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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos
Área de Bromatologia
Atividade anti-inflamatória de extrato fenólico de tomate roxo (Solanum Lycopersicum L.) em camundongo em modelo de peritonite induzido pelo
LPS
Afonso Pinho da Silva Maia
Dissertação para obtenção do grau de
MESTRE.
Orientador:
Profa. Dra. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto
São Paulo 2015
AFONSO PINHO DA SILVA MAIA
Atividade anti-inflamatória de extrato fenólico de tomate roxo (Solanum Lycopersicum L.) em camundongo em modelo de peritonite induzido pelo LPS
Versão corrigida
Tese apresentada ao Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo para obtenção do grau de MESTRE em Ciências dos Alimentos.
Área de Concentração: Bromatologia
Orientador: Profa. Dra. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto
São Paulo 2015
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Afonso Pinho da Silva Maia
Atividade anti-inflamatória de extrato fenólico de tomate roxo (Solanum Lycopersicum L.) em camundongo em modelo de peritonite induzido pelo LPS
Versão corrigida
Comissão julgadora da
dissertação para obtenção do grau de Mestre
_____________________________________________ Profa. Dra. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto
orientadora/presidente
_________________________________________ Prof. Tit. Jorge Mancini Filho - 1º examinador
_________________________________________ Prof. Dr. William Tadeu Lara Festuccia2º examinador
São Paulo, 11 de março de 2015
Dedico este trabalho
aos meus queridos pais, Mário e Sandra, e à minha amada irmã, Bruna.
Família símbolo de união, força e amor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais e irmã, sem minha família me apoiando em todos
os momentos que passei nessa jornada não teria dado um único passo a diante.
Foi mais suave a minha caminhada tendo-os ao meu lado.
Aos meus familiares, especialmente às minhas avós, que sempre me
desejaram o melhor e sempre me recebiam de braços abertos a cada visita à
minha cidade natal; e a meu primo Hugo agradeço por não deixar me sentir mais
um em alguns milhões em São Paulo e pelo abrigo sempre que precisei.
Aos meus amigos/irmãos de Resende, vocês sempre participaram da
minha vida de forma especial. Obrigado por me fazer lembrar os momentos bons
e nunca me esquecer das minhas origens, de quem eu sou.
A todos os profissionais que estiveram envolvidos no meu processo de
educação, em especial aos meus professores de graduação. Sem o
conhecimento dividido por vocês, hoje não estaria tão perto de ser semelhante
ao profissional que sempre me cativaram a ser.
Aos meus amigos de graduação saibam que a pessoa que me torno a
partir deste momento conta, e sempre contou, com a ajuda e lembrança de
vocês.
Agradeço imensamente ao Prof. Tit. Dr. Franco Maria Lajolo por,
primeiramente, ter lido um simples email que mudaria minha vida e
consequentemente ter enxergado em mim um potencial a ser lapidado e me
encaminhado à minha orientadora.
À Profa. Dra. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto eu agradeço
profundamente à oportunidade me dada a fazer um sonho se tornar realidade. A
atenção e a paciência que teve em me ensinar e dividir todo seu conhecimento
científico, profissional e pessoal. Obrigado por me orientar a sempre procurar
acertar, mesmo que tenhamos as maiores dificuldades pelo caminho.
Aos professores do departamento Dra. Beatriz Cordenunsi, Dr. João
Paulo Fabi, Dr. Eduardo Purgatto e Dr. João Roberto Oliveira, agradeço as
oportunidades em que tive de observá-los e poder absorver aquilo que de melhor
tinham a me oferecer. Aos queridos técnicos; Márcia Moraes, Tânia Shiga, Elias
Araújo, Aline Santos e Lúcia Justino agradeço desde os abraços molhados aos
puxões de orelha. A todos os funcionários da secretaria do departamento,
obrigado por me ajudarem auxiliando em todos os problemas e dúvidas que tive
durante esse período.
