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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

“CITOGENÉTICA MOLECULAR APLICADA AO DIAGNÓSTICO

PRÉ-IMPLANTACIONAL DE ANEUPLOIDIAS

CROMOSSÔMICAS”

Juliana Fabrícia Cuzzi

Ribeirão Preto

2008

Tese apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo para

concorrer ao título de Doutor, pelo

curso de Pós-Graduação em Genética.

Livros Grátis

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

“CITOGENÉTICA MOLECULAR APLICADA AO DIAGNÓSTICO

PRÉ-IMPLANTACIONAL DE ANEUPLOIDIAS

CROMOSSÔMICAS”


Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Martelli

Ribeirão Preto 2008

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo para concorrer ao título de Doutor,

pelo curso de Pós-Graduação em Genética.

FICHA CATALOGRÁFICA

Cuzzi, Juliana Fabrícia

Citogenética-Molecular Aplicada Ao Diagnóstico Pré-Implantacional de Aneuploidias Cromossômicas. Ribeirão Preto, São Paulo, 2008.

154p.: il. ; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/ USP – Área de concentração: Genética.

Orientadora: Martelli, Lúcia.

1. Diagnóstico Genético Pré-Implantacional. 2. Aneuploidias Cromossômicas. 3. CGH. 4. FISH.

Data da Defesa: ____/____/____

BANCA EXAMINADORA

Prof.Dr. __________________________________________________________

Julgamento: __________________________Assinatura: ____________________

Prof.Dr. __________________________________________________________


Prof.Dr. __________________________________________________________


Prof.Dr. __________________________________________________________


Prof.Dr. __________________________________________________________


Aos meus pais,

Norma e Jorge Cuzzi

"Tem dias que eu fico pensando na vida, e sinceramente não vejo saída.

Como é por exemplo que dá pra entender? A gente mal nasce e começa

a morrer. Depois da chegada vem sempre a partida, porque não há

nada sem separação. Sei lá, Sei lá... A vida é uma grande ilusão. Sei lá,

sei lá... A vida tem sempre razão. A gente nem sabe que males se

apronta fazendo de conta, fingindo esquecer que nada renasce antes

que se acabe e o sol que desponta tem que adormecer. De nada adianta

ficar-se de fora a hora do sim é o descuido do não. Sei lá, sei lá... Só sei

que é preciso paixão. Sei lá, sei lá... A vida tem sempre razão."

Viníciu de Moraes

AGRADECIMENTOS

Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo e à Unidade de Biologia e Genética Médica do Departamento de Biologia Celular,

Fisiologia e Imunologia da Universidade Autônoma de Barcelona que, em parceria,

proporcionaram a estrutura necessária para a realização deste trabalho.

Às instituições de fomento a pesquisa, CAPES (bolsa de doutorado, CAPES/PROEX),

CNPq (bolsa de doutorado sanduíche, SWE) à FAEPA-HC/ FMRP pelo suporte financeiro

necessário para minha formação profissional e realização desse trabalho.

À Profª. Drª. Lúcia Martelli, por todo o trabalho desenvolvido, pela orientação e

ensinamento. Mais do que tudo, pelo carinho e a amizade cultivada nestes sete anos de

convivência.

A la Profª. Drª. Joaquima Maria Navarro Ferreté, además de todo el conocimiento que

trabajar con ella me ha proporcionado, agradezco por recibirme de forma tan abierta y por

haberse preocupado siempre con mis necesidades profesionales y personales. Por todo el cariño y

amistad, muchas gracias.

Al Prof. Dr. Jordi Benet, agradezco por su presencia siempre muy agradable, por haber

enriquecido mis conocimientos tanto científicos como culturales, gastronómicos y enológicos.

Ao Prof. Dr. Raysildo Barbosa Lobo e a Profª. Drª. Ester Silveira Ramos, pela contribuição

para minha formação acadêmica e por favorecerem os projetos científicos desenvolvidos no

Bloco C do Departamento de Genética da FMRP/USP.

Ao Prof. Dr. Péricles Assad Hassun Filho, pela parceria estabelecida que possibilitou a

realização deste trabalho e nos permitirá desenvolver novos projetos na área de genética

reprodutiva.

Aos Profs. Drs. Silvana Giuliatti e Ademilson Espencer Egea Soares pela disposição com a

qual realizam seu trabalho junto a pós-graduação deste departamento. Agradeço especialmente

por toda ajuda burocrática referente a minha bolsa sanduíche.

Aos Profs. Drs. Leila Montenegro Silveira Farah e Rui Alberto Ferriani por serem sempre

atenciosos e colaborarem de forma especial para a minha formação.

Ao Sílvio Avelino dos Santos, por ter estado sempre presente, sem a sua ajuda a realização

desse trabalho teria sido muito mais difícil.

Luiz Antonio Framartino Bezerra, Marco Pinto Corrado, Maria Aparecida Oliveira Silva

Elias, Marli Aparecida Vanni Galerani, Reginaldo Aparecido Vila, Sebastião Paulo Framartino

Bezerra e Susie Adriana Penha Nalon, obrigada por estarem sempre dispostos a me auxiliar.

À todos os pós-graduandos e estagiários do Bloco C do Departamento de Genética da

FMRP/USP, pelo agradável convívio e sugestões muitas vezes oportunas.

À Lucimar Laureano e à Maria Lúcia Machado, pelo auxílio técnico e pela simpatia com que

sempre me trataram.

À Comissão Organizadora do XII Curso de Verão em Genética, foi um prazer trabalhar com

vocês. É muito bom saber que mais do que colegas de trabalho, nos tornamos amigos.

Ao Fábio Pablo de Souza, Fernando Biase, Juliana Meola, Luciana Veiga Castelli, Maria

Silvina Juchniuk de Vozzi e Pedro Alejandro Vozzi, agradeço não só pela contribuição

acadêmica, mas principalmente pelos momentos divertidos que compartilhamos.

Dicen de los catalanes que de las piedras hacen panes. Quizá sea verdad, aunque durante el

tiempo que he estado en Barcelona no pude asegurarme de esto, pero otra cosa que ni siempre

dicen de los catalanes y que ya en el primer momento me di cuenta, es como son amigables, por

eso me conquistaron…

A los amigos Mariona, Edmon, Albert, Lidia, Miguel y Gemma por todos los momentos

que tuvimos juntos. Agradezco por tantas risas, cenas, cafés y charlas. Os echo de menos a cada

día.

A todo el grupo de docentes, alumnos y funcionarios de la Unidad de Biologia y Genética

Médica del Departamento de Biologia Celular, Fisiologia y Imunologia de la UAB, por haberme

ayudado siempre tan prontamente, por la convivencia agradable de cada día y claro, por toda la

gastronomía que me han presentado durante estos seis meses.

Aos meus amigos...

Amanda Gonçalves, Ana Carolina Laus, Daniel Dentillo, Dante Gavio, Fabiano Alves,

Juliana Nunes, Maria Fernanda Laus, Mariana Maschietto, Monika Chaves e Paula Nascimento,

agradeço por todos os momentos juntos, por estarem sempre perto mesmo que de longe e

principalmente por todo o apoio que sempre recebi de vocês.

Com todo meu amor, agradeço...

Aos meus pais, por serem simplesmente imprescindíveis. Não sei transformar em

palavras todo o sentimento que tenho por vocês, por hora digo apenas muito obrigada.

Ao melhor de todos os irmãos, tenho muito a agradecer, mas prefiro me limitar à

cumplicidade, lealdade e parceria incondicional. Claro, agradeço também por ter trazido para

nossa família uma pessoa tão especial quanto a Cláudia, que muitas vezes é quem acaba

segurando as pontas. Obrigada.

Ao meu avô, tias e primos, por toda torcida e carinho que dedicam a mim.

Ao Ricardo Rodrigues por me presentear a cada dia com a nossa história. Sou mais feliz

por ter você na minha vida.

RESUMO

CUZZI, J.F. Citogenética-Molecular aplicada ao Diagnóstico Pré-Implantacional de

Aneuploidias Cromossômicas. 2008. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

Os seres humanos apresentam uma baixa capacidade fértil, quando comparados a outras espécies.

Casais com fertilidade comprovada e que tentam ter outro filho, têm somente 25% de chance de

sucesso por ciclo menstrual. O alto índice de morte embrionária contribui de forma significativa

para essa baixa fertilidade. Vários fatores estão relacionados com a perda gestacional prematura,

no entanto as anomalias cromossômicas são as mais importantes. Aproximadamente 70% dos

embriões morfologicamente normais apresentam alterações cromossômicas, sendo que mais de

50% dos embriões em estágio pré-implantacional possuem células aneuplóides. O Diagnóstico

Genético Pré-implantacional é uma forma precoce de diagnóstico pré-natal na qual é possível

detectar anomalias genéticas em oócitos e em embriões humanos. A maioria dos diagnósticos foi

obtida por meio da técnica de FISH (hibridação in situ fluorescente) com o intuito de detectar

anomalias de cromossomos específicos, existindo porém, limitações em relação ao número de

cromossomos que podem ser avaliados simultaneamente. A hibridação genômica comparativa

(CGH) não requer a fixação do núcleo da célula embrionária e é capaz de detectar perdas e

ganhos de seguimentos cromossomos maiores do que 10Mb em um único experimento. O

objetivo deste trabalho foi estabelecer o Diagnóstico Genético Pré-implantacional de

aneuploidias utilizando dois métodos de investigação citogenética molecular: (1) CGH em oócitos

(MII) e nos primeiros corpúsculos polares correspondentes (1CP) e (2) FISH em blastômeros

obtidos de embriões humanos em estágio de clivagem. Na primeira parte deste estudo,

realizamos com êxito, a análise por CGH de 16 células (MII+1CP) procedentes de oito oócitos

maduros e não criopreservados. Observou-se uma taxa de aneuploidias de 25% e os

cromossomos envolvidos foram o 16, 19 e 22. Estes dados sugerem uma associação entre o

tamanho do cromossomo e a freqüência de aneuploidias, o que está de acordo com relatos

anteriores da literatura. No segundo capítulo desta tese, descrevemos um novo protocolo de

FISH para PGD. Com o objetivo de ampliar o número de cromossomos analisados em cada

blastômero, aplicamos um procedimento de hibridações repetidas que permitiu identificar 15

cromossomos por núcleo (n=14). A porcentagem de perda nuclear foi de 35,7% após a primeira

etapa de FISH e 50% após a segunda hibridação. Encontramos um índice de aneuploidias de

100% que pôde ser relacionado às características morfológicas e de desenvolvimento dos

embriões. De acordo com os resultados obtidos concluímos que as técnicas de CGH e o

protocolo de FISH utilizando sondas de oligonucleotídeos foram eficientes, possibilitando maior

acurácia do diagnóstico citogenético pré-implantacional.

ABSTRACT

CUZZI, J.F. Molecular Cytogenetics applied for Primeplantation Diagnosis of

Chromosomal Aneuploidies. 2008. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

Compared with other species for which data is available, human display a low fecundity, couples

of proven fertility that are trying to have another child have only a 25% chance of achieving a

viable pregnancy per menstrual cycle. The high level of embryonic death contributes significantly

to the observed low fecundity. Various factors may cause these early pregnancy failures, but

chromosome abnormality is likely to be the most important. Around 70% of morphologically

normal cleavage stage embryos show chromosomal abnormalities and more than 50% of them

have aneuploid cells. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is an early form of prenatal

diagnosis, which makes it possible to detect genetic disorders in oocytes and human embryos.

Most of the reliable data that has been collected of PGD has been obtained using fluorescent in

situ hybridization (FISH) to detect specific chromosomes. Unfortunately the interphase FISH is

subject to technical difficulties that limit the number of chromosomes that may be simultaneously

assessed. Comparative genomic hybridization (CGH) is technique does not require the

preparation of chromosomes from the sample and in a single experiment reveals gains and losses

of every chromosome segment bigger than 10Mb in size. The purpose of this study was to

establish the Preimplantation Genetic Diagnosis for aneuploidies applying two molecular

cytogenetics methods: (1) CGH in oocytes nuclei (MII) as well in theirs first polar body (1PB)

and (2) FISH in single blastomeres of cleavage-stage human embryos. In the first part of this

study, we have successfully performed CGH analysis of 16 cells (MII + 1PB) derived from eight

matured and non criopreservated oocytes. The aneuploidy rate was 25%. The involved

chromosomes were 16, 19 and 22, like previous reports of CGH conducted on 1PB, we found

relation between chromosome size and aneuploidy frequency. In the second chapter of this

thesis, we describe a new FISH protocol for PGD. In order to increase the number of

chromosomes examined in each blastomere we have developed repeated hybridization procedure

by which 15 chromosomes could be analysed per nucleus (n=14). The percentages of nuclear loss

was 35,7% after the first FISH and 50% after de second round. We found a 100% rate of

aneuploidies. It could be related to embryo developmental and morphological characteristics.

According to our point of view, results reported here had shown the reliability of the single cell

CGH and oligonucleotides probe FISH improving the preimplantational cytogenetic diagnosis

accuracy.

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Aplicação Clínica do PGD para doenças monogênicas, modificado de FRAGOULI et

al., 2007.

TABELA 2: Reagente utilizados no procedimento de DOP –PCR.

TABELA 3: Reagentes utilizados na marcação por Nick Translation.

Tabela 4: Resultado obtido pela técnica de CGH aplicada a 8 oócitos. ** : Oócitos provenientes

da doadora número 1 e * : Oócitos provenientes da doadora número 5.

Tabela 5: Relação das 15 sondas de DNA e seus respectivos fluorocromos, utilizadas no

diagnóstico pré-implantacional.

Tabela 5: Resultados da FISH com sondas de oligonucleotídeos em 161 núcleos interfásicos de

linfócitos cultivados. Experimento controle para as três etapas de hibridação.

Tabela 6: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16,

2, 4, 6, 9q e 12 em 14 núcleos obtidos de 6 embriões. ND = não detectado.

Tabela 7: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16,

2, 4, 6, 9q, 12, 13 e 21 em 3 núcleos.

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação esquemática da divisão meiótica feminina normal e de três mecanismos

responsáveis por erros na segregação cromossômica de oócitos. Figura adaptada de Pellertor et

al., 2005.

Figura 2: Ilustração de cromossomos em metáfase II oocitária. A seta indica uma cromátide que

sofreu divisão precoce. Figura adaptada de Pellestor et al., 2005.

Figura 3: Análise de CGH demonstrando perfil normal. A razão entre as fluorescências verde e

vermelha equivale a aproximadamente 1,0.

Figura 4: Gel de eletroforese mostrando padrões ideais (2-7 e 9-12) e inadequados (1 e 8) para a

amplificação do DNA genômico. C- :Controle Negativo.

Figura 5: Etapas básicas para a realização da Hibridação Genômica Comparativa em células

únicas, neste caso, especificamente 1CP. Imagem cedida por OBR ADORS, 2007.

Figura 6: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 190. (A) Resultado 1CP: 24,X,+22

e (B) Resultado MII: 23,X.

Figura 7: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 191. (A) Resultado 1CP: 24,X,+16

e (B) Resultado MII: 23,-16,+19.

Figura 7C: Exemplo de uma das metáfases analisadas para obtenção do perfil de CGH do oócito

191 (1CP). As setas indicam os cromossomos 16 marcados mais intensamente com fluorocromo

vermelho, o que corresponde a ganho de material genético para este cromossomo.

Figura 8: O gráfico mostra os comprimentos de onda de luzes emitidas pelos fluorocromos

utilizados, evidenciando suas áreas de sobreposição

Figura 9: Primeira etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais

fluorescentes seguem a ordem: A) 20 em Spectrum Far Red; B) X em Spectrum Red; C) 15 em

Spectrum Orange; D) 17 em Spectrum Green; E) Y em Spectrum Aqua e F) Imagem composta, núcleo

euplóide.

Figura 10: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais

fluorescentes seguem a ordem: A) 16 em Spectrum Far Red; B) 3 em Spectrum Red; C) 10 em

Spectrum Orange; D) 8 em Spectrum Green; E) 7 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta, núcleo

euplóide.

Figura 11: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais

fluorescentes seguem a ordem: A) 9q12 em Spectrum Far Red; B) 4 em Spectrum Red; C) 12 em

Spectrum Orange; D) 2 em Spectrum Green; E) 6 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta, núcleo

euplóide.

Figura 12: Série de hibridações em blastômero (número 6, embrião 16BSF). A) Coloração com

DAPI para controle da morfologia; B) Etapa A, três sinais para os cromossomos X (Red), 15

(Orange), 17 (Green), 20 (Far Red) e ausência de sinal para o cromossomo Y (Aqua); C) Etapa B,

dois sinais para os cromossomos 3 (Red), 8 (Green), 16 (Far Red), três sinais para o cromossomo

7 (Aqua) e um sinal para o cromossomo 10 (Orange); D) Etapa C, dois sinais para os

cromossomos 2 (Green), 4 (Red), 6 (Aqua), 12 (Orange) e ausência de sinal para a região 9q12

(Far Red).

SUMÁRIO

RESUMO 11

ABSTRACT 13

LISTA DE TABELAS 15

LISTA DE FIGURAS 16

IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO GGEERRAALL 21

I. EFEITO DAS ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS NA FERTILIDADE HUMANA 22 II. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL (PGD): REVISÃO DA LITERATURA 24 II.1. APLICAÇÕES DO DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL 26 ANÁLISE DE CORPÚSCULOS POLARES 26 ANÁLISE DE BLASTÔMEROS 27 ANÁLISE DE BLASTOCISTO 29 II.2. INDICAÇÕES PARA O DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL 29 SCREENING PARA ANEUPLOIDIAS (PGD-AS) 29 PORTADORES DE TRANSLOCAÇÕES EQUILIBRADAS 30 DOENÇAS MONOGÊNICAS 31

JJUUSSTTIIFFIICCAATTIIVVAA DDAA PPEESSQQUUIISSAA 34

DDIIAAGGNNÓÓSSTTIICCOO GGEENNÉÉTTIICCOO PPRRÉÉ--IIMMPPLLAANNTTAACCIIOONNAALL PPOORR HHIIBBRRIIDDAAÇÇÃÃOO GGEENNÔÔMMII CCAA CCOOMMPPAARRAATTIIVVAA 37

INTRODUÇÃO 38

I.1. NÃO-DISJUNÇÃO CROMOSSÔMICA E ANEUPLOIDIAS DO GAMETA FEMININO 40 CITOGENÉTICA CONVENCIONAL E CARIOTIPAGEM 42 TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA-MOLECULAR 43 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA (CGH) 44

OBJETIVOS 47

MATERIAIS E MÉTODOS 48

I. CASUÍSTICA 48 II. AMOSTRAS 48 III. MÉTODOS 49 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA (CGH) EM CÉLULA ÚNICA: 49 III.1. OBTENÇÃO E ISOLAMENTO DAS CÉLULAS 49 III.2. MEDIDAS PARA EVITAR CONTAMINAÇÃO 50 III.3. LISE CELULAR 51 III.4. AMPLIFICAÇÃO GENÔMICA DA CÉLULA ISOLADA POR DOP – PCR 51 III.5. ELETROFORESE DE COMPROVAÇÃO 52

III.6. MARCAÇÃO DA SONDA 53 III.7. PREPARAÇÃO DA SONDA 55 III.8. LÂMINAS E PREPARAÇÕES METAFÁSICAS 55 III.9. HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA 56 III.10. MICROSCOPIA E ANÁLISE DAS IMAGENS 57

RESULTADOS 60

DISCUSSÃO 65

CONSIDERAÇÕES SOBRE A METODOLOGIA 65 CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA 71 CONSIDERAÇÕES FINAIS 75

CONCLUSÕES 77

REFERÊNCIAS 78

ANEXO A 84

REAGENTES E SOLUÇÕES: 84 1. ISOLAMENTO CELULAR 84 2. LISE 84 3. DOP-PCR 85

UUTTIILLIIZZAAÇÇÃÃOO DDEE SSOONNDDAASS DDEE OOLLIIGGOONNUUCCLLEEOOTTÍÍDDEEOOSS PPAARRAA DDIIAAGGNNÓÓSSTTIICCOO PPRRÉÉ--IIMMPPLLAANNTTAACCIIOONNAALL DDEE AANNEEUUPPLLOODDIIAASS 88

INTRODUÇÃO 89

I.3. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL DE ANEUPLOIDIAS CROMOSSÔMICAS 89 I.2. TÉCNICA DE HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH) 93

OBJETIVOS 97

MATERIAIS E MÉTODOS 98

I. CASUÍSTICA 98 II. AMOSTRA 98 III. MÉTODOS 99 III.1. ISOLAMENTO E FIXAÇÃO DE BLASTÔMEROS 99 III.2. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH) 100 III.2.1.TRATAMENTO DAS LÂMINAS 103 III.2.2. SONDAS E HIBRIDAÇÃO 103 III.2.3. LAVAGENS PÓS – HIBRIDAÇÃO E COLORAÇÃO 104 III.2.4. ANÁLISE CITOGENÉTICA-MOLECULAR 104

IV. RESULTADOS 106

V. DISCUSSÃO 114

I. CONSIDERAÇÕES SOBRE A METODOLOGIA 114 II. CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA 116

REFERÊNCIAS 123

ANEXO B 129

REAGENTES E SOLUÇÕES: 129 ISOLAMENTO CELULAR 129 FIXAÇÃO DE BLASTÔMEROS 129 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE 130

RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS 131

MMAANNUUSSCCRRIITTOO 138

Introdução Geral

21

INTRODUÇÃO GERAL

Introdução Geral

22

I. Efeito das Alterações Cromossômicas na Fertilidade Humana

A probabilidade de sucesso reprodutivo para um casal fértil com faixa etária abaixo de 35

anos é somente 25% de probabilidade de sucesso por ciclo menstrual (WILCOX, 1988). Dados

da literatura sugerem que mais da metade das gestações humanas resultam em perdas fetais,

sendo esta taxa ainda mais elevada com o aumento da idade materna. Isto pode ser evidenciado

nos procedimentos relacionados à reprodução in vitro, onde muitos embriões cessam o

desenvolvimento antes que sejam transferidos para o útero materno. Somente 31% dos embriões

que sobrevivem à transferência, completam a gestação (Society for Assisted Reproductive

Technology and the American Society of Reprodutive Medicine, 2004).

Existem muitos fatores que influenciam negativamente a sobrevida do embrião, mas um dos

mais importantes é a alta incidência de alterações cromossômicas (LOS et al., 2004).

