre, o colágeno tipo II fica exposto e sofre ação proteolítica da enzima DDR-2. Estas
alterações na matriz extracelular da cartilagem primeiramente desencadeiam a proliferação
22
dos condrócitos e a formação de tecido fibroso, o qual cicatriza em resposta à doença. Com a
cicatrização, são produzidos fatores de crescimento, como o TGFβ, que causam hipertrofia
dos condrócitos (GARCÍA-CARVAJAL et al., 2013).
Figura 1 – Articulação normal e com osteoartrite e, em detalhe, a composição da cartilagem
(adaptada de WIELAND et al., 2005 e HARDIN; COBELLI; SANTAMBROGIO, 2015).
Até 2030, estima-se que por volta de 25% da população americana irá desenvolver
algum tipo de artrite (KUO; LI; TUAN, 2013). De acordo com dados da Previdência Social
Brasileira, a osteoartrite é responsável por 7,5% dos afastamentos de trabalho, sendo a
segunda doença entre as que justificam o auxílio inicial, e ocupando a quarta posição entre as
doenças que levam à aposentadoria, correspondendo a 10,5% dos casos (TREVISANI;
FIDELIX, 2009). Isto demonstra claramente potencial para elevados dispêndios neste sentido,
reforçando a necessidade urgente de se desenvolver terapias alternativas eficientes para se
tratar a osteoartrite.
ColágenoCondrócito Proteoglicano
23
2.1.1 Tratamentos padrões versus tratamentos atuais
A cartilagem é um tecido hipocelular que não possui sistema linfático para auxiliar na
circulação de células e moléculas que atuam no reparo, como fatores de crescimento e
citocinas para iniciar a cicatrização de feridas. Dessa maneira, lesões na cartilagem
geralmente progridem de uma maneira praticamente irreversível (HUNZIKER, 2002).
Os tratamentos atuais para lesões cartilaginosas incluem intervenções cirúrgicas e não
cirúrgicas, estando sumarizados na Tabela 1. Tratamentos não cirúrgicos, como a utilização
de drogas ou fisioterapia, são geralmente realizados nos estágios iniciais da osteoartrite ou em
cartilagens com lesões pouco expressivas, enquanto as intervenções cirúrgicas são realizadas
nos estágios intermediários e avançados da OA ou em cartilagens com danos severos. Nestes
casos, tipicamente, o único recurso para o reparo do tecido cartilaginoso é a intervenção
cirúrgica, devido à baixa capacidade de autorregeneração celular.
O protocolo padrão para tratar lesões severas de cartilagem é a troca total da
articulação, um procedimento efetivo, porém realizado somente quando os demais
tratamentos não propiciaram alívio ao paciente. Além disso, resultados clínicos demonstram
que apesar destes procedimentos cirúrgicos serem capazes de melhorar o quadro do paciente,
podem ocorrer complicações inerentes aos tratamentos, como a formação de fibrocartilagem
(KUO; LI; TUAN, 2013).
Para os pacientes com lesões menos severas, outros procedimentos cirúrgicos são
realizados, sendo a microfratura a técnica mais comum. Nesta técnica são realizadas
perfurações ósseas para promover a liberação de células mesenquimais provenientes da
medula óssea que realizarão, posteriormente, a regeneração da cartilagem (CAVALCANTI et
al., 2012).
Recentemente, novas técnicas de reparação condral têm sido desenvolvidas, como
artroscopia da borda condral com sutura ou com cola de fibrina e utilização de scaffolds ou de
suportes sólidos tridimensionais (CASSAR-GHEITI et al., 2015), como o Chondro-Gide®
(suporte composto por colágeno I e III) e o MACI (suporte de terceira geração constituído de
colágeno de origem porcina), na presença ou ausência de células. Além destes, existem
também a mosaicoplastia e o implante de condrócitos autólogos (CASSAR-GHEITI et al.,
2015).
24
Tabela 1: Métodos mais utilizados no tratamento de doenças cartilaginosas e seus resultados
típicos (adaptado de Segal, Buckwalter e Amendola, 2006, com contribuições de Coimbra,
2015).
Método Considerações Resultados
Desbridamento Reestabelece um leito ósseo
sangrante, para que as células-tronco
locais formem um tecido cicatricial
reparando a lesão. É um método
considerado em desuso atualmente
Formação de fibro-cartilagem
com menor resistência quando
comparada à cartilagem hialina.
Microfraturas Desbridamento da cartilagem
associado a perfurações do osso
subcondral, reestabelecendo um leito
ósseo sangrante com maior número
de células que o desbridamento.
Pode ser associado ao uso de
membranas acelulares, como as de
ácido hialurônico.
Formação de fibro-cartilagem
com menor resistência quando
comparada à cartilagem hialina.
Transplante
Autólogo de
Condrócitos
Técnica complexa, realizada em dois
estágios: artroscopia para coletar
cartilagem hialina e desbridamento
da lesão com sutura de bolsa de
perióstio ao redor da lesão, formando
uma cavidade para injeção das
células cultivadas.
O tecido resultante é muito
semelhante à cartilagem hialina.
Mosaicoplastia Retirada de cilindros osteocondrais
da região da tróclea ou intercôndila e
seu transplante para o local da lesão
cartilaginosa.
Técnica efetiva de
preenchimento da lesão com
cartilagem hialina, porém
limitada no tratamento de lesões
grandes por morbidade na área
doadora.
Transplante de
Cartilagem
Transplante de osso e cartilagem de
cadáver humano para o paciente, não
havendo limitação de tamanho para
utilização e não gerando morbidade
na área doadora.
É necessário que haja
compatibilidade anatômica da
área doadora com a área
receptora.
Engenharia de
tecido
Condrócitos são cultivados em
suportes artificiais.
Com esse tipo de estratégia, a
hipertrofia é reduzida em torno
de 5%, e entre 3 e 6 meses as
membranas são reabsorvidas.
A engenharia de tecidos representa uma abordagem emergente para o reparo e
regeneração da cartilagem. Nos anos 90, os estudos de células-tronco, biomateriais e
biorreatores fez com que a engenharia de tecido cartilaginoso ganhasse novas perspectivas.
Tais estudos se baseiam na inoculação de condrócitos ou de células-tronco em scaffold
25
constituído por materiais biocompatíveis em um biorreator para produzir cartilagem in vitro.
A cartilagem obtida é, então, implantada in vivo para o tratamento ou substituição do tecido
danificado. Pontos críticos para o sucesso dessa estratégia são o desenvolvimento de scaffolds
com resistência mecânica adequada, que regulem as atividades biológicas celulares e que
garantam a manutenção do fenótipo dos condrócitos (KUO; LI; TUAN, 2013).
2.2 Engenharia de tecidos e células-tronco mesenquimais
A engenharia de tecidos é uma área emergente, definida como um campo
interdisciplinar que aplica os princípios da engenharia, biologia e medicina de forma científica
com o intuito de desenvolver substitutos biológicos que reconstruam, mantenham ou
melhoram as funções dos tecidos lesados, sendo a substituição completa de um órgão seu
maior desafio (SARKAR et al., 2013). No ano de 2007, aproximadamente 50 indústrias e
mais de 3000 funcionários desenvolveram produtos comerciais para a regeneração de tecidos,
gerando receita anual superior a 1,3 bilhões de dólares (LYSAGHT; JAKLENEC;
DEWEERD, 2008). As vantagens tecnológicas em torno das descobertas biológicas
continuam a impulsionar a engenharia de tecidos (SARKAR et al., 2013).
Basicamente, os princípios da engenharia de tecidos podem ser aplicados
terapeuticamente de duas maneiras: 1) os tecidos desenvolvidos em laboratório (in vitro),
constituídos de células e fatores de crescimento inoculados em uma matriz artificial, são
transplantados, como um conjunto, para a região lesada; e 2) uma combinação de matriz
artificial e fatores de crescimento é introduzida na região a ser regenerada, induzindo as
células hospedeiras a restaurarem o tecido in vivo in situ.
No primeiro método, as células também podem ser injetadas diretamente no local a ser
recuperado, porém a taxa de sobrevivência dessas células é extremamente baixa, geralmente
devido à falta de suprimento de nutrientes e oxigênio (MUSCHLER; NAKAMOTO;
GRIFFITH, 2004). Assim, uma variedade de dispositivos extracorpóreos ou implantáveis é
utilizada para abrigar as células transplantadas em matrizes semipermeáveis. A matriz permite
a difusão de nutrientes e de produtos de excreção, além de prevenir o movimento de
anticorpos, agentes patogênicos ou células imunocompetentes (MURUA et al., 2008).
As células utilizadas na engenharia de tecidos podem ser selecionadas de diversas
regiões, incluindo células autólogas do paciente, células alogênicas de outro ser humano, e
células xenogênicas geradas a partir de outras espécies. Entretanto, células alogênicas e
26
xenogênicas geralmente são rejeitadas pelo sistema imunológico (SARKAR et al., 2013).
Os tipos de células mais comuns utilizadas incluem as células-tronco, células maduras
diferenciadas, ou uma mistura de células diferenciadas. As células-tronco podem ser
classificadas considerando-se sua origem (embrionárias, pré-natais e adultas) ou sua
capacidade de diferenciação (pluripotente, multipotente e unipotente) (KARAMZADEH;
ESLAMINEJAD, 2013). As células-tronco embrionárias constituem uma alternativa atrativa
para a engenharia de tecidos, visto que elas podem se reproduzir sem que haja perda do
fenótipo, podem ser expandidas em cultura e, o mais importante, podem se diferenciar em
qualquer tipo de célula (pluripotentes) quando sujeitas a estímulos específicos. Como essas
células-tronco são isoladas a partir do estágio embrionário, elas podem se desenvolver em
qualquer uma das três camadas germinativas: endoderme, mesoderme ou ectoderme
(SARKAR et al., 2013). As células-tronco adultas incluem, por exemplo, células
mesenquimais, hematopoiéticas, neurais e hepáticas. As hematopoiéticas são utilizadas
geralmente para o tratamento de doenças do sangue. As células-tronco mesenquimais (CTM)
têm a vantagem de poder ser transplantadas de um paciente para outro sem desencadear
resposta imunológica apreciável, não sendo necessária a utilização de drogas
imunossupressoras. Além disso, são capazes de se diferenciar em diversas linhagens
(multipotentes) como osso, cartilagem e músculos. Células-tronco mesenquimais podem
também modular a resposta imune do hospedeiro através de mecanismos parácrinos ou
endócrinos, sendo atualmente aplicadas em ensaios clínicos para o tratamento de doenças do
sistema imunológico (SARKAR et al., 2013).
Entre os diferentes tipos de células-tronco, as que provêm de tecidos adultos, apesar de
terem menor plasticidade, são muito atrativas para aplicação na medicina regenerativa, pois
não estão associadas a questões éticas, e apresentam potencial tumorigênico inferior ao das
células-tronco embrionárias (KARAMZADEH; ESLAMINEJAD, 2013).
Diversos tecidos adultos contêm células-tronco, como a medula óssea, o cérebro, o
sangue periférico, a medula espinhal, a polpa dentária, vasos sanguíneos, os epitélios do
sistema digestivo e pele, córnea, retina, fígado, pâncreas e músculo esquelético (MALGIER;
NOVELLI; SANGIUOLO, 2011). Este assunto será tratado em mais detalhes adiante.
Uma ampla variedade de suportes é desenvolvida para diversas aplicações na
engenharia de tecidos, e suas características influenciam no tecido a ser formado. Diante do
exposto, no próximo item são descritas as características desejáveis dos suportes (scaffolds)
utilizados para engenharia do tecido cartilaginoso.
27
2.2.1 Propriedades esperadas de scaffolds com aplicação na terapia de osteoartrite
Os scaffolds são definidos como matrizes que permitem o crescimento tecidual através
de um suporte estrutural que pode conter fármacos e/ou células (HOWARD et al., 2008). Os
fármacos podem estimular as células do tecido danificado a se proliferarem ou até mesmo se
diferenciarem, ocasionando a regeneração tecidual. Todavia, quando este tecido danificado
possui baixa quantidade de células, pode-se optar por cultivar novas células sobre os scaffolds
que serão implantados no local da lesão, onde irão se proliferar e formar tecidos in vivo
(HOWARD et al., 2008). A necessidade de novos tratamentos para doenças degenerativas da
cartilagem articular vem sendo cada dia mais discutida, colocando a engenharia de tecidos em
destaque (GORDELADZE et al., 2011).
Para a regeneração de tecidos cartilaginosos, células-tronco mesenquimais ou
condrócitos podem ser inoculados em scaffolds biocompatíveis e biodegradáveis e cultivados
in vitro previamente à implantação in vivo (BANDEIRAS et al., 2015). A biocompatibilidade
dos scaffolds é essencial, significando ausência de imunogenicidade ou de produção de
resposta inflamatória adversa, para que não haja rejeição do dispositivo implantado
(BABENSEE; MCINTIRE; MIKOS, 2000). O scaffold deve apresentar taxa de biodegradação
suficiente para que o tecido regenerado substitua o material progressivamente ao longo do
processo de regeneração da lesão. Dessa forma, diferentes tipos de polímeros são amplamente
utilizados nesses sistemas, visto que vários deles possuem características como
biodegradabilidade, fácil processamento e biocompatibilidade (HUANG; LEE; LOO, 2014).
Um scaffold ideal deve servir como suporte para as células animais aderirem,
proliferarem, diferenciarem e formarem a matriz extracelular (MEC). Estes fatores estão
relacionados intimamente às características do scaffold, como sua topografia, características
químicas; microestrutura (porosidade, dimensão dos poros, formato dos poros,
interconectividade dos poros e área superficial específica) e suas propriedades mecânicas
(GORDELADZE et al., 2011). Além disso, o scaffold deve ser passível de esterilização e ser
capaz de se degradar sem produzir metabólitos tóxicos, inflamatórios ou imunogênicos
(BABENSEE; MCINTIRE; MIKOS, 2000).
Para realizar a ancoragem celular, a interação célula-scaffold deve ser adequada. Esta
interação tem impacto direto na adesão e na morfologia das células, o que pode afetar
diversos processos celulares. Esta interação é direta ou indiretamente influenciada pelas
características físico-químicas da superfície do polímero, incluindo a hidrofilicidade,
28
cristalinidade, carga e presença de grupos funcionais. A presença desses grupos funcionais é
de grande relevância, visto que eles podem ser utilizados para a conjugação de proteínas e
peptídeos específicos que irão influenciar na atividade celular desejada (BENOIT et al.,
2008).
Scaffolds para cartilagens devem apresentar características gerais comuns para
suportes visando à substituição de tecidos de qualquer tipo, como osso, vasos sanguíneos,
bexiga, músculos, pele, etc. Para se construir um scaffold ideal para a engenharia de tecido
cartilaginoso, é essencial identificar as atividades celulares críticas e quais são as propriedades
requeridas pelo biomaterial para que haja uma regeneração robusta (KUO; LI; TUAN, 2013).
A morfologia celular é um dos parâmetros críticos que devem ser analisados, pois
regula as atividades celulares. Como pode ser observado na Figura 2, a cartilagem articular
nativa é composta por quatro zonas distintas: zona superficial ou tangencial, zona média, zona
profunda ou radial e zona calcificada (GARCÍA-CARVAJAL et al., 2013).
Figura 2 – Organização da cartilagem articular nativa (adaptada de GARCÍA-CARVAJAL et
al., 2013).
Zona
superficial
Zona
média
Zona
radial
Zona
calcificada
29
Os condrócitos que se encontram na zona superficial exibem morfologia elíptica, os da
zona média possuem morfologia esférica, os que se encontram na zona radial são agrupados
em colunas e expressam marcadores hipertróficos e os localizados na zona calcificada já se
encontram em apoptose (GARCÍA-CARVAJAL et al., 2013).
Assim, a manutenção do fenótipo dos condrócitos associado a estas diferentes
morfologias é um fator crítico. Testes in vitro demonstram que, após os condrócitos serem
isolados da cartilagem e cultivados em monocamadas em superfícies planas, as células
mudam do formato esférico para o um formato alongado e em fuso, e se dediferenciam em
células similares aos fibroblastos (KUO; LI; TUAN, 2013), conforme mostrado na Figura 3.
Figura 3 – Dediferenciação de condrócitos em cultura em monocamada para fibroblastos: (A)
condrócitos em formato esférico; (B) condrócitos dediferenciados após 6 dias em cultura em
monocamada (fonte: GLATTAUER et al., 2011).
O scaffold deve também ter capacidade efetiva de transporte de massa. Esta
característica é de suma importância no desenvolvimento de scaffolds para tecido
cartilaginoso, pois a cartilagem possui uma natureza avascular que dificulta a remoção
eficiente dos bioprodutos, sendo a difusão o único mecanismo disponível para tal finalidade
(KUO; LI; TUAN, 2013). Assim, os scaffolds devem possuir microporos para o transporte de
nutrientes e eliminação dos metabólitos produzidos pelas células (VIKINGSSON et al.,
2015). Além disso, a porosidade de um scaffold deve propiciar um ambiente biomecânico
adequado para permitir a transdução de sinais mecânicos para que haja diferenciação celular
(VIKINGSSON et al., 2015) e, simultaneamente, deve oferecer proteção para a nova
30
cartilagem formada dos danos mecânicos, visto que a carga aplicada sobre eles após a
implantação é elevada (KUO; LI; TUAN, 2013).
Diferentemente dos condrócitos, que produzem colágeno tipo II, as células
dediferenciadas produzem colágeno tipo I, decorinas e biglicanos (KUO; LI; TUAN, 2013).
De fato, o formato de fuso dos condrócitos dediferenciados demonstra uma atividade celular
distinta daquele dos condrócitos esféricos. Entretanto, as células dediferenciadas podem se
rediferenciar no fenótipo esférico se forem encapsuladas em hidrogéis ou cultivadas em uma
superfície pouco adesiva. Os sistemas de cultivo utilizados para que haja a diferenciação em
condrócito são o micromass ou o cultivo de pellets em um sistema tridimensional (KUO; LI;
TUAN, 2013). O cultivo de pellets é um método padrão, baseando-se na centrifugação da
suspensão celular com o intuito de concentrá-la para promover maior interação entre as
células (centrifugação de 1 mL de meio de cultura contendo cerca de 106 células em tubos
cônicos, descartando-se em seguida o sobrenadante e incubando-se em estufa a 37,0 °C
durante 2 horas com posterior adição de meio de cultivo vagarosamente). Esta interação
celular é similar à observada na condensação inicial da formação de cartilagem durante o
desenvolvimento embriogênico (ZHANG et al., 2010). Todavia, dificilmente é obtida uma
cartilagem satisfatória por esta técnica, visto que as células muitas vezes são encontradas
indiferenciadas ou necrosadas na região central do pellet, e somente a camada superficial de
células se diferencia em condrócitos (ZHANG et al., 2010). O sistema de cultura micromass,
descrito primeiramente para a transformação de células-tronco mesenquimais em tecido
esquelético, foi aplicado para a indução de condrogênese de CTM (SCHARSTUHL et al.,
2007). Este sistema é superior à cultura em pellets, observando-se maior homogeneidade da
cultura e elevada produção de colágeno tipo II (ZHANG et al., 2010). Nesta técnica, cerca de
5 x 105 células contidas em gotas de 10 µL são inoculadas em poços de placas de fundo
cônico e mantidas em estufa com circulação de ar enriquecido com 5% de CO2 por 2 a 4
horas. Em seguida, é adicionado o meio de cultivo condrogênico delicadamente para que o
conjunuto de células não se desagregue e espalhe pelo poço.
Dahlin e colaboradores (2014) inocularam co-culturas de condrócitos e CTM de ratos
em scaffolds de poli(caprolactona) produzidos por eletrofiação e implantaram o sistema em
ratos com deficiência osteocondral. As análises histológicas revelaram que as articulações
tratadas com o sistema formaram cartilagem hialina, enquanto que os grupos tratados com os
scaffolds na ausência das células formaram cartilagem fibrosa, demonstrando o potencial uso
da PCL com células para o reparo de cartilagens.
31
Em outro estudo, scaffolds constituídos de quitosana e fibroína de seda foram
utilizados para a ancoragem de condrócitos bovinos, observando-se boa adesão e crescimento
celular no scaffold, além de manutenção do fenótipo celular (BHARDWAJ et al., 2011).