À minha família de laboratório divido minha vitória. Amigos, desde o
momento em que cheguei ao laboratório considero todos vocês como meus
irmãos. Agradeço a todos por sempre terem me escutado, por terem gargalhado
comigo mesmo quando não podíamos, agradeço por sempre ter alguém para
almoçar ao meu lado, agradeço pelos conhecimentos divididos, pelas piadas
contadas, pelas muitas caronas, agradeço por terem se importado comigo. Serei
eternamente agradecido: pelos carinhos/mimos das minhas menininhas Talita
Nascimento, Juliana Nunes e Renata Shitakubo; pelas caronas, abrigo e, por
que não, biritas do Victor Castro-Alves, Eric Tobaruela e Samira Prado; as ajudas
de Ana Sansone e a parceria de Marcelo Sansone; e as conversas sobre todos
os assuntos imagináveis com Florence Castelan, Lorenzo Saraiva, Maria
Fernanda Nobre, Gabriela Schmitz, Bruna Lima, Deborah DeFusco, Vanessa
Bonato, Fernanda Peroni e Roberta Guedini. Saibam que estão todos no meu
coração, guardo todos os momentos com muito carinho e amor. Muito obrigado
por terem feito tudo parecer mais fácil, por terem me incentivado a conquistar e
acreditar no que parecia distante e impossível.
Agradeço em especial às minhas colegas do grupo dos flavonoides,
Manuela Brito, Luciane Teixeira, Ana Marla Duarte, Mariana Souto, Regina
Stanquevis, Sara de Lima e Daniela Chaves. Sem o apoio de vocês sorrir todos
os dias seria bem mais difícil. Obrigado pelas ajudas profissionais e pessoais.
Agradeço à Universidade de São Paulo por toda infraestrutura a mim
ofertada para que me tornasse um profissional, e até mesmo, um “atleta” melhor.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e ao Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos da
Universidade de São Paulo pela oportunidade e apoio financeiro.
A todos que, de alguma forma, tenham me ajudado em algum momento
que precisei.
E finalmente, agradeço a Deus e a Nossa Senhora Aparecida por terem
me guiado no caminho da paz e da sabedoria e me protegido de todos os
perigos.
“O único verdadeiro fracasso é o de não haver tentado.
E o sucesso se mede pela forma como lidamos com as decepções.
É o que sempre devemos fazer.
Viemos aqui, e tentamos.
Cada um a sua maneira.
É nossa culpa achar que somos muito velhos para mudar?
Com medo da decepção para começarmos novamente?
Nós nos levantamos de manhã,
e fazemos o melhor que podemos.
Nada mais importa.”
Trecho de O Excêntrico Hotel Marigold.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de quadros
Resumo
Abstract
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20
2.1 FLAVONOIDES 20
2.1.1 Características estruturais 20
2.1.2 Biossíntese 24
2.1.3 Biodisponibilidade dos compostos fenólicos 26
2.2 PROPRIEDADES DOS FLAVONOIDES 29
2.2.1 Atividade antioxidante 29
2.2.2 Atividade anti-inflamatória 31
2.3 TOMATE ROXO 36
3. OBJETIVO 39
4. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO
DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO TOMATE ROXO 40
4.1 MATERIAL E MÉTODOS 40
4.1.1 MATERIAL 40
4.1.1.1. Amostra 40
4.1.1.2. Preparo da amostra 40
4.1.2 MÉTODOS 40
4.1.2.1. Extração de compostos fenólicos 40
4.1.2.2. Determinação de fenólicos totais 41
4.1.2.3. Capacidade antioxidante 41
4.1.2.3.1. Método Oxygen radical assay capacity (ORAC) 41
4.1.2.3.2. Método DPPH 42
4.1.2.4. Extração de flavonoides 42
4.1.2.5. Extração de fase sólida 43
4.1.2.6. Cromatografia líquida de alta eficiência - DAD 43
4.1.2.7. LC-ESI-MS/MS 44
4.1.2.8. Determinação de ácido ascórbico 45
4.1.2.9. Análise estatística 45
4.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO 46
5. ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO
FENÓLICO DE TOMATE ROXO 66
5.1 MÉTODOS 66
5.1.1 Preparo do extrato aquoso 66
5.1.2 Delineamento experimental 66
5.1.2.1. Estudo de inflamação 67
5.1.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) 68
5.1.4 Determinação da concentração de citocinas no exsudato
peritoneal 68
5.1.5 Estudo de absorção 69
5.1.6 Extração de flavonoides do fígado de camundongo 70
5.1.7 Análise estatística 70
5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO 71
5.2.1 Influxo leucocitário 71
5.2.2 Expressão gênica de mRNA de COX-2 73
5.2.3 Concentração de citocinas no exsudato peritoneal 74
5.2.4 Absorção dos compostos fenólicos do tomate roxo 80
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 84
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 85
8. ANEXO 95
LISTA DE ABREVIATURAS
AsA Ácido ascórbico
AAPH 2,2’- azobis (2-amidinopropano) dihidrocloreto
ABG Aubergine
AFT Anthocyanin fruit
AG Ácido gálico
ATV atroviolaceum
CAT Catalase
CHI Chalcona isomerase
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
COX Ciclo-oxigenase
DCNT Doenças crônicas não transmissíveis
DNA Deoxyribonucleic acid / Ácido desoxirribonucleico
DPPH Radical α,α-difenil-β-picrilhidrazina
ERN Espécie reativa de nitrogênio
ERO Espécie reativa de oxigênio
FAO Food and Agriculture Organization
GPx Glutationa peroxidase
GST Glutationa S-transferase
ICAM-1 Intercellular cell adhesion molecule - 1 / Molécula de
adesão intracelular-1
IL Interleucina
iNOS Inducible oxide nitric synthase / Óxido nítrico sintetase
indutível
LOO• Radical peroxil
LOX Lipo-oxigenase
LPS Lipopolissacarídeo
MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1 / Proteína quimiotática
de monócito-1
mKC murine keratinocyte-derived chemokine / Quimiocina
específica para neutrófico
NF-κB Fator de transcrição kappa B
NO Óxido Nítrico
OMS Organização Mundial de Saúde
ORAC Oxygen radical assay capacity
PGE-2 Prostaglandina E 2
SGLT-1 Sodium-dependent glucose transporter – 1 / Transportador
de glicose sódio-dependente
SOD Superóxido dismutase
SUS Sistema único de saúde
TNF-α Fator de necrose tumoral α
VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule -1 / Molécula de adesão
de célula vascular-1
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura básica dos flavonoides. 20 Figura 2 Classificação dos flavonoides em subclasses. 22 Figura 3 Estrutura básica das principais antocianidinas
encontradas nos alimentos vegetais. 23
Figura 4 Rota biossintética dos flavonoides. 25 Figura 5 Via da absorção dos flavonoides. 29 Figura 6 Reação redox entre um flavonoide e um grupamento
peroxil. 30
Figura 7 Relação entre o processo inflamatório crônico e o
desenvolvimento de doenças crônicas. 33
Figura 8 Possível papel dos flavonoides nas vias de sinalização
da cascata inflamatória induzida por LPS/AGS. 35
Figura 9 Piramidação de genes para obtenção do tomate roxo. 37 Figura 10 Rota biossintética das antocianinas no tomate. 38 Figura 11 Cromatograma obtido por CLAE-DAD (270 nm) dos
flavonoides presentes na casca (A) e polpa (B) do tomate roxo.
50
Figura 12 Principais compostos fenólicos encontrados no tomate
roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv. 51
Figura 13 Espectro de massas (MS2) de flavonoides
encontrados na casca do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv obtidos por LC-ESI -MS/MS, em modo positivo.
54
Figura 14 Espectro de massas (MS2) de flavonoides
encontrados na casca do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv obtidos por LC-ESI -MS/MS, em modo negativo.
57
Figura 15
Cromatograma obtido por CLAE-DAD (270 nm) dos flavonoides presentes na casca (A) e polpa (B) do tomate vermelho (MT).
58
Figura 16 Espectro de massas (MS2) de flavonoides encontrados na casca do tomate vermelho (MT) obtidos por LC-ESI -MS/MS, em modo positivo.
61
Figura 17 Espectro de massas (MS2) de flavonoides
encontrados na casca do tomate vermelho (MT) obtidos por LC-ESI -MS/MS, em modo positivo.
63
Figura 18 Comparação entre tomate roxo obtido por piramidação
do genes Aft, Abg e atv (A) e tomate vermelho- MT (B). 64
Figura 19 Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por
piramidação do genes Aft, Abg e atv no influxo leucocitário em modelo de peritonite induzida por LPS.
72
Figura 20
Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv na expressão de mRNA de COX-2 em modelo de peritonite induzida por LPS.
73
Figura 21 Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por
piramidação do genes Aft, Abg e atv na concentração de citocinas pró-inflamatórias no exsudato em modelo de peritonite induzida por LPS.
75
Figura 22 Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por
piramidação do genes Aft, Abg e atv na concentração de MCP-1 e mKC no exsudato em modelo de peritonite induzida por LPS.
76
Figura 23 Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por
piramidação do genes Aft, Abg e atv na concentração das citocinas anti-inflamatórias no exsudato em modelo de peritonite induzida por LPS.
77
Figura 24 Espectro de massas (MS2) de flavonoides
encontrados no fígado dos animais tratados com extrato fenólico de tomate roxo obtidos por LC-ESI -MS/MS, em modo positivo.
81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante, avaliada pelos métodos DPPH e ORAC, de tomate roxo, obtido por piramidação dos genes Aft, Abg e atv, e de tomate vermelho-Micro Tom (MT)
46
Tabela 2 Conteúdo de ácido ascórbico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv e de tomate vermelho-MT.
48
Tabela 3 Conteúdo dos flavonoides e ácidos fenólicos do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv.
49
Tabela 4
Composição de compostos fenólicos da casca do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv identificados por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo.
52
Tabela 5
Composição de compostos fenólicos da polpa do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv detectados por LC-ESI-MS/MS, em modo negativo.
55
Tabela 6 Conteúdo dos flavonoides e ácidos fenólicos do tomate vermelho (MT).
59
Tabela 7 Composição de compostos fenólicos da casca do tomate vermelho (MT) identificados por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo.
60
Tabela 8 Composição de compostos fenólicos da polpa do tomate vermelho (MT) identificados por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo.
62
Tabela 9 Flavonoides encontrados no fígado dos animais tratados com extrato fenólico de tomate roxo obtidos por LC-ESI -MS/MS, em modo positivo.
80
RESUMO
MAIA, A.P.S. Atividade anti-inflamatória de extrato fenólico de tomate roxo
(Solanum Lycopersicum L.) em camundongo em modelo de peritonite
induzido pelo LPS. 2015. 101p. (Dissertação de mestrado). Faculdade de
Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
Visando a produção de um alimento que possua elevados teores de compostos bioativos, a piramidação de genes é uma técnica capaz de estimular o acúmulo e a expressão de novas classes de flavonoides em tecidos vegetais, como por exemplo, o tomate roxo, rico em antocianinas. As antocianinas podem atenuar o processo inflamatório através da modulação da cascata de sinalização e da expressão de enzimas, sendo este um dos possíveis mecanismos de ação que leva a promoção da saúde, atribuído a esta classe de compostos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a ação anti-inflamatória do extrato de tomate roxo, obtido por piramidação dos genes Anthocyanin Fruit (Aft), Aubergine (Abg) e atroviolaceum (atv), em camundongos submetidos ao modelo de peritonite induzida por lipopolissacarídeo (LPS). O fruto tomate vermelho - Micro Tom (MT) e o transformado foram caracterizados quanto ao seu perfil de compostos fenólicos. A casca do tomate roxo, rica em antocianinas, apresentou conteúdo de fenólicos totais dez vezes maior quando comparado à casca do MT, apresentando também maiores quantidades de ácido ascórbico e capacidade antioxidante avaliado nos métodos DPPH e ORAC; em relação à polpa e casca do tomate vermelho e a polpa do tomate roxo. Os principais flavonoides identificados na casca do tomate roxo, por CLAE-DAD, foram: as antocianidinas petunidina (86,5 mg/100 g