Aproximadamente 0,3% dos nascidos vivos são cromossomicamente anormais sendo que as

alterações mais comuns são as trissomias do cromossomo 21, 18 e 13 além das aneuploidias dos

cromossomos sexuais (HASSOLD and JACOBS, 1984, 1995). Entretanto, acredita-se que a

incidência de aneuploidias durante a concepção e nos primeiros dias pós-fertilização seja duas

vezes maior do que a taxa observada na população de nascidos vivos (HASSOLD & HUNT,

2001). Estudos citogenéticos de embriões em estágio pré-implantacional revelaram que mais da

metade de todos os embriões contém células aneuplóides (VOULLAIRE et al., 2000; WELLS &

DELHANTY, 2000). A maioria das anomalias cromossômicas presentes no período pré-

implantacional não são compatíveis com o desenvolvimento embrionário, impedindo que a

gestação chegue a termo.

De acordo com HASSOLD e colaboradores (1996) grande parte das trissomias e/ou

monossomias detectadas em amostras pré-natais ou em abortos se devem a erros na primeira

divisão da meiose materna. Estudos citogenéticos utilizando a técnica de FISH (hibridação in situ

fluorescente) em embriões mostram que as alterações cromossômicas de novo podem ser

Introdução Geral

23

originadas durante a meiose ou na fase pós-zigótica (HARPER et al., 1995). Para determinar a

origem dessas anomalias, foram estudados marcadores polimórficos de DNA (regiões próximas

ao centrômero) em abortos espontâneos e também em gametas humanos (especialmente oócitos)

por meio de análises citogenéticas (KULIEV et al., 2003). Esses estudos indicaram que a maioria

das aneuploidias humanas constitucionais, viáveis ou não, detectada durante o primeiro trimestre

de gestação e em nascidos vivos, era originária da meiose I materna (ANTONORAKIS, 1991;

NICOLAIDIS & PETERSEN, 1998; HASSOLD & HUNT, 2001). As exceções são a Síndrome

de Turner, na qual o espermatozóide é o gameta nulissômico em 80% dos casos e a trissomia 18,

que se origina majoritariamente na segunda divisão meiótica materna (FISHER et al., 1995;

JACOBS & HASSOLD, 1995; SAVAGE et al., 1998).

Uma possível explicação para este fenômeno é que na meiose materna, o ponto de controle

entre a metáfase I e a anáfase I, que regula o alinhamento correto dos cromossomos no fuso, não

é tão rigoroso como na espermatogênese (LEMARIE-ADKINS et al., 1997). Desta forma,

quando existe um erro neste alinhamento (por exemplo, a presença de um univalente), a meiose

masculina é bloqueada enquanto a meiose feminina tolera este erro e continua, originando

gametas aneuplóides (HUNT, et al., 1995).

O fato da idade materna ser o fator mais importante associado ao aumento de aneuploidias,

também explica porque a maioria dos erros de segregação ocorre durante a primeira divisão

meiótica, já que essa fase pode durar de 10 a 45 anos, enquanto que a segunda etapa da divisão

celular independe da idade da mulher (MILLER & THERMAN, 2001).

A idade materna além de estar correlacionada com um aumento do risco de abortos

(geralmente envolvendo aneuploidias dos cromossomos 15, 16, 22 e X) e do risco de gerar

descendentes portadores de cromossomopatias (que envolvem predominantemente os

cromossomos 13, 18, 21, X e Y), também está associada com a diminuição das taxas de

implantação, provavelmente devido à letalidade de muitas aberrações cromossômicas, e, portanto,

com a diminuição da fertilidade.

Introdução Geral

24

II. Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (PGD): Revisão da Literatura

Estudos citogenéticos por meio da técnica de FISH mostraram que mais de 50% dos

embriões em estágio pré-implantacional possuem células aneuplóides (Munné et al., 1998a).

Considerando que a maioria dessas alterações impede o desenvolvimento embrionário e

conseqüente implantação, a identificação e seleção de embriões geneticamente normais é crucial

para a obtenção de gestações viáveis (Wells & Levy, 2003).

Inicialmente as estratégias utilizadas para identificar, in vitro, embriões cromossomicamente

anômalos eram a seleção segundo a morfologia embrionária (PLACHOT et al., 1990) ou de

acordo com a sua capacidade de alcançar o estágio de blastocisto (MENEZO et al., 1992). No

entanto, aproximadamente 70% dos embriões morfologicamente normais apresentam alterações

cromossômicas (IWARSSON et al., 1999, SANDALINAS et al., 2001) e em torno de 40% dos

blastocistos são cromossomicamente anômalos (MAGLI et al., 1999).

Atualmente, a identificação confiável de embriões euplóides só pode ser determinada pelo

Diagnóstico Genético Pré-implantacional (PGD) O PGD envolve a interação entre as técnicas de

reprodução assistida, a biópsia de blastômero ou do corpúsculo polar e posterior análise da célula

única, possibilitando o diagnóstico de doenças geneticamente herdadas em embriões humanos

(HANDYSIDE et al., 1990; VERLINSKY et al., 1990).

A idéia do diagnóstico genético pré-implantacional é mais antiga do que Louise Brown, a

primeira criança nascida por meio do método de fertilização in vitro (FIV), há 21 anos. Ela teve

origem na década de sessenta, quando foi realizado o primeiro diagnóstico pré-natal para

sexagem de embriões de coelhos no estágio de blastocisto, por GARDNER & EDWARDS.

Entretanto, o PGD só se tornou possível após o desenvolvimento da FIV e da tecnologia

molecular, especificamente dos métodos de amplificação de DNA, incluindo a PCR (reação em

cadeia da polimerase), e da técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH) (VERLINSKY

et al., 2000).

Introdução Geral

25

A aplicação clínica desse método permite proporcionar aos casais com alto risco reprodutivo,

maiores chances de terem filhos não afetados, identificando os embriões portadores de alterações

gênicas ou cromossômicas e evitando que os mesmos sejam transferidos. Segundo LUDWIG e

colaboradores (2001), a técnica permite diminuir o risco de transmissão de alterações genéticas

em mais de 95%.

Os primeiros casos de Diagnóstico Genético Pré - Implantacional em embriões humanos

foram descritos independentemente por HANDYSIDE e colaboradores (1990) e VERLINSKY

e colaboradores. (1990).

HANDYSIDE e seus colaboradores ampliaram seqüências específicas do cromossomo Y

usando a técnica de PCR para determinar o sexo de embriões obtidos de casais com risco de

transmitir doenças recessivas ligadas ao cromossomo X. Somente embriões femininos foram

transferidos e várias meninas saudáveis nasceram após esse procedimento (HANDYSIDE et al.,

1990).

No mesmo ano, VERLINSKY e seus colaboradores descreveram o diagnóstico pré-

concepcional de doenças de herança autossômica recessiva, obtido por análise do primeiro

corpúsculo polar. Os autores adequaram a técnica de PCR para diferenciar oócitos segundo os

genótipos do tipo Z e M, para a deficiência de alfa-1-antitripsina e aplicaram a técnica para casais

com risco de transmitir o genótipo ZZ, responsável pela doença.

Desde as primeiras tentativas na década de noventa, centenas de PGD têm sido realizados,

demonstrando uma crescente aceitação da metodologia por diferentes populações. De acordo

com a classificação determinada pela ESHRE PGD Consortium, o diagnóstico genético pré-

implantacional deve ser dividido em duas categotias: (1) PGD de alto risco, que inclui casais com

anomalias cromossômicas e/ou doenças monogênicas; (2) PGD de baixo risco, que tem por

objetivo aumentar a taxa de implantação em casais com idade materna elevada, perdas fetais de

repetição ou com freqüentes falhas de fertilização in vitro.

Introdução Geral

26

Atualmente, sua indicação mais comum é o screening para aneuploidias em embriões gerados

por mães idosas (SERMON et al., 2007).

II.1. Aplicações do Diagnóstico Genético Pré-Implantacional

ANÁLISE DE CORPÚSCULOS POLARES

Na gametogênese feminina, durante a primeira divisão meiótica, um dos cromossomos

homólogos de cada bivalente segrega para o primeiro corpúsculo polar (1CP) e o outro para o

núcleo do oócito (MII) que se encontra em metáfase II da meiose. Desta forma, conclui-se que o

1CP tem o conteúdo genético complementar ao núcleo MII, o que significa dizer que um

desequilíbrio em MII implicará na alteração recíproca no corpúsculo polar.

Considerando que o 1CP por sofrer extrusão não tem função reprodutiva, a sua biópsia e

posterior análise permitem a caracterização indireta da constituição cromossômica do MII e a

identificação dos oócitos aneuplóides (GITLIN, 2003) sem comprometer a viabilidade do

gameta. Desta forma, a análise do primeiro corpúsculo polar tornou-se um método diagnóstico

atrativo por ser realizado antes da concepção, evitando dessa forma, o desenvolvimento de

embriões afetados (MUNNÉ et al., 1998a; VERLINSKY et al., 1996; DURBAN et al., 2001;

MONTAG et al., 2004; GUTIERREZ-MATEO et al., 2004a)

De fato, esta metodologia apresenta algumas vantagens: em primeiro lugar, a biópsia do 1CP

é realizada no mesmo dia em que a punção folicular, permitindo um prazo de 3 a 4 dias para

realização do diagnóstico antes da transferência embrionária. Além disso, a análise do 1CP por

FISH é de fácil interpretação, se comparada ao blastômero. Isto porque o 1CP, ao sofrer

extrusão, encontra-se estagnado no estágio de metáfase, enquanto os blastômeros, por serem

células proliferativas, podem ser fixados em qualquer fase do ciclo celular dificultando a

Introdução Geral

27

interpretação dos sinais da FISH (PUJOL et al.; 2004). Por último, a análise do 1CP, ao contrário

da análise de blastômeros, não sofre interferência de mosaicismo embrionário, ou seja, mais de

uma linhagem celular no mesmo embrião.

Contudo, a análise do 1CP também apresenta uma série de limitações, iniciando pela

impossibilidade de se avaliar a contribuição genética paterna (WELLS & DELHANTY, 2001).

Ainda que a maioria das aneuploidias detectadas no primeiro trimestre de gravidez tenha origem

na meiose materna, não podemos excluir as originadas na meiose paterna, embora menos

freqüentes. Além do mais, erros de segregação cromossômica durante o processo da segunda

divisão meiótica do oócito não podem ser detectados pela metodologia. Entretanto, já é bem

conhecido que a grande maioria dos erros de segregação é derivada da primeira divisão meiótica

(SHERMAN et al., 1994; FISHER et al., 1995; HASSOLD et al., 1995; PETERSON &

MIKKELSEN, 2000). Na literatura, há autores que indicam a investigação tanto do primeiro

quanto do segundo corpúsculo polar, para que seja possível detectar tanto as alterações

cromossômicas provenientes de erros da segunda divisão meiótica quanto para viabilizar a análise

de mutações originadas da recombinação dos homólogos (VERLINSKY et al., 1999;

RECHITSKY et al., 1999; KULIEV et al., 2003).

ANÁLISE DE BLASTÔMEROS

Trata-se da metodologia mais empregada no PGD (HANDYSIDE et al., 1990; GRIFFIN et

al., 1991; SERMON et al., 2005). Esse procedimento envolve a dissolução de uma região da zona

pelúcida e a aspiração de uma ou, no máximo, duas células embrionárias. A remoção de um

blastômero em embrião com o equivalente de 6-8 células parece não afetar o seu

desenvolvimento, in vitro, para o estágio de blastocisto (HARDY et al., 1990) sendo considerada

uma técnica eficiente (AO & HANDYSIDE, 1995).

Introdução Geral

28

A vantagem mais evidente é que, nesta metodologia, se analisa tanto a contribuição paterna

quanto a materna, pois neste estágio a constituição genética do embrião está completamente

formada; tornando o PGD em blastômeros um método comparável ao diagnóstico pré-natal. Por

outro lado, a desvantagem desta técnica é a coexistência de mais de uma linhagem celular no

embrião (linhagens cromossomicamente normais e linhagens aneuplóides), fenômeno chamado

de mosaicismo embrionário, que tem origem pós-zigótica e que tem sido detectado em uma

porcentagem considerável de embriões (MUNNÉ et al., 1994b; HAPER et al., 1995; MUNNÉ et

al., 1995a; VOULLAIRE et al., 2000; WELLS & DELHANTY, 2000; MALMGREN et al., 2002).

A presença deste mosaicismo dificulta o diagnóstico citogenético pré-implantacional em

blastômeros (MUNNÉ et al., 1994b; 2002), sobretudo nos casos em que apenas uma célula é

analisada. Em 2004, SERMON e colaboradores descreveram a necessidade de um estudo

prospectivo e randomizado que comparasse a viabilidade embrionária quando realizada a biópsia

de uma ou duas células e a incidência de erros no diagnóstico citogenético dos blastômeros.

Atualmente esta questão parece, ainda que de forma preliminar, estar solucionada. GOOSSENS e

colaboradores (2008), após analisarem 3377 embriões, concluíram que a remoção de 2

blastômeros interferia de forma negativa no desenvolvimento embrionário até o estágio de

blastocisto, enquanto a eficiência do diagnóstico por FISH não se alterava. No entanto, as

metodologias moleculares para detecção de mutações causadoras de doenças monogênicas

parecem ser mais eficientes aplicadas a duas células.

Outra desvantagem deste protocolo é que a biópsia do blastômero é realizada no terceiro dia

pós-fecundação. Consequentemente, o tempo para definição diagnóstica é reduzido, quando

comparado com a biópsia do 1CP.

Introdução Geral

29

ANÁLISE DE BLASTOCISTO

Este tipo de biópsia é a mais tardia que se pode proceder. Consiste em cultivar o embrião in

vitro até alcançar o estágio de blastocisto (aproximadamente 5 dias após a fecundação) e remover

de 10 a 30 células. As vantagens são: proporcionar a análise de diversas células e a seleção dos

embriões mais viáveis pela manutenção do seu cultivo até a fase de blastocisto (SANDALINAS et

al., 2001). A principal desvantagem é que não restam mais do que poucas horas após a biópsia

para a realização do diagnóstico, já que segundo o informe do ESHRE PGD Consortium

Steering Commitee (2004), a transferência embrionária deve ser realizada no máximo no 6º dia

pós-fecundação. Além disso, muitos centros de reprodução assistida têm dificuldades para

cultivar os embriões in vitro até blastocisto e, por esta razão, são poucos os centros no mundo que

praticam esta forma de biópsia (BOADA et al., 1998; DE BOER et al., 2004). No Brasil, de

acordo com a legislação do CREMESP (Processo 25784/01), a manipulação de blastocistos

humanos é considerada ilícita.

II.2. Indicações para o Diagnóstico Genético Pré-Implantacional

SCREENING PARA ANEUPLOIDIAS (PGD-AS)

É a aplicação mais freqüente do PGD (ANDERSEN et al., 2008). As anomalias

cromossômicas numéricas estão relacionadas tanto com falhas de implantação quanto com morte

e perda embrionária resultando em abortos espontâneos. A incidência de anomalias

cromossômicas é de 1,4% em embriões de mães com até 34 anos de idade e aumenta para 52,4%

em mulheres entre 40-47 anos (MÁRQUEZ et al., 2000). Estes dados confirmam o que já foi

mencionado, que mulheres com idade avançada têm um risco aumentado de conceber embriões

Introdução Geral

30

aneuplóides (MUNNÉ et al, 1995a). Da mesma forma, também foi detectada uma incidência

elevada de alterações cromossômicas em embriões de casais jovens com mais de três falhas de

implantação (>55% de embriões são aneuplóides) e em casais com pelo menos dois abortos

espontâneos (>68%) (GIANAROLI et al.,2001).

SHAHINE & CEDARS (2006) questionaram se a aplicação do PGD-AS em gametas e

embriões poderia ajudar a aumentar as taxas de implantação e gestação em casais com idade

materna elevada, em casais com falhas recorrentes de implantação, em mulheres que apresentam

abortos espontâneos de repetição e também em casais portadores de translocação equilibrada

para detectar alterações dos cromossomos envolvidos no rearranjo (MUNNÉ et al., 1999;

GIANAROLI et al., 2002; MUNNÉ et al., 2002; KULIEV et al., 2003; PUJOL et al., 2003).

Baseados em dados de 20.000 ciclos de PGD, KULIEV & VERLINSKY (2008) relataram que

apesar da necessidade de se realizar um estudo controle randomizado para quantificar o impacto

clínico da pré-seleção de embriões euplóides, o efeito positivo do PGD-AS é evidente quando

comparadas as taxas de sucesso reprodutivo dos mesmos pacientes, antes e depois da realização

do diagnóstico.

Dados da literatura descrevem uma variedade de técnicas empregadas na detecção de

aneuploidias em células únicas, porém a metodologia mais utilizada no PGD-AS é a hibridação in

situ fluorescente (FISH) para estudo de 5 a 9 pares cromossômicos (MUNNÉ et al., 1998a;

KULIEV et al., 2003; WILTON et al., 2003a; MONTAG et al., 2004).

PORTADORES DE TRANSLOCAÇÕES EQUILIBRADAS

As translocações recíprocas caracterizam-se pela troca de fragmentos de DNA entre

cromossomos. Entre essas estão as translocações do tipo robertsonianas que consistem na fusão

dos braços q de dois cromossomos acrocêntricos. Os portadores de translocações equilibradas,

Introdução Geral

31

apesar de aparentemente saudáveis, apresentam um risco maior risco de gerar descendentes

portadores de cariótipos desequilibrados, anomalias congênitas e deficiência mental. Além do

mais, freqüentemente apresentam abortos recorrentes e infertilidade.

Nesses casos, o objetivo do PGD nestes casos é reduzir a incidência dos abortos espontâneos

e obviamente, minimizar o risco de nascimento de um bebê com cariótipo desequilibrado.

Inicialmente, o diagnóstico pré-implantacional de translocações se dava pelo uso da FISH com

sondas de pinturas cromossômicas sobre 1CP fixados em lâmina (MUNNÉ et al., 1998c;

DURBAN et al., 2001). No entanto, esta estratégia não detectava as translocações de origem

paterna. Atualmente, o PGD para casais com translocações é realizado em blastômeros fixados

(MUNNÉ, 2002).

No caso das translocações robertsonianas, a abordagem metodológica é bastante simples, já

que para chegar ao diagnóstico, basta aplicar duas sondas locos específicas de diferentes cores,

uma para cada cromossomo envolvido. No entanto, no caso das translocações recíprocas, o PGD

é um pouco mais complicado já que cada translocação apresenta pontos de quebra específicos e

únicos para aquela família. Em cada caso, cabe estudar as translocações separadamente e

identificar 3 sondas com cores diferentes, para proceder o diagnóstico (SERMON et al., 2004).

Além disso, a combinação destas sondas, apesar de poder distinguir os embriões

cromossomicamente equilibrados dos não equilibrados, não permite distinguir entre os embriões

portadores da translocação equilibrada e os normais, que seriam preferencialmente transferidos

para evitar a herança da translocação (MUNNÉ et al., 1998b).

DOENÇAS MONOGÊNICAS

O primeiro PGD publicado teve por objetivo a sexagem embrionária com o intuito de evitar

a transmissão de doenças recessivas ligadas ao cromossomo X (HANDYSIDE et al., 1990). No

Introdução Geral

32

entanto esta estratégia implica na não transferência de embriões masculinos apesar de 50% deles

não serem afetados pela doença além da transferência de 50% de embriões femininos que podem

ser portadores da mutação.

Atualmente, as técnicas de diagnóstico molecular permitem a detecção direta das mutações

responsáveis por algumas doenças ligadas ao cromossomo X (hemofilia A, distrofia muscular de

Duchenne, X-frágil, retinite pigmentar, entre outras), além da detecção de mutações causadoras

de doenças autossômicas recessivas (fibrose cística, β-talassemia,Tay-Sachs, anemia de Fanconi,

etc.) e de doenças autossômicas dominantes acarretam um rico de 50% de ser transmitida para a

descendência (por exemplo, síndrome de Marfan, distrofia miotônica e corea de Huntington)

(Tabela 1).

DOENÇA NÚMERO DE CICLOS

Fibrose Cística

69 β- Talassemia 53 β- Talassemia + Seleção de HLA 8 Atrofia Espino-Muscular 29 Amenia Falciforme 9 Corea de Huntigton 90 Distrofia Miotônica tipo I 67 Polipose Adenomatosa 9 Síndrome de Marfan 8 Distrofia Muscular de Duchenne 17 Distrofia Muscular de Becker 4 Hemofilia 14 Síndrome do X-Frágil 27 Outras 112 Total 516

Tabela 1: Aplicação Clínica do PGD para doenças monogênicas, modificado de FRAGOULI et al., 2007.

A técnica mais utilizada para a detecção direta das mutações é a PCR (reação em cadeia da

polimerase). Paralelamente, deve ser feita a detecção de STRs (seqüências repetiras em tandem)

que permite um diagnóstico indireto e desempenha o papel de controle interno de contaminação.

O PGD em geral, e a PCR em células únicas em particular, são procedimentos que requerem um

Introdução Geral

33

trabalho muito especializado, o que reduz o número de centros capacitados para investigar e

desenvolver os testes específicos para diferentes mutações.

Mesmo assim, a lista de doenças monogênicas diagnosticadas em período pré-implantacional

tem aumentado pouco a pouco (SERMON, 2007).

JUSTIFICATIVA DA PESQUISA

Justificativa da Pesquisa

35

Trata-se de um estudo que permite o aprimoramento de técnicas citogenéticas utilizadas para

diagnóstico pré-implantacional. Este procedimento, além de diminuir a porcentagem de falhas de

implantação embrionária e possibilitar o nascimento de crianças não afetadas por

cromossomopatias, possibilita a investigação de fatores responsáveis pelo desenvolvimento

embrionário, como mecanismos de segregação cromossômica e a correlação genótipo/ fenótipo.

O primeiro passo para a definição do diagnóstico pré-implantacional em nosso laboratório

foi a sistematização de um protocolo para detecção de aneuploidias cromossômicas pela técnica

de FISH a partir da biópsia de blastômeros. Esta sistematização resultou na dissertação de

mestrado intitulada “Diagnóstico Genético Pré-Implantacional de Aneuploidias Cromossômicas”

que foi o primeiro projeto de pesquisa, encaminhado e aprovado pelo CONEP (663/2003),

envolvendo embriões humanos viáveis, em estágio pré-implantacional, para definição do

diagnóstico citogenético.

Posteriormente, consideramos que a aplicação das sondas de oligonucleotídeos em

blastômeros fixados tratava-se de uma opção viável para a análise de um grande número de

aneuploidias (15 cromossomos) por meio da técnica de FISH. Desta forma, padronizar este

protocolo significaria ampliar o screening de alterações numéricas em blastômeros de forma rápida

e economicamente viável.

Devido à experiência metodológica, aos resultados obtidos após investigação de casais de

risco para diagnóstico de rearranjos cromossômicos herdados, além da discussão por nosso grupo

de pesquisa sobre os aspectos éticos e as limitações técnicas da FISH, consideramos que o

diagnóstico pré-implantacional de oócitos pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa

(CGH) contribuiria não só para o conhecimento dos mecanismos de segregação meiótica como

também para melhores resultados das técnicas de reprodução assistida.

Justificativa da Pesquisa

36

Sendo assim, decidimos trabalhar concomitantemente com as duas metodologias, FISH e

CGH em célula única, para aperfeiçoamentoe precisão do Diagnóstico Genético Pré-

Implantacional de aneuploidias cromossômicas.

Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética local (CEP, HC/FMRP-USP) e pela comissão

nacional de ética em pesquisa (CONEP- Ministério da Saúde) recebendo o número de processo

HCRP 14587/2006.

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL POR

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA

Introdução

38

INTRODUÇÃO

Vários estudos descritos na literatura sugerem que a meiose materna é mais suscetível a erros

cromossômicos do que a paterna. Análises citogenéticas de oócitos humanos não fertilizados

revelaram dois principais mecanismos de não-disjunção. O primeiro foi proposto por ANGELL

(1991), cujas observações indicaram que o desequilíbrio cromossômico seria causado por uma

pré-divisão do centrômero antes da anáfase I, favorecendo uma segregação ao acaso das

cromátides irmãs para cada célula-filha. O segundo envolve a segregação do par de cromossomos

homólogos para o mesmo pólo durante a primeira fase de meiose, gerando células-filhas

dissômicas e nulissômicas (ZENZES & CASPER, 1992).

Diversas técnicas de análise citogenética têm sido utilizadas para estudo de oócitos e

corpúsculos polares. Dentre elas, estão o bandeamento cromossômico (VEIGA et al., 1987;

KAMIGUCHI et al.,1993; PELLESTOR et al., 2003), a hibridação in situ fluorescente (FISH)

(DAILEY et al., 1996; MAHMOOD et al., 2000; CUPISTI et al., 2003; PUJOL et al., 2003), o

cariótipo espectral (SKY) (SANDALINAS et al., 2002) e a FISH multicolorida (M-FISH)

(CLYDE et al., 2003). Os resultados obtidos com estas investigações confirmam a relação direta

entre o avanço da idade materna e o processo de não disjunção meiótica (SANDALINAS et al.,

2002; PELLESTOR et al., 2003).

A constatação de que algumas aneuploidias são mais freqüentes do que outras (MAHMOOD

et al., 2000; CUPISTI et al., 2003) indicava que um terceiro mecanismo pudesse explicar as

aneuploidias de origem materna. Trata-se da presença de uma linhagem celular trissômica nas

gônadas de algumas pacientes, caracterizando o mosaicismo gonadal ou germinativo

(MAHMOOD et al., 2000; CUPISTI et al., 2003; PUJOL et al., 2003).

As incidências relatadas de anomalias cromossômicas detectadas em oócitos e corpúsculos

polares são muito variáveis. PELLESTOR e colaboradores (2003) descreveram uma taxa de 11%

de aneuploidia em oócitos na fase II da meiose (MII) analisados por bandeamento R. Por outro

Introdução

39

lado, os achados de KULIEV e colaboradores (2003) em diagnósticos realizados por FISH em

corpúsculos polares e oócitos de mães com idade elevada revelaram 52,1% de aneuploidia. Esta

variabilidade de resultados deve-se a vários fatores, tais como a faixa etária do grupo analisado, a

história clínica das pacientes e o tipo de amostra que inclui oócitos maduros não fertilizados, MII

maturados in vitro ou apenas corpúsculos polares. Segundo PICKERING e colaboradores (1988),

a maturação in vitro de oócitos pode causar alterações morfológicas no fuso celular promovendo o

aumento da taxa de aneuploidia nestes oócitos. Além disso, embriões provenientes de oócitos

maturados in vitro têm uma incidência relatada de anomalias superior à encontrada em embriões

originados de oócitos maturados in vivo (DE SCISCIOLO et al., 2000).

Entretanto, o parâmetro técnico mais importante nesta variação é que a metodologia

empregada requer a fixação dos núcleos em lâminas de vidro, o que aumenta o risco de perda

cromossômica por artefato de técnica. Em geral, as técnicas que envolvem fixação celular em

lâminas são eficientes em diagnosticar casos de hiperploidia, falhando na detecção de

hipoploidias. Com o intuito de superar esta limitação técnica, Wells e colaboradores (1999) e

WELLS & DELHANTY (2000) descreveram e aprimoraram a aplicação da Hibridação

Genômica Comparativa (CGH) (KALLIONIEMI et al., 1992) em célula única.

Algumas dificuldades da técnica de CGH e alguns pontos críticos devem ser analisados,

como a qualidade das metáfases na lâmina, a qualidade do DNA que será usado como sonda, a

marcação desse DNA, a eficiência dos supressores das seqüências de DNA repetitivo, a qualidade

do equipamento utilizado e, principalmente, o tempo despendido até a emissão do resultado final.

Além disso, a supressão de seqüências de DNA repetitivo pelo Cot-1 DNA é um ponto

fundamental para realização da técnica, uma vez que essas regiões poderiam ser erroneamente

classificadas como regiões de amplificação pelo software que analisa os resultados obtidos após a

hibridação. Apesar dessas limitações, até o momento, a técnica de CGH é a única ferramenta

viável para determinação de ganhos ou perdas de regiões cromossômicas envolvendo os 24 pares

de cromossomos (WELLS et al., 1999; WELLS & DELHANTY et al., 2000).

Introdução

40

I.1. Não-Disjunção Cromossômica e Aneuploidias do Gameta Feminino

Foram descritos dois principais mecanismos causadores de aneuploidias:

Não-disjunção de bivalentes em meiose I

Este é o modelo clássico e define-se pelo ganho ou perda de um univalente (cromossomos

com cromátides duplicadas) (ZENZES et al., 1992; KAMIGUCHI et al., 1993; DAILEY et al.,

1996) (Figura 1)

Separação precoce de cromátides irmãs

Explica o ganho e a perda de cromátides. Este modelo foi proposto por Roslyn Angell em

1991 ao observar cromátides extras em fixações de oócitos em metáfase II (MIIs). A pré-divisão

de cromátides irmãs pode ser equilibrada ou desequilibrada, podendo ou não causar perdas e

ganhos de material genético (Figura 1). A separação prematura das cromátides é comumente

observada em síndromes de instabilidade e estudos em células somáticas sugerem que a base

desse fenômeno são erros no processo de checkpoint (MATSUURA et al., 2000). Recentemente foi

identificada uma nova classe de proteínas nucleares, responsáveis pelo funcionamento do fuso

meiótico e pela progressão da anáfase, chamadas coesinas. Essas proteínas são altamente

conservadas e promovem a coesão entre as cromátides irmãs, se opondo a força de tração

exercita pelos microtúbulos e estabilizando os pontos de recombinação (quiasmas) durante a

meiose. A perda dessas coesinas durante a meiose I pode ser responsável pela separação precoce

das cromátides irmãs observada em MII (PELLESTOR et al., 2005). Esse evento parece ser

dependente da idade materna.

Introdução

41

Figura 1: Representação esquemática da divisão meiótica feminina normal e de três mecanismos responsáveis por erros na segregação cromossômica de oócitos. Figura adaptada de Pellertor et al., 2005.

Introdução

42

I.2. Análise Citogenética de Oócitos (MII) e Corpúsculos Polares

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL E CARIOTIPAGEM

No ano de 1966 foi descrita por TARKOWSKI a primeira técnica para fixação de oócitos de

mamíferos. Na década de 80, a adaptação desta técnica permitiu a realização e publicação de um

grande número de estudos em oócitos humanos. No entanto, estes estudos mostraram uma

quantidade exagerada de monossomias (17.5%) se comparada com o número de trissomias

(8.5%) fato que indicava a elevada incidência de perdas de cromossomos por artefato de técnica

(MIKAMO & KAMIGUCHI, 1983). Além disso, a morfologia particular dos cromossomos em

MII (Figura 2), com cromatina muito condensada e as duas cromátides irmãs bem separadas,

dificulta a identificação individual dos cromossomos que ao serem corados com Giensa podem

apenas ser classificados segundo o método de Denver , em 7 grupos de acordo com tamanho e a

posição do centrômero (PELLESTOR, et al., 2006).

Figura 2: Ilustração de cromossomos em metáfase II oocitária. A seta indica uma cromátide que sofreu divisão precoce. Figura adaptada de Pellestor et al., 2005.

Introdução

43

TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA-MOLECULAR

O uso das técnicas de citogenética molecular tem favorecido os estudos em oócitos humanos.

Baseadas na utilização de diversos tipos de sondas de DNA (centroméricas, locos específicas ou

pinturas cromossômicas) e associadas a diferentes fluorocromos, essas metodologias vêm se

aprimorando com a evolução dos microscópios e dos sistemas de captura. Atualmente, as

técnicas de citogenética molecular constituem tanto protocolos de pesquisa quanto de

diagnóstico, adicionando sensibilidade e especificidade aos resultados obtidos por citogenética

convencional. Muitas dessas técnicas têm sido utilizadas com sucesso para screening de gametas

femininos, já que permitem estudar paralelamente oócitos e corpúsculos polares.

A hibridação in situ fluorescente (FISH) se tornou a técnica padrão para a avaliação de

aneuploidias, sendo possível analisar de duas a nove sondas cromossomo-específicas divididas em

uma, duas ou três etapas de hibridação (PUJOL et al., 2003). A FISH, assim como as técnicas de

citogenética convencional, depende da fixação do núcleo MII e portanto pode sofrer perdas de

cromossomos. Cabe destacar que o número de cromossomos que pode ser analisado em cada

etapa está ligado ao número limitado de fluorocromos disponíveis e à possibilidade de

sobreposição dos sinais (WELLS & LEVY, 2003; WILTON, 2005). Em resumo, na melhor das

possibilidades, é possível analisar somente 5 cromossomos em cada hibridação. Além disso, a

quantidade de vezes que o material genético pode ser hibridado também é limitada, sendo

observada perda considerável na qualidade da amostra a partir da terceira denaturação (LIU et al.,

1998). Outra limitação da FISH é que as informações obtidas referem-se à região de hibridação

da sonda e não a todo o cromossomo.

Limitações semelhantes são encontradas nas metodologias de PRINS (primed in situ labelling)

e PNAs (peptide nucleic acid) que tiveram suas aplicações ao PGD descritas por PETIT et

al.(2000) e PAULASOVA et al. (2004), respectivamente.

Introdução

44

Com o intuito de superar a limitação da FISH convencional, PRINS e PNAs, quanto ao

número de cromossomos analisados, alguns estudos relataram o uso de técnicas de FISH

multicolorida, como M-FISH (multiple-FISH), SKY (spectral karyotyping) e cenM-FISH no

diagnóstico de aneuploidias em núcleos MII (MARQUEZ et al., 1998; CLYDE et al., 2001 e 2003;

SANDALINAS et al., 2002). No entanto, são técnicas que exigem metáfases de ótima qualidade e

principalmente sem sobreposição dos cromossomos. Este fato fez com que grande parte do

oócitos fixados fosse descartada justificando assim, o tamanho reduzido das amostras nos

trabalhos citados.

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA (CGH)

Esta metodologia permite detectar desequilíbrios no número de cópias de qualquer

cromossomo em apenas uma hibridação, sem a necessidade de fixar o material genético ou

empregar algum método de coloração para visualizar os cromossomos metafásicos.

A técnica de CGH foi primeiramente descrita por KALLIONIEMI e colaboradores em 1992

no estudo de DNA tumoral. Ela consiste na marcação do DNA teste com um fluorocromo

vermelho, que é misturado em uma razão de 1:1 com DNA normal marcado com um

fluorocromo verde. Ambos são hibridados em preparações metafásicas humanas normais fixadas

em uma lâmina controle. O DNA normal e as metáfases são obtidos de um voluntário saudável.

Os fragmentos de DNA marcados em verde e vermelho competem pela hibridação em seus

locos de origem na preparação metafásica. A proporção de fluorescência verde e vermelha

medida ao longo do eixo cromossômico representa perda (razão < 1) ou ganho (razão > 1) de

material genético na região específica da célula analisada. As metáfases são observadas com

auxílio de um microscópio de epifluorescência e as imagens obtidas são analisadas por softwares

(Figura 3).

Introdução

45

A primeira aplicação da CGH no diagnóstico pré-implantacional foi descrita em blastômeros

(VOULLAIRE et al., 2002). Neste caso, a biópsia deve ser realizada no terceiro dia após a

fecundação, sendo imprescindível a criopreservação dos embriões biopsiados até que se obtenha

o resultado da CGH. Após o diagnóstico, os embriões são descongelados e transferidos para o

útero materno em um ciclo posterior. Este procedimento foi aplicado com sucesso em mulheres

com falhas repetidas de implantação (WILTON et al., 2001) e apresentou taxas de implantação e

de gestação superiores às obtidas após PGD-FISH (WILTON et al., 2003). Mesmo assim, esta

estratégia iniciou uma controvérsia considerável (HILL, 2003; MUNNÉ & WELLS, 2003;

VERLINSKY & KULIEV, 2003; WILTON et al., 2003) já que 46% dos embriões não

sobrevivem ao processo de congelamento e descongelamento. Dessa forma, a vantagem de se

analisar todos os cromossomos foi mascarada pela perda de praticamente metade dos embriões

disponíveis.

Atualmente, a técnica de CGH tem sido aplicada ao diagnóstico do primeiro corpúsculo polar

(WELLS et al., 2002; GUTIERREZ-MATEO et al., 2004a, 2004b). A maior vantagem desta

estratégia é que a biópsia do 1CP é realizada no mesmo dia da ICSI, assim desenvolvimento de

um protocolo curto de hibridação permite a análise da CGH em um tempo compatível com a

transferência embrionária (dia +4 ou +5), dispensando a criopreservação do embrião.

No entanto, a técnica de CGH apresenta algumas limitações como: (1) ser capaz de detectar

apenas os ganhos e as perdas de DNA que sejam maiores de 10 Mb; (2) não detectar alterações

de ploidia (triploidia, tetraploidia...) e alterações cromossômicas equilibradas; (3) apresentar

resultados inespecíficos para algumas regiões cromossômicas heterocromáticas tais como,

centrômeros e telômeros, além de mostrar desvios por AT dos perfis correspondentes aos

cromossomos 17, 19 e 22. (KALLIONIEMI et al., 1992). Outro ponto a ser levado em

consideração é a escassez de DNA presente em uma única célula (5-10pg). Considerando que a

quantidade necessária para realizar a CGH é de 200ng-1µg, torna-se imprescindível que o DNA

total da célula seja pré-amplificado aproximadamente 40.000 vezes (WELLS & LEVY, 2003).

Introdução

46

Figura 3: Análise de CGH demonstrando perfil normal. A razão entre as fluorescências verde e vermelha equivale a aproximadamente 1,0.

Objetivos

47

OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho foram:

1. Padronizar e estabelecer a técnica de CGH em corpúsculos polares para

Diagnóstico Genético Preimplantacional.

2. Validação da metodologia por meio do estudo de complementaridade entre

primeiro corpúsculo polar e núcleo oocitário em metáfase II

3. Determinar a freqüência de aneuploidias em Oócitos maduros, não

criopreservados e Primeiro Corpúsculo Polar proveniente de doadoras com

cariótipo normal:

4. Identificar os cromossomos mais freqüentemente envolvidos em aneuploidias

Materiais e Métodos

48

MATERIAIS E MÉTODOS

I. Casuística

O trabalho foi realizado na Unidade de Biologia e Genética Médica do Departamento de

Biologia Celular, Fisiologia e Imunologia da Universidade Autônoma de Barcelona, coordenado

pela Profa Joaquima M. Navarro Ferrete, em colaboração com o Departamento de Genética da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.

Devido às implicações éticas envolvidas na manipulação de gametas humanos, todos os

procedimentos descritos neste trabalho seguiram os preceitos éticos pertinentes à legislação

vigente no país onde foi realizada a pesquisa.

Os oócitos foram doados por cinco mulheres jovens, com faixa etária média de 23 anos, com

idade variando entre 20 e 26 anos, com cariótipo normal. As pacientes foram participantes do

programa de doação de oócitos da Clínica Eugin de Reprodução Assistida (Barcelona, Espanha),

tendo sido submetidas ao mesmo procedimento de estimulação hormonal e punção folicular.

II. Amostras

A amostra caracterizou-se por oito oócitos maduros e não criopreservados provenientes de

cinco doadoras. Em cada oócito foram realizadas duas análises de CGH: a primeira utilizando

DNA do primeiro corpúsculo polar (1CP) que por meio de biópsia foi separado do núcleo

oocitário (MII), no qual se realizou a segunda análise. Assim obtivemos resultados pareados que

serviram de controle para a eficiência da metodologia.


49

III. Métodos

A descrição e o preparo das soluções utilizadas encontram-se no Anexo A.

Hibridação Genômica Comparativa (CGH) em célula única:

A metodologia de CGH empregada neste trabalho baseou-se em GUTIÉRREZ-MATEO e

colaboradores (2004a e 2004b).

Na CGH de células isoladas, o DNA teste foi marcado com um fluorocromo vermelho,

misturado em uma razão de 1:1 com DNA normal marcado com um fluorocromo verde, e

ambos foram hibridados em preparações metafásicas humanas normais (lâmina controle). A

proporção de fluorescência vermelha e verde medida ao longo do eixo cromossômico

representava perda (razão <0,8:1) ou ganho (razão >1,2:1) de material genético na célula do

embrião naquela região específica. A análise foi feita em microscópio de epifluorescência

acoplado a sistema computadorizado. A figura 5 mostra as etapas principais da técnica de CGH

em corpúsculo polar.

III.1. Obtenção e Isolamento das células

Foram utilizadas células isoladas da mucosa oral, núcleos de oócitos em metáfase II (MII) e

primeiro corpúsculo polar oocitário (1CP).

As células da mucosa oral foram obtidas por meio de alguns segundos de enxagüe bucal com

água destilada. A partir dessa suspensão as células foram isoladas procedendo a sucessivas

diluições feitas em placa de Corning com pipetas Pasteur estiradas e sob o controle de um

estereomicroscópio. Desta forma, as células foram transferidas de gota em gota (contendo


50

solução PBS) até que uma única célula em um volume mínino de solução fosse transferida para

um tubo plástico de PCR.

Com relação aos oócitos, obtivemos a separação do 1CP e MII por meio de biópsia utilizando

microscópio invertido com sistema de micromanipulação (Zeiss). Os oócitos foram transferidos

para placas de Corning contendo microgotas de solução PBS. A abertura na zona pelúcida foi

feita de forma mecânica utilizando-se pipetas para biópsia. Após a biópsia, o 1CP e o MII foram

transferidos separadamente para tubos de PCR e permaneceram congelados até o início da etapa

de lise celular.

III.2. Medidas para evitar contaminação

A contaminação proveniente de células do próprio pesquisador, de bactérias e fungos ou de

produtos de PCR é um dos principais problemas no procedimento de amplificação genômica de

células únicas. Algumas das medidas utilizadas para evitar esta contaminação foram:

� Determinou-se uma área no laboratório onde foram manipulados produtos de PCR ou

DNA que não pertencesse aos experimentos em questão.

� Todos os procedimentos foram realizados em sistema de fluxo laminar previamente

desinfetado e esterilizado com luz ultravioleta por no mínimo 30 minutos antes do

procedimento.

� Foi obrigatório o uso de luvas de procedimento sem talco, trocadas freqüentemente.

� Todo material utilizado (placas de Corning, pipetas Pasteur, tubos de PCR...) foram

esterilizados e permaneceram sob luz ultravioleta por 30 minutos antes do início do

procedimento. As soluções também estiveram sob o efeito da luz ultravioleta, com

exceção do óleo mineral.


51

� As pipetas e as estantes para suporte dos tubos plásticos permaneceram dentro do fluxo

laminar e foram de uso exclusivo da amplificação do DNA da célula isolada.

� Foram utilizadas apenas ponteiras com filtro.

� As soluções foram preparadas em condições estéreis e aliquotadas em pequenos volumes

para evitar o excesso de manuseio.

� Controles negativos de contaminação foram rigorosamente utilizados em cada

experimento.

III.3. Lise celular

A lise celular foi obtida pela ação da proteinase K diluída em solução SDS. Foram adicionados

3 µl de solução de lise em cada microtubo e a amostra foi coberta por uma gota de óleo mineral.

Para que ocorresse a ativação da enzima as amostras foram incubadas durante 1h a 37ºC e, para

neutralizar a sua ação, mais 10 minutos de incubação a 95ºC.

III.4. Amplificação genômica da célula isolada por DOP – PCR

O protocolo de CGH utiliza, no mínimo, 200ng de DNA por amostra. O cálculo teórico para a

quantidade de DNA de uma única célula varia de 5 a 10 pg. Dessa forma, o genoma celular foi

amplificado para viabilizar a técnica de hibridação.

A amplificação do DNA genômico foi obtida pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase

com Primer de Oligonucleotídeo Degenerado (DOP–PCR), descrita por Telenius e

colaboradores em 1992. Esta técnica foi posteriormente modificada para a aplicação em células

únicas e análise de CGH (WELLS et al., 1999).


52

Após a reação de amplificação obtivemos uma solução de DNA com 50µl de volume final. O

volume e a concentração de cada reagente utilizado na reação de amplificação estão descritos na

tabela seguinte.

Reagente Composição e Concentração por Reação Volume

Água Água milliQ estéril e filtrada 32,0µl

10x Long PCR Buffer -MgSO4 (Ambion)

1x (a solução 10x contém Tris-HCl 100mM pH=9 e 500mM KoAc) 5,0µl

MgSO4 (Ambion) 1,75mM (solução mãe com 25mM) 3,5µl

dNTPs Mix (1C:1G:1A: 1T) (Ambion)

0,2mM dCTP, 0,2mM dGTP, 0,2mM dATP e 0,2mM dTTP 4,0µl

Primer de DOP 6MW (Roche)

2 M de primer de DOP 5´-GACTCGAGNNNNNNATGTGG-3´ 1,0µl

Super Taq Plus (Ambion) 2,5U 0,5µl

Amostra Célula + aprox.1,0µl de solução de isolamento

+ 3,0 de solução de lise 4,0µl

TABELA 2: Reagente utilizados no procedimento de DOP –PCR.

A amostra foi então homogeneizada e submetida ao programa de PCR: denaturação da

amostra a 94º C por 4,5 minutos, 8 ciclos de 95º C por 30 segundos, 56º C por 1minuto e 72º C

por 3 minutos com uma etapa final de 72º C por 8 minutos. A PCR foi realizada em um

termociclador de gradiente T (Biometra, Goettingen, Germany). Controles negativos foram

incluídos em cada experimento para testar tanto as soluções utilizadas na reação de PCR quanto a

solução salina usada para obtenção da amostra.

III.5. Eletroforese de comprovação

A qualidade do DNA amplificado foi comprovada por eletroforese na qual se utilizou um gel

de agarose com concentração de 1,5%. O gel corado com brometo de etídeo e observado em


53

transiluminador. Os produtos da amplificação do DNA da célula devem parecer um smir com

maior quantidade de fragmentos acima de 600pb, indicando a boa qualidade do DNA obtido

com a amplificação. O tamanho foi determinado por comparação com o DNA marcador de

100pb (Invitrogem).

FIGURA 4: Gel de eletroforese mostrando padrões ideais (2-7 e 9-12) e inadequados (1 e 8) para a amplificação do DNA genômico. C- :Controle Negativo.

III.6. Marcação da sonda

Os produtos da amplificação das células isoladas (tanto DNA teste quanto DNA controle)

receberam a marcação fluorescente pela técnica de Nick Translation.


54

Esta metodologia associa a ação da enzima DNAse I capaz de fragmentar o DNA alvo, e da

enzima DNA polimerase I que segue unindo estes fragmentos. Durante esta polimerização,

nucleotídeos normais (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e também nucleotídeos marcados

fluorescentemente (dUTP) vão sendo incorporados ao DNA. No caso das células ¨teste¨ a

marcação foi feita com fluorescência de Spectrum Red-dUTP (Texas Red, Vysis Downers-Grove,

USA.) enquanto que para as células ¨controle¨ utilizou-se Spectrum Green- dUTP (FITC, Vysis

Downers-Grove, USA). O protocolo utilizado para a marcação das sondas foi ajustado para as

amostras em questão, seguindo as normas do fornecedor (Vysis Inc.). As soluções utilizadas neste

procedimento estão descritas na tabela abaixo.

Reagentes Composição e Concentração por Reação Volume

Nick Translation Enzime

25U de DNAse I e DNA polimerase I 5,0µl

10x Nick Translation Buffer

1x (solução 10x contém Tris-HCl 500mM pH=7,2, MgSO4 10mM e DDT 1mM) 5,0 µl

dNTPs Mix (1C:1G:1A)

0,02mM dCTP, 0,02mM dGTP, 0,02mM dATP (solução inicial de 0,1mM de cada dNTP)

10,0 µl

dTTP 0,01mM dTTP (solução inicial de 0,1mM dTTP) 5,0 µl

dUTP marcado com FITC e TR

0,01 mM Spectrum Green e 5 µM Spectrum Red (solução inicial com 0,2mM FITC e 0,1 TR – por

ser mais intenso compensa na diluição) 2,5 µl

Produto de Amplificação

500-800 ng de DNA 22,5 µl

TABELA 3: Reagentes utilizados na marcação por Nick Translation.

A reação com volume final de 50 µl foi mantida por 1h e 30 min a 15ºC e depois ter a sua

temperatura elevada para 70ºC permanecendo por mais 10 minutos para que as enzimas fossem

inativadas. O tamanho dos fragmentos (sondas) e a incorporação dos fluorocromos são fatores

decisivos na qualidade da hibridação e conseqüente análise dos resultados. Para comprovar a


55

incorporação dos fluorocromos à amostra, pode-se correr um gel de 1,5% agarose e observá-lo

no transiluminador sem passar pela etapa de coloração com brometo de etídeo. A sonda com

qualidade adequada (com aproximadamente 20% de incorporação) já deve conter fluorescência

suficiente permitindo a visualização do smir de DNA.

III.7. Preparação da sonda

Após a marcação fluorescente de DNA, as duas sondas (spectrum red - DNA teste e spectrum

green - DNA normal) foram transferidas para o mesmo tubo plástico. Para finalizar a preparação

da sonda adicionaram-se 5µl de Human Cot-1-DNA (concentração de 1µg/ µl), 0,1x o volume da

solução de acetato de sódio (NaAc) 3M, pH=5,5 e 2,5x o volume de etanol absoluto. Esta

solução foi deixada por no mínimo 1h a -80ºC para precipitação do DNA. Em seguida a amostra

foi centrifugada por 30 minutos a 12000rpm, o sobrenadante foi descartado, permanecendo em

temperatura ambiente para secar. Depois de seco, o pellet de DNA foi ressuspendido em 10µl de

solução de hibridação, permanecendo a 37ºC, até o momento da aplicação da sonda sobre a

amostra.

III.8. Lâminas e Preparações Metafásicas

Para a análise da CGH devem foram consideradas as metáfases que estejam completas, com

cromossomos alongados, sem sobreposições cromossômicas. Com o objetivo de conseguir

melhores preparados metafásicos, foram utilizadas lâminas comerciais da marca Vysis Downers-

Grove, USA contendo metáfases masculinas normais 46,XY. Estas lâminas permaneceram

estocadas em freezer a -20ºC até momento da hibridação. Antes do início das lavagens, as lâminas

foram observadas em microscópio de contraste de fase para que as áreas ideais para a análise

fossem demarcadas com caneta de diamante.


56

III.9. Hibridação Genômica Comparativa

PRÉ-TRATAMENTO, SONDAS E HIBRIDAÇÃO

Metáfases 46,XY fixadas foram desidratadas em uma série de diferentes concentrações de

etanol (70, 85 e 100% por 2 minutos cada). Depois de secas, as lâminas foram denaturadas em

solução de 70% formamida a 73º C por 5 minutos e, imediatamente após, passaram por outra

série de álcoois gelados para evitar a união das cromátides cromossômicas (70, 85 e 100% por 2

minutos cada). Em seguida, as lâminas permaneceram em temperatura ambiente para que

secassem completamente.

As sondas foram denaturadas a 73º C por 10 minutos e aplicadas às lâminas, que foram

cobertas por lamínulas e então seladas. A hibridação ocorreu em câmera única a 37º C por 72h.

LAVAGENS PÓS-HIBRIDAÇÃO

Todos os procedimentos após a hibridação foram realizados em local sem incidência direta

de luz. As lâminas foram lavadas em soluções com alta adstringência, 0,4x SSC/0,3% NP-40 a

73º C por 2 minutos e 2x SSC/0,1% NP-40 por 2 minutos em temperatura ambiente. Em seguida

foram desidratadas em álcool e mantidas à temperatura ambiente para secar. Com estas lavagens

foram feitas com o intuito de remover as hibridações inespecíficas e eliminar os resíduos da

preparação. Este tipo de background pode interferir na análise final comprometendo os resultados.

Finalmente as lâminas foram montadas aplicando-se a solução de DAPI/ Antifade

Vectashield (Vector Labs, Peterborough, UK) e para contrastar os cromossomos e núcleos e

impedir o photobleaching das marcações florescentes. As lâminas foram estocadas a 4ºC e

protegidas da luz.


57

III.10. Microscopia e Análise das Imagens

As preparações metafásicas foram analisadas utilizando um microscópio de epifluorescencia

(Nikon Eclipse 90i) equipado com câmera CCD (charge-coupled device) de alta sensibilidade e filtros

apropriados para a detecção dos fluorocromos empregados.

� Filtro U-MNIBA para captura de emissões de fluorescência verde (Spectrum Green, luz de

excitação com comprimento de onda de 497nm e 524nm de emissão).

� Filtro U-MWIY para captura de emissões de fluorescência vermelha (Spectrum Red, luz de

excitação com comprimento de onda de 592nm e 612nm de emissão).

� Filtro U-MNU para captura de emissões de fluorescência azul (DAPI, luz de excitação

com comprimento de onda de 367nm e emissão de 452nm).

Foram capturadas e, posteriormente analisadas, 10 metáfases por caso utilizando os softwares

Metasystem ISIS-FISH Capture Analysis e Vysis Quips CGH. Para que as metáfases fossem

incluídas na análise deveriam seguir um padrão de confiabilidade:

� Metáfases com cromossomos longos, separados e sem sobreposições.

� Metáfases que apresentassem alta intensidade de fluorescência, sendo a verde e a

vermelha equivalentes.

� Hibridação homogênea (sem grânulos) ao longo dos cromossomos.

� Ausência ou pequena quantidade de artefatos de hibridação ao redor da metáfase ou

sobre os cromossomos.

A captura foi feita de forma seqüencial: primeiramente o sinal correspondente ao DAPI,

depois o spectrum de fluorescência verde e finalmente a fluorescência vermelha. Em seguida,

foram aplicadas as ferramentas do sistema computacional de análise com as quais se

individualizou dos cromossomos, determinando os perfis de hibridação.


58

A média entre as taxas de fluorescência verde/vermelha para cada cromossomo foi

determinada pelo software. Em regiões em que o número de cópias do DNA teste era idêntico ao

DNA normal, o perfil do CGH mostrou uma pequena variação na qual taxa esperada manteve-se

perto de 1,0. Desvios desse valor abaixo de 0,8 (o DNA teste está sub-representado) ou acima de

1,2 (o DNA teste está supra-representado) foram classificados, respectivamente, como perdas e

ganhos.


59

FIGURA 5: Etapas básicas para a realização da Hibridação Genômica Comparativa em células únicas, neste caso, especificamente 1CP. Imagem cedida por OBR ADORS, 2007.

IICCSSII

MII

BBiióóppssiiaa 11CCPP

1CP LLiissee 11CCPP

AAmmpplliiffiiccaaççããoo DDNNAA GGeennôômmiiccoo DDOOPP--PPCCRR

CCCCGGAATTCCGGAAGGNNNNNNNNNNNNAATTGGTTGGGG AApprrooxx.. 77 hhoorraass

NNiicckk TTrraannssllaattiioonn Aprox. 2 horas

CCoonnttrroollee DDOOPP--DDNNAA

11CCPP DDOOPP--DDNNAA

FFIISSHH 4444 hhoorraass

AAnnáálliissee CCGGHH

Resultados

60

RESULTADOS

Foram analisados 8 oócitos frescos (não criopreservados) e maduros (coletados no estágio II

da meiose, ou seja, com 1CP evidente) totalizando 16 procedimentos de CGH, devido a análise

pareada de 1CP e do núcleo MII. As 16 células analisadas foram amplificadas pela técnica de

DOP-PCR apresentando um smear de DNA entre 200 e 4000pb.

A taxa de aneuploidia encontrada na amostra foi de 25%, já que 2 dos 8 oócitos analisados

apresentaram anomalias cromossômicas. Os resultados estão descritos na tabela abaixo.

Oócito Idade da Doadora Resultado 1CP Resultado MII Figuras

190 26** 24,X,+22 23,X 6 (A) e (B)

191 26** 24,X+16 23,X,-16,+19 7(A), (B), (C) 206 20 23,X 23,X 207 20 23,X 23,X 208 20 23,X 23,X 209 20* 23,X 23,X 210 20* 23,X 23,X 211 20* 23,X 23,X

Tabela 4: Resultado obtido pela técnica de CGH aplicada a 8 oócitos. ** : Oócitos provenientes da doadora número 1 e * : Oócitos provenientes da doadora número 5.

Um dos oócitos alterados apresentou ganho do cromossomo 22 (24,X,+22) apenas na análise

do 1CP, ou seja, não houve concordância entre os perfis de CGH quando comparados 1CP e

núcleo MII, que neste caso foi diagnosticado como euplóide (23,X).

No segundo oócito aneuplóide, observou-se concordância parcial dos resultados. Desta vez,

foi detectado ganho do cromossomo 16 no 1CP (24,X,+16) e no núcleo MII, além da

correspondente perda de 16, também foi identificado ganho de 19 e cariótipo final 23,X,-16,+19.

Com relação aos oócitos cromossomicamente normais, todos apresentaram concordância

entre os diagnósticos de 1CP (23,X) e MII (23,X).

Resultados

61

Sendo assim, observou-se: (1) uma taxa de aneuploidia de 25% da amostra; (2) concordância

entre os perfis de 1CP e MII quando euplóides; (3) uma tendência ao ganho cromossômico em

1CP; (4) a não concordância de resultados entre 1CP e MII nos dois casos positivos de

aneuploidias.

Resultados

62

A

B

Figura 6: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 190. (A) Resultado 1CP: 24,X,+22 e (B) Resultado MII: 23,X.

Resultados

63

A

B

Figura 7: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 191. (A) Resultado 1CP: 24,X,+16 e (B) Resultado MII: 23,-16,+19.

Resultados

64

Figura 7C: Exemplo de uma das metáfases analisadas para obtenção do perfil de CGH do oócito 191 (1CP). As setas indicam os cromossomos 16 marcados mais intensamente com fluorocromo vermelho, o que corresponde a ganho de material genético para este cromossomo.

Discussão

65

DISCUSSÃO

Considerações sobre a Metodologia

O primeiro ponto a ser discutido com relação à metodologia é a utilização de material

previamente amplificado para proceder a hibridação genômica comparativa. A maioria dos

protocolos descritos para a amplificação do DNA total de uma célula baseia-se na

utilização de primers degenerados ou parcialmente degenerados e temperaturas de

pareamento baixas, favorecendo uma amplificação totalmente inespecífica (TELENIUS et

al., 1992). Este fato exige que precações no sentido de evitar a contaminação com outros

DNAs que não sejam o da célula. Apesar de estarem descritas várias alternativas para a

amplificação do genoma celular, a técnica que parece se ajustar mais à CGH é a Degenerate

Oligonucleotide Primed PCR (DOP-PCR). Alguns estudos demonstraram que as características

citogenéticas obtidas por DOP-PCR-CGH são equivalentes às obtidas por meio da CGH

convencional, sem amplificação prévia do DNA (HARADA et al., 2000; LARSEN et al.,

2001).

Com relação à marcação da sonda, optou-se pela técnica de Nick Translation como

descrito por GUTIÉRREZ-MATEO e colaboradores em 2004. Esta metodologia permite

cortar a sonda e obter fragmentos de 300-3000pb, correspondente ao tamanho ideal para a

realização da CGH. Segundo a literatura, a marcação com Nick Translation resulta em

hibridações mais homogêneas e com menos background do que as hibridações de sondas

marcadas com DOP-PCR (LARSEN et al., 2001).

Como já citado anteriormente, o tempo desprendido para a realização do PGD é um

fator importante. Desta forma, uma característica a ser considerada no protocolo deste

trabalho é a redução do tempo de hibridação de 72 para 40h realizando uma etapa prévia

de 1h em microondas à 70W de potência. O tratamento com microondas acelera a

Discussão

66

hibridação permitindo a obtenção de sinais intensos, porém em menos tempo (BAHÇE et

al., 2000; GOSÁLVEZ et al., 2002). Os resultados das hibridações com duração de 72h e

40h mais 1h de microondas foram comparados e a intensidade dos sinais parece ser

equivalente (Navarro, comunicação pessoal).

Embora o número de publicações venha aumentando (WELLS et al., 1999; WELLS &

DELHANTY, 2000; GUTIÉRREZ-MATEO et al., 2004a,b; FRAGOULI et al., 2006a,b), a

eficiência e a precisão da técnica de CGH aplicada à análise de células únicas ainda é

controvertida. Por este motivo, foi realizada neste trabalho uma validação da CGH a partir

da análise de complementaridade dos pares 1CP-MII. Este delineamento experimental

garante um controle interno proporcionando informação sobre a confiabilidade dos

resultados (PELLESTOR et al., 2005).

Foram analisados 8 pares 1CP-MII, todos provenientes de mulheres jovens com

cariótipo normal. Observamos discordância entre 1CP e MII em 2 dos 8 pares analisados,

ou seja, 25%. Em um dos casos a análise do 1CP resultou no cariótipo 24,X,+22 enquanto

o complemento MII apresentou perfil normal compatível com o cariótipo 23,X. No outro

caso, detectamos aneuploidias nas duas células, sendo que os resultados foram parcialmente

concordantes, já que o ganho do cromossomo 16 (24,X,+16) observado em 1CP foi

confirmado com a sua correspondente perda em MII. No entanto, também apresentou

ganho para o cromossomo 19 com cariótipo 23,X,-16,+19. Em todos os casos em que o

1CP foi diagnosticado como normal (23,X) o complemento cromossômico encontrado em

MII correspondeu ao cariótipo esperado, também normal (23,X). Este dado representou

75% da amostra.

Há possíveis explicações para este padrão de concordância e discordância entre os

resultados encontrados para 1CP e MII. Com relação ao primeiro caso, com ganho do

cromossomo 22 em 1CP, a análise do CGH de MII evidenciou um desvio no perfil

compatível com perda cromossômica (para a esquerda) que, no entanto não ultrapassou o

Discussão

67

limite de 0,8. Esta falta de concordância pode ser explicada pelo fato de que a capacidade

da técnica de CGH em detectar perdas e ganhos cromossômicos muitas vezes está

relacionada com a quantidade de material genético envolvido na anomalia. Assim, perfis

duvidosos e difíceis de interpretar podem ser gerados, sobretudo, quando a alteração

observada envolver apenas cromátides e não cromossomos inteiros.

GUTIÉRREZ-MATEO e colaboradores (2004) mostraram que a técnica de CGH

aplicada às células únicas é capaz de detectar ganhos e perdas tanto de cromossomos

quanto de cromátides, entretanto distinguir entre os dois resultados é quase impossível. A

não ser em alguns casos de nulissomia (perda do cromossomo), nos quais se observa um

desvio muito pronunciado do perfil da CGH para a esquerda, ultrapassando o limite de 0,5.

Segundo KALLIONEMI e colaboradores (1992) a técnica de CGH permite a

quantificação dos cromossomos inteiros e, portanto, no caso de uma trissomia (ou de um

ganho de cromátide em células haplóides) o desvio teórico esperado para o perfil da CGH

estaria exatamente sobre o limite de 1,5 enquanto que nos casos de tetrassomias (ganho de

um cromossomo completo em células haplóides) este perfil deveria apresentar um desvio

maior posicionando-se sobre o limite com valor igual a 2,0. Os autores descreveram que os

perfis de CGH apresentados foram semelhantes tanto em anomalias de cromátides quanto

de cromossomos, sendo difícil determinar qual o tipo de erro observado. Esses resultados

foram questionados por outros autores que discutem que a CGH nem sempre permite a

quantificação dos ganhos e perdas e que estes perfis teóricos poucas vezes são observados

na prática (LESTOU et al., 1999; VOULLAIRE et al., 2002).

Contudo, é importante destacar que nem todas as falhas de complementaridade podem

ser atribuídas aos erros na interpretação dos perfis da CGH ou à falta de sensibilidade da

técnica. Alterações nos mecanismos de meiose materna e, portanto, implicados na origem

das aneuploidias também devem ser consideradas. Do ponto de vista biológico, existem

duas possíveis explicações para a não concordância em 25% dos pares analisados.

Discussão

68

A primeira explicação foi sugerida por GUTIÉRREZ-MATEO e colaboradores

(2004a) e baseia-se na possível existência de mosaicismo gonadal em algumas pacientes. De

fato, resultados obtidos a partir de FISH em pares 1CP-MII evidenciaram que oócitos

provenientes de mulheres com cariótipo normal, pareciam ter sido originados de linhagens

celulares germinativas trissomicas. Alguns pares mostraram uma cromátide extra tanto no

1CP como no oócito, enquanto outros tinham um cromossomo extra sem a perda

recíproca de material genético na sua célula complementar (MAHMOOD et al., 2000;

CUPISTI et al.,2003; PUJOL et al., 2003).

Já a segunda pode ser discutida com base nos trabalhos de VERLINSKY e

colaboradores (1996, 1999) e KULIEV e colaboradores (2003), que relataram uma grande

quantidade de dados referentes às aneuploidias presentes em primeiro e segundo

corpúsculos polares comparando ao seu complemento MII. Esses estudos demonstraram

que, embora haja uma prevalência de anomalias cromossômicas provenientes da meiose I

(42%), erros tanto na primeira quanto na segunda divisão meiótica contribuam para a

ocorrência de aneuploidias, sendo que uma porcentagem significativa de células (29%)

apresentava alteração nas duas etapas da divisão. Um dado importante relatado pelos

autores foi observação de que entre 30 e 35% dos segundos corpúsculos polares são

aneuplóides. Além disso, 50% dos erros na meiose II foram encontrados em oócitos que

apresentavam alterações prévias na meiose I, resultando assim, em núcleos MII

aparentemente normais. Sendo assim, KULIEV & VERLINSKY sugeriram em 2004 que, a

não disjunção na segunda divisão meiótica deve ser conseqüência de erros ocorridos já na

primeira divisão e que, um mecanismo hipotético para a resolução da aneuploidia poderia

explicar a formação de zigotos cromossomicamente equilibrados por meio de erros

seqüenciais na primeira e na segunda etapa da divisão meiótica feminina.

Cabe lembrar que os pontos discutidos acima, não só esclarecem os motivos pelos

quais não foi observada concordância entre 1CP-MII nos casos onde foram detectadas

Discussão

69

aneuploidias, como também justifica a complementaridade presente nos pares euplóides

(75% dos casos). Desta forma, sugerimos que o diagnóstico do 1CP seja capaz de revelar

informações importantes quanto à condição cromossômica do núcleo oocitário MII, já que

o maior risco desta estratégia está na obtenção de resultados falsos positivos (casos em que

1CP é aneuploide e MII normal) e não em falhas diagnósticas do 1CP. Nossos resultados

mostraram 100% de concordância entre os complementos cromossômicos quando o 1CP

foi diagnosticado como normal.

Esta afirmação vai de acordo com FRAGOULI e colaboradores (2006a), que diz que a

soma dos resultados obtidos por seu grupo com os dados publicados por GUTIÉRREZ-

MATEO e colaboradores (2004a) é suficiente para comprovar a confiabilidade da aplicação

da CGH no estudo de oócitos.

Os resultados falsos positivos exigem algumas considerações. As regiões centroméricas

e as regiões de heterocromatina (1qh, 9qh e 16qh) são partes do genoma de difícil

interpretação e costumam apresentar desvios inespecíficos dos perfis da CGH

(KALLIONEMI et al., 1994). Estas regiões são ricas em seqüências repetitivas e são

bloqueadas durante a CGH pelo Cot-1-DNA, resultando em regiões onde a intensidade de

fluorescência é tão baixa que não pode ser captada de forma adequada pelo software de

análise. Esse fato pode levar a desequilíbrios entre as fluorescências verdes e vermelhas e,

portanto, gerar perfis não confiáveis para estas regiões (MOORE et al., 1997). Além disso,

em relação aos telômeros existe também uma dificuldade do programa em localizar com

precisão o limite final dos cromossomos sendo mais uma justificativa para os perfis

inespecíficos encontrados nessa região (MOORE et al., 1997).

De acordo com LARRAMENDY e colaboradores (1998), um dos mecanismos

responsáveis pelos desvios nos perfis da CGH, nas regiões citadas acima, é a maior

afinidade dos fluorocromos (Spectrum Green e Spectrum Red) por regiões de DNA repetitivo

que não se distribuem homogeneamente pelo genoma. Os autores sugerem que uma

Discussão

70

marcação reversa (ou seja, DNA teste marcado em vermelho e DNA controle marcado em

verde), ou seja, contrária da descrita inicialmente por Kallionemi onde DNA teste foi

marcado em verde e controle em vermelho, poderia diminuir os artefatos da técnica nessas

regiões.

Embora os resultados apresentados neste trabalho tenham sido obtidos por meio da

aplicação da CGH com marcação reversa, as regiões teloméricas e controméricas foram

excluídas da análise, assim como sugerido por KALLIONEMI e colaboradores (1994) e

adotado pela maioria dos grupos que realiza CGH em células isoladas.

Outras regiões de conflito no genoma são a região 1p33-pter, o braço curto do

cromossomo 16 e os cromossomos 17, 19 e 22. Desvios nos perfis da CGH envolvendo

dois ou mais desses cromossomos pode ser indicativo do artefato da técnica e não de

alteração cromossômica real. No entanto, o que se espera é que esses desvios mostrem

igualmente ganho ou perda para todos os cromossomos. A detecção de aneuploidias desses

cromossomos deve ser feita com muita precaução, já que muitas vezes as alterações são

reais e não devem ser desconsideradas. Em nosso trabalho, relatamos ganho do

cromossomo 22 (1CP), ganho do cromossomo 16 (1CP) e perda de 16 associada ao ganho

do cromossomo 19 na mesma célula (MII). Após análise cuidadosa dos perfis, os

resultados foram considerados reais e não artefatos da técnica de CGH. Alguns fatores

auxiliaram neste diagnóstico. O mais importante é o fato de que nas análises para

aneuploidias, perdas e ganhos de regiões cromossômicas não são considerados, ou seja, são

relevantes apenas os desvios envolvendo o cromossomo todo e que ultrapassem o limite

estatístico previamente estipulado (0,8 - 1,2). Dentre os resultados apresentados, o único

que poderia causar dúvida é a perda do cromossomo 16 e o ganho do cromossomo 19 na

mesma célula. No entanto, como discutido anteriormente, os resultados falsos positivos

Discussão

71

envolvendo estes cromossomos deveriam ser caracterizados por ganho ou perda de ambos

e não uma perda e um ganho no mesmo cariótipo.

Considerações sobre a Amostra

A incidência de anomalias cromossômicas varia em função das características do

estudo. Os resultados originados de estudos com FISH variam de acordo com o número e

de quais cromossomos são analisados. PELLESTOR e colaboradores (2006) descreveram

que a taxa de aneuploidias observada em 12 trabalhos, publicados entre 1996 e 2003, nos

quais foram analisados de 2 a 9 cromossomos variou de 3,0 a 45,7 %. Em 5 estudos,

também publicados entre 1996 e 2003, envolvendo de 648 a 7103 corpúsculos polares e 3 a

5 sondas para FISH, a freqüência média de aneuploidias foi estipulada em 42,6%. Certa

variabilidade na taxa de aneuploidias também é observada quando considerados os estudos

que avaliam todo o complemento cromossômico, já que a bibliografia aponta para uma

média de 21% de oócitos aneuplóides após análise por cariótipo convencional, de 20 a

100% de aneuploidias em 4 estudos com SKY e uma média de 69% (48 a 90%) relatada em

dois estudos utilizando DOP-PCR e CGH (PELLESTOR et al., 2005, 2006).

Detectamos uma taxa de aneuploidia de 25% que pode ser considerada baixa, quando

comparada à taxa de 48% descrita por GUTIERREZ-MATEO e colaboradores (2004).

Embora os dois estudos se utilizem da mesma metodologia, o presente trabalho descreve

os resultados encontrados em um número reduzido de oócitos que, no entanto, segue um

padrão rígido de caracterização morfológica, estágio de desenvolvimento, tipo de

maturação, idade materna e ausência de relatos prévios de infertilidade feminina. É

importante considerar que no estudo anterior e em outros trabalhos, foram utilizados

oócitos previamente descartados de ciclos de fertilização in vitro e a maioria provem de

Discussão

72

mulheres inférteis. Dessa forma, a incidência de aneuploidias diagnosticada nesses estudos

não pode ser extrapolada para a população em geral.

Paralelamente, outro estudo realizado no mesmo laboratório e, portanto aplicando a

mesma metodologia em 29 oócitos (1CP e MII) frescos, maduros e provenientes de

mulheres férteis, jovens e com cariótipo normal mostrou taxa semelhante de aneuploidias

(OBRADORS et al., in press).

Todas as técnicas baseadas na fixação do material cromossômico de MII e 1CPs

apresentam uma limitação importante que é a dificuldade em determinar se a perda

cromossômica corresponde realmente a uma hipohaploidia ou se deve ser considerada

como artefato. De fato, a análise dos complementos 1CP e MII determinou que mais de

25% das hipohaploidias detectadas são, na realidade, artefatos de técnica (PUJOL, et al.,

2003). O restante pode ser devido a uma série de mecanismos biológicos como o atraso

anafásico, alterações de citoesqueleto ou a perda de cromossomos na meiose feminina.

A dificuldade em distinguir entre perdas reais e artefato explica porque muitos autores

optaram por estimar uma taxa conservadora para aneuploidias, ou seja, duplicar a taxa de

hiperhaploidias já que as perdas e os ganhos cromossômicos são originados em igual

proporção com resultado de uma segregação independe dos cromossomos entre o núcleo

MII e o primeiro corpúsculo polar (PELLESTOR et al., 2006) No entanto, esta estimativa

poderia não considerar de maneira correta a freqüência real de aneuploidias em oócitos. A

maioria dos estudos relata um excesso de nulissomias em comparação com as dissomias, o

que era geralmente justificado pela incidência de perdas de material genético devido à

fixação do núcleo MII, somada às perdas reais. No entanto, trabalhos recentes, nos quais

foram empregadas as metodologias de FISH e CGH, mostraram que há uma maior

incidência de ganhos cromossômicos em MII e conseqüente perda em 1CP (WELLS et al.,

2002; KULIEV et al., 2003; PUJOL et al., 2003; GUTIÉRREZ-MATEO et al, 2004a).

Discussão

73

Em nosso trabalho, observamos uma tendência a ganhos cromossômicos em 1CP e a

única perda cromossômica observada foi, justamente, no núcleo MII (23,X,-16,+19). Os

dados descritos podem, contar com o suporte de estudo prévio realizado no mesmo

laboratório e seguindo os mesmos critérios para a amostra, que detectou ganho de 11 e

perda de 3 cromossomos em 27 1CPs analisados. Além disso, o mesmo padrão foi

encontrado na análise de 22 primeiros corpúsculos polares biopsiados de oócitos não

criopreservados provenientes de 2 pacientes, jovens e com cariótipo normal, sob

tratamento de reprodução assistida. Dentre os 22 1CP estudados, 12 apresentavam

aneuploidias sendo que apenas 2 foram diagnosticados como perdas e 10 apresentaram

ganhos cromossômicos.

MUNNÉ e colabaoradores (2004) observaram um excesso de monossomias em

blastômeros analisados por FISH, o que comumente é atribuído à hibridação deficiente das

sondas, à sobreposição dos sinais da FISH ou à perda de micronúcleos (HARPER et al.,

1995; MUNNÉ et al.,1998). Além dos fatores biológicos, como erros durante a segunda

divisão meiótica, nulissomia do gameta paterno e erros na divisão pós zigótica (COONEN

et al., 2004; DAPHNIS et al., 2004 ; MUNNÉ et al., 2004).

As aneuploidias encontradas no presente trabalho afetaram os grupos cromossômicos

E (cromossomo 16), F (cromossomo 19) e G (cromossomo 22). Este resultado está de

acordo com os dados da literatura que sugerem uma maior incidência de aneuploidias para

os cromossomos pequenos (GUTIÉRREZ-MATEO et al., 2004a).

Enquanto, a distribuição de aneuploidias em espermatozóides é geralmente homogênea

nos diferentes grupos cromossômicos (PELLESTOR, et al. 1991), os erros na segregação

cromossômica de oócitos e embriões parecem seguir um padrão de freqüência (MUNNÉ et

al, 2004). Os cromossomos são divididos em grupos de acordo com o seu tamanho; os

cromossomos considerados grandes vão desde o 1 até o 12 e incluem o cromossomo X, e

Discussão

74

os cromossomos pequenos compreendem do par 13 até o 22. Outros autores também

observaram que os cromossomos pequenos são mais afetados por erros de segregação

(MAHMOOD et al., 2002; SANDALINAS et al., 2002; WELLS et al, 2002; CUPISTI et al.,

2003; PELLESTOR et al., 2005) já que os mesmos tendem a apresentar menos quiasmas

durante a meiose e já foi descrito que taxas reduzidas de recombinação podem levar à

predisposição da não-disjunção meiótica (THOMAS et al., 2001). Por outro lado, alguns

autores sugeriram a existência de uma relação entre a não-disjunção e o tamanho reduzido

da região de DNA alfa-satélite nos centrômeros (LO et al., 1999; MARATOU et al., 2000).

A divisão precoce das cromátides (pré-divisão) parece refletir o fato de que o tamanho

reduzido da região centromérica (DNA alfa-satélite) dificulta a ação das coesinas

promovendo falhas na coesão entre cromátides homólogas. Por outro lado, a assimetria da

divisão meiótica feminina, resultando em somente um gameta funcional e dois corpúsculos

polares, pode favorecer a segregação meiótica não aleatória dos cromossomos e das

cromátides (PARDO-MANUEL DE VILLENA & SAPIENZA, 2001). Enquanto alguns

estudos mostram que o cromossomo 22 é o mais freqüentemente envolvido em

aneuploidias de oócitos e embriões (SANDALINAS et al., 2002; CLYDE et al., 2003;

MUNNÉ et al., 2004) outros relatam que é o cromossomo 16 que apresenta mais erros

(VOULLAIRE et al., 2002; ABDELHADI et al., 2003; PUJOL et al.,2003). De qualquer

modo, esta variabilidade na não-disjunção indica que erros no processo de segregação na

meiose feminina não são um evento ao acaso e que os dados obtidos pelas análises

citogenéticas dos oócitos humanos são de grande valia para a compreensão deste

mecanismo.

Se fossem comparadas as incidências de aneuploidias para os diferentes cromossomos

em embriões ou em oócitos com a descrita em abortos espontâneos ou nascidos vivos, s

dados seriam discordantes. Isto porque as anomalias dos diferentes cromossomos

apresentam viabilidade variável ao longo do desenvolvimento embrionário

Discussão

75

(SANDALINAS et al., 2001; MUNNÉ et al., 2004). Por exemplo, a aneuploidia para o

cromossomo 22 tem a sua incidência reduzida em 11 vezes desde embriões (24,5%)

(BAHÇE et al, 1999) até abortos espontâneos (2,26%) (SIMPSON, 1990). O mesmo se

observa com relação às aneuploidias para o cromossomo 1, que foram detectadas em 16%

dos embriões (BAHÇE et al, 1999) e apenas um caso de trissomia 1 foi publicado em

gestação de primeiro trimestre (HANNA et al., 1997). Desta forma, as aneuploidias que não

foram detectadas em nascidos vivos trissômicos ou em abortos espontâneos podem ser, na

realidade, comuns no momento da concepção.

Considerações Finais

A técnica de CGH permite a análise confiável de todos os cromossomos permitindo

detecção de não somente das aneuploidias mais freqüentes, como também de todas que

podem interferir negativamente no desenvolvimento do embrião e na sua conseqüente

implantação. Além do mais, a CGH possibilita a detecção real de nulissomias já que esta

técnica não exige a fixação do material genético e, desta forma, evita as perdas

cromossômicas por artefato, possibilitando a análise cromossômica em toda a sua

longitude, o que não é possível por meio da FISH (WELLS & DELHANTY, 2000).

No entanto, o tempo que a metodologia requer, desde a obtenção da célula até a

determinação do resultado, restringe sua aplicação, de forma segura, à análise do primeiro

corpúsculo polar. A utilização do 1CP no PGD, por sua vez, também apresenta limitações.

Em primeiro lugar, não analisar o 2CP impossibilita a detecção dos erros da segunda

divisão meiótica, sendo que já foram descritas taxas similares de aneuploidias originadas

tanto na primeira (41,8%) como na segunda divisão (37,%) (KULIEV et al., 2003).

Também cabe considerar que aproximadamente um terço dos erros da primeira divisão

Discussão

76

meiótica pode ser corrigido durante a segunda divisão e, portanto, avaliar somente o 1CP

seria super valorizar a taxa de aneuploidia destes oócitos (WELLS et al., 2002; KULIEV &

VERLINSKY, 2004). Outra desvantagem é que a análise exclusiva de oócitos não permite

reconhecer as anomalias de origem paterna, ainda que esta contribuição seja baixa, ao redor

de 10%, quando comparada ao total de aneuploidias embrionárias.

Estas limitações poderiam ser solucionadas se as aneuploidias encontradas em 1CP

fossem confirmadas pela análise de um blastômero do embrião proveniente da fecundação

deste oócito pré-avaliado (MAGLI et al., 2004). No entanto, o efeito de duas biópsias no

desenvolvimento embrionário permanece desconhecido.

Uma opção que parece ser cada vez mais viável é a aplicação da CGH no estudo de

blastômeros. Para isto seria necessário desenvolver um protocolo onde houvesse uma

diminuição considerável do tempo, evitando a criopreservação do embrião. Em 2007,

LANDWEHR e colaboradores publicaram um trabalho em que 32 1CP foram analisados

por um protocolo rápido de CGH, no qual foi possível chegar ao resultado após 16 horas

do início do procedimento. Uma metodologia com este tempo de duração possibilitaria

novas aplicações de técnicas de screening genômico, tanto para o diagnóstico pré-natal

quanto para o pré-implantacional.

77

CONCLUSÕES

(1) A técnica de CGH utilizada neste trabalho foi eficaz em avaliar todos os cromossomos

de uma única célula, permitindo avaliar de forma acurada tanto a perda quanto o ganho de

qualquer cromossomo e podendo ser aplicada para screening de aneuploidias em oócitos.

(2) A análise de complementaridade entre 1CP-MII permitiu a avaliação da sensibilidade da

CGH na detecção de ganhos e perdas cromossômicas.

(3) A análise por CGH indicou uma prevalência de aneuploidias envolvendo ganho

cromossômico em 1CP, que pode estar relacionada às características da amostra,

constituída por oócitos maduros e não criopreservados provenientes de doadoras.

(4) As aneuploidias envolveram cromossomos pertencentes aos grupos E, F e G, sendo

concordante com a literatura, que relata uma maior incidência de aneuploidias para os

cromossomos pequenos.

78

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Anexo A

84

ANEXO A

Reagentes e Soluções:

1. ISOLAMENTO CELULAR

Solução de Isolamento: tampão fosfato (PBS)-0,1% polivinil álcool (PVA)

Foi preparada uma solução 10x PBS livre de Ca+2 e Mg+2 (80g de NaCl; 25,08g de

Na2HPO4 dihidratado, 2g de KCl e 1,5g de KH2PO4 dissolvidos em 1l de água miliQ). Esta

solução foi então autoclavada com pH ajustado para 7,2. Partindo da dessa concentração

foi feita uma diluição 1/10 adicionando 100ml de 10xPBS em 900ml de água miliQ. Na

solução de PBS já diluída adicionou-se 1g de PVA, que foi filtrada e estocada em alíquotas

de 1,5ml. O PVA evita que as células se fixem na superfície da placa e o PBS livre de Ca+2 e

Mg+2 desestabiliza os íons intracelulares e faz com que as células se desagreguem mais

facilmente.

Tripsina:

A tripsina (Sigma) foi diluída a 30mg/ml em PBS (pH 7,2).

2. LISE

Solução de Lise: 1µl de SDS (17µM) + 2µl de proteinase K (125µg/ml)

A proteinase K (Roche) foi preparada em concentração de aproximadamente 20mg/ml,

aliquotada em condições estéreis e conservada a 4oC. Foi diluída para 125µg/ml em água

miliQ e filtrada no momento do uso (1µl de proteinase K em 160µl de água). O SDS

(sodium dodecyl sulpahte, Sigma) a 10% foi aliquotado e mantido a temperatura ambiente.

Para obter uma concentração de 17µM foi realizada uma diluição de 1/100 e após agitação,

Anexo A

85

uma nova diluição de 1/200. Finalmente foi obtida a solução SDS-proteinase K em

proporção 1:2, mantida refrigerada até a sua utilização.

3. DOP-PCR

Primer de DOP

É importante que os primers sigam um alto padrão de qualidade e que sejam

dessalinizados ao máximo, liofilizados e purificados com RP-HPLC (cromatografia líquida

de alto rendimento e de fase reversa). Isto garante que os primers incompletos ou com erro

na seqüência de bases sejam eliminados. Os primers liofilizados foram diluídos em água

miliQ estéril e filtrada para obter uma solução de trabalho com concentração de 100µM.

4. ELETROFORESE

50xTAE:

Foram preparados 100ml de EDTA 0,5M diluindo 18,61g de EDTA (Sigma) em 95ml de

água miliQ, com pH ajustado para 8,0. Aos 100ml de EDTA foram adicionados 242g de

Tris e 57,1ml de ácido acético glacial. O volume final de 1000ml de solução foi alcançado

pela adição de água miliQ.

Gel de agarose a 2%:

Foram utilizados géis de agarose de 65x80mm (30ml de volume final). Foram diluídos

0,6g de agarose em 30ml de 1xTAE (20ml de 50xTAE e 980ml de água miliQ). A solução

foi aquecida em microondas por 1,5 minutos a 450W de potência e colocada na cuba do

aparelho de eletroforese para polimerizar. O DNA marcador utilizado, determinante do

padrão de bandas, foi de 100pb (Invitrogen).

Anexo A

86

III.5. MARCAÇÃO COM NICK TRANSLATION

Mix dNTPs (1A: 1C: 1G):

Cada dNTP foi fornecido originalmente em uma solução concentrada de 0,3mM.

A solução de trabalho foi preparada na proporção de 1:1:1 de dATP: dCTP: dGTP,

obtendo assim, a concentração de 0,1mM por dNTP.

dTTP:

A solução inicial foi de 0,3mM, sendo necessário proceder uma diluição 1:3 com água

miliQ livre de DNAse para obter uma concentração final de 0,1mM.

dUTP- Spectrum Red e dUTP- Spectrum Green:

A solução original de 1mM foi diluída, 1:5 para o dUTP-spectrum green e 1:10 para spectrum

red, ambos em água miliQ livre de DNAse, para obter concentração final de 0,2mM e

0,1mM respectivamente.

III.6. HIBRIDAÇÃO COMPARATIVA

20xSSC:

Em 1litro de água miliQ foram diluídos 88g de citrato tri-sódico dihidratato e 175g de

cloreto de sódio. O pH da solução foi ajustado em 5,5.

Tampão de Hibridação: (50% Formamida/ 10% Dextran sulfato/ 2xSSC)

Anexo A

87

A solução estoque foi composta por 2g de dextran sulfato, 2ml de 20xSSC e 8ml de água

miliQ. A solução de hibridação foi composta por 50% formamida deionizada e 50% de

solução estoque, conservada a -20ºC.

Solução de Denaturação: (70% Formamida/ 2xSSC)

Em cabine de fluxo laminar, foram adicionados 35ml de formamida, 5ml de 20xSSC e

10ml de água miliQ. O pH da solução foi ajustado entre 6,8-7,2.

Solução I de Lavagem: (0,4xSSC/ 3% NP-40)

Adicionados 20ml de 20xSSC, 3ml de NP-40, completando com água miliQ até obter

volume final de 1litro de solução. O pH foi ajustado entre 6,8-7,2.

Solução II de Lavagem: (2xSSC/ 0,1% NP-40)

Adicionados 100ml de 20xSSC, 1ml de NP-40, completando com água miliQ até obter

volume final de 1 litro. O pH foi ajustado da solução entre 6,8-7,2.

Solução DAPI:

A solução de uso foi preparada a partir da solução de estoque de 4,6-diamino-2-fenilindol

(DAPI, Sigma) a 2,5µg/ml. Para obter essa concentração, o produto na sua forma

comercial (1mg/ml) sofreu uma série de 2 diluições: primeiro, 1:10 e depois, 1:40. A

concentração final do DAPI foi de 125ng/ml (50µl DAPI com concentração 2,5µg/ml,

50µl de água miliQ e 900ml de antifade). A solução antifade (1,4-fenildiamina, Vectashield)

foi fornecida pela Vector Lab. A solução de uso foi mantida a temperatura de 4ºC.

UTILIZAÇÃO DE SONDAS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL DE ANEUPLODIAS

Introdução

89

INTRODUÇÃO

O Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (PGD) foi realizado, a princípio, em embriões

fertilizados in vitro para detecção de doenças gênicas, como alternativa para o diagnóstico pré-

natal e consequentemente evitar a interrupção da gestação. Esta aplicação do PGD rapidamente

evoluiu para o screening de aneuploidias, por meio da técnica de FISH (hibridação in situ

fluorescente) em células únicas. A Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético Pré-

Implantacional classifica esse processo de seleção embrionária para aberrações cromossômicas

numéricas como “PGD para infertilidade”. Inicialmente, um conjunto de cinco sondas de DNA

foram aplicadas para diagnóstico. Recentemente, várias combinações de sondas são oferecidas,

podendo-se avaliar até 12 cromossomos, o que ainda parece não ser suficiente, já que existem

relatos de embriões portadores de aneuploidias envolvendo quase todos os cromossomos

(LATHI et al., 2008).

I.3. Diagnóstico Pré-Implantacional de Aneuploidias Cromossômicas

Muitas vezes, as falhas das técnicas de reprodução assistida são explicadas por alterações

endometriais que interferem na implantação do embrião, causando a interrupção da gestação.

Entretanto, é reconhecido que as características genéticas do embrião desempenham um papel

relevante na manutenção e evolução da gravidez.

Estudos citogenéticos de abortos demonstraram que 50 a 70% dos casos envolviam

anormalidades cromossômicas (EIBEN et al., 1990; STEPHENSON et al., 2002; LATHI et al.,

2002, 2004, 2008), sugerindo uma maior incidência de aneuploidias específicas em perdas

espontâneas de primeiro trimestre (LJUNGER et al., 2005). Segundo JOBANPUTRA e

Introdução

90

colaboradores (2002), a análise de oito cromossomos (X, Y, 13, 15, 16, 18, 21 e 22) foi capaz de

identificar 83% das anomalias cromossômicas encontradas no estudo de 57 abortos espontâneos.

Além disso, as monossomias autossômicas raramente foram detectadas nesta amostra, sugerindo

que elas sejam responsáveis pelas perdas embrionárias precoces.

De acordo com DE BRAEKELEER & DÃO (1990), somente 4,7% dos casais com dois ou

mais abortos apresentam alterações cromossômicas estruturais equilibradas. Entretanto, o estudo

citogenético realizado em nosso laboratório, analisando uma amostra rigorosamente selecionada

de 120 casais com dois ou mais abortamentos sem causa estabelecida, evidenciou que 7,5%

desses casais eram portadores de translocações equilibradas (PEREIRA-MARTINS, 2000).

Além disso, a maior incidência de falhas na implantação parece estar relacionada com a idade

materna elevada e pode ser explicada por uma ocorrência maior de aneuploidias em conceptos

originados de mulheres com mais de 35 anos. FARFALLI e colaboradores (2007) relataram, após

avaliar por FISH 1.437 oócitos, uma alta incidência de aneuploidias em oócitos tanto de mulheres

acima de 38 anos como daquelas que apresentavam falhas repetidas de fertilização in vitro. Além

disso, foi observado um aumento significativo de anomalias dos cromossomos 16, 21 e 22 em

pacientes acima de 43 anos, se comparadas com pacientes abaixo de 35 anos. De acordo com

RUBIO e colaboradores (2003), 33% dos embriões gerados in vitro por mães jovens e saudáveis

são anormais para sete cromossomos analisados (13, 16, 18, 21, 22, X e Y). Quando

consideramos mães com idade superior ou igual a 37 anos, esse valor dobra e quando incluídas

portadoras de translocações e de abortos recorrentes, essa taxa alcança 70% (ESHRE PGD

Consotium Steering Committee, 2002). Segundo KULIEV e colaboradores (2003), a idade

materna avançada de aproximadamente 38 anos, é uma indicação absoluta para a realização do

PGD em corpúsculos polares. Os autores demonstraram que, entre 6.733 oócitos, 3.509 (52,1%)

eram aneuploides quando testados para os cromossomos 13, 16, 18, 21 e 22.

Em uma revisão publicada recentemente pela SISMER (Sociedade Italiana Estudos de

Medicina da Reprodução), 67% de 5.115 embriões foram diagnosticados como

Introdução

91

cromossomicamente alterados. Desses, 825 (16%) eram portadores de aneuploidias compatíveis

com a implantação, incluindo 123 trissômicos para o cromossomo 21, 90 para o cromossomo 13

e 49 para o cromossomo 18. Embora a capacidade implantacional dos embriões aneuploides seja

inferior da apresentada por embriões normais, estes dados proporcionam uma estimativa de

quanto o PGD diminui o risco de concepção de um feto cromossomicamente anormal

(FARFALLI et al., 2007).

A análise por FISH multicolor para a identificação do sexo de embriões que mantiveram o

processo inicial de clivagem revelou uma alta incidência de mosaicismo cromossômico pós-

zigótico, incluindo não-disjunção mitótica, mosaicismo de ploidia e distribuição “caótica” dos

cromossomos. A origem e os mecanismos de desenvolvimento dessas anormalidades são

desconhecidos, mas alterações nucleares foram freqüentemente observadas em embriões

humanos in vitro. Células binucleadas podem surgir por falhas durante a citocinese, ou ainda

células multinucleadas ou tetraplóides podem originar-se a partir de alterações no fuso mitótico

(RAY & HANDYSIDE, 1996; HARDY et al., 1993).

Em embriões predominantemente diplóides, a presença de linhagens haplóides é mais difícil

de ser explicada, podendo ter diferentes causas: fertilização por mais de um espermatozóide, falta

de sincronismo dos pró-núcleos, segregação da linhagem zigótica durante a clivagem ou

ocorrência de divisão, semelhante à redução meiótica, formando núcleos haplóides derivados de

células diplóides (DELHANTY et al., 1997).

No início do processo de clivagem de embriões humanos, podemos encontrar também uma

distribuição de cromossomos completamente caótica, semelhante a observada em cariótipos de

células malignas. Uma das possíveis explicações para esse fato é que os checkpoints que ocorrem

normalmente durante o ciclo celular, responsáveis pela checagem e conclusão de eventos

essenciais à progressão da célula nas diferentes fases do ciclo, não estariam operando

efetivamente durante a clivagem, devido à inativação de genes que controlam os mesmos

(DELHANTY & HANDYSIDE, 1995).

Introdução

92

As conseqüências do mosaicismo cromossômico no desenvolvimento embrionário humano

permanecem desconhecidas. Algumas trissomias ou a monossomia do X são compatíveis com o

desenvolvimento da gestação e termo, mas muitos desses fetos são perdidos durante estágios

diferentes da gestação (SANDALINAS et al., 2001; MUNNÉ et al., 2004). Outras anormalidades

como células trissômicas ou poliplóides, podem ser compatíveis com a divisão e diferenciação em

linhagens específicas, como nos casos de mosaicismo limitado ao tecido placentário, detectado

por exames de amostras de vilosidade coriônica, em que algumas ou todas as células são

aneuploides (HANDYSIDE & DELHANTY, 1997).

Aproximadamente metade dos embriões cultivados in vitro cessa o seu desenvolvimento entre

o primeiro e segundo dia após a fertilização (GRIFO et al., 1996). A associação entre a

constituição cromossômica e o desenvolvimento embrionário já foi demonstrada. Parece ser

evidente que embriões que alcançam o estágio de 7 a 8 células no 3º dia após a fertilização (entre

62-64h) apresentam uma menor taxa de aneuploidias quando comparados aos que sofrem atraso

no desenvolvimento ou aos que apresentam uma divisão celular acelerada (FARFALLI et al.,

2007).

Aneuploidias recorrentes têm sido relacionadas à predisposição de algumas mulheres de

gerarem embriões aneuploides devido a uma alteração no processo meiótico ou mitótico

(GUTIÉRREZ-MATEO et al., 2004). Isto pode explicar os casos de abortos espontâneos

repetidos em casais com cariótipos somáticos normais e porque alguns casais não obtêm sucesso

nos procedimentos de fertilização in vitro. Nessas situações, se fossem transferidos apenas

embriões euploides, a taxa de abortos poderia diminuir (LATHI et al., 2008) e a de implantação

aumentar (GIANAROLI, et al., 1997).

A maioria dos estudos limita-se a avaliar numericamente os cromossomos envolvidos nas

trissomias mais comuns em nascidos vivos (X, Y, 13, 18 e 21) ou aqueles sabidamente

relacionados com abortos espontâneos, como o 15, 16 e o 22 utilizando kits de cinco sondas para

o diagnóstico de aneuploidias em corpúsculos polares (13, 16, 18, 21 e 22) e para o diagnóstico de

Introdução

93

aneuploidias em blastômeros (X, Y, 13, 18 e 21). Contudo, outros conjuntos de nove sondas (X,

Y, 13, 15, 16, 17, 18, 21 e 22 – Reprogenetics New Jersey e California), dez sondas (X, Y, 8, 9, 13,

15, 16, 18, 21 e 22 – Genzy Califórnia) e doze sondas (X, Y, 8, 13, 14, 5, 16, 17, 18, 20, 21 e 22 -

Reprogenetics New Jersey e Califórnia) também estão disponíveis. No entanto, a análise de 12

cromossomos parece não ser suficiente para evitar a transferência de um embrião aneuploide para

o útero materno. Segundo LATHI e colaboradores (2008), a trissomia envolvendo os

cromossomos 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21 e 22 é responsável por

somente 69% das anomalias cromossômicas de embriões em estágio preimplantacional.

I.2. Técnica de Hibridação in situ Fluorescente (FISH)

A hibridação in situ fluorescente (FISH) aplicada à análise de corpúsculos polares ou

blastômeros é a técnica mais amplamente utilizada para o diagnóstico genético pré-implantacional

de anomalias cromossômicas, já que fornece informações sobre a ploidia de núcleos interfásicos

(SERMON et al, 2007).

A hibridação in situ fluorescente é um procedimento de pareamento específico entre uma

sonda de ácido nucleico marcada com fluoresceína e seqüências de ácido nucleico pertencentes à

amostra analisada. A análise cromossômica por FISH teve início quando a citogenética

convencional combinou-se com a metodologia do DNA recombinante, originando a citogenética

molecular. Anteriormente, seqüências específicas de DNA e RNA eram detectadas em metáfases

ou núcleos interfásicos pela hibridação in situ utilizando sondas de ácido nucléicos marcadas

radioativamente. Entretanto, quando se tornaram disponíveis sondas marcadas com

fluorocromos, como a biotina, a técnica de hibridação in situ incorporou muitas vantagens, como

o manuseio mais seguro das sondas, a maior estabilidade entre sonda e amostra, a obtenção mais

rápida dos resultados, localização espacial mais precisa da seqüência analisada, menor quantidade

Introdução

94

de background e o uso de sondas marcadas com fluorocromos de cores diferentes, diversificando

as possibilidades de diagnóstico (BEATTY, MAI e SQUIRE, 2002).

Atualmente, a FISH é considerada uma técnica amplamente utilizada e versátil, que permite a

localização de seqüências de DNA em cromossomos metafásicos, o mapeamento de fibras

cromatídicas, a quantificação de DNA microarray e análises de expressão de RNA em núcleo e

citoplasma celular, em diferentes tipos de amostras. Dois terços dos casos de PGD realizados no

mundo utilizaram a técnica de FISH com sondas cromossomo-específicas para diagnóstico de

aneuploidias. O principal motivo de encaminhamento foi a idade materna acima de 35 anos para

mulheres submetidas às técnicas de reprodução assistida (ANDERSON et al., 2008).

Primeiramente, a eficiência da técnica de FISH para detecção de aneuploidias em embriões

foi confirmada pelos estudos de MUNNÉ (1994a, 1994b, 1995). Comparando os resultados

obtidos por FISH entre embriões humanos com graus diferentes de qualidade morfológica e

originados por mães em faixas etárias distintas, foi possível determinar que as alterações

cromossômicas observadas estavam associadas às características dos grupos estudados

(morfologia anormal do embrião e idade materna elevada), excluindo a possibilidade de erros

metodológicos. Mais recentemente, DE UGARTE e colaboradores (2008) reanalisaram 241

embriões previamente diagnosticados por FISH para determinar o valor preditivo positivo (VPP)

e o valor preditivo negativo (VPN) desta técnica. Os autores determinaram os valores para VPP e

VPN como sendo 83 e 81% respectivamente, responsabilizando a presença de mosaicismo

embrionário pela maior parte dos erros encontrados no diagnóstico por FISH.

Embora uma taxa de 12% de mosaicismo constitutivo seja esperada na fase inicial do

desenvolvimento embrionário, uma quantidade particularmente significativa de mosaicos foi

detectada em embriões que apresentavam divisão celular lenta ou interrupção do processo de

clivagem (MUNNÉ et al., 1994b; FARFALLI, et al., 2007). De modo geral, tem sido relatado que

50% dos embriões produzidos in vitro possuem mosaicismo constitutivo (KATAGIRI &

KATAYAMA, 1996; HANDYSIDE & DELHANTY, 1997; BAART et al., 2004). O diagnóstico

Introdução

95

de mosaicismo representa um desafio e uma limitação para a análise de aneuploidias por FISH e

detecção de alterações gênicas por PCR. Segundo EVSIKOV (1998), o mosaicismo representa

um problema de diagnóstico não apenas quando consideramos embriões com poucas células em

fase de blastômero, mas também em blastocistos. Nesse caso, ao contrário do que se esperava, a

linhagem celular alterada parece não migrar completamente para a formação do trofoblasto,

sendo possível detectá-la na massa celular interna do blastocisto.

Segundo a Sociedade Européia de Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE), Consórcio

PGD, a maioria dos procedimentos diagnósticos pode acarretar erros, sendo que no último

relatório deste consórcio foram apresentados 7 erros diagnósticos após PGD por FISH e 10 por

PCR (SERMON, et al., 2007). De acordo com MUNNÉ et al. (2002, 2003), 7,2% dos embriões

não transferidos para o útero materno após o procedimento de PGD foram diagnosticados

erroneamente por FISH, sendo que 60% desses embriões foram diagnosticados como falso-

positivos devido à presença de mosaicismo. Outros trabalhos já haviam relatado índices

parecidos, onde as taxas para resultados falsos negativos e falsos positivos foram estipuladas em

1,5 e 19% respectivamente (GIANAROLI et al., 2001; MUNNÉ et al., 1998).

Com o intuito de evitar os erros diagnósticos secundários ao mosaicismo embrionário, alguns

autores sugeriram que, em embriões de 6 a 8 células, dois blastômeros deveriam ser analisados.

Esta proposta gerou discussões que, por um lado, questionavam a segurança e o possível efeito

negativo de se remover duas células do embrião e por outro, quanto este procedimento

melhoraria a eficiência do PGD. GOOSSENS e colaboradores (2008) sugeriram, após analisarem

3377 embriões, que a remoção de 2 blastômeros interfere negativamente no desenvolvimento

embrionário até o estágio de blastocisto, mas não na taxa de nascimento. Ou seja, seu

desenvolvimento após a transferência para o útero materno segue inalterado. Enquanto a

eficiência do PGD por FISH parece não se alterar após análise de uma ou duas células (98.2% e

97.5% respectivamente), os métodos moleculares para detecção de mutações responsáveis por

Introdução

96

doenças monogênicas parecem ser mais eficientes quando aplicadas a duas células, devido ao

aumento da quantidade inicial de DNA e diminuição do risco de contaminação.

Sendo assim, considerando o alto índice de aneuploidias presente em embriões gerados in

vitro, a necessidade de analisar o maior número possível de cromossomos por blastômero e a

elevada eficiência da técnica de hibridação in situ fluorescente, novos protocolos devem ser

propostos para aumentar a eficácia do diagnóstico citogenético pré-implantacional.

Objetivos

97

OBJETIVOS

O objetivo principal do projeto foi estabelecer um novo protocolo de FISH utilizando sondas

de oligonucleotídeos para determinação do Diagnóstico Pré-implantacional de aneuploidias de

quinze cromossomos em blastômeros humanos.

Os objetivos intermediários foram:

1) Avaliar a eficiência desta metodologia para definição do diagnóstico de aneuploidias dos

cromossomos 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 20, X e Y em blastômeros;

2) Determinar a freqüência dessas aneuploidias em núcleos provenientes de embriões

descartados durante o procedimento de reprodução assistida.


98

MATERIAIS E MÉTODOS

I. Casuística

O trabalho foi realizado na Unidade de Biologia e Genética Médica do Departamento de

Biologia Celular, Fisiologia e Imunologia da Universidade Autônoma de Barcelona, coordenado

pela Profa Joaquima M. Navarro Ferrete, em colaboração com o Departamento de Genética da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.

Os casais assinaram termo de consentimento livre e esclarecido para a doação de embriões à

pesquisa, de acordo com os preceitos éticos pertinentes à legislação vigente na Espanha. O

projeto foi aprovado no CEP e no CONEP, registro HCRP 14587/2006.

II. Amostra

A amostra caracterizou-se por núcleos interfásicos obtidos por meio de cultura

temporária de linfócitos de doador masculino com cariótipo normal e 14 núcleos de blastômeros

provenientes de seis embriões gerados in vitro. Foram utilizados embriões com aspectos

morfológicos e padrão de desenvolvimento inadequados para a transferência materna ou

criopreservação, independentemente da idade materna.


99

III. Métodos

III.1. ISOLAMENTO E FIXAÇÃO DE BLASTÔMEROS

O primeiro passo para obtenção dos blastômeros foi a digestão da membrana embrionária

com ácido Tyrode (pH=2,5). A seguir, o embrião foi transferido para uma gota de PBS livre de

cálcio e magnésio para facilitar a desagregação das células. Com movimentos de aspirar e soltar,

os blastômeros foram separados mecanicamente para depois serem fixados um a um.

Em geral, a fixação depende de três fatores:

⇒ Tratamento hipotônico: quanto mais longo o tratamento com a solução hipotônica, mais

rápido será o rompimento da membrana. Isso diminui o controle sobre o processo de

fixação e aumenta os riscos de perda do núcleo. No entanto, se este procedimento não for

suficientemente longo, a célula pode não se romper e o núcleo continuar inacessível.

⇒ Temperatura ambiente: a temperatura ambiente interfere no tempo de evaporação do

fixador e conseqüentemente na remoção do citoplasma.

⇒ Umidade ambiental: também interfere na evaporação do fixador e, portanto, na qualidade

do núcleo fixado.

Depois de isolado, o blastômero foi transferido para uma gota de solução hipotônica, citrato

de sódio a concentração 1%, à temperatura ambiente, por aproximadamente cinco minutos. As

condições ideais são 5 a 6 minutos de hipotonização com aproximadamente 25ºC de temperatura

ambiente e 50% de umidade relativa. Durante o tratamento com solução hipotônica, o

blastômero deve ser mantido sob observação.

Em seguida, o núcleo foi transferido (em um volume mínimo de solução de citrato de sódio)

para a superfície de uma lâmina de vidro. Quando a gota da solução hipotônica começou

evaporar, uma gota de fixador Carnoy foi aplicada sobre a célula com o intuito de romper a


100

membrana e remover o citoplasma celular, fixando assim, apenas o núcleo. Esta etapa foi repetida

o número de vezes necessário para a total retirada do citoplasma.

Então a lâmina foi deixada para secar ao ar e depois analisada no microscópio de contraste de

fase para confirmar a presença do núcleo, determinar suas coordenadas na lâmina e observar se

ainda restava citoplasma sobre a amostra. As lâminas foram então desidratadas em série de

etanóis e estocadas a -20ºC até o momento da hibridação.

Todos os núcleos passaram por uma coloração controle com solução DAPI (5µl de solução

DAPI em uma lamínula 20x20mm). As imagens então capturadas serviram como padrão para as

características morfológicas do núcleo a ser analisado. Isto porque, a realização de três ou mais

etapas de denaturação compromete a morfologia e a integridade do núcleo interfásico,

interferindo assim no diagnóstico por FISH.

Após a obtenção das imagens, o DAPI foi eliminado das lâminas lavando-as por 5 minutos a

temperatura ambiente com a solução de 2xSSC/ 0,1% Tween 20. Em seguida, a amostra foi

novamente desidratada em uma série de etanóis.

III.2. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH)

A aplicação desta metodologia teve por objetivo padronizar o uso de oligonucleotídeos

marcados com fluorescência no diagnóstico de diferentes aneuploidias em células embrionárias

humanas. Para isto, utilizamos quinze sondas de oligonucleotídeos, distribuídas em três etapas de

hibridação para cinco cromossomos cada (Tabela 5 e Figura 8). Os kits dessas sondas foram

fornecidos por One Cell Systems, Inc.


101

A primeira etapa de hibridação (Etapa A) incluiu oligonucleotídeos marcados para as regiões

centroméricas dos cromossomos X em Spectrum Red, 15 em Spectrum Orange, 17 em Spectrum Green

e 20 em Spectrum Far Red e para a região satélite III do cromossomo Y em Spectrum Aqua.

Cromossomo Cor

X Red (ex 580nm/ em 599nmn) DY590

Y Aqua (ex 418nm/ em 467nm) DY415

15 Orange (ex 558nm/ em 572nm) DY549

17 Green (ex 490nm/em 516nm) DY490

20 Far Red (ex 653nm/ em 647nm) DY649

3 Red (ex 580nm/ em 599nm) DY590

7 Aqua (ex 418nm/ em 467nm) DY415


10 Orange (ex 558nm/ em 572nm) DY549



4 Red (ex 580nm/ em 599nm) DY590

6 Aqua (ex 418nm/ em 467nm) DY415

9q12 Orange (ex 558nm/ em 572nm) DY549


Tabela 5: Relação das 15 sondas de DNA e seus respectivos fluorocromos, utilizadas no diagnóstico pré-implantacional.

Na segunda etapa (Etapa B) foram aplicadas sondas correspondentes às regiões centroméricas

dos cromossomos 3 em Spectrum Red, 7 em Spectrum Aqua, 8 em Spectrum Green, 10 em Spectrum

Orange e 16 em Spectrum Far Red.


102

A última hibridação (Etapa C) incluiu oligonucleotídeos específicos para as regiões

centroméricas dos cromossomos 2 em Spectrum Green, 4 em Spectrum Red, 6 em Spectrum Aqua e 12

em Spectrum Orange e para a região heterocromática 9q12 em Spectrum Far Red

Figura 8: O gráfico mostra os comprimentos de onda de luzes emitidas pelos fluorocromos utilizados, evidenciando suas áreas de sobreposição

Para determinação da eficácia do protocolo, as três etapas de hibridação foram inicialmente

aplicadas em núcleos interfásicos de linfócitos cultivados, obtidos de um doador masculino com

cariótipo normal. Foram analisados em torno de 50 núcleos para cada etapa de hibridação, todos

apresentando diâmetro aproximado ao esperado para núcleos embrionários no terceiro dia de

desenvolvimento in vitro. A partir deste experimento prévio, determinamos a porcentagem de

eficiência para a hibridação de cada sonda e sua correspondente margem de erro. O mesmo

protocolo de hibridação foi aplicado aos blastômeros fixados.


103

III.2.1.TRATAMENTO DAS LÂMINAS

As lâminas foram então retiradas do congelador e mantidas no mínimo 30 minutos à

temperatura ambiente. Foram então lavadas em solução PBS e em água purificada. Após imersão

em três diluições de etanol (70, 85 e 100%) por dois minutos cada, as lâminas secaram em

temperatura ambiente.

III.2.2. SONDAS E HIBRIDAÇÃO

A hibridação foi realizada em três tempos. Primeiro utilizando as sondas dos cromossomos

X, Y, 15, 17 e 20, em seguida as sondas do 3, 7, 8, 10 e 16 e por último as sondas do 2, 4, 6, 9q12

e 12 (One Cell Systems, Inc.), marcadas diretamente com os fluorocromos Red (DY590), Aqua

(DY415), Green (DY490), Orange (DY549) e Far Red (DY649). Todos os oligonucleotídeos citados

apresentavam localização pericentromérica, com exceção da sonda referente ao cromossomo 9

que marcava a região 9q12.

A solução de hibridação para as 3 etapas foi constituída de 5,0µL de sonda e 5,0µL de

tampão, de acordo com protocolo do fornecedor. A hibridação foi realizada adicionando-se

3,0µL dessa solução por lâmina na etapa correspondente. A relação entre o volume de sonda e o

a área da lamínula está descrita na tabela a seguir:

As sondas foram diluídas em solução-tampão (30% Formamida) específica para este tipo de

seqüência de DNA (oligonucleotídeos), aplicadas sobre a amostra, cobertas por lamínula circular

e não foram seladas. Ambas, sondas e amostra foram denaturadas em placa aquecedora a 76oC

por 5 minutos. O processo de hibridação ocorreu em câmara escura, úmida e pré-aquecida (37oC)

por 10 minutos sob agitação do material.


104

III.2.3. LAVAGENS PÓS – HIBRIDAÇÃO E COLORAÇÃO

Os procedimentos foram realizados em local sem incidência direta de luz, devido à marcação

direta dos fluorocromos.

Após remoção das lamínulas em solução 2xSSC com agitação, as lâminas foram lavadas a

50oC em solução 0,2xSSC/ 0,1%SDS durante dois minutos. Em temperatura ambiente, as

lâminas foram lavadas em solução 2xSSC e sofreram desidratação por uma série de três diluições

de etanol (70, 85 e 100%) por um minuto cada. Quando seco, o material foi corado com solução

de DAPI/Antifade (125 ng/ mL) e coberto com lamínula 24x50mm para análise microscópica.

Entre as três etapas de hibridação, efetuamos alguns passos para que as primeiras sondas e o

corante DAPI fossem removidos. Desta forma, após a análise microscópica de cada conjunto de

sondas, as lâminas foram lavadas, em temperatura ambiente em solução PBS por cinco minutos e

então desidratadas em uma série de três diluições de etanol (70, 85 e 100%) por dois minutos

cada, reiniciando então o ciclo seguinte de hibridação.

III.2.4. ANÁLISE CITOGENÉTICA-MOLECULAR

As lâminas foram analisadas imediatamente após a aplicação da solução de DAPI/Antifade.

Para que não houvesse erros na interpretação dos sinais foram considerados aqueles que

apresentaram a mesma intensidade de cor e estavam completamente separados uns dos outros.

Além disso, o tamanho e a cor característicos de cada sonda foram cuidadosamente considerados.

A análise foi realizada em microscópio de epifluorescência (Nikon Eclipse 90i) equipado com

câmera CCD (charge-coupled device) de alta sensibilidade e filtros apropriados para a detecção dos

fluorocromos empregados sob objetiva de imersão (100X) acoplado ao sistema computadorizado

de captura de imagem MetaSystem com software Isis. Obedecendo aos comprimentos de onda dos

fluorocromos utilizados (Figura 8), tanto de excitação quando de emissão, seguiu-se a seguinte


105

ordem para a análise e captura dos sinais: Far Red → Red → Orange → Green → Aqua → DAPI.

Após as 6 capturas, cada uma para um fluorocromo específico, a imagem foi montada

posicionando o sinal de cada sonda sobre o núcleo corado em DAPI

Resultados

106

IV. RESULTADOS

Por meio da técnica de FISH com sondas de oligonucleotídeos, foram detectados sinais

fluorescentes correspondentes aos cromossomos X, Y, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 16, 17 e 20

em 161 núcleos interfásicos de sangue periférico e 14 núcleos obtidos a partir de 6 embriões.

Sonda Valor Absoluo

Hibr. Eficiente

(%)

Margem Erro (%)

Valor Absoluto

Hibr. Ineficiente

(%)

Margem Erro (%)

Cromossomo X (Red) 52 94,54 6,00 3 5,45 6,00

Cromossomo 15 (Orange) 49 89,10 8,24 6 10,90 8,24

Cromossomo 20 (Far Red) 45 81,80 10,20 10 18,19 10,20

Cromossomo 17 (Green) 49 89,10 8,24 6 10,90 8,24

Cromossomo Y (Aqua) 55 100,00 0,00 0 Zero 0,00

Cromossomo 3 (Red) 48 82,75 9,72 10 17,25 9,72


Cromossomo 16 (Far Red) 48 82,75 9,72 10 17,25 9,72

Cromossomo 8 (Green) 49 84,50 9,31 9 15,50 9,31

Cromossomo 7 (Aqua) 55 94,83 5,70 3 5,17 5,70

Cromossomo 4 (Red) 47 97,90 4,06 1 2,10 4,06


Cromossomo 9q12 (Far Red) 12 25 12,25 36 75 12,25

Cromossomo 2 (Green) 47 97,90

4,06 1 2,10 4,06

Cromossomo 6 (Aqua) 47 97,90 4,06 1 2,10 4,06

Tabela 5: Resultados da FISH com sondas de oligonucleotídeos em 161 núcleos interfásicos de linfócitos cultivados. Experimento controle para as três etapas de hibridação.

Resultados

107

A Tabela 5 apresenta os resultados obtidos por FISH em 161 núcleos de linfócitos incluindo

as porcentagens de hibridação eficiente e ineficiente e as respectivas margens de erro. A

porcentagem de hibridação foi de 87,6% quando considerados os 15 cromossomos, no entanto a

mesma eleva-se para 92% quando descartamos a porcentagem de hibridação referente à sonda

9q12. A sonda que apresentou melhor resultado foi a do cromossomo Y marcada com

fluorocromo Aqua (100%) e a de pior resultado foi a sonda da região 9q12 marcada com o

fluorocromo Far Red (25%).

Número de Sinais por Cromossomo Embrião Núcleo X Y 15 17 20 3 7 8 10 16 2 4 6 9q 12

M2B 1 1 3 3 1 1 1 1 2 1 1 2 2 2 1 3 29BSF 2 6 - 6 8 6 8 7 5 6 5 7 5 7 - 7 12BSF 3 3 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 16BSF 4 3 - 3 3 3 3 2 2 2 1 2 - 2 - 2

5 3 - 3 3 3 5 1 2 2 - 1 1 2 - 1 6 3 - 3 3 3 2 3 2 1 2 2 2 2 - 2 7 2 - 2 2 3 2 2 2 2 2 2 3 2 - 2 8 1 - 1 1 1 1 1 1 1 1 ND

2B2 9 4 - 4 4 5 6 3 4 5 - ND 10 1 - 1 1 2 ND ND 11 1 - 1 1 1 ND ND

26BSF 12 3 - 3 2 2 ND ND 13 4 - 4 3 4 ND ND 14 4 - 4 4 2 ND ND

Tabela 6: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16, 2, 4, 6, 9q e 12 em 14 núcleos obtidos de 6 embriões. ND = não detectado.

A Tabela 6 apresenta os dados obtidos por FISH em núcleos fixados de blastômeros, obtidos

a partir de embriões descartados por não serem viáveis para transferência. A tabela inclui, os

resultados referentes ao número de sinais encontrados para cada sonda. Em 35,7% dos núcleos

(n=5) não foi possível realizar as análises referentes às segunda e terceira etapas de hibridação,

pois estes núcleos foram perdidos após o segundo procedimento de denaturação. Durante a

Resultados

108

terceira etapa foram perdidos mais dois núcleos, sendo os 15 cromossomos analisados em 50%

dos núcleos (n=7).

Dos núcleos que apresentaram boa morfologia após as três etapas de hibridação, três foram

submetidos a mais um ciclo de hibridação com as sondas para os cromossomos 13 e 21 da marca

Vysis Inc. As informações obtidas a partir desta última hibridação foram utilizadas para validação

do diagnóstico de aneuploidias detectadas nestes núcleos, ou seja, os núcleos 1, 14 e 15 que se

mostraram aneuplóides para vários cromossomos, também apresentaram alterações no número

de sinais correspondentes aos cromossomos 13 e 21 (Tabela 7).

Número de Sinais por Cromossomos Vysis Inc. Embrião Núcleo X Y 15 17 20 3 7 8 10 16 2 4 6 9q 12 13 21

M2B 1 1 3 3 1 1 1 1 2 1 1 2 2 2 1 3 1 2 29BSF 2 6 - 6 8 6 8 7 5 6 5 7 5 7 - 7 9 6 12BSF 3 3 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 1

Tabela 7: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16, 2, 4, 6, 9q, 12, 13 e 21 em 3 núcleos.

Todos os núcleos avaliados neste trabalho apresentaram algum tipo de aneuploidia e apenas

um mostrou-se euplóide para os cromossomos sexuais (núcleo número 5). Com relação à

primeira etapa de hibridação (n=14 núcleos), a freqüência de alterações encontradas em cada

cromossomo foi de 92,85% para o cromossomo 15; 78,57% para o cromossomo 17 e 71,42%

para o cromossomo 20. Para as sondas da segunda etapa de hibridação (n=9 núcleos) detectamos

66,66% de aneuploidia dos cromossomos 3, 7 e 16; 55,55% do cromossomo 10 e 33,33% do

cromossomo 8. Por fim, as alterações cromossômicas encontradas após a terceira etapa de

hibridação (n=7) foram detectadas em 57,14% para o cromossomo 4; 42,85% para o

cromossomo 12; 28,57% para o cromossomo 2 e 14,28% para o cromossomo 6. Como esperado

após o experimento controle com linfócitos, a sonda da região 9q12 mostrou-se pouco eficiente,

Resultados

109

sendo informativa em apenas 2 de 7 núcleos. Dentre estes, um foi diagnosticado como euplóide e

o outro como monossômico.

Dentre os resultados descritos neste trabalho foi observada alta freqüência de alterações

cromossômicas denominadas caóticas, de acordo com critérios definidos por LAVERGE e

colaboradores (1998) e IWARSSON e colaboradores (1999)

Resultados

110

Figura 9: Primeira etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais fluorescentes seguem a ordem: A) 20 em Spectrum Far Red; B) X em Spectrum Red; C) 15 em Spectrum Orange; D) 17 em Spectrum Green; E) Y em Spectrum Aqua e F) Imagem composta, núcleo euplóide.

DD CC

BB AA

EE FF

Resultados

111

Figura 10: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais fluorescentes seguem a ordem: A) 16 em Spectrum Far Red; B) 3 em Spectrum Red; C) 10 em Spectrum Orange; D) 8 em Spectrum Green; E) 7 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta, núcleo euplóide.

AA BB

CC DD

EE FF

Resultados

112

Figura 11: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais fluorescentes seguem a ordem: A) 9q12 em Spectrum Far Red; B) 4 em Spectrum Red; C) 12 em Spectrum Orange; D) 2 em Spectrum Green; E) 6 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta, núcleo euplóide.

BB AA

DD CC

FF EE

Resultados

113

Figura 12: Série de hibridações em blastômero (número 6, embrião 16BSF). A) Coloração com DAPI para controle da morfologia; B) Etapa A, três sinais para os cromossomos X (Red), 15 (Orange), 17 (Green), 20 (Far Red) e ausência de sinal para o cromossomo Y (Aqua); C) Etapa B, dois sinais para os cromossomos 3 (Red), 8 (Green), 16 (Far Red), três sinais para o cromossomo 7 (Aqua) e um sinal para o cromossomo 10 (Orange); D) Etapa C, dois sinais para os cromossomos 2 (Green), 4 (Red), 6 (Aqua), 12 (Orange) e ausência de sinal para a região 9q12 (Far Red).

AA BB

CC DD

Discussão

114

V. DISCUSSÃO

I. Considerações sobre a Metodologia

O Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (PGD) não é um procedimento simples e inclui

uma série de limitações metodológicas, desde a biópsia do corpúsculo polar ou do blastômero, a

escolha e aplicação do protocolo investigativo na célula única e finalmente a análise para

determinação do diagnóstico. O PGD pode ser utilizado na detecção de um número cada vez

maior de doenças e de acordo com BARUCH e colaboradores (2005), mais de 100 anomalias

genéticas diferentes já podem ser diagnosticadas. Desta forma, muitos estudos têm sido

realizados com o intuito de esclarecer as dúvidas e reduzir as limitações em torno das técnicas de

remoção celular, o protocolo de fixação ou de pré-amplificação de DNA e a seleção do conjunto

de sondas adequado pra a realização da FISH (DE VOS & VAN STEIRTEGHEM, 2001;

COHEN & MUNNÉ, 2005; COHEN et al., 2007; MUNNÉ et al., 2007).

O principal objetivo desde trabalho foi propor uma metodologia para o diagnóstico de

aneuploidias em blastômeros, capaz de determinar a ploidia do maior número possível de

cromossomos, ampliando o espectro do diagnóstico citogenético. Tendo em vista tal objetivo,

utilizamos 15 sondas de oligonucleotídeos, marcadas com cinco fluorocromos distintos, divididas

em três procedimentos de FISH.

As sondas foram primeiramente testadas em uma série de hibridações controle utilizando-se

núcleos interfásicos de linfócitos cultivados, masculinos e cromossomicamente normais. Foi

encontrada uma taxa de 87,6% de hibridações eficientes para os 15 cromossomos, no entanto

este valor pôde ser elevado para 92% quando a porcentagem de hibridação referente à sonda

9q12 foi retirada da análise. Independentemente deste fato, os resultados obtidos estão aquém do

esperado já que a metodologia de FISH apresenta 98% de eficiência na maioria das suas

Discussão

115

aplicações. Esta porcentagem foi confirmada pela assessoria científica da One Cell System, Inc.

quando questionada sobre os índices de hibridação das diferentes sondas de oligonucleotídeos

fornecidas pela empresa (Joan Aurich, comunicação pessoal). O protocolo proposto por esta

companhia sugere que a denaturação do DNA seja feita a temperatura de 85ºC, no entanto os

resultados aqui descritos foram obtidos após procedimento de denaturação por 5 minutos a 76ºC

de temperatura. Este pode ser um dos fatores que favoreceu a menor eficiência de hibridação das

sondas testadas em núcleos de linfócitos. Contudo, tendo em vista a aplicabilidade deste

protocolo para PGD, a temperatura de 76ºC foi escolhida considerando a suscetibilidade da

célula embrionária a altas temperaturas, principalmente quando a FISH exige mais de duas etapas.

A confiabilidade de um diagnóstico realizado por FISH depende da qualidade da seqüência

de DNA e da sua marcação fluorescente, do grau de preservação da amostra, padronização do

protocolo empregado na realização da técnica e por fim, das características do sistema utilizado

para a análise (microscópio, objetivas e filtros) e a captura (software de processamento de imagem)

das imagens (BEATTY, MAI e SQUIRE, 2002).

Dentre as sondas empregadas neste estudo, a que apresentou melhor resultado foi a do

cromossomo Y marcada com fluorocromo Aqua (100%) e a de menor eficiência foi a sonda para

a região 9q12 marcada com o fluorocromo Far Red (25%). A seqüência de DNA utilizada para

identificar o cromossomo Y foi a região satélite III, que por ser de grande tamanho e composta

por DNA repetitivo, facilita a hibridação e gera um sinal de fácil identificação. Outro fator que

possivelmente contribuiu para o sucesso desta sonda foi a sua marcação com o fluorocromo

Aqua. Esse fluocromo emite um sinal luminoso com o menor comprimento de onda de luz entre

as fluorescências utilizadas (467nm) que evita a sua sobreposição com outros sinais,

proporcionando assim a observação de um sinal limpo e definido. Por outro lado, a sonda do

cromossomo 9 mostrou uma taxa de hibridação muito abaixo do esperado, possivelmente devido

ao fato do experimento ter utilizado amostra de apenas um indivíduo e a região 9q12 ser

Discussão

116

polimórfica, apresentando variações de tamanho na população normal. A influência negativa do

fluorocromo Far Red, que emite luz com um comprimento de onda que coincide com o spectrum

Red, foi desconsiderada já que as sondas para os cromossomos 20 e 16, marcadas com a mesma

fluorescência apresentaram taxas de hibridação de 81,8 e 82,75% respectivamente.

Dentre os resultados descritos na Tabela 1 está a porcentagem de ineficiência na hibridação

das sondas referentes a cada cromossomo. Este dado é a somatória da quantidade de núcleos que

não apresentaram sinal fluorescente e dos núcleos com número de sinais diferente do esperado

pra um indivíduo normal do sexo masculino. Desta forma, podem-se considerar duas prováveis

causas para este dado de ineficiência: (1) falha real na hibridação; (2) erros da divisão mitótica das

células sanguíneas em cultura; (3) inclusão de núcleos em diferentes fases do ciclo celular, por

exemplo, em G2.

II. Considerações sobre a Amostra

A triagem de aneuploidias (PGD-AS) é a aplicação mais comum do diagnóstico pré-

implantacional (ANDERSEN et al., 2008), já que as anomalias cromossômicas numéricas estão

relacionadas tanto com falhas de implantação quanto com morte e perda embrionária por

abortamentos espontâneos. A incidência de anomalias cromossômicas é de 1,4% em embriões de

mães com até 34 anos de idade e aumenta para 52,4% em mulheres entre 40-47 anos

(MÁRQUEZ et al., 2000). Da mesma forma, também é conhecida uma elevada incidência de

anomalias cromossômicas em embriões de casais jovens com mais de três falhas de implantação

(>55% dos embriões são aneuploides) e em casais com pelo menos dois abortos espontâneos

(>68%) (GIANAROLI et al.,2001). SHAHINE & CEDARS (2006) questionaram se a aplicação

do PGD-AS em gametas e embriões poderia colaborar para maiores taxas de implantação e de

gestação em casais com idade materna elevada, em casais com falhas recorrentes de implantação,

Discussão

117

em mulheres que apresentaram abortos espontâneos de repetição e também em casais portadores

de translocação equilibrada, já que estas são as principais indicações pra o screening pré-

implantacional de anuploidias (MUNNÉ et al., 1999; GIANAROLI et al., 2002; MUNNÉ et al.,

2002; KULIEV et al., 2003; PUJOL et al., 2003). Baseados em dados de 20.000 ciclos de PGD,

KULIEV & VERLINSKY (2008) relataram que apesar da necessidade de se realizar um estudo

controle para quantificar o impacto clínico da pré-seleção de embriões euplóides, o efeito

positivo do PGD-AS é particularmente evidente quando comparadas as taxas de sucesso

reprodutivo dos mesmos casais, antes e depois da realização do diagnóstico.

A literatura descreve uma variedade de técnicas empregadas para detecção de aneuploidias em

células únicas, porém a metodologia mais utilizada no PGD-AS é a hibridação in situ fluorescente

(FISH) para o estudo de 5 a 9 cromossomos (MUNNÉ et al., 1998a; KULIEV et al., 2003;

WILTON et al., 2003; MONTAG et al., 2004).

Com o objetivo de proporcionar análise de uma maior quantidade de cromossomos em um

único núcleo, este trabalho propõe três ou quatro ciclos de FISH em um mesmo blastômero. Foi

observado que o número de núcleos que apresentaram sinal fluorescente diminuiu

gradativamente da primeira (n=14) para a segunda (n=9) etapa de hibridação e da segunda para a

terceira (n=7), sendo que apenas três núcleos foram considerados ideais para proceder a quarta

hibridação. A diminuição da eficiência na segunda e terceira etapa possivelmente está relacionada

com as sucessivas lavagens e procedimentos de desnaturação, que podem afetar a hibridação

entre as sondas de DNA e as seqüências alvo. Já a perda do núcleo fixado pode ocorrer durante a

técnica de FISH com apenas uma hibridação ou entre as etapas de um procedimento em série.

Os motivos relacionados com estas perdas são a qualidade do núcleo, o protocolo de fixação ou

mesmo a seqüência de lavagens à qual o núcleo é submetido (LIU et al., 1998a; 1998b). Ainda de

acordo com estes autores, a baixa qualidade dos núcleos é o motivo principal da falta de

eficiência na hibridação de alguns blastômeros, assim como os altos índices de resultados

anormais. No presente trabalho foram analisados 14 núcleos embrionários obtidos a partir de seis

Discussão

118

embriões gerados in vitro. Nenhum núcleo foi diagnosticado como normal, euplóide para os 15

cromossomos avaliados e os diagnósticos citogenéticos descritos permitiram a diferenciação de

três categorias: os núcleos poliplóides, os portadores de aneuploidia (monossomia ou trissomia)

para poucos cromossomos e os núcleos “caóticos”, portadores de alterações numéricas para

vários cromossomos analisados. As duas últimas categorias parecem ser os tipos mais freqüentes

de aneuploidias quando considerados embriões em estágio de 2 células até mórula. BIELANSKA

e colaboradores (2002) avaliaram por meio de FISH os cromossomos X, Y, 2, 7, 13, 16, 18, 21 e

22 de 216 embriões em estágios diferentes do desenvolvimento, detectando 48,1% de

mosaicismo. Dentre os aneuplóides, os achados mais freqüentes foram os complementos

cromossômicos caóticos.

O número de cromossomos investigados em uma única célula, por meio da técnica de FISH,

é limitado pela probabilidade de falha na hibridação e pela possibilidade dos sinais fluorescentes

de cromossomos diferentes se sobreporem, aparentando ser um único sinal. Esses problemas

ocorrem devido à configuração tridimensional dos cromossomos em um núcleo interfásico e ao

número limitado de fluorocromos para marcação das sondas. A sobreposição de sinais pode

causar uma super estimativa das incidências de deleções e monossomias. Além disso, erros

ocasionais podem acontecer devido a forma em duplicação (split) do sinal, sugerindo que dois

sinais estejam muito próximos um do outro (COHEN et al., 2007; MUNNÉ et al., 2007). Devido

às limitações descritas, o procedimento de FISH em núcleo interfásico apresenta uma taxa maior

do que 5% de erro por sonda por célula, não sendo indicada a utilização de mais de 9 sondas por

blastômero para diagnóstico pré-implantacional em uma única etapa de hibridação

(RUANGVUTILERT et al., 2000).

Embora a incidência elevada de aneuploidias em blastômeros já tenha sido extensivamente

relatada, as freqüências variam de acordo com o número de cromossomos analisados. Estudos

recentes utilizando a técnica de CGH (Hibridação Genômica Comparativa) demonstraram

alterações cromossômicas envolvendo quase todos os cromossomos. (WELLS & LEVY, 2003;

Discussão

119

GUTIERREZ-MATEO et al., 2004; PELLESTOR et al., 2005; 2006; FRAGOULI, 2007). O

número de sondas utilizadas na realização do PGD para exclusão de aneuploidias varia de 5 a 9,

dependendo do protocolo da instituição que conduz o diagnóstico. Muitos estudos têm se

limitado à análise dos cromossomos envolvidos nas aneuploidias viáveis (X, Y, 13, 18 e 21) e

daqueles associados aos abortos espontâneos (15, 16 e 22) (COHEN et al., 2007; SERMON et al.,

2007; GROOSSENS et al., 2008). Em 1999, BAHÇE e colaboradores sugeriram que os

cromossomos envolvidos na falha de implantação poderiam ser diferentes dos relacionados às

trissomias e aos abortos espontâneos. A partir desse estudo, os cromossomos 1 e 17 passaram a

ser incluídos, por alguns centros, na investigação de aneuploidias. No entanto, uma variedade de

aneuploidias que raramente é observada em diagnósticos pré-natais é tolerada durante o estágio

pré-implantacional, podendo impedir o desenvolvimento tardio do embrião. Essas aneuploidias

não podem ser detectadas pelo PGD com as sondas utilizadas de rotina.

Novas técnicas de citogenética-molecular, como o M-FISH (Multiplex Fluorescence In Situ

Hybridization) e o cariótipo espectral (SKY) permitem que todos os cromossomos de uma

metáfase sejam identificados com cores diferentes (SCHRÖCK et al., 1996; SPEICHER et al.,

1996). Entretanto, assim como a técnica convencional de bandamento GTG, esses métodos

exigem que os cromossomos estejam em metáfases, não podendo ser aplicadas aos núcleos

interfásicos. O desenvolvimento da técnica de CGH parece responder algumas questões não

resolvidas pela FISH, permitindo a análise de todo o material cromossômico da célula.

Em 2004, GUTIERREZ-MATEO e colaboradores confirmaram a aplicabilidade da CGH no

diagnóstico pré-implantacional e relataram uma taxa de 48% de aneuploidias em sua amostra.

Segundo os autores, 58,3% das anomalias observadas não seriam detectadas com a análise de 5

cromossomos (X, Y, 13, 18 e 21) (KULIEV et al., 2003; MONTAG et al., 2004); 31,3% dessas

alterações ainda não seriam identificadas pela FISH com 11 cromossomos (X, Y, 8, 9, 13, 15, 16,

17, 18, 21 e 22) (www.reprogenetics.com) e aproximadamente 25% dos casos não seriam

Discussão

120

diagnosticados pelo protocolo de 9 sondas (1, 13, 15, 16, 17, 18, 21 e 22) descrito por PUJOL e

colaboradores (2003).

Na literatura, poucos embriões foram estudados por CGH, entretanto já é possível confirmar

e ampliar os achados citogenéticos obtidos por FISH (WELLS & LEVY, 2003). Algumas

aneuploidias incomuns, como monossomia de cromossomos dos grupos A e B e de nulissomias,

têm sido detectadas pelas duas técnicas. Presume-se que essas alterações cromossômicas

começam a limitar o desenvolvimento embrionário assim que iniciada a expressão gênica no

embrião (WELLS & DELHANTY, 2000; VOULLAIRE et al., 2000). A aplicação da hibridação

comparativa em blastômeros também confirmou a alta freqüência de mosaicismo em embriões

pré-implantação, particularmente em embriões classificados como mosaicos “caóticos”. Esse tipo

de embrião contém células com múltiplas aneuploidias, devido a uma falência no mecanismo de

segregação meiótica da célula. A existência de embriões caóticos foi inicialmente detectada pela

FISH, mas sua caracterização completa só foi feita pela técnica de CGH, revelando que um

núcleo caótico pode apresentar até 14 cromossomos alterados simultaneamente (WELLS &

DELHANTY, 2000).

Todos os blastômeros analisados neste estudo apresentaram alterações numéricas em pelo

menos dois pares cromossômicos, sendo que as aneuploidias para os cromossomos sexuais e o

cromossomo 15 foram observadas com maior freqüência (92,8%) enquanto o cromossomos 6

apresentou a menor freqüência (14,3%). Embora a elevada taxa de aneuploidia possa ser

correlacionada à metodologia utilizada, as características da amostra também podem justificar

nossos resultados. Além de terem sido mantidos em cultivo por mais de 5 dias, os embriões

empregados neste trabalho não alcançavam os critérios morfológicos e o padrão mínino de

desenvolvimento para serem transferidos para o útero materno ou mesmo criopreservados. De

acordo com a literatura (MAGLI et al., 1998; BIELANSKA et al., 2002; ZIEBE et al., 2003; DE

UGARTE et al, 2008), estas características estão intimamente relacionadas com a alto índice de

anomalias cromossômicas em embriões em estágio pré-implantacional cultivados in vitro.

Discussão

121

Com o intuito de descartar possíveis erros resultantes da aplicação de novas sondas de DNA

(One Cell System, Inc.) para diagnóstico, realizamos uma quarta etapa de hibridação com sondas

amplamente testadas na literatura (cromossomos 13 e 21, Vysis Inc.) em três núcleos que

mantiveram a morfologia após os ciclos anteriores de hibridação. A detecção de alterações

numéricas para os cromossomos 13 e 21 evidenciaram a presença de aneuploidias nestes núcleos,

confirmando a eficiência das sondas de oligonucleotídeos. A validação dos resultados indica que

o procedimento pode ser utilizado para qualquer seqüência cromossomo-específica, tornando

viável o diagnóstico de aneuploidia de diferentes cromossomos em célula única.

Por se tratar do método diagnóstico mais utilizado no PGD (SERMON et al., 2007), DE

UGARTE e colaboradores (2008) reavaliaram 241 embriões previamente diagnosticados por

FISH para determinar o VPP (Valor Preditivo Positivo) e o VPN (Valor Preditivo Negativo) da

técnica quando aplicada para diagnóstico pré-implantacional. Os autores determinaram os valores

para VPP e VPN como sendo 83 e 81% respectivamente, responsabilizando a presença de

mosaicismo embrionário pela maior parte dos erros encontrados no diagnóstico por FISH.

Nossos resultados confirmaram a eficiência da técnica de FISH mesmo após séries sucessivas

de hibridação. A utilização de sondas cromossômicas combinadas possibilitou uma ampliação do

diagnóstico de aneuploidias em células únicas e, principalmente introduziu, com sucesso, o uso

de sondas de oligonucleotídeos; acessíveis comercialmente aos países em desenvolvimento.

122

CONCLUSÕES

(1) O protocolo de FISH estabelecido com objetivo de determinar o diagnóstico pré-

implantacional em blastômeros foi eficaz na detecção de aneuploidias de 14 pares

cromossômicos.

(2) As sondas de oligonucleotideos para diagnóstico de aneuploidias cromossômicas

mostraram taxa de hibridação entre 81,8 e 100% para os cromossomos 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10,

12, 15, 16, 17, 20, X e Y. A sonda especifica da região 9q12 foi considerada ineficaz para

diagnóstico, devido a sua baixa taxa de hibridação (25%).

.

123

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Anexo B

129

ANEXO B

Reagentes e Soluções:

ISOLAMENTO CELULAR

Solução de Isolamento: tampão fosfato (PBS)-0,1% polivinil álcool (PVA)

Foi preparada uma solução 10x PBS livre de Ca+2 e Mg+2 (80g de NaCl; 25,08g de

Na2HPO4 dihidratado, 2g de KCl e 1,5g de KH2PO4 dissolvidos em 1l de água miliQ). Esta

solução é então autoclavada e tem o pH ajustado para 7,2. Partindo da dessa concentração

é feita uma diluição 1/10 adicionando 100ml de 10xPBS em 900ml de água miliQ. Na

solução de PBS já diluída adiciona-se 1g de PVA, que então é filtrada e estocada em

alíquotas de 1,5ml. O PVA evita que as células se fixem na superfície da placa e o PBS livre

de Ca+2 e Mg+2 desestabiliza os íons intracelulares e faz com que as células se desagreguem

mais facilmente.

FIXAÇÃO DE BLASTÔMEROS

Solução Hipotônica: (1% citrato de sódio)

A solução de citrato de sódio foi escolhida em detrimento da solução alternativa de KCl

por evitar lise celular. Diluiu-se 10g do sal citrato de sódio em 1litro de água miliQ.

Fixador Carnoy:

Utilizou-se, como fixador, a solução Carnoy (3 partes de metanol para 1 de ácido acético

glacial) à 4ºC. Esta solução deve ser refeita a cada fez que for utilizada.

Anexo B

130

HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE

Sondas de Oligonucleotídeos:

Foram utilizados oligonucleotídeos marcados com diferentes fluorocromos(One Cell

Systems, Inc.) para 15 cromossomos diferentes. As sondas foram diluídas na concentração

1:1 (sonda: tampão de hibridação), de acordo com a indicação do fabricante.

Washing Solution : (0,2xSSC/ 0,1% SDS)

Adicionou-se 1ml de SDS (sodium dodecyl sulphate, Sigma) em 100ml de solução 2xSSC

(10ml 20xSSC + 90ml água miliQ).

20xSSC:

Em 1litro de água miliQ devem ser diluídos 88g de citrato tri-sódico dihidratato e 175g

de cloreto de sódio. O pH da solução deve ser ajustado em 5,5.

2xSSC:

Para 100ml de solução, 10ml de 20xSSC deve ser adicionada a 90ml de água miliQ e o

pH ajustado entre 6,8 e 7,2.

131

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W


138

MANUSCRITO

139

PREFERENTIAL MEIOTIC SEGREGATION CONFIRMED BY

PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS

Juliana F. Cuzzi (1); Lúcia Martelli (1); Claudia G. Petersen (2); Ana L. Mauri (2); Ricardo L. R. Baruffi

(2); José G. Franco Jr. (2)

(1)Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto – University of São Paulo,

Brazil

(2) Center of Human Reproduction, Sinhá Junqueira Maternity Hospital, Ribeirão Preto, São

Paulo, Brazil

Running tittle: PGD for balanced translocations


Dept. Genetics, School of Medicine of Ribeirao Preto, USP

Av Bandeirantes, 3900.

Ribeirao Preto-SP, Brazil

14040-030

Phone: +55 16 602-3081 / Fax: +55 16 633-1610

e-mail: [email protected]

140

ABSTRACT

Chromosome translocations can originate abnormal gametes which are responsible for

embryos with unbalanced karyotypes and, consequently, for first trimester abortions, fetal losses

or malformed liveborns due to a variety of chromosomal syndromes. Preimplantation genetic

diagnosis (PGD) is an early form of prenatal diagnosis, which makes it possible to detect genetic

disorders in oocytes and human embryos. In this study, we have performed PGD in two young

couples who presented 2 miscarriages, both due to a maternal reciprocal translocation. In the

first couple (A), the woman was the carrier of a Robertsonian translocation involving

chromosomes 13 and 14, with karyotype 45,XX,der(13;14)(q10;q10). In the second (couple B),

the reciprocal balanced translocation involves the chromosomes 7 and 18, with karyotype

46,XX,t(7;18)(q31;q22). Our objective was to establish a molecular cytogenetic diagnosis, to

indicate the transfer of normal embryos. In Couple A, seven embryos were biopsied at the 6–10-

cell stage, and 8 intact blastomeres were obtained and spread individually. During fixation, no

nuclei were observed in 2 blastomeres removed from distinct embryos, and 6 nuclei were

submitted to fluorescent in situ hybridization (FISH) technique, using 14q telomeric and LSI –

13q14 probes. The hybridization index was 100%. All nuclei showed 2 signals corresponding to

chromosome 14, but presented aneuploidy of chromosome 13, three of them being monosomic

and two trisomic. In Couple B, five embryos were biopsied and 5 intact blastomeres were

obtained and submitted to FISH technique, using 7q telomeric and 18q telomeric probes. All

nuclei showed 2 signals related to chromosome 18 and aneuploidy of chromosome 7, three of

them being trisomic and two monosomic. Therefore, the transfer of the embryos was not

indicated in both cases. The PGD results suggested that these women are developing a

preferential meiotic segregation being all oocytes abnormal for one of the involved

chromosomes. PGD made it possible not only the embryos selection, as the definition of the risk

for the offspring, preventing embryo implantation failure, fetal losses or affected newborns.

Key Words: PGD, Robertsonian Translocation, Meiotic Segregation

141

INTRODUCTION

Balanced translocations occur in 0.2% of the newborn population, but cytogenetic

investigations have shown that the frequency of translocations is higher in couples with

recurrent spontaneous abortions. Reciprocal translocations are usually phenotypically

harmless, since there is a balanced gene complement. Translocations, however, are

associated with the production of a large number of gametes with an unbalanced genetic

complement and therefore with an increased potential for one or more spontaneous

abortions or phenotypically abnormal liveborns.

According to Stern et al. (1999), balanced translocations were found in 0.6% of

infertile couples, in 3.2% of couples who failed more than 10 IVF cycles, and in 9.2% of

fertile couples who experienced three or more consecutive first trimester abortions. The

frequency of Robertsonian translocations was around 0.7%, usually carried by the mother.

Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is a very early form of prenatal diagnosis

that makes the detection of hereditary genetic diseases possible in human embryos.

However, only 25% of the blastomere nuclei show metaphase chromosomes after anti-

meiotic treatment, and even fewer nuclei show banding quality chromosomes (Santaló et al.,

1995). For this reason, several techniques involving alternative ways to obtain metaphase

stage chromosomes have been developed. Whenever metaphases are not available,

diagnosis is made using FISH technique in interphase nuclei.

Preimplantation genetic diagnosis (PGD) can be offered to carriers of balanced

translocations to reduce the risk of the unbalanced transmission of aberrant chromosomes.

PGD can thus reduce the risk of chromosomally abnormal offspring, reduce the frequency

of miscarriages and, as a result, increase the baby take home rate. In 2001, the ESHRE

consortium has reported 51 PGD cycles for carriers of Robertsonian translocations and 96

PGD cycles for carriers of balanced reciprocal translocations (ESHRE PGD Consortium

142

Steering Committee, 2002). The large majority of reciprocal translocations are terminal

translocations. It is well established that reciprocal translocations form quadrivalents during

meiosis which, in turn, lead to a higher incidence of chromosomal anomalies (Goldman and

Hulten, 1993; Martin and Hulten, 1993). Not only can the 2:2 segregants be unbalanced for

the translocation chromosomes, but also a higher incidence of 3:1 segregants resulting in

aneuploidy for the abnormal chromosomes was observed. PGD of such translocations has

been performed by fluorescence in situ hybridization (FISH), using a variety of approaches

(Scriven et al., 1998). The most common approach is FISH on blastomeres, with specific

probes spanning the breakpoints of each translocation (Munné et al., 1998).

Another possibility is the spectral karyotyping, used to identify all 23 chromosomes

in polar bodies, but this technique requires well-spread chromosomes in order to identify

each one of them (Márquez et al., 1998). Having observed that more than 90% first polar

bodies fixed up to six hours after retrieval were at the metaphase stage, Munné et al. (1998)

proposed metaphase analysis of first polar bodies. However, this approach presents some

problems, like the occurrence of crossing-over and predivision of chromatids, interstitial

crossover with subsequent segregation of balanced and unbalanced sets of chromosomes

during the second meiotic division, and the state of condensation of polar body

chromosomes, making difficult the diagnosis of terminal translocations.

Willadsen et al. (1999) described another method of obtaining metaphase

chromosomes, but from blastomeres. Human blastomeres were fused with enucleated cow

oocytes, and the nuclei changed to metaphase. The fused blastomeres can be either banded

or analyzed with painting probes or spectral karyotyping.

Considering all the technical difficulties and the time-consuming, the FISH

technique is the best choice for PGD of translocations.

143

In our study, we describe the development of PGD in two couples where the

women are the carriers of a Robertsonian translocation between chromosomes 13 and 14

and a apparently balanced translocation between chromosomes 7 and 18. The protocol

involved hybridization of specific probes with interphase nuclei obtained from embryos at

the third day of in vitro development. The objective was to detect embryos with

aneuploidies and unbalanced karyotypes, to avoid implantation failure, abortion or fetal

loss.

144

SUBJECTS AND METHODS

Patients

Both non consanguineous couples was referred to Human Reproduction Centre

presenting two miscarriages due to maternal balanced translocations. Investigative protocol

for infertility has excluded hormonal, biochemical and immunological etiologic fators.

Blastomere biopsy and spreading

Embryos at the 7–10-cell stage were placed in oil 25µL drops of magnesium and

calcium-free medium. Each embryo was immobilized against a holding pipette, and an

opening was made in the zona pellucida using laser (15 to 25 milli seconds of irradiation

time). The blastomere was extracted using a biopsy pipette controlled by a Narashige IM-6

microinjector. The biopsied embryos returned to culture, and the isolated blastomeres were

fixed on to slides using a spreading solution (0.01 HCl/ 1%Tween 20) at 37oC. The

blastomere was constantly observed under an inverted microscope, and, after lysis, the

spreading solution was removed. Slides were dried for 1h at room temperature, and then

FISH was carried out.

FISH technique

Slides were washed in PBS for 5 min and then fixed in Carnoy solution at 4o C for

10 min. After fixation, the slides were rinsed once in PBS, then twice in bi-distilled water,

and then dehydrated in an ethanol series (70% - 90% - 100%). For the Couple A, seven

embryos were biopsied and 6 nuclei were submitted to fluorescent in situ hybridization

145

(FISH) technique, using 14q telomeric and LSI – 13q14 probes. Regarding the Couple B,

five embryos were biopsied and 5 blastomeres were obtained and submitted to FISH

technique, using 7q and 18q telomeric probes.

The hybridization mixture (3.0 µL probe and 7.0 µL of buffer from Vysis, Inc.) was added

to the slide under a cover slip. Nuclear DNA and probes were denatured simultaneously

for 2 min at 75o C. The slides were then incubated overnight in a moist chamber at 37o C, to

allow hybridization with the DNA probes. After hybridization, the slides were washed two

times with 50% formamide/ 2 x SSC, 5 min each, and with 2 x SSC for 5 min at 42oC,

followed by two additional washes with 2 x SSC/ 0,1% NP40, 2 min each at room

temperature, and then dehydrated in an ethanol series (70-90-100%). Then the slides were

counterstained with DAPI and examined using a Zeiss epifluorescence microscope.

146

RESULTS

The results are summarized in table 1 and 2. The table 1 shows the FISH results

for single blastomeres related to Couple A. A total of 7 embryos were biopsied, and 8

intact blastomeres were obtained. We did not observe nuclei in 2 blastomeres (blastomeres

4 and 5). From the 8 blastomeres spread, 6 nuclei were obtained, giving a spreading

efficiency of 75%. All 6 nuclei exhibited a FISH signal, 100% per nucleus and 75% per

blastomere. All nuclei were normal regarding chromosome 14, but abnormal regarding

chromosome 13. In this case, none of the embryos was indicated for transfer. Table 2

resume the FISH results for single blastomeres in Couple B. Five embryos were biopsied,

we had 5 blastomeres spreaded (100% of spreading eficiency) and 4 nuclei showed FISH

conclusive signals. In this case we had 80% of hybridation efficiency. All nuclei were

normal regarding chromosome 18, but abnormal regarding chromosome 7. As we

determineted for couple A, we did not indicate embryo transfer for couple B.

147

DISCUSSION

The present study describes a preimplantation genetic diagnosis (PGD) approach to

a Robertsonian translocation and a balanced tranlocation of maternal origin. PGD was

based on FISH analysis using specific probes in interphase nuclei to select euploid

embryos, aiming at ensuring a normal pregnancy. This procedure does not allow

differentiating normal from balanced embryos, so both should be transferred.

Ten embryos reported here were aneuploidies (trisomic or monosomic) for

chromosome 13 (couple A) or chromosome 18 (couple B) due to adjacent mode of meiotic

segregation.

For most translocation carriers, consecutive pregnancy losses are the main

motivation for seeking PGD procedures. The unbalanced products of translocations are

usually incompatible with life, therefore increasing the risk of pregnancy loss. Some studies

have demonstrated that PGD substantially increases the chances of couples with

translocations of sustaining a pregnancy to full term.

Menezo et al. (1997) suggested that growing embryos to the blastocyst stage may

select against unbalanced embryos, but, according to Munné (2001), this procedure is

unreliable, at best because many unbalanced embryos, in this stage of development,

implant and are then spontaneously aborted.

The ten embryos reported here were aneuploid (trisomic or monosomic) for

chromosomes 13 and 7, due to the adjacent mode of meiotic segregation (Figures 1, 2, 3

and 4). The meiotic segregation patterns found in female Robertsonian translocations are

different from those described in male carriers, with higher rates of unbalanced gametes in

females than in males (Munné et al., 2000).

Little is known at the gamete and embryo level about chromosome segregation in

female carriers of balanced translocations. Data available on female translocation carriers

148

report only rates of spontaneous abortions and live births. Since most unbalanced

segregations have to be considered as lethal, no reliable information is available on female

segregation of translocations. PGD of translocations should provide important information

regarding this subject; in particular, it will be very informative for Robertsonian

translocations and for reciprocal translocations of patients producing large cohorts of

oocytes.

Ogilvie and Scriven (2002) presented data collected from 25 PGD cycles of 18

couples carrying 15 different reciprocal translocations. Overall, 47.7% of the embryos

tested showed signal patterns consistent with alternate segregation, 24.8% with adjacent-1

segregation, 10.1% with adjacent-2 segregation, and 17.4% others. The frequencies of

alternate and adjacent-1 segregation were similar in male and female carriers; however,

5.7% of the embryos from female translocation carriers showed adjacent-2 segregation,

while the corresponding figure for male carriers was 4.5%.

According to Boué and Gallano (1984), amniocenteses from carriers of 45,XY,

der(14;21)(q10;q10) and 45,XY,der(21;22)(q10;q10) karyotypes showed almost no

unbalanced karyotypes when the origin was paternal, but 15% when it was maternal. In

1998, Munné et al. published a PGD study on translocations of maternal origin in polar

bodies, concluding that 23% of the oocytes were unbalanced.

This is the first Brazilian report of preimplantation genetic diagnosis (PGD) of a

balanced translocation and shows that the PGD approach applied to these couples was

efficient for diagnosis of unbalanced abnormalities. All tested embryos were originated

from meiotic adjacent segregation oocytes. Our findings confirmed that, in maternal

translocations, the rate of abnormal embryos can be 100% due to a preerential mechanism

of meiotic segregation.

149

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151

LEGENDS

Table 1. Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labeled

probes for chromosomes 13 (LSI 13q14) and 14 (tel 14q) on interphase nuclei obtained by

biopsy from couple A blastomeres.

Table 2. Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labelled

probes for chromosomes 7 (tel 7q) and 18 (tel 18q) on interphase nuclei obtained by biopsy

from couple B blastomeres.

Figure 1: Monosomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric

14q probe and 1 green signal corresponding to LSI 13q14.

Figure 2: Trisomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric 14q

probe and 3 green signals corresponding to LSI 13q14.

152

Table 1: Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labeled

probes for chromosomes 13 (LSI 13q14) and 14 (tel 14q) on interphase nuclei

obtained by biopsy from human blastomeres.

Blastomere

Reference

Nuclei

Reference

Probes signals

13 14 FISH result

1 1A 3 signals 2 signals TRISOMY 13

2 2A 1 signal 2 signals MONOSOMY 13

3 3A 1signal 2 signals MONOSOMY 13

6 6A 1signal 2 signals MONOSOMY 13

7 7A

7B

3 signals

3 signals

2 signals

2 signals

TRISOMY 13

TRISOMY 13

153

Table 2. Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labelled probes for

chromosomes 7 (tel 7q) and 18 (tel 18q) on interphase nuclei obtained by biopsy from

couple B blastomeres.

Blastomere

Reference

Nuclei

Reference

Probes signals

7 18 FISH result

1 1A 1 signal 2 signals MONOSOMY 7


3 2A 3 signals 2 siagnals TRISOMY 7

4 4A - - INCONCLUSIVE


154

Figure 1: Monosomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric 14q probe

and 1 green signal corresponding to LSI 13q14.

Figure 2: Trisomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric 14q probe and

3 green signals corresponding to LSI 13q14

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