Bhardwaj e Kundu (2012) também estudaram este tipo de scaffold poroso para a diferenciação
de células-tronco mesenquimais em condrócitos. Para tal, inocularam uma alta concentração
de condrócitos sobre os scaffolds em placas de 24 poços e, após 3 horas de incubação em
condições apropriadas, adicionaram meio condrogênico. Este meio era constituído de meio
DMEM, 10% de soro fetal bovino, antibióticos, 100 nmol/L de dexametasona, 10 ng/ml de
TGF β1, além de outras substâncias. Os autores relataram a retenção do fenótipo de
condrócito após cultivo de três semanas nos scaffolds, demonstrando que sua utilização para
tal finalidade é eficiente.
2.2.2 Células-tronco mesenquimais obtidas da polpa dentária
Recentemente, as células-tronco dentárias têm atraído a atenção mundial para
potencial uso na área de terapia celular devido a suas superioridades técnicas e práticas. Além
de terem várias das características de células-tronco mesenquimais originadas de outros
tecidos, como a habilidade de adesão a plásticos com a formação de colônias in vitro, elas
apresentam propriedades adequadas em relação à resposta imune, acessibilidade e capacidade
de proliferação quando comparadas às células-tronco mesenquimais derivadas da medula
óssea (KARAMZADEH; ESLAMINEJAD, 2013), uma das fontes comumente empregadas.
Outras desvantagens das células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea são a
dificuldade de obtenção, pois gera dor ao paciente e morbidade no local de coleta, além do
número de células coletadas ser inferior aos das células-tronco dentárias (HUANG;
GRONTHOS; SHI, 2009). Outras fontes celulares amplamente empregadas são as derivadas
do tecido adiposo obtidas por sucção assistida (lipoaspiração) (ZUK et al., 2001; MIZUNO et
al., 2002) e aquelas adquiridas do sangue do cordão umbilical. CTM de tecidos adiposos e
especialmente as derivadas do cordão umbilical (BALLEN et al., 2008) ainda são mais
populares que as células-tronco dentárias, pois estes tecidos são versáteis, possuem grande
potencial para muitas aplicações clínicas e assim, são mais investigados que as células
dentárias.
Cinco tipos de células-tronco são relatados como provenientes de tecidos dentários: 1)
Células-tronco da polpa de dentes decíduos, popularmente conhecidos como dentes de leite
32
(dental pulp stem cells - DPSC), 2) Células-tronco da esfoliação dos dentes decíduos humanos
(stem cells from human exfoliated deciduous teeth - SHED), 3) Células-tronco do ligamento
periodontal (periodontal ligament stem cells - PDLSC), 4) Células-tronco da papila apical
(stem cells from apical papilla - SCAP) dos dentes permanentes e 5) Células-tronco do
folículo dental (dental follicle progenitor cells - DFSC). As DPSC, SHED e SCAP são
referidas como células-tronco relacionadas à polpa dentária, e as PDLSC e DFSC como
células-tronco relacionadas ao periodonto (HUANG; GRONTHOS; SHI, 2009). Na Figura 4
são sumarizadas as localizações das células-tronco encontradas nos dentes. As polpas dos
dentes decíduos, geralmente descartadas após a extração, representam assim uma fonte
vantajosa de células-tronco jovens devido ao processo ser pouco invasivo e não envolver
questões éticas como no caso das células embrionárias (KERKIS; CAPLAN, 2012).
Células-tronco de polpa dentária são células multipotentes e têm elevado potencial
proliferativo, podendo ser mantidas por pelo menos 25 passagens. Estas células podem ser
seguramente criopreservadas, possuem propriedades imunosupressivas, expressam
marcadores tais como CD13, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105, CD146 e STRO-1,
e não expressam CD14, CD24, CD34, CD45, CD19 e HLA-DR, estando de acordo com o
critério de células-tronco mesenquimais proposto pela Sociedade Internacional para Terapia
Celular (ISCT) (LINDROOS et al., 2008 e EGUSA et al., 2012). As DPSC possuem a
habilidade de se diferenciar in vitro em células odontoblásticas, osteoblastos, adipócitos,
células neurais, cardimiócitos, miócitos e condrócitos (CARINCI et al., 2008), e a
diferenciação neste último tipo celular será discutida a seguir.
Figura 4 – Células-tronco dos dentes decíduos antes (DPSC) e depois (SHED) da esfoliação e
dos dentes permanentes antes e depois da erupção, destacando-se as células-tronco do
ligamento periodontal (PDLSC), as da papila apical (SCAP) e as do folículo dental (DFSC)
(adaptada de BOJIC et al., 2014).
33
2.2.3 Condrogênese
Na evolução embrionária, os condrócitos surgem durante o desenvolvimento do
esqueleto, a partir de células progenitoras mesenquimais, para sintetizar a cartilagem com o
objetivo de desenvolvimento ósseo (GOLDRING; TSUCHIMOCHI; IJIRI, 2005). A
condrogênese embrionária se inicia quando as células-tronco mesenquimais passam por uma
condensação (redução do espaço intercelular), na qual começam a expressar colágeno tipo I,
III e V. A diferenciação em células condroprogenitoras gera a expressão de colágenos
específicos da cartilagem, como os tipos II, IX e XI (GOLDRING, 2012). O processo de
condensação é responsável pelas interações iniciais inespecíficas célula-célula, como a adesão
celular mediada pelas n-caderinas e a comunicação das junções de hiato (KUO; LI; TUAN,
2013).
Durante o desenvolvimento ósseo, os condrócitos remanescentes formam a cartilagem
na extremidade do osso oposto ao formado ou proliferam e, em um determinado momento,
cessam essa proliferação realizando uma diferenciação terminal que leva à hipertrofia e
apoptose. Esse fenômeno permite a ossificação endocondral, através da qual a cartilagem
hipertrófica calcificada é reabsorvida e substituída por osso (GOLDRING, 2012). Estes
processos estão sujeitos a uma complexa regulação através da interação dos fatores de
crescimento de fibroblastos (FGF), do fator transformador de crescimento β (TGFβ), da
proteína morfogenética óssea (BMP) e da sinalização pela via Wnt (HAQUE; NAKADA;
HAMDY, 2007). Sox9 e Runx2 são dois reguladores de transcrição fundamentais para a
formação de cartilagem articular e para a maturação hipertrófica, respectivamente. Além
disso, Runx2 é inibido diretamente por Sox9, TGFβ e por sinais de BMP que regulam de
maneira diferenciada a sinalização Wnt/β-catenina através da ativação de Runx2 (DONG et
al., 2006).
No processo de cultivo dos condrócitos in vitro, é importante garantir que as células
expandidas mantenham seu fenótipo. Entretanto, um dos principais problemas encontrados na
cultura de condrócitos é o processo de dediferenciação, no qual os condrócitos cultivados em
monocamadas produzem de maneira falha a matriz cartilaginosa (HOLTZER et al., 1960).
Isso se deve a uma baixa síntese de colágeno tipo II, sendo produzidos principalmente os
colágenos dos tipos I e III, os quais não são encontrados em cartilagens normais
(THOROGOOD; BEE; VON DER MARK, 1986). Além disso, os condrócitos
dediferenciados começam gradualmente a produzir proteoglicanos de baixa massa molecular
34
(conhecidos como versicanos) ao invés de proteoglicanos agregados (agrecanos), e diminuem
a atividade da fosfatase alcalina (BENYA; SHAFFER, 1982).
Os mecanismos que envolvem o processo de dediferenciação ainda não foram
completamente elucidados, mas acredita-se que este seja mediado pela formação das fibras de
estresse de actina quando as células se propagam em um substrato aderente (BENYA;
PADILLA; NIMNI, 1978).
Esse fenômeno de dediferenciação é provavelmente a limitação mais importante no
processo de cultivo de condrócitos para aplicação na engenharia de tecidos. Porém, as células
dediferenciadas podem se rediferenciar em condrócitos através de algumas técnicas de cultura
que inibem o achatamento celular e a formação das fibras de estresse de actina, como a
técnica de cultura em alta densidade, a qual simula o processo de condensação celular através
do empacotamento das células por centrifugação para aumentar as interações entre elas
(KUO; LI; TUAN, 2013). A técnica de cultura de pellets também gera alta densidade de
células agregadas, mantendo o fenótipo de condrócito. O cultivo de condrócitos em hidrogéis
é outra técnica que torna viável a expressão dos marcadores fenotípicos originais das células
tronco, porém a manutenção do fenótipo pode chegar a somente 40% em uma semana de
cultura (MELERO-MARTIN; AL-RUBEAI, 2007).
Fatores de crescimento modulam a proliferação e diferenciação dos condrócitos. A
utilização de FGF-2 durante a expansão em monocamada e de BMP-2 durante o cultivo
tridimensional em scaffolds melhoram de forma eficaz a diferenciação das células-tronco em
condrócitos, aprimorando a engenharia de tecido cartilaginoso (MARTIN et al., 2001). Além
disso, foi demonstrado que a condrogênese de condrócitos articulares adultos pode ser
melhorada se estes condrócitos forem expandidos na presença de uma combinação de fatores
pertencentes à superfamília das BMPs (JAKOB et al., 2001). Também foi relatado que os
condrócitos expandidos em monocamada na presença de FGF-2/TGF-β exibem maior taxa de
proliferação e dediferenciação e alta capacidade de rediferenciação em resposta à
suplementação de meio isento de soro com TGF-β e dexametasona durante culturas
tridimensionais (MARTIN; SMITH; AL-RUBEAI, 2005).
Estes resultados evidenciam que fatores de crescimento adicionados durante a
expansão de condrócitos não só influenciam a proliferação e diferenciação celular, mas
também o potencial da célula para rediferenciação e suas respostas à moléculas regulatórias
após transferência para um ambiente tridimensional (MELERO-MARTIN; AL-RUBEAI,
2007).
35
Neste âmbito, novas moléculas têm sido estudas. Johnson e colaboradores (2012)
realizaram um estudo exaustivo de 22.000 moléculas com capacidade potencial de
diferenciação de células-tronco mesenquimais em condrócitos. Um composto, chamado de
kartogenina (KGN) promoveu a diferenciação das células-tronco em condrócitos de uma
maneira dose-dependente (JOHNSON et al., 2012), e será mais detalhadamente abordado no
item seguinte.
2.2.4 Kartogenina
A kartogenina é uma molécula heterocíclica e hidrofóbica que promove a
diferenciação de células-tronco mesenquimais em condrócitos. Quando testada em dois
modelos animais com osteoartrite induzida, promoveu a regeneração da matriz cartilaginosa e
reduziu significativamente os níveis de dor, sem nenhum efeito negativo aparente (JOHNSON
et al., 2012). Sua estrutura é mostrada na Figura 5.
O mecanismo de ação da kartogenina também foi elucidado no estudo de Johnson e
colaboradores (2012), sendo mostrado, de forma resumida, na Figura 6. Ele se baseia na
ligação do composto com a proteína filamina A, promovendo o deslocamento do fator CBFβ
(fator de transcrição da subunidade β do fator núcleo-ligante) de seu sítio de ligação
citoplasmático. Livre, o CBFβ tem capacidade de se inserir no núcleo, onde se liga ao fator de
transcrição RUNX1, o qual em seguida se liga ao DNA. O complexo CBFβ-RUNX1 ativa a
transcrição de proteínas envolvidas na diferenciação da cartilagem, aumentando a síntese de
colágeno tipo II, agrecanos e inibidores teciduais de metaloproteinases (JOHNSON et al.,
2012). Por se tratar de uma droga nova no mercado, seu preço é elevado. Um miligrama é
comercializado, atualmente, por aproximadamente 12 dólares (equivalentes, em janeiro de
2016, a cerca de R$ 48,00).
Figura 5 – Estrutura química da kartogenina (Fonte: Sigma-Aldrich, 2016).
36
Em outro estudo, um sistema de liberação controlada de drogas foi desenvolvido para
a kartogenina. Este consistiu da conjugação do composto a micro e nanopartículas de
quitosana por ligação covalente através de seu grupo carboxílico com o grupo amina da
quitosana. A liberação controlada da kartogenina se manteve por 7 semanas e a diferenciação
das células em condrócitos foi expressiva naquelas tratadas com o sistema (KANG et al.,
2014).
A dexametasona é um glicocorticoide conhecido também por auxiliar o início do
processo condrogênico, no qual ocorre uma condensação celular. Este composto será descrito
detalhadamente a seguir.
Figura 6 – Mecanismo de ação de diferenciação condrogênica da kartogenina em uma célula
animal.
2.2.5 Dexametasona
A dexametasona (C22H29FO5) é definida como um hormônio esteroide sintético e está
entre os glicocorticoides usualmente descritos para uso sistêmico, uma vez que possui ação
anti-inflamatória e imunossupressora, apesar de também apresentar alguns efeitos adversos,
37
como perda óssea e aumento da susceptibilidade à infecções (KLEIMAN; TUCKERMANN,
2007).
Este fármaco pode ser descrito como um pó cristalino branco e inodoro, praticamente
insolúvel em água e facilmente solúvel em etanol, acetona, dioxano e metanol (BERGAMINI,
2008). Possui peso molecular de 392,46 g/mol e deve ser armazenado de 2 a 8 °C, sendo
sensível à luz. Na Figura 7 é representada a estrutura da dexametasona.
Em conjunto com fatores de crescimento, glicocorticoides análogos à dexametasona
possuem um papel central na diferenciação das células-tronco em condrócitos, porém seu
mecanismo de ação preciso de diferenciação ainda não foi completamente elucidado. Seu
efeito condrogênico foi primeiramente reportado em células-tronco mesenquimais derivadas
da medula óssea, quando Yoo (1998) observou que as células tratadas com TGFβ somente se
diferenciaram em condrócitos na presença de dexametasona. Após esta descoberta, diversos
pesquisadores testaram o TGFβ na presença de dexametasona com CTM de diversas origens,
incluindo células do tecido adiposo (ERICKSON et al., 2002), do periósteo (DE BARI;
DELL’ACCIO; LUYTEN, 2001), do líquido sinovial (DE BARI et al., 2001), do tecido ósseo
(NÖTH et al., 2002) e do tecido muscular (MASTROGIACOMO; DERUBEIS;
CANCEDDA, 2005). Entretanto, os autores não testaram se realmente a dexametasona era
necessária para que ocorresse a condrogênese.
Figura 7: Estrutura química da dexametasona (Fonte: DUARTE et al., 2009).
Shintani e Hunziker (2007) demonstraram que explantes sinoviais bovinos se
diferenciavam em condrócitos na presença de BMP-2 somente na ausência de dexametasona.
Kurth e colaboradores (2007) também verificaram que a dexametasona suprimia a ação de
diferenciação do BMP-2 em CTM sinoviais humanas. Estas pesquisas indicaram que a ação
da dexametasona é diferente para cada tipo de célula-tronco mesenquimal estudada e para
cada tipo de fator de diferenciação, sendo necessários estudos específicos para células-tronco
38
dentárias, assim como seu uso em conjunto com a kartogenina. Estratégias que explorem seu
uso direto no meio de cultura e também sua aplicação incorporada em dispositivos de
liberação controlada devem ser também consideradas visando determinar as condições mais
apropriadas de sua utilização.
A incorporação de fármacos em suportes obtidos a partir de polissacarídeos é, na
maioria das vezes, feita pela adição direta do composto à solução polimérica aquosa (PIRES
et al., 2008). No entanto, para compostos que possuem baixa solubilidade em água, como a
dexametasona, esta técnica apresenta desvantagens, como a formação de cristais não
dissolvidos na matriz que influenciam a cinética de liberação e prejudicam as propriedades
mecânicas (DA SILVA et al., 2009) do suporte. Métodos alternativos de incorporação
incluem a impregnação por absorção, na qual o fármaco é dissolvido em um solvente
apropriado (aquoso ou orgânico), o suporte é imerso nesta solução e a impregnação ocorre
durante o intumescimento da matriz (COSTA et al., 2010).
O estudo da cinética de liberação da droga incorporada na matriz pode ser realizado
em meios que simulem as condições de aplicação biológica e pelo ajuste dos dados a variados
modelos matemáticos, visando determinar os mecanismos de liberação, conforme será
abordado no próximo item.
2.2.6 Mecanismos de liberação controlada de fármacos incorporados em matrizes
poliméricas
A liberação de substâncias ativas pode ser resultante de diversos fatores, que incluem a
dissolução, a partição, a difusão e a osmose do fármaco na matriz, o inchaço, a erosão e a
degradação do suporte (SIEPMANN; SIEPMANN, 2012).
A difusão é um dos principais mecanismos de liberação, sendo descrita pela Lei de
Fick. Esta lei define o fenômeno da difusão como um mecanismo de agitação e mistura em
escala molecular. O movimento aleatório e individual das moléculas das substâncias alvo
associado a um gradiente de concentração faz com que, macroscopicamente, resulte em um
fluxo de massa. A difusão pode ser vista como um processo no qual a concentração tende a se
igualar em todos os pontos de cada fase do sistema com o passar do tempo levando a uma
concentração de equilíbrio do soluto entre as fases (HAN, 2000). Assim, a força motriz para a
transferência de massa é a diferença de concentração. Consequentemente, a difusividade do
soluto e sua solubilidade no entorno da matriz são as duas principais interações que governam
39
a taxa de transporte ou liberação no sistema matricial específico e podem ser aplicados para
estimar o perfil de concentração de uma substância ativa no suporte (HAN, 2000).
Sistemas de liberação controlados primariamente por este mecanismo difusivo podem
ser considerados do tipo reservatório, monolíticos ou mistos. Como pode ser visto na Figura
8, estes podem se dividir em outros tipos, dependendo da fonte de atividade para os do tipo
reservatório, e da possível solução ou dispersão do fármaco para os monolíticos.
Figura 8 – Tipos de sistemas com mecanismos de liberação controlados por difusão (adaptada
de SIEPMANN; SIEPMANN, 2012).
Esta categorização dos sistemas de liberação permite avaliar com maior facilidade com
qual tipo de sistema se está trabalhando e entender melhor sua estruturação a partir de sua
liberação.
Um dos principais fatores a ser considerado é o intumescimento da matriz, o qual gera
duas grandes consequências:
i) o aumento do caminho difusivo do fármaco, resultando na diminuição dos
gradientes de concentração, diminuindo sua taxa de liberação.
ii) Aumento significativo da mobilidade das macromoléculas, resultando em um
aumento da taxa de liberação do fármaco.
Dispersões monolíticas
Liberação de Primeira Ordem
Liberação de Ordem Zero
Liberação dependente da
geometria
Sistemas reservatórios
Sistemas monolíticos
Outros sistemas
Membrana controladora da taxa de liberação
Formador da droga e da matriz
Fonte de atividade não constante
Fonte de atividade constante
Soluções monolíticas
Moléculas individuais da droga
Cristais da droga ou agregados amorfos
40
Enquanto o primeiro fator prejudica a liberação, o segundo auxilia a mesma. Portanto,
um balanço entre estes dois fatores deve sempre ser levado em consideração, visto que
dependendo de qual fator prevalecer, este inchaço pode implicar tanto uma melhoria quanto
uma redução da liberação, o que será determinado pelo sistema polimérico utilizado.
A Figura 9 representa de maneira simplificada o que ocorre com a matriz polimérica
intumescida, demarcando as principais seções onde o fármaco encontra-se disperso na região
não intumescida, dissolvido e disperso na região em moderado estágio de intumescimento, e
ainda completamente dissolvido e eventualmente liberado nas demais regiões de fronteira e
alto intumescimento.
Figura 9 – Configurações típicas de matrizes poliméricas intumescíveis durante o processo de
dissolução e transporte do fármaco (adaptada de SIEPMANN; SIEPMANN, 2012).
Devido ao solvente provocar grande aumento de volume no polímero no caso de
matrizes intumescíveis, a difusão muitas vezes não é adequadamente descrita pela lei de Fick,
pois não é o único fenômeno responsável pelo deslocamento do fármaco para a solução
receptora. Assim, diversos modelos matemáticos foram propostos para a análise do
comportamento cinético no desenvolvimento de dispositivos de liberação controlada de
fármacos, vários deles utilizados por Girata (2011) para o ajuste de dados de liberação do
agente antimicrobiano Alphasan RC2000 de matrizes de quitosana e alginato.
Alguns dos modelos de liberação mais aplicados para matrizes poliméricas são os de
ordem zero, de primeira ordem, de Korsmeyer-Peppas (também conhecido como de Peppas
ou modelo de potência), o modelo de Hopfenberg , o de Weibull e o de Higuchi. Estes e
outros modelos são discutidos em detalhes nos trabalhos de Costa (2002) e de Siepmann e
Siepmann (2012).
Seio do Fluido Somente droga dissolvida Droga dissolvida e dispersa
Matriz não intumescidaMatriz intumescida
Fronteira da erosão Fronteira difusional Fronteira de intumescimento
41
Determinados modelos destacam-se no âmbito do trabalho aqui desenvolvido, como
os indicados na Tabela 2. Nestes modelos, o termo Qt/Q∞ refere-se à fração do fármaco
liberada em um dado intervalo de tempo, sendo Qt e Q∞ as quantidades absolutas e
cumulativas de fármaco liberadas no tempo t e no tempo infinito, respectivamente.
Tabela 2 – Exemplos de alguns dos modelos matemáticos mais utilizados para a liberação de
fármacos a partir de matrizes poliméricas (adaptado de COSTA, 2002).
Modelo Equação
Korsmeyer-Peppas
𝑄𝑡
𝑄∞= 𝐾𝑘𝑡𝑛
Higuchi 𝑄𝑡 = 𝐾𝐻√𝑡 = A[D(2C0 - CS)CS t]
0,5
Hopfenberg
𝑄𝑡
𝑄∞= 1 − [
1 − 𝐾0𝑡
𝐶0𝑎0]
𝑛
O modelo de Korsmeyer e Peppas, por exemplo, é um dos mais frequentemente
utilizados devido à sua simplicidade e por seus paramêtros poderem ser utilizados para a
interpretação do mecanismo dominante de liberação ou mesmo resultante da combinação de
dois processos aparentemente independentes: um devido ao transporte do fármaco no interior
da matriz, que obedece às leis de Fick, e outro devido à consequência dos fenômenos de
intumescimento/relaxamento do gel (expansão dinâmica), que envolve a transição de um
estado semirrígido para outro mais flexível.
Na equação de Korsmeyer-Peppas, Kk é uma constante que incorpora características
estruturais e geométricas do sistema, sendo que quanto maior for seu valor, mais rápida é a
liberação do fármaco. O parâmetro n representa o expoente de liberação, o qual indica o tipo
de mecanismo de liberação da droga. Para filmes finos, quando n é menor ou igual a 0,5, a
liberação é controlada por difusão. Quando n é igual a 1, a liberação do fármaco é controlada
pelo intumescimento e corresponde à cinética de ordem zero. Neste caso, o processo de
relaxamento das macromoléculas que ocorre por meio da embebição de água no sistema é o
passo controlador. No caso de n entre 0,5 e 1, a liberação se dá por sobreposição dos dois
fenômenos citados, sendo o mecanismo denominado transporte anômalo. Se o n é igual a 0,5,
o modelo de Korsmeyer-Peppas e o de Higuchi coincidem.
O modelo desenvolvido por Higuchi define que a liberação do fármaco é um processo
42
de difusão dependente da raiz quadrada do tempo, podendo ser utilizado para a liberação a
partir de sistemas matriciais homogêneos esféricos, granulosos planos e granulosos esféricos.
KH é definida como a constante de liberação de Higuchi (COSTA, 2002). No desdobramento
da equação de Higuchi, o termo A refere-se à área da superfície do filme exposta ao meio de
liberação, D à difusividade do fármaco na matriz carreadora, C0 à concentração inicial de
droga na matriz e CS à solubilidade da droga na matriz.
O modelo de Hopfenberg destaca-se por considerar a degradação do sistema de
liberação à medida que esta ocorre. A taxa de liberação é considerada de ordem zero, sendo
confinada à superficie da matriz carreadora, podendo computar, além da dissolução e da
clivagem da matriz, também o seu intumescimento. Neste modelo, o termo K0 é a constante
de erosão do suporte, C0 é a concentração inicial do fármaco na matriz e a0 representa o raio
inicial para esferas e cilindros ou metade da espessura para sistemas planos. O termo n refere-
se a um fator de forma, assumindo o valor de 1 para sistemas planos como filmes, 2 para
cilíndricos e 3 para esféricos.
Para aplicação na engenharia de tecidos, estes sistemas matriciais devem apresentar
características apropriadas, o que significa que devem ser produzidos a partir de materiais
com propriedades também adequadas, algumas das quais serão enfocadas a seguir.
2.3 Polímeros com aplicação na produção de scaffolds
Com o avanço da engenharia de tecidos, diversos materiais têm sido amplamente
estudados com o intuito de aprimorar as características de scaffolds e outros tipos de
biomateriais que possam ser aplicados com sucesso na terapia de lesões em tecidos
cartilaginosos. Por biomateriais entende-se, no contexto do presente trabalho, os produtos que
entram em contato direto com sistemas biológicos, podendo ter diversas aplicações, por
exemplo, como dispositivos para a liberação controlada de drogas e como materiais
implantáveis para a fixação e mesmo a substituição de tecidos. Os biomateriais podem ser de
origem sintética ou natural e são encontrados em diversos formatos, como por exemplo,
sólidos, géis e líquidos (PIRES; BIERHALZ; MORAES, 2015).
Dentre os componentes sintéticos, os compostos mais utilizados para a produção de
suportes são os poli(α-hidroxi ésteres), sendo suas utilizações clínicas aprovadas pelo FDA.
Dentre os poli(α-hidroxi ésteres), o poli(ácido glicólico) (PGA), o poli(ácido láctico) (PLA), o
poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e a poli(ε-caprolactona) (PCL) têm sido
43
exaustivamente investigados para a utilização na engenharia de tecidos cartilaginosos (KUO;
LI; TUAN, 2013).
A PCL é o poliéster biodegradável mais utilizado em aplicações médicas devido à sua
baixa taxa de degradação, elevada biocompatibilidade, propriedades mecânicas e flexibilidade
estrutural apropriadas. Além disso, os produtos de degradação da PCL são considerados
pouco nocivos, visto que são metabolizados pelo ciclo do ácido tricarboxílico
(CHRISTENSEN et al., 2012).
Os biopolímeros naturais, tanto os baseados em proteína quanto os baseados em
carboidratos, têm sido amplamente pesquisados como compostos de constituição desde uma
longa data. A vantagem da utilização de biopolímeros naturais é que eles possuem domínios
moleculares biofuncionais que podem melhorar as atividades celulares, como adesão celular e
migração (KUO; LI; TUAN, 2013).
Dentre os biopolímeros protéicos, o colágeno tipo I é comumente usado na
constituição de scaffolds para o reparo de cartilagem. A fibrina, um biopolímero encontrado
em coágulos sanguíneos, também foi utilizada recentemente no reparo cartilaginoso, porém na
forma de cola para assegurar que os scaffolds implantados se fixassem de maneira eficiente no
local implantado (WORSTER et al., 2000).
Já dentre os biopolímeros baseados em carboidratos, o alginato é um exemplo de
polissacarídeo utilizado no reparo da cartilagem devido principalmente à sua capacidade de
formar géis na presença de cátions divalentes, como por exemplo o cloreto de cálcio. Isso
possibilita a encapsulação de células na matriz, permitindo que os condrócitos mantenham seu
formato esférico (LIU; LEE; DEAN, 1998). Entretanto, sua taxa de degradação é muito baixa,
o que gera uma reposta imune in vivo inapropriada (PIER et al., 1994), além de que, se
utilizado com cálcio, pode aumentar a severidade da osteoartrite através da degradação da
matriz extracelular, visto que ocorre uma hipertrofia dos condrócitos diferenciados na
presença de cristais de cálcio (FUERST et al., 2009).
Outro polissacarídeo utilizado é a agarose. Este composto foi empregado
exaustivamente como scaffold para rediferenciação de condrócitos ou diferenciação de CTMs
em condrócitos ex vivo (HUANG et al., 2004). Entretanto, assim como o alginato, sua taxa de
degradação é lenta, podendo provocar resposta imune indesejável (COOK et al., 2003).
O polissacarídeo mais utilizado na engenharia de tecido cartilaginoso é o ácido
hialurônico. Ele é o principal componente da matriz extracelular da cartilagem, o que torna
sua utilização como scaffold biologicamente compatível. Entretanto, sua característica
44
mecânica não é favorável, o que torna seu uso na forma nativa, inapropriado (KUO; LI;
TUAN, 2013).
A quitosana é um tipo de polissacarídeo comumente encontrado no exoesqueleto de
crustáceos. Ela possui uma alta densidade de cargas positivas, o que permite sua interação
com diversos polímeros aniônicos, como por exemplo, a xantana (PIRES; BIERHALZ;
MORAES, 2015). Além disso, sua excelente biocompatibilidade e facilidade de manipulação
a torna uma grande promessa na engenharia de tecido cartilaginoso (KUO; LI; TUAN, 2013).
A goma xantana (GX) é um heteropolissacarídeo natural, composto por cinco unidades
monossacarídicas (SHAO et al., 2013). Segundo Shao et al. (2013), a injeção intra-articular
de GX protege a cartilagem articular em modelos animais com OA da degradação induzida
por papaína, o que leva a crer que este biopolímero seja um excelente candidato para a
produção de scaffolds visando à regeneração de cartilagem.
A poli(caprolactona), a quitosana e a goma xantana serão, então, mais profundamente
discutidas a seguir, visto que são objeto de estudo no presente trabalho.
2.3.1 Poli(caprolactona) (PCL)
A poli(caprolactona) é definida como um poliéster sintético biodegradável derivado de
síntese química a partir de petróleo bruto. Os solventes mais utilizados para solubilizar a PCL
são clorofórmio, diclorometano, tetracloreto de carbono, benzeno, tolueno, ciclohexanona e 2-
nitropropano, visto que podem ser empregados em temperatura ambiente. Já nos solventes
como a acetona, 2-butanona, etil acetato dimetilformamida e acetonitrila, a PCL possui baixa
solubilidade. É considerada como praticamente insolúvel em água, álcool, éter de petróleo e
éter dietílico (MOHAMED; YUSOH, 2015).
Este polímero é hidrofóbico, semicristalino, com temperatura de transição vítrea (Tg)
de -60 °C e temperatura de fusão entre 59 e 64 °C. Sua massa molar geralmente varia de
3.000 a 90.000 g/mol, sendo que a cristalinidade tende a diminuir com o aumento da massa
molar (MOHAMED; YUSOH, 2015). A estrutura da PCL é mostrada na Figura 10.
O processo de degradação da PCL é considerado lento, característica que favorece a
utilização na liberação controlada de fármacos, visto que o polímero permanece ativo por
mais de um ano no local implantado (SULTANA, 2013). Frente a isso, o FDA aprovou a
utilização da PCL para esta finalidade e para utilização em outros tipos de dispositivos
médicos (KYRIAKIDOU et al., 2008). Luong-Van e colaboradores (2006) demonstraram que
45
a incorporação de heparina em suportes de PCL obtidos pela técnica de eletrofiação resulta
em liberação controlada do fármaco em lesões vasculares de maneira eficiente.
Figura 10 - Estrutura química da poli(caprolactona).
O processo de liberação controlada de compostos incorporados em matrizes de PCL
pode estar ligado ao processo de degradação polimérica. A degradação da PCL é dividida em
duas fases. Na primeira, ocorre cisão aleatória da cadeia hidrolítica, o que resulta em redução
da massa molecular do polímero. Na segunda fase, os fragmentos de baixa massa molecular e
as pequenas partículas de polímero são levadas para locais distantes da implantação por
solubilização nos fluidos corpóreos ou por fagocitose, o que resulta em redução do tamanho
das cadeias. O processo de degradação e eliminação da PCL pelo organismo pode levar de
dois a quatro anos para ser concluído (DUMITRIU; POPA, 2013).
A elevada solubilidade da PCL em variados solventes, assim como seu baixo ponto de
fusão e compatibilidade apropriada para formação de blendas, têm estimulado seu uso em
pesquisas na área biomédica (MOHAMED; YUSOH, 2015). No caso de scaffolds, a PCL
pode ser utilizada em pesquisas para regeneração de tecidos da pele, ossos, cartilagem e
fígado (WILLIAMS et al., 2005; CHUNG; BURDICK, 2007; LEEA; SHIN, 2007).
Khor e colaboradores (2002) desenvolveram suportes de PCL para o cultivo e
proliferação de queratinócitos humanos. Os resultados indicaram que os suportes foram
capazes de prover superfícies adequadas para a adesão e proliferação das células, podendo ser
aplicados como matrizes na engenharia de tecidos.
Martins et al. (2010) desenvolveram scaffolds de PCL eletrofiados contendo diferentes
concentrações de dexametasona para diferenciação de células-tronco da medula óssea em
osteoblastos. A bioatividade da dexametasona frente as células mesenquimais foi obtida nos
scaffolds com 15% (m/v) do fármaco quando cultivadas em meio osteogênico na ausência do
mesmo, indicando que o scaffold é eficiente para diferenciação celular.
Salgado et al. (2012) produziram suportes de quitosana complexada com PCL em
diferentes proporções do surfactante Pluronic F68®. Os resultados mostraram que os suportes
46
produzidos apresentaram baixa citotoxicidade e, os que continham Pluronic F68®,
estimularam a proliferação celular. A biodegradabilidade e biocompatibilidade dos suportes
foram consideradas satisfatórias e, portanto, apresentaram aplicação potencial na terapia de
lesões.
Tornello e colaboradores (2012) produziram suportes porosos e não porosos de PCL,
obtidos por eletrofiação e evaporação do solvente, respectivamente. O agente antimicótico
embelina foi incorporado nos suportes. A liberação do fármaco foi maior para os suportes
porosos, sendo 90% do fármaco liberado em 12 horas, enquanto que a mesma quantidade foi
liberada em 72 horas pelos suportes não porosos.
Vacanti e colaboradores (2012) desenvolveram scaffolds eletrofiados constituídos de
poli(ácido lático) (PLLA) e PCL contendo dexametasona com o objetivo de diminuir a
resposta inflamatória no local de implantação. A análise dos implantes subcutâneos
demonstrou que as fibras que continham o anti-inflamatório geravam resposta inflamatória
menos severa que as que não possuíam o fármaco, indicando que a incorporação de
dexametasona em scaffolds possui, além de propriedades de diferenciação celular, a
capacidade de diminuir uma possível rejeição do suporte pelo organismo.
Kharaziha e colaboradores (2015) também desenvolveram suportes constituídos de
PCL, porém com diferentes proporções de forsterita (0, 5 e 10% m/v) e encapsularam
dexametasona com o intuito de regeneração óssea. Os resultados demonstraram que a
liberação de dexametasona foi mantida por 21 dias e que a cinética de liberação era governada
pela composição do suporte. Além disso, o processo de diferenciação osteogênica dependia da
liberação da dexametasona, visto que enquanto a proliferação celular diminuía com a
liberação do fármaco, a mineralização da matriz era estimulada, ocorrendo assim a
diferenciação celular em osteoblastos. Os dados de liberação obtidos para o controle (PCL
sem forsterita) foram de 44% de dexametasona em aproximadamente dez dias.
Diante do exposto, a PCL pode ser considerada uma alternativa promissora para a
produção de scaffolds porosos para CTM dentárias visando à aplicação na engenharia do
tecido cartilaginoso.
2.3.2 Quitosana
A quitosana é um copolímero policatiônico de N-acetil-glicosamina e N-glicosamina,
sendo geralmente obtida a partir da desacetilação alcalina da quitina. A quitina se relaciona
47
estruturalmente aos glicosaminoglicanos, porém não possui os grupos de ácido urônico. Ela é
o componente primário das paredes celulares de fungos e também do exoesqueleto de
crustáceos, como camarão, caranguejo, e lagosta (KHOR; LIM, 2003). Quando o grau de
desacetilação é maior que 50%, a quitina passa a ser denominada como quitosana. As
estruturas químicas da quitina e da quitosana são mostradas na Figura 11.
Figura 11 – Estruturas químicas da quitina e da quitosana: (a) quitina ou poli(N-acetil-β-D
glicosamina); (b) quitosana ou poli(D-glicosamina); (c) quitosana parcialmente acetilada (DA
– grau de acetilação) (Fonte: RINAUDO, 2006).
Dependendo do valor do grau de acetilação, o pKa da quitosana pode variar de 6,3 a
7,3 (KARAKEÇILI et al., 2007). A conformação e o grau de distensão das cadeias também
dependem do grau de acetilação e da força iônica das soluções diluídas.
Este biopolímero é solúvel em soluções ácidas diluídas, como de ácido acético, visto
que os grupamentos amina ficam protonados nestas condições (JIANG et al., 2015). Devido à
natureza catiônica da quitosana, ela possui a capacidade de se ligar a outros polímeros
aniônicos, formando uma rede iônica interconectada (PRESTWICH; ATZET, 2013). A
quitosana pode ser metabolizada por enzimas humanas, como a lisozima, sendo assim
considerada biodegradável. A taxa de degradação depende do tipo de rede formada com
48
outros biopolímeros, devido principalmente às ligações covalentes formadas (FREIER et al.,
2005). Uma das grandes vantagens de utilização da quitosana refere-se à grande quantidade
de grupos amina e hidroxila livres, que permitem diversas modificações químicas funcionais
(BERGER et al., 2005).
Além disso, a quitosana possui atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de
diversos tipos de microorganismos, como E. coli, Fusarium, Alternaria, Helmintho sporium,
S. epidermidis, P. aeruginosa, S. pyogenes, K. pneumoniae, S. aureus, S. faecalis, Shigella
dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Coliforms,
Vibrio, Agrobacterium tumefaciens, Corynebacterium michiganence, Erwinia sp.,
Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Xanthomonas campestris, Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum, Drechslera sorokiniana, Micronectriella nivalis, Procularia oryzae,
Rhizoctonia solani, Tricophyton equinum e Candida (SILVA; SANTOS; FERREIRA, 2006).
A atividade anti-microbiana da quitosana é atribuída a seus grupos amínicos que, em contato
com os fluidos fisiológicos, provavelmente são protonados e se ligam a grupos aniônicos da
superfície desses microrganismos, resultando na aglutinação das células microbianas e
inibição de seu crescimento (SILVA; SANTOS; FERREIRA, 2006).
Também é atribuída à quitosana potente ação analgésica tópica, sendo esta decorrente
principalmente da captura de íons hidrônio liberados no local da inflamação, através da
ionização do grupo amino a -NH3+
(OKAMOTO et al., 2003). A bradicinina, mediador
químico liberado pela clivagem do cininogênio plasmático e por citocinas, parece ser
particularmente importante na geração da dor no local inflamado (SILVA; SANTOS;
FERREIRA, 2006). A quitosana teria a propriedade de absorver a bradicinina liberada no sítio
da inflamação, diminuindo a dor.
Duarte et al. (2009) desenvolveram um suporte de quitosana impregnado com
dexametasona e observaram que a liberação do fármaco a partir da matriz apresentou perfil
contínuo, o que se considerou adequado para aplicações na engenharia de tecidos. Além disso,
os autores concluíram que há o estabelecimento de ligações de hidrogênio entre as hidroxilas
da dexametasona e as aminas da quitosana.
A quitosana é um dos diversos biopolímeros disponíveis que têm sido extensamente
investigada na produção de sistemas de liberação controlada de drogas e de scaffolds para
uma grande diversidade de tipos celulares (KANG et al., 2014), sendo seu uso na constituição
de biomateriais já bem consolidado.
49
2.3.3 Goma Xantana
A goma xantana é um heteropolissacarídeo ramificado produzido pela bactéria
Xanthomonas campestris sp. Dependendo da cepa microbiana e das condições de fermentação
pode-se obter gomas xantanas com estruturas moleculares diferentes quanto às proporções de
unidades de carboidratos tanto na cadeia principal quanto na cadeia lateral (ARGIN-
SOYSAL; KOFINAS; LO, 2009). Geralmente, sua estrutura primária consiste em cinco
unidades repetidas de carboidrato, duas de β-D-glicose ligadas à cadeia principal nas posições
1 e 4, duas unidades de manose e uma de ácido glicurônico (ARGIN-SOYSAL; KOFINAS;
LO, 2009). Em suas cadeias laterais, existem grupos de ácido pirúvico e acetil. A
desprotonação destes grupos é aumentada em pH acima de 4,5, causando um aumento na
carga negativa ao longo das cadeias da xantana (BUENO; PETRI, 2014). A presença dos
resíduos de ácido pirúvico e acético nas cadeias laterais torna a goma xantana um polímero
aniônico natural (LUO; WANG, 2014). Na Figura 12 mostra-se a estrutura típica da goma
xantana.
Figura 12 – Estrutura química típica da goma xantana (adaptada de MORRIS; HARDING,
2009).
50
A produção mundial da goma xantana tem aumentado de maneira considerável, a uma
taxa anual de 5 a 10%, e compreende 15,6% da pauta de importações brasileira de
polissacarídeos (CUNHA; PAULA; FEITOSA, 2009). Isso se deve a suas atrativas
propriedades reológicas que conferem à xantana variadas aplicações em diversas industriais,
incluindo a alimentícia, farmacêutica, cosmética, entre outras (LUO; WANG, 2014). Outras
características relevantes da xantana são sua não toxicidade, sua estabilidade na presença da
maioria dos sais metálicos, sua elevada solubilidade e estabilidade tanto em meio ácido
quanto alcalino, sua resistência à degradação em elevadas temperaturas assim como a
oscilações de pH (FARIA, 2005). Este composto foi aprovado pelo FDA na indústria
alimentícia e farmacêutica em quantidades ilimitadas já em 1968 (LUO; WANG, 2014).
A molécula de xantana é grande e rígida, gerando soluções com viscosidades elevadas,
sendo este um dos polissacarídeos com maior solubilidade em água. Estas características
tornam a xantana um polímero ideal para ser utilizado como agente de suspensão e espessante
(MORRIS; HARDING, 2009).
Segundo estudos recentes de Han e colaboradores (2014), a injeção intra-articular de
goma xantana na cartilagem protege e reduz a velocidade de avanço da osteoartrite. Além
disso, injeções intra-articulares de xantana uma vez a cada duas semanas, no decorrer de cinco
semanas, inibiram significativamente a apoptose de condrócitos e a expressão de
metaloproteínases-1 e -3 e também aumentaram a produção de inibidores dessas enzimas na
cartilagem.
Shao e colaboradores (2013) mostraram que a administração local de xantana reduz a
dor na OA e também diminui a degradação da cartilagem, corroborando com os resultados
obtidos por Han e colaboradores (2014).
2.3.4 Complexo polieletrólito de quitosana-xantana
Complexos macromoleculares não-covalentes compostos por diferentes polímeros se
conectam por interações intermoleculares, como ligações de hidrogênio, forças de Coulomb e
forças de van der Waals. Tais complexos podem ser divididos de acordo com a natureza das
interações em complexos polieletrólitos, complexos de transferência de carga, complexos de
ligação de hidrogênio e estereocomplexos (DUMITRIU; CHORNET, 1998).
Os complexos polieletrólitos (PEC) são formados pela associação entre moléculas de
cargas opostas, como de polímero-polímero, polímero-droga e polímero-droga-polímero.
51
Estas reações ocorrem devido às interações eletrostáticas entre poliíons de cargas opostas,
permitindo a utilização adicional de agentes reticuladores químicos, reduzindo assim a
possibilidade de citotoxicidade e de outros efeitos indesejáveis dos polímeros
(LANKALAPALL; KOLAPALLI, 2009). Além disso, os complexos polieletrólitos formados
entre um poliácido e uma polibase são apenas discretamente afetados pelas oscilações de pH
no meio de dissolução e geralmente são pouco solúveis em água, visto que as interações
eletrostáticas são consideradas mais fortes que as demais interações secundárias existentes
(LANKALAPALL; KOLAPALLI, 2009 e ARGIN-SOYSAL; KOFINAS; LO, 2009).
A propriedade da quitosana de apresentar grupamentos amina carregados em valores
de pH abaixo de seu pKa permite que ela se ligue a materiais carregados negativamente como
enzimas, células, diversos tipos de polissacarídeos, ácidos nucleicos, cabelo e pele. Assim, é
possível formar um complexo polieletrólito entre a quitosana e a xantana, por meio de
interações iônicas entre os grupos amina da quitosana e carboxila da xantana, conforme
indicado na Figura 13 (ARGIN-SOYSAL; KOFINAS; LO, 2009).
A rede de hidrogel formada entre a quitosana e a xantana é uma candidata promissora
para a liberação controlada de fármacos, visto que os metabólitos produzidos durante sua
degradação são atóxicos e o complexo possui elevada resistência à degradação por enzimas
(ARGIN-SOYSAL; KOFINAS; LO, 2009), tendo já sido explorado com sucesso em outros
trabalhos da equipe para a incorporação de fármacos destinados à terapia de lesões de pele
(VEIGA, 2012; SOUZA, 2014).
Figura 13 - Representação esquemática da interação entre xantana e quitosana na formação de
hidrogéis (fonte: CHELLAT et al., 2000).
Diversos géis compostos pelo PEC de xantana e quitosana podem ser obtidos através
da alteração das propriedades moleculares dos polímeros, tais como a massa molar, o grau de
acetilação da quitosana, a quantidade de ácido pirúvico da xantana, bem como a alteração das
52
condições de complexação, tais como o pH da solução de quitosana, a concentração dos
polímeros, o tempo de complexação e a proporção dos componentes da mistura (DUMITRIU,
2002).
Veiga e Moraes (2011) estudaram a formação de membranas por complexação de
quitosana e xantana empregando diferentes concentrações de polissacarídeos a diferentes
taxas de adição de quitosana em seus estudos. Os resultados demonstraram que é possível
produzir membranas com altas capacidades de absorção e drenagem sem perda de massa
significativa quando expostas a soluções aquosas.
Bellini e colaboradores (2012), também estudaram o efeito de diferentes
concentrações dos polímeros quitosana e xantana para a obtenção de membranas, sendo que a
proporção mássica de 1:1 foi a de melhor resultado para a utilização das membranas como
curativos para feridas de pele. Também foram testadas membranas porosas obtidas a partir da
adição de Pluronic F-68 nas misturas com diferentes proporções poliméricas, e a razão
mássica de 1:1 dos polímeros resultou em características favoráveis para a utilização das
membranas como scaffolds.
2.3.5 Agentes porogênicos
A formação de uma estrutura porosa é uma das principais metas na fabricação de
scaffolds. Estruturas porosas são criadas quando partículas ou bolhas são introduzidas
enquanto o scaffold se solidifica, sendo posteriormente removidas, gerando uma rede
interconectada de poros (SARKAR et al., 2013). A maioria das técnicas de fabricação de
scaffolds porosos, incluindo lixiviação de partículas, liofilização, infusão de gás, e separação
de fases, criam poros interconectados distribuídos isotopicamente (SARKAR et al., 2013).
A liofilização é um dos métodos mais comumente utilizados para a produção de poros
em scaffolds (KUCHARSKA et al., 2008). Entretanto, trata-se de um método oneroso,
trabalhoso e de difícil escalonamento (BUENO; MORAES, 2011). Desta forma, outras
estratégias para a elaboração de scaffolds porosos são de grande interesse, como através da
adição de tensoativos como Tween 80 e Pluronic F-68 à mistura reacional dos polissacarídeos
(BUENO; MORAES, 2011). A adição de tensoativos a polímeros também é muitas vezes
realizada para promover homogeneização, emulsificação, suspensão, controle da reologia e
melhora da estabilidade coloidal (HOLMBERG et al., 2002).
O Pluronic F-68, atualmente comercializado como Poloxamer 188, pertence à classe
53
de surfactantes não-iônicos, considerados menos prejudiciais, e usados como aditivo em
formulações cosméticas e no preparo de emulsões tópicas (ZHANG et al., 2003). Sendo
assim, o Poloxamer 188 foi selecionado para o desenvolvimento deste trabalho e será mais
detalhadamente descrito a seguir.
2.3.5.1 Poloxamer 188
Poloxamers são copolímeros sintéticos compostos por três blocos: uma cadeia central
hidrofóbica de poli(oxi propileno) (PPO) e duas cadeias laterais hidrofílicas de poli(oxi
etileno) (PEO), conforme demonstrado na Figura 14.
Figura 14 – Estrutura química típica de poloxamers: PEO definido por polioxietileno e PPO
definido por polioxipropileno (adaptada de SANTANDER-ORTEGA et al., 2006).
Este arranjo resulta em uma estrutura anfifílica, sendo sua massa molar,
hidrofilicidade e hidrofobicidade variáveis através da alteração do número de cadeias laterais
da molécula. Uma enorme variedade de poloxamers teve sua fabricação iniciada nos anos 50 e
disponibilizada comercialmente pela empresa BASF Corporation, com o nome comercial de
Pluronic® (MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012).
O Poloxamer 188 (P188), além de ser também conhecido como Pluronic® F-68, é
denominado comercialmente como Kolliphor® P188 (Sigma-Aldrich), Flocor
TM (CytRx
Corporation), RheothRx (Glaxo Wellcome Inc.), Lutrol® (Basf) e Synperonic F-68 (Croda),
sendo um copolímero linear com massa molar de aproximadamente 8400 Daltons, contendo
cerca de 80% de poli(oxi etileno) e 20% de poli(oxi propileno). Este surfactante é um
excipiente aprovado pela FDA há cerca de 50 anos, sendo solúvel tanto em água quanto em
solventes orgânicos diversos, muito utilizado em dispersões sólidas para melhorar a
solubilidade de fármacos (MA; SONG, 2007).
Em estudos clínicos de fase I, o Poloxamer 188 mostrou uma meia-vida de 18 horas e
PEO PEOPPO
54
demonstra ser seguro em períodos de exposição por infusão superiores a 72 horas em doses a
partir de 30 mg de Poloxamer 188 por quilograma do paciente por hora (MOLOUGHNEY;
WEISLEDER, 2012). É bem tolerado em exposições repetidas e é comumente utilizado em
diversos produtos, como pasta de dente, laxantes e enxaguantes bucais. Suas propriedades
fazem deste copolímero um composto muito útil em aplicações cosméticas e farmacêuticas
(MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012).
A característica mais bem documentada do P188 é sua habilidade de reparar
membranas celulares degradadas através de mecanismos que ainda não foram totalmente
elucidados. O surfactante pode agir aumentando o empacotamento lipídico, pois se acredita
que ele é incorporado diretamente na bicamada lipídica, sendo o processo modulado pela
tensão superficial da membrana, como demonstrado em alguns estudos in vitro utilizando
monocamadas lipídicas (MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012).
Além de apresentar características crioprotetoras, recentes estudos comprovam a
atividade promotora de crescimento celular do P188. Clincke e colaboradores (2011)
demonstraram que a adição de Pluronic F-68 em meio de cultura para células CHO em
sistemas estáticos e agitados estimula o crescimento celular, aumenta a viabilidade, reduz a
taxa de lise celular em até quatro vezes e ainda proporciona um aumento da produção de γ-
interferon.
O Poloxamer P188 é utilizado intensivamente pela indústria de biofármacos como
agente protetor das células em cultivo em biorreatores do tipo tanques agitados, por propiciar
sua proteção efetiva contra estresse mecânico, podendo ser empregado com sucesso na
constituição de membranas porosas de quitosana complexada com xantana úteis no cultivo de
células mesenquimais estromais para o tratamento de lesões de pele (BELLINI et al.; 2015).
2.4 Colocação do problema
Frente às lacunas detectadas na revisão bibliográfica realizada, identifica-se que
muitos obstáculos ainda são enfrentados na produção de scaffolds para regeneração de
cartilagem, como a dificuldade de suprimento de nutrientes nas partes centrais das matrizes,
poucas opções para o monitoramento do comportamento celular na matriz, dificuldade de
manutenção da produção da cartilagem hialina (BANDEIRAS, et al., 2015) e o fato de que a
ação da dexametasona é diferente para cada tipo de célula-tronco mesenquimal estudada e
para cada tipo de fator de diferenciação, sendo necessários estudos específicos para células-
55
tronco dentárias, assim como seu uso em conjunto com a kartogenina.
Desta maneira, verifica-se a importância do desenvolvimento de scaffolds porosos
alternativos constituídos por substâncias biocompatíveis e sua associação a compostos que
estimulem a diferenciação de células-tronco em condrócitos para o tratamento da osteoartrite.
Suportes de quitosana-xantana apresentam potencial aplicação no tratamento de lesões
de pele com alta produção de exsudato. Bellini et al. (2015) utilizaram suportes de quitosana-
xantana porosos como scaffolds, obtendo resultados satisfatórios na engenharia de tecido
dérmico. Porém, não foram localizados trabalhos referentes à associação destes scaffolds a
células multipotentes derivadas da polpa dentária, à kartogenina e à dexametasona como
fatores de diferenciação para o tratamento de tecido cartilaginoso.
Para suportes constituídos de PCL, também não se localizou na literatura associação
com o fator de diferenciação kartogenina. Desta forma, optou-se por analisar o potencial uso
de suportes poliméricos porosos, obtidos pela complexação de xantana e quitosana e por
eletrofiação de PCL incorporando ou não dexametasona, na presença ou não de kartogenina,
como scaffolds para adesão, multiplicação e diferenciação de células-tronco mesenquimais da
polpa dentária, destinados ao uso terapêutico em lesões cartilaginosas, como a osteoartrite.
56
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes
3.1.1 Polímeros
Para a produção dos suportes foram utilizados os polímeros quitosana de média massa
molecular (190 a 310 kDa) com grau de desacetilação de 75% (Sigma-Aldrich Co.; lote
#STBF3507V; referência do produto: 448877), a goma xantana de Xanthomonas campestris
(Sigma-Aldrich Co.; lote #108K0038; referência do produto: G1253) e a poli(caprolactona)
(Sigma-Aldrich Co.; lote #MKBJ4388V; massa molecular de 70.000 a 90.000 g/mol,
referência do produto: 440744).
3.1.2 Reagentes para cultivo e análise do comportamento celular
1) Ácido ascórbico (Sigma-Aldrich Co.);
2) Ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico (Sigma-Aldrich Co.);
3) Ácido pícrico (Sigma-Aldrich Co.);
4) Azul de anilina (Sigma-Aldrich Co.);
5) Azul de Trypan (Sigma-Aldrich Co.);
6) Brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-ila)-2,5-difeniltetrazólio) (MTT) (Sigma-Aldrich Co.);
7) Dexametasona (Sigma-Aldrich Co.).
8) Dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich Co.);
9) Dodecil sulfato de sódio (SDS) (Synth);
10) Escarlate de Biebrich (Qeel)
11) Estreptomicina e penicilina (Sigma-Aldrich Co.);
12) Formaldeído (Sigma-Aldrich Co.);
13) Formol (Sigma-Aldrich Co.);
14) Fosfomolíbdico (Inlab);
15) Fucsina ácida (Synth);
16) Glutaraldeído a 25% (m/v) (Dinâmica);
17) Insulina recombinante humana e transferrina humana (ITS) (Sigma-Aldrich Co.);
18) Kartogenina (Sigma-Aldrich Co.);
57
19) Meio de cultura DMEM alta glicose (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco);
20) Papel para permanente lavável (Santa Clara);
21) Parafina para histologia (Merck);
22) Paraformaldeído (Synth);
23) PBS (tampão fosfato salino) (Sigma-Aldrich Co.);
24) Prolina (Sigma-Aldrich Co.);
25) Soluções A e B de hematoxilina férrica de Weigert (Sigma-aldrich Co.)
26) Soro fetal bovino (SFB) (Sigma-aldrich Co.)
27) Tricrômico de Masson (Sigma-Aldrich Co.);
28) Tripsina bovina/EDTA (ácido etileno-diamino-tetracetato-dissódico) a 0,25% (m/v)
(Gibco);
29) Xilol (MBF).
3.1.3 Outros reagentes
1) Ácido acético glacial (Synth);
2) Clorofórmio (Sigma-Aldrich Co.);
3) Etanol (Sigma-Aldrich Co.);
4) Isopropanol (Sigma-Aldrich Co.);
5) Metanol (Sigma-Aldrich Co.);
6) Poloxamer 188 (Sigma-Aldrich Co.);
7) Tampão Hepes 10 mmol/L (Sigma-Aldrich Co.).
3.1.4 Células-tronco mesenquimais
As células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana foram cedidas pela
empresa R-Crio®, que por sua vez as obteve a partir de uma amostra padronizada adquirida da
empresa Lonza, correspondente ao código de produto PT-5025, lote 0000361150, e as
armazenava em criotudos em nitrogênio líquido no banco de células.
58
3.2 Métodos
3.2.1 Preparação dos suportes poliméricos de Quitosana-Xantana
Para obtenção dos suportes de quitosana-xantana foram realizadas adaptações no
protocolo descrito por Bellini et al. (2012). Foram preparados suportes porosos, perfurados ou
não para aumentar sua permeabilidade, na razão mássica de 1:1 de quitosana e xantana. As
soluções empregadas foram xantana a 1% (m/v) em água deionizada (sistema Milli-Q,
Millipore) (pH = 7,7) e quitosana a 1% (m/v) em solução aquosa de ácido acético a 1% (v/v).
Adicionou-se 15 mL do surfatante Poloxamer P188 a 200 mL de solução de xantana visando a
formação de poros.
No protocolo executado, 200 mL da solução de quitosana foram adicionados a 200 mL
da solução de xantana contendo o surfactante com auxílio de uma bomba peristáltica Gilson,
modelo Minipuls 3, a uma vazão de 10 mL/min. A mistura ocorreu em um reator cilíndrico de
aço inoxidável encamisado com diâmetro interno de 10 cm e altura de 20 cm e fundo chato.
Durante a adição da solução de quitosana à solução de xantana, o sistema foi mantido sob
agitação de 1000 rpm com auxílio de um agitador mecânico Q-251 D da marca Quimis, com
hélice do tipo naval de pás inclinadas de raio de 3 cm, a cerca de 4 cm de distância da base do
reator. A temperatura do sistema foi controlada em 25,0 °C com auxílio de um banho
termostático (Q-214 M2, Quimis).
Após a adição da solução de quitosana à solução de xantana, a taxa de rotação foi
aumentada para 1200 rpm, assim permanecendo por 10 minutos. A seguir, a mistura foi
dividida igualmente em termos mássicos em duas placas de Petri de poliestireno de 15 cm de
diâmetro e levada à estufa com circulação de ar (modelo 410D, Nova Ética) à temperatura
constante de 37,0°C, por aproximadamente 48 horas. Em seguida, os suportes foram lavados
em água deionizada através de sua imersão em 200 mL do solvente durante 30 minutos e, em
seguida, foi realizada sua imersão em 200 mL de tampão Hepes 10 mmol/L por 30 minutos
por duas vezes e, novamente em 200 mL de água por 30 minutos. Com este procedimento,
efetuou-se simultaneamente a remoção do tensoativo dos suportes e sua neutralização. Após
as lavagens, os suportes passaram ou não por um processo de perfuração através de agulhas
hipodérmicas de 0,30 x 13 mm (BD Precision Glide). Para tal, foi montada uma estrutura com
diâmetro de 15 cm contendo aproximadamente 250 agulhas hipodérmicas fixadas com cola de
cianoacrilato e dispostas a uma distância de 1 cm uma da outra, conforme demonstrado na
59
Figura 15. Após o processo de lavagem dos suportes porosos, esta estrutura foi pressionada
contra o suporte, visando aumentar a intercomunicação transversal dos poros. Feito isso, os
suportes foram novamente secos em estufa com circulação de ar a 37,0 ºC por um período de
aproximadamente 48 horas. Alternativamente à neutralização dos suportes após a secagem
inicial, testou-se também um procedimento no qual as amostras foram neutralizadas
imediatamente após a adição da solução de quitosana à solução de xantana, visando a
eliminação da etapa de lavagem com tampão Hepes e água. Para tal, adicionou-se 2 mL de
NaOH 2M após todo volume de quitosana ser acrescentado à solução de xantana e seguiu-se
com o procedimento conforme já descrito anteriormente.
Figura 15 – Vista lateral do dispositivo utilizado para perfuração das membranas porosas.
3.2.2 Incorporação de dexametasona por impregnação em solução hidroetanólica nos
suportes de quitosana-xantana
O intuito deste ensaio foi obter suportes de quitosana-xantana com dexametasona
incorporada em quantidade suficiente para a diferenciação das células-tronco mesenquimais
dentárias em condrócitos que foram cultivadas na estrutura tridimensional.
Como durante o processo de sua produção os suportes precisam ser submetidos ao
processo de lavagem para neutralização do pH, optou-se por utilizar para estas matrizes
somente o método de impregnação empregando solução água/etanol na proporção de 5:95%
(v/v) contendo a dexametasona dissolvida, visto que se este composto fosse adicionado
diretamente à mistura polimérica, poderia ser liberado durante o processo de lavagem, ficando
indisponível para as células durante o cultivo.
60
A incorporação de dexametasona por impregnação foi realizada por imersão dos
suportes de QX e QXp já prontos e secos em solução água/etanol na proporção de 5:95% (v/v)
contendo dexametasona na concentração de 0,06 mg/mL. Para determinação da concentração
a ser utilizada, levou-se em consideração a solubilidade da dexametasona em etanol
(25 mg/mL à 25 °C), considerando-se também o princípio de evitar o uso de quantidades
excessivas do composto ativo.
Neste procedimento, realizado em triplicata, amostras de 1 cm2 dos suportes foram
previamente armazenados e pesados em condições de baixa umidade relativa para que
apresentassem capacidade máxima de absorção quando expostos à solução de dexametasona.
As amostras foram incubadas em estufa por 1 hora com 4,0 mL de solução contendo ou não
(branco) o composto ativo. A temperatura utilizada foi de 25,0 ºC, e o sistema foi agitado na
taxa de 170 rpm.
3.2.2.1 Análise da eficiência de incorporação de dexametasona incorporada nos suportes de
QX e QXp
O cálculo da eficiência de incorporação de dexametasona incorporada foi realizado a
partir da determinação da quantidade de composto ativo presente na solução remanescente por
espectrofotometria à 242 nm, através da interpolação dos dados em uma curva de calibração
apropriada.
Como a concentração inicial da solução de incorporação era conhecida, um simples
balanço de massa forneceu a quantidade de agente ativo realmente incorporado às matrizes.
3.2.3 Preparação dos suportes poliméricos de poli(caprolactona)
Os suportes de PCL foram preparados pela técnica de eletrofiação através de
adaptações do protocolo descrito por Kharaziha e colaboradores (2015). Para tal, uma solução
de 15% (m/v) de PCL foi preparada através da dissolução do polímero em uma solução de
clorofórmio e metanol na proporção de 5:1 (v/v). A solução foi mantida sob agitação
magnética por 4 horas, até que todo o polímero fosse dissolvido. Em seguida, 5,0 mL da
solução polimérica foram transferidos para uma seringa de capacidade igual a 10 mL, sendo
acoplada na sua extremidade uma agulha romba como ejetor. O fluxo da solução foi
controlado em 25 mL/h através de uma bomba de seringa programável (Samtronic Infusion
61
Pump 670T, Brasil). Uma fonte de alimentação de alta tensão foi utilizada para promover uma
diferença de potencial de 30 kV. A aplicação da diferença de potencial resultante da ligação
do eletrodo de polaridade positiva à agulha e do eletrodo de aterramento da fonte de alta
tensão à placa coletora forrada com papel alumínio deslocou a solução polimérica ejetada pela
agulha em direção à placa, formando fibras devido ao estiramento do polímero e evaporação
do solvente. A distância da agulha à placa coletora era de cerca de 30 cm e o tempo de
formação do suporte (dado pelo tempo de bombeamento da solução polimérica) foi de
12 minutos. Todos os suportes foram preparados à temperatura ambiente (cerca de 25 °C). Ao
final do processo, os suportes foram transferidos para uma estufa a vácuo (Lab-Line,
Squaroid, EUA) onde ficaram por 24 horas, à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), para
que o solvente fosse evaporado.
3.2.4 Incorporação de dexametasona nos suportes de poli(caprolactona)
Para a escolha da concentração de dexametasona a ser incorporada nas matrizes de
PCL, levou-se em consideração os dados de liberação obtidos por Kharaziha et al. (2015).
Para a regeneração de tecido cartilaginoso são necessárias quantidades em torno de 10
a 100 nmol/L (0,004 a 0,04 mg/mL) de dexametasona no meio de cultivo durante 21 dias e
levando-se em conta os dados relatados pelo autor supracitado quanto à liberação do
composto incorporado em matrizes de PCL, dissolveu-se 2 mg do anti-inflamatório em 30 mL
da solução de clorofórmio e metanol na proporção de 5:1 (v/v) previamente à adição da PCL,
sendo executado em seguida o protocolo descrito anteriormente.
3.2.4.1 Estimativa da eficiência de incorporação de dexametasona por análise da perda por
evaporação do solvente
Para determinar a eficiência de incorporação de dexametasona adicionada aos suportes
de PCL, pesou-se 2 mg do fármaco e dissolveu-se em 30 mL de solução de clorofórmio e
metanol na proporção de 5:1 (v/v) para determinar quanto dele seria arrastado ao longo do
processo de evaporação do solvente verificado durante a preparação dos suportes. Aguardou-
se em torno de 24 horas para que todo o volume da solução fosse evaporada em temperatura
ambiente (aproximadamente 25 °C) em capela de exaustão e pesou-se novamente o frasco
para obter-se a quantidade remanescente do fármaco. Como a massa inicial do fármaco era
62
conhecida, determinou-se a proporção arrastada e aplicou-se o resultado para, por balanço de
massa, determinar a quantidade de agente ativo realmente incorporado à matriz.
3.2.5 Caracterização físico-química dos suportes poliméricos
3.2.5.1 Aspecto e morfologia da superfície
A morfologia dos suportes foi avaliada macroscopicamente (utilizando uma câmera
fotográfica) e microscopicamente (utilizando um microscópio eletrônico de varredura modelo
LEO 440 da marca Leica operando a 10 kV e 50 pA). Previamente às análises de microscopia
ótica, os suportes foram mantidos em dessecador com sílica ativada por no mínimo 24 horas.
Para as análises de microscopia eletrônica de varredura, os suportes foram cortados
com tesoura em amostras de 1 cm x 1 cm e mantidos em dessecador com sílica por no mínimo
24 horas. As amostras foram recobertas com uma camada ultrafina de ouro (92 Å) em um
mini sputter coater (SC 7620, VG Microtech).
3.2.5.2 Espessura
Os suportes de QX QXp, PCL e PCLd foram previamente acondicionados em um
dessecador contendo sílica como dessecante por um período de aproximadamente 24 horas. A
espessura das amostras foi medida através de um micrômetro digital (Mitutoya, modelo
MDC-25S, Japão), sendo realizadas 10 replicatas em amostras com dimensões de 6 cm x 1 cm
de diferentes lotes.
3.2.5.3 Capacidade de absorção e estabilidade em decorrência da exposição a soluções
aquosas
A estabilidade dos suportes foi determinada pela perda de massa (por dissolução) de
seus componentes em água, PBS e em meio de cultura α-MEM suplementado com 10% de
SFB.
As análises foram realizadas em triplicata com amostras de dimensões de 6 cm x 1cm,
sendo as mesmas previamente armazenadas em dessecador contento sílica gel por um período
de aproximadamente 24 horas anteriormente à determinação da sua massa inicial. Em
63
seguida, as amostras foram imersas em 15 mL das diferentes soluções contidas em tubos do
tipo Falcon e incubadas em estufa (modelo: 410D, Nova Ética) a 37,0 ºC por um período de
sete dias. Após a incubação, cada suporte foi lavado com 20 mL de água purificada durante 5
minutos, por 4 vezes, para a remoção de compostos não ligados, como proteínas,
polissacarídeos e íons. Em seguida, as amostras foram secas em estufa a 37,0 °C por
aproximadamente cinco dias até atingirem massa constante. A perda de massa (Pm) foi
determinada através da Equação 1:
100)(
i
fi
M
MMPm (1)
onde Mi refere-se à massa inicial e Mf à massa final das amostras após o período de incubação
nas diferentes soluções.
Para a análise da capacidade de absorção, as amostras passaram pelo mesmo processo
supracitado, porém ficaram imersas nas diferentes soluções por um período de
aproximadamente 24 horas. Ao final deste período, as amostras foram gentilmente
pressionadas entre duas folhas de papel de filtro por 5 segundos e imediatamente pesadas em
balança analítica. A capacidade máxima de absorção (Ab) foi calculada de acordo com a
Equação 2:
s
su
M
)MM(Ab
(2)
onde Mu refere-se à massa da amostra úmida e Ms refere-se à massa da amostra seca.
3.2.5.4 Análise Termogravimétrica (TGA)
A estabilidade térmica dos suportes foi avaliada pela variação da massa em função da
temperatura através do analisador termogravimétrico TGA 50M (Shimadzu; Kyoto, Japan) do
Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração (LRAC). As amostras, com massa de
aproximadamente 1 mg, foram dispostas em cadinhos de alumínio e aquecidas, a uma taxa de
10,0 °C/min, desde a temperatura ambiente até 600,0 °C. Os experimentos foram conduzidos
em atmosfera de nitrogênio (vazão de 100 mL/min).
64
3.2.5.5 Determinação da Cristalinidade
A cristalinidade dos suportes foi determinada por difração de raios-X, utilizando-se
um difratômetro Philips Analytical X'Pert MPD (Almelo, Holanda) com radiação Cu-Kα,
λ=1,54Å. A fonte de raios-X operou em 40 kV e 40 mA e a intensidade da difração foi
medida no modo de reflexão a uma taxa de 0,01°/s para 2θ= 5 - 35°. As análises foram
realizadas no Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração (LRAC).
3.2.5.6. Ensaio de liberação de dexametasona incorporada nos suportes
Conforme será abordado mais à frente, a incorporação de dexametasona nos suportes
de QX e QXp por impregnação em solução hidroetanólica não foi eficiente, sendo o ensaio de
liberação realizado somente para os suportes de PCL.
Para a análise da cinética de liberação da dexametasona, realizada em triplicata,
amostras de 0,3 g da matriz de PCL contendo dexametasona foram colocadas em frascos de
vidro contendo 5 mL de PBS e fechados com tampas apropriadas para evitar a evaporação do
líquido. Os frascos foram mantidos em estufa (Tecnal, modelo TE-394/2, Brasil) a 37,0 °C
sob agitação (170 rpm) por até 96 horas. A absorbância do meio de liberação foi avaliada por
espectrofotometria (espectrofotômetro Beckman, modelo DU640) no comprimento de onda
de 242 nm periodicamente através da coleta de 1 mL do líquido, o qual era retornado ao
frasco em seguida à análise. Previamente às leituras, o aparelho era zerado com a solução de
PBS visando desconsiderar o efeito de qualquer interferente da solução na absorbância das
amostras. Como branco, utilizou-se 0,3 g de suporte de PCL sem dexametasona em 5 mL de
PBS.
Os dados experimentais obtidos nos ensaios de liberação de dexametasona em PBS
foram ajustados aos modelos matemáticos de Korsmeyer e Peppas, Hopfenberg e Higuchi,
visando analisar o comportamento cinético do sistema e inferir acerca do mecanismo de
liberação.
65
3.2.6 Metodologias de análise do comportamento biológico
3.2.6.1 Reativação e preservação das células mesenquimais e obtenção do inóculo
O conteúdo do criotubo de célula-tronco dentárias foi reativado através do
descongelamento em banho-maria (Q-214 M2, Quimis) a 37,0 oC transferindo-se, em seguida,
todo o volume para um tubo tipo Falcon de 15 mL que continha 10 mL de meio α-MEM
suplementado com 10% de SFB. A amostra foi centrifugada por 10 min a 1200 rpm (modelo
5804/5804 R, Eppendorf), em seguida descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet
em 3 mL de α-MEM suplementado. O material foi transferido para garrafas de poliestireno
(TPP) com 25 cm2 de área e incubado em estufa a 37,0
oC e 5% de CO2 (Tecnal, modelo TE-
399). Verificada a adesão celular (entre 3 a 4 dias após o descongelamento) e atingida a
confluência de cerca de 70%, realizou-se a expansão para outras garrafas. Para tal, o meio foi
descartado e a garrafa lavada com 2 mL de tampão PBS para a retirada das proteínas do soro e
de debris celulares. Para o desprendimento das células da parede da garrafa, adicionou-se
1 mL de tripsina bovina/EDTA a 0,25% (m/v) (Sigma), aguardando-se de 3 a 5 minutos em
estufa a 37 oC e 5% de CO2 (Thermo scientific, VIOS 160i). Foram acrescentados 2 mL de
meio α-MEM suplementado com 10% de SFB para a neutralização da enzima, transferindo-se
a suspensão para um tubo tipo Falcon de 15 mL e centrifugando-se por 10 min a 1200 rpm. O
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em 10 mL de α-MEM suplementado,
transferindo-se a seguir as células para uma garrafa com área superficial de cultivo de 75 cm2.
Cultivou-se as células nas mesmas condições supracitadas e, após quatro dias,
realizou-se a contagem das células viáveis em câmara de Neubauer utilizando azul de Trypan
como corante. Adequou-se a concentração celular adicionando-se soro fetal bovino e, dessa
maneira, um banco com 6 criotubos de 1,5 mL foi conservado em nitrogênio líquido contendo
106 células suspensas em 600 μL de SFB e 100 μL de DMSO.
3.2.6.2 Caracterização dos parâmetros de crescimento das células mesenquimais
Alíquotas de 2 mL de meio α-MEM suplementado com 10% de SFB contendo
5 x 104
células/mL foram inoculadas em três placas de seis poços de 35 mm de diâmetro. As
placas foram incubadas em estufa a 37,0 °C e 5% de CO2 (Thermo scientific, VIOS 160i).
Decorridas 24 horas, o meio de três poços foi descartado e os poços foram lavados com 1 mL
66
de PBS cada para a retirada de debris celulares e de proteínas do soro. Foram adicionados
700 μL de tripsina bovina/EDTA a 0,25% (m/v) em cada poço. A placa foi novamente
incubada por 3 a 5 minutos em estufa a 37,0 °C e 5% de CO2 para que ocorresse o
desprendimento celular. A atividade da enzima foi então interrompida com 700 μL de SFB e a
concentração de células viáveis daqueles poços foi analisada por microscopia ótica (Olympus,
IX53) utilizando o corante azul Trypan. O procedimento foi realizado a cada 24 horas em
novos poços das placas até a verificação da fase de declínio. O meio de cultura dos poços foi
renovado a cada 72 horas para que as células não ficassem desprovidas de nutrientes e
também para evitar a inibição do crescimento celular pelo acúmulo de metabólitos.
Os dados foram graficados na forma de logaritmo natural da concentração de células
viáveis versus tempo para a identificação das fases de crescimento celular lag, log,
estacionária e de declínio. O valor da taxa específica máxima de crescimento (μmáx),
correspondente à inclinação da parte linear da curva na fase log, foi utilizado para determinar
o tempo de duplicação celular (td) pela Equação 3.
𝑡𝑑 = ln 2
𝜇𝑚á𝑥 (3)
3.2.6.3 Análise da citotoxicidade in vitro indireta dos suportes às células mesenquimais
A análise da citoxicidade indireta dos suportes às células-tronco mesenquimais da
polpa dentária foi realizada pelo ensaio colorimétrico de MTT. Quando o MTT é exposto às
células, ele é reduzido enzimaticamente ou através de reação direta com NADH ou NADPH
em cristais de formazan púrpura, sendo a intensidade da cor proporcional ao número de
células viáveis presentes. O composto formado é detectável espectrofotometricamente a
570 nm (SADRIA; CHANGIZIA; EIVAZADEHB, 2015).
O protocolo executado consistiu na utilização de extratos dos suportes obtidos através
da imersão dos mesmos em meio de cultura α-MEM suplementado a uma proporção de 0,05 g
de material seco por mililitro de meio durante 48 horas em estufa a 37 ºC e 5% de CO2
(Thermo scientific, VIOS 160i). Como controles positivo e negativo do ensaio, foram
utilizados extratos de fragmentos de látex obtido de luvas comerciais na mesma proporção em
meio de cultura e o próprio meio de cultura na ausência de extratos, respectivamente. Os
extratos de látex foram obtidos através da imersão de 0,05 g de luva de látex estéril em 1 mL
de meio de cultivo α-MEM suplementado durante 48 horas em estufa a 37 ºC e 5% de CO2.
67
Alíquotas de 100 μL de uma suspensão contendo 105 células/mL em meio α-MEM
suplementado foram inoculadas em placas de fundo chato de 96 poços e mantidas por
24 horas em estufa a 37 ºC a 5% de CO2. Após este período, e observada a formação de uma
monocamada celular, os sobrenadantes foram removidos e substituídos por 100 μL dos
extratos, e a placa foi novamente mantida em estufa a 37,0 °C a 5% de CO2 por 24 horas. Os
extratos foram então removidos e cada poço foi lavado duas vezes com 100 μL de tampão
PBS. Após a lavagem, foram adicionados, em cada poço, 100 μL de α-MEM suplementado
sem vermelho de fenol, etapa esta seguida da adição de 10 μL de MTT a 5 mg/mL em tampão
PBS. Após quatro horas de incubação em estufa a 37 ºC foram adicionados a cada poço
100 μL de solução de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 100g/L dissolvido em uma solução de
dimetil sulfóxido (DMSO) contendo 0,6% de ácido acético. As amostras foram gentilmente
homogeneizadas e as culturas foram então incubadas a 37 ºC por uma hora. Decorrido este
período, as amostras foram levadas para medida de absorbância a 570 nm em
espectrofotômetro ELISA (Thermo Scientific, Multiskan FC, Finlândia).
3.2.6.4 Diferenciação das células mesenquimais dentárias em condrócitos
Para a análise da diferenciação das células-tronco mesenquimais dentárias em
condrócitos foi realizado primeiramente o cultivo no sistema micromass na presença de
diferentes concentrações de kartogenina (100 nmol/L, 1 µmol/L e 10 µmol/L). Para tal,
alíquotas de 10 µL contendo cerca de 5 x 105 células foram adicionadas a poços de fundo
cônico de 6,4 mm de diâmetro de placas de TPP. Destaca-se que para a obtenção dos meios de
cultura contendo as diferentes concentrações de kartogenina, o composto foi inicialmente
dissolvido em DMSO a uma concentração de 0,05 mol/L e posteriormente diluído em meio de
cultura α-MEM nas concentrações utilizadas.
As culturas foram mantidas em estufa a 37 ºC e 5% de CO2 (Thermo scientific, VIOS
160i) por 2 horas e, após este período, foram acrescidos 190 μL de meio condrogênico ao
sistema, o qual consiste em DMEM com alta concentração de glicose, prolina, ácido
ascórbico, antibióticos estreptomicina e penicilina, ITS (insulina, transferrina e selênio) e as
diferentes concentrações de kartogenina. O sistema foi tratado da mesma maneira descrita,
durante 21 dias, com trocas de meio realizadas aproximadamente a cada 3 dias.
Decorridos os 21 dias, foram realizadas análises histológicas com os corantes Azul de
Alcian, Tricrômico de Masson e hematoxilina e eosina (H&E) para determinar qual
68
concentração levou ao melhor desempenho na diferenciação em condrócitos. Estas técnicas
são descritas no próximo item.
Após determinada a concentração mais adequada de kartogenina, o ensaio de
diferenciação foi realizado sobre os suportes de QX, QXp e PCL contendo ou não
dexametasona. Para tal, as células-tronco dentárias foram inoculadas nos suportes cortados em
formato circular, com diâmetro de 15,6 mm. Os suportes foram dispostos em poços de placas
de 24 poços e esterilizados com óxido de etileno (OE) por exposição a Oxyfume-30 (30% OE
e 70% dióxido de carbono) por 8 horas à 40 ºC e umidade relativa de 30 a 80%. Esta
esterilização foi realizada pela empresa Acecil Central de Esterilização Comércio e Indústria
Ltda. (Campinas, SP, Brasil). Primeiramente foi utilizado vácuo a 0,4 a 0,6 kgf/cm2 durante
15 min e o reagente Oxyfume-30 foi adicionado até que a câmara atingisse a pressão de
0,5 kgf/cm2. Após um período de 3,5 horas, o vácuo foi restabelecido e as amostras foram
aeradas com ar filtrado por 10 min. O OE residual foi removido mantendo-se as amostras sob
aeração por 48 horas.
Em fluxo laminar vertical, os suportes foram intumescidos com 1 mL de meio de
cultura condrogênico durante três dias, sendo o meio trocado diariamente. Feito isso, o meio
foi descartado e 5x105 células contidas em 100 µL de meio condrogênico foram injetadas em
cinco pontos diferentes dos suportes através de agulhas hipodérmicas. A placa foi então
levada à estufa a 37,0°C e 5% de CO2 por duas horas. Em seguida, foram adicionados 2 mL
de meio condrogênico aos poços vagarosamente, para evitar a dispersão das células.
Este sistema foi cultivado durante 14 dias totais a 37,0 °C e 5% de CO2, com trocas de
meio realizadas aproximadamente a cada dois dias. Após este período, os suportes foram
analisados por histologia e microscopia eletrônica de varredura.
3.2.6.5 Análises histológicas
Após as células serem cultivadas, os meios de cultura foram descartados dos poços e
os suportes foram transferidos diretamente para cassetes histológicos. Já as microesferas de
células formadas pelo cultivo micromass foram transferidas para o centro de uma folha de
papel para permanente lavável, o qual foi dobrado de maneira que não houvesse perda das
microesferas durante o processamento. Os papéis contendo as microesferas de micromass
foram então transferidos para cassetes histológicos. Todos os cassetes foram fechados e
69
imersos em um frasco de solução de PBS contendo 10% (v/v) de formol (formalina), onde
ficaram incubados por aproximadamente 24 horas em temperatura ambiente.
Feito isso, a solução de formalina foi substituída por etanol absoluto até que os
cassetes fossem completamente cobertos pelo reagente. Os cassetes foram incubados em
estufa (Odontobras 1.2) a 60,0 °C durante 5 minutos. O etanol foi descartado e esta etapa foi
realizada por mais três vezes. Sequencialmente, os cassetes foram imersos em xilol e
incubados em estufa (Odontobras 1.2) por 5 minutos a 60,0 °C. Esta etapa foi realizada por
mais uma vez e, em seguida, os cassetes foram imersos em parafina para histologia, a qual se
encontrava em estufa à 60,0 °C no estado líquido. Os cassetes ficaram incubados por
5 minutos e esta etapa foi repetida por mais uma vez.
Por fim, foi realizada a etapa de inserção das amostras nos moldes de inclusão. Para
tal, os cassetes foram retirados da parafina, abertos, e as amostras foram transferidas para os
moldes de inclusão. Os moldes foram completados com a parafina líquida, sendo a parte
inferior do cassete inserida sobre o molde e também completada com parafina líquida. Os
moldes permaneceram em temperatura ambiente até que a parafina se solidificasse. As
amostras foram então removidas dos molde e processadas em micrótomo (Leica RM 2125
RTS), realizando-se três cortes histológicos de 5 µm de espessura. Os materiais assim obtidos
foram imersos em banho-maria histológico (MFB – BHD 1701) à 50,0 °C e em seguida
transferidos para lâminas de microscopia. As lâminas foram colocadas em estufa (Odontobras
1.2) a 70,0 °C durante 20 minutos para remoção de grande parte da parafina.
As três colorações realizadas para a análise da diferenciação das células mesenquimais
dentárias em condrócitos foram tricrômico de Masson, hematoxilina e eosina (H&E), e azul
de Alcian, as quais serão detalhadas a seguir.
3.2.6.5.1 Tricrômico de Masson
Para a realização da técnica, as lâminas foram retiradas da estufa (Odontobras 1.2) e
foram feitos os procedimentos de desparafinização completa e hidratação do material. As
lâminas foram imersas em Xilol durante 5 minutos em temperatura ambiente, por duas vezes.
Sequencialmente, foram imersas três vezes em diferentes alíquotas de álcool anidro
(99,5 INPM) e, em seguida, mais três vezes em outra alíquota de álcool anidro. As lâminas
foram lavadas em água corrente por cinco minutos e incubadas durante 30 minutos em
temperatura ambiente em solução de Bouin (75 mL de solução saturada de ácida pícrico;
25 mL de formaldeído e 5 mL de ácido acético glacial). Em seguida, foram novamente
70
lavadas em água corrente até que a coloração amarelada clareasse de maneira considerável,
sendo então rapidamente lavadas em água destilada e coradas com 2,5 mL das soluções A e B
de Hematoxilina Férrica de Weigert, por 10 minutos em temperatura ambiente. As lâminas
foram lavadas em água corrente, passadas em água destilada e coradas com a solução de
Escarlate de Biebrich (90 mL de solução aquosa Escarlate de Biebrich, 10 mL de solução de
fucsina ácida 1% (v/v) e 1 mL de ácido acético glacial) durante 10 minutos. As lâminas foram
passadas em água destilada e em solução de ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico (2,5 g de
ácido fosfotungstico, 2,5 g de fosfomolíbdico e 100 mL de água destilada) durante
10 minutos. As lâminas foram passadas novamente em água destilada e coradas pela solução
azul de anilina (2,5 g de azul de anilina, 2 mL de ácido acético glacial e 100 mL de água
destilada) por 1 minuto e lavadas em água destilada. Por fim, foram desidratadas por 3 vezes
em álcool absoluto (99,5 INPM), e diafanizadas por duas vezes em Xilol (Fabricante: MBF,
lote: 14456).
3.2.6.5.2 Hematoxilina e Eosina (H&E)
As lâminas foram desparafinizadas e hidratadas conforme descrito acima. Em seguida,
foram lavadas em água corrente por cinco minutos e em água destilada por uma vez para
posterior imersão no corante hematoxilina durante 1 minuto e meio em temperatura ambiente.
Foram novamente lavadas em água corrente por cinco minutos e imersas na solução do
corante eosina (2,5 g de eosina, 50 mL de água destilada, 200 mL de álcool 95% em volume
em água purificada e 750 mL de álcool 80% em volume em água purificada) por dois minutos
em temperatura ambiente e lavadas em água destilada por três vezes. Por fim, as lâminas
foram desidratadas por três vezes em álcool absoluto (99,5 INPM), e diafanizadas por duas
vezes em Xilol (Fabricante: MBF, lote: 14456) para a retirada de impurezas da amostra.
3.2.6.5.3 Azul de Alcian
As lâminas foram desparafinizadas e hidratadas conforme já descrito. Em seguida,
foram lavadas em água corrente por cinco minutos e em água destilada por uma vez para
posterior imersão no corante azul de Alcian 1% (m/v) em ácido acético 3% (v/v) por
30 minutos. As lâminas foram lavadas em água corrente por 10 minutos e contra-coradas pela
solução de safranina 0,1% (m/v) em ácido acético 3% (v/v) por 1 minuto. O excesso de
71
corante foi retirado através de água destilada e as lâminas foram então desidratadas por
3 vezes em álcool absoluto (99,5 INPM), e diafanizadas por duas vezes em Xilol.
3.2.6.6 Análise das CTMs aderidas nas membranas por microscopia eletrônica de varredura
(MEV)
Decorrido o período de inoculação (24 horas ou 14 dias), as células aderidas nos
suportes de QX, QXp, PCL e PCLd foram fixadas para análise por MEV segundo protocolo
descrito por Bellini (2012). O processo de fixação consistiu da imersão das amostras em
análise em duas diferentes soluções fixadoras, seguida pela desidratação das mesmas.
Primeiramente foi adicionado 1 mL da primeira solução fixadora constituída de
paraformaldeído a 4% (v/v) e glutaraldeído a 2% (m/v) em tampão cacodilato a 0,2mol/L
armazenado em geladeira e a pH 7,2, em cada poço. Após o período de incubação de uma
hora à 4,0 °C, as amostras foram lavadas com 1 mL de tampão cacodilato a 0,2 mol/L gelado
por 15 minutos por três vezes a cada lavagem.
A segunda fixação ocorreu adicionando-se, em cada amostra, 1 mL de solução de
tetróxido de ósmio a 1% (m/v) em tampão cacodilato a 0,2 mol/L. As amostras permaneceram
imersas neste fixador por cerca de 15 minutos à 4,0 °C, sendo posteriormente lavadas por
3 vezes com tampão cacodilato a 0,2 M a cerca de 4,0 °C por 10 minutos a cada lavagem.
Para a desidratação, as amostras foram imersas em 1 mL de soluções de etanol em
água (v/v) a 50 e 70%, durante 15 minutos e por uma noite, respectivamente. Em seguida,
deu-se continuidade ao processo de desidratação com as soluções de etanol em água (v/v) a
90, 100, 100 e 100%, por 15 minutos em cada solução. Após a desidratação em solução
alcoólica, o etanol contido nos materiais foi substituído por CO2 líquido e posteriormente as
amostras foram secas em ponto crítico (critical point dryer CPD 030, Balzers). Após secas, as
amostras foram metalizadas (sputter SCD 050, Balzers) através da deposição de uma fina
camada de ouro (92A) e as morfologias das superfícies das membranas foram avaliadas em
microscópio eletrônico de varredura (MEV) (modelo JSM 5800 LV, JEOL) no Laboratório de
Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia – UNICAMP.
72
3.3 Análise estatística dos resultados
O software Statistica 7® foi utilizado para analisar os resultados numéricos referentes
às propriedades das membranas, empregando-se o teste de comparação de médias de Tukey
com nível de significância de 5%. Todos os resultados são expressos como a média das
medidas experimentais com seus respectivos desvios padrão.
73
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização físico-química dos suportes poliméricos
4.1.1 Determinação da eficiência de incorporação de dexametasona nos suportes
Para o ensaio de determinação da eficiência de incorporação de dexametasona nos
suportes constituídos de quitosana e xantana perfurados ou não (QXp e QX, respectivamente),
primeiramente estabeleceu-se a curva de calibração de dexametasona em solução de
etanol/água (5:95%), conforme demonstrado no Anexo I, Figura AI. O comprimento de onda
utilizado na análise de absorbância foi aquele no qual a dexametasona apresentou o maior
pico de absorbância (242 nm). O ensaio foi realizado em duplicata, utilizando-se como branco
uma amostra de solução exposta aos suportes sem dexametasona na mesma condição do
ensaio de incorporação.
Os scaffolds de QX e QXp secos foram imersos em 4 mL de solução de etanol/água
(5:95%) com concentração igual a 0,06 mg/mL de dexametasona, na temperatura de 37,0 °C,
e a absorbância a 242 nm foi medida após 24 e 48 horas. As concentrações obtidas no líquido
remanescente mantiveram-se constantes em valores de aproximadamente 0,06 mg/mL, não
diferindo estatisticamente entre si. Assim, inferiu-se que não ocorreu impregnação apreciável
de dexametasona nos suportes, possivelmente devido à baixa afinidade da dexametasona pela
matriz polimérica, indicando que o método de incorporação utilizado não foi eficiente.
Uma alternativa a este método seria realizar a incorporação da dexametasona por
adição direta à mistura polimérica, porém sua dispersão possivelmente não seria uniforme.
Ainda, os suportes de QX passam por uma etapa de secagem e posteriormente, de lavagem
para a retirada de Poloxamer 188 e para a neutralização do pH, o que provavelmente
acarretaria em perda precoce de uma fração da dexametasona por arraste na lavagem, a qual
não ficaria mais disponível para o cultivo celular. Seria possível também adicionar uma
quantidade de dexametasona maior que a requerida para o cultivo celular para que a
quantidade remanescente do fármaco após as lavagens fosse suficiente para tal objetivo.
Entretanto, este glicocorticóide possui custo relativamente elevado (cerca de 370 dólares por
grama, equivalentes, em janeiro de 2016, a quase R$ 1500,00 por grama), comprometendo a
viabilidade econômica desta abordagem. Dessa maneira, optou-se por não realizar a
incorporação do fármaco nos suportes constituídos de quitosana-xantana, sendo a
74
dexametasona adicionada ao meio de cultivo durante os ensaios de diferenciação celular
quando do uso destes biomateriais nestes ensaios biológicos. Visto que a dexametasona não
mais foi incorporada nas matrizes de quitosana e xantana, somente foram realizados ensaios
de caracterização físico-química dos suportes de polissacarídeos livres deste composto.
Para o ensaio de determinação da eficiência de incorporação de dexametasona nos
suportes constituídos de PCL, pesou-se a dexametasona antes e após o processo de
evaporação do solvente, e de acordo com o teste de Tukey, as massas não diferiram entre si,
podendo-se considerar que não há arraste de dexametasona do sistema durante a produção e a
secagem das fibras. Assim, supõe-se que 100% do composto tenha ficado retido no suporte,
atingindo-se a razão de 0,13 mg de dexametasona por grama de PCL. Neste caso, tanto os
suportes constituídos somente de PCL quanto os que continham dexametasona incorporada
foram caracterizados.
4.1.2 Aspecto e morfologia da superfície
Observou-se durante a fabricação dos suportes de quitosana-xantana a formação de um
complexo homogêneo, opaco e de alta viscosidade. A agitação da mistura contendo o
surfactante Poloxamer P188 ocasionou a incorporação de uma elevada quantidade de bolhas
de ar, beneficiando a formação de uma estrutura porosa. A secagem ocorreu em 72 horas, o
que diferiu do trabalho descrito por Bellini et al. (2012) para os suportes obtidos com os
mesmos polissacarídeos. Isto pode ter ocorrido devido ao agitador utilizado diferir do
empregado no referido trabalho, sendo que este agitador provavelmente incorpora mais ar na
matriz e resulta em uma maior quantidade de espuma, dificultando a evaporação do solvente.
Além disso, as estufas utilizadas diferem de marca, contribuindo para o resultado obtido.
Durante as sucessivas lavagens realizadas para a remoção do ácido acético residual e
neutralização do suporte, as amostras apresentaram aumento de tamanho, principalmente em
seu diâmetro. Após a segunda secagem, observou-se a formação de suportes porosos e
opacos, com a superfície ondulada. As imagens de microscopia eletrônica de varredura e da
superfície dos suportes obtidas estão mostradas na Figura 16.
Nas Figuras 16(a) e 16(c) observa-se que os suportes de quitosana-xantana íntegros ou
perfurados não possuem diferença macroscópica na morfologia de suas superfícies. Nas
Figuras 16(b) e 16(d) nota-se que ambos os suportes possuem diversas irregularidades na
superfície, porém no suporte perfurado encontram-se pontos de fissura, que podem ser
75
atribuídos às perfurações realizadas com as agulhas hipodérmicas visando aumentar a
interconectividade entre os poros.
Figura 16 – Superfície do suporte de quitosana-xantana não perfurado (a); MEV da superfície
do suporte de quitosana-xantana não perfurado (b); superfície do suporte de quitosana-xantana
perfurado (c); MEV da superfície do suporte de quitosana-xantana perfurado (d).
A etapa de neutralização dos suportes efetuada imediatamente após a mistura da
xantana à quitosana visando eliminar a etapa de lavagem posterior à preparação não resultou
em amostras íntegras, conforme se pode observar na Figura 17, não sendo possível a
utilização destes suportes na engenharia do tecido cartilaginoso.
Os suportes de PCL foram produzidos pela técnica de eletrofiação, que consiste na
aplicação de uma elevada diferença de potencial elétrico entre um coletor e uma agulha da
qual uma solução polimérica é expelida a fluxo constante (CIPITRIA et al., 2011). Durante o
a b
c d
76
processo de fabricação dos suportes de PCL com e sem dexametasona, observou-se a
formação de fluxo contínuo da solução polimérica, o que indica que a diferença de potencial
aplicada foi adequada, visto que não houve ruptura do jato ou formação de eletrospray com
produção de micro ou nanogotas. As imagens da superfície deste tipo de suporte assim como
os resultados da análise por microscopia eletrônica de varredura do mesmo são mostrados na
Figura 18.
Figura 17 – Aspecto final do suporte de quitosana-xantana neutralizado durante o preparo
através da adição de NaOH.
As amostras observadas nas Figuras 18(a) e 18(c) apresentaram aspecto macroscópico
homogêneo e flexível, sendo de fácil manipulação e possibilitando o dobramento e o corte de
forma similar a um tecido elástico. O diâmetro dos suportes se aproximou da área do coletor
(diâmetro de cerca de 10 cm). Os suportes de PCL contendo ou não dexametasona não
possuem diferença macroscópica na morfologia de suas superfícies, possivelmente devido à
baixa concentração empregada do composto. Nas Figuras 18(b) e 18(d) verifica-se
aleatoriedade no alinhamento das fibras eletrofiadas, também não se detectando diferenças
morfológicas entre as fibras com e sem presença de dexametasona.
77
Figura 18 - Superfície do suporte de PCL sem dexametasona (a); MEV da superfície do
suporte de PCL sem dexametasona (b); Superfície do suporte de PCL com dexametasona (c);
MEV da superfície do suporte de PCL com dexametasona (d).
4.1.3 Espessura
Os valores correspondentes às espessuras médias dos suportes de quitosana-xantana e
de PCL mantidos em dessecador com sílica são apresentados na Tabela 3. As espessuras
variaram de 887 a 969 µm para os suportes de QX e de 286 a 395 µm para os suportes
constituídos de PCL.
a b
c d
78
Tabela 3 – Valores médios das espessuras dos suportes de quitosana–xantana sem perfuração
(QX), perfurados (QXp) e de poli(caprolactona) sem (PCL) e com dexametasona (PCLd).
Amostra Espessura (µm)
QX 886,8 ± 107,5 b
QXp 927,6 ± 69,97 b
PCL 357,8 ± 29,99 a
PCLd 302,9 ± 11,91 a
Mesma letra na mesma linha ou coluna indica que não há diferença significativa entre os valores
médios (Teste de Tukey, p<0,05).
Para as formulações de quitosana-xantana não se observa variação na espessura das
membranas decorrentes da perfuração. As formulações à base de PCL são significativamente
mais finas que as de quitosana-xantana, mas a adição de dexamentasona às mesmas também
não implicou em diferenças nas espessuras.
Entretanto, o desvio padrão encontrado para os suportes de quitosana-xantana é
elevado, o que pode ser atribuído à baixa uniformidade dos suportes em decorrência de
distribuição não homogênea da mistura polimérica sobre a superfície das placas de Petri
usadas para moldar os scaffolds, acarretando na formação de suportes de espessura variável
em diferentes regiões.
O dado obtido para QX difere daqueles reportados por Bellini et al. (2012), sendo que
no estudo citado a espessura encontrada foi de 1840 µm. Os dados aqui reportados foram
analisados em amostras de diferentes lotes, sendo observada uma coerência nas medidas
obtidas. Possivelmente, as amostras analisadas no estudo supracitado não se encontravam nas
mesmas condições de umidade do presente estudo, contribuindo para a diferença entre os
resultados obtidos.
Ateshian, Soslowsky e Mow (1991) mediram a espessura da cartilagem articular
humana e verificaram que esta varia na tíbia de 0,35 a 6,25 mm e na patela de 0,89 a
5,94 mm. Kladny et al. (1999) também mediram a espessura da cartilagem articular humana e
encontraram medidas que variavam de 0,5 a 7,1 mm. Os scaffolds para a engenharia de
tecidos cartilaginosos devem ser capazes de completar a gama das possíveis lesões
cartilaginosas, que podem atingir de maneira parcial ou total a espessura da cartilagem nativa.
Assim, os suportes poliméricos de QX e PCL aqui obtidos podem ser utilizados
em lesões parciais de cartilagens, visto que suas espessuras não alcançam valores suficientes
para o tratamento de lesões condrais severas. Para atender a demandas de lesões desta
79
categoria, poderiam ser opcionalmente utilizados na forma empilhada em várias camadas,
desde que devidamente afixados entre si.
4.1.4 Capacidade de absorção e estabilidade durante a exposição a soluções aquosas
A medida da capacidade máxima de absorção e perda de massa dos suportes em
diferentes soluções aquosas é realizada com o intuito de verificar o comportamento dos
scaffolds obtidos, tanto em relação ao seu intumescimento, que tem efeito direto no transporte
de nutrientes e metabólitos no interior da matriz, quanto à sua estabilidade em condições que
podem simular o ambiente de cultivo. Os resultados de capacidade de absorção encontram-se
resumidos na Tabela 4. Nota-se que nos suportes constituídos de quitosana-xantana a maior
capacidade de absorção foi detectada em presença de água. Veiga e Moraes (2011)
demonstraram que membranas lamelares destes mesmos biopolímeros absorvem entre 24,22 e
61,23 g de água por grama de membrana seca. Bellini e colaboradores (2012) obtiveram
resultados de 29,8 g de água por grama de membrana seca, ou seja, relativamente próximos
dos dados aqui relatados. Para solução salina, este último estudo reporta capacidade de
absorção de 17,1 g de solução salina por grama de membrana seca, também estando próximo
do obtido em solução de PBS no presente estudo.
Tabela 4 – Valores médios da capacidade de absorção dos suportes de QX, QXp, PCL e PCLd
em diferentes soluções aquosas após 24 horas.
Solução
Capacidade de Absorção (g/g)
QX QXp PCL PCLd
Água 22,17 ± 10,17 b 28,87 ± 2,17
a 0,52 ± 0,12
d 0,48 ± 0,07
d
α-MEM + 10% SFB 13,20 ± 14,23 c 12,59 ± 2,93
c 0,71 ± 0,04
d 0,79 ± 0,02
d
PBS 11,85 ± 3,81 c 11,86 ± 5,56
c 0,51 ± 0,05
d 0,41 ± 0,14
d
Mesma letra na mesma linha ou coluna indica que não há diferença significativa entre os valores
médios (Teste de Tukey, p<0,05).
Detectou-se diferenças estatísticas entre os suportes de QX e QXp somente para a
capacidade de absorção em água, sendo que o suporte perfurado absorveu maior quantidade
do líquido que o íntegro. Esse resultado supõem que os suportes perfurados têm potencial de
80
permitir maior acesso de nutrientes para as células cultivadas no interior dos scaffolds,
mantendo de maneira mais eficaz a viabilidade das mesmas, além de possivelmente facilitar
também a saída de metabólitos tóxicos excretados pelas células, como amônio e lactato.
Para os suportes de poli(caprolactona), a capacidade de absorção de soluções aquosas
foi pequena, visto que se trata de um polímero de caráter hidrofóbico. Não se identificou
diferenças estatísticas no comportamento dos suportes de PCL com e sem dexametasona em
nenhumas das três diferentes soluções.
Os resultados da estabilidade dos scaffolds foram determinados pela perda de massa
por 7 dias em água, PBS e em meio α-MEM suplementado, e são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5: Valores médios da perda de massa dos scaffolds de QX, QXp, PCL e PCLd em
diferentes soluções aquosas após 7 dias.
Solução
Perda de Massa (%)
QX QXp PCL PCLd
Água 46,61 ± 0,95 a 45,94 ± 2,49
a 14,28 ± 1,16
b 11,48 ± 2,16
b
α-MEM + 10% SFB 49,57 ± 9,14 a 47,38 ± 2,97
a 11,14 ± 3,14
b 10,84 ± 1,02
b
PBS 49,83 ± 7,55 a 42,26 ± 2,95
a 15,38 ± 2,23
b 11,76 ± 1,08
b
Mesma letra na mesma linha ou coluna indica que não há diferença significativa entre os valores
médios (Teste de Tukey, p<0,05).
Os suportes de quitosana-xantana tiveram perdas consideráveis de massa, variando de
42,3 a 49,8%. A elevada perda de massa observada leva a crer que os tensoativos não foram
totalmente retirados durante as sucessivas lavagens dos suportes ou que impediram a total
complexação dos polissacarídeos. Estes dados diferem daqueles obtidos por Bellini e
colaboradores (2012), que reportam perdas de no máximo 34,7% para amostras porosas nas
mesmas proporções de polissacarídeos utilizadas no presente estudo. O teste de Tukey indicou
que não houve diferenças significativas entre o scaffold perfurado e o não perfurado, assim
como nos dados obtidos para as diferentes soluções utilizadas.
Para os scaffolds de PCL também não se detectou diferenças significativas entre os
suportes com e sem dexametasona e entre as diferentes soluções. As perdas de massa dos
suportes de poli(caprolactona) foram significantemente menores que as obtidas para os de
quitosana-xantana, o que pode ser atribuído às características hidrofóbicas da PCL.
81
4.1.5 Liberação de dexametasona incorporada nos suportes de poli(caprolactona)
A fim de verificar se os suportes de PCL produzidos contendo dexametasona são
capazes de liberar a quantidade requerida do composto para diferenciação das células-tronco
em condrócitos (0,004 a 0,040 mg/mL), fez-se o estudo da cinética de liberação do agente
ativo em meio de liberação que simula o ambiente fisiológico (PBS, pH 7,4, a 37,0 ºC).
Primeiramente estabeleceu-se a curva de calibração de dexametasona dissolvida em
PBS, conforme demonstrado no Anexo I, Figura AII. O comprimento de onda utilizado na
análise de absorbância foi aquele no qual a dexametasona apresentou o maior pico de
absorbância, ou seja, 242 nm. O ensaio foi realizado em duplicata, utilizando-se como branco
uma amostra sem dexametasona exposta ao solvente do ensaio.
Na Figura 19 são mostrados os resultados da cinética de liberação da dexametasona
para os suportes de PCL, no que diz respeito à variação da concentração do composto na
solução de liberação, quantidade liberada por grama de membrana e porcentagem liberada em
função do tempo. Estudos prévios reportam que a liberação de drogas em sistemas
eletrofiados ocorre geralmente em dois estágios, sendo que no primeiro observa-se uma rápida
liberação, seguida de uma liberação controlada no segundo estágio (VACANTI et al., 2012).
Podem-se identificar na Figura 19 estes dois estágios, sendo nos primeiros 10 minutos
observada uma rápida liberação de dexametasona, seguida por uma liberação controlada no
intervalo seguinte. A liberação máxima da dexametasona é alcançada após 72 horas,
atingindo-se em seguida um platô. A porcentagem liberada correspondeu a um total de 38%,
resultado que se aproxima daqueles apresentados por Kharaziha et al. (2015), que detectaram
liberação de 44% de dexametasona de suportes constituídos de PCL. Conforme já
mencionado, a quantidade necessária de dexametasona varia de 0,004 a 0,040 mg/mL para
favorecer a condrogênese de células-tronco. Assim, a quantidade do fármaco liberada em PBS
(cerca de 0,013 mg/mL) é condizente com a esperada para que ocorra a diferenciação das
CTMs em condrócitos quando a proporção de massa de suporte por volume de solução é
respeitada. A liberação in vivo também deve ser testada a fim de se verificar se a quantidade
de dexametasona incorporada na matriz condiz com a necessária quando em lesões de
diferentes tamanhos e espessuras.
Na Figura 20 são apresentados os resultados obtidos para a análise por MEV dos
suportes de PCL contendo ou não dexametasona antes e após o ensaio de liberação do
fármaco (96 horas).
16
Figura 19 - Liberação de dexametasona incorporada aos suportes de PCL em termos de massa liberada acumulada do composto por grama de
membrana e sua concentração no meio de liberação (a), e da porcentagem liberada (b). O comportamento no período inicial de liberação é
detalhado em termos de massa de dexametasona liberada por grama de membrana (c) e de concentração do composto no meio de liberação (d).
0,000
0,004
0,008
0,012
0,016
0,020
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Conce
ntr
ação
(m
g/m
L)
Mas
sa d
e dex
amet
asona
liber
ada
por
mas
sa d
e m
embra
na
(mg/g
)
Tempo (horas)
Massa de dexametasona liberada
por massa de membrana (µg/mg)
Concentração do composto no
meio de liberação (mg/mL)
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Porc
enta
gem
lib
erad
a (%
)
Tempo (horas)
b
0,000
0,004
0,008
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Co
nce
ntr
ação
(m
g/m
L)
Mas
sa d
e d
exam
etas
on
a li
ber
ada
por
mas
sa d
e m
emb
ran
a (µ
g/m
g)
Tempo (minutos)
Massa de dexametasona liberada
por massa de membrana (µg/mg)Concentração do composto no
meio de liberação (mg/mL)0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Po
rcen
tagem
lib
erad
a (%
)
Tempo (minutos)
a
c d
16
Figura 20 - Suporte de PCL sem dexametasona (A); suporte de PCL com dexametasona (B);
suporte de PCL sem dexametasona após liberação em PBS durante 96 horas (C); suporte de
PCL com dexametasona após liberação em PBS durante 96 horas (D).
Conforme já mencionado na análise da Figura 18, nas Figuras 20A e 20B, obtidas em
maior ampliação que a Figura 18, observa-se que a presença da dexametasona não afeta a
morfologia das fibras, possivelmente devido à baixa concentração empregada. Após 96 h em
tampão fosfato (pH 7,4, sob agitação à 37 °C), nota-se claramente que houve erosão
superficial das fibras de PCL, como pode ser observado nas Figuras 20C e 20D para os
suportes sem dexametasona e com dexametasona, respectivamente, embora a superfície do
material contendo o hormônio pareça menos afetada. Essa erosão é esperada, sendo resultado
da hidrólise das cadeias de PCL nas condições de realização do ensaio de liberação.
Supõe-se que nos períodos iniciais de liberação a dexametasona localizada na
A B
DC
17
superfície das fibras tenha rapidamente se deslocado para o meio aquoso, sendo esta
quantidade apreciável em função da grande área superficial das fibras. Com o passar do
tempo, a dexametasona passaria a ser liberada em decorrência de difusão, devendo-se também
computar a discreta contribuição do efeito de absorção da solução tampão pela matriz
polimérica, que, por sua vez, contribui no transporte da dexametasona por canais no interior
da matriz e também na hidrólise da PCL.
4.1.6 Modelagem matemática dos dados de liberação de dexametasona
Os resultados dos ajustes dos diferentes modelos matemáticos testados aos dados
experimentais do início do período de liberação são representados graficamente na Figura 21,
visando elucidar qual seria o mecanismo inicial predominante. Utilizou-se para tal o intervalo
de dados de Qt/Q até 0,4.
Para o modelo de Higuchi, obteve-se KH de 0,092 e R2 de 0,983, indicando que o
modelo proposto ajustou-se de maneira adequada os dados experimentais. Este modelo
considera a matriz como insolúvel e não intumescível o que, na prática, é próximo do que
seria observado para a PCL no período inicial do ensaio.
O modelo de Korsmeyer-Peppas apresentou o melhor ajuste para a liberação, com R2
de 0,986, Kk de 0,032 e n de 0,354, o qual, sendo menor que 0,5, caracteriza uma liberação do
tipo quasi-Fickiana, em que a difusão do fármaco dá-se parcialmente pela matriz em que se
encontra, e parcialmente pelos poros que contêm PBS.
O modelo de Hopfenberg, que descreve a liberação como decorrente da degradação da
matriz, foi o que apresentou o ajuste menos apropriado, de aproximadamente 0,961, com
constante K0 de 0,204, não sendo o mais adequado para descrever a liberação da
dexametasona no suporte de PCL no período inicial. Apesar de se visualizar pela microscopia
eletrônica de varredura (Figura 20) apreciável degradação do dispositivo contendo apenas
PCL, tal fato pode não ser dominante no início do ensaio.
4.1.7 Análise Termogravimétrica (TGA)
A TGA foi realizada com o objetivo de analisar a decomposição térmica dos suportes
poliméricos e se a adição da dexametasona afeta o comportamento do suporte de PCL. Na
Figura 22 são exibidas as curvas de TGA de perda de massa em função da temperatura para os
18
Figura 21 - Ajuste linear dos dados experimentais do ensaio de liberação de dexametasona
dos suportes de PCLd em relação aos modelos de Korsmeyer-Peppas (A), Hopfenberg (B) e
Higuchi (C).
y = 0,3535x - 3,4575
R² = 0,9857 -1,6
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
5,5 6 6,5 7 7,5
ln (
Qt/
Q∞
) ln (t)
y = 0,0001x + 0,2041
R² = 0,9606 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
300 800 1300
Qt/
Q∞
Tempo (s)
y = 0,0085x + 0,0917
R² = 0,9831 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
17 20 23 26 29 32 35 38
Qt/
Q∞
√t (s)
A
B
C
A
19
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0
20
40
60
80
100
0 150 300 450 600
Der
ivad
a (%
/°C
)
Mas
sa r
esid
ual
(%
)
Temperatura (°C)
TGA Xantana
DrTGA Xantana
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0
20
40
60
80
100
0 150 300 450 600
Der
ivad
a (%
/°C
)
Mas
sa r
esil
dual
(m
g)
Temperatura (°C)
TGA Quitosana
DrTGA Quitosana
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0
20
40
60
80
100
0 150 300 450 600
Der
ivad
a (%
/°C
)
Mas
sa r
esid
ual
(%
)
Temperatura (°C)
TGA Poloxamer 188
DrTGA Poloxamer
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0
20
40
60
80
100
0 150 300 450 600
Der
ivad
a (
%/
°C)
Mas
sa r
esid
ual
(m
g)
Temperatura (°C)
TGA QXP
DrTGA QXP
suportes de QX e para os polímeros quitosana, xantana e Poloxamer 188 individualmente.
Não foi analisada a matriz QXp por não ser esperada variação de comportamento no material
em função apenas das perfurações com agulhas.
Já na Figura 23 são mostradas as curvas do suporte de PCL com e sem dexametasona e
do polímero individualmente. Para uma visualização mais efetiva dos eventos térmicos, as
curvas de primeira derivada da perda de massa (DrTGA) foram adicionadas aos gráficos. Os
picos destas derivadas correspondem aos pontos de inflexão nas curvas de TGA e indicam a
temperatura na qual ocorreu maior variação de massa.
Figura 22 – Análises térmicas dos polímeros quitosana (A), xantana (B), Poloxamer 188 (C) e
do suporte constituídos por estes polímeros (D).
A análise de TGA da quitosana, da xantana e do Poloxamer 188 isolados (Figuras 22A
a 22C) resultou em dois eventos térmicos. O primeiro evento, atribuído à perda de água,
ocorreu em temperaturas inferiores a 100 °C. Observa-se que os valores do primeiro pico
foram mais baixos para a quitosana (Figura 22A), indicando uma ligação mais fraca da água
por pontes de hidrogênio com os grupos hidroxila.
Os eventos térmicos subsequentes foram associados à degradação dos polímeros. Na
análise da quitosana (Figura 22A), verificou-se perda de massa de 30 % no segundo evento
A B
D C
20
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600
Der
ivad
a (%
/°C
)
Mas
sa r
esid
ual
(%
)
Temperatura (°C)
TGA suporte PCLd
DrTGA suporte PCLd
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600
Der
ivad
a (%
/°C
)
Mas
sa r
esid
ual
(%
)
Temperatura (°C)
TGA suporte PCL
DrTGA suporte PCL
térmico, com pico a 324 °C. Resultados similares foram encontrados por Martins et al.
(2012), que observaram um pico de degradação a 312 °C. Esta etapa de degradação pode ser
atribuída à despolimerização e decomposição pirolítica do polissacarídeo (MARTINS et al.,
2012).
Figura 23 – Análise termogravimétrica do polímero PCL (A) e dos suportes constituídos de
PCL com (B) ou sem dexametasona (C).
Verificou-se uma perda de massa de 40 % para a degradação térmica da xantana no
segundo evento (Figura 22B), com pico a 310 °C. A literatura registra resultados similares
quanto à degradação térmica da xantana, com pico entre 220-320 °C e perda de massa de 40
%, atribuída à degradação da cadeia de xantana (FARIA et al., 2011).
Para o Poloxamer 188 (Figura 22C), o primeiro pico atribuído à perda de massa de
água foi elevado, visto que o produto analisado é apresentado na forma de solução. O segundo
pico de degradação teve máximo em 400 °C com perda de massa de 96%. Li et al. (2015)
também observaram que o Poloxamer 188 se degrada em torno de 400 °C, corroborando os
dados obtidos.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0
20
40
60
80
100
0 150 300 450 600
Der
iva
da
(%
/°C
)
Mas
sa r
esid
ual
(%
)
Temperatura (°C)
TGA PCL
DrTGA PCLA
B C
21
Na análise dos suportes de QX (Figura 22D), o primeiro evento térmico, que pode ser
atribuído à perda de água, ocorreu em temperaturas variando de 25 a 145 °C, com perda de
massa em torno de 10 %. Os eventos térmicos seguintes são atribuídos às etapas de
degradação do suporte. Supõe-se que no evento entre 200 e 360 °C ocorra a degradação por
oxidação da xantana e da quitosana. Para o terceiro pico, o qual varia de 380 a 460 °C pode
ser atribuído ao Poloxamer 188, visto que a degradação deste composto isolado ocorre neste
intervalo. Dessa maneira, pode-se inferir que os suportes de QX retêm uma fração de
Poloxamer 188 em sua composição mesmo após as lavagens.
A análise de TGA do polímero de PCL (Figura 23A) resultou em um único evento
térmico, com perda de massa de quase 58% a 438 °C. A análise de TGA para a dexametasona
não foi realizada devido já ser bem estabelecida e não apresentar grandes variações, além da
dexametasona ser um composto de alto custo e não se ter material disponível para esta
análise. Islam (2011) demonstrou que a dexametasona tem perda de massa de 50% em torno
de 300 °C.
Para os suportes (Figuras 23B e 23C), observou-se somente um evento térmico, que
pode ser atribuído à degradação do polímero, visto que o pico encontra-se no intervalo de
degradação localizado para a PCL isolada. O pico relativo a dexametasona não foi detectado,
provavelmente devido à baixa quantidade empregada do fármaco. O suporte de PCL sem
dexametasona apresentou temperatura de maior variação de massa em 436,1 °C, enquanto que
para o suporte que contém o fármaco, o evento ocorreu na temperatura de 435,9 °C. Isso
indica que a adição de dexametasona no suporte de PCL não altera a estabilidade e
decomposição do material.
4.1.8 Determinação da cristalinidade
A cristalinidade dos suportes de quitosana-xantana e de PCL contendo ou não
dexametasona foi determinada por difração de raios-X, e os resultados são apresentados nas
Figuras 24 e 25, respectivamente.
Para os suportes de QX, são observados dois picos referentes aos planos
cristalográficos, em 18,9° e em 23,2°, que podem ser atribuídos à fase amorfa da xantana e da
quitosana, respectivamente. A existência de uma estrutura mais amorfa nos suportes ajuda a
explicar o elevado intumescimento dessas amostras, visto que a transferência de massa em um
polímero é altamente afetada pela estrutura polimérica, sendo que quanto mais amorfo, mais
22
permeável o polímero se torna, ou seja, a fase cristalina pode ser considerada impermeável
(MILLER; KROCHTA, 1997).
Para os suportes de PCL contendo ou não o fármaco dexametasona, observam-se dois
picos referentes aos planos cristalográficos da PCL, em 21,5° e em 23,8°, indicando a
natureza cristalina dos suportes e corroborando com os dados encontrados na literatura
(NOJIMA; ONO; ASHIDA, 1992; SUN et al., 2011). A semelhança entre os resultados indica
que a presença de dexametasona não afeta o grau de cristanilidade da PCL.
Figura 24 - Difratograma de raio-X do suporte de QX.
Figura 25 - Difratogramas de raios-X dos suportes de PCL contendo ou não dexametasona.
23
4.2 Análise do comportamento biológico
4.2.1 Caracterização dos parâmetros de crescimento das células mesenquimais
A análise do comportamento das células-tronco mesenquimais dentárias em meio de
cultura α-MEM suplementado com 10% de SFB se fez necessária, a fim de padronizar as
condições de cultivo. Estas células crescem de forma aderida, com morfologia fusiforme.
A curva de crescimento de células inoculadas a uma concentração inicial de
0,5 x 105
células/mL por poço de 35 mm de diâmetro de placas de poliestireno contendo
2 mL de meio α-MEM suplementado com 10% de SFB foi analisada, os daos obtidos estão
apresentados na Figura 26.
De acordo com os dados coletados, não foi possível identificar a fase de adaptação
celular, visto que o primeiro ponto analisado foi de 24 horas, o qual já indica fase exponencial
de crescimento. Esta fase é mantida por até 72 horas de cultivo, quando ocorre uma queda no
número de células viáveis, a qual pode ser atribuída à falta de espaço (inibição por contato) ou
à produção de metabólitos tóxicos pelas células, como amônio e lactato. Estabelecendo como
fase log o período entre 24 e 72 horas de cultivo, calculou-se a velocidade específica máxima
de crescimento (µmáx), de 0,036 h-1
, e o tempo de duplicação celular, de, aproximadamente,
23,1 horas. Em células proliferativas típicas de mamíferos a interfase pode durar 23 horas e a
mitose, uma hora, resultando em tempo de duplicação médio de 24 horas (MORAES;
AUGUSTO; CASTILHO, 2007). Pham e colaboradores (2014) demonstraram que células-
tronco extraídas do cordão umbilical cultivadas em meio de cultura contendo 10% de SFB
geram tempos de duplicação em torno de 25,2 horas, corroborando com os dados obtidos.
4.2.2 Análise da citotoxicidade in vitro indireta dos suportes às células mesenquimais
A citotoxicidade dos extratos obtidos a partir dos suportes poliméricos a células-tronco
mesenquimais dentárias foi analisada por via indireta e os resultados obtidos são mostrados na
Figura 27. Os resultados obtidos mostram que nenhuma das amostras afeta de maneira
expressiva o crescimento celular. A análise estatística de Tukey demonstrou que não existem
diferenças significativas entre os suportes de QX e QXp. Já para os suportes de PCL com e
sem dexametasona existem diferenças estatísticas, sendo que o suporte que possui
dexametasona possui citotoxicidade inferior ao suporte sem dexametasona.
24
Figura 26 – Curva de crescimento das células-tronco mesenquimais dentárias (A); curva de
crescimento celular expressa em termos de seu logaritmo neperiano (B).
0
100.000
200.000
300.000
400.000
0 20 40 60 80 100 120
Cél
ula
s viá
vei
s (c
el/m
L)
Tempo de cultivo (horas)
10,5
11,0
11,5
12,0
12,5
13,0
0 20 40 60 80 100 120
Ln [
Cél
ula
s viá
vei
s]
Tempo de cultivo (horas)
A
B
25
Os valores de toxicidade para os suportes de PCL pode ser resultante da presença de
traços dos solventes orgânicos utilizados.
Em síntese, os valores de citotoxicidade encontrados indicam que todos os suportes
poliméricos produzidos possuem potencial uso como scaffolds para células-tronco
mesenquimais dentárias.
Figura 27 - Citotoxicidade indireta dos suportes de QX, QXp, de PCL e PCLd. Não há
diferença significativa entre os dados marcados com a mesma letra (teste de Tukey, p<0,05).
4.2.3 Diferenciação das células mesenquimais dentárias em condrócitos
4.2.3.1 Cultivo das células-tronco dentárias no sistema micromass
Para determinar a concentração ideal de kartogenina no meio de cultura, realizou-se o
cultivo das células-tronco mesenquimais dentárias no sistema do tipo micromass. Após 21
dias, realizou-se as análises histológicas usando os corantes tricrômico de Masson,
hematoxilina e eosina (H&E) e azul de Alcian, conforme sumarizado nas Figuras 28 a 36.
A coloração de tricrômico de Masson cora os núcleos celulares de marrom escuro a
preto, o citoplasma, a queratina e as fibras intercelulares de vermelho e o colágeno de azul
26
(SCHMITZ et al., 2010). Observando-se as micrografias obtidas com este corante (Figuras 28
a 30), pode-se verificar elevada quantidade celular, assim como formação de colágeno
(indicada pelas setas) em todas as concentrações de kartogenina, sugerindo diferenciação das
células-tronco mesenquimais dentárias em condrócitos. Todavia, o aumento da concentração
de kartogenina não induziu maior formação de fibras de colágeno, indicando que a menor
concentração do fator de diferenciação seja a mais indicada visando a economia do reagente.
Figura 28 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
0,1 µmol/L de kartogenina coradas com tricrômico de Masson. Barra de escala: 50 µm.
0,1
µm
ol/
L K
GN
27
Figura 29 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
1 µmol/L de kartogenina coradas com tricrômico de Masson. Barra de escala: 50 µm.
Figura 30 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
10 µ µmol/L de kartogenina coradas com tricrômico de Masson. Barra de escala: 50 µm.
1 µ
mo
l/L
KG
N10 µ
mol/
L K
GN
28
Figura 31 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
0,1 µmol/L de kartogenina coradas com H&E. Barra de escala: 50 µm.
Figura 32 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
1 µmol/L de kartogenina coradas com H&E. Barra de escala: 50 µm.
0,1
µm
ol/
LK
GN
1 µ
mo
l/L
KG
N
29
Figura 33 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
10 µmol/L de kartogenina coradas com H&E. Barra de escala: 50 µm.
Figura 34 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
0,1 µmol/L de kartogenina coradas com azul de alcian. Barra de escala: 50 µm.
10
µm
ol/
L K
GN
D
0,1
µm
ol/
L K
GN
30
Figura 35 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
1 µmol/L de kartogenina coradas com azul de alcian. Barra de escala: 50 µm.
Figura 36 – Microscopia das células cultivadas em sistema micromass na presença de
10 µmol/L de kartogenina coradas com azul de alcian. Barra de escala: 50 µm.
1 µ
mo
l/L
KG
N1
0 µ
mo
l/L
KG
N
31
A coloração H&E é a principal técnica de coloração de tecidos em histologia. A
hematoxilina comporta-se como uma base, tendo afinidade por compostos presentes nos
tecidos celulares que apresentam radicais ácidos, como proteínas e ácidos nucléicos, corando
de azul a roxo os núcleos celulares e a matriz extracelular de tecidos cartilaginosos. Já a
eosina, sendo acidófila, cora de rosa a roxo predominantemente o citoplasma e as fibras de
colágeno (SCHMITZ et al., 2010). Conforme verificado para o tricrômico de Masson, pode-se
notar nas Figuras 31, 32 e 33 elevada densidade celular e formação de colágeno (indicadas
pelas setas) em todas as concentrações de kartogenina, confirmando que a concentração de
100 nmol/L seria, portanto, preconizada.
O corante azul de Alcian é utilizado para corar de azul polissacarídeos ácidos, como os
glicosaminoglicanos encontrados na cartilagem (YAMASHITA; KRAWETZ; RANCOURT,
2009). Observando-se as micrografias feitas com este corante (Figuras 34 a 36), pode-se
inferir que houve elevada produção de glicosaminoglicanos em todas as concentrações de
kartogenina, também indicando diferenciação das células-tronco em condrócitos.
Diante do exposto, todas as colorações indicaram diferenciação das células dentárias
em condrócitos e que não houve diferenças significativas entre as três concentrações de
kartogenina empregadas, sugerindo que a menor concentração do fator de diferenciação seja
já suficiente. Assim, a diferenciação das células-tronco nos suportes poliméricos foi realizada
com 100 nmol/L de kartogenina no meio de cultivo.
4.3 Cultivo das células-tronco dentárias nos suporte poliméricos
4.3.1 Análise das CTMs aderidas nos suportes por microscopia eletrônica de varredura
(MEV)
As células-tronco foram cultivadas nos suportes poliméricos com adição de
100 nmol/L de kartogenina e na presença e na ausência de 100 nmol/L de dexametasona no
meio de cultivo condrogênico, durante 14 dias. Após o cultivo, as células aderidas no suporte
foram submetidas às análises de microscopia eletrônica de varredura.
O intuito desta análise era verificar se as células-tronco dentárias haviam aderido,
proliferado e se diferenciado em condrócitos através da comparação da variação na densidade
celular nos tempos de 24 horas e 14 dias e na formação de redes de colágeno e
glicosaminoglicanos características da linhagem de condrócitos. O aspecto típico das culturas
32
realizadas nos suportes de quitosana-xantana e de PCL com e sem dexametasona são
mostrados nas Figuras 37 e 38, respectivamente.
Observando-se as micrografias dos suportes de QX e QXp do tempo de 24 horas
(Figuras 37A e 37B), pode-se inferir que a adesão celular ocorre já nas primeiras horas de
contato com os suportes, o que demonstra que os mesmos são adequados para esta finalidade.
Aparentemente, a quantidade de células aderidas nos suportes perfurados e íntegros é a
mesma nas primeiras horas de inoculação. No tempo de 14 dias (Figuras 37C a 37F), verifica-
se elevada densidade celular em ambos os suportes, indicando que os scaffolds permitem que
as células se repliquem e cresçam de maneira satisfatória. Entretanto, observa-se que as
células cultivadas nos suportes perfurados apresentam morfologia mais circular (característica
essencial de condrócitos) quando comparadas com as células dos suportes íntegros, que
crescem formando agregados celulares. Não foram detectadas diferenças relevantes entre as
células cultivadas na presença e na ausência de dexametasona neste tipo de matriz.
Já para os suportes de PCL, as micrografias do tempo de 24 horas (Figuras 38A e 38B)
demonstram que a adesão celular também ocorre já nas primeiras horas de contato com os
suportes, porém em uma quantidade inferior quando comparada aos suportes de QX. Apesar
disso, pode-se também inferir que os suportes de PCL são adequados para a adesão celular,
porém de maneira menos eficiente que os suportes de QX. Assim como para os suportes de
QX, os suportes de PCL contendo ou não dexametasona não apresentaram diferenças na
quantidade de células aderidas nas primeiras horas de inoculação.
No tempo de 14 dias de cultivo com adição de dexametasona no meio de cultura
(Figuras 38C e 38D), verifica-se elevada densidade celular em ambos os suportes de PCL,
demonstrando que os suportes permitem proliferação celular de forma eficiente. Porém, o
suporte que possui dexametasona em sua formulação ainda apresentou maior quantidade de
fibras de colágeno e glicosaminoglicanos, indicando que este scaffold possibilita a
diferenciação de maneira mais eficaz das células-tronco dentárias em condrócitos.
33
Figura 37 – MEV dos suportes de QX (A, C e E) e de QXp (B, D e F) nos tempos de 24 horas
e 14 dias com e sem dexametasona adicionada ao meio de cultivo.
a
24 h
ora
s
b
14 d
ias
com
dex
amet
asona
c
e
d
f
14 d
ias
sem
dex
amet
asona
34
Figura 38 – MEV dos suportes de PCL (A, C e E) e de PCL com dexametasona (B, D e F) nos
tempos de 24 horas e 14 dias com e sem dexametasona no meio de cultivo.
Comparando-se as micrografias de 14 dias com e sem adição de dexametasona no
meio de cultivo (Figuras 38C a 38F), verifica-se que quando o fármaco está presente na forma
líquida no meio de cultivo, a diferenciação e proliferação celular é maior. Entretanto, quando
se analisa as micrografias de 14 dias sem dexametasona no meio de cultivo (Figuras 38E e
38F), observa-se que o scaffold que contém o fármaco apresenta maiores quantidades de
células e redes de colágeno e glicosaminoglicanos que os suportes sem dexametasona,
confirmando de maneira mais explícita que sua utilização na diferenciação celular em
condrócitos é mais efetiva.
a b
c
e
d
f
24 h
ora
s14 d
ias
com
dex
amet
asona
14 d
ias
sem
dex
amet
asona
35
Como neste trabalho tinha-se por meta analisar se os scaffolds produzidos seriam
capazes de serem utilizados para a recuperação de lesões cartilaginosas in vivo, verificou-se
com base na análise dos dados obtidos que o suporte que contém dexametasona torna-se mais
interessante para esta utilização, visto que ele resulta em diferenciação de maneira mais eficaz
das células-tronco cultivadas no mesmo. Após a implantação, o suporte contendo o fármaco
supostamente poderia auxiliar na diferenciação de células-tronco do próprio organismo, além
de ter atividade imunossupressora e anti-inflamatória (KLEIMAN; TUCKERMANN, 2007).
Em síntese, pode-se considerar que os suportes de QXp (perfurados) e de PCL com
dexametasona (PCLd) são mais eficazes que os suportes de QX não perfurado e de PCL sem o
fármaco na diferenciação de células-tronco mesenquimais dentárias em condrócito.
Comparando-se os suportes de QXp e PCLd, pode-se inferir que os suportes de QXp
apresentam características que favorecem a engenharia do tecido cartilaginoso, visto que este
suporte apresentou maior densidade celular.
Destaca-se que não foi possível quantificar as células nos suportes, visto que a técnica
de trispinização normalmente utilizada para este fim não funciona de maneira apropriada nos
suportes porosos avaliados, particularmente nas matrizes compostas de quitosana e xantana.
Também análises com indicadores metabólicos como o MTT não fornecem resultados
inequívocos, já que os mesmos podem ser adsorvidos pelas matrizes poliméricas, em especial
pelas de QX.
4.3.2 Análise das CTMs aderidas nos suportes por histologia
Após o cultivo nos suportes, as células foram submetidas às análises histológicas com
tricrômico de Masson, H&E e azul de Alcian, visando, pelo uso de métodos de coloração
específica, detectar a presença de colágeno e de glicosaminoglicanos.
Para realizar esta análise, é necessário que os suportes poliméricos sejam imersos em
parafina líquida a 60 °C. Nesta etapa do procedimento experimental, os suportes de PCL não
resistiram à temperatura elevada, desintegrando-se, já que a temperatura de fusão da PCL está
entre 59 e 64 °C (MOHAMED; YUSOH, 2015). Dessa maneira, não foi possível realizar os
cortes histológicos para os suportes de PCL, somente para os de QX e QXp. Todavia, as
análises de microscopia eletrônica de varredura já indicaram que os suportes de PCL são
adequados para o cultivo de células-tronco mesenquimais dentárias. As micrografias das
36
histologias dos suportes de quitosana-xantana sem e com células cultivadas encontram-se nas
Figuras 39 a 53.
Analisando-se as imagens obtidas em presença de tricrômico de Masson (Figuras 39 a
43), observou-se produção de fibras de colágeno (indicadas pelas setas) nos suportes
cultivados tanto na presença quanto na ausência de dexametasona e de perfuração nos
suportes. Nas análises realizadas com o corante H&E (Figuras 44 a 48) pode-se notar também
formação de fibras de colágeno (indicadas pelas setas) em todas as micrografias, sugerindo
que as células-tronco dentárias se diferenciaram em condrócitos tanto na presença quanto na
ausência de dexametasona, também confirmando o que foi observado para as micrografias de
MEV.
Para a coloração de azul de Alcian (Figuras 49 a 53), foram observadas células
completamente coradas de azul, indicando produção de glicosaminoglicanos pelas mesmas, o
que também pressupõe diferenciação dessas células em condrócitos.
Diante do exposto, todas as colorações indicaram diferenciação das células dentárias
em condrócitos e que não houve diferenças significativas entre a presença e a ausência de
dexametasona no meio de cultivo condrogênico e na presença e ausência de perfuração.
37
Figura 39 – Micrografia do suporte de QX sem células corado com Tricrômico de Masson.
Barra de escala: 50 µm.
Figura 40 - Micrografia do suporte de QX com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na presença de dexametasona corado com Tricrômico de
Masson. Barra de escala: 50 µm.
QX
Sem
cél
ula
s
QX
com
dex
amet
asona
38
Figura 41 – Micrografia do suporte de QXp com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na presença de dexametasona corado com Tricrômico de
Masson. Barra de escala: 50 µm.
Figura 42 – Micrografia do suporte de QX com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na ausência de dexametasona corado com Tricrômico de
Masson. Barra de escala: 50 µm.
QX
p
com
dex
amet
aso
na
QX
sem
dex
amet
aso
na
39
Figura 43 – Micrografia do suporte de QXp com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na ausência de dexametasona corado com Tricrômico de
Masson. Barra de escala: 50 µm.
Figura 44 – Micrografia do suporte de QX sem células corado com H&E. Barra de escala:
50 µm.
QX
p
sem
dex
amet
aso
na
QX
sem
cél
ula
s
40
Figura 45 – Micrografia do suporte de QX com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na presença de dexametasona corado com H&E. Barra de escala:
50 µm.
Figura 46 – Micrografia do suporte de QXp com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na presença de dexametasona corado com H&E. Barra de escala:
50 µm.
QX
com
dex
amet
aso
na
QX
p
com
dex
amet
asona
41
Figura 47 – Micrografia do suporte de QX com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na ausência de dexametasona corado com H&E. Barra de escala:
50 µm.
Figura 48 – Micrografia do suporte de QXp com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na ausência de dexametasona corado com H&E. Barra de escala:
50 µm.
QX
sem
dex
amet
aso
na
QX
sem
dex
amet
aso
na
QX
p
sem
dex
amet
aso
na
QX
p
sem
dex
amet
aso
na
42
Figura 49 – Micrografia do suporte de QX sem células corado com azul de Alcian. Barra de
escala: 50 µm.
Figura 50 – Micrografia do suporte de QX com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na presença de dexametasona corado com azul de Alcian. Barra
de escala: 50 µm.
QX
Sem
cél
ula
s
QX
com
dex
amet
aso
na
43
Figura 51 – Micrografia do suporte de QXp com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na presença de dexametasona corado com azul de Alcian. Barra
de escala: 50 µm.
Figura 52 – Micrografia do suporte de QX com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na ausência de dexametasona corado com azul de Alcian. Barra
de escala: 50 µm.
QX
p
com
dex
amet
aso
na
QX
sem
dex
amet
aso
na
44
Figura 53 – Micrografia do suporte de QXp com células cultivadas durante 14 dias com
100 nmol/L de kartogenina e na ausência de dexametasona corado com azul de Alcian. Barra
de escala: 50 µm.
QX
p
sem
dex
amet
aso
na
45
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES
5.1 Conclusões
Perante os estudos realizados neste trabalho foi possível obter conclusões tanto no
âmbito do preparo e das caracterizações dos suportes quanto no âmbito da adesão,
crescimento e diferenciação das células-tronco dentárias cultivadas nos suportes.
Em relação ao preparo e caracterização dos suportes, pode-se concluir que:
1) O preparo dos suportes foi realizado de forma eficaz, através da adaptação do protocolo
descrito por Bellini et al. (2012) para os suportes de QX. A neutralização destes suportes
durante o preparo visando a eliminação das etapas de lavagem não foi efetiva, impedindo a
formação de uma membrana homogênea e estável.
2) Os suportes QX perfurados apresentaram fissuras na superfície, indicando potencial de
melhoria da interconectividade entre os poros.
3) As espessuras observadas para os suportes QX, QXp, PCL e PCLd atingiram valores que
indicaram que, idealmente, os scaffolds podem ser utilizados para lesões cartilaginosas
parciais. Para o tratamento de lesões condrais severas, seria necessária a sobreposição de
várias unidades do material.
4) Nos suportes de QX, a maior capacidade de absorção foi detectada em presença de água,
sendo que o suporte perfurado absorveu mais água que o íntegro. Para os suportes de PCL
e PCLd, a capacidade de absorção de soluções aquosas foi pequena.
5) A incorporação da dexametasona por impregnação nos suportes de QX não foi eficiente na
concentração testada, inviabilizando sua utilização. Para os suportes de PCL, a
dexametasona foi incorporada por adição direta, e apresentou liberação máxima em
72 horas, atingindo uma concentração adequada para a diferenciação celular.
6) As análises de TGA indicaram que a adição de dexametasona no suporte de PCL não altera
a estabilidade e decomposição do suporte. Para os suportes de QX, as análises de TGA
indicaram a ocorrência de três eventos térmicos.
7) As análises de cristalinidade demonstraram estrutura amorfa para QX e cristalina para os
suportes de PCL.
46
No tocante ao estudo de adesão, crescimento e diferenciação das células-tronco, pode-
se concluir que:
1) As células-tronco mesenquimais dentárias analisadas apresentaram taxa específica máxima
de crescimento (µmáx), de 0,036 h-1
, e tempo de duplicação celular de, aproximadamente,
23 horas.
2) A citotoxicidade dos suportes poliméricos em relação a estas células foi baixa para todas as
matrizes, sendo os de PCL menos citotóxicos que os de QX.
3) O cultivo das células-tronco dentárias no sistema de micromass em presença de diferentes
concentrações de kartogenina indicou que na menor concentração (0,1 mol/L) já se
observa diferenciação em nível apropriado por análise de microscopia.
4) Os ensaios de microscopia eletrônica de varredurra e a análise histológica dos suportes
com as células-tronco dentárias neles inoculadas indicaram adesão, proliferação e
diferenciação das células em condrócitos, mostrando também que a kartogenina é eficiente
na diferenciação celular e que o suporte de QX perfurado é o mais apropriado para a
aplicação na área de Engenharia de Tecidos cartilaginosos dentre os testados, visto que
nestes suportes ocorrem adesão e proliferação mais significativas que nos suportes de PCL.
5.2 Sugestões para trabalhos futuros
Para dar continuidade aos estudos nesta linha de atuação, recomenda-se:
1) A avaliação do comportamento das células cultivadas nos suportes pela reação em cadeia
da polimerase em tempo real (RT-PCR) para quantificar a produção de colágeno tipo II,
agrecanos e SOX9;
2) A análise do desempenho in vivo dos suportes de QXp e de PCLd, uma vez que a proposta
de regeneração cartilaginosa é destinadas a humanos;
3) A incorporação da dexametasona por impregnação mediada por CO2 supercrítico nos
suportes de QX, uma vez que o CO2 supercrítico pode apresentar alto poder de solvatação,
mas com viscosidade e difusividade similares às de um gás, facilitando a transferência do
agente bioativo para o interior da matriz. Além disso, esta técnica é de baixo custo, não
utiliza solventes orgânicos, não gera resíduos e poderia propiciar a impregnação de
dexametasona de forma bastante homogênea na matriz polimérica em condições amenas de
temperatura, o que contribuiria para a integridade de substâncias termossencíveis.
47
4) A realização de análises histológicas das células nos suportes de PCL por congelamento,
visto que estes suportes não se mantêm íntegros nas condições das análises histológicas
convencionais;
5) O desenvolvimento de scaffolds de QX, PCL e outros tipos de polímeros em outros estados
ou formatos, como géis e micropartículas, para o cultivo de células-tronco mesenquimais
para a diferenciação em condrócitos, visto que estes tipos de scaffods permitem injeção
intra-articular na lesão condral.
48
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO I
Figura AI – Curva de calibração de dexametasona obtida a partir da absorbância a 242 nm de
diferentes concentrações da droga dissolvida em etanol/água (5:95 %).
Figura AII – Curva de calibração de dexametasona obtida a partir da absorbância a 242 nm de
diferentes concentrações da droga dissolvida em PBS.
De acordo com os dados obtidos, considerou-se satisfatória as curvas-padrão obtidas,
visto que os valores de absorbância encontraram-se dentro de um intervalo adequado para o
equipamento utilizado e os R2
são próximos de 1,0.
y = 32,592x + 0,0271
R² = 0,999 0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070
Ab
sorb
ânci
a (2
42
nm
)
Concentração (mg/mL)
y = 36,187x + 0,0275
R² = 0,9929
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070
Ab
sorb
ânci
a (2
42
nm
)
Concentração (mg/mL)