b.u.), delfinidina (6,85 mg/100 g b.u.), principalmente na forma acilada, e o flavonol rutina (106,26 mg/100 g b.u.). A propriedade anti-inflamatória dos compostos fenólicos foi avaliada através de um modelo de peritonite, em camundongos, induzida por LPS. O extrato aquoso do tomate roxo, rico em antocianinas (2 e 4 mg petunidina eq./100 g peso corpóreo) foi administrado, por via oral, 30 minutos antes do estímulo inflamatório. No exsudato peritoneal, coletado após 3h do estímulo, foi observada, no grupo que recebeu 4 mg quando comparado ao grupo estimulado com LPS, uma redução significativa (p<0,05) de cerca de 37% no número de leucócitos totais e de 64% na expressão gênica de mRNA de COX-2 e na produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 e MCP-1), assim como um aumento significativo da citocina anti-inflamatória IL-10. Em estudo de absorção, os metabólitos: delfinidina aglicona (m/z 303) e malvidina aglicona (m/z 331) foram detectados, por cromatografia líquida – ESI-MS/MS, nas amostras de fígado dos animais eutanasiados após 30 minutos de administração do extrato do tomate roxo. Portanto, os resultados demonstram que as antocianinas presentes no tomate roxo, por meio dos metabólitos encontrados no fígado dos animais, apresentam atividade anti-inflamatória através do controle do influxo leucocitário, da modulação da expressão gênica de COX-2 e da produção citocinas. Palavras-chave: antocianinas, tomate roxo, petunidina, atividade anti-
inflamatória.
ABSTRACT
MAIA, A.P.S. Anti-inflammatory activity of phenolic extract of purple tomato (Solanum lycopersicum L.) in mouse model of peritonitis induced by LPS. 2015. 101p. (Dissertação de mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
Aiming to produce a food having high contents of bioactive compounds, the gene pyramiding is a technique capable of stimulating the expression and accumulation of new classes of flavonoids in plant tissues, such as purple tomato, rich in anthocyanins. Anthocyanins may attenuate the inflammatory process by modulating the signaling cascade and expression of enzymes, which is one of the possible mechanisms of action that leads to health promotion, assigned to this class of compounds. The objective of this study was to evaluate the anti-inflammatory action of the purple tomato paste, obtained by pyramiding of genes Fruit Anthocyanin (Aft), Aubergine (Abg) and atroviolaceum (atv) in mice submitted to peritonitis model induced by lipopolysaccharide (LPS). The tomato fruit - Micro Tom (MT) and the transformed were characterized according to their profile of phenolic compounds. The purple tomato peel, rich in anthocyanins, phenolics content presented ten times higher compared to the shell of the MT, and also provides increased amounts of ascorbic acid and antioxidant activity in the DPPH rated and the ORAC methods; than the pulp and peel the tomato pulp and purple tomatoes. The main flavonoids identified in tomato peel purple, by HPLC-DAD were: petunidin the anthocyanidins (86.5 mg / 100 g wb), delphinidin (6.85 mg / 100 g wb), especially in the acylated form, and flavonol rutin (106.26 mg / 100 g bu). The anti-inflammatory properties of the phenolic compounds was evaluated through a model of peritonitis in mice induced by LPS. The extract of purple tomato, rich in anthocyanins (2 and 4 petunidin mg eq. / 100 g body weight) was administered orally 30 minutes before the inflammatory stimulus. In the peritoneal exudate collected after 3 h of stimulation was observed in the group receiving 4 mg as compared to the LPS stimulated group, a significant reduction (p <0.05) of about 37% in the number of total leukocytes and 64 % mRNA gene expression of COX-2 and production of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 and MCP-1), as well as a significant increase of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In a study of absorption, the metabolites: aglycone delphinidin (m / z 303) and malvidin aglycone (m / z 331) were detected by HPLC - ESI-MS / MS, in liver samples from animals euthanized 30 minutes after administration the purple tomato extract. Therefore, the results show that anthocyanins present in the purple tomato, through the metabolites found in animal liver, exhibit anti-inflammatory activity by controlling the leukocyte influx, the modulation of gene expression of COX-2 and production cytokines. Keywords: anthocyanins, purple tomatoes, petunidin, anti-inflammatory activity.
18
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A realidade mundial revela que grande parte da população sofre de algum
tipo de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT). De acordo com dados da
Organização Mundial da Saúde (OMS), no ano de 2008, cerca de 63% das 57
milhões de mortes ocorridas no mundo foram decorrentes das DCNT,
caracterizando-se uma importante questão de saúde pública, tanto nos países
desenvolvidos quanto nos países em desenvolvimento (OMS, 2011; OLIVEIRA
et al., 2009).
O Brasil que passa por uma significativa transição demográfica, nutricional
e epidemiológica, desde os anos 60, segue a tendência mundial. De acordo com
estudos atuais as DCNT são responsáveis por 74% das causas de mortes e por
75% dos gastos com atenção à saúde no Sistema Único de Saúde (SUS), além
de atingirem prioritariamente os estratos mais pobres e grupos vulneráveis da
população (OMS, 2011; BRASIL, 2011).
Uma maior oferta dietética de alimentos vegetais juntamente com
escolhas de vida saudáveis e práticas regulares de exercícios físicos pode
auxiliar na redução do risco de desenvolvimento das DCNT, tais como o câncer,
a diabetes, a hipertensão arterial sistêmica e a hipercolesterolemia. A
recomendação da OMS para ingestão diária de frutas, verduras e legumes é de
400 g fracionados em 5 porções, já que em suas projeções recentes é
demonstrado que uma dieta inadequada no que se diz respeito ao consumo de
vegetais é um dos fatores primordiais para o desenvolvimento de doenças em
todo mundo (BRASIL, 2010).
Os vegetais possuem, além de nutrientes, compostos bioativos que
podem atuar auxiliando na promoção à saúde através de diversos mecanismos,
tais como antioxidantes, ação antiproliferativa e anti-inflamatória. Entre estes
compostos os flavonoides despertam o interesse de diversos estudos que visam
investigar o seu papel no organismo humano (GARCÍA-LAFUENTE et al., 2009).
O tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das hortaliças mais
importantes no mundo, sua produção mundial em 2011 foi de cerca de 159
milhões de toneladas (FAO, 2014) (MES et al., 2008).
O vegetal é reconhecido pelo seu alto teor de licopeno, um carotenoide
vermelho com diversos efeitos benéficos relacionados à saúde. Além disso, o
19
fruto contém teores significativos de compostos fenólicos, tais como os
flavonoides e ácidos fenólicos, sendo comumente encontrados na forma de
glicosídeos de quercetina, campferol e naringenina (SLIMESTAD & VERHUEL,
2009; GONZALI et al., 2009).
Entretanto, é possível obter-se frutos com teores significativos de outros
compostos bioativos, tais como as antocianinas, através de processos de
cruzamentos interespecíficos, ou piramidação, de algumas cultivares selvagens
de tomate, originando frutos que possuem genes que aumentam a expressão do
flavonoide, tais como o gene Anthocyanin Fruit (Aft), Aubergine (Abg) e
atroviolaceum (atv) (MES et al., 2008).
Portanto, tendo em vista que os alimentos vegetais contêm, além dos
nutrientes básicos, compostos bioativos, destacando os flavonoides, que podem
contribuir para a manutenção e promoção da saúde e, consequentemente,
auxiliar na prevenção de DCNT e que o melhoramento convencional de plantas,
através da piramidação de genes, pode ser uma ferramenta para o
enriquecimento de alimentos largