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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

BRUNA HAWERROTH

AVALIAÇÃO IN SÍLICO E IN VIVO DO POTENCIAL

ANTICONVULSIVANTE E TOXICOLÓGICO DE

DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS

Itajaí (SC)

2017

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

BRUNA HAWERROTH




Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profª. Drª. Fátima de

Campos Buzzi Co-orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria de Souza

Itajaí (SC)

Julho, 2017

À Deus que é meu refúgio e me faz vitoriosa pelo simples fato de me dar uma nova oportunidade todos os dias. Seu fôlego de vida em mim me tornou capaz e me deu coragem para enfrentar um novo mundo de possibilidades.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, que me presenteou com o dom da vida e me ensinou a

lutar pelas conquistas dos meus ideais. A Ele que foi minha fortaleza para enfrentar todas as

dificuldades e iluminou todos os passos da minha caminhada.

A Nossa Senhora por me segurar em seu colo santo e acolhedor. Por interceder e levar

minhas orações ao seu filho Jesus.

Aos meus pais, Vilson e Jussara, que sempre acreditaram que eu era capaz. Mãe, seu

cuidado, carinho e dedicação me fortaleceram e me deram esperança para seguir. Pai, sua

presença me oferece segurança e certeza de que não estou sozinha nunca.

Ao meu irmão, William, pela paciência e por torcer pelo meu sucesso.

Ao meu namorado, Danilo, pessoa com quem amo partilhar os dias. Com você a vida

ganhou cor. Sou grata a Deus pela sua vida, por dedicar todo seu amor por mim, por suas

orações e por sonhar junto comigo.

Aos amigos dos grupos de oração jovem Obra Nova e Javé Nessi, que muitas vezes me

estenderam a mão e me mostraram o valor da minha fé. Valeu a pena toda distância, todo

sofrimento e toda renúncia. Obrigada por cada momento e por cada rezar, hoje colho frutos da

vida em oração.

As professoras orientadoras Fátima e Márcia pela paciência, compreensão e convívio.

Estendo os agradecimentos aos avaliadores Eduardo Dalmarco, Luisa Mota e Rivaldo Niero.

Aos companheiros de laboratório por todo apoio e aprendizado compartilhados. Em

especial agradeço a Bianca e a Aline, minhas parceiras de bancada e café da tarde. Sentirei

falta das nossas conversas e da parceria.

A minha única e companheira amiga de orações pelo laboratório, Juliana, por todo

carinho e aconselhamento. Obrigada por partilhar a sua fé comigo e por servir a Deus como eu.

A minha companheira de disciplinas Daniele, por toda parceria e consolo. Sua

presença foi muito importante na correria de cada semestre.

As pesquisadoras Elaine, Maria Tereza e Cristiani, que iniciaram os estudos e

proporcionaram a conclusão deste trabalho.

As alunas Ana Paula Dalmagro, Luisa Bolda e Priscila Zimath, por todo auxílio

durante os experimentos no laboratório de farmacologia. Sem a dedicação de vocês não conseguiria

concluir esta etapa de formação.

A CAPES/PROSUP pelo apoio financeiro.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente na construção deste trabalho.




Bruna Hawerroth

Julho/2017

Orientadora: Fátima de Campos Buzzi, Drª.

Co-orientadora: Márcia Maria de Souza, Drª.

Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.

Núero de páginas: 178.

A epilepsia é uma doença neurológica que afeta aproximadamente 1% da população, caracterizada por crises convulsivas recorrentes, decorrentes de descargas elétricas anormais causadas principalmente pelo desequilíbrio dos sistemas de neurotransmissão GABAérgica, glutamatérgica e oxidonitrérgica. O tratamento é realizado com fármacos antiepilépticos (FAEs) que reduzem a ictogênese e apresentam efeitos adversos como alterações comportamentais, hepáticas e renais, no qual, 30% dos pacientes não são responsivos ao tratamento disponível. Portanto, se faz importante a descoberta de novas

substâncias com potencial anticonvulsivante. As tiazolidinodionas (TZDs) são fragmentos que possuem esta atividade. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anticonvulsivante e toxicológico in vivo e in sílico de derivados tiazolidinodiônicos. Uma série de 5 derivados TZDs, nomeados como A1, D1, D2, D3 e D4, foi avaliada in sílico por métodos computacionais como Molinspiration, PreADMET e OSIRIS, para investigação de suas propriedades físico-químicas e bioatividade. Posteriormente, os compostos foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) na dose de 10 mg/Kg, e avaliados em testes farmacológicos in vivo, utilizando camundongos Swiss Webster machos e fêmeas, a partir de testes de convulsão induzida quimicamente por

pentilenotetrazol (PTZ) (85 mg/Kg, i.p.) e estricnina (STR) (4 mg/Kg, i.p.); e eletricamente, sendo seus efeitos comparados com veículo, gabapentina (20 mg/Kg, i.p.), fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), e carbamazepina (20 mg/Kg, i.p.). Testes como o labirinto em cruz elevado (LCE), esquiva inibitória (EI), sono induzido por barbitúricos (MSB) e campo aberto (CA) foram utilizados para avaliar o efeito do composto de melhor atividade anticonvulsivante no comportamento dos animais. O composto que apresentou atividade anticonvulsivante nos testes de triagem também foi avaliado na dose de 100 mg/Kg, v.o. A investigação do mecanismo de ação da propriedade

anticonvulsivante do composto D4 a partir do teste de convulsão induzida por PTZ, foi realizado utilizando antagonistas como flumazenil, para avaliação da via GABAérgica, ketamina, para via glutamatérgica, e L-arginina, éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-NAME) e 7-nitroindazol (7-NI), para a via oxidonitrérgica. Os animais foram avaliados após tratamento de 21 dias com D4 para investigação de efeitos tóxicos e comportamentais. O plasma dos animais foi coletado para análise de parâmetros hepáticos (aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, fosfatase alcalina e proteínas totais), renais (ureia e creatinina), glicose e creatinofosfoquinase. O tecido

cerebral foi analisado em testes ex vivo. Para isto, foi realizada a quantificação de glutationa reduzida (GSH), hidroperóxidos lipídicos (LOOH) e a determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD). Os animais foram submetidos a controle de

peso corporal e seus órgãos foram pesados para verificação de alterações morfológicas. Os resultados mostraram que nenhum dos compostos violou os parâmetros de Lipinski, não apresentaram perfil tóxico indicado pelo OSIRIS, indicaram a capacidade de os compostos atravessarem a barreira hematoencefálica (BHE) e terem boa absorção intestinal (AIH). Os compostos D1, D2, D3 e D4 apresentaram atividade anticonvulsivante no teste de convulsão induzida por STR e os compostos A1, D1 e D4 apresentaram ação anticonvulsivante no teste de convulsão induzida por eletrochoque. O composto que aumentou o limiar convulsivo dos animais nos testes de indução de

convulsão química por PTZ (51,98%) e STR (51,67%), e elétrica (65%) foi o composto D4, sendo escolhido para a continuidade dos experimentos. Este composto não produziu déficit motor no CA e de memória na EI, apresentou efeito ansiolítico observado no LCE e efeito hipnótico no MSB. O composto D4 aumentou o limiar convulsivo em 24,31% em relação ao grupo controle por v.o. O efeito anticonvulsivante foi revertido significativamente com o pré-tratamento com 7-NI, sugerindo o envolvimento da via oxidonitrérgica. No teste CA os animais não demonstraram alterações motoras e comportamentais. O composto D4 aumentou significativamente o limiar convulsivo após

tratamento subcrônico, observado no teste de convulsão induzida por PTZ. O composto D4 não alterou significativamente os níveis de aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina, ureia e creatinofosfoquinase, mas alterou outros parâmetros bioquímicos, como glicose, creatinina, proteínas totais e alanina aminotransferase, portanto, são necessários estudos mais aprofundados para a confirmação de possível hepatotoxicidade e nefrotoxicidade em tratamento subcrônico. Os níveis de GSH e SOD não foram significativos, mas houve aumento de LOOH no hipocampo, compatível com o envolvimento da pontencialização de longa duração (LTP). Não foi observada alterações

morfológicas nos órgãos e no desenvolvimento ponderal dos animais. Os resultados sugerem que o composto D4 pode ser útil no manejo de crises epilépticas (CEs), embora estudos adicionais são importantes para garantir a sua segurança.

Palavras-chave: Anticonvulsivantes. Epilepsia. Tiazolidinodionas.

IN SÍLICO AND IN VIVO EVALUATION OF

ANTICONVULSANT AND TOXICOLOGICAL

POTENTIAL OF THIAZOLIDINEDIONE DERIVATIVES

Bruna Hawerroth

July/2017

Advisor: Fátima de Campos Buzzi, Drª.

Co-advisor: Márcia Maria de Souza, Drª.

Concentration area: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.

Number of pages: 178.

Epilepsy is one of the most common neurological disorders, and affects about 1% of the population. It is characterized by recurrent seizures, due to abnormal electrical discharges caused mainly by an imbalance of the GABAergic, glutamatergic and oxide nitrogenic neurotransmission systems. Treatment involves antiepileptic drugs (AEDs) that reduce ictogenesis but have adverse effects such as behavioral, hepatic and renal changes. Given that 30% of patients are unresponsive to the available treatment, it is important to discover new substances with anticonvulsant potential. Thiazolidinediones (TZD) are fragments that possess this activity. The aim of this study was to synthesize

and evaluate the in silico and in vivo anticonvulsant and toxicological potential of TZD derivatives. A series of 5 TZD derivatives, namely A1, D1, D2, D3 and D4, were evaluated in silico by computational methods such as Molinspiration, PreADMET and OSIRIS, for investigation of their physicochemical properties and bioactivity. The compounds were then administered intraperitoneally (i.p.) at a dose of 10 mg/Kg, and evaluated in in vivo pharmacological tests using male and female Swiss Webster mice, by seizures chemically induced by pentylenetetrazole (PTZ) (85 mg/Kg, i.p.) and strychnine (STR) (4 mg/Kg, i.p.); and electrically induced convulsions, comparing their

effects with vehicle, gabapentin (20 mg/Kg, i.p.), phenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), and carbamazepine (20 mg/Kg, i.p.). Tests such as the Elevated plus-maze (EPM), Inhibitory Avoidance (IA), Barbiturate-induced Sleeping test (MSB) and the Open-Field test (OF) were used to evaluate the effect of the compound with the best anticonvulsant activity on the animal’s behavior. The compound that showed anticonvulsant activity in both screening tests was also evaluated at a dose of 100 mg/Kg, v.o. The evaluation of the mechanism of action of the anticonvulsant property of compound D4 through the PTZ-induced seizure test was performed using antagonists such as flumazenil, for

GABAergic pathway evaluation, ketamine, for glutamatergic pathway, and L-arginine, N-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and 7-nitroindazole (7-NI), for the oxide nitrergic pathway. Mice were evaluated after 21 days with D4 to investigate the toxic and behavioral effects. Blood plasma was collected from the animals for analysis of hepatic parameters (aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase and total proteins) and renal parameters (urea and creatinine). Brain tissue was analyzed in ex vivo tests. For this purpose, the quantification of reduced glutathione (GSH), lipid hydroperoxides (LOOH) and determination of superoxide dismutase (SOD)

activity was performed. The animals were submitted to body weight control and their organs were weighed to determine morphological changes. The results showed that none of the compounds violated Lipinski’s rule or presented a toxic profile indicated by

OSIRIS; they indicated the ability of the compounds to cross the blood-brain barrier (BBB) and good intestinal absorption (IA). Compounds D1, D2, D3 and D4 showed anticonvulsant activity in STR-induced seizure test, and compounds A1, D1 and D4 presented anticonvulsant action the electroshock-induced seizure test. The compound that increased the seizure threshold of the animals in the PTZ (51.98%) and STR (51.67%) seizure induction tests, and in the electrical induction test (65%) was compound D4, which was therefore chosen for the remaining experiments. This compound did not produce motor deficit in the OF or memory deficit in the IA, and

demonstrated anxiolytic effect in EPM and hypnotic effect in MSB. Compound D4 increased the seizure threshold by 24.31% in relation to the control group per v.o. The anticonvulsant effect was significantly reversed with pre-treatment with 7-NI, suggesting the involvement of the oxidonitrergic pathway. In the OF test, the animals did not demonstrate any motor or behavioral changes. Compound D4 also increased the seizure threshold by 28.82% in the PTZ-induced test after subchronic treatment. This compound did not significantly alter the aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase and urea levels, but did alter other parameters, such as alanine

aminotransferase, total proteins and creatinine. More in-depth studies are therefore needed to confirm possible hepatotoxicity and nephrotoxicity in subchronic treatment. GSH and SOD levels were not significant, but there was an increase in LOOH level in the hippocampus, compatible with the involvement of long-term potentialization (LTP). No morphological changes were observed in the organs or weight development of the animals. The results suggest that compound D4 may be useful in the management of epileptic seizures, though additional studies are important to ensure their safety.

Keywords: Anticonvulsants. Epilepsy. Thiazolidinodiones.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Classificação das crises epilépticas de acordo com a área cerebral

afetada. ................................................................................................. 39 Figura 2. Figura ilustrativa da sinapse glutamatérgica e dos tipos de receptores

glutamatérgicos. .................................................................................... 46 Figura 3. Classificação dos receptores glutamatérgicos. ................................. 47 Figura 4. Imagem ilustrativa da estrutura do receptor GABAA. ...................... 48 Figura 5. Exemplos de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio

(EROs/ERNs). ...................................................................................... 52 Figura 6. Formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e o impacto

do estresse oxidativo e nitrosativo na função proteica............................. 53 Figura 7. Reações bioquímicas envolvidas na geração de espécies reativas de

oxigênio e mecanismos de defesa antioxidantes. .................................... 56 Figura 8. Período de introdução de fármacos antiepilépticos no mercado

farmacêutico entre 1857 e 2012. ............................................................ 58 Figura 9. Estimativa de crescimento e gastos globais com medicamentos até

2021. .................................................................................................... 68 Figura 10. Medicamentos globais em fase avançada de desenvolvimento em

2016. .................................................................................................... 69 Figura 11. Média de prazos para as fases clínicas e aprovação de entidades

terapêuticas entre 2005 e 2009. .............................................................. 70 Figura 12. Taxa de sucesso de aprovação clínica. .......................................... 70 Figura 13. Esquema estrutural da barreira hematoencefálica e capilares

periféricos. ............................................................................................ 74 Figura 14. Principais descritores utilizados para a predição da permeabilidade

da barreira hematoencefálica segundo Geldenhuys et al., 2015. .............. 75 Figura 15. Modelos estruturais de heterociclos de interesse biológico. ........... 78 Figura 16. Estrutura molecular da tiazolidina (A) e seu derivado tiazolidina-2,4-

diona (TZD) (B). ................................................................................... 79 Figura 17. Agentes antihiperglicêmicos contendo o núcleo TZD. ................... 80 Figura 18. Rota sintética para a obtenção dos derivados sulfonamídicos

benzilidenotiazolidinodionas. ................................................................ 83 Figura 19. Foto ilustrativa do aparato de campo aberto (Open Field).............. 89 Figura 20. Foto ilustrativa do aparato e esquema do teste de esquiva inibitória.

............................................................................................................. 90 Figura 21. Foto ilustrativa do aparato do labirinto em cruz elevado (Plus-maze).

............................................................................................................. 91 Figura 22. Partes do cérebro de camundongos utilizadas para obtenção das

amostras. .............................................................................................. 94 Figura 23. Estrutura química do pentilenotetrazol (PTZ). ............................. 107

Figura 24. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.),

da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste

de convulsão induzida por pentilenotetrazol. ........................................108 Figura 25. Estrutura química do ácido gama-aminobutírico (GABA), da

gabapentina e do fenobarbital. ..............................................................109 Figura 26. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.),

da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste

de convulsão induzida por estricnina. ...................................................110 Figura 27. Efeito dos compostos A1, D1, D2, D3 e D4 (10 mg/Kg, i.p.) e da

carbamazepina (20 mg/Kg, i.p.) sobre a porcentagem de crise (A) e

duração da extensão clônica dos membros posteriores dos animais (B)

submetidos ao teste de convulsão ECM. ...............................................112 Figura 28. Efeito do composto D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg, i.p., sobre a

latência da crise convulsiva no teste de convulsão induzida por PTZ. ....113 Figura 29. Efeito anticonvulsivante do composto D4 (100 mg/Kg, v.o.) e do

fenobarbital (100 mg/Kg, v.o.) no teste de convulsão induzida por

pentilenotetrazol. .................................................................................115 Figura 30. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre a consolidação da

memória no teste de esquiva inibitória. .................................................118 Figura 31. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e diazepam (DZP) (0,75

mg/Kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais: (A) frequência de entradas nos braços abertos; e (B) tempo de permanência nos braços

abertos, de animais submetidos ao plus-maze. ......................................120 Figura 32. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre: (A) latência do sono e

(B) tempo total de sono, no teste de sono induzido por barbitúrico. .......121 Figura 33. Influência da via GABAérgica sobre o efeito anticonvulsivante do

composto D4 (10 mg/Kg, i.p.)...............................................................123 Figura 34. Influência da via glutamatérgica sobre o efeito anticonvulsivante do

composto D4 (10 mg/Kg, i.p.). .............................................................126 Figura 35. Influência da via oxidonitrérgica sobre o efeito anticonvulsivante do

composto D4 (10 mg/Kg, i.p.)...............................................................129 Figura 36. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros comportamentais avaliados no teste

Open Field. .........................................................................................131 Figura 37. Efeito anticonvulsivante subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg,

i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por

PTZ. ....................................................................................................132 Figura 38. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros hepáticos avaliados no plasma. ........136 Figura 39. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros renais avaliados no plasma...............137

Figura 40. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre glicose e creatinofosfoquinase avaliados no plasma.

........................................................................................................... 139 Figura 41. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de glutationa reduzida (GSH). ............ 141 Figura 42. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de hidroperóxidos lipídicos (LOOH). .. 143 Figura 43. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis da atividade de superóxido dismutase (SOD). ................................................................................................ 144

Figura 44. Porcentagem do aumento de peso dos animais submetidos ao

tratamento subcrônico com o composto D4. ......................................... 146

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades físico-químicas de compostos e valores relacionados à

penetração da barreira hematoencefálica. ............................................... 77 Tabela 2. Estrutura, rendimento, R.f. e p.f. dos compostos em estudo. ........... 97 Tabela 3. Parâmetros de Lipinski e extensão da regra dos 5 dos compostos

tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software

Molinspiration. ................................................................................... 100 Tabela 4. Valores de druglikeness, drugscore e LogS dos compostos

tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software OSIRIS. ... 101 Tabela 5. Parâmetros farmacocinéticos (ADMET) dos compostos

tiazolidinodiônicos calculados pelo software PreADMET..................... 103 Tabela 6. Parâmetros farmacocinéticos considerados para boa permeabilidade

no sistema nervoso central. .................................................................. 106 Tabela 7. Efeitos do composto D4 avaliados no teste do Open Field. ............ 116 Tabela 8. Valores de referência de parâmetros bioquímicos plasmáticos em

camundongos Swiss............................................................................. 133 Tabela 9. Peso dos órgãos dos animais submetidos a tratamento subcrônico

com o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.). ... 147

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Classificações das crises epilépticas. ............................................. 41 Quadro 2. Fármacos antiepilépticos, mecanismos de ação e efeitos adversos. . 60 Quadro 3. Compostos tiazolidinodiônicos em estudo. .................................... 84 Quadro 4. Parâmetros toxicológicos dos compostos tiazolidinodiônicos

calculados pelo software OSIRIS......................................................... 102

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT – Serotonina

Ach – Acetilcolina ADMET – Absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade

AIH – Absorção Intestinal Humana

ALT – Alanina aminotransferase

AMPA – Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico

AP-1 – Proteína ativadora 1

AST – Aspartato aminotransferase

ATC – Ácido tricloroacético

BD – Bilirrubina direta

BHE – Barreira hematoencefálica

BI – Bilirrubina Indireta

BT – Bilirrubina Total

BTZD – Benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona BTZDCl – Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)-

metil]benzeno-sulfonila

CA – Campo aberto

cAMP – AMP cíclico

CAT – Catalase

CE/CEs – Crise epiléptica/Crises epilépticas

CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais

CoQH2 – Citocromo C redutase

COX-2 – Ciclooxigenase 2

CPK – Creatinofosfoquinase CRE – Creatinina

DA – Dopamina

DNA – Ácido desoxirribonucleico

DSM-V – Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders

DZP – Diazepam

ECM – Teste de Eletrochoque Máximo

EEG – Eletroencefalograma

EH – Esclerose hipocampal

EI – Esquiva inibitória

eNOS – Enzima óxido nítrico sintase endotelial

EPM – Erro padrão da média

ERNs – Espécies reativas de nitrogênio EROs – Espécies reativas de oxigênio

FAE/FAEs – Fármaco antiepiléptico/Fármacos antiepilépticos

FDA – Food and Drug Administration

FALC – Fosfatase alcalina

GABA – ácido-γ-aminobutírico

GAT1 – Transportador GABAérgico

GC – Guanilato ciclase

GLI – Glicose

GLU – Glutamato

GMPc – Guanosina monofosfato cíclica

GPx – Glutationa peroxidase

GSH – Glutationa reduzida

GSR – Glutationa redutase GST – Glutationa S-transferase

GSSG – Glutationa oxidada

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

IL-1β, IL-6 – Interleucinas 1β e 6

ILAE – Liga Internacional Contra a Epilepsia

iNOS – Enzima óxido nítrico sintase induzível

i.p. – Via intraperitoneal

IP3 – Inositoltrifosfato

IV – Infravermelho

KA – Cainato

LCE – Labirinto em cruz elevado (plus-maze) LEAC – Laboratório Escola de Análises Clínicas

L-NAME – Éster metílico de N-nitro-L-arginina

LogP – Coeficiente octanol/água

LogD – Coeficiente de distribuição

LOOH – Hidroperóxidos lipídicos

LPO – Peroxidação lipídica

MDA – Malonaldeído

MM – Massa molecular

MEG – Magnetoencefalografia

mGluR – Receptores metabotrópicos de glutamato

MSB – Teste do sono induzido por barbitúricos NA – Noradrenalina

NCEs – Novas entidades químicas

NF-kB – Fator nuclear kappa B

NMDA – N-metil-D-aspartato

NO – Óxido nítrico

NOS – Enzima óxido nítrico sintase

nNOS – Enzima óxido nítrico sintase neuronal

O2- – Ânion superóxido

OH- – Radical hidroxila

ONOO- – Ânion peroxinitrito

PCP – Fenilciclidina P&D – Pesquisa e desenvolvimento

PET – Tomografia por emissão de pósitrons

p.f. – Ponto de fusão

PLC – Fosfolipase C

PPARs – Receptores ativadores proliferadores de peroxissoma

PPREs – Elementos de resposta do proliferador de peroxissoma

PT – Proteínas totais

PTZ – Pentilenotetrazol

QSAR – Quantitative Structure Activity Relationships (Relação estrutura-

atividade) Rf – Fator de retenção

RM – Ressonância magnética

RMN 1H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RMN 13C - Ressonância magnética nuclear de carbono 13

RNAm – RNA mensageiro

RXRs – Receptores X-retinóides

SNC – Sistema Nervoso Central

SOD – Superóxido dismutase

SPECT – Tomografia computadorizada de emissão de um único fóton

STR – Estricnina

TNF-α – Fator de necrose tumoral α TPSA – Área de superfície polar

TZD/TZDs – Tiazolidinodiona/Tiazolidinodionas

URE – Ureia

VNS – Estimulação nervosa vagal

v.o. – Via oral

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 33

2 OBJETIVOS ............................................................................................ 35

2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 35

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 35

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 37

3.1 Epilepsia ................................................................................................ 37

3.1.1 Classificação das crises .................................................................... 38

3.1.2 Etiologia ........................................................................................... 41

3.1.3 Diagnóstico ...................................................................................... 43

3.1.4 Manifestações clínicas ...................................................................... 44

3.1.5 Hipóteses neuroquímicas envolvidas na epilepsia ............................. 45

3.1.5.1 Neurotransmissão glutamatérgica na epilepsia .................................. 45

3.1.5.2 Neurotransmissão GABAérgica na epilepsia ...................................... 48

3.1.5.3 Outras vias de neurotransmissão envolvidas na epilepsia .................. 49

3.1.5.4 Estresse oxidativo e estresse nitrosativo na epilepsia ......................... 50

3.1.6 Tratamento da epilepsia.................................................................... 57

3.1.6.1 Fármacos antiepilépticos (FAEs) ....................................................... 57

3.1.6.2 Antioxidantes como adjuvantes na terapia antiepiléptica ................... 63

3.2 Testes animais em epilepsia .................................................................. 63

3.3 Química medicinal e a descoberta de fármacos .................................... 66

3.4 Desenvolvimento de fármacos anticonvulsivantes ................................ 67

3.5 Planejamento de fármacos e ferramentas computacionais .................. 71

3.5.1 Parâmetros físico-químicos para a permeação e biodisponibilidade

por via oral in sílico ..................................................................................... 71

3.5.2 Parâmetros físico-químicos para a permeação no SNC in sílico ....... 74

3.6 Heterociclos ........................................................................................... 77

3.6.1 Tiazolidinodiona (TZD) .................................................................... 78

4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 83

4.1 Química................................................................................................. 83

4.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo ......................................... 83

4.1.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico ................................... 85

4.2 Atividade anticonvulsivante ................................................................. 86

4.2.1 Drogas e reagentes ........................................................................... 86

4.2.2 Via de administração ........................................................................ 86

4.2.3 Animais ............................................................................................ 87

4.2.4 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão

induzida por pentilenotetrazol e estricnina .................................................. 87


induzida eletricamente ................................................................................. 88

4.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre os parâmetros

comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field) ............. 88

4.2.7 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através do teste

da esquiva inibitória (EI) ............................................................................. 89

4.2.8 Avaliação do efeito ansiolítico do composto D4 através do teste do

labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze) .............................................. 90

4.2.9 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através do teste da

indução do sono por barbitúricos (MSB) ..................................................... 91

4.3 Análise do mecanismo de ação do composto D4 ................................... 91

4.3.1 Investigação da via GABAérgica sobre o mecanismo de ação da

propriedade anticonvulsivante do composto D4............................................ 91

4.3.2 Investigação da via glutamatérgica sobre o mecanismo de ação da


4.3.3 Investigação da via oxidonitrérgica sobre o mecanismo de ação da


4.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4 .................... 92

4.4.1 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 sobre os parâmetros

comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field) ............. 93

4.4.2 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 no teste de convulsão

induzida por PTZ ......................................................................................... 93

4.4.3 Investigação de alterações fisiológicas pelo tratamento com o

composto D4 através de análise laboratorial de plasma ................................ 93

4.4.4 Avaliação de parâmetros oxidativos no tecido cerebral ..................... 94

4.4.4.1 Preparação das amostras .................................................................. 94

4.4.4.2 Quantificação dos níveis de GSH ....................................................... 94

4.4.4.3 Determinação de LOOH .................................................................... 95

4.4.4.4 Determinação da atividade de SOD ................................................... 95

4.4.4.5 Mensuração da concentração de proteínas ........................................ 96

4.4.5 Análises complementares: avaliação do peso em tratamento

subcrônico com o composto D4 e peso dos órgãos isolados ........................... 96

4.4.6 Análise estatística ............................................................................. 96

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 97

5.1 Avaliação química ................................................................................. 97

5.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo: caracterização e

identificação ................................................................................................ 97

5.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico .................................. 98

5.1.2.1 Molinspiration - Análise de Lipinski (Regra dos cinco) ...................... 98

5.1.2.2 OSIRIS ............................................................................................ 100

5.1.2.3 PreADMET ..................................................................................... 102

5.1.2.4 Descritores físico-químicos e farmacocinéticos utilizados na

predição da permeabilidade no SNC dos compostos TZDs ......................... 103

5.2 Atividade anticonvulsivante ................................................................ 106


induzida por pentilenotetrazol e estricnina................................................. 106

5.2.2 Avaliação do efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo no

teste de convulsão induzida eletricamente ................................................. 111

5.2.3 Escolha do composto efetivo nos testes de convulsão induzida

quimicamente e eletricamente ................................................................... 113

5.2.4 Avaliação do efeito anticonvulsivante do composto D4 no teste de

convulsão induzida quimicamente por pentilenotetrazol administrado por via

oral ............................................................................................................ 114


comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field). .......... 115

5.2.4 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através da

esquiva inibitória (EI) ............................................................................... 116

5.2.5 Avaliação do efeito do composto D4 sobre parâmetros de ansiedade

através do teste do labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze) ............... 118

5.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através da indução

do sono por barbitúricos (MSB) ................................................................ 120

5.3 Mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4

.................................................................................................................. 121

5.3.1 Influência da via GABAérgica sobre a propriedade anticonvulsivante

do composto D4 .......................................................................................... 122

5.3.2 Influência da via glutamatérgica sobre a propriedade

anticonvulsivante do composto D4 ............................................................. 124

5.3.3 Influência da via oxidonitrérgica sobre a propriedade

anticonvulsivante do composto D4 ............................................................. 126

5.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4 .................. 130


comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field) ........... 130


induzida por PTZ....................................................................................... 131

5.4.3 Análise do plasma de animais tratados subcronicamente com o

composto D4 ............................................................................................... 132

5.4.3.1 Avaliação de parâmetros hepáticos ................................................. 133

5.4.3.2 Avaliação de parâmetros renais ...................................................... 136

5.4.3.3 Outros parâmetros .......................................................................... 138

5.4.4 Estresse oxidativo ........................................................................... 139

5.4.4.1 Quantificação dos níveis de GSH ..................................................... 140

5.4.4.2 Determinação de LOOH .................................................................. 141

5.4.4.3 Determinação da atividade de SOD ................................................. 143

5.4.5 Acompanhamento do desenvolvimento ponderal e efeito sobre o peso

dos órgãos dos animais submetidos ao tratamento subcrônico com o

composto D4 ............................................................................................... 144

5.4.5.1 Efeito do tratamento subcrônico com o composto D4 sobre o peso

corporal dos animais .................................................................................. 145

5.4.5.2 Avaliação do peso dos órgãos dos animais tratados subcronicamente

com o composto D4. .................................................................................... 146

6 CONCLUSÃO ....................................................................................... 149

REFERÊNCIAS ....................................................................................... 151

ANEXO 1 .................................................................................................. 177

33

1 INTRODUÇÃO

A epilepsia é uma doença caracterizada por crises convulsivas

recorrentes, resultantes de descargas elétricas excessivas e anormais no sistema

nervoso central (SNC). É uma doença mental que apresenta alterações

sensitivas, motoras e/ou de consciência (VAURIO; KARANTZOULIS; BARR,

2017). Trata-se de uma das condições neurológicas mais comuns no mundo,

afetando aproximadamente 1% da população, ou seja, cerca de 65 milhões de

pessoas (MOSHÉ et al., 2015; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017),

com um custo de aproximadamente US$ 15,5 bilhões anuais nos Estados

Unidos (WALSH et al., 2015). A doença é diagnosticada por exames clínicos,

eletrofisiológicos e de neuroimagem. As crises epilépticas (CEs) são

classificadas pela Liga Internacional Contra a Epilepsia (ILAE) em crises

generalizadas, que envolvem ambos os hemisférios e crises focais, que são

limitadas a um dos hemisférios cerebrais (MOSHÉ et al., 2015; SILVA;

CARDOSO; MACHADO, 2013; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).

A epilepsia não tem cura e a forma mais comum de tratamento é baseada na utilização de fármacos antiepilépticos (FAEs). Estes fármacos

atuam na modificação do potencial de descarga elétrica no SNC, reduzindo a

atividade convulsiva. Diversos mecanismos de ação parecem estar envolvidos

na fisiopatologia da epilepsia, mas a hipótese mais estudada está relacionada ao

desequilíbrio entre a hiperexcitação glutamatérgica e a hipoatividade

GABAérgica, relacionada com a geração de crises, isto é, a ictogênese (SILVA;

CABRAL, 2008; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017; WERNER;

COVEÑAS, 2015). A terapia com os FAEs é indispensável no controle das

crises, mas apresentam efeitos adversos e/ou colaterais, como: ganho de peso, cansaço, tonturas, reações alérgicas, depressão e psicoses, que podem ser

incapacitantes e diminuir a adesão ao tratamento (FERNANDES, 2013;

REMÍGIO, 2014; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).

Segundo alguns autores, 30% dos pacientes diagnosticados não são

responsivos ao tratamento, chamados de refratários, ou seja, quando não

respondem adequadamente as terapias (MOSHÉ et al., 2015; NAGAE et al.,

2016; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017). A indústria farmacêutica é

a responsável pela pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos fármacos

potenciais que satisfaçam as necessidades dos pacientes epilépticos, mas o

número de fármacos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA),

durante várias décadas, foi pouco significante. No entanto, em 2014, 41 novas entidades químicas (NCEs) foram aprovadas, indicando uma possível melhoria

no setor de P&D. Por isso, a indústria farmacêutica continua pesquisando e

investindo em desenvolvimento de novas moléculas bioativas (MIGNANI et

al., 2016a).

34

Neste aspecto, a indústria farmacêutica tem incessantemente buscado a

produção de fármacos mais seletivos e com menor latência de ação, toxicidade

e efeitos adversos, na tentativa de melhorar a adesão ao tratamento (MIGNANI

et al., 2016a). Na última década, uma prática adotada pela indústria farmacêutica na

obtenção de novas substâncias ativas, é o planejamento racional, identificação e

otimização dos compostos, capazes de atuarem em diversos alvos terapêuticos

(BARREIRO, 2009).

Para a obtenção de novos fármacos, são fundamentais as estratégias

moleculares in sílico, como a regra de Lipinski (LIPINSKI et al., 2001), pois

permitem a análise de características físico-químicas dos compostos em estudo,

além da predição de parâmetros farmacocinéticos, ou seja, que influenciam a

absorção, distribuição, metabolização, excreção e toxicidade (ADMET)

(NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).

Na grande maioria dos fármacos, os heterociclos são fragmentos

farmacologicamente ativos que apresentam diferentes heteroátomos no anel. As TZDs, derivadas da tiazolidina, são consideradas umas das classes mais

promissoras e desempenham papel fundamental na química medicinal

(SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016). Atualmente são atribuídas

diversas atividades biológicas ao núcleo TZD, entre elas a anticonvulsivante

(KORMANN, 2013; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).

Com base nestes trabalhos, o presente estudo objetivou estudar o

potencial anticonvulsivante e toxicológico in vivo e in sílico de derivados

tiazolidinodiônicos em camundongos, contribuindo para o desenvolvimento de

novos fármacos que possam ser utilizados no tratamento da epilepsia.

35

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar o potencial anticonvulsivante e toxicológico in vivo e in

sílico de derivados tiazolidinodiônicos.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar o perfil farmacocinético de compostos tiazolidinodiônicos,

nomeados A1, D1, D2, D3 e D4, a partir da técnica in sílico, segundo as regras de Lipinski;

Avaliar os parâmetros de absorção intestinal humana (AIH) e

penetração pela barreira hematoencefálica (BHE) dos compostos,

através da ferramenta computacional PreADMET;

Predizer o potencial de mutagenicidade e carcinogenicidade dos

compostos pelos softwares PreADMET e OSIRIS;

Avaliar valores de druglikeness, drugscore, propriedades físico-

químicas e perfil toxicológico dos compostos;

Avaliar os efeitos da série de compostos nos testes de convulsão

induzida quimicamente por PTZ e STR e, no teste de convulsão

induzida por eletrochoque; Selecionar a substância efetiva em todos os testes de triagem;

Estudar o composto mais promissor quanto a possíveis efeitos

hipnótico, motor, sobre a memória e ansiedade, observados em

anticonvulsivantes comerciais;

Avaliar a propriedade anticonvulsivante do composto selecionado por

via oral;

Determinar o possível mecanismo de ação do composto, nos testes de

convulsão induzida quimicamente por PTZ, investigando a influência

das vias glutamatérgica, GABAérgica e oxidonitrérgica;

Avaliar a influência da administração subcrônica do composto D4

sobre o desenvolvimento ponderal dos animais e sobre os órgãos:

fígado, rins e coração; Avaliar parâmetros bioquímicos hepáticos, renais, glicose e

creatinofosfoquinase, após tratamento subcrônico com o composto

mais ativo na dose mínima efetiva;

Avaliar possíveis parâmetros oxidativos em tecido cerebral de animais

submetidos a tratamento subcrônico com o composto D4.

37

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Epilepsia

A epilepsia atualmente é definida como uma desordem cerebral

crônica, de várias etiologias, caracterizada por CEs recorrentes não provocadas

(crises que aparecem sem um desencadeante óbvio), conseqüentes de descargas

neuronais excessivas e síncronas. Uma CE por sua vez, é um evento clínico

definido como uma alteração paroxística de função neurológica causada por despolarização síncrona, rítmica, de neurônios corticais (TRINKA,

KÄLVIÄINEN, 2016).

A epilepsia é uma doença neurológica descrita desde os primeiros

escritos da história. Nos papiros babilônicos (cerca de 1050 aC) acreditava-se

que a epilepsia era causada por demônios e fantasmas. Estas primeiras crenças

sobrenaturais em relação à doença, provavelmente, foram fomentadas pelos

sinais e sintomas clínicos presentes nas manifestações. O mito da epilepsia

como uma maldição dos deuses tem sido largamente vencido, mas a doença

continua a ser um estigma social para muitos pacientes (MASIA; DEVINSKY,

2000).

O primeiro argumento contra as ideias ligadas à aspectos espirituais

foi do médico grego Hipócrates, autor do primeiro livro sobre epilepsia entitulado “Sobre a Doença Sagrada”, que, por volta de 400 aC, reconheceu a

doença como uma disfunção cerebral (MASIA; DEVINSKY, 2000).

Segundo a DSM-V (Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders (DSM-V, 2013), estima-se que existam cerca de 65 milhões de

pacientes com epilepsia no mundo. Estudos mais recentes continuam

mostrando que a epilepsia é um problema de saúde pública, onde a estimativa

de prevalência foi relatada em 8,4 casos por 1.000 habitantes em países

desenvolvidos, segundo Helmers e colaboradores (2015). De acordo com os

mesmos autores, as estimativas de incidência de epilepsia mostram que a

doença acomete, na maioria dos casos, pacientes entre 5 ou 60 anos de idade e

atinge pessoas de todas as raças, sexo, e condições socioeconômicas (WALSH et al., 2015). O risco de morte prematura em pessoas com epilepsia é de duas a

três vezes maior do que para a população em geral (WHO, 2017).

Dados dos Estados Unidos revelam que os custos da doença no país

gira em torno de US$ 15,5 bilhões anuais (WALSH et al., 2015). No Brasil, não

há dados concretos sobre a epidemiologia e/ou gastos com a doença. A grande

maioria dos trabalhos referenciados na literatura não permite generalizações,

quanto a dados epidemiológicos precisos, pois foram realizados em pequenas

populações, e a disparidade entre os resultados pode ser atribuída às variações

na metodologia e à estrutura da população. Baseado no último censo

38

demográfico e na prevalência mundial de epilepsia, supõe-se que 1.907.327

pessoas sejam acometidas pela doença no Brasil (SILVA, 2013).

A epilepsia foi caracterizada conceitualmente em 2005, como uma

predisposição duradoura do cérebro para gerar CEs, com conseqüências neurobiológicas, cognitivas, psicológicas e sociais. Esta definição pode ser

difícil de ser aplicada na prática clínica, portanto, a ILAE redefiniu os conceitos

relacionados à epilepsia em 2010. Conforme definição prática, a epilepsia pode

ser considerada quando: (a) há pelo menos duas convulsões não provocadas (ou

reflexo) ocorrendo com mais de 24 horas de intervalo; (b) há uma convulsão

não provocada (ou reflexo) e uma probabilidade de novas convulsões

semelhantes ao risco de recorrência geral (pelo menos 60%) após duas

convulsões não provocadas, ocorrendo nos próximos 10 anos; e (c) diagnóstico

de uma síndrome de epilepsia. O termo "não provocada" implica a ausência de

um fator temporário ou reversível que diminua o limiar e que produza uma

crise nesse momento (MOSHÉ et al., 2015), ou seja, indica que a CE não foi

causada por febre, traumatismo crânio-encefálico, alteração hidroeletrolítica ou doença concomitante (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). Entretanto, na

grande maioria das vezes, os clínicos se baseiam nos critérios do DSM-V para

seu diagnóstico (DSM-V, 2013).

3.1.1 Classificação das crises

Antigamente, a classificação das CEs era baseada em observações e

opiniões de especialistas. Em 1960, a classificação foi publicada pela primeira

vez e atualizada oficialmente em 1981, pela Comissão Sobre Classificação e

Terminologia da ILAE, que se baseou em conceitos mais modernos de

neuroimagem, tecnologias genômicas e biologia molecular. As CEs são classificadas de acordo com a área cerebral afetada, de

acordo com informações obtidas a partir do eletroencefalograma (EEG) (Figura

1) (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). De forma prática, as CEs podem

ser classificadas segundo dois grandes eixos: topográfico e etiológico. No eixo

topográfico, são classificadas em generalizadas e focais (BRASÍLIA, 2013).

39

Figura 1. Classificação das crises epilépticas de acordo com a área cerebral afetada.

Fonte: TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016.

As CEs generalizadas são originárias de alterações de uma ou mais

funções cerebrais, em algum ponto do encéfalo, com envolvimento simultâneo

de ambos os hemisférios cerebrais. Distribuídas bilateralmente, as descargas

podem afetar estruturas corticais e subcorticais, mas não necessariamente

afetam todo o córtex (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; MOSHÉ et al.,

2015; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017). Em geral, são

geneticamente determinadas e acompanhadas de alteração da consciência e

ausência de aura. Seus principais exemplos são as crises de ausência, crises

mioclônicas, clônicas e crises tônico-clônicas generalizadas (BRASÍLIA, 2013;

REMÍGIO, 2014).

As crises tônico-clônicas são as crises mais conhecidas. Normalmente tem início com uma fase tônica em que há perda de consciência e de postura,

extensão das costas, pescoço e pernas, flexão dos antebraços, desvio ocular

cefálico, respiração ruidosa e cianose. Em seguida, a crise segue para uma fase

clônica, que continua com espasmos musculares violentos e generalizados, em

que persiste a cianose e pode haver perda de esfíncteres. No período pós-ictal

(pós crise), o paciente pode apresentar cefaleia, dor muscular, fadiga,

sonolência e confusão mental (BEM et al., 2016).

A crise de ausência (ou pequeno-mal) é mais comum na infância e é

caracterizada por perda súbita da consciência, sem perda da postura, com

fixação do olhar e sem resposta a estímulos. Geralmente costumam durar entre

2 a 20s e podem se repetir várias vezes durante um dia. Alguns fenômenos motores breves, como piscamento e mastigação podem ocorrer. Podem ser

40

típicas, quando ocorrem descargas em espícula e paragem súbita e transitória,

ou atípicas, quando tem início e término menos abrupto, com consciência,

frequência cardíaca e tônus muscular menos afetados (BEM et al., 2016;

REMÍGIO, 2014). Remígio (2014) nos fornece uma caracterização mais simplificada das

CEs: as mioclônicas apresentam breves contrações musculares dos membros

com intensidade regular e sonolência; as clônicas se caracterizam por espasmos

musculares rápidos, evolui com movimentos dos membros, apneia e mordedura

de língua. Há perda de consciência. Perda súbita de consciência, endurecimento

tônico muscular seguido de espasmos de fase clônica, evolução com apneia,

cianose, mordedura de língua são características das crises tônico-clônicas.

Podem apresentar confusão, cansaço e abatimento profundo; crises atônicas são

muito raras, não apresentam perda de consciência, mas caracterizam-se por

perda rápida do tônus muscular.

As CEs focais são originárias de redes limitadas a um hemisfério

cerebral, portanto são parciais (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). Elas podem ser discretamente localizadas ou mais amplamente distribuídas.

Também podem ser originadas em estruturas subcorticais (MOSHÉ et al.,

2015). Suas manifestações clínicas dependem do local de início do foco

epiléptico e da velocidade com que ocorre a propagação da descarga

epileptogênica.

Conforme reportado por Kim, Lee e Lee (2016), as CEs focais são

divididas em focais simples (CE sem comprometimento da consciência) e

focais complexas (CE com comprometimento ao menos parcial da consciência

durante o episódio). Uma CE focal pode terminar numa crise tônico-clônica

generalizada, quando há a propagação das descargas para todo córtex cerebral,

sendo então denominada crise focal secundariamente generalizada. As crises focais simples se iniciam com manifestações motoras

(movimentos súbitos nas mãos, pés ou face), sensoriais (dormência,

formigamento), autonômicas (palidez, sudorese, palpitação) ou psíquicas

(medo, transtorno transitório da compreensão da realidade), sem perda de

consciência (BEM et al., 2016; REMÍGIO, 2014). As crises focais complexas

são mais comuns em pacientes adultos e auras podem antecedê-las, com

perturbação da consciência. Normalmente há a fixação do olhar e dispersão,

sem resposta a estímulos ou comandos. Pacientes em crises focais também

podem apresentar movimentos repetitivos (mastigação, movimentos manuais) e

no período pós-ictal há sonolência e/ou confusão mental prolongada. Ocorre

amnésia de todo período de duração da crise (BEM et al., 2016; REMÍGIO,

2014). No quadro 1, encontram-se as classificações reconhecidas das CEs

mais comuns na clínica.

41

Quadro 1. Classificações das crises epilépticas.

Classificações das crises epiléticas

Crises generalizadas

Tônico-clônicas (em qualquer combinação)

Ausências

Típicas

Atípicas

Ausências com características especiais

Ausências mioclônicas

Mioclonias palpebrais

Mioclônicas

Mioclônica atônicas

Mioclônica tônicas

Clônicas

Tônicas

Atônicas

Crises focais/parciais

Desconhecidas

Espasmos epilépticos

Fonte: adaptado de MOSHÉ et al., 2015.

3.1.2 Etiologia

Sabe-se que as CEs são ocasionadas pelo comportamento anormal de

grupos de neurônios cerebrais, mas ainda são desconhecidos todos os aspectos

causais específicos da epilepsia em si. Já são reconhecidas algumas possíveis causas, mas sua fisiopatologia continua a ser um foco de pesquisa

(BALESTRINI; SISODIYA, 2017).

No eixo etiológico, as epilepsias são, previamente, divididas em

idiopáticas (quando não há lesão estrutural subjacente), sintomáticas (quando

há lesão) ou criptogênicas (quando apresentam sintomas, mas nenhuma lesão

aos exames de imagem disponíveis no momento) (BRASÍLIA, 2013).

Em 2010, a ILAE substituiu as classificações pelas seguintes

categorias:

- Genética: epilepsias com fatores genéticos importantes e em que

os genes causadores ou de suscetibilidade são herdados ou resultam de

42

mutações que podem ou não ser herdadas. Nestes casos a epilepsia é resultado

direto de um defeito genético conhecido, podendo haver modificações da

expressão da doença por fatores ambientais. A influência da genética na

epilepsia tem sido amplamente avaliada (BALESTRINI; SISODIYA, 2017; MOSHÉ et al., 2015; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; WALSH et al.,

2015;);

- Estrutural/metabólica: convulsões resultantes de lesões cerebrais

ou condições associadas a anomalias estruturais ou metabólicas que favoreçam

o surgimento de CE, como: acidente vascular cerebral, trauma, tumor cerebral,

malformações corticais, aminoacidopatias, isquemia, infecções, entre outros

(MOSHÉ et al., 2015; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; WALSH et al.,

2015;);

- Desconhecida: causa não pode ser presumida (MOSHÉ et al.,

2015; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; WALSH et al., 2015;).

Em 2013, a Comissão de Classificação da ILAE emitiu um relatório sobre a classificação e terminologia das epilepsias após o surgimento de

diversas críticas quanto à proposta de 2010. Assim, revisões foram realizadas

recentemente e neste documento alguns termos foram melhores definidos

(YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014). As síndromes

epilépticas anteriormente classificadas como genética, estrutural/metabólica e

desconhecida, são agora subdivididas em:

- Genética: a epilepsia é resultado direto de um defeito genético

conhecido ou presumido (BALESTRINI; SISODIYA, 2017; YACUBIAN;

CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014);

- Estrutural: quando uma lesão estrutural (genética ou adquirida) é visível na neuroimagem e concordante com os achados eletroclínicos,

sugerindo uma relação direta entre lesão e epilepsia. Ex: polimicrogirias

(relacionadas à mutação do gene GPR56 ou secundárias a um insulto isquêmico

ou infeccioso intraútero) (YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-

POHL, 2014);

- Metabólica: defeito metabólico com sintomas sistêmicos que

levam também ao desenvolvimento de epilepsia (YACUBIAN; CONTRERAS-

CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014);

- Imunológica: quando há evidência de um processo autoimune

ocasionando inflamação do SNC, como encefalite antirreceptor glutamatérgico

do tipo NMDA e anti-LGI1 (YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014);

- Infecciosa: desencadeada por um processo infeccioso, como

neurocisticercose, toxoplasmose, HIV. Neste caso, não seriam consideradas as

crises desencadeadas por infecção aguda como meningite ou encefalite

(YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014).

43

- Desconhecida: causa não determinada (YACUBIAN;

CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014).

Existem também substâncias que tornam o SNC vulnerável a

descargas elétricas exageradas e, por isso, conhecidas como substâncias epileptogênicas, podem induzir o surgimento de CEs. São exemplos o álcool, a

cocaína e as anfetaminas (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).

3.1.3 Diagnóstico

O diagnóstico da epilepsia é bastante complexo e envolve critérios

multidimensionais e investigações importantes sobre o paciente com suspeita

dessa patologia. Normalmente é baseado em anamnese e exame neurológico.

Exames complementares dependem da individualidade de cada caso (NAGAE

et al., 2016; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013).

Histórico pessoal e familiar, idade de início e tipo de crise, estado cognitivo e neurológico são critérios primordiais para caracterizar os supostos

episódios como verdadeiras CEs (NAGAE et al., 2016; SILVA; CARDOSO;

MACHADO, 2013).

Exames o EEG, principalmente nas primeiras 24 horas da crise, é

importante na diferenciação das CEs ou eventos não-epilépticos psicogênicos.

Além disso, auxilia na caracterização da atividade cerebral elétrica anormal e

dos tipos de crise (focais ou generalizadas). Em geral, o EEG é capaz de

responder a três questões importantes diagnósticas nos pacientes com suspeita

de epilepsia: 1) o paciente tem epilepsia? 2) onde está localizada a zona

epileptogênica? 3) o tratamento está sendo adequado? (BRASÍLIA, 2013). Exames de EEG em vigília e em sono são obrigatórios para confirmação

diagnóstica de epilepsia, entretanto, a eletroencefalografia é normal em 30%

dos casos e não exclui o diagnóstico de epilepsia (BRASÍLIA, 2013; NAGAE

et al., 2016).

A imagiologia pode auxiliar no diagnóstico de pacientes com epilepsia

também abrangendo ressonância magnética (RM), tomografia computadorizada

de emissão de um único fóton (SPECT), tomografia por emissão de pósitrons

(PET) e magnetoencefalografia (MEG), importantes para a detecção de lesões

cerebrais (NAGAE et al., 2016; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).

Estes devem ser solicitados na suspeita de causas estruturais, tais como

tumores, malformações vasculares ou esclerose hipocampal (BRASÍLIA,

2013). Exames laboratoriais, como análises sanguíneas e punção lombar,

auxiliam na investigação da etiologia da epilepsia, assim como a investigação

com testes genéticos, às vezes, se faz necessária (SILVA; CARDOSO;

MACHADO, 2013).

44

Alguns tipos de CEs podem não ser responsivas ao tratamento com

FAEs, desencadeando encaminhamento para consulta cirúrgica. O tratamento

cirúrgico da epilepsia intratável mostrou diminuir o custo geral de saúde e

melhorar a qualidade de vida dos pacientes, embora possa haver recorrência das convulsões após a cirurgia (NAGAE et al., 2016).

3.1.4 Manifestações clínicas

As manifestações clínicas da epilepsia variam dependendo da extensão

da área do cérebro afetada e da sua localização. As convulsões podem ocorrer

ou não, e quando ocorrem podem afetar funções sensoriais, motoras e

autonômicas, consciência, estado emocional, memória, cognição e comportamento (VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).

Cabe salientar que convulsão não é sinônimo de epilepsia e que as

mesmas podem ser desencadeadas por processos biológicos transitórios (febre

alta, por exemplo) sem indução completa a um quadro de epilepsia. Trata-se de

um termo leigo, que caracteriza episódio de contração muscular excessiva ou

anormal, usualmente bilateral, que pode ser sustentada ou interrompida. Nem

todas as CEs afetam necessariamente todos estes fatores acima descritos, mas

influenciam pelo menos um. Neste contexto, podem surgir também manifestações somatossensoriais, auditivas, visuais, olfativas e gustativas,

variando nos pacientes conforme o gênero (NAGAE et al., 2016).

Segundo a ILAE, déficits cognitivos durantes as CEs podem aparecer

como problemas de percepção, atenção, emoção, memória, execução e

alteração de discurso. Esse dado é amplamente discutido atualmente pela

literatura, sobretudo na epilepsia infantil (FUENTES; KERR, 2017).

Alguns pacientes podem apresentar manifestações que precedem as

crises, como auras de curta duração (1 ou 2 minutos), que correspondem a

manifestações sensitivo-sensoriais, vegetativas ou psíquicas puramente

subjetivas e que ocorrem em 20% a 90% dos casos. Como exemplos podem-se

citar a aura epigástrica (sensação de náusea, mal-estar); medo; depressão e angústia; déjà-vu (ilusão da memória que leva ao indivíduo a crer que já

vivenciou algo desconhecido); jamais vu (sensação de vivenciar algo

totalmente estranho); e pensamento forçado (pensamento que ocorre

repetidamente mesmo quando se tenta concentrar em outro fato)

(FERNANDES, 2013).

De acordo com Bem et al. (2016), os pacientes que apresentam CEs

podem entrar em estado pós-ictal, ou seja, apresentam sintomas após o evento

epiléptico. Com exceção das crises de ausência, podem surgir sintomas como:

confusão mental prolongada, sonolência, dor muscular e fadiga.

45

3.1.5 Hipóteses neuroquímicas envolvidas na epilepsia

As CEs podem ser causadas por vários mecanismos. Embora estes ainda não estejam totalmente esclarecidos, podem-se estabelecer hipóteses de

envolvimento neuronal relacionados às crises. Sabe-se que o desequilíbrio entre

excitação e inibição dos neurônios cerebrais está envolvido e facilita a

ictogênese, ou seja, a geração das crises (SILVA; CABRAL, 2008; WERNER;

COVEÑAS, 2015).

Em condições fisiológicas normais, existem mecanismos que

promovem disparos neuronais e outros que controlam e protegem os neurônios

de descargas excessivas (SILVA; CABRAL, 2008). Alterações de canais

iônicos e das funções neurotransmissoras estão intimamente relacionadas com

distúrbios e doenças neurológicas, assim como na epilepsia (SILVA;

CABRAL, 2008; WERNER; COVEÑAS, 2015). Segundo Werner e Coveñas (2015), os principais desequilíbrios

envolvidos na fisiopatologia da epilepsia são a hipoatividade do

neurotransmissor ácido-γ-aminobutírico (GABA) e hiperatividade do

neurotransmissor glutamato (GLU). Há relatos do envolvimento de outros

neurotransmissores, como hiperatividade da dopamina (DA) e noradrenalina

(NA), hipoatividade da serotonina (5-HT), distúrbios na função

neuromoduladora do óxido nítrico (NO) o qual com ação dual: pró-convulsiva

ou anticonvulsiva, e disfunção de neuropeptídeos.

3.1.5.1 Neurotransmissão glutamatérgica na epilepsia

O GLU é o principal neurotransmissor excitatório do SNC e

desempenha papel importante no desenvolvimento neural, plasticidade

sináptica, aprendizado, memória e no mecanismo de doenças neurológicas, em

especial, a epilepsia (FORMAN et al., 2009; VALLI; SOBRINHO, 2014;

WERNER; COVEÑAS, 2015).

Atua sobre dois diferentes tipos de receptores: ionotrópicos,

subdivididos em receptores do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), cainato

(KA) e ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA)

(HADZIC; JACK; WAHLE, 2017) e metabotrópicos (FORMAN et al., 2009; WERNER; COVEÑAS, 2015) (Figura 2).

Os receptores ionotrópicos medeiam respostas excitatórias rápidas,

são constituídos por múltiplas unidades, que ativadas, permitem o fluxo de íons

Na+, K+ e Ca++ através das membranas plasmáticas. É reportado na literatura

que o aumento da concentração dos níveis de Ca++ intracelular tem papel

fundamental na manutenção da hiperexcitabilidade que ocorre em processos

convulsivos. Além disso, os defeitos de função do canal iônico também estão

46

associados a formas de epilepsia adquirida. Os auto-anticorpos dirigidos contra

canais iônicos ou proteínas associadas, tais como canais K+, receptores LGI1 ou

NMDA, foram identificados em desordens epilépticas, estado epiléptico e

sintomas psiquiátricos (FORMAN et al., 2009; VALLI; SOBRINHO, 2014). Os receptores AMPA são encontrados em todo SNC, principalmente

no hipocampo e no córtex cerebral. Sua ativação permite o influxo de Na+,

efluxo de K+ e o aumento da permeabilidade ao Ca++, permitindo a regulação

da despolarização pós-sináptica excitatória celular (FORMAN et al., 2009).

Receptores do tipo KA são expressos em todo SNC, amplamente

distribuídos no hipocampo e no cerebelo, também permitem a entrada de Na+ e

a saída de K+ e maior permeabilidade ao Ca++ (FORMAN et al., 2009).

Figura 2. Figura ilustrativa da sinapse glutamatérgica e dos tipos de receptores glutamatérgicos.

Fonte: traduzido de DU et al., 2004.

Os receptores NMDA, que são expressos particularmente no

hipocampo, no córtex cerebral e na medula espinhal, exige a ativação

simultânea pelo neurotransmissor GLU e glicina; e permite o efluxo de K+ e o

influxo de Na+ e Ca++ (FORMAN et al., 2009; YAO; ZHOU, 2017). De todos

os receptores glutamatérgicos, o NMDA é o mais estudado atualmente. A ativação destes receptores dá início a cascatas de sinalização intracelular

47

dependente de Ca++, as quais estão relacionadas a processos biológicos

importantes (VALLI; SOBRINHO, 2014) (Figura 2).

Os receptores NMDA são essenciais para todos os aspectos da função cerebral, incluindo aprendizagem e formação de memória. As mutações

distribuídas ao longo das subunidades do receptor NMDA foram associadas a

uma série de distúrbios neuropsiquiátricos, dentre eles a depressão e a epilepsia.

Estudos estruturais, funcionais e computacionais recentes auxiliaram no

discernimento da verdadeira natureza sobre o processo de ativação que liga o

GLU com a abertura do canal iônico, que é central para a fisiologia e

fisiopatologia do receptor NMDA (ZHOU; WOLLMUTH, 2017).

Os chamados receptores metabotrópicos de GLU (mGluR) desempenham suas funções através da proteína G. Existem pelo menos oito

subtipos de mGluR, pertencentes a três grupos (I, II e III) (Figura 3).

Figura 3. Classificação dos receptores glutamatérgicos.

Fonte: adaptado de FLORES-SOTO et al., 2012.

Receptores do grupo I promovem excitação neuronal através de

mecanismos de ativação da fosfolipase C (PLC) e liberação intracelular de

inositoltrifosfato (IP3), mediada por Ca++ ou através da adenilato ciclase e

geração de AMP cíclico (cAMP). Receptores do grupo II e III inibem a

adenilato ciclase e diminuem a formação de cAMP. Estas vias conduzidas por segundos mensageiros, como IP3 e cAMP, regulam o fluxo de íons de outros

canais. A hiperestimulação de receptores glutamatérgicos pode induzir

convulsões e dano neuronal (FORMAN et al., 2009; WERNER; COVEÑAS,

2015).

A atividade excitatória do GLU é interrompida por proteínas

transportadoras que fazem sua receptação e o retiram da fenda sináptica ou

48

dessensibilização do receptor (FORMAN et al., 2009; VALLI; SOBRINHO,

2014). Como reportado anteriormente, em estados patológicos, como na

epilepsia, o aumento deste neurotransmissor na fenda ou a desregulação na sua

receptação resulta em níveis elevados de Ca++ intracelular, podendo levar ao fenômeno conhecido como excitotoxicidade, morte neuronal causada por

excessiva excitação celular (MURPHY-ROYAL et al., 2017; VALLI;

SOBRINHO, 2014).

3.1.5.2 Neurotransmissão GABAérgica na epilepsia

O GABA é o principal neurotransmissor inibitório do SNC e seus

receptores ativados diminuem a excitabilidade neuronal por vários mecanismos

(FORMAN et al., 2009; WERNER; COVEÑAS, 2015). Esse neurotransmissor

desempenha suas funções por ativação de receptores ionotrópicos (GABAA e GABAC), que aumentam o fluxo de Cl-, e metabotrópicos (GABAB), receptores

acoplados à proteína G que permitem a troca iônica a partir de segundos

mensageiros (MELE; LEAL; DUARTE, 2016).

Os receptores GABAA (Figura 4) são os mais estudados, e

estruturalmente, são formados por 5 subunidades: duas α, duas β e uma γ. O

neurotransmissor e agonistas se ligam nas porções α e β do complexo receptor-

canal, que abre passagem para o íon Cl-. Com o fluxo do íon, há a

hiperpolarização de membrana, inibindo o impulso nervoso (MELE; LEAL;

DUARTE, 2016).

Figura 4. Imagem ilustrativa da estrutura do receptor GABAA.

Fonte: traduzido e adaptado de UUSI-OUKARI; KORPI, 2010.

Os receptores GABAB, quando ativados, interagem com proteínas Gi,

inibindo a adenilato ciclase, que ativam canais iônicos de K+ e inibem canais de

49

Ca++ voltagem-dependentes, reduzindo assim, a geração de potenciais de ação,

restringindo correntes excitatórias (FORMAN et al., 2009). Esses receptores

têm sido estudados nos últimos anos em várias desordens neurológicas e,

parecem estar envolvidos em processos cognitivos e na formação de memória (HEANEY; KINNEY, 2016).

Os receptores GABAC não estão diretamente ligados à epilepsia,

porém em outras desordens do SNC. Esses receptores são expressos

principalmente na retina e sua distribuição no SNC é restrita. De particular

interesse é o desenvolvimento de análogos seletivos de GABA e o seu potencial

uso em distúrbios do sono, inibindo o desenvolvimento de miopia, bem como

melhorando a aprendizagem e a memória (NG et al., 2011).

Devido sua importante função inibitória no SNC, prejuízos na síntese

GABAérgica, alterações na expressão ou mutações nas subunidades receptoras

principalmente do receptor GABAA, que perturbam a homeostase de Cl-, e

perda neuronal podem levar ao aparecimento de descargas excessivas, com

indução de epileptogênese em humanos e em testes animais, como no teste do PTZ (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).

3.1.5.3 Outras vias de neurotransmissão envolvidas na epilepsia

Conforme reportado na literatura, há relatos do possível envolvimento

de vários neurotransmissores na fisiopatologia da epilepsia (WERNER;

COVEÑAS, 2015). As monoaminas são os principais sistemas

neuromoduladores do SNC e evidências convincentes acumuladas nos últimos

30 anos também estabeleceram seu papel central na epilepsia. 5-HT, DA, NA, histamina e melatonina são conhecidas por interromper a atividade de crises

convulsivas. Porém há muita controvérsia e pouco estudo para desvendar o real

papel das monoaminas no processo epiléptico (WERNER; COVEÑAS, 2015).

No SNC, mais especificamente na epilepsia, o envolvimento da NA se

dá por ação pós-sináptica pró-convulsiva em baixas doses e antiepiléptica em

altas doses. Durante o estado epiléptico, a liberação de NA no hipocampo está

diminuída. O bloqueio de receptores α e β adrenérgicos aumenta a

concentração do neurotransmissor e reduz a epileptogênese (WERNER;

COVEÑAS, 2015). No entanto, a relação NA e epilepsia se faz mais presente

não na epileptogênse em si, mas principalmente quanto aos efeitos pós crise, sobretudo no sistema cardiovascular. Um recente estudo confirma que a

atividade de crises prolongadas resulta em alterações agudas e crônicas no

controle cardiovascular, levando a uma deterioração da estrutura e função

cardíaca (READ et al., 2015).

A DA e a 5-HT são conhecidas por seu papel modulador da

ictogênese. Há relatos de que inibidores da reabsorção de DA têm propriedades

anticonvulsivantes, embora o envolvimento da DA seja bastante controverso.

50

As respostas para atividade epiléptica são opostas de acordo com o tipo de

receptor dopaminérgico estudado. Os receptores D1 medeiam efeitos pró-

convulsivos e os D2 anticonvulsivantes. Assim, o real mecanismo de ação pelo

qual a DA influencia na epileptogênese não é bem estabelecida. Os inibidores seletivos de recaptação de 5-HT podem potencializar convulsões. O aumento da

concentração de 5-HT no hipocampo induz a ictogênese. Recentes estudos

sugerem a ausência de uma relação direta entre a suscetibilidade à convulsão e

as alterações nos níveis 5-HT do hipocampo (WERNER; COVEÑAS, 2015).

A ativação de receptores colinérgicos muscarínicos e nicotínicos tem

uma ação pró-convulsiva e está envolvida na epileptogênese (WERNER;

COVEÑAS, 2015).

3.1.5.4 Estresse oxidativo e estresse nitrosativo na epilepsia

Uma atenção especial vem sendo dada ao NO, no que tange a epilepsia. O NO é um gás solúvel produzido pela óxido nítrico sintase (NOS)

com funções de sinalização no SNC (ZHU et al., 2016).

Inicialmente, a investigação do papel do NO se deu a partir do

interesse pelo uso de nitratos orgânicos no tratamento de doenças cardíacas

(DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Na década de 70, várias atividades

foram atribuídas ao NO no SNC. Em 1980, a produção de NO no SNC foi

confirmada, assim como a sua liberação estimulada pelo GLU, a partir da

ativação dos receptores NMDA (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).

A partir da oxidação do aminoácido L-arginina em L-citrulina, o NO é

sintetizado através da enzima NOS. Existem três diferentes isoenzimas:

endoteliais (eNOS), constitutiva endotelial, dependente de íons Ca++ e de calmodulina, presente normalmente nas células endoteliais vasculares e nas

plaquetas; neuronais (nNOS), constitutiva neuronal, dependente de íons Ca++ e

de calmodulina, presente normalmente nos neurônios; e induzíveis (iNOS),

produzidas por macrófagos e outras células ativadas por citocinas (DUSSE;

VIEIRA; CARVALHO, 2003; MOHAZAB et al., 2012; ZHU et al., 2016). Das

três isoformas de NOS, a nNOS é a principal forma expressa no cérebro (ZHU

et al., 2016).

Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas por análogos da

arginina N-substituídos, como o N(G)-nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME),

utilizado em vários estudos da função oxidonitrérgica in vivo (DUSSE;

VIEIRA; CARVALHO, 2003; MOHAZAB et al., 2012). De acordo com dados relatados na literatura, sabe-se que o NO está fortemente implicado como um

fator neurodegenerativo nos estados epilépticos (ZHU et al., 2016).

Várias evidências relatam o envolvimento do NO em processos

fisiológicos e fisiopatológicos no cérebro, incluindo necrose e apoptose, a

modulação da transmissão sináptica e da plasticidade, funções cognitivas e

51

comportamentais e em distúrbios neurológicos, como a epilepsia e a depressão

(BHAT et al., 2015; GOOSHE et al., 2017; ZHU et al., 2016).

O NO pode desempenhar suas funções biológicas por vários

mecanismos diferentes, mas é através da difusão pela membrana plasmática que qualquer processo que o envolve se inicia. Como vasodilatador, pesquisadores

relataram que o NO promove o relaxamento vascular sanguíneo através da

ativação da enzima guanilato ciclase (GC) com conseqüente acúmulo de

guanosina monofosfato cíclica (GMPc) (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO,

2003).

Os efeitos biológicos relacionados ao NO podem ocorrer por

diferentes mecanismos: a) a ativação de GC e GMPc, e b) S-nitrosilação (RAJU

et al., 2016).

O NO é envolvido na sinalização celular através da influência sobre a

GC, com consequente formação de GMPc e ativação de diversas proteínas

quinases (OLIVEIRA et al., 2016). A S-nitrosilação consiste na modificação de

resíduos de cisteína reduzidos em proteínas para a formação da S-nitrosocisteína (RAJU et al., 2016). Sob condições normais, a S-nitrosilação

regula a atividade de muitas proteínas e é um mecanismo de sinalização celular.

No entanto, em condições caracterizadas por estresse nitrosativo, níveis

aumentados de NO conduzem a S-nitrosilação aberrante, que contribui para o

surgimento de diversas patologias (NAKAMURA; LIPTON, 2015). Um

importante efeito da S-nitrosilação envolve o receptor glutamatérgico NMDA.

Altos níveis de NO podem levar a diminuição da expressão dos receptores

glutamatérgicos e inativação de proteínas responsáveis pela liberação de

glutamato. Assim, evidências indicam que a S-nitrosilação leva a diminuição da

liberação de glutamato na fenda sináptica (MORRIS et al., 2016). Ainda, os

autores Gu, Nakamura e Lipton (2010) e Oliveira e colaboradores (2016) relataram que o NO é produzido em resposta à estimulação dos receptores

NMDA, impulsionando o influxo de Ca++ e a síntese de nNOS, bem como a

geração de NO. Além disso, o aumento dos metabólitos reativos de NO podem

interagir com estes receptores glutamatérgicos, potencializando a ação

excitotóxica no SNC.

Em concentrações fisiológicas, como abordado, o NO possui

importantes funções reguladoras e mediadoras (NIEDZIELSKA et al., 2016),

mas alterações nos níveis de NO dão origem a citotoxicidade, resultado da sua

ação direta ou da sua reação com compostos liberados durante um processo

oxidativo e nitrosativo (BHAT et al., 2015; NIEDZIELSKA et al., 2016). Em

analogia com o estresse oxidativo, o termo "estresse nitrosativo" foi proposto

para a formação excessiva ERNs que pode ocorrer in vivo em patologias associadas a processos inflamatórios, neurotoxicidade e isquemia, bem como

durante a neurotransmissão através da ativação do receptor NMDA (KLATT;

LAMAS, 2000).

52

Como já abordado acima, os processos de estresse oxidativo e

nitrosativo, também são fatores determinantes da epilepsia, que podem ser

mediados fisiologicamente via cascata oxidonitrérgica formando os radicais

livres. Em processos metabólicos, estes radicais medeiam o transporte de elétrons mitocondrial em diversas reações bioquímicas. A transferência de

elétrons é considerada uma etapa crítica nos processos biológicos já que está

envolvida em eventos como fosforilação, permeabilidade de membrana,

participação em mecanismos imunes, síntese de neurotransmissores e

exocitose, geração de energia e controle de canais iônicos, contribuindo para a

excitabilidade neuronal (BHAT et al., 2015; DUSSE; VIEIRA; CARVALHO,

2003; NIEDZIELSKA et al., 2016).

Os radicais livres podem ser derivados do oxigênio ou do nitrogênio,

compondo, dessa forma, as espécies reativas de oxigênio e do nitrogênio, EROs

ou ERNs, respectivamente (Figura 5). As EROs incluem radicais livres como

superóxido (O2-), hidroxil (OH-), alcoxil (RO) e peroxil (RO2), juntamente com

espécies não radicalares, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl) e o ozônio (O3). Dentre as ERNs estão o óxido nítrico

(NO) e o ânion peroxinitrito (ONOO-) (CALLONI, 2014).

Figura 5. Exemplos de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs).

Fonte: adaptado de ZISHAN et al., 2017.

A formação excessiva e a alta reatividade das EROs/ERNs com

proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos (Figura 6), ou a deficiência de

53

antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, aumenta o risco de danos às

células, levando ao estado conhecido como estresse oxidativo/nitrosativo,

bastante relacionado na literatura a diversas condições neurológicas e

neurodegenerativas agudas e crônicas, como acidente vascular cerebral, trauma, doença de Parkinson, Alzheimer, Huntington, epilepsia, esclerose lateral

amiotrófica e câncer. Os processos chamados de estresse oxidativo e nitrosativo

são conhecidos por causar lesão e morte neuronal, através da alteração da

função mitocondrial e excitotoxicidade induzida pelo glutamato (BHAT et al.,

2015; MAZHAR; MALHI; SIMJEE, 2016; NIEDZIELSKA et al., 2016).

Figura 6. Formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e o impacto do estresse oxidativo e nitrosativo na função proteica.

Fonte: traduzido de KLATT; LAMAS, 2000.

Os mecanismos de lesão celular causados por altas concentrações de

NO incluem vários processos celulares. Entre eles, alguns efeitos podem estar

relacionados a reação do NO com o superóxido (O2-), formando o peroxinitrito

(ONOO-). A liberação de glutamato pela ativação de receptores do tipo NMDA é associada a formação de radicais livres, pela ativação da enzima nNOS.

Dentre estes radicais livres, o superóxido, na presença do NO, pode formar o

peroxinitrito, que pode perturbar funções mitocondriais e outras funções

celulares, o que é responsável pelo dano neuronal (CALLONI, 2014;

GUMIENICZEK; OWCZAREK; PAWLIKOWSKA, 2012; RAJU et al., 2016).

54

Além disso, um dos principais mecanismos de formação de EROs é a

redução do O2. Inicialmente há a formação do superóxido, resultante da adição

de um elétron à molécula de O2. Este produto inicial pode ser rapidamente

degradado pela enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), dando origem a outra ERO, o peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2, por sua vez,

pode ser decomposto por outras enzimas antioxidantes, a catalase (CAT) ou a

glutationa peroxidase (GPx), em H2O e O2, ou ainda, ser convertido a OH- na

presença de metais como o ferro, através da reação de Fenton (CALLONI,

2014).

A maior fonte endógena de geração de EROs/ERNs é a mitocôndria,

onde há a formação destas espécies reativas a partir do escape de elétrons da

chamada cadeia de transporte de elétrons (CTE) (CALLONI, 2014; ZISHAN et

al., 2017). As mitocôndrias são os principais produtores de ATP necessários

para atividades elétricas normais de neurônios e transmissão sináptica. Além

disso, elas têm um papel central na síntese de neurotransmissores, homeostasia

de Ca++, sinalização redox, produção e modulação de EROs/ERNs e morte neuronal. As hipóteses ligam a falha mitocondrial à geração de crises através de

alterações na homeostase do Ca++, oxidação de canais iônicos e transportadores

de neurotransmissores por EROs/ERNs, diminuição do potencial da membrana

plasmática neuronal e redução da inibição da rede devido à disfunção

interneuronal (VENEDIKTOVA et al., 2017). As apreensões,

independentemente da sua origem, representam uma demanda excessiva de

energia aguda no cérebro. Consequentemente, a disfunção mitocondrial

secundária tem sido descrita em várias doenças epilépticas, incluindo distúrbios

que são principalmente de origem não mitocondrial. Uma compreensão da

relação recíproca entre disfunção mitocondrial e epilepsia é crucial para

selecionar o tratamento anticonvulsivo apropriado e tem o potencial de abrir novas abordagens terapêuticas no subconjunto de doenças epilépticas causadas

por disfunção mitocondrial (GULER et al., 2016).

Outras fontes endógenas de geração de EROs/ERNs são as enzimas

microssomais, como o citocromo P450, e o metabolismo de lipídeos nos

peroxissomas, onde há a formação, principalmente, de H2O2 (CALLONI, 2014;

ZISHAN et al., 2017).

Os peroxissomas são organelas celulares que contém diversas

proteínas de função enzimática, capazes de catalisar reações de síntese e

degradação de compostos de importantes no metabolismo celular. São

caracterizados pela presença de enzimas oxidativas que transferem átomos de

hidrogênio de diversos substratos para o oxigênio. Suas funções incluem a

oxidação dos ácidos graxos de cadeia longa, formação de lipídeos localizados na mielina, colesterol e ácidos biliares. Algumas de suas enzimas são a CAT,

urato oxidase, acil CoA oxidases, D-aminoácido oxidase, L-alfa-hidroxi

oxidase, xantina oxidase e D-aspartato oxidase, capazes de produzir diferentes

55

EROs/ERNs (BORGES, 2002; ZISHAN et al., 2017). Receptores PPARs têm

sido relacionados à modulação do transporte de lipídios e do metabolismo de

ácidos graxos, principalmente via oxidação mitocondrial e peroxissomal

(ABDELMEGEED et al., 2009). Estudos de Garcia-Bueno e colaboradores (2007) demostraram que ligantes de PPARs sintéticos e naturais impedem as

consequências oxidativas e nitrosativas no SNC de animais expostos ao

estresse, sugerindo que estes fármacos podem ser úteis como potenciais agentes

neuroprotetores.

O estresse oxidativo/nitrosativo pode ser desencadeado por radicais

gerados tanto por processos endógenos, como citados anteriormente, ou por

processos exógenos, como xenobióticos, infecções virais ou bacterianas,

radiação, ultrassom, má alimentação, consumo de álcool e drogas (CALLONI,

2014; NIEDZIELSKA et al., 2016).

Qualquer disfunção nos mecanismos que mantém o equilíbrio entre a

formação e a eliminação de EROs/ERNs podem levar a um distúrbio da

homeostase redox, conduzindo a um estado de estresse oxidativo/nitrosativo (CALLONI, 2014).

Para manter a homeostase celular e limitar os níveis de EROs/ERNs

intracelulares, evitanto danos oxidativos, as células possuem mecanismos de

defesa antioxidantes, que podem ser endógenos ou absorvidos na dieta. Os

antioxidantes enzimáticos endógenos (Figura 7), incluem a superóxido

dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST)

e catalase (CAT), e os não enzimáticos, glutationa reduzida (GSH), peptídeos

de histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido

diidrolipóico e o citocromo C redutase (CoQH2). Dentre os antioxidantes

adquiridos na dieta se destacam o ácido ascórbico, α-tocoferol (vitamina-E) e β-

caroteno (pró-vitamina-A) (NIEDZIELSKA et al., 2016; RAJ; GOTHANDAM, 2014).

Os antioxidantes endógenos têm função muito importante na

prevenção da geração e degradação das EROs/ERNs formadas. Mesmo assim,

podem ser insuficientes para conter a formação excessiva das EROs/ERNs,

levando a dano celular por peroxidação lipídica e inativação de enzimas.

Durante o processo de peroxidação lipídica, há a alteração da fluidez e forma

da membrana celular, e como consequência ocorre a paralisação do transporte

de Ca++, essencial nas vias de transdução de sinal. Devi et al. (2008) relataram

que os antioxidantes reduzem as manifestações convulsivas e as alterações

bioquímicas acompanhantes (isto é, marcadores de estresse

oxidativo/nitrosativo). Seus achados suportam um papel para os radicais livres

em convulsões e destacam o possível uso de antioxidantes como adjuvantes de FAEs para melhorar o controle de convulsões.

Devido sua excessiva atividade, o cérebro tem menor capacidade de

regeneração celular em relação a outros órgãos, por isso, está mais susceptível a

56

danos oxidativos, fortemente relacionados ao fator neurodegenerativo nos

estados epilépticos (BHAT et al., 2015; ZHU et al., 2016).

Figura 7. Reações bioquímicas envolvidas na geração de espécies reativas de oxigênio e mecanismos de defesa antioxidantes.

Fonte: traduzido de NIEDZIELSKA (2016).

A GSH é o antioxidante hidrossolúvel não proteico mais importante

nos seres vivos. É constituída por três aminoácidos: o ácido glutâmico, a

cisteína e a glicina; e é catalisada sequencialmente por duas enzimas

citosólicas, a gama-glutamilcisteína sintetase e GSH-sintetase. Apresenta um

papel muito importante no metabolismo de nutrientes, regulação do

metabolismo celular e na defesa antioxidante. Estudos demonstram que a

deficiência da atividade da GSH, contribui para a formação de EROs/ERNs, e

essa diminuição parece estar relacionada com a fisiopatologia de doenças psiquiátricas, dentre elas se destacam a ansiedade, esquizofrenia, epilepsia e

depressão (NIEDZIELSKA et al., 2016).

As enzimas SOD, tem a função de catalisar a dismutação do O2- em

oxigênio e H2O2, causando a proteção das células expostas as reações do O2-,

além de evitar o envelhecimento precoce causado pelas EROs/ERNs.

Ercegovac et al. (2013) relataram que as atividades de SOD foram

significativamente aumentadas em pacientes com epilepsia, e diminuíram após

6 meses de tratamento com os FAEs.

57

Neste contexto, os estresses oxidativo e nitrosativo são possíveis

mecanismos implicados na patogênese da epilepsia, onde estes têm um papel

importante na excitabilidade e lesão celular. A utilização experimental de

substâncias antioxidantes ou sequestradoras de radicais livres em animais possuem propriedade redox protetora, e melhoram a atividade convulsiva

(MAZHAR; MALHI; SIMJEE, 2016). Assim, o uso de antioxidantes

administrados exogenamente, como vitamina C e vitamina E, pode ser um

importante adjuvante contra lesões cerebrais induzidas por ataques epilépticos

(OLIVEIRA et al., 2016).

3.1.6 Tratamento da epilepsia

3.1.6.1 Fármacos antiepilépticos (FAEs)

O tratamento dos pacientes diagnosticados com epilepsia deve ser

realizado com o intuito de melhorar a qualidade de vida pelo alcance do

controle das CEs (BRASÍLIA, 2013; NAGAE et al., 2016; SILVA;

CARDOSO; MACHADO, 2013).

Os FAEs são também conhecidos como anticonvulsivantes, e são

definidos como substâncias capazes de diminuir a incidência ou a severidade

das CEs em pacientes portadores de epilepsia (NAGAE et al., 2016; REMÍGIO,

2014; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017). A introdução dos FAEs se deu a partir de 1857 por Locock (Figura 8),

onde era utilizado como fármaco eficaz o brometo (MARCOS, 2011). De fato,

a era farmacológica contra a epilepsia se deu a partir da descoberta do

fenobarbital (Gardenal®), ainda hoje prescrito na terapia antiepiléptica. Em

seguida, foram descobertos a fenitoína (Hidantal®), o valproato de sódio

(Depakene®), e em 1953 foi sintetizada a carbamazepina (Tegretol®),

juntamente com os benzodiazepínicos (MARCOS, 2011).

Os FAEs de primeira geração: carbamazepina (Tegretol®); fenobarbital (Gardenal®); fenitoína (Hidantal®); valproato de sódio

(Depakene®); clonazepam (Rivotril®); diazepam (Valium®) e etossuximida

(Etoxin®) (MARCOS, 2011; REMÍGIO, 2014), apresentam efeitos colaterais

significativos: ataxia, sedação, visão turva, retenção de água, reações de

hipersensibilidade, leucopenia, insuficiência hepática, aumento de peso,

hipersonia, dentre outros (ver tabela 2).

Ao longo dos anos com o desenvolvimento farmacêutico e médico na

compreensão da fisiopatologia da epilepsia, novos fármacos foram descobertos

com o objetivo de melhorar o controle das convulsões, diminuir os efeitos

adversos e interações medicamentosas. Surgiram então os fármacos de segunda e terceira geração: lamotrigina (Lamictal®), vigabatrina (Sabril®), tiagabina

58

(Gabitril®), topiramato (Topamax®), gabapentina (Neurontin®), leviracetam

(Keppra®), felbamato (Felbatol®), oxcarbazepina (Trileptal®), pregabalina

(Lyrica®), zonisamida (Zonegran®), lacosamida (Vimpat®) e rufinamida

(Inovelon®) (MARCOS, 2011; REMÍGIO, 2014). Estes medicamentos possuem melhor perfil farmacocinético e farmacodinâmico comparado aos

antiepilépticos de primeira geração e, portanto, são mais vantajosos em relação

aos efeitos adversos e interações medicamentosas, facilitando a adesão ao

tratamento (REMÍGIO, 2014).

Figura 8. Período de introdução de fármacos antiepilépticos no mercado farmacêutico entre 1857 e 2012.

Fonte: YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014.

Considerando os fármacos de primeira e segunda geração, há no

mercado farmacêutico um arsenal terapêutico bastante amplo para o tratamento

da epilepsia, mas cerca de 30% dos pacientes não respondem adequadamente e

destes, 40% apresentam resistência aos fármacos (FERNANDES, 2013;

NAGAE et al., 2016; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).

O sucesso da terapia antiepiléptica depende de fatores como o tipo de

crise, tempo de duração e frequência, estilo de vida e idade do paciente, além

de fatores relacionados ao fármaco, como cinética e efeitos colaterais (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). O ideal é a escolha por monoterapia, mas

59

alguns pacientes apresentam maior controle das CEs com politerapia devido a

sinergia (BRASÍLIA, 2013; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013).

Os FAEs podem atuar por diferentes mecanismos de ação, entre eles: bloqueio de canais de Na+, bloqueio de canais de Ca++, aumento da inibição

GABAérgica e bloqueio da transmissão glutamatérgica excitatória (BRASÍLIA,

2013).

Fármacos como a carbamazepina (Tegretol®), gabapentina

(Neurontin®), lamotrigina (Lamictal®), leviracetam (Keppra®), oxcarbazepina

(Trileptal®), fenitoína (Hidantal®), topiramato (Topamax®), valproato de

sódio (Depakene®) e zonisamida (Zonegran®) atuam bloqueando canais de

Na+ ou Ca++ e são importantes no tratamento das crises parciais e tônico-

clônicas generalizadas (SILVA; CABRAL, 2008).

As crises de ausência podem ser tratadas com fármacos que

bloqueiam seletivamente canais de Ca++ como a etossuximida (Etoxin®) e zonisamida (Zonegran®); e valproato de sódio (Depakene®) que bloqueia o

influxo de Na+ (SILVA; CABRAL, 2008).

Todos os tipos de crise, exceto crises de ausência, podem ser tratados

com fármacos que atuam em receptores do tipo GABAA (SILVA; CABRAL,

2008).

O quadro 2 mostra as classificações dos FAEs e seus principais

exemplos, descreve os principais mecanismos de ação, suas indicações clínicas

e efeitos adversos.

60

Quadro 2. Fármacos antiepilépticos, mecanismos de ação e efeitos adversos.

FÁRMACO INDICAÇÃO

CLÍNICA MECANISMO DE

AÇÃO EFEITOS ADVERSOS

Barbitúricos – Fenobarbital (Gardenal®)

NH

NH

O O

O

CH3

Convulsões

tônico-clônicas,

generalizadas e parciais

Modulação alosté-

rica de GABAA, prolongamento da abertura dos canais

de Cl-.

Depressão, hipoten-

são, bradicardia, sonolência, letargia, ataxia, tolerância e

dependência

Benzodiazepínicos – Diazepam (Valium®)

ClN

N

O

CH3

Ausência, con-

vulsões parciais e

febris

Modulação alosté-rica, aumento da ação do GABA

Sedação, tolerância e dependência

Carbamazepina (Tegretol®)

N

NH2O

Convulsões tônico-

clônicas generalizadas

e parciais

Bloqueio de canais de Na+ dependen-tes de voltagem

Sedação, ataxia, retenção hídrica,

hipersensibilidade grave

Etossuximida (Etoxin®)

NH

O

O

CH3

CH3

Convulsões parciais e

generalizadas

Bloqueio de canais

de Ca++ e Na+ voltagem-

dependentes

Visão dupla, tontu-

ra, náuseas, dor de cabeça, exantema e

leucopenia

Gabapentina (Neurontin®)

NH2

O

OH

Convulsões parciais

Análogo estrutural do GABA, blo-queio canais de

Ca++ voltagem-dependentes

Sedação, náuseas, alteração de

comportamento e

movimento, ganho de peso

61

Hidantoínas – Fenitoína (Hidantal®)

NH

NH

O

O

Convulsões tônico-

clônicas generalizadas

e parciais

Bloqueio de canais de Na+ dependen-tes de voltagem

Sedação e anemia megaloblástica

Lacosamida (Vimpat®)

NHNH

O

O

CH3

O

CH3


Modulação de canais de Na+

Tontura, náuseas,

fadiga, ataxia, diplopia e nistagmo

Lamotrigina (Lamictal®) N

NN

NH2 NH2

Cl

Cl

Coadjuvante para

convulsões parciais em adultos e epilepsia

generalizada

Bloqueio de canais de Na+ e bloqueio

indireto da libera-ção do GLU

Rash, diplopia, sedação, síndrome

de Stevens-Johnson, necrólise epidérmica tóxica

Leviracetam (Keppra®)

N

O

CH3

NH2

O

Convulsões parciais e

generalizadas

Mecanismo desco-nhecido

Irritabilidade e transtornos de hu-

mor

Oxcarbazepina (Trileptal®)

N

O

NH2

O


Mecanismo desco-nhecido

Sonolência, fadiga, cefaleia, tontura, ataxia e vômito

62

Perampanel (Fycompa®)

N

N

O

N


Bloqueio do recep-tor AMPA de GLU

Tontura, sonolência,

irritabilidade, dor de cabeça e ataxia

Pregabalina (Lyrica®)

CH3 OH

OCH3

NH2

Complementar

para convulsões

focais

Modulação de canais de Ca++

Sonolência, tonturas, ataxia,

diplopia, ganho de peso, irritabilidade

e euforia

Primidona (Primid®)

NH

NH

O

O CH3

Convulsões

parciais e generalizadas

Metabolização a barbituratos, blo-queio canais de

Na+.

Anemia megaloblástica,

interações far-macológicas por

indução enzimática

Topiramato (Topamax®)

O

O

OO

O

CH3

CH3

CH3

CH3

O

S

OO

NH2

Coadjuvante no tratamento

de crises parciais e

generalizada

Bloqueio de canais de Na+, anta-

gonismo glutama-térgico (AMPA) e ação gabaérgica

Alterações do pen-samento, perda de peso, parestesias,

nefrolitíase

Tiagabina (Gabitril®)

N

OH

O

H

S

S

CH3

CH3

Coadjuvante de crises

parciais

Inibição de trans-portadores gaba-

érgicos

Nervosismo, tontu-ras, perda de peso

Valproato de sódio (Depakene®)

ONa

O

CH3

CH3

Convulsões generalizadas,

mioclônicas e ausência

Bloqueio de canais de Na+ e alteração

da atividade gluta-matérgica

Hepatotoxicidade, perda de pelos,

malformações fetais

Vigabatrina (Sabril®)

OH

O CH2

NH2

Crises parciais e

generalizadas

Análogo estrutural do GABA, inibição da GABA transa-

minase

Sedação, náuseas, ganho de peso, de-pressão, psicose, alteração visual

Fonte: adaptado de FORMAN et al., 2009; MOSHÉ et al., 2015; SILVA; CABRAL,

2008.

63

De acordo com a Academia Brasileira de Neurologia (2014) a maioria

dos tratamentos são oferecidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) de maneira

individualizada em centros credenciados. Entretanto, 30% dos pacientes que não respondem ao tratamento convencional são encaminhados para os centros

de especialização em epilepsia e normalmente há a indicação cirúrgica ou

alternativas como a estimulação nervosa vagal (VNS) (NAGAE et al., 2016).

3.1.6.2 Antioxidantes como adjuvantes na terapia antiepiléptica

Como descrito no item 3.1.5.4, o efeito mais importante da formação

excessiva dos radicais livres é o processo de peroxidação lipídica, no qual pode ocorrer o rompimento das membranas lipídicas e a destruição celular. Estes

efeitos das EROs/ERNs são controlados in vivo pela ação de vários

antioxidantes como vitamina E, vitamina C, vitamina A e enzimas

antioxidantes GPx, GSH, SOD e CAT, por exemplo (SUDHA; RAO; RAO,

2001).

À exemplo dos antioxidantes, pode-se citar a vitamina C, uma

substância exógena solúvel em água que desempenha função neuroprotetora

pela inibição do estresse oxidativo, bloqueando o efluxo de Ca++, portanto,

pode interferir nos mecanismos de liberação e/ou absorção de

neurotransmissores. Além disso, a vitamina C diminui a peroxidação lipídica e atua como um neuromodulador (SAMARIYA; SHAH, 2016; SAWICKA-

GLAZER; CZUCZWAR, 2014; SUDHA; RAO; RAO, 2001).

O SNC possui regiões específicas mais susceptíveis a reações

oxidativas, como o hipocampo. O hipocampo é bastante vulnerável a

concentrações desta vitamina, além da amígdala e hipotálamo. A vitamina C é

transportada principalmente para mitocôndrias, onde as EROs/ERNs estão

acumuladas, e lá transfere um elétron para "peroxidase dependente de

ascorbato", atuando bioquimicamente como um agente redutor. Além disso, as

vitaminas antioxidantes são capazes de reduzir o estresse oxidativo e evitar a

depleção de reservas de antioxidantes endógenos pelas espécies reativas. Neste

contexto, a vitamina C parece oferecer benefícios na terapia complementar em pacientes epilépticos (OLIVEIRA et al., 2016; SAMARIYA; SHAH, 2016;

SAWICKA-GLAZER; CZUCZWAR, 2014).

3.2 Testes animais em epilepsia

A experimentação animal é uma ferramenta fundamental para a

neurociência. Os testes animais são utilizados para explorar e avaliar

determinadas doenças, mecanismos envolvidos e avaliar a potencial eficácia

das intervenções terapêuticas, a partir do efeito produzido que mimetiza, direta

64

ou indiretamente, o que acontece nos seres humanos (FERNANDES, 2013;

MCGONIGLE, 2014).

Distúrbios do SNC normalmente são multicausais e não tem todos os

mecanismos bem estabelecidos. Em decorrência da escassez de informações e mecanismos moleculares não compreendidos, a tarefa de se pesquisar e

reproduzir testes animais é desafiadora (GRONE; BARABAN, 2015;

MCGONIGLE, 2014).

Os experimentos animais utilizados em doenças mentais, como por

exemplo a epilepsia, mimetizam os sintomas de maneira discreta e distante,

pois envolve não só a fisiopatologia, mas outros fenômenos somáticos

associados, que ocorrem unicamente in vivo. O desenvolvimento e a utilização

de testes animais do SNC estão limitados a sintomas mensuráveis da doença,

como alterações sensoriais e comportamentais (GRONE; BARABAN, 2015;

YACUBIAN, 2014) e com os testes de epilepsia isso não é diferente.

Um experimento animal in vivo ideal deve satisfazer alguns critérios,

como: presença de padrões fisiológicos semelhantes aos observados em humanos; predisposição genética ou lesão semelhantes; a condição

experimental deve responder de maneira semelhante aos FAEs; e as

características comportamentais devem também refletir as manifestações

humanas (AUVIN et al., 2012). Neste contexto, os testes devem satisfazer três

critérios primordiais: validade de constructo, validade preditiva e validade

fenomenológica, ou seja, deve apresentar habilidade de reproduzir as condições

fisiopatológicas humanas, os agentes terapêuticos utilizados devem reverter os

sintomas causados pelo teste, e mimetizar os sintomas da doença (GRONE;

BARABAN, 2015).

Os experimentos animais disponíveis para o estudo dos mecanismos

epilépticos são categorizados em testes de convulsões ou modelos de epilepsia. Os testes que induzem somente crises agudas devem ser considerados testes de

convulsão. Do contrário, modelos que permitem a investigação de mecanismos

fisiopatológicos, avaliação, desenvolvimento de novos FAEs, consequências

cognitivas e comorbidades concomitantes a epilepsia são considerados modelos

de epilepsia (AUVIN et al., 2012).

Diversas espécies animais podem ser utilizadas em estudos

experimentais epilépticos, mas roedores como ratos e camundongos são os mais

empregados devido ao baixo custo, facilidade de procriação em laboratório, e

pelos conhecimentos sobre questões neuroanatômicas, neuroquímicas e

comportamentais (FERNANDES, 2013).

Os procedimentos devem sempre ser aprovados pelo Comitê de Ética

no Uso de Animais (CEUA) da instituição pesquisadora, com o objetivo de reduzir conflitos de interesse em relação a avaliação e aprovação de protocolos

experimentais, verificando a viabilidade dos mesmos (GRONE; BARABAN,

2015). Após aprovação pelo CEUA, os animais são submetidos a indução das

65

CEs por agentes químicos (PTZ, STR, pilocarpina, por exemplo), físicos

(criogenia) ou elétricos (eletrochoque máximo), e podem ser mantidos vivos

para acompanhar o desenvolvimento e a evolução da epileptogênese

(FERNANDES, 2013). O teste de convulsão induzida por PTZ, um dos mais utilizados no

desenvolvimento de FAEs, induz crises convulsivas agudas ou crônicas

(método do abrasamento). A geração das crises se dá pelo antagonismo dos

receptores GABAA, reduzindo sua ação inibitória no SNC. Após a

administração de PTZ os animais apresentam crises tônico-clônicas,

mioclônicas e de ausência, de aproximadamente 5 minutos (HAHN;

BURRELL, 2015).

No teste de convulsão induzida por STR há a geração de crises

intensas, que normalmente levam os animais a óbito. Sua ação é o antagonismo

dos receptores de glicina, promovendo a diminuição do seu efeito inibitório no

SNC (SOLIMAN et al., 2016).

A pilocarpina é capaz de induzir crises prolongadas (estado epiléptico), seguido de crises recorrentes, por seu potencial agonista colinérgico

muscarínico. As manifestações epilépticas iniciam cerca de 15-30 minutos após

a administração da pilocarpina e podem durar por horas. O animal que

sobrevive às manifestações agudas entre num período de latência até a

ocorrência de novas crises que perduram toda a vida (FERNANDES, 2013).

Comumente usado no desenvolvimento de novos FAEs, o teste de

eletrochoque máximo (ECM) é capaz de induzir convulsões clônicas e/ou

tônicas generalizadas a partir de uma corrente elétrica alternada, administrada

na cavidade auricular dos animais através de eletrodos, com impulsos de

intensidade que variam entre 60 Hz e 50 mA (em camundongos) ou 150 mA

(em ratos) (YACUBIAN, 2014). Além dos experimentos animais in vivo mencionados acima, a

atividade farmacológica de compostos em estudo pode ser rastreada

inicialmente por testes animais in vitro, que permitem a utilização de tecidos e

cultura celular para estudar processos associados à epileptogênese

(FERNANDES, 2013; GALANOPOULOU et al., 2013).

Técnicas de baixo custo e potencial permitem a avaliação de milhares

de compostos que vem sendo desenvolvidos. Neste sentido, testes em

organismos simples (Drosophila, C. elegans, zebrafish e Xenopus), podem

servir de screening para compostos com atividade anticonvulsivante

(CALCAGNOTTO; MELLO, 2014).

A utilização de métodos alternativos tem papel fundamental na

comunidade científica porque proporciona a redução do número de animais e custos nos experimentos. No entanto, mas não substituem os testes

convencionais já que os fenômenos envolvidos nas patologias mentais ocorrem

unicamente in vivo. Mesmo que existam outros testes animais disponíveis e

66

relatados na literatura, nenhum mostra-se mais eficaz do que os testes de PTZ e

ECM na descoberta de novos FAEs (YACUBIAN, 2014).

3.3 Química medicinal e a descoberta de fármacos

Desde o início da civilização os povos procuravam e utilizavam

substâncias naturais para o alívio das doenças. A sociedade científica é

constantemente instigada pelos tratamentos e pela cura das doenças através da

implementação de nova e avançada tecnologia na busca de novos fármacos

(NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).

Estima-se que cerca de 1,5 bilhões de pessoas no mundo sofrem de

algum transtorno do SNC e, portanto, há uma forte demanda pela busca e

desenvolvimento de novos tratamentos eficazes. De acordo com Brasnjevic et

al. (2009), se novos fármacos não forem descobertos, o número de pessoas com

distúrbios do SNC será de aproximadamente 1,9 bilhões até 2020. A cadeia farmacêutica transforma, em primeiro passo, intermediários

químicos e extratos vegetais em princípios ativos, os quais, posteriormente são

convertidos em medicamentos finais para o tratamento e prevenção de doenças

no ser humano (BARREIRO, 2009).

É através de estudos da química medicinal que a pesquisa de

moléculas biologicamente ativas é realizada, sendo de fundamental importância

durante o processo de desenvolvimento de novos medicamentos, até sua

inclusão no mercado farmacêutico. A química medicinal, segundo definição da

International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), é uma ciência

multidisciplinar de importante papel na produção e desenvolvimento de

fármacos, cuja implicação se dá nas áreas química, biológica, médica e

farmacêutica, na qual os objetivos são o planejamento, descoberta, invenção, identificação e preparação de protótipos, para a elucidação da relação estrutura

química e a atividade farmacológica (GUIDO; ANDRICOPULO; OLIVA,

2010; LIMA, 2007).

O principal foco das indústrias farmacêuticas, atualmente, está voltado

à descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos que possam satisfazer

as necessidades da população, tanto na oferta de novas terapias para doenças

sem tratamento, quanto para a melhoria das opções de tratamentos já existentes,

contudo mais eficazes e mais seguros (MIGNANI et al., 2016a). Além disso, as

empresas farmacêuticas devem buscar novas abordagens de desenvolvimento,

visando a melhoria da produtividade, garantia das demandas do setor de saúde e

da sobrevivência em termos de retorno do investimento (MIGNANI et al., 2016b).

A descoberta de novos fármacos é considerada o maior desafio

encontrado para a indústria farmacêutica. A área de P&D necessita de altos

investimentos, que mostra um contraste em relação aos medicamentos incluídos

67

no mercado nos últimos anos. Durante várias décadas, o setor encarou grandes

questões não técnicas, como a redução do número de medicamentos aprovados

pela FDA, reduções nos orçamentos e aumentos nos custos globais de P&D

(MIGNANI et al., 2016a). Estima-se que a cada 9 anos, desde a década de 1950, o número de aprovações de novos medicamentos tenha reduzido pela

metade (BAYLISS et al., 2016).

Segundo Lima (2007), há uma questão quanto à produtividade, já que

a relação entre os investimentos em P&D e a descoberta de NCEs é

inversamente proporcional. Segundo dados recentes de Bayliss e colaboradores

(2016) apenas 4,3% dos projetos de P&D prosseguem com fármacos

promissores desde a fase clínica até estudos de fase III.

A relação estrutura química e atividade biológica compreende o estudo

dos efeitos que a estrutura química de um composto pode causar durante sua

interação com o receptor biológico levando-se em consideração as forças

intermoleculares, para que esses compostos se tornem fortes candidatos a novos

fármacos. Geralmente, novos compostos são descobertos durante um planejamento racional, que envolve etapas como a identificação e a otimização

de um composto-protótipo (BARREIRO, 2009). O grande desafio dos pesquisadores durante a descoberta de novos

fármacos é o equilíbrio que deve existir entre sua eficácia, que se traduz em

potência e seletividade, e características farmacocinéticas, que envolve

absorção, distribuição, metabolização e excreção (MELO, 2008).

Em resposta a esta demanda crescente por substâncias estruturalmente

inovadoras para a avaliação farmacológica, um novo paradigma se estabelece

na identificação de substâncias bioativas e ao desenvolvimento de compostos-

protótipo com propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas otimizadas,

com o intuito de se obter conhecimentos mais detalhados sobre a complexidade de doenças.

3.4 Desenvolvimento de fármacos anticonvulsivantes

Apesar dos avanços da neurociência e das pesquisas que tratam do

desenvolvimento de novos fármacos para doenças do SNC, o número de

aprovações de novos medicamentos tem diminuído ao longo das décadas. Para

Muglia (2011), a psiquiatria pode ser considerada a área terapêutica mais difícil

e arriscada para a descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos.

Um dos principais desafios para a indústria farmacêutica na produção

e desenvolvimento destes medicamentos é o alto investimento necessário para a pesquisa, que chegam a milhares de dólares e que tendem a aumentar com o

passar dos anos (MILLER, 2010).

Segundo o IMS Health (2016) os gastos globais com medicamentos

chegarão a aproximadamente US$ 1,5 trilhões até 2021. A inovação em

68

medicamentos, inclusive para SNC, continuará elevando os gastos de 30% em

2016, para 35% em 2021. De acordo com o instituto, devido a má compreensão

dos mecanismos das doenças que acometem o SNC, e falhas no processo de

P&D por conta de efeitos colaterais e falta de eficácia, o desenvolvimento de medicamentos foram escassos por vários anos, mas até 2021, novos fármacos

para o SNC podem chegar ao mercado farmacêutico (Figura 9).

Figura 9. Estimativa de crescimento e gastos globais com medicamentos até 2021.

Fonte: Traduzido de IMS Health (2016).

Nos próximos anos, o lançamento de novos fármacos deverá atingir

níveis que poderão chegar a 45 novas substâncias ativas até 2021. Estes novos

agentes terapêuticos atenderão as necessidades de várias doenças, que ainda

não foram satisfeitas, incluindo doenças autoimunes, câncer e SNC. Compostos com ação central ocupam o 3º lugar dos medicamentos globais na fase tardia de

desenvolvimento clínico (Figura 10) (IMS HEALTH, 2016).

69

Figura 10. Medicamentos globais em fase avançada de desenvolvimento em 2016.

Fonte: Traduzido de IMS Health (2016).

De acordo com Franco, French e Perucca (2016) os altos

investimentos são necessários não só na fase de pesquisa. Estima-se que até

2019, a venda dos FAEs nos principais mercados do mundo (Estados Unidos,

França, Alemanha, Itália, Espanha, Reino Unido e Japão) deverá atingir US$

4,5 bilhões. Segundo os mesmos autores, a lacosamida (Vimpat®),

anticonvulsivante que aumenta a inativação de canais de Na+, que foi

introduzida no mercado farmacêutico em 2008, pode se tornar um dos fármacos

mais rentáveis do mundo até 2020, atingindo vendas de até US$ 1,2 bilhões.

De acordo com Muglia (2011), além dos medicamentos desenvolvidos

para o SNC custarem mais, estes demoram mais tempo para serem lançados no

mercado farmacêutico, quando comparados com outros tipos de fármacos, pois, segundo ele, modelos pré-clínicos preditivos e biomarcadores humanos

validados não são suficientemente eficazes. A figura 11 mostra que os prazos

para as fases clínicas e aprovação de drogas do SNC, entre 2005 e 2009 foi

maior do que para qualquer outro fármaco de outra área terapêutica: 10 anos

para fármacos que atuam no SNC contra 7,8 anos para fármacos com ação

cardiovascular e 7,6 para antineoplásicos.

70

Figura 11. Média de prazos para as fases clínicas e aprovação de entidades terapêuticas entre 2005 e 2009.

Fonte: adaptado de MILLER, 2010.

Como descrito na literatura, apenas 8% dos fármacos para SNC que

chegam aos ensaios clínicos são aprovados, o que significa cerca de metade da

taxa de sucesso em outras áreas terapêuticas (Figura 12). Outra questão importante, é que quando estes fármacos falham, costumam falhar em fases

tardias do processo de descoberta e desenvolvimento, quando muitos

investimentos já foram realizados (MILLER, 2010; MUGLIA, 2011).

Figura 12. Taxa de sucesso de aprovação clínica.

Fonte: adaptado de MILLER, 2010.

71

No que tange a epilepsia, as indústrias farmacêuticas e os

pesquisadores continuam na busca por novos agentes anticonvulsivantes

eficazes a partir de duas vertentes principais: o uso de testes experimentais de

epilepsia em animais de laboratório e a síntese de compostos com potencial ação na geração de crises (CALCAGNOTTO; MELLO, 2014). Porém, sabe-se

que até o presente momento, não há um FAE ideal capaz de prevenir ou curar a

epilepsia. Fármacos bem tolerados, superiores aos agentes existentes em

relação a capacidade de influenciar mecanismos da doença, sugere um enorme

sucesso no mercado (FRANCO; FRENCH; PERUCCA, 2016).

3.5 Planejamento de fármacos e ferramentas computacionais

3.5.1 Parâmetros físico-químicos para a permeação e biodisponibilidade por

via oral in sílico

Inovações tecnológicas têm contribuído no desenvolvimento de novos

produtos e, consequentemente, a sobrevivência da indústria farmacêutica tem se

destacado no mercado por ser considerada uma das mais lucrativas. Inovar é

fundamental para a sobrevivência das empresas neste setor industrial. O método

de descoberta de fármacos baseado na modificação estrutural de moléculas

conhecidas leva à obtenção de novos compostos-protótipo, que possam atuar

pelo mesmo mecanismo farmacológico da molécula de origem (BARREIRO;

FRAGA, 2008).

Os modelos computacionais são conhecidos por relacionar dados

químicos e propriedades biológicas e propor mecanismos de ligação entre

ligantes e alvos, conhecido como modelos de relação estrutura-atividade (QSAR) foram desenvolvidos em 1962 (MALTAROLLO et al., 2014), a fim

de minimizar custos e experimentação animal (CLARK et al., 2015).

As técnicas de modificação molecular e estudos QSAR são

largamente empregadas na indústria farmacêutica durante o desenvolvimento

de novos fármacos. No entanto, são dispendiosas e demandam considerável

tempo de investigação. Por outro lado, a descoberta de novas substâncias

bioativas de possível aplicação terapêutica, caracteriza a inovação

farmacêutica (BARREIRO; FRAGA, 2008).

Várias análises se destacam como estratégias de avaliação para

identificar novas moléculas e melhorar a qualidade do composto, como, por

exemplo, técnicas de triagem e acompanhamento dos vários índices cinéticos e parâmetros físico-químicos (MIGNANI et al., 2016a).

Além da otimização de candidatos a fármacos em desenvolvimento,

uma das principais razões para a utilização dos métodos computacionais na

72

triagem de novas moléculas é a teórica classificação de um composto como

ativo ou inativo, utilizando descritores (MALTAROLLO et al., 2014).

Maltarollo et al. (2014) relataram que há estimativas em que entre

2020 e 2030, os estudos computacionais precederão os experimentais indicando aplicação bem-sucedida destas ferramentas em estágios iniciais de

desenvolvimento farmacêutico. A probabilidade de sucesso pode ser melhorada

através do aumento do número de compostos que possuem ótimo perfil,

levando-se em conta parâmetros ADMET, o qual podem ser avaliados por

testes de predição computacionais, chamados in sílico, além de testes in vitro e

in vivo. Neste campo, a compreensão das propriedades físico-químicas é

fundamental quando se pensa em desenvolvimento de novos compostos-

protótipo (MIGNANI et al., 2016a).

Segundo Uddin e Khan (2016) existem várias abordagens in sílico

para o rastreio de dados químicos e biológicos essenciais no processo de

desenvolvimento de novos compostos sintéticos. Dentre as estratégias

utilizadas na identificação de novas substâncias biologicamente ativas, a técnica de triagem biológica virtual (Virtual screening), ocupa papel

fundamental, levando-se em conta o significativo número de alvos

farmacológicos. Esta técnica consiste em um método computacional, in sílico,

utilizado em grandes bases de dados de compostos, a fim de se identificar

substâncias capazes de interagir com alvos para futuros testes in vitro (UDDIN;

KHAN, 2016).

Ferramentas como Molinspiration, Osiris Property Explore e

PreADMET são programas de livre acesso na internet, que auxiliam na

determinação de propriedades físico-químicas e farmacocinéticas, a partir de

bases de dados químicas disponíveis. A triagem virtual é uma abordagem

importante na P&D de novas moléculas, já que correlaciona a estrutura molecular com as possíveis propriedades farmacológicas (UDDIN; KHAN,

2016).

O software Molinspiration permite a análise de alguns parâmetros

sugeridos por Lipinski, em 1997 (LIPINSKI et al., 2001) e reavaliados pelo

mesmo autor em 2016 (LIPINSKI, 2016). Estes parâmetros possuem grande

relevância na descoberta e identificação de novas substâncias ativas, sendo

utilizados pelas indústrias farmacêuticas para estimar a solubilidade e a

permeabilidade de fármacos administrados pela via oral (v.o.). A partir dos

resultados obtidos, podem-se predizer as influências moleculares e estruturais

de um fármaco que estão relacionadas a sua absorção in vivo (MIGNANI et al.,

2016a; NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).

A regra de Lipinski (Lipinski rule) ou “regra dos cinco” (Five´s rule ou Rule of five) tem este nome pois, cada parâmetro envolvido usa valores que

são múltiplos do número 5 (LIPINSKI et al., 2001; MIGNANI et al., 2016;

NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).

73

De acordo com Lipinski, para que um composto possua boa absorção e

permeabilidade oral, este deve obedecer alguns critérios: massa molecular

(MM) menor que 500 Da (daltons); LogP calculado menor do que 5; não mais

do que 5 doadores de ligação de hidrogênio (OH + NH); não mais do que 10 aceptores de ligações de hidrogênio (O + N) (LIPINSKI et al., 2001;

MATSSON et al., 2016; MIGNANI et al., 2016; NOGUEIRA;

MONTANARI; DONNICI, 2009).

Estudos posteriores também realizados por Lipinski sugeriram a

ampliação das análises pela introdução dos parâmetros: número de ligações

rotacionais, que não deve exceder a 10; e a área de superfície polar (TPSA),

que deve ser menor ou igual a 140 Å2 (LIPINSKI, 2004).

Conforme mencionado anteriormente, a regra dos cinco foi reavaliada

pelo mesmo autor recentemente (LIPINSKI, 2016). Segundo ele, três dos

quatro parâmetros avaliados pela regra, são fundamentais para a ligação

fármaco-receptor. São elas: MM, aceptores e doadores de ligação de

hidrogênio. A lipofilicidade é também um parâmetro importante, mas não se relaciona diretamente com a biofísica do sítio de ligação.

Em 2008 surgiu o OSIRIS, programa eletrônico que abrange

informações desde a síntese de compostos até o desenvolvimento clínico. É

uma ferramenta de análise que, a partir do acesso à base de dados, pode-se

predizer o perfil toxicológico, as propriedades físico-químicas, a semelhança

aos fármacos (druglikeness) e a classificação de fármacos (drugscore). Quanto

aos valores de druglikeness, espera-se que os compostos ativos tenham

resultados positivos, o que indica a presença de fragmentos de fármacos já

conhecidos na base de dados, em relação a descritores topológicos, dados

estruturais, LogP e MM. A avaliação do potencial farmacológico do composto

é dada pelo drugscore com valores positivos, a partir da comparação entre lipofilicidade, solubilidade, MM e toxicidade (HASSAN et al., 2015). Além

dos dados de druglikeness e drugscore, o programa fornece valores de LogS

(solubilidade), que também auxilia na avaliação da sua capacidade de absorção,

e normalmente apresenta valor maior que -4mol/L (NUNES, 2016; OSIRIS,

2017).

O programa PreADMET é utilizado para a avaliação dos parâmetros

farmacocinéticos, como a absorção intestinal humana (AIH), passagem pela

barreira hematoencefálica (BHE) e toxicidade, avaliando mutagênese e

carcinogênese. Particularmente o modelo in sílico AIH e BHE podem fornecer

informações essenciais sobre a administração oral e ação no SNC,

respectivamente (KOVAČEVIĆ et al., 2014; MALTAROLLO et al., 2014;

NUNES, 2016; PreADMET, 2017). As estratégias moleculares in sílico tornam possível o

estabelecimento de estudos sobre moléculas promissoras e de interesse

biológico, em especial no caso dos anticonvulsivantes, já que a relação de

74

permeabilidade cerebral e fármaco-sangue é a medida experimental mais

utilizada na previsão de compostos ativos no SNC (LIPINSKI, 2004).

3.5.2 Parâmetros físico-químicos para a permeação no SNC in sílico

Como mencionado anteriormente, o desenvolvimento de fármacos

direcionados ao SNC é um desafio e apenas 8% dos compostos chegam aos

estudos de Fase 1 e ao lançamento no mercado farmacêutico (MILLER, 2010;

MUGLIA, 2011).

A BHE é o principal obstáculo que impede a entrada de fármacos e

outras substâncias no cérebro. Esta barreira consiste em uma monocamada de

células endoteliais microvasculares cerebrais, unidas por junções apertadas que

formam uma membrana (Figura 13). Estas junções restringem o movimento de

fármacos através da via paracelular e forçam os compostos a utilizarem as vias

transcelulares. Portanto, a função da BHE é o transporte de nutrientes e substâncias para o cérebro e remoção de compostos potencialmente tóxicos.

Compostos lipossolúveis se difundem por difusão passiva, enquanto que

compostos hidrossolúveis requerem a presença de transportadores, como a

glicoproteína-P (GELDENHUYS et al., 2015; ZHANG et al., 2016).

Figura 13. Esquema estrutural da barreira hematoencefálica e capilares periféricos.

Fonte: traduzido de GELDENHUYS et al., 2015.

A capacidade de permeação pela BHE depende de propriedades

físico-químicas e farmacocinéticas, incluindo: LogP, MM, TPSA, doadores e

aceptores de ligações de hidrogênio, ligações rotacionais, Log S, ligação a

proteínas plasmáticas, coeficiente de distribuição (LogD), entre outros

75

(GELDENHUYS et al., 2015; GOLANI; GOLANI, 2015; ZHANG et al.,

2016). De acordo com Geldenhuys et al. (2015), os principais descritores

considerados na predição da permeabilidade no SNC devem ser LogP, LogD e

TPSA, seguido pela predição dos outros parâmetros (Figura 14).

Figura 14. Principais descritores utilizados para a predição da permeabilidade da

barreira hematoencefálica segundo Geldenhuys et al., 2015.

Fonte: traduzido de GELDENHUYS et al., 2015.

A lipofilicidade, comumente medida pelo LogP, desempenha papel

importante na ADME de fármacos. Embora o elevado grau de lipossolubilidade

favoreça a penetração pela BHE por difusão transmembrana, pode ocorrer a

captação do composto pelos tecidos periféricos, diminuindo a quantidade de

fármaco livre. Normalmente, a lipofilicidade é um bom preditor da penetração da BHE (GOLANI; GOLANI, 2015). Os valores de LogP recomendados para

os fármacos atuarem no SNC estão entre 1 e 4 (EIGENMANN et al., 2016).

A MM ideal de um composto para a passagem pela BHE situa-se na

região de 300 a 450 Da (CLARK, 2003; EIGENMANN et al., 2016; GOLANI;

GOLANI, 2015).

Com relação à polaridade ou capacidade de ligação de hidrogênio, os

descritores como doadores e aceptores de hidrogênio se correlacionam

inversamente com a permeabilidade pela BHE. Ou seja, compostos altamente

polares não permeiam facilmente esta membrana. Assim, os valores

recomendados são 3 e 7 para doadores e aceptores de ligações de hidrogênio,

respectivamente (PAJOUHESH; LENZ, 2005). Segundo Clark (2003) e Pajouhesh; Lenz (2005), se a soma de átomos de nitrogênio e oxigênio (N + O)

em uma molécula é ≤ 5, o composto tem maior chance de entrar no SNC.

O papel da flexibilidade molecular é importante para a permeação

cerebral, e o aumento da taxa de permeação está relacionado com a diminuição

da contagem de ligações rotacionais, as quais devem ser menores que 8 para

fármacos do SNC (CLARK, 2003; EIGENMANN et al., 2016).

76

A TPSA é uma medida comumente usada para a otimização da

capacidade de um fármaco em permear as células. Compostos com TPSA

superior a 140 Å2, tem contribuição negativa para permeabilidade na BHE

(GOLANI; GOLANI, 2015). Segundo a literatura, compostos bem absorvidos e com ação central apresentam valor de TPSA entre 70 Å2 e 90 Å2 (CLARK,

2003; EIGENMANN et al., 2016; PAJOUHESH; LENZ, 2005).

Clark (2003) também leva em consideração os valores de LogD, que

é o logaritmo do coeficiente de distribuição de um composto, no qual um valor

no intervalo de 0 – 3 é recomendado. A distribuição dos fármacos nos tecidos

está intimamente relacionada com a ligação às proteínas plasmáticas (albumina,

glicoproteína P e lipoproteínas). Dependendo do fármaco e do alvo, a afinidade

com proteínas plasmáticas pode, consequentemente, ser vantajosa ou não para a

eficácia. A albumina é a proteína mais abundante no plasma sanguíneo e serve

como uma proteína de transporte de baixa afinidade e alta capacidade de

ligação. Os fármacos com grau de ligação mais baixo estão mais disponíveis

para a distribuição para os órgãos e tecidos, incluindo o SNC. Apenas o fármaco livre está disponível para difusão passiva através da BHE, e

consequentemente, para efeito farmacológico (GOLANI; GOLANI, 2015;

PAJOUHESH; LENZ, 2005). A glicoproteína-P tem baixa capacidade de

ligação e alta afinidade, portanto, fármacos para o SNC não devem ser um

substrato de glicoproteína-P eficiente e um ligante de albumina sérica de

elevada afinidade (PAJOUHESH; LENZ, 2005).

A tabela 1 mostra os descritores mencionados por Mahar Doan et al.

(2002) e Pajouhesh e Lenz (2005) para o sucesso da penetração de fármacos

pela BHE.

Assim, o possível efeito no SNC de um novo candidato a fármaco

pode ser investigado por predições de parâmetros físico-químicos e farmacocinéticos, os quais devem se adequar ao maior número de critérios

estabelecidos cientificamente, para uma taxa de sucesso muito maior em

relação à penetração cerebral.

77

Tabela 1. Propriedades físico-químicas de compostos e valores relacionados à penetração da barreira hematoencefálica.

Propriedades físico-

químicas

SNC Não-SNC

MM 319 (151 – 655) 330 (163-671)

LogP 3,43* (0,16 – 6,59) 2,78* (-2,81 – 6,09)

LogD 2,08 (-1,34 – 6,57) 1,07 (-2,81 – 5,53)

TPSA 40,5 (4,63 – 108) 56,1 (3,25 – 151)

∑NH+OH 0,85* (0 – 3) 1,56* (0 – 6)

∑N+O 3,56 (1 – 10) 4,51 (1 – 11)

nRot 1,27* (0 – 5) 2,18* (0 – 4) Legenda: MM – massa molecular; LogP – coeficiente de partição octanol/água; LogD –

coeficiente de distribuição; TPSA – área de superfície polar; ∑NH+OH – doadores de ligação de

hidrogênio; ∑N+O – aceptores de ligação de hidrogênio; nRot – número de ligações rotacionais.

*Diferença estatística

Fonte: adaptado de MAHAR DOAN et al., 2002; PAJOUHESH; LENZ, 2005.

3.6 Heterociclos

Os heterociclos são amplamente distribuídos na natureza e fazem parte

da grande maioria de substâncias essenciais para a vida. Fragmentos

farmacologicamente ativos podem conter átomos de nitrogênio, enxofre e

oxigênio e são utilizados para o design de novos medicamentos (TOMI et al.,

2016).

A química de heterociclos trata da síntese e de suas aplicações

essenciais para o desenvolvimento de novos bioprodutos. Em especial na

indústria farmacêutica, os heterociclos são fragmentos comuns na grande

maioria dos fármacos comerciais. Estes podem ser definidos como estruturas

cíclicas que contém diferentes heteroátomos em um anel, sendo oxigênio,

enxofre e especialmente nitrogênio, os heteroátomos prevalentes (TOMI et al.,

2016). A figura 15 mostra heterociclos de interesse biológico.

78

Figura 15. Modelos estruturais de heterociclos de interesse biológico.

S

N

Tiazol

NH

NH

Piperazina

NH

O

O

Succinimida

N

NH

Pirazol

N

S

Isotiazol

NH

Pirrol

O

N

Oxazol

Fonte: o autor.

A partir da introdução de heterociclos em estruturas moleculares, as propriedades farmacológicas, farmacocinéticas, toxicológicas e físico-químicas

podem ser manipuladas e modificadas, contribuindo na melhoria das

características essenciais dos novos candidatos a fármacos (GOMTSYAN,

2012).

Dentre os compostos extensivamente estudados e frequentemente

submetidos a alterações estruturais em busca de moléculas mais reativas frente

às diversas atividades biológicas relatadas, destacam-se as TZDs, uma classe de

compostos com utilidade comprovada pela química medicinal.

3.6.1 Tiazolidinodiona (TZD)

Existem atualmente muitos compostos biologicamente ativos com

anéis de cinco membros que contém heteroátomos. As TZDs são consideradas

umas das mais promissoras estruturas na química medicinal (SHYAM;

DEBNATH; DEVBHUTI, 2016). A tiazolidina-2,4-diona é uma substância

derivada do tiazol ou tiazolidina (A), que apresenta em sua estrutura um

sistema de anel de cinco membros, contendo três átomos de carbono, um átomo

de enxofre e um átomo de nitrogênio, com dois grupos carbonila nas posições 2

e 4 do anel (Figura 16) (KORMANN, 2013; SHYAM; DEBNATH;

DEVBHUTI, 2016).

79

Figura 16. Estrutura molecular da tiazolidina (A) e seu derivado tiazolidina-2,4-diona (TZD) (B).

Fonte: adaptado de KORMANN, 2013.

As TZDs, também conhecidas como glitazonas, foram inicialmente

descobertas pela indústria farmacêutica Takeda, no Japão, em 1975

(CHINTHALA et al., 2013). Na década de 1980, as TZDs foram

extensivamente estudadas como agentes antihiperglicêmicos. De acordo com

Chinthala e colaboradores (2013), e Shyam, Debnath, Devbhuti (2016), o

primeiro representante do grupo foi a ciglitazona (1), porém, embora

melhorasse o controle glicêmico, a toxicidade impediu ensaios em humanos.

Em seguida, foram descobertos seus derivados englitazona (2), troglitazona

(Resulin®) (3), retirada do mercado farmacêutico por causa de sua toxicidade

hepática (GAONKAR et al., 2014), rosiglitazona (Avandia®) (4), associada a

riscos cardiovasculares (GILBERT, KRUM, 2015), e pioglitazona (Actos®) (5), útil no tratamento para diabetes mellitus tipo 2 (CHINTHALA et al., 2013)

(Figura 17). Estes compostos partilham uma estrutura comum de tiazolidina-

2,4-diona, responsável pela atividade farmacológica.

5

4

S1

NH3

2

5

4

S1

NH3

2

O

O

(A) (B)

80

Figura 17. Agentes antihiperglicêmicos contendo o núcleo TZD.

NH

SO

O

O

CH3

Ciglitazona (1)

NH

S

OO

O

Englitazona (2)

NH

SO

O

O

N

CH3

Pioglitazona (5)

NH

S

O

O

O

OCH3

OH CH3

CH3

CH3

Troglitazona (3)

NH

S

O

O

O

NCH3

N

Rosiglitazona (4)

Fonte: adaptado de CHINTHALA et al., 2013 e NCBI, 2016.

Além da atividade antihiperglicêmica, são atribuídas diversas

atividades biológicas ao núcleo TZD, tais como antitumoral, antimicrobiana,

antiviral, antiarrítmica, anti-inflamatória e analgésica, anti-hiperlipidêmica,

anti-obesidade, anti-oxidante e anticonvulsivante (KORMANN, 2013;

SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016). Recentemente, tem surgido vários

trabalhos apontando os possíveis efeitos anti-Alzheimer das TZDs em ensaios

pré-clínicos e clínicos (LIU; WANG; JIA, 2014; TOBA et al., 2016).

O mecanismo de ação das TZDs é atribuído a capacidade de ativação

dos receptores ativadores de proliferadores de peroxissomas (PPARs), um

receptor nuclear amplamente expresso em todos os tipos de células do SNC e

81

células imunes, capaz de controlar a expressão gênica relacionada com a

homeostase de lipídeos e glicose, diferenciação e proliferação celular, apoptose

e inflamação (DUHART et al., 2016; KORMANN, 2013; YASMIN;

JAYAPRAKASH, 2017). Existem três diferentes tipos de isoformas desse receptor: PPARα, PPARβ/δ e PPARγ, que diferem quanto à distribuição nos

tecidos, seletividade e responsividade aos ligantes. Ligantes específicos de

PPARs, geralmente são moléculas pequenas e lipofílicas, que provocam a

alteração conformacional do receptor e dá orgiem à transcrição de genes alvo

(CHING et al., 2015).

As TZDs agem como agonistas dos receptores PPARγ. A ativação dos

receptores PPARs pelas TZDs conduz à formação de heterodímeros com

receptores X-retinóides (RXRs), que contém sítios de ligação para as TZDs e

para o ácido retinóico. Após a ativação, ocorrem ligações específicas de

sequências de DNA, chamadas elementos de resposta do proliferador de

peroxissoma (PPREs). Estes PPREs são encontrados nos promotores dos genes

PPARγ, estimulando a transcrição. O PPARγ também reprime a expressão de genes de resposta inflamatória através do mecanismo chamado de

transrepressão, que não envolve a ligação ao seu elemento de DNA, e sim pela

ativação de outras classes de fatores de transcrição, como proteínas NF-kB

(fator nuclear kappa B) e AP-1 (proteína ativadora 1), e citocinas incluindo IL-

1β, IL-6 e TNF-α (fator de necrose tumoral α), reduzindo as vias de sinalização

inflamatória (DUHART et al., 2016; KORMANN, 2013). Porém, as TZDs

também podem estar envolvidos em outros mecanismos independentes de

PPARs.

Embora muitas contribuições dessa classe de compostos já se

encontram relatadas na literatura, os agentes da classe TZD estão associados à

efeitos colaterais como anemia, edema, risco cardiovascular, ganho de peso e hepatotoxicidade, portanto, fármacos com perfil mais seletivo e seguro são o

foco das pesquisas das indústrias farmacêuticas (GILBERT; KRUM, 2015).

Estudos têm demonstrado o envolvimento de respostas inflamatórias

no cérebro de humanos com epilepsia e também em modelos animais. Em

diferentes modelos, especialmente envolvendo a ciclooxigenase (COX-2) e

citocinas, como as IL-1β, IL-6 e o TNF-α, têm sido reportados com

propriedades pró-convulsivas (CHING et al., 2015; OKADA; YAMASHITA;

TSUJI, 2006).

Segundo Ching e colaboradores (2015) e Okada, Yamashita e Tsuji

(2006), a administração crônica de pioglitazona em animais reduz os

fenômenos epilépticos e a expressão de RNAm de interleucinas IL-1β, IL-6 e

TNF-α no cérebro. Ainda que se tenham dados na literatura sobre possíveis alvos das TZDs, seu mecanismo real no SNC não está totalmente elucidado.

Além da inibição da expressão de mediadores inflamatórios, ligantes

específicos PPARγ podem inibir a expressão de genes indutíveis da óxido

82

nítrico sintase (iNOS). Como mencionado anteriormente, o NO é um

modulador da susceptibilidade à convulsão, com diversos efeitos

anticonvulsivantes e/ou pró-convulsivos, e pode ser inibido por diversos

análogos de L-arginina, como por exemplo o L-NAME (MOHAZAB et al., 2012; SHAFAROODI et al., 2012).

Estudos têm demonstrado que a pioglitazona aumenta o limiar

convulsivo induzido pelo PTZ através do sistema óxidonitrérgico (MOHAZAB

et al., 2012; SHAFAROODI et al., 2012), reforçando a ideia de que derivados

da TZD podem ser úteis no tratamento da convulsão (MOHAZAB et al., 2012;

OKADA; YAMASHITA; TSUJI, 2006; SHAFAROODI et al., 2012).

Desta forma, o estudo de novos fármacos anticonvulsivantes com o

núcleo TZD parece ser bastante promissor, o que corrobora a relevância deste

estudo em encontrar novas moléculas mais seletivas, potentes, eficazes e menos

tóxicas, contribuindo para a P&D de novos compostos com potencial na

terapêutica da epilepsia.

83

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Química

4.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo

Os compostos em estudo foram sintetizados no laboratório de Síntese

Orgânica da UNIVALI pela doutoranda Elaine Cristina Kormann sob

orientação da Profª Drª Fátima de Campos Buzzi.

Eles foram sintetizados em três etapas sequenciais (KORMANN,

2013). Inicialmente foi sintetizada (5Z)-5-benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona

(BTZD), por irradiação em micro-ondas da 1,3-tiazolidino-2,4-diona e do

benzaldeído, utilizando piperidina e ácido acético como catalisadores (Figura

18A). Em seguida, o composto BTZD foi clorossulfonado, por refluxo com

ácido clorossulfônico por uma hora, formando o cloreto de 4-[(5Z)-(2,4-dioxo-

1,3-tiazolidino-5-lideno)-metil]benzeno-sulfonila (BTZDCl) (Figura 18B). A partir desta etapa foram realizadas as reações de substituição nucleofílica com

as anilinas contendo os diferentes grupos espaçadores, para a obtenção das

substâncias em estudo (Figura 18C).

Figura 18. Rota sintética para a obtenção dos derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas.


O

+S

NH

O

O

S

NH

O

O

+ H2O

Ácido acético

Piperidina(A)

1,3-tiazolidino-2,4-diona

Benzaldeído

BTZD

(B)

S

NH

O

O

+ H2SO3ClS

NH

O

O

S

O

OCl

BTZD BTZDCl

(C)S

NH

O

O

S

O

OCl

BTZDCl

+S

NH

O

O

S

O

ONH

R

NH2R

R = -C6H5; -CH2C6H5; -(CH2)2)C6H5; -(CH2)3C6H5; -(CH2)4C6H5

Derivados sulfonamídicos

benzilidenotiazolidinodionas

MeOH + HCl

+H2O

SO30-45ºC

84

Os compostos foram caracterizados por fator de retenção (Rf) e ponto

de fusão (p.f.) e confirmados por análise de IV, RMN 1H e RMN 13C

(KORMANN, 2013). As substâncias foram denominadas conforme Quadro 3.

Quadro 3. Compostos tiazolidinodiônicos em estudo.

Código do

composto Estrutura química e nomenclatura IUPAC

A1

S NH

O

OS

O

O

NH

4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-N-

fenilbenzenosulfonamida

D1

S NH

O

OS

O

O

NH

N-benzil-4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-

benzenosulfonamida

D2

S

NH

O

O

S

O

O

NH

4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-N-(2-

feniletil)benzenosulfonamida

D3

S NH

O

OS

O

O

NH


fenilpropil)benzenosulfonamida

D4

S

NH

O

O

S

O

O

NH


fenilbutil)benzenosulfonamida Fonte: adaptado de KORMANN, 2013.

85

4.1.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico

Os valores de MM, LogP, aceptores de ligação hidrogênio (∑ N + O),

doadores de ligação hidrogênio (∑ NH + OH), número de violações, número de ligações rotacionais, volume e TPSA foram obtidos por cálculos teóricos

computacionais, através do programa Free Molinspiration Online, através do

JME Editor, cortesia de Peter Ertl da Novartis, disponível no site:

http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties.

Os parâmetros de Lipinski foram calculados utilizando o ícone de

acesso à calculadora do programa Molinspiration, o qual permite a criação de

tabelas a partir dos resultados gerados.

O coeficiente de partição octanol/água (LogP), capaz de mensurar a

hidrofobicidade, foi calculado pelo software a partir da soma do LogP

calculado e LogP experimental de fragmentos de mais de 12 mil moléculas (35

pequenos fragmentos e 185 fragmentos maiores). A TPSA, relacionada com a absorção intestinal e penetração na

barreira hematoencefálica (BHE), foi calculada com base na soma de

superfícies dos átomos polares (normalmente N e O), pelo procedimento

detalhado descrito por Ertl, Rohde e Selzer (2000).

O volume molecular determina características relacionadas ao

transporte das moléculas, influenciando na absorção intestinal e permeação da

BHE. Foi calculado pelo software a partir de valores já preestabelecidos de

fragmentos ou métodos de geometria 3D. Dados de MM, ligações rotacionais,

aceptores e doadores de hidrogênio também foram calculados e fornecidos pelo

programa.

A abordagem druglikeness e drugscore foi realizada a partir de

cálculos fundamentados em base de dados de fragmentos de substâncias já conhecidas pelo programa OSIRIS, disponível no site http://www.organic-

chemistry.org/prog/peo/. Resultados positivos para druglikeness, calculados em

combinação com descritores topológicos, dados estruturais, LogP e MM,

indicam compostos possivelmente ativos devido a presença de fragmentos

disponíveis na base de dados. O potencial do composto (drugscore) foi previsto

a partir da combinação de valores referentes a lipofilicidade, solubilidade, MM

e toxicidade (HASSAN et al., 2015; NUNES, 2016).

O programa PreADMET, disponível no site

https://preadmet.bmdrc.kr/, permite a predição de parâmetros farmacocinéticos

(ADME) e de toxicidade (NUNES, 2016; PreADMET, 2017). Para a avaliação

de AIH foram considerados: 0 a 20% baixa absorção, 20 a 70% absorção moderada e 70 a 100% alta absorção (HOU et al., 2007; NUNES, 2016). Para

BHE: > 2,0 compostos com alta absorção, entre 2,0 e 0,1 compostos com média

absorção e < 0,1 compostos com baixa absorção (NUNES, 2016). Além disso,

http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties

http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/

http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/

https://preadmet.bmdrc.kr/

86

o programa forneceu valores de ligação a proteínas plasmáticas, solubilidade

aquosa e LogD.

4.2 Atividade anticonvulsivante

O delineamento experimental para o estudo das TZDs (A1, D1, D2, D3

e D4) foi realizado no laboratório de farmacologia da UNIVALI em parceria

com as acadêmicas do Curso de Farmácia, Cristiani Vanessa Ternus e Maria

Tereza Dalla Vecchia (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016), sob orientação

da Profª Drª Márcia Maria de Souza e co-orientação da Profª Drª Fátima de Campos Buzzi. O protocolo experimental foi aprovado pelo CEUA/UNIVALI

com parecer 13/15p (Anexo 1).

Os compostos foram avaliados quanto a atividade anticonvulsivante

nos testes de convulsão induzida quimicamente por PTZ e STR; e convulsão

induzida eletricamente. Os compostos foram comparados com fármacos usados

na terapia da epilepsia. A substância com melhor desempenho farmacológico

nos testes foi selecionada para avaliação sobre efeitos na memória, ansiedade,

hipnose e sistema motor, além do mecanismo de ação e avaliação bioquímica.

Após os experimentos, os animais que sobreviveram as convulsões

foram eutanasiados por equipe responsável, pelo método em atmosfera de CO2.

4.2.1 Drogas e reagentes

Para os ensaios farmacológicos, foram utilizados: estricnina (4,0

mg/Kg) (SIGMA, EUA), pentilenotetrazol (85mg/Kg) (SIGMA, EUA),

carbamazepina (20 mg/Kg) (SIGMA, EUA), gabapentina (20 mg/Kg)

(CRISTÁLIA, Brasil), flumazenil (2 mg/Kg) (CRISTÁLIA, Brasil), ketamina

(0,5 mg/Kg) (RHOBIFARMA, Brasil), fenobarbital (100 mg/mL)

(CRISTÁLIA, Brasil), L-arginina (60 mg/Kg) (SIGMA, EUA), L-NAME (10

mg/Kg) (SIGMA, EUA), 7-NI (40 mg/Kg) (SIGMA, EUA), e o composto D4

(10 mg/Kg). Foram solubilizados em solução salina enquanto que os derivados

TZD foram solubilizados em Tween 80 mais salina.

4.2.2 Via de administração

A via i.p. foi utilizada para a administração dos derivados TZDs,

salina utilizada como veículo, fármacos utilizados como controles positivos, e

PTZ e STR utilizados como indutores da crise convulsiva, no volume 0,10 mL

para cada 10 g de peso.

87

4.2.3 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss Webster machos e fêmeas com

peso entre 25 e 30 g, criados no biotério central da UNIVALI, mantidos conforme critérios exigidos pelo CEUA. Os protocolos experimentais foram

enviados ao CEUA/Univali sendo aprovado com o parecer 13/15p.

Os derivados TZDs foram inicialmente avaliados em dose única 10

mg/Kg, i.p., nos testes de PTZ, STR e ECM. Os animais foram divididos em 7

grupos com número experimental igual a 10 indivíduos por grupo (n = 10).

Num segundo momento, a substância mais ativa nos testes de

convulsão em dose única foi avaliada no teste de convulsão induzida por PTZ

em 3 doses (3, 10 e 30 mg/Kg, i.p.), para determinação da curva dose-resposta.

Para a avaliação dos parâmetros comportamentais relacionados a

deambulação, a substância foi avaliada no teste CA. Foram também avaliados

os efeitos sobre memória, ansiedade e sono, através dos testes de esquiva inibitória, labirinto em cruz elevado, e sono induzido por tiopental,

respectivamente.


induzida por pentilenotetrazol e estricnina

Conforme descrito e padronizado por Holzmann e colaboradores

(2011), grupos de animais diferentes foram tratados com os compostos em

estudo e, receberam, no teste de PTZ, como controles positivos a gabapentina

(20 mg/Kg, i.p.) e o fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), e controle negativo a salina (10 mL/Kg, i.p.). Após 30 minutos dos tratamentos, foi administrado o PTZ (85

mg/Kg, i.p.), sendo os animais colocados sob funis de vidro para observação do

tempo de latência para a primeira crise convulsiva, número de crises e número

de óbitos, num período de mais 30 minutos. Foi realizado também um teste de

convulsão induzida por PTZ por via oral (v.o.). Os animais foram tratados

conforme o mesmo procedimento descrito por Holzmann et al. (2011),

modificando apenas o tempo para a administração do composto D4 (100

mg/Kg) e do controle positivo fenobarbital (100 mg/Kg) (SON; YEN, 2014;

YAMADA; SUMIDA; SAITO, 2016), que foram administrados 1 hora antes da

indução das CEs.

No teste da STR foi modificado apenas o agente indutor das crises,

neste caso a STR (4 mg/Kg, i.p.) mantendo-se os mesmos procedimentos descritos anteriormente (HOLZMANN et al., 2011). O tempo de observação do

efeito neuroprotetor (sobrevivência) se deu num período de 24 horas após a

indução com os agentes convulsivantes.

88


induzida eletricamente

Foi utilizado um gerador de choques, conhecido como PLAT-2, como

indutor das crises. O aparato é responsável por gerar correntes elétricas

alternadas, que são aplicadas através de eletrodos de aço inoxidável na

cavidade auricular dos animais. O estímulo, necessário para a produção de

extensão tônica dos membros traseiros em 95% dos animais, foi ajustado para

impulsos de intensidade 50 mA a 60 Hz, por 200 ms. A extensão tônica

provocada pelo eletrochoque foi considerada como o registro da crise e o tempo/porcentagem de animais que a apresentaram geraram o índice de

gravidade de convulsão, conforme descrito por Swinyard e colaboradores

(1952).


comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field)

Conforme descrito por Holzmann e colaboradores (2011), foi

administrada a substância D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg via i.p. nos

animais. Passados 30 minutos, os animais foram transferidos ao aparato de

campo aberto (Figura 19) (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016). O aparato

consiste numa caixa de madeira medindo 40 x 60 x 50 cm, no qual possui um

assoalho dividido em 12 quadrantes iguais (GONÇALVES et al., 2012).

Durante um período de 6 minutos, foram avaliados o número de cruzamentos,

registrado pelo número de vezes que o animal cruzava, com as quatro patas, as

divisões do campo (crossing), e o número de atividades exploratórias caracterizado pelo levantamento do corpo do animal apoiado pelas patas

posteriores (rearing). O número crossings foi considerado como indicativo de

atividade locomotora e o número de elevações (rearing) indicativo de

comportamento exploratório.

89

Figura 19. Foto ilustrativa do aparato de campo aberto (Open Field).

Fonte: adaptado de CRYAN; HOLMES, 2005.

4.2.7 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através do teste da

esquiva inibitória (EI)

Com o intuito de verificar os efeitos do D4 sobre a memória dos

animais foi utilizado o teste da EI. O aparato de EI consiste numa caixa automatizada (ALBARSCH®), que mede 50 cm de comprimento, 25 cm de

largura e 25 cm de altura, com uma das paredes em vidro, permitindo a

observação dos animais pela parte frontal (Figura 20). O aparato possui

assoalho com uma grade formada por barras de bronze de 1 mm de diâmetro

espaçadas por 1 cm, que, quando eletrificada, aplica uma diferença de potencial

regulável de 0 a 1 mA. Sobre o assoalho encontra-se uma plataforma de

madeira. Os animais foram treinados primeiramente colocando-os sobre a

plataforma e foi cronometrado o tempo de latência para sua descida até as

barras de bronze (com as quatro patas na grade). Quando o animal desce e entra

em contato com a grade de bronze são disparados choques de 0,4mA com

duração de 2 s. Após o treino, os animais receberam o tratamento com o composto D4

e/ou salina (10 mL/Kg, i.p.), e os testes foram realizados 24 h depois, seguindo

o mesmo procedimento, com a omissão dos choques. A diferença entre a

latência de descida entre o treino e o teste foi considerada como o índice de

memória.

90

Figura 20. Foto ilustrativa do aparato e esquema do teste de esquiva inibitória.

Fonte: traduzido e adaptado de IZQUIERDO; FURINI; MYSKIW, 2016.

4.2.8 Avaliação do efeito ansiolítico do composto D4 através do teste do

labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze)

Com o intuito de avaliar o efeito do tratamento do composto D4 sobre

os parâmetros de ansiedade foi utilizado o teste do LCE. O aparato LCE tem

forma de cruz composta de dois braços abertos (50 x 10 cm) com 1 cm de

altura e dois braços fechados (50 x 10 x 15 cm), ambos opostos, interligados

por uma plataforma central de 10 x 10 cm, a uma altura de 70 cm do chão

(Figura 21).

Os animais foram tratados com o composto D4 na dose de 10 mg/Kg,

i.p., controle negativo com salina (10 mL/Kg, i.p.) e positivo com diazepam

(DZP) (0,75 mg/Kg, i.p.), e colocados sobre a plataforma central voltados com a cabeça para um dos braços fechados, após 30 minutos. O comportamento de

cada animal foi observado por 5 minutos e foram registrados a frequência de

entradas nos braços abertos e fechados, bem como o tempo gasto para

exploração desses braços (HOLZMANN et al., 2011).

91

Figura 21. Foto ilustrativa do aparato do labirinto em cruz elevado (Plus-maze).

Fonte: CRYAN; HOLMES, 2005 e REDISH, 2016.

4.2.9 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através do teste da

indução do sono por barbitúricos (MSB)

Para avaliar a atividade hipnótica do composto D4, os animais foram

avaliados no teste MSB. Os animais foram tratados com D4 na dose de 10

mg/Kg, i.p., controle positivo diazepam (2 mg/Kg, i.p.) e controle negativo

veículo. Decorridos 30 minutos, os mesmos receberam tiopental (30 mg/Kg,

i.p.) e foram colocados individualmente em funis de vidro. Foi cronometrado a latência para o sono e o tempo de sono, o que representa perda e recuperação

do reflexo postural, respectivamente (DEVI et al., 2003).

4.3 Análise do mecanismo de ação do composto D4

4.3.1 Investigação da via GABAérgica sobre o mecanismo de ação da

propriedade anticonvulsivante do composto D4

Com o objetivo de analisar a influência do sistema GABAérgico sobre

o mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4, realizou-se o teste de convulsão induzida por PTZ, com a administração de

92

flumazenil, um antagonista do sítio de ligação dos benzodiazepínicos no

receptor GABAA (MOHAMMADI-KHANAPOSHTANI et al., 2016).

Grupos de animais receberam o flumazenil (2 mg/Kg, i.p.) e controles,

e após 30 minutos os mesmos foram tratados com D4 (10 mg/Kg, i.p.). Decorridos mais 30 minutos, os animais foram avaliados no teste do PTZ,

conforme procedimento descrito anteriormente (item 4.2.4).

4.3.2 Investigação da via glutamatérgica sobre o mecanismo de ação da


Com o objetivo de investigar a influência da via

glutamatérgica/sistema NMDA sobre o mecanismo de ação do composto D4, os

experimentos foram conduzidos conforme descrito por Mohseni et al., (2016).

Diferentes grupos de animais foram tratados com ketamina (0,5 mg/Kg, i.p.), um antagonista não-competitivo dos receptores glutamatérgicos do tipo

NMDA, e decorridos 30 minutos, receberam o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e

controles. Após mais 30 minutos, esses animais foram submetidos ao teste do

PTZ conforme descrito no anteriormente (item 4.2.4).

4.3.3 Investigação da via oxidonitrérgica sobre o mecanismo de ação da


Com o intuito de avaliar a influência da via oxidonitrérgica sobre o

mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4 os procedimentos experimentais foram conduzidos confome descrito por Mohseni

et al., (2016). Diferentes grupos de animais foram tratados com L-arginina,

precursor do NO (60 mg/Kg, i.p.), L-NAME, um análogo da L-arginina

inibidor não-seletivo da NOS (10 mg/Kg, i.p.), e 7-NI, um inibidor seletivo da

NOS (40 mg/Kg, i.p.) e, após 30 minutos foram tratados com D4 (10 mg/Kg,

i.p.) e controles. Decorridos mais 30 minutos, os animais foram avaliados no

teste do PTZ conforme descrito anteriormente (item 4.2.4).

4.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4

Os animais foram tratados por 21 dias consecutivos com o composto em estudo D4 (10 mg/Kg, i.p.), fenobarbital, agonista GABAA utilizado como

controle positivo (50 mg/Kg, i.p.) e salina como controle negativo (10 mg/Kg,

i.p.). Foi realizado controle de peso dos animais a cada 3 dias. Ao final dos

tratamentos, os animais foram eutanasiados através do método da guilhotina

93

para a coleta de sangue a fim de realizar análises bioquímicas do plasma e para

a retirada do cérebro, rins, fígado e coração, a fim de realizar análises

toxicológicas, ambas descritas abaixo.



Animais tratados (n = 8, por grupo) com o composto em estudo D4 (10

mg/Kg, i.p.), fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) e controle negativo com veículo (10

mg/Kg, i.p.) foram submetidos ao teste do campo aberto no 21º dia do

experimento, conforme proposto por Holzmann e colaboradores (2011),

descrito no item (4.2.6), para a avaliação da atividade locomotora e

comportamento exploratório e comparação com os resultados do teste agudo.


induzida por PTZ

Conforme padronizado por Holzmann e colaboradores (2011), animais

tratados (n = 8, por grupo) com o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.), fenobarbital

(50 mg/Kg, i.p.) e controle negativo com veículo (10 mg/Kg, i.p.) receberam

PTZ (85 mg/Kg, i.p.) (MOEZI et al., 2015), no 21º dia do experimento, para

observação do tempo de latência para a primeira crise convulsiva e número de

óbitos, e comparação com o teste agudo.

4.4.3 Investigação de alterações fisiológicas pelo tratamento com o composto

D4 através de análise laboratorial de plasma

As amostras de plasma foram obtidas através da adição do

anticoagulante heparina, após centrifugação a 2000 rpm por 10 minutos. Foram

encaminhadas ao Laboratório Escola de Análises Clínicas (LEAC) da Univali

para a realização das análises de ureia e creatinina, determinados como

parâmetros renais, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gamma-glutamiltransferase, fosfatase alcalina, bilirrubina total e direta

como parâmetros hepáticos, além de proteínas totais, glicose e

creatinofosfoquinase (ARAÚJO, 2012; SASIDHARAN et al., 2015; SPINELLI

et al., 2014), através do analisador automático de bioquímica Vitalab Flexor E

(VITAL SCIENTIFIC N.V., 2000).

94

4.4.4 Avaliação de parâmetros oxidativos no tecido cerebral

4.4.4.1 Preparação das amostras

Após o tratamento subcrônico por 21 dias consecutivos, os animais foram eutanasiados pelo método da guilhotina, para a coleta das amostras

utilizadas na realização dos testes bioquímicos. Por ser a principal região

cerebral envolvida em distúrbios neuropsiquiátricos, a região límbica (Figura

22) foi utilizada para a realização dos testes, sendo separados córtex e

hipocampo. Fazem parte da região límbica estruturas cerebrais corticais que se

situam em volta do tronco encefálico, na face interna (medial) e inferior dos

hemisférios cerebrais (dentre essas estruturas se destaca o hipocampo, a

amígdala, a substância cinzenta periaquedutal, o hipotálamo) e subcorticais

dentre as quais foram incluídos os bulbos olfatórios. O córtex e o hipocampo

dos animais foram pesados e homogeneizados em tampão fosfato 200 mM (pH

= 6,5) a 4°C (MAIA, 2016; SILVA et al., 2015). Esse homogenato foi utilizado

para a quantificação dos níveis de GSH, LOOH e SOD.

Figura 22. Partes do cérebro de camundongos utilizadas para obtenção das amostras.

Fonte: MAIA, 2016.

4.4.4.2 Quantificação dos níveis de GSH

Através do método de Sedlak e Lindsay (1968) os níveis de GSH

foram determinados. Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 50 μL do

homogenato de cada amostra preparado conforme item (4.4.4.1) e 40 μL de

ácido tricloroacético (ATC) 12%. Foram agitados em vórtex e centrifugados

por 15 minutos a 4.000 rpm (4 °C).

95

Em placa de 96 poços foram adicionados 20 μL do sobrenadante, 280

μL de tampão TRIS 0,4 M (pH 8,9) e 5 μL de solução 3,96 mg/mL de DTNB

(5,5’-ditiobis-2-ácidonitrobenzoico) em metanol.

A leitura espectrofotométrica em 420 nm foi realizada após 15 minutos pelo leitor de microplacas Molecular Devices®, modelo VersaMax. Os

valores individuais foram interpolados numa curva padrão de GSH (0,41 – 3,33

μg) e expressos em μg GSH/g tecido (MARIANO, 2016; SILVA et al., 2015).

4.4.4.3 Determinação de LOOH

Conforme metodologia de Jiang et al. (1991) procedeu-se a

determinação do total de LOOH no tecido cerebral. Em tubos de

microcentrífuga foram adicionados 50 μL de metanol e 50 μL do homogenato,

agitados em vórtex e centrifugados a 20 minutos a 11.000 rpm (4°C) em

ultracentrífuga.

Em placa de 96 poços foram colocados 30 μL do sobrenadante e 170

μL de meio reacional (xilenol laranja, ferro II e hidroxitolueno butilado solubilizados em metanol), incubados por 30 minutos ao abrigo da luz a

temperatura ambiente. Procedeu-se a leitura em espectrofotômetro a 560 nm,

determinando-se a concentração de LOOH para cada 1 mg de tecido. Desta

maneira, os resultados foram apresentados como mmol/mg de tecido

(MARIANO, 2016; SILVA et al., 2015).

4.4.4.4 Determinação da atividade de SOD

A atividade da SOD foi medida de acordo com a metodologia proposta

por Marklund e Marklund (1974) e Gao et al. (1998), baseada na capacidade de

inibição da enzima sobre o processo de autoxidação de pirogalol. Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 40 µL de sobrenadante, 442,5 µL de

solução tampão (Tris HCl-EDTA 200 mM, pH 8,5) e 25 µL pirogalol (1 mM),

e depois misturou-se durante 1 min. A reação foi incubada por 20 minutos à

temperatura ambiente, parada com a adição de 12,5 µL de HCl 1 N. Em placa

de 96 poços foram adicionados 150 μL da reação e a absorbância foi

determinada a 405 nm. A quantidade de SOD que inibiu a oxidação de

pirogalol em 50%, em relação ao controle, foi definida como uma unidade de

atividade de SOD, expressa como U/mg de proteína (SILVA et al., 2015).

96

4.4.4.5 Mensuração da concentração de proteínas

A concentração de proteínas foi mensurada em espectrofotômetro a

590 nm utilizando o reagente de Bradford (AMRESCO®) e albumina bovina (0,012 – 0,100 mg/mL) foi utilizada como curva padrão.

4.4.5 Análises complementares: avaliação do peso em tratamento subcrônico

com o composto D4 e peso dos órgãos isolados

Durante o tratamento subcrônico de 21 dias, foi realizado controle do

desenvolvimento ponderal dos animais (ganho ou perda de peso do animal

durante o período do experimento), a cada 3 dias, para ajuste de dose e

avaliação da variabilidade de peso. Para avaliar possíveis efeitos tóxicos sobre

rins, fígado e coração, após a eutanásia, estes foram coletados e pesados

separadamente.

4.4.6 Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média erro padrão da média (EPM) e os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) de uma

ou duas vias quando aplicável, seguidas pela análise post hoc Tukey e

Bonferroni. Para ensaios como a EI foi utilizado o teste de Kruskal Wallis

seguido pelo teste de Dunns. Para a análise estatística dos resultados do estresse

oxidativo foi utilizado o teste de Dunnett. Os dados foram expressos como

medianas com os intervalos interquativos (25 e 75); diferenças estatisticamente

significantes foram consideradas com p<0,05. Os testes e as figuras foram

gerados pelo programa estatístico GraphPad Prisma® 5.0.

97

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Avaliação química

5.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo: caracterização e identificação

Os resultados obtidos na síntese e na caracterização dos compostos

estão demonstrados na Tabela 2. Considerando a rota reacional de síntese dos

compostos, nas primeiras duas etapas formou-se o BTZDCl, a partir do qual os

derivados foram obtidos em um curto espaço de tempo a temperatura ambiente.

Os compostos foram submetidos ao processo de recristalização com etanol, a fim de se obter maior grau de pureza. Dentre as propriedades físicas utilizadas

pelos químicos como critério básico na determinação do grau de pureza de

substâncias orgânicas, destaca-se o ponto de fusão (p.f.) (DIAS et al., 2014;

ZAYED et al., 2016). Como o p.f. é afetado por impurezas e considerando que

a faixa de fusão das moléculas não ultrapassou 1ºC, pode-se considerar que foi

possível a obtenção de compostos puros (KORMANN, 2013).

Tabela 2. Estrutura, rendimento, R.f. e p.f. dos compostos em estudo.

S1

2

5

NH3

4

O6

O7

8

9

10

14

11

13

12

R15

Substituinte

-R Código

Tempo

(min)#

Rend*

(%) R.f.** p.f.*** (ºC)

NH

SO2

A1 5 74,68 0,71 236,8-237,2

NH

SO2

D1 5 50,10 0,69 248,1-248,8

(CH2)2NH

SO2

D2 5 23,85 0,47 210,2-210,7

(CH2)3NH

SO2

D3 6 55,12 0,67 235,3-235,7

(CH2)4NH

SO2

D4 5 40,40 0,75 198,2-198,8

#Tempo reacional da etapa 3; *Rendimento; **Fator de retenção com eluente hexano: acetato de

etila 1:1; ***Ponto de fusão.


98

Técnicas espectroscópicas como IV, RMN 1H e RMN 13C são

utilizadas para identificar os principais picos característicos da estrutura

química, comparar a similaridade com o seu análogo de referência e/ou avaliar

a pureza de compostos (ZAYED et al., 2016). Estas técnicas foram utilizadas para a confirmação estrutural dos compostos em estudo, onde foi possível a

identificação de todos os picos, deformações e estiramentos correspondentes as

estruturas TZDs, cujos resultados estão demonstrados de forma detalhada em

KORMANN (2013).

5.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico

5.1.2.1 Molinspiration - Análise de Lipinski (Regra dos cinco)

Alguns parâmetros físico-químicos auxiliam na predição da

capacidade do fármaco em atravessar membranas biológicas e, consequentemente, desempenhar suas atividades farmacológicas. A regra de

Lipinski avalia se um determinado composto possui propriedades físico-

químicas adequadas para serem biodisponíveis por v.o. (LIPINSKI et al., 2001;

LIPINSKI, 2004; MIGNANI et al., 2016b).

A tabela 3 mostra os resultados obtidos a partir do software

Molinspiration que calcula os parâmetros de Lipinski e alguns extensores como

a TPSA (≤ 140 Å2) e o número de ligações rotacionais (nRot ≤ 10). De acordo

com os critérios da regra, pode-se observar que nenhum dos compostos violou

os parâmetros propostos, o que significa que os compostos apresentam

capacidade para atravessar membranas biológicas e potencial farmacológico

para administração oral. A MM dos compostos variou entre 360,42 e 416,52 g/mol, faixa

aceitável para a regra dos 5, que considera valor máximo de 500 g/mol

(LIPINSKI et al., 2001). Segundo Matsson e colaboradores (2016) a

permeabilidade celular, absorção e biodisponibilidade são características

essenciais para compostos protótipo e, normalmente, são conseguidas por

fármacos de baixa MM. Teoricamente, o aumento da MM tem sido

correlacionado com a diminuição da solubilidade e da permeabilidade e com o

aumento do efluxo mediado por transportador e toxicidade (MATSSON et al.,

2016).

Os valores de LogP variaram entre 1,95 a 3,14, também obedecendo

a regra estipulada por Lipinski. O aumento da lipofilicidade (representado pelo

LogP) promove o aumento da permeabilidade celular com consequente acúmulo em membranas e tecido adiposo, e risco de toxicidade (MATSSON et

al., 2016). Portanto, valores de LogP menores que 5 indicam boa

permeabilidade aos compostos em estudo.

99

Quanto aos valores de doadores e aceptores de hidrogênio, os

compostos também não violaram as regras. O número de aceptores foi 6 e de

doadores foi 2, para todos os compostos, estando de acordo com os resultados

estabelecidos. Doadores e aceptores de hidrogênio podem promover interações intramoleculares a fim de reduzir a hidrofilicidade e aumentar a

hidrofobicidade, facilitando a permeação da molécula entre as camadas

lipídicas celulares. No sítio alvo, as ligações de H aumentam a seletividade do

fármaco. Portanto, o limite estabelecido por Lipinski prevê que o equilíbrio

entre grupos doadores e aceptores de hidrogênio é fundamental para a potência

e seletividade de um fármaco, pois já que possuem a capacidade de aumentar a

lipofilicidade, podem promover o acúmulo em tecidos gordurosos e causar

toxicidade (ALEX et al., 2011). Além disso, a redução de doadores e aceptores

de H+ é uma estratégia de sucesso para otimizar a atividade de fármacos no

SNC. Assim, pode-se sugerir que os compostos em estudo são suficientemente

hidrofóbicos para atravessar as bicamadas lipídicas e interagir com seus sítios

alvo. O número de ligações rotacionais variou entre 4 e 8, e prevê boa

flexibilidade e conformação dos compostos em estudo. As moléculas são

capazes de modificar sua conformação para a interação com seus receptores.

Ligantes mais flexíveis, ou seja, que apresentam conformações mais acessíveis,

ligam-se mais facilmente a uma variedade maior de receptores, estando,

portanto, relacionada com eficácia clínica. Quando há o extrapolamento (nRot

>10) pode também ser associada a toxicidade (HE; LEE, 2015).

A área de superfície polar (TPSA) está intimamente relacionada com a

capacidade de formar ligações de hidrogênio e facilitar o transporte entre

membranas. A limitação da TPSA abaixo de 140 Å2 como nos resultados

obtidos, onde valores de TPSA foram 96,10 Å2, aumenta a probabilidade de uma boa absorção oral (ALEX et al., 2011).

Dados do fenobarbital, fármaco anticonvulsivante utilizado no

tratamento da epilepsia e como controle dos experimentos, mostram que não há

violações dos parâmetros da regra de Lipinski, assim como os compostos

TZDs. Os valores dos parâmetros de extensão também se mostram dentro dos

limites considerados para boa permeabilidade celular e absorção oral. Esta

comparação entre fármacos de referência e compostos em desenvolvimento

demonstra, que, teoricamente, os compostos sintetizados seriam capazes de

permear membranas biológicas para interagir com seus receptores alvo.

100

Tabela 3. Parâmetros de Lipinski e extensão da regra dos 5 dos compostos tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software Molinspiration.

Parâmetros de Lipinski Extensão

LogP MM ∑N+O ∑NH+OH Viol nRot Vol TPSA

A1 2,25 360,42 6 2 0 4 284,36 96,10

D1 1,95 374,44 6 2 0 5 301,16 96,10

D2 2,35 388,47 6 2 0 6 317,96 96,10

D3 2,87 402,50 6 2 0 7 334,76 96,10

D4 3,14 416,52 6 2 0 8 351,57 96,10

Fnb 0,80 232,24 5 2 0 2 204,82 75,27 Legenda: LogP: valores de coeficiente de partição octanol/água; MM: massa molecular (g/mol);

∑N+O: número de aceptores de hidrogênio; ∑NH+OH: número de doadores de hidrogênio; Viol:

violações; nRot: número de ligações rotacionais; Vol: volume (mm3); TPSA: área de superfície

polar (Å2); Fnb: Fenobarbital.

5.1.2.2 OSIRIS

Como na metodologia, os cálculos de druglikeness, drugscore, LogS e

parâmetros de toxicidade como mutagenicidade, carcinogenicidade, irritação e

efeitos sobre o sistema reprodutor foram obtidos a partir da ferramenta OSIRIS,

através das estruturas dos composos analisados.

A tabela 4 mostra os resultados calculados para os parâmetros de

druglikeness, drugscore e LogS. Observa-se que todos os compostos em estudo

apresentaram para druglikeness valores positivos, o que indica que apresentam

fragmentos de fármacos conhecidos em suas estruturas. Em relação ao drugscore, os valores calculados também foram todos positivos, o que indica

que os compostos estudados apresentam em sua estrutura grupos

farmacofóricos, facilitando o reconhecimento fármaco-receptor e atividade

biológica (HASSAN et al., 2015; NUNES, 2016).

A solubilidade aquosa de compostos pode afetar significativamente a

capacidade de absorção e distribuição no meio biológico. Em geral, é

necessário que os compostos tenham um equilíbrio entre solubilidade e

lipofilicidade para que estes sejam suficientemente permeáveis a membrana.

Um parâmetro de avaliação da solubilidade é o LogS, cujo valor desejável é

maior que -4 mol/L (NUNES, 2016). Segundo Nunes (2016), mais de 80% dos

medicamentos comercializados no mercado farmacêutico apresentam valores

superiores ao estimado. Os valores de LogS calculados pelo software foram todos menores que -4 mol/L e são mostrados na tabela 13. Para o parâmetro de

LogS os compostos não demonstraram valores como o estimado, mas de acordo

com alguns autores nem todos os medicamentos disponíveis se enquadram na

regra estabelecida (NUNES, 2016; RITCHIE; MACDONALD, 2014).

101

Tabela 4. Valores de druglikeness, drugscore e LogS dos compostos tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software OSIRIS.

Composto Druglikeness Drugscore LogS (mol/L)

A1 4,72 0,73 -4,48

D1 5,09 0,76 -4,03

D2 5,63 0,73 -4,14

D3 4,51 0,68 -4,41

D4 1,22 0,56 -4,68

Fnb 9,60 0,20 -2,80 Legenda: Fnb – Fenobarbital.

Parâmetros toxicológicos também foram calculados pelo programa

OSIRIS. Substâncias químicas podem induzir danos no material genético,

contribuindo para os processos de mutagênese e carcinogênese (OSIRIS, 2017;

ZANONI, 2014). Uma substância é considerada mutagênica quando favorece a transmissão de danos no DNA de uma célula mãe a uma célula filha e pode dar

origem a diversas outras doenças hereditárias humanas. Quando há danos no

material genético o ciclo celular pode ser bloqueado, levando ao processo de

envelhecimento e apoptose celular. Portanto, o processo mutagênico quando

instalado e permanente, pode levar ao processo de carcinogênese (ZANONI,

2014).

A tabela 4 mostra os resultados dos parâmetros toxicológicos

preestabelecidos pelo software. Observa-se que todos os compostos TZDs

estudados neste trabalho não apresentaram perfil tóxico. Em relação ao

fenobarbital, que apresenta risco alto de toxicidade ao sistema reprodutor,

mutagenicidade e carcinogenicidade, percebe-se que, mesmo fármacos já comercializados e utilizados na clínica para o tratamento de doenças do SNC,

como a epilepsia, não se enquadram em todos os limites desejáveis de análise.

Embora os compostos tenham apresentado ótimo perfil, vale ressaltar que a

ausência de alerta de riscos não garante que estas substâncias estejam livres

destes efeitos (NUNES, 2016).

102

Quadro 4. Parâmetros toxicológicos dos compostos tiazolidinodiônicos calculados pelo software OSIRIS.

Composto

Parâmetros

Mutagênico Carcinogênico Irritante Sistema

Reprodutor

A1

D1

D2

D3

D4

Fenobarbital

Legenda:

Sem toxicidade

Média toxicidade

Alta toxicidade

5.1.2.3 PreADMET

O processo de absorção é imprescindível para a potência

farmacológica das substâncias (KOVAČEVIĆ et al., 2014; TRIFUNOVIĆ et

al., 2016). A absorção intestinal humana (AIH) é um dos principais

mecanismos da passagem entre as membranas e foi predito pelo programa PreADMET. Conforme descrito na metodologia, para a avaliação de AIH são

considerados: 0 a 20% baixa absorção, 20 a 70% absorção moderada e 70 a

100% alta absorção (HOU et al., 2007; NUNES, 2016). Os compostos TZDs

investigados apresentaram valores superiores a 90% (Tabela 5), indicando a

probabilidade de uma boa absorção intestinal (TRIFUNOVIĆ et al., 2016),

inclusive superior ao fármaco fenobarbital, cujo valor estimado foi de 89,42%.

Os valores obtidos estão de acordo com os valores de TPSA preditos pela

extensão da regra de Lipinski (Tabela 3), pois, para fármacos com boa

permeabilidade oral, baixos valores de TPSA são necessários, além de ligações

rotacionais abaixo de 10 que melhoram a flexibilidade molecular (HASSAN et

al., 2015). Estes dados também corroboram com os dados já obtidos na tabela

6, que indicam uma boa permeabilidade celular e absorção oral. A BHE representa uma superfície que controla a troca de compostos

entre o sangue e o cérebro, dificultando a entrada de compostos hidrofílicos

pelas células endoteliais e capilares cerebrais (TRIFUNOVIĆ et al., 2016). Para

compostos que devem atuar no SNC, a penetração por esta barreira é crucial

(KOVAČEVIĆ et al., 2014). A permeação pela BHE de fármacos foi predita

103

também pelo programa PreADMET. Valores positivos descrevem a possível

passagem pela barreira, enquanto que valores negativos indicam a incapacidade

do composto de acender ao cérebro. A tabela 5 mostra os valores da predição

farmacocinética para BHE. Todos os compostos apresentaram valores positivos, indicando que possuem capacidade para permeação pela BHE, sendo

que os compostos D3 e D4 foram os que mais se aproximaram do fármaco

fenobarbital.

O programa PreADMET também prediz resultados para

mutagenicidade e carcinogenicidade, como a ferramenta OSIRIS. Observa-se

que os resultados não são equivalentes para ambos os programas. Pelo OSIRIS,

os compostos TZDs não apresentaram perfil tóxico, enquanto que o

fenobarbital se mostrou tóxico ao sistema reprodutor, mutagênico e

carcinogênico. Pelo software PreADMET, todos os compostos investigados por

este trabalho se mostraram mutagênicos, carcionogênicos em camundongos e

sem risco de carcinogenicidade em ratos; ao passo que o fármaco fenobarbital

também foi mutagênico e carcinogênico. Deste modo, são necessárias investigações mais detalhadas para determinar a real toxicidade dos compostos.

Tabela 5. Parâmetros farmacocinéticos (ADMET) dos compostos tiazolidinodiônicos calculados pelo software PreADMET.

5.1.2.4 Descritores físico-químicos e farmacocinéticos utilizados na predição

da permeabilidade no SNC dos compostos TZDs

Assim como para permeabilidade oral, a predição in sílico é fundamental para auxiliar cientistas na seleção de compostos com potencial

ação no SNC, após a determinação teórica de propriedades físico-químicas e

farmacocinéticas, também em programas computacionais online baseados em

perfis de fármacos comerciais (ZHANG et al., 2016). Como descrito no item

3.5.2, os descritores moleculares que podem afetar a permeação no cérebro

incluem LogP, MM, TPSA, doadores e aceptores de ligações de hidrogênio,

Parâmetros A1 D1 D2 D3 D4 Fnb

AIH (%) 95,22 95,39 95,39 95,37 95,35 89,42

BHE 0,21 0,23 0,34 0,45 0,42 0,50

TA M M M M M M

PC +C/-R +C/-R +C/-R +C/-R +C/-R + Legenda: AIH - absorção no intestino humano (%); BHE - penetração na barreira

hematoencefálica in vivo (concentração cérebro/concentração sangue); TA - Teste de Ames (M =

mutagênico / --- = não mutagênico); PC - potencial carcinogênico em camundongosC ou ratosR (+

= positivo/ - = negativo); Fnb - Fenobarbital.

104

ligações rotacionais, ligação a proteínas plasmáticas e LogD (GELDENHUYS

et al., 2015; GOLANI; GOLANI, 2015; ZHANG et al., 2016).

Como na regra de Lipinski e extensão de seus parâmetros (ver tabela

6), a lipofilicidade, mencionada pelo LogP, é considerada como parâmetro para permeabilidade no SNC. Neste caso, segundo Lipinski (2004), se LogP é

positivo, então o composto pode ser ativo no SNC. Os valores também se

enquadram nos valores recomendados para fármacos do SNC, que são entre 1-4

de acordo com Eigenmann et al. (2016). Quanto à MM, os resultados obtidos

também se enquadram nos valores estabelecidos para fármacos que atuam no

SNC, onde é considerado o valor de até 450 g/mol para boa permeabilidade

pela BHE, de acordo com os autores Clark (2003) e Pajouhesh e Lenz (2005).

Mensch e colaboradores (2009) identificaram como descritores de

forte influência o número de doadores e aceptores de hidrogênio, além do

TPSA, assim como Geldenhuys et al. (2015). De acordo com estudos

científicos da literatura, valores de TPSA até 90 Å2 indicam a probabilidade de

penetração pela BHE (CLARK, 2003; PAJOUHESH; LENZ, 2005). Em 2002, Mahar Doan e colaboradores realizaram experimentos bioquímicos e

computacionais de 48 fármacos para o SNC e 45 para outros fins terapêuticos.

Nestes estudos, os pesquisadores observaram que os valores de TPSA para os

compostos do SNC podem variar entre 4,63 e 108 Å2. O valor de TPSA de

todos os compostos testados foi de 96,10 Å2, indicando boa permeabilidade

celular oral e, por apresentarem valores muito próximos a 90 Å2, e estarem na

faixa estipulada por Mahar Doan et al. (2002), indicam capacidade para

penetração na BHE. Zhang et al. (2016) também analisaram 54 fármacos

comerciais do SNC em ratos e verificaram que a maioria dos compostos tinha

TPSA <100. Segundo Geldenhuys et al. (2015) e Mensch e colaboradores

(2009), espera-se que um composto seja rapidamente permeável ao SNC se possuírem <3 doadores de H e <7 aceptores. Estes valores também corroboram

com resultados obtidos pela predição computacional dos compostos, no qual o

resultado foi 2 e 6, respectivamente. No mesmo estudo de Zhang et al. (2016), a

maioria dos 54 fármacos comerciais do SNC apresentaram número de aceptores

de hidrogênio entre 1 e 6. Ainda, Segundo Pajouhesh e Lenz (2005), o valor

máximo de 8 ligações rotacionais deve ser considerado para fármacos com ação

central, no qual a predição dos compostos também se encaixa, enfatizando a

probabilidade de atuar no SNC.

Como mencionado anteriormente, a lipofilicidade é questão

fundamental na absorção de fármacos e permeabilidade pela BHE. Muitos dos

fármacos são ácidos ou básicos, e dependendo do pH, se apresentam

fisiologicamente na forma ionizada. Para isto, outro parâmetro pode ser considerado como indicativo de boa permeabilidade. O LogD é utilizado para

descrever o logarítmo do coeficiente de distribuição de um fármaco ionizável,

ou seja, é o LogP em determinado pH. Normalmente o pH considerado para

105

permeabilidade de fármacos para o SNC é 7,4 (ALLEN-JR, 2016). Para uma

melhor permeação do cérebro e para uma boa permeabilidade intestinal, os

valores de LogD têm de ser maiores do que 0 e inferiores a 3 (CLARK, 2003;

PAJOUHESH; LENZ, 2005). Os valores de LogD foram obtidos a partir do programa PreADMET, e variaram entre 2,54 e 3,58, conforme Tabela 6. Os

resultados obtidos para os compostos A1, D1 e D2 se mostraram dentro do valor

estimado por Clark (2003) e Pajouhesh; Lenz (2005). Os compostos D3 e D4

apresentaram valores superiores a 3, mas de acordo com o estudo realizado por

Mahar Doan et al. (2002), a faixa para a penetração pela BHE de compostos do

SNC encontrada foi -1,34 e 6,57 (ver tabela 1), portanto, estes cálculos

teóricos, podem indicar que os compostos possuam capacidade para atravessar

a BHE.

Outros fatores que influenciam a permeabilidade são a ligação à

proteínas plasmáticas e seu metabolismo. Fármacos que atuam no SNC

normalmente ligam-se à albumina do plasma e à glicoproteína P. Conforme

descrito na revisão da literatura, os fármacos SNC não devem sofrer inibição da glicoproteína-P e não ser um bom ligante de albumina sérica, pois pode haver a

redução de fármaco disponível para a atividade farmacológica (GOLANI;

GOLANI, 2015; PAJOUHESH; LENZ, 2005). Os resultados, também

calculados pelo software PreADMET, estão descritos na tabela 6. Percebe-se

que os resultados de inibição da glicoproteína P corroboram com o descrito na

literatura, mas a ligação dos compostos à albumina é elevada, o que pode

implicar na redução do seu potencial. Nota-se também, que dentre os

compostos estudados, o que apresentou menor valor em relação a este

parâmetro foi o composto D4, que corrobora com os resultados observados nos

testes in vivo.

Alguns parâmetros ADME, incluindo avaliações do citocromo P, podem ser realizadas em testes de triagem. As CYP constituem a família mais

importante de enzimas de biotransformação envolvidas no metabolismo de

fármacos, e possuem função importante na disposição dos fármacos e nos seus

efeitos. As isoformas mais conhecidas são CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6,

CYP1A2 e CYP2C19. Para boa absorção oral, um fármaco voltado ao SNC

bem sucedido não deve ter metabolismo CYP2D6 significativo e ser um indutor

não potencial de CYP3A4 (GOLANI; GOLANI, 2015; PAJOUHESH; LENZ,

2005). Os resultados demonstrados na tabela 6, corroboram com os dados

descritos na literatura, pois os compostos não apresentam metabolismo via

CYP2D6 e não são indutores da enzima CYP3A4, de acordo com resultados

computacionais teóricos, indicando possível permeação oral e pela BHE.

106

Tabela 6. Parâmetros farmacocinéticos considerados para boa permeabilidade

no sistema nervoso central.

LogD Indução

CYP3A4

Metabolismo

CYP2D6

Ligação à

albumina (%)

Inibição

glicoproteína-P

Valor

estimado* 0 – 3 FRACA NÃO BAIXA NÃO

A1 2,54 NÃO NÃO 98,69 NÃO

D1 2,52 NÃO NÃO 100 NÃO

D2 2,67 FRACA NÃO 100 NÃO

D3 3,13 FRACA NÃO 96,39 NÃO

D4 3,58 FRACA NÃO 95,97 NÃO

Legenda: LogD: coeficiente de distribuição.

*Valores estimados por autores citados no texto.

A partir da avaliação in sílico, pode-se perceber a importância da

utilização das ferramentas computacionais na compreensão das características

físico-químicas e farmacológicas no desenvolvimento de novas substâncias

candidatas a fármacos (MIGNANI et al., 2016a; RITCHIE; MACDONALD,

2014), e que os resultados aqui apresentados demonstram a possibilidade das

moléculas em estudo atuarem no SNC.

5.2 Atividade anticonvulsivante

Os derivados TZDs sintetizados foram estudados inicialmente em

parceria com as acadêmicas do Curso de Farmácia, Cristiani Vanessa Ternus e

Maria Tereza Dalla Vecchia, para a avaliação da possível atividade

anticonvulsivante, considerando que compostos contendo o núcleo TZD

demonstraram resultados importantes e promissores contra CEs (KORMANN,

2013; SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016).


induzida por pentilenotetrazol e estricnina

O PTZ (6,7,8,9-tetrahidro-5H-tetrazol-[1,5-a]azepina) (Figura 23), utilizado inicialmente na década de 1920 (OFFORD; ISOM, 2016), é um dos

principais indutores de crises convulsivas agudas ou crônicas, utilizados em

testes experimentais de epilepsia. Trata-se de um farmacóforo que contém em

sua estrutura um anel tetrazol, altamente eficaz, encontrado em diversos

compostos farmacêuticos no mercado. Além da atividade convulsiva, derivados

107

tetrazólicos possuem atividades biológicas como atividades hipotensivas,

antimicrobianas, citostáticas e outras. A introdução de um anel tetrazol em uma

molécula conduz a estruturas mais eficazes, com um aumento no

prolongamento da ação destes fármacos. O PTZ é constituído por um anel tetrazol condensado a um anel de 7 membros, capaz de formar ligações

intermoleculares de hidrogênio com seus sítios ativos (OSTROVSKII;

TRIFONOV; POPOVA, 2012).

A ação convulsiva do PTZ se dá por sua capacidade de reduzir a

atividade inibitória dos receptores GABAA no SNC. O antagonismo destes

receptores dá origem a crises generalizadas do tipo ausência ou mioclônicas e

crises tônico-clônicas, de aproximadamente 5 minutos com rigidez de cauda,

extensão corporal e morte (HAHN; BURRELL, 2015; KUMAR; LALITHA;

MISHRA, 2014; KUMAR et al., 2016).

Figura 23. Estrutura química do pentilenotetrazol (PTZ).

6

10

7

9

8

N1

5

N4

N3

N2

Fonte: OSTROVSKII; TRIFONOV; POPOVA, 2012.

No teste de convulsão induzida por PTZ através da administração via

i.p., o composto D4 aumentou a latência para as crises de maneira

estatisticamente significativa (p<0,001) quando comparado ao controle

negativo (Figura 24). A porcentagem de latência para a crise foi de 51,98% em

relação ao controle, mas o tratamento com o composto D4 não protegeu os

animais contra a letalidade, uma vez que os animais não sobreviveram às crises

induzidas por PTZ. Assim como o tratamento com D4, os animais submetidos

ao tratamento com gabapentina tiveram um aumento de 44,06% (p<0,05) na latência para as crises, embora também não foram protegidos contra a

letalidade.

108

Figura 24. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.), da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por pentilenotetrazol.

C Gabap. Fnb. A1 D1 D2 D3 D4

0

100

200

300

400

***

***

*

Tratamentos (10 mg/Kg, i.p.)

PTZ (85 mg/Kg, i.p.)

La

tên

cia

pa

ra

cri

ses

(s)

Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média do tempo

de latência para crises (s) de 8 a 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância

estatística quando comparados ao grupo controle (salina) (C) (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Os

dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de

Tukey. Siglas: C – controle, Gabap. – Gabapentina, Fnb – Fenobarbital, PTZ – Pentilenotetrazol.

A gabapentina é um fármaco análogo estrutural do GABA (Figura 23),

ou seja, mimetiza a estrutura GABAérgica (OFFORD; ISOM, 2016; WANKA;

IQBAL; SCHREINER, 2013). Segundo Wanka, Iqbal e Schreiner (2013),

interage com a subunidade α2-δ dos canais de Ca++ voltagem-dependentes,

reduzindo sua concentração, com consequente modulação da liberação de

neurotransmissores e CEs. Foi desenvolvida com características químicas

lipofílicas para que pudesse atravessar facilmente a BHE e desempenhar seus

efeitos no SNC. A gabapentina tem ação anticonvulsivante em testes

experimentais de convulsão induzida por PTZ e STR e também é ativa em

testes de convulsão induzida por eletrochoque (OFFORD; ISOM, 2016). Diferentemente do tratamento com o composto D4 e com a

gabapentina, o tratamento com o fenobarbital foi capaz de proteger os animais

das crises convulsivas. O fenobarbital, quimicamente chamado de ácido 5-etil-

5-fenilbarbitúrico (Figura 25), é um barbitúrico anticonvulsivante utilizado

comercialmente há mais de 100 anos. Este fármaco reduz a gravidade e o

número de CEs tônico-clônicas, generalizadas e parciais, atuando sobre

receptores GABAA, intensificando a abertura dos canais de Cl- e

109

hiperpolarização neuronal, diminuindo a excitabilidade da célula alvo

(STABILE; BARNETT, 2017).

Figura 25. Estrutura química do ácido gama-aminobutírico (GABA), da gabapentina e do fenobarbital.

NH2

OH

ONH2

OH

O

GABA Gabapentina

NH

NH

O

O

O CH3

Fenobarbital

Fonte: NCBI, 2016; OFFORD; ISOM, 2016.

Os resultados descritos acima corroboram com os resultados

demonstrados na literatura, pela qual observa-se uma gama de estudos que

comprovam o uso eficaz das TZDs em testes de indução química de

convulsões. Shyam, Debnath e Devbhuti (2016) fizeram uma revisão da

literatura e demonstram que uma série de derivados TZDs apresentam potencial

anticonvulsivante, inclusive alguns compostos possuem atividade superior à da

fenitoína. Patil et al. (2015) afirmou que os compostos TZDs testados exibiram

proteção contra as CEs induzidas por PTZ em até 80%. Payandemehr e

colaboradores (2015) estudaram um canabinóide sintético conhecido como

mesilato Win 55, 212-2, que possivelmente medeia as atividades dos receptores

PPARs envolvidas em funções do SNC. Assim como as TZDs, o “Win” apresenta atividade agonista PPARs e, portanto, apresentou aumento

significativo do limiar convulsivo de animais submetidos ao teste do PTZ.

Estes mesmos autores, Moezi et al. (2015), Ranade (2013) e Wong et al.

(2015), afirmaram que também há o aumento do limiar convulsivo através da

redução da hiperexcitabilidade neuronal pela administração de pioglitazona e

rosiglitazona, fármacos pertencentes a classe das TZDs, também agonistas

PPARs, que eram utilizados por sua ação hipoglicemiante.

Outro indutor de convulsão utilizado neste estudo foi a STR, um

alcaloide natural de núcleo indólico monoterpênico, obtido a partir das

sementes secas de Strychnos nux-vomicaum. A STR, utilizada também em testes animais de epilepsia, é um indutor de crises convulsivas intensas,

caracterizadas apenas por extensões tônicas, capaz de reduzir a atividade

inibitória do SNC pelo antagonismo de receptores de glicina (SOLIMAN et al.,

2016).

110

Neste teste, os compostos D1, D2, D3 e D4, quando administrados via

i.p. na dose de 10 mg/Kg, produziram um aumento da latência da crise

convulsiva induzida pela STR, de forma estatisticamente significativa (p<0,01;

p<0,001; p<0,05; p<0,01), quando comparados com o grupo controle (salina) (Figura 26). A porcentagem de latência calculada para as crises convulsivas foi

de 49,59% para D1, 54,81% para D2, 47,07% para D3 e 51,67% para D4, em

relação ao controle. A porcentagem de latência calculada para os compostos em

estudo foi muito próxima as porcentagens de latência obtidas pela

administração da gabapentina, que foi 50,98% (p<0,01) e pela administração de

fenobarbital, que foi 48,26% (p<0,05) em relação ao grupo controle.

Assim como nos testes de convulsão induzida por PTZ, observa-se na

literatura estudos que apontam o uso eficaz das TZDs em testes de indução

química por STR. O resultado obtido neste estudo corrobora com os resultados

demonstrados na literatura, pela qual Wong et al. (2015) indicam a supressão

das descargas epileptiformes e a inibição significativa da liberação pré-

sináptica do neurotransmissor glutamatérgico, mediada pela ativação de receptores PPARs através da administração da rosiglitazona.

Figura 26. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.), da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por estricnina.

C Gabap. Fnb. A1 D1 D2 D3 D4

0

50

100

150

200

***

********


STR (4 mg/Kg, i.p.)

Latê

nci

a p

ara c

rise

s (s

)


de latência para crises (s) de 8 a 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância

estatística quando comparados ao grupo controle (salina) (C) (p*<0,05; **p<0,01). Os dados foram

submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C –

controle, Gabap. – Gabapentina, Fnb – Fenobarbital, STR – Estricnina.

111

5.2.2 Avaliação do efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo no teste

de convulsão induzida eletricamente

O teste de ECM foi desenvolvido para avaliar a eficácia

anticonvulsivante de compostos químicos em 1946, por Merritt e Putnam. A

partir de uma corrente elétrica administrada na cavidade auricular dos animais,

há a indução das CEs caracterizadas por extensão tônica das patas traseiras

(TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016; YACUBIAN, 2014). O teste de indução

elétrica é utilizado em testes experimentais para mimetizar CEs generalizadas

do tipo tônico-clônicas. O teste também é requerido junto aos órgãos de

aprovação de fármacos como antiepilépticos (JACKSON et al., 2016).

A incidência de crises foi reduzida em 70, 15, 55 e 65% em animais

tratados com carbamazepina, A1, D1 e D4, respectivamente, quando comparados

ao grupo controle. Grupos tratados com os compostos D2 e D3 tiveram 100% de

crises (Figura 27A). Foi observada diminuição significativa da duração da extensão tônica do membro posterior dos animais pelos tratamentos com

carbamazepina (p<0,001), compostos A1 (p<0,05), D1 (p<0,01) e D4

(p<0,0001), com porcentagens de 45,22, 34,78, 42,61 e 53,04%,

respectivamente, também em relação ao grupo controle (Figura 27B).

Segundo Vengurlekar, Sharma e Trivedi (2012), assim como nos testes

de indução química de convulsões, as TZDs apresentam efeito

anticonvulsivante em testes de indução elétrica de convulsões. Nos resultados

descritos acima, observou-se que a administração do composto D4 aumentou o

limiar convulsivo dos animais, corroborando com os dados encontrados na

literatura, na qual o estímulo elétrico é utilizado como indutor da crise

convulsiva.

112

Figura 27. Efeito dos compostos A1, D1, D2, D3 e D4 (10 mg/Kg, i.p.) e da carbamazepina (20 mg/Kg, i.p.) sobre a porcentagem de crise (A) e duração da extensão clônica dos membros posteriores dos animais (B) submetidos ao teste de convulsão ECM.

(A)

C Carb. A1 D1 D2 D3 D4

0

50

100

150% de crises

% de inibição das crises


Cri

ses

(%)

(B)

C Carb. A1 D1 D2 D3 D4

0

5

10

15

****

******


Du

raçã

o e

xte

nsã

o

tôn

ica d

o m

emb

ro p

ost

eri

or (

s)

Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média de 10

animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo

controle (salina) (C) (****p<0,0001; ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05). Os dados foram submetidos

à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle,

Carb. – Carbamazepina.

113

5.2.3 Escolha do composto efetivo nos testes de convulsão induzida

quimicamente e eletricamente

Com os resultados descritos acima, a substância D4 foi escolhida para

continuidade dos testes, pois foi o único composto que apresentou efeito

anticonvulsivante nos testes de indução química por PTZ e STR, e elétrica.

Assim, foram realizados testes de indução química por PTZ pela administração

do composto D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg, i.p., para avaliação do efeito

dose-resposta. Conforme demonstrado na figura 28, não houve efeito contra a

epileptogênese na dose de 3 mg/Kg, i.p., mas houve um aumento significativo

do limiar convulsivo nas doses de 10 (p<0,01) e 30 (p<0,001) mg/Kg, i.p., em

comparação com o controle. O limiar das crises aumentou em 40,49% para 10

mg/Kg, i.p., e 51,22% para 30 mg/Kg, i.p. Embora houve aumento da resposta

na dose de 30 mg/Kg, i.p., não houve diferença significativa entre as doses,

somente em relação ao veículo (salina). Desta forma, a dose de 10 mg/Kg, i.p. foi a escolhida para o prosseguimento dos experimentos com administração do

composto pela via i.p.

Figura 28. Efeito do composto D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg, i.p., sobre a latência da crise convulsiva no teste de convulsão induzida por PTZ.

C 3 10 300

80

160

**

***

D4 (mg/Kg, i.p.)


Latê

nci

a p

ara

cri

ses

(s)


de latência (s) para crises de 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística

quando comparados ao grupo controle (salina) (C) (**p<0,01; ***p<0,001). Os dados foram

submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C –

controle, PTZ – Pentilenotetrazol.

114

5.2.4 Avaliação do efeito anticonvulsivante do composto D4 no teste de

convulsão induzida quimicamente por pentilenotetrazol administrado por via

oral

Conforme descrito no item 4.2.4, a atividade anticonvulsivante do

composto D4 foi avaliada também pela administração por v.o., a fim de

verificar se o composto é absorvido pelo trato gastrointestinal. De acordo com

os resultados das análises in sílico realizadas e descritas anteriormente, a figura

29 demonstra que o composto D4 é capaz de atravessar as membranas lipídicas

intestinais e atuar em seu sítio alvo. O limiar convulsivo dos animais tratados

com o composto D4 (100 mg/Kg, v.o.) aumentou em 24,31% em relação ao

grupo dos animais tratados somente com veículo (salina). O fenobarbital,

utilizado como controle positivo neste experimento, foi capaz de proteger os

animais das CEs, uma vez que estes não apresentaram CEs dentro de 24 horas. Os resultados foram apresentados com tempo máximo de 180 segundos para

melhor visualização.

Os resultados obtidos neste estudo corroboram com dados descritos na

literatura, já que os compostos que atuam em receptores PPARs demonstram

atividade farmacológica através de administração v.o. em experimentos

científicos publicados. A pioglitazona foi testada por Barbiero et al. (2014) e

Lalouxa e colaboradores (2012) no desenvolvimento de terapias

neuroprotetoras para a doença de Alzheimer. Os autores observaram atividade

neuroprotetora após a administração por gavagem, reforçando a possibilidade

de boa permeabilidade deste composto pelas membranas biológicas e sua

utilização oral.

115

Figura 29. Efeito anticonvulsivante do composto D4 (100 mg/Kg, v.o.) e do fenobarbital (100 mg/Kg, v.o.) no teste de convulsão induzida por pentilenotetrazol.

C D4 Fenobarbital0

50

100

150

200

**

***

###


100 mg/Kg, v.o.

La

tên

cia

pa

ra c

rise

(s)


de latência para crises (s) de 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística

quando comparados ao grupo controle (C) (salina) (**p<0,01; ***p<0,001). Sustenidos denotam

significância estatística quando comparados ao grupo D4 (###p<0.001). Os dados foram submetidos

à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle,

PTZ – Pentilenotetrazol.


comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field).

O teste conhecido como CA permite a avaliação de comportamentos emocionais, exploração de novos ambientes e atividade locomotora dos

animais. Segundo Bailey e Crawley (2009), o teste fornece também subsídios

comportamentais para a avaliação de parâmetros relacionados a ansiedade, que

pode ser influenciada por fatores como o isolamento social resultante da

separação física do animal e seus companheiros durante o teste, e o estresse

criado pelo novo ambiente, iluminado e desprotegido (BAILEY; CRAWLEY,

2009; HOLZMANN et al., 2011; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).

Naturalmente, os roedores possuem preferência por áreas protegidas,

explorando, por um período significativamente maior, a periferia da arena,

geralmente em contato com as paredes. Os roedores que permanecem mais

tempo explorando áreas centrais desprotegidas apresentam comportamento

ansioso (BAILEY; CRAWLEY, 2009; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016). Neste contexto, avaliam-se variáveis como números de cruzamentos (crossings)

e atividade exploratória (rearings).

116

A avaliação dos efeitos do composto D4 em animais submetidos ao CA

mostrou que não houve influência significativa sobre a atividade motora dos

animais, já que os números de crossings e rearings entre tratamento e controle

permaneceram semelhantes (Tabela 7). O efeito do composto D4 sobre os parâmetros comportamentais dos

animais obtidos neste estudo estão de acordo com os resultados obtidos em

estudos científicos. Park et al. (2007) realizou uma pesquisa na qual comprovou

que o tratamento com agonistas PPARs, como a rosiglitazona e pioglitazona,

melhoram a função motora. Salehi-Sadaghiani et al. (2012) estudou compostos

TZDs e observou uma redução significativa no tempo de imobilidade sem

alterações significativas no comportamento locomotor dos animais tratados.

Assim como os dados destes estudos, os autores Shahsavarian et al. (2014) e

Pérez e Quintanill (2015) também reforçaram que a administração de derivados

TZDs não altera a atividade locomotora.

Tabela 7. Efeitos do composto D4 avaliados no teste do Open Field.

Tratamento Latência do

movimento (s)

Comportamento

exploratório

(rearing)

Número de

cruzamentos

(crossing)

Controle negativo 4 56 127

D4 3mg/Kg, i.p. 2 53 115

D4 10mg/Kg, i.p. 4 53 121

D4 30mg/Kg, i.p. 3 45 123

Resultados apresentados como média. Cada linha representa 8 animais por grupo. Os dados

foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey.

5.2.4 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através da esquiva

inibitória (EI)

Testes experimentais baseados no aprendizado de tarefas

comportamentais são utilizados para o esclarecimento de mecanismos

envolvidos em processos de memória. Dentre os testes convencionais e

amplamente utilizados, a esquiva inibitória ou esquiva passiva, é um teste de

memória de aprendizagem rápida, que envolve sessões de teste e treino.

Conforme item 4.2.7, o animal aprende que, ao descer de uma plataforma,

recebe um choque, reprimindo a tendência natural dos roedores em explorar o

ambiente além da plataforma (IZQUIERDO; FURINI; MYSKIW, 2016; KÖHLER, 2012). Replicando à humanos, a EI representa uma forma de

memória utilizada para questões de sobrevivência, por exemplo: nós humanos

passamos por um processo de aprendizagem quando colocamos nosso dedo em

117

uma tomada elétrica (IZQUIERDO; FURINI; MYSKIW, 2016; KÖHLER,

2012).

Os processos envolvidos na formação da memória estão bem

estabelecidos na literatura. As vias glutamatérgica e GABAérgica podem estar envolvidas no processo de consolidação de memória. De maneira geral, através

de receptores metabotrópicos e ionotrópicos do tipo NMDA e AMPA, o

neurotransmissor GLU induz ao aumento dos níveis intracelulares de Ca++ com

consequente alterações na morfologia e composição de neurônios envolvidos

no aprendizado. A ativação de receptores NMDA no hipocampo, na amígadala

e em outras áreas cerebrais, regulam processo de plasticidade neural, na fase de

consolidação da memória (FABBRI et al., 2016).

Estudos também indicam que a ativação do sistema GABAérgico, via

receptor GABAA, pode diminuir a consolidação da memória (KÖHLER, 2012).

Descobertas como estas foram fundamentais na elucidação dos efeitos dos

barbitúricos e benzodiazepínicos, que, pela potencialização dos receptores

GABAA, podem dificultar o processo de aprendizagem e memória (FORSAN, 2010; KÖHLER, 2012). A exemplo, o flumazenil, antagonista GABAérgico, é

usado na reversão dos efeitos psicomotores, amnésicos e sedativos adversos dos

benzodiazepínicos (RAUT; BOLEGAVE; MARATHE, 2016).

Compostos hipnóticos e anticonvulsivantes podem exercer efeitos

negativos sobre a memória. Substâncias psicoativas, como os

benzodiazepínicos, classe terapêutica de fármacos utilizados na terapia da

epilepsia, ansiedade e insônia, causam déficits de memória (amnésia

anterógrada) em humanos e em testes animais experimentais (LEÃO et al.,

2016).

Neste contexto, tratamentos com fármacos e compostos químicos em

desenvolvimento podem também afetar o processo de consolidação da memória, portanto, o teste de esquiva inibitória foi escolhido para investigar

possíveis efeitos sobre a memória dos animais tratados com o composto D4.

Após a sessão de treino e a administração de 10 mg/Kg, i.p. da

substância D4, foram avaliados possíveis efeitos sobre a consolidação da

memória de longa duração nos animais. De acordo com a Figura 30, os

resultados demonstraram que o composto não tem efeito negativo sobre a

memória, já que a latência do teste não foi significativamente diferente do

grupo controle.

O tratamento com compostos TZDs mostra uma melhora significativa

na memória de acordo com alguns pesquisadores. Heneka, Fink e Doblhammer

(2015) verificaram que agonistas PPARs melhoram o aprendizado em pacientes

com demência e doença de Alzheimer, e reduzem a formação das placas β-amilóides, responsáveis pela manifestação da doença. Pérez e Quintanill (2015)

relataram que animais tratados com rosiglitazona mostraram uma melhoria

significativa na aprendizagem e na tarefa de memória. Segundo ele, este efeito

118

está relacionado com a regulação da via de sinalização da insulina, que envolve

a redução na expressão de alguns mediadores celulares, e melhora o

comprometimento induzido pelas placas β-amilóides. Em animais os efeitos

nootrópicos de TDZs também é observado. Em nossos laboratórios, análogos das TDZs foram testados em animais com doença de Alzheimer induzida pela

estreptozotocina e por peptídeo amiloide Aβ 1-42, e mostraram efeitos

superiores à rivastigmina e galantamina (SILVA et al., 2014, resultados não

publicados).

Figura 30. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre a consolidação da memória no teste de esquiva inibitória.

C treino C teste D4 treino D4 teste0

50

100

150

200

La

tên

cia

de

des

cid

a (s

)

Cada coluna representa a mediana dos experimentos seguidos dos intervalos interquativos (25 e

75). Os dados foram submetidos à análise de variância não paramétrica de uma via (Kruslkal-

Wallis) e teste de comparações múltiplas Dunns. Sigla: C – controle.

5.2.5 Avaliação do efeito do composto D4 sobre parâmetros de ansiedade

através do teste do labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze)

Os anticonvulsivantes utilizados na terapêutica da epilepsia podem

alterar parâmetros de ansiedade, tornando-se ansiolíticos ou ansiogênicos. Os

agonistas diretos do receptor GABAA como os benzodiazepínicos podem ser

ansiolíticos (HUANG et al., 2016), enquanto que carbamazepina tem um perfil ansiogênico. Para verificar se o composto D4 exibia tais efeitos, foi utilizado no

presente estudo o teste do LCE, conhecido também como plus–maze.

Desenvolvido por Handley e Mithani (CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ,

2012), o teste de plus-maze é utilizado há vários anos para a avaliação de

parâmetros comportamentais de ansiedade. É um teste etológico que se baseia

na tendência natural de roedores em explorar novos ambientes (BAILEY;

CRAWLEY, 2009; CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012). O aparato é

feito de madeira, e possui braços abertos e fechados em forma de cruz. Os

119

animais, durante a execução do teste, têm a opção de permanecerem nos braços

abertos e desprotegidos do labirinto, ou nos braços fechados e protegidos, que

são elevados do chão (BAILEY; CRAWLEY, 2009; TERNUS; DALLA-

VECCHIA, 2016). Normalmente, os animais tendem a evitar áreas abertas, iluminadas, preferindo os braços fechados. Portanto, a porcentagem de entrada

e o tempo de permanência nos braços abertos representam efeito ansiolítico.

Neste contexto, a administração de ansiolíticos e benzodiazepínicos promove

diminuição da ansiedade nos animais, resultando em aumento de transições

entre os compartimentos, sem afetar a atividade locomotora geral (BAILEY;

CRAWLEY, 2009; CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012; TERNUS;

DALLA-VECCHIA, 2016).

De acordo com os estudos realizados, o tratamento dos animais com o

composto D4 (10 mg/Kg, i.p.), em relação ao grupo controle, aumentou

significativamente a frequência de entrada dos animais nos braços abertos do

labirinto, em torno de 49,74% (p<0,05), (Figura 31A), enquanto que o

tratamento com DZP (0,75 mg/Kg, i.p.), controle positivo, promoveu um aumento da frequência de entrada nos braços abertos de 67,35% (p<0,0001). O

tempo de permanência nos braços abertos dos animais tratados com D4 também

aumentou de maneira significativa quando comparado ao grupo controle, em

torno de 59,52% (p<0,05) (Figura 31B). Nos animais tratados com DZP,

observou-se um aumento de 76,22% (p<0,0001).

O efeito de derivados TZDs sobre a ansiedade foi avaliado em teste

LCE em estudos anteriores. De acordo com Kurhe e Mahesh (2016), a

pioglitazona eleva a frequência de entrada e o tempo gasto nos braços abertos

do labirinto, na depressão induzida por estresse em camundongos obesos. Domi

et al. (2016) também estudaram e afirmaram que os compostos TZDs reduzem

comportamentos relacionados a ansiedade em testes experimentais. Estes dados demonstram que os resultados obtidos pelos testes farmacológicos realizados

neste estudo corroboram com os dados científicos já descritos na literatura.

120

Figura 31. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e diazepam (DZP) (0,75 mg/Kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais: (A) frequência de entradas nos braços abertos; e (B) tempo de permanência nos braços abertos, de animais submetidos ao plus-maze.

(A) (B)

C D4 (10 mg/Kg) DZP (0,75 mg/Kg)0

20

40

60

80

*

****

Tratamento i.p.

Fre

qu

ência

de e

ntr

ad

a n

os

bra

ço

s a

bert

os d

oplu

s-m

aze

C D4 (10 mg/Kg) DZP (0,75 mg/Kg)0

20

40

60

80

100

*

****

Tratamento i.p.

Tem

po

de

per

ma

nên

cia

no

s b

raço

s a

bert

os

do

plu

s-m

aze

Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média de 10

animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo

controle (salina) (C) (*p<0,05; ****p<0,0001). Os dados foram submetidos à análise de variância

ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle, DZP – Diazepam.

5.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através da indução do

sono por barbitúricos (MSB)

A sonolência também é um dos efeitos colaterais observados com o

tratamento de anticonvulsivantes (HUANG et al., 2016). Desta forma no

presente estudo, o efeito hipnótico do composto D4 foi avaliado através de um

teste farmacológico específico para esse fim, o teste de indução do sono por

barbitúricos. Sintetizados em 1864 por Adolph von Baeyer, os barbitúricos são

conhecidos e utilizados por suas propriedades anticonvulsivantes e hipnóticas

(ELLENS; FIGUEROA; CLARK, 2015; TERNUS; DALLA-VECCHIA,

2016). De maneira geral, os barbitúricos como o tiopental, fármaco escolhido

para o teste, induzem o sono por atuar em receptores GABAA em sítios de

ligação diferentes dos benzodiazepínicos (FALUDI et al., 2016; WALLE et al.,

2014).

Como demostra a figura 32, o composto D4 (10 mg/Kg i.p.) no teste de indução do sono por tiopental promoveu a redução da latência para o sono em

38,30% (p<0,01), e o DZP (p<0,001) em 44,85% (Figura 32A) e o aumento do

tempo total do sono em 35,95% (p<0,001), enquanto o DZP (p<0,001) em

62,29% (Figura 32B), conferindo possível efeito hipnótico ao composto em

estudo.

Como mencionado anteriormente, Patil et al. (2015) avaliaram

derivados TZDs quanto à proteção das CEs e, corroborando com os resultados

deste estudo, os compostos por eles estudados, apresentaram capacidade para

potencializar a hipnose induzida por barbitúricos em animais. Segundo os

121

autores, o aumento total do sono variou de 10 ± 3 min nos animais do grupo

controle e 98,6 ± 10 min em animais pré-tratados com as TZDs. Outro estudo

bastante recente de Duhart e colaboradores (2016) revelou propriedades

sedativas e hipnóticas de compostos TZDs. Estes autores sintetizaram e avaliaram o perfil tóxico dos compostos e observaram que derivados TZDs

exibiram efeito sedativo-hipnótico e alguns animais manifestaram letargia

grave com extremidades cianóticas após a administração de doses superiores a

700 mg/Kg v.o., doses estas muito superiores as usadas no presente estudo.

O efeito hipnótico de fármacos anticonvulsivantes pode ser

considerado vantajoso ou não, dependendo do tipo de CE a que ele será

indicado e, muitas vezes, está relacionado à dosagem utilizada e ao mecanismo

de ação farmacodinâmico, que independente do mecanismo apresentado, de

uma forma geral, deprimem o SNC (HUANG et al., 2016). No presente estudo,

o composto D4 demonstrou tanto a propriedade hipnótica, quanto sedativa,

apresentando um padrão de resposta muito parecido aos anticonvulsivantes

utilizados na clínica. Figura 32. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre: (A) latência do sono e (B) tempo total de sono, no teste de sono induzido por barbitúrico.

(A) (B)

C D4 (10 mg/Kg) DZP (2 mg/Kg)0

50

100

150

200

250

*****

Tiopental (30 mg/Kg, i.p.)

La

tên

cia

pa

ra o

so

no

(s)

C D4 (10 mg/Kg) DZP (2 mg/Kg)0

5000

10000

15000

***

***

Tiopental (30 mg/Kg, i.p.)

Tem

po t

ota

l d

e so

no (

s)

Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna do gráfico A, representa o

tempo de latência para sono (s), e do gráfico B, o tempo total de sono (s) de 10 animais por grupo.

Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo controle (salina) (C)

(**p<0,01, ***p<0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via

seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle, DZP – Diazepam.

5.3 Mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4

Para avaliação do mecanismo de ação, a dose escolhida do composto

D4 foi a dose 10 mg/Kg, i.p., pois os efeitos obtidos com 10 ou 30 mg/Kg, i.p.

não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. Ambas as doses

tiveram eficácia anticonvulsivante.

122

5.3.1 Influência da via GABAérgica sobre a propriedade anticonvulsivante do

composto D4

Os anticonvulsivantes disponíveis para o tratamento de pacientes

epilépticos podem atuar através da via GABAérgica. Desta forma optou-se in

vivo, investigar a influência dessa via no mecanismo de ação do composto D4.

O GABA exibe papel preponderante como neurotransmissor inibitório no SNC

e sua função é antagônica a função do GLU, o qual é excitatório. Fármacos

como fenobarbital, diazepam, vigabatrina, valproato e benzodiazepínicos atuam

sobre a via GABAérgica, ora inibindo a degradação do GABA via

GABAtransaminase, ora inibindo a sua receptação via GAT1 (transportador

GABAérgico), ora aumentando a condutância do Cl- no receptor GABAA como

agonistas (ABOU-KHALIL; FAAN, 2016).

Com esse intuito, procurou-se avaliar a via GABAérgica, sobretudo a

influência do receptor GABAA, utilizando o flumazenil (antagonista dos sítios de ação dos benzodiazepínicos no receptor GABAA) e se o mesmo poderia

interferir no efeito do composto D4.

O flumazenil é um imidazobenzodiazepínico, se comporta como um

antagonista benzodiazepínico específico e foi descoberto por Hoffman e

Warren, (1993). O flumazenil se liga com alta afinidade a locais específicos

sobre o receptor GABA, onde impede a ligação e os efeitos hipnóticos dos

benzodiazepínicos. Em estudos realizados em animais, o flumazenil não

influenciou nos efeitos de substâncias que não demonstram afinidades pelos

receptores benzodiazepínicos, como por exemplo, barbitúricos, etanol,

meprobamato, GABA-miméticos e agonistas de receptores de adenosina.

Entretanto, são bloqueados os efeitos de agonistas não benzodiazepínicos dos receptores benzodiazepínicos, tais como as ciclopirrolonas (zopiclona, por

exemplo) e as triazolopiridazinas. Em estudo pré-clínicos, o flumazenil é usado

para avaliação do envolvimento do receptor GABAA no mecanismo de ação de

compostos sintéticos e naturais (RAINES, 2017).

123

Figura 33. Influência da via GABAérgica sobre o efeito anticonvulsivante do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.).

Salina Flumazenil (2 mg/Kg, i.p.)0

20

40

60

80

100Controle

D4 (10 mg/Kg)**

La

tên

cia

pa

ra c

rise

(s)

Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa 10 animais por

grupo. Os asteriscos denotam significância (**p<0,01). Os dados foram submetidos à análise de

variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de Tukey.

Com relação à via GABAérgica investigada, a análise da figura 33

mostra que o composto D4 promoveu o aumento do limiar convulsivo dos

animais em 37,61% em relação ao controle/salina, de forma estatisticamente

significante (p<0,01), replicando o efeito anticonvulsivante demonstrado nos

resultados anteriores. Porém, de forma não esperada (uma vez que o composto

D4 mostrou-se hipnótico e ansiolítico), os dados demonstram também que o

pré-tratamento dos animais com flumazenil não reverteu esse efeito, sugerindo

que a via GABAérgica, via receptor GABAA, parece não estar envolvida no mecanismo de ação do composto em estudo.

De fato, até o momento não foi encontrada na literatura nenhuma

relação direta entre a classe das TDZs com o sitesma GABAérgico, tampouco

com os receptores PPARs e esse sistema. A relação entre o efeito

anticonvulsivante das TDZs e o envolvimento dos receptores PPARs na

epilepsia envolvem as vias oxidonitérgica (MOHAZAB et al., 2012) e

glutamatérgica (WONG et al., 2015), bem como a atenuação do estresse

oxidativo (YU et al., 2008) e neuroinflamação (OKADA et al., 2006). A partir

destes resultados, não foi possível afirmar que os receptores PPARs estão

envolvidos no mecanismo de ação do efeito anticonvulsivante do composto D4.

Para isto, é necessário realizar estudos que avaliem diretamente a atividade destes receptores, como, por exemplo, com a administração de antagonistas

PPARs. Utilizando antagonistas PPARs, como o GW-9662, pode-se avaliar se

o efeito anticonvulsivante do composto D4 é dependende ou independente da

atividade dos receptores PPARs. Assim, a atividade independente do receptor

PPAR é suportada pelo fato de a reversão do efeito anticonvulsivante do

124

composto D4 não ser inibida pelo GW-9662, e vice-versa (COSTELLO;

O’LEARY; HERRON, 2005; WONG et al., 2015).

5.3.2 Influência da via glutamatérgica sobre a propriedade anticonvulsivante

do composto D4

O sistema glutamatérgico é outro alvo de investigação no

mecanismo de ação de FAEs. Como já reportado anteriormente, o GLU é o

principal neurotransmissor excitatório do SNC e desempenha papel importante

no mecanismo de doenças neurológicas (FORMAN et al., 2009; VALLI;

SOBRINHO, 2014; WERNER; COVEÑAS, 2015). Atua sobre dois diferentes

tipos de receptores: ionotrópicos, subdivididos em receptores do tipo NMDA,

KA e AMPA (HADZIC; JACK; WAHLE, 2017); e metabotrópicos (FORMAN

et al., 2009; WERNER; COVEÑAS, 2015). Os receptores ionotrópicos são responsáveis pelas respostas

excitatórias rápidas e ao serem ativados, permitem o fluxo de íons Na+, K+ e

Ca++ através das membranas plasmáticas. De acordo com o que é reportado na

literatura, o aumento da concentração dos níveis de Ca++ intracelular participa

de eventos de hiperexcitabilidade que ocorre em processos convulsivos.

Portanto, defeitos de função de canais iônicos podem estar associados a formas

de epilepsia. Fármacos anticonvulsivantes utilizados na clínica podem envolver

mecanismos de inibição do sistema glutamatérgico, como por exemplo o

felbamato, a acetazolamida e o topiramato (FORMAN et al., 2009; VALLI;

SOBRINHO, 2014).

No presente estudo, a ketamina foi utilizada para investigar o

envolvimento do receptor NMDA no mecanismo de ação do composto D4. A ketamina, também conhecida como cetamina, quetamina ou Special K, é um

anestésico dissociativo que às vezes é utilizado para produzir sono profundo. O

fármaco foi desenvolvido em 1963 como um substituto para a fenilciclidina

(PCP). Na maioria das vezes, a ketamina é utilizada em medicina veterinária

como um tranquilizante de animais, no entanto, também pode ser utilizada em

medicina humana como um anestésico ou em episódios de depressão (AMIRI

et al., 2016). Seus efeitos no SNC se dão pelo antagonismo de receptores

glutamatérgicos do tipo NMDA (MOHSENI et al., 2016).

Analisando a figura 34, verifica-se que o composto D4, aumenta o

limiar convulsivo dos animais em torno de 33,63% em relação ao veículo.

Além disso, pode-se observar que o efeito anticonvulsivante do composto D4 não foi revertido, mas potencializou o efeito anticonvulsivante com o pré-

tratamento com a ketamina (antagonista seletivo dos receptores NMDA).

Portanto, o sistema glutamatérgico, via participação do receptor NMDA, pode

estar envolvido no mecanismo de ação do composto D4, já que, em estudos

125

anteriores, a inibição da liberação pré-sináptica do GLU pela administração de

TZDs foi observada (WONG et al., 2015).

O resultado obtido no presente estudo com relação à via

glutamatérgica, era o esperado. Geralmente, compostos sintéticos ou naturais, que exibem efeito anticonvulsivante pela via glutamatérgica, atuam bloqueando

o receptor NMDA, ou seja, comportam-se como antagonistas desse receptor ou

de outros receptores glutamatérgicos (WHITE; BARKER-HALISKI, 2016).

Espera-se que o bloqueio dos receptores glutamatérgicos diminuam a excitação

cerebral induzida pelo GLU, e em contrapartida, melhorem, consequentemente,

a inibição GABAérgica. De fato, fármacos antivonvulsivantes como o

felbamato, bloqueiam diretamente os receptores NMDA, enquanto que o

topiramato, bloqueia receptores AMPA (STRIANO et al., 2016). Entretanto, a

via glutamatérgica é bastante complexa, e o efeito anticonvulsivante dos

fármacos nessa via não se restringe somente ao bloqueio de receptores.

Fármacos como a carbamazepina e fenitoína, por exemplo, não são

antagonistas glutamatérgicos, mas inibem os disparos elétricos de neurônios glutamatérgicos bloqueando canais de Na+, impedindo assim, a propagação do

impulso nervoso. A gabapentina, por sua vez, bloqueia canais de Ca++ voltagem

dependentes de neurônios glutamatérgicos, bloqueando desta forma, a liberação

de GLU (VALLI; SOBRINHO, 2014).

Na literatura, tem sido reportado que as TDZs, como a rosiglitazona,

suprimem as descargas epileptiformes mediadas pelo receptor NMDA por

inibição da liberação de GLU pré-sináptico. Os autores reportam que em testes

in vitro, a rosiglitazona protegeu fatias do hipocampo de ratos da

excitotoxicidade provocada pela ativação de receptores NMDA, parcialmente

pela ativação de receptores PPARγ, sugerindo que a rosiglitazona pode ser um

agente potencial para tratar pacientes com CEs do lobo temporal (WONG et al., 2015).

126

Figura 34. Influência da via glutamatérgica sobre o efeito anticonvulsivante do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.).

Salina Ketamina (0,5 mg/Kg, i.p.)0

50

100

150Controle

D4 10 mg/Kg

****

**

*

*

La

tên

cia

pa

ra c

rise

(s)


grupo. Os asteriscos denotam significância estatística (*p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001). Os

dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de

Tukey.

5.3.3 Influência da via oxidonitrérgica sobre a propriedade anticonvulsivante

do composto D4

O envolvimento da via oxidonitrérgica nos mecanismos indutores de

CEs e no mecanismo de ação dos FAEs tem sido estudado por muitos

pesquisadores. O NO é conhecido por ser um neuromodulador que participa de

vários processos fisiológicos no SNC, como a percepção da dor, plasticidade

neuronal, memória e comportamento. Além disso, o NO também está envolvido

em processos neurodegenerativos patológicos, como na doença de Alzheimer,

doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla e, claro, na epilepsia. O NO atua como um mensageiro neuronal intracelular no cérebro e é

um modulador da susceptibilidade a convulsões com efeitos anticonvulsivantes

e/ou pró-convulsivos (GOYA et al., 2006; MOHAZAB et al., 2012). Os níveis

elevados de NO em todas as regiões cerebrais, especialmente no córtex

temporal, contribuem para o limiar de convulsões induzidas por PTZ

(GOOSHE et al., 2017).

Em adição, estudos científicos demonstram que o NO pode estar

aumentado no cérebro de animais que forem tratados com PTZ e há uma forte

atuação do NO no hipocampo e em outras regiões do cérebro de animais após a

127

indução de CEs. Este excesso de NO pode dar origem a formação do ONOO-,

radical livre extremamente potente que pode levar à apoptose celular

(MOHAZAB et al., 2012).

Como descrito, o NO é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina pelas enzimas NOSs e pode ser inibido por análogos da L-arginina, como o L-

NAME (MOHAZAB et al., 2012; ZHU et al., 2016).

No presente estudo, o possível envolvimento da via oxidonitrérgica no

mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4 foi

investigado utilizando o L-NAME (inibidor não seletivo da NOS), a L-arginina

(precursor do NO) e o 7-NI (inibidor seletivo da nNOS), administrados antes da

administração do composto D4. Os resultados expressos na figura 33

demonstram que o composto D4 aumentou de forma estatisticamente

significativa (p<0,01) o limiar convulsivo dos animais em relação ao veículo

(salina), confirmando o efeito anticonvulsivante obtido nos resultados

anteriores nas três situações apresentadas (Figura 35 A, B e C). Os resultados

também demonstram que houve redução não significativa do limiar convulsivo dos animais pré-tratados com L-arginina e L-NAME e, nos animais pré-tratados

com 7-NI houve redução estatisticamente significativa do limiar convulsivo,

conforme visualizados na figura 35 A, B e C, respectivamente, em relação aos

animais tratados somente com o composto D4, sugerindo, portanto, o

envolvimento da via oxidonitrérgica no mecanismo de ação do efeito

anticonvulsivante do composto D4. O aumento dos níveis de NO pela

administração prévia de L-arginina revertem o efeito do composto, sugerindo

que a dose de L-arginina usada é suficiente para alterar as concentrações de NO

no cérebro dos animais de forma que o efeito anticonvulsivante seja alterado.

Da mesma forma, a administração prévia de L-NAME nos animais também

reverteu o efeito anticonvulsivante do composto, corroborando com os resultados obtidos pela administração prévia de 7-NI no mesmo experimento,

bem como resultados já descritos na literatura. No estudo de Mohazab e

colaboradores (2012), os pesquisadores observaram que o L-NAME reverteu

significativamente o efeito anticonvulsivante da pioglitazona, e reforçaram a

ideia de que o fármaco pode ser um adjuvante útil no tratamento da convulsão.

Allami et al. (2011) relataram que o efeito neuroprotetor dos agonistas

de PPARs em crises convulsivas se deve, pelo menos em parte, pela supressão

de NO e pode ser revertido por um gerador de NO, como a L-arginina. Os

autores afirmam também que a atenuação da síntese de NO está entre os vários

mecanismos pelos quais os agonistas de PPARs reduzem a neuroinflamação,

causa de diversos processos patológicos do SNC, como a epilepsia. Como já

reportado, o NO está envolvido em processos patológicos neurodegenerativos e/ou neuropsicológicos. As TZDs, por exemplo, melhoram a cognição nos

estágios iniciais da doença de Alzheimer, a partir da diminuição no acúmulo de

placas senis e da reação inflamatória na glia, o que resulta em neuroproteção

128

(GRAY et al., 2012). Sadaghiani et al. (2011) estudaram a co-administração de

pioglitazona com inibidores da NOS, como o L-NAME e com o precursor de

NO, L-arginina, e observaram a reversão significativa do efeito antidepressivo

da pioglitazona. Um estudo bastante recente de Mansouri et al. (2017) evidenciou que

os agonistas de PPARγ podem inibir a expressão da enzima NOS e

consequentemente reduzir a produção de NO. Pode-se propor, portanto, que as

vias PPARγ e oxidonitrérgica podem interagir em conjunto na modulação de

algumas condições fisiológicas e/ou fisiopatológicas.

129

Figura 35. Influência da via oxidonitrérgica sobre o efeito anticonvulsivante do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.).

(A)

(B) Salina L-arginina

0

20

40

60

80

100Controle

D4 10 mg/Kg

**

*

**

La

tên

cia

pa

ra c

rise

(s)

(C) Salina L-NAME

0

20

40

60

80

100Controle

D4 10 mg/Kg

***

***

La

tên

cia

pa

ra c

rise

(s)

Salina 7-NI

0

20

40

60

80Controle

D4 10 mg/Kg**

*

*

*

La

tên

cia

pa

ra c

rise

(s)


grupo. Os asteriscos denotam significância estatística (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Os dados

foram submetidos à análise de variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de Tukey.

130

5.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4



Compostos que atuam no SNC, utilizados no tratamento de desordens

psiquiátricas, como no caso da epilepsia, quando administrados

subcronicamente, podem produzir alterações neuroquímicas e comportamentais

em roedores (ENKEL; THOMAS; BARTSCH, 2013). Assim, se faz importante

a investigação da influência do tratamento subcrônico de compostos em estudo

com ação no SNC.

Para a avaliação dos efeitos comportamentais emocionais, exploração

de novos ambientes e atividade locomotora (BAILEY; CRAWLEY, 2009;

HOLZMANN et al., 2011; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016), os animais foram submetidos ao teste CA no 20º dia de tratamento com o composto D4.

De acordo com a figura 36, pelos resultados demonstrados é possível

observar que os roedores deram preferência por áreas protegidas, explorando

durante maior período de tempo as áreas em contato com as paredes e, portanto,

o tratamento subcrônico não influenciou significativamente a atividade motora

dos animais, já que os números de crossings (A) e rearings (B), entre

tratamento e controle, permaneceram semelhantes.

Assim como no teste agudo do CA descrito anteriormente, o efeito do

composto D4 sobre os parâmetros motores dos animais obtidos neste estudo

estão de acordo com os resultados descritos na literatura, no qual Park et al.

(2007), Pérez e Quintanill (2015), Salehi-Sadaghiani et al. (2012) e

Shahsavarian et al. (2014) relataram que o tratamento com compostos agonistas PPARs não influenciam a atividade locomotora.

131

Figura 36. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros comportamentais avaliados no teste Open Field.

(A) (B)

C D4 Fenobarbital0

50

100

150

Nú

mer

o d

e cr

oss

ings

C D4 Fenobarbital0

20

40

60

80

Nú

mer

o d

ere

arin

gs

Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 8 animais por

grupo. Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-

hoc de Tukey.


induzida por PTZ

As TZDs, agonistas PPARs (ver item 3.6.1), apresentam benefícios em

vários testes de doenças do SNC (MOEZI et al., 2015; SHYAM; DEBNATH;

DEVBHUTI, 2016). A ação antiepiléptica das TZDs, a partir de testes com a pioglitazona, foi relatada pela primeira vez por Okada, Yamashita e Tsuji

(2006) em tratamento agudo e crônico no teste de convulsão induzida por PTZ,

antagonista GABAérgico (ver item 4.2.1).

Segundo Moezi e colaboradores (2015), a pioglitazona reduz o tempo

de latência para CEs e encurta a duração da convulsão em roedores. De acordo

com Okada, Yamashita e Tsuji (2006), a pioglitazona reduz o fenômeno

epiléptico pela inibição de citocinas inflamatórias envolvidas na patogenia da

doença.

Pela constatação de que o tratamento com TZDs induz efeito

anticonvulsivo em testes de convulsões de PTZ agudos e crônicos, no presente

estudo, animais foram tratados com o composto D4 por 21 dias, para a observação do tempo de latência para a primeira crise convulsiva e número de

óbitos.

No teste de convulsão induzida por PTZ em administração subcrônica

com o composto D4, houve aumento significativo (p<0,01) do limiar

convulsivo em 28,82% quando comparado ao controle negativo e 42,35%

(p<0,001) quando comparado ao fenobarbital, fármaco utilizado como controle

positivo (Figura 37).

Com base em estudos da literatura científica, compostos que contém o

núcleo TZD possuem ação anticonvulsivante em tratamento agudo e crônico

132

(MOEZI et al., 2015; PATIL et al., 2015; PAYANDEMEHR et al., 2015;

RANADE, 2013; SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016; WONG et al.,

2015). Nos estudos realizados pelos autores, revelou-se um efeito

anticonvulsivo significativo da pioglitazona nas doses 10 e 20 mg/Kg em testes de convulsão induzida por PTZ, administradas cronicamente pelas vias

intravenosa e intraperitoneal. Ranade (2013) verificou a ação anticonvulsivante

PPARγ da pioglitazona em testes in vitro e correlacionou este resultado com a

redução crônica da hiperexcitabilidade in vivo. O efeito anticonvulsivante

subcrônico pela administração com o composto D4 corroboram com os

resultados apresentados acima, onde observou-se que sua utilização apresenta

potencial anticonvulsivo tanto em testes agudos, quanto em testes subcrônicos.

Figura 37. Efeito anticonvulsivante subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por PTZ.

C D4 Fenobarbital0

50

100

150

**

###

Latê

nci

a p

ara

cri

ses

(s)

Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 8 a 10 animais por

grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparada ao grupo controle (salina)

(C) (**p<0,01). Sustenidos denotam significância estatística quando comparada ao grupo

fenobarbital (###p<0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via

seguido pelo post-hoc de Tukey.

5.4.3 Análise do plasma de animais tratados subcronicamente com o

composto D4

Antes de um medicamento ser efetivamente usado clinicamente, seus

efeitos tóxicos devem ser avaliados. Alterações em parâmetros bioquímicos

estão bastante relacionados com a toxicidade de produtos químicos e fármacos.

Portanto, estes parâmetros se fazem extremamente necessários na avaliação de

alterações toxicológicas induzidas por tratamentos farmacológicos

(ORLANDINI, 2012). Os exames bioquímicos são utilizados como indicadores de resposta a

alterações endógenas e como biomarcadores diagnósticos. Têm a finalidade de

avaliar alterações em funções metabólicas desempenhadas por órgãos e tecidos,

133

identificar alterações patológicas de animais de laboratório e realizar

acompanhamento terapêutico e/ou procedimentos experimentais. Os ensaios

bioquímicos disponíveis avaliam funções renais, hepáticas, pancreáticas e

cardíacas, além de alterações na homeostase eletrolítica e endócrina (ARAÚJO, 2012; BRANCO, et al., 2011; SASIDHARAN et al., 2015).

Todos os parâmetros bioquímicos avaliados no plasma dos animais

devem ser comparados aos grupos controle e a valores de referência (VR) para

cada espécie animal utilizada, e então interpretados. Na literatura, dados sobre

os VR para animais de laboratório, especialmente camundongos Swiss, são

limitados. Os valores podem variar dependendo das condições a que os animais

são submetidos. Portanto, cada biotério deve padronizar e estabelecer seus

valores conforme as espécies utilizadas. Além disso, os valores podem ser

discrepantes entre estudos da literatura, pois muitos analisam um número

pequeno de animais ou parâmetros, utilizam metodologias e equipamentos

diferentes, e os resultados são influenciados por fatores como coleta, idade,

sexo e nível de estresse (ARAÚJO, 2012; ORLANDINI, 2012; SPINELLI et al., 2014).

Neste estudo, os animais foram avaliados para a determinação de

possíveis alterações bioquímicas relacionadas ao uso subcrônico do composto

D4 e os resultados foram comparados com o grupo controle. Foram também

selecionadas duas referências para comparação dos resultados, conforme tabela

8.

Tabela 8. Valores de referência de parâmetros bioquímicos plasmáticos em camundongos Swiss.

Parâmetro bioquímico Valor de referência (VR)

SPINELLI et al., 2012 ARAÚJO, 2012

ALT/TGP 15,03 – 33,37 U/L 41 U/L

AST/TGO 21,97 – 44,03 U/L 152 U/L

FALC - 141,8-248,4 U/L

PT 47,38 – 47,78 mg/dL 5,22 g/dL

URE 12,93 – 23,71 mg/dL 20,7 mg/dL

CRE 0,10 – 0,18 mg/dL 0,28 mg/dL

GLI 62,38 – 88,02 md/dL -

CPK - - ALT/TGP: alanina aminotransferase; AST/TGO: aspartato aminotransferase; FALC: fosfatase

alcalina; PT: proteínas totais; URE: ureia; CRE: creatinina; GLI: glicose; CPK:

creatinofosfoquinase.

5.4.3.1 Avaliação de parâmetros hepáticos

O fígado é o órgão responsável por várias funções vitais do organismo.

As células hepáticas, chamadas hepatócitos, são capazes de sintetizar

134

substâncias como albumina, fibrinogênio, α e β-globulinas, lipoproteínas e

colesterol. Além disso, possuem a função excretora relacionada a síntese e

secreção de substâncias à bile (LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007).

Alguns testes bioquímicos podem ser utilizados para avaliar a função hepática como: dosagens de ALT/TGP, AST/TGO, fosfatase alcalina, gama-

glutamiltransferase, bilirrubina, entre outros. A liberação destas substâncias

pode ocorrer por alterações como reações inflamatórias, degeneração celular,

cirrose crônica e ingestão de substâncias hepatotóxicas (LOPES; BIONDO;

SANTOS, 2007; SASIDHARAN et al., 2015).

As aminotransferases são enzimas intracelulares que realizam a

conversão de aminoácidos pela transferência de grupamentos amina. A enzima

ALT é uma transaminase encontrada abundantemente no fígado e em menores

quantidades no rim e na musculatura esquelética, utilizada para a determinação

de lesões hepáticas, já que é liberada por hepatócitos lesados. A AST é

encontrada em órgãos e tecidos como o coração, fígado, músculo esquelético e

eritrócitos. O aumento desta enzima é indicativo de lesões hepáticas mais profundas, pois está presente no citoplasma e mitocôndrias. A redução das

enzimas ALT e AST não possui significado clínico (LOPES; BIONDO;

SANTOS, 2007; SPINELLI et al., 2014).

A fosfatase alcalina é uma enzima mitocondrial presente em tecidos

ósseos, sistema hepatobiliar e mucosa gastrointestinal, além de rins, placenta e

baço. Seu aumento também pode indicar dano hepático (LOPES; BIONDO;

SANTOS, 2007), mas as maiores elevações nos níveis de fosfatase alcalina

ocorrem nos casos de obstrução do trato biliar que pode ser induzida por

medicamentos (COSTA et al., 2012).

Outra enzima utilizada como marcador em desordens hepáticas é a

gama-glutamiltransferase (LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007). Além das enzimas, substâncias como as bilirrubinas podem estar

envolvidas em processos patológicos hepáticos. A bilirrubina é um pigmento

biliar resultante do metabolismo da hemoglobina e deve ser conjugada ao ácido

glicurônico nos hepatócitos para sua excreção. Seu aumento pode ser

caracterizado pela icterícia e ser decorrente de alterações hepáticas, aumento de

produção ou redução de excreção e doenças extra-hepáticas, como doenças

pancreáticas (COSTA et al., 2012; LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007).

O fígado está envolvido em diversas funções celulares, como catálise

de reações bioquímicas, regulação de hormônios, coagulação sanguínea, defesa

humoral e como carreadores de constituintes plasmáticos (LOPES; BIONDO;

SANTOS, 2007).

As TZDs, especialmente a rosiglitazona e troglitazona, foram associadas a hepatotoxicidade e a efeitos colaterais cardiovasculares, causa da

sua retirada do mercado nos EUA (DUHART et al., 2016). Por isso, foram

realizadas dosagens de parâmetros bioquímicos hepáticos como AST, ALT,

135

fosfatase alcalina e proteínas totais. Nenhuma diferença estatisticamente

significativa pôde ser observada com a administração subcrônica do composto

D4 para os valores de AST e fosfatase alcalina. Os valores de AST variaram

entre 197,80±19,63 U/L para o grupo controle, 191,20±70,79 U/L para D4 e 184,00±28,51 U/L para o fenobarbital. Já os valores de fosfatase alcalina foram

257,00±30,15 U/L, 180,00±60,82 U/L e 208,80±39,74 U/L, para os grupos

controle, D4 e fenobarbital respectivamente. Nota-se uma discrepância entre os

valores de referência citados por Spinelli et al. (2012) e Araújo (2012) para

valores de AST. Nossos resultados corroboram com o VR de Araújo (2012).

Houve também uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) (30%) para

valores de ALT, quando comparados ao controle. Os valores obtidos foram

43,33±4,46 U/L para controle, 33,33±8,26 U/L para D4 e 41,60±5,37 U/L para

fenobarbital, mas, estes resultados estão de acordo com Araújo (2012).

Conforme relatado anteriormente, a redução desta enzima não possui

significado clínico (LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007; SPINELLI et al.,

2014). Embora os valores de PT terem sido menores que o VR citado por Araújo (2012), pode-se perceber que, o composto D4 aumentou de maneira

estatisticamente significativa (p<0,01), em torno de 31,13%, os valores de PT

(2,88±0,44 g/dL), enquanto que o fármaco de referência, fenobarbital,

aumentou 35,33% (p<0,001) (3,07±0,48 g/dL), em relação ao controle

(1,98±0,04 g/dL) (Figura 38). Segundo Ruiz-Giménez et al. (2010), em casos

de disfunção hepática, o metabolismo hepático de alguns FAEs pode ser

prejudicado, e pode haver hipoalbuminemia associada. Por esta razão, sugere-

se investigar os níveis de albumina no tratamento subcrônico com o composto

D4. Valores de gama-glutamiltransferase não foram obtidos devido a

linearidade do método. Sugere-se, portanto, que a partir destes resultados

obtidos não há alta possibilidade de hepatotoxicidade em tratamento subcrônico, embora sejam necessários aprofundamentos nos estudos

bioquímicos.

136

Figura 38. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros hepáticos avaliados no plasma.

Aspartato aminotransferase

C D4 Fenobarbital0

50

100

150

200

250

AS

T (

U/I

)

Alanina aminotransferase

C D4 Fenobarbital0

10

20

30

40

50

*

AL

T (

U/I

)

Fosfatase alcalina

C D4 Fenobarbital0

100

200

300

FA

LC

(U

/I)

Proteínas totais

C D4 Fenobarbital0

1

2

3

4

*****

PT

(g/d

L)



(C) (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA

de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey.

5.4.3.2 Avaliação de parâmetros renais

Os rins são os órgãos responsáveis pela manutenção da homeostase de

líquidos do organismo através da filtração sanguínea e produção da urina. É

através deles, que a maioria das substâncias exógenas e estranhas são eliminadas. As principais provas bioquímicas realizadas para a determinação da

função renal são as dosagens sérica/plasmática e urinária de ureia e creatinina

(COSTA et al., 2012; SASIDHARAN et al., 2015; SPINELLI et al., 2014).

A ureia é o principal produto do catabolismo de proteínas. Em

condições de comprometimento renal, a filtração glomerular diminui, levando

ao aumento dos níveis de ureia. A creatinina é resultado do metabolismo da

creatina e fosfocreatina muscular. É utilizada como parâmetro de filtração

glomerular, pois é totalmente excretada pelos glomérulos (OGNA et al., 2015;

SPINELLI et al., 2014).

137

Embora superiores aos VR dos autores acima citados, os valores de

ureia com a administração do composto D4 (34,66±13,54 mg/dL) e fenobarbital

(21,60±2,19 mg/dL) não foram estatisticamente diferentes do grupo controle

(30,60±6,54 mg/dL). Já para valores de creatinina, houve redução estatisticamente significativa, em torno de 42,86% (p<0,01) (0,19±0,02

mg/dL), dos resultados obtidos pela administração do composto D4, e 45,24%

para fenobarbital (p<0,001) (0,18±0,04 mg/dL), em relação ao grupo controle

(0,34±0,07 mg/dL) (Figura 39). A redução nos níveis plasmáticos de ureia e

creatinina não possuem significado clínico, e podem fornecer indícios de

melhora renal (COSTA et al., 2012). Os agonistas PPARs, como as TZDs

podem influenciar favoravelmente a hemodinâmica glomerular. Um exemplo é

a pioglitazona, que se mostrou nefroprotetora e preveniu a deterioração da

função renal (BENIGNI et al., 2006).

O reconhecimento de lesões renais requer a consideração de vários

fatores, incluindo avaliação de marcadores de lesão em testes de função renal,

concentrações de eletrólitos séricos, análise de urina e estudos de imagem renal. Estes marcadores podem sugerir que lesões renais estão presentes, mas não

necessariamente confirmam a presença de doenças renais (POLZIN, 2011). A

confirmação da presença de lesões renais deve ser baseada em avaliações de

plasma (ex: ureia e creatinina), juntamente com biomarcadores urinários (ex:

depuração de creatinina 24 horas) (CASTRO et al., 2014; DEVARAJAN;

MURRAY, 2014; OGNA et al., 2015). Considerando os resultados obtidos no

teste experimental deste estudo, sugere-se que, possivelmente, não há

sobrecarga renal na utilização subcrônica do composto D4, embora sejam

necessários estudos aprofundados para a avaliação dos níveis de creatinina e

sua excreção pela urina, a fim de se estimar o real potencial de ação do

composto sobre os rins.

Figura 39. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros renais avaliados no plasma.

Ureia

C D4 Fenobarbital0

10

20

30

40

50

UR

E (

mg/d

L)

Creatinina

C D4 Fenobarbital0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

*****

CR

E (

mg/d

L)



(C) (**p<0,01; ***p>0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma

via seguido pelo post-hoc de Tukey.

138

5.4.3.3 Outros parâmetros

O pâncreas participa do processo de manutenção do equilíbrio

nutricional do organismo, através do glucagon e insulina, produzidos respectivamente pelas células α e β das ilhotas de Langerhans. A glicose induz

a liberação de insulina a fim de manter a homeostase nutricional. Assim,

distúrbios pancreáticos podem levar ao aparecimento de doenças como o

diabetes mellitus (ARAÚJO, 2012; SPINELLI et al., 2012). Embora os

resultados de glicose se mostraram inferiores aos VR estabelecidos por Spinelli

et al. (2012), estes apresentaram aumento estatisticamente significativo dos

valores em relação ao controle (11,00±1,22 mg/dL), em torno de 53,78%

(p<0,001) (23,80±3,03 mg/dL) para o composto D4 e 50,75% (p<0,001)

(22,33±2,16 mg/dL) para o fenobarbital (Figura 40A).

O aumento dos níveis de glicose pode estar associado a alterações

originadas por estresse e metabólicas. Diversos estudos científicos relatam o aumento de glicose por episódios estressantes há vários anos. Mediada pelo

eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e pelo sistema simpato-adrenal, a

resposta neuroendócrina ao estresse é caracterizada por excessiva

gliconeogênese, glicogenólise e resistência à insulina (MARIK; BELLOMO,

2013). Segundo Banin (2011), Kubokawa et al. (1999) e Tanno; Marcondes

(2002), durante o estresse, ocorre a ativação do sistema nervoso simpático,

levando o hipotálamo a produzir Fatores de Liberação de Corticotropina (FLC),

que coordenam as respostas ao estresse. A partir daí, há a produção do

hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) que estimula a liberação dos

corticoesteróides, que, juntamente com a adrenalina e NA, atuam no fígado

para estimular a glicogenólise, elevando os níveis de glicose.

O grau de resposta ao estresse está relacionado à intensidade do agente estressor e também às espécies envolvidas. Além disso, o hormônio ACTH é

aumentado e possui ação mais prolongada em fêmeas do que em machos

(TANNO; MARCONDES, 2002). Assim, os níveis de glicose elevados neste

estudo podem estar relacionados ao estresse do processo de coleta do plasma e

ao sexo dos animais.

Como o aumento nos níveis de glicose também pode estar relacionado

a alterações metabólicas, baixa capacidade de captação e distúrbios na

gliconeogênse hepática (PÁDUA et al., 2009), sugere-se o aprofundamento das

análises e investigação da causa do aumento nos níveis glicêmicos do composto

D4.

É relatado na literatura que as TZDs estão relacionadas a efeitos adversos cardíacos (DUHART et al., 2016; ERDMANN; CHARBONNEL;

WILCOX, 2009). A creatinofosfoquinase é uma enzima presente em tecidos

musculares e, portanto, reflete índices de lesão muscular (SPINELLI et al.,

2012). Seus níveis elevados podem estar presentes em miocardites e infarto

139

agudo do miocárdio, por exemplo (ERDMANN; CHARBONNEL; WILCOX,

2009). Assim, a dosagem de creatinofosfoquinase foi realizada no plasma dos

animais para verificar possível aumento e indicativo de lesão cardíaca. Nenhum

autor acima citado estabeleceu o VR para creatinofosfoquinase, mas também não se observou diferença significativa em relação ao grupo controle

(7305,60±1299,48 U/L), após administração do D4 (8499,20±3270,83 U/L) e

fenobarbital (6868,00±2146,00 U/L) (Figura 40B). Vale ressaltar que a enzima

creatinofosfoquinase não é um marcador específico, e para isto, sugere-se que,

em estudos posteriores sejam avaliados os níveis de marcadores como

creatinoquinase-MB, troponina-1 e mioglobina, relacionados diretamente com

problemas cardíacos (ELSHAMA; EL-KENAWY; OSMAN, 2016).

Figura 40. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre glicose e creatinofosfoquinase avaliados no plasma.

(A) (B)

Glicose

C D4 Fenobarbital0

10

20

30

******

GL

I (m

g/d

L)

Creatinofosfoquinase

C D4 Fenobarbital0

5

10

15

CP

K (

U/I

)



(C) (**p<0,01; ***p>0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma

via seguido pelo post-hoc de Tukey.

5.4.4 Estresse oxidativo

O cérebro consome aproximadamente 20% do total de oxigênio do

organismo humano. Mais da metade desta energia consumida é utilizada para restaurar o potencial de repouso das células excitatórias. Sendo assim, o SNC

conta com um número bastante elevado de mitocôndrias, organela com função

extremamente importante na respiração celular. Por conta disso, o SNC está

fortemente susceptível a disfunções mitocondriais, que resultam na

desregulação da homeostase de Ca++ e da geração de EROs/ERNs, ambas

ligadas à neurotoxicidade, instalando-se o chamado estresse

oxidativo/nitrosativo (BHAT et al., 2015).

A produção excessiva de EROs/ERNs, pode também estar associada

ao processo de excitotoxicidade, fortemente relacionado com a epilepsia. O

140

aumento do GLU e os níveis de Ca++ levam a perda neuronal e instala-se o

processo de lesão oxidativa/nitrosativa. Conforme item 3.1.5.4, o estresse

oxidativo/nitrosativo causa efeitos negativos sobre a membrana celular,

proteínas e DNA, podendo levar ao processo de neurodegeneração (BHAT et al., 2015; MAIA, 2016; SULAKHIYA et al., 2015).

Segundo Ercegovac e colaboradores (2013), o equilíbrio antioxidante

na epilepsia não é apenas modulado pelas CEs, mas também pelos FAEs. Os

anticonvulsivantes utilizados na clínica, como carbamazepina, fenobarbital e

ácido valpróico podem gerar metabólitos reativos, provocando toxicidade

sistêmica (ERCEGOVAC et al., 2013). Há estudos controversos na literatura,

que relatam que os FAEs não influenciam os marcadores

oxidativos/nitrosativos e que são as CEs que induzem os danos (GULER et al.,

2016; MENON; RAMALINGAM; KUMAR, 2012).

Há relatos também de que os agonistas do receptor PPARγ diminuem

o estresse oxidativo/nitrosativo no SNC (POPA-WAGNER et al., 2013).

Assim, é importante que sejam realizados estudos relacionados ao estresse oxidativo/nitrosativo em compostos derivados das TZDs.

Como as EROs/ERNs podem estar envolvidas na fisiopatogenia da

epilepsia e o uso prolongado de FAEs pode provocar alterações nos radicais

livres, o composto D4 foi avaliado em testes ex vivo para a avaliação de dano

oxidativo/nitrosativo.

5.4.4.1 Quantificação dos níveis de GSH

Dentre os componentes que desempenham funções antioxidantes está

a GSH, a principal responsável pela defesa antioxidante intracelular não

enzimática no corpo. A glutationa oxidada (GSSG) é reduzida pela glutationa redutase, a GSR, utilizada como um dos marcadores de estresse oxidativo. O

desequilíbrio nesse sistema dá origem a alterações mitocondriais e danos

celulares, afetando a excitabilidade neuronal e, portanto, a CEs (RAJ;

GOTHANDAM, 2014).

Níveis reduzidos de GSH no homogenato cerebral podem indicar

danos do estresse oxidativo, assim como níveis elevados de GSH podem

indicar o favorecimento das defesas antioxidantes (MAIA, 2016; MARIANO,

2016).

A fim de analisar os níveis de GSH no tecido cerebral, animais foram

tratados por 21 dias para a determinação de possíveis danos oxidativos do

composto D4. A figura 41 mostra os resultados obtidos na quantificação dos níveis de GSH no tecido cerebral, mais especificamente no córtex e hipocampo.

Os gráficos mostram que não houve diferença significativa dos níveis de GSH

do composto D4 em relação ao controle. O mesmo resultado pode ser observado

no tratamento com fenobarbital, fármaco utilizado como controle positivo.

141

Em estudos anteriores aprovados cientificamente em periódicos,

autores relatam que o aumento de EROs/ERNs danificam estruturas celulares, e

compostos TZDs podem influenciar positivamente a atividade antioxidante. De

acordo com Pilipović e colaboradores (2015), a administração de uma dose única de pioglitazona aumenta significativamente a os níveis de GSH,

sugerindo que a pioglitazona, diminuiu o dano oxidativo cerebral. Os resultados

do presente estudo corroboram com os resultados de Pilipović et al. (2015) e de

Popa-Wagner et al. (2013) que também relatou o aumento dos níveis de GSH,

indicando que a administração subcrônica do composto D4, provavelmente

reduziu os danos oxidativos no cérebro dos animais. Figura 41. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de glutationa reduzida (GSH).

C D4 Fenobarbital0

500

1000

1500

2000

GSH - Córtex

GS

H (

mg

/g t

ecid

o)

GSH - Hipocampo

C D4 Fenobarbital0

500

1000

1500

GS

H (

g/g

tecid

o)



hoc de Dunnett.

5.4.4.2 Determinação de LOOH

As membranas celulares são constituídas por ácidos graxos poli-

insaturados, responsáveis por sua fluidez. Danos às camadas lipídicas celulares

podem gerar alterações estruturais e funcionais da célula. Algumas EROs/ERSs

podem abstrair átomos de hidrogênio destes ácidos graxos e dar origem ao

início do processo conhecido como peroxidação lipídica (LPO) (COBB; COLE,

2015; RAJ; GOTHANDAM, 2014). Em distúrbios neurodegenerativos, a

alteração da homeostase oxidativa resulta em produtos LPO acumulados,

chamados LOOH (COBB; COLE, 2015). Os produtos finais da decomposição

de LOOH incluem aldeídos altamente citotóxicos, como malonaldeído (MDA), acroleína, 4-hidroxi-2-trans-nonenal (HNE) e trans,trans-2,4-decadienal (DDE)

(RAJ; GOTHANDAM, 2014).

Pesquisadores têm procurado avaliar este processo e, para isto,

utilizam métodos que determinam os produtos da oxidação de lipídeos, como

indicadores da produção de EROs/ERSs (COBB; COLE, 2015). A importância

142

da determinação da presença destes produtos derivados da LPO se dá pela

citotoxicidade dos mesmos, que pode causar alterações celulares (ANDRADE,

2011). O aumento dos níveis de LOOH indica a presença de estresse oxidativo

(SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004; SILVA et al., 2015). A figura 42 mostra os resultados obtidos quanto a determinação dos

níveis de LOOH em tecido cerebral (córtex e hipocampo) de animais tratados

subcronicamente com o composto D4. Percebe-se através dos resultados, que no

córtex, os níveis de LOOH foram reduzidos em 47,13% em relação ao grupo

controle, de maneira estatisticamente significativa (p>0,05). Isso significa que

possivelmente houve uma redução do processo de estresse oxidativo nos

animais tratados, especificamente naquela região. Contrariamente, no

hipocampo houve um aumento significativo (p>0,01) de LOOH em 36,41% nos

animais tratados com o composto D4 e 38,05% com o fármaco de referência

fenobarbital, indicando possível aumento do estresse oxidativo nesta área

cerebral.

Com base na literatura, observa-se que derivados TZDs possuem capacidade de reduzir os danos oxidativos celulares. Baghcheghi et al. (2016)

estudaram os efeitos da pioglitazona e rosiglitazona em ratos hipotiroideanos e

observaram a redução da LPO cerebelar. Collino e colaboradores (2006)

afirmaram que a administração dos mesmos fármacos, pioglitazona e

rosiglitazona, 30 minutos antes da indução de lesão isquêmica, diminui

significativamente a produção de EROs/ERNs e, como consequência, a LPO.

Os níveis de MDA, um produto final do processo de LPO, mostraram-se

reduzidos em experimentos com animais após o tratamento com pioglitazona

(BUTTERFIELD; DOMENICO; BARONE, 2014; KAUNDAL et al., 2009),

sugerindo que os compostos TZDs possuem capacidade de aumentar os níveis

de antioxidantes endógenos, responsáveis pela redução no estresse oxidativo. Os resultados deste estudo mostraram uma redução significativa dos LOOH no

córtex, mas, contrariamente, elevaram seus níveis no hipocampo. Este dado é

compatível com os achados na literatura sobre o envolvimento da

pontencialização de longa duração (LTP) nos processos epileptogênicos

hipocampais. A LTP pode ser mediada pelo GLU, via receptores NMDA, e

também, pela modulação de NO. Agonistas NMDA promovem a estimulação

da LTP e o que ocorre é a manuntenção da excitabilidade nesta área do SNC,

originando o estatus do mal epiléptico (KULLMANN; ASZTELY; WALKER,

2000). Além disso, os resultados também sugerem que, em outros locais do

SNC, o efeito anticonvulsivante do composto D4 pode envolver outras vias de

neurotransmissão e, no hipocampo, ocorra estimulação da via glutamatérgica.

O composto D4 não se mostrou agonista do receptor NMDA, uma vez que o pré-tratamento com ketamina não reverteu seu efeito. Além disso, a LTP é

altamente sensível a NOS e à ação do NO, sendo possível a facilitação da LTP

por ligantes TZDs, como o composto D4, pela atuação através da via

143

oxidonitrérgica (CHONG et al., 2017; COSTELLO; O’LEARY; HERRON,

2005).

Figura 42. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de hidroperóxidos lipídicos (LOOH).

C D4 Fenobarbital0

1

2

3

4

*

LOOH - Córtex

LO

OH

(mm

ol/

mg

de

teci

do

)


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5**

LOOH - Hipocampo

**

LO

OH

(mm

ol/

mg

de t

eci

do

)


grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo controle

(salina) (C) (*p<0,05; **p<0,01). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de

uma via seguido pelo post-hoc de Dunnett.

5.4.4.3 Determinação da atividade de SOD

O sistema antioxidante do corpo humano é constituído por diversas

enzimas que, por meio de mecanismos de prevenção, impedem e/ou controlam

a formação de radicais livres e espécies não-radicais, são responsáveis pela

manutenção do equilíbrio oxidativo/nitrosativo. Dentre as principais enzimas, a

SOD é responsável pela conversão do radical O2- em H2O2. Posteriormente,

outras enzimas, CAT e GPx convertem o H2O2 em água e oxigênio, reduzindo

os efeitos tóxicos (BARBOSA et al., 2010; RAMA; MANJABHAT, 2014;

RAJ; GOTHANDAM, 2014). O aumento da atividade da SOD reflete em um aumento da resistência ao estresse oxidativo ou aumento da geração de ânion

superóxido (SANTOS, 2013; TORSDOTTIR et al., 2010).

A figura 43 mostra os resultados obtidos na determinação da

atividade da SOD no córtex e no hipocampo de animais tratados

subcronicamente com o composto D4. Percebe-se que não houve aumento na

atividade da SOD, quando se comparam os resultados do tratamento com o

composto D4 com o controle negativo. Também não houve diferença

significativa no tratamento com o fenobarbital, fármaco de referência utilizado

neste experimento. Pressupõe-se, a partir destes resultados, que o composto D4

não influenciou na atividade de SOD, já que o resultado foi semelhante ao

controle. Os resultados obtidos estão de acordo com os estudos realizados por Guler et al. (2016) e Menon, Ramalingam e Kumar (2012), que afirmaram que

o tratamento com FAEs não influencia o status antioxidante. Além disso, Fong

144

et al. (2010) relataram que a rosiglitazona suprimiu a geração de H2O2,

protegendo contra a apoptose induzida por hipóxia. Portanto, se não houve

alteração na atividade de SOD, não houve também a redução de H2O2,

justificando o resultado de LOOH descrito anteriormente. Os mesmos autores ainda propuseram que os agonistas PPARs medeiam a transcrição de genes

SOD, promovendo a remoção de EROs/ERNs. Remels e colaboradores (2008)

relataram que os agonistas de PPARs podem atenuar diretamente o estresse

oxidativo impedindo a geração de EROs/ERNs, pela regulação de enzimas

antioxidantes, incluindo a SOD. Assim, a ativação de PPARs aumenta a

capacidade antioxidante. Collino et al. (2006) demonstraram que o pré-

tratamento com agonistas de PPAR-γ protegeu células do hipocampo de ratos

contra o estresse oxidativo induzido por GLU ou H2O2. Os resultados obtidos

pelo presente experimento são apoiados por dados relatados anteriormente,

sugerindo que a pioglitazona possui papel contra o estresse oxidativo,

reforçando o sistema de defesa antioxidante (YIN et al., 2013).

Figura 43. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50

mg/Kg, i.p.) sobre os níveis da atividade de superóxido dismutase (SOD).


0.005

0.010

0.015

SOD - Córtex

U S

OD

/mg p

rote

ína


0.005

0.010

0.015

0.020

SOD - Hipocampo

U S

OD

/mg p

rote

ína



hoc de Dunnett.

5.4.5 Acompanhamento do desenvolvimento ponderal e efeito sobre o peso

dos órgãos dos animais submetidos ao tratamento subcrônico com o

composto D4

A administração de compostos químicos, especialmente fármacos

administrados cronicamente, podem induzir alterações no peso corporal de

animais e alterações morfológicas e funcionais em órgãos como fígado, rins e coração, e assim dar indícios simples e sensíveis de toxicidade (GRIFFITHS;

145

MATULKA, 2006; TAN et al., 2008). Além disso, o uso prolongado de FAEs

está associado ao risco de alterações de peso (NAKKEN, 2011; RUIZ-

GIMÉNEZ et al., 2010; SHAPIRO et al., 2016; SHETH, 2004; VERROTTI et

al., 2011). Com o objetivo de avaliar possíveis alterações tóxicas devido tratamento subcrônico com o composto D4, foram avaliados os pesos dos

animais durante o experimento e o peso dos órgãos após eutanásia, cujos

valores são demostrados a seguir.

5.4.5.1 Efeito do tratamento subcrônico com o composto D4 sobre o peso

corporal dos animais

O uso terapêutico de FAEs pode ter influência variável no peso

corporal. Alguns medicamentos, como fenitoína, oxcarbazepina, levetiracetam,

lamotrigina e tiagabina, parecem não ter efeitos significativos sobre o peso

corporal dos seus usuários (SHETH, 2004). Um segundo grupo de FAEs, incluindo topiramato, felbamato e zonisamida, é associado com perda de peso,

ao passo que um terceiro grupo, que compreende valproato, carbamazepina,

gabapentina, pregabalina, fenobarbital e vigabatrina, promove ganho de peso e

pode causar sobrepeso e obesidade (RUIZ-GIMÉNEZ et al., 2010; SHAPIRO

et al., 2016). A obesidade é o aspecto mais preocupante, pois pacientes

epilépticos apresentam risco aumentado de sobrepeso, independente do

tratamento, pelo sedentarismo, depressão e co-morbidades psiquiátricas

associadas (BORTOLINI; KULAK; BOGUSZEWSKI, 2008; VERROTTI et

al., 2011).

Sengupta et al. (2016) relatam que os agonistas PPARs, como as

TZDs, podem afetar o peso de animais devido alterações a nível metabólico. A redução de massa corporal deve-se a uma variedade de respostas, que pode

estar associada a toxidade sistêmica (LIMA, 2014). A figura 44 mostra os

resultados do peso corporal dos animais durante o tratamento de 21 dias com o

composto D4 e com o fenobarbital. De acordo com a literatura, os resultados

demonstram que os grupos ganharam peso de maneira não significativa entre si,

durante o período do experimento, levando-se em consideração a ingesta de

água e alimentos, não demonstrando, portanto, influência do composto D4 sobre

o desenvolvimento ponderal dos animais tratados. Estudos posteriores

relacionando o tratamento com D4 e o ganho ponderal, devem ser aprofundados

para comprovar se o mesmo altera ou não o peso em tratamentos prolongados.

146

Figura 44. Porcentagem do aumento de peso dos animais submetidos ao tratamento subcrônico com o composto D4.

Desenvolvimento ponderal

1 7 14 2190

100

110

120

130

140

Controle

D4 (10 mg/Kg, i.p.)

Fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.)

Dia de tratamento

Au

men

to d

e p

eso (

%)

Resultados apresentados como média. Cada coluna representa 10 animais por grupo. Os dados

foram submetidos à análise de variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de

Bonferroni.

5.4.5.2 Avaliação do peso dos órgãos dos animais tratados subcronicamente

com o composto D4.

São relatados na literatura alguns efeitos colaterais das TZDs, como

disfunção renal, retenção de sódio e insuficiência cardíaca congestiva. A

necessidade de estudos toxicológicos das TZDs se dá pela capacidade destas

moléculas causarem, por mecanismos ainda não bem reconhecidos, edema periférico e insuficiência cardíaca congestiva devido a um aumento de

transportadores tubulares e diminuição na taxa de filtração glomerular em

consequência da retenção de sódio renal. Assim, alterações no peso destes

órgãos: rins e coração podem ocorrer (HORITA et al., 2015).

Os agonistas PPAR, como os derivados TZDs, podem também exercer

efeitos sobre o tecido adiposo e na homeostase de lipídeos. Há evidências de

esteatose hepática e hepatócitos distendidos com o uso de TZDs

(BOELSTERLIA; BEDOUCHA, 2002).

Em avaliações toxicológicas, é avaliado o efeito de compostos sobre o

peso dos órgãos dos animais submetidos ao tratamento com o intuito de

verificar alterações morfológicas. A tabela 9 demonstra os resultados dos pesos

dos órgãos dos animais. De acordo com Fong et al. (2010), a pioglitazona e a rosiglitazona estão associadas a eventos adversos como ganho de peso e edema

periférico. Nota-se que não há diferença significativa entre os grupos tratados

com fenobarbital, fármaco de referência, e com o composto D4, para os órgãos:

147

rins, fígado e coração, o que dá indícios de que não há alterações referentes a

efeitos adversos conhecidos das TZDs, como nefrotoxicidade, hepatotoxicidade

e toxicidade cardíaca. O tratamento com composto D4 e fenobarbital não

promoveu aumento do peso desses órgãos, embora tenha ocorrido uma diminuição do peso do coração nos animais tratados em relação ao controle.

Ainda sim, ressalta-se a importância de mais estudos para a elucidação do

potencial toxicológico.

Tabela 9. Peso dos órgãos dos animais submetidos a tratamento subcrônico com o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.).

Fígado (g) Rim (g) Coração (g)

Controle 1,19±0,14 0,15±0,02 0,13±0,02

D4 (10 mg/Kg, i.p.) 1,18±0,13 0,15±0,01 0,11±0,01

Fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) 1,23±0,11 0,13±0,01 0,11±0,01 Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada linha representa 6 animais por


hoc de Tukey.

149

6 CONCLUSÃO

Pela observação dos aspectos analisados, este estudo demonstrou que

os compostos TZDs propostos são inéditos e podem ser sintetizados. Os

resultados in sílico e in vivo, em conjunto, indicaram o potencial anticonvulsivante destes compostos TDZs, corroborando com dados já

apresentados pela literatura. Nenhum dos compostos estudados violou os

parâmetros de Lipinski, na análise in sílico, sugerindo que a série de compostos

possui propriedades físico-químicas adequadas para serem biodisponíveis por

v.o. Além disso, os resultados obtidos de druglikeness e drugscore indicaram

que os compostos apresentam fragmentos de fármacos conhecidos e que

possuem grupos farmacofóricos, facilitando o reconhecimento fármaco-

receptor. Os resultados dos descritores físico-químicos e farmacocinéticos

utilizados na predição da permeabilidade indicaram que os compostos TZDs

estudados possuem capacidade para permear a BHE e terem boa absorção

intestinal (AIH). Os compostos D1, D2, D3 e D4 apresentaram atividade

anticonvulsivante no teste de convulsão induzida por STR e, os compostos A1, D1 e D4 apresentaram ação anticonvulsivante no teste de convulsão induzida

por eletrochoque. Apenas o composto D4 foi efetivo em todos os testes de

indução química e elétrica, e, portanto, foi escolhido para os estudos

posteriores.

Em resumo, os resultados in sílico e in vivo mostraram potencial

anticonvulsivante dos compostos TZDs. O composto D4 reduziu

significativamente o limiar convulsivo dos animais tratados por v.o. e por via

i.p., e o seu mecanismo de ação parece envolver a via oxidonitrérgica. O

composto D4 não produziu déficit motor no CA e de memória na EI, apresentou

efeito ansiolítico observado no LCE e efeito hipnótico no MSB.

A administração subcrônica do composto D4 apresentou atividade anticonvulsivante e não alterou significativamente os níveis de aspartato

aminotransferase, fosfatase alcalina, ureia e creatinofosfoquinase, mas alterou

outros parâmetros bioquímicos, como glicose, creatinina, proteínas totais e

alanina aminotransferase, portanto, são necessários estudos mais aprofundados

para a confirmação de possível hepatotoxicidade e nefrotoxicidade em

tratamento subcrônico. O tratamento com o composto D4 não influenciou

significativamente os níveis de GSH e SOD, mas aumentou os níveis de LOOH

no hipocampo, em testes ex vivo e, a administração do composto não

influenciou o desenvolvimento ponderal e aparentemente não causou alterações

morfológicas nos rins, fígado e coração.

Em virtude dos dados mencionados, o composto D4 pode ser útil no manejo de crises epilépticas (CEs), embora estudos adicionais são importantes

para garantir a sua segurança.

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ANEXO 1

universidade do vale do itajaÍ bruna hawerrothsiaibib01.univali.br/pdf/bruna hawerroth2017.pdf ·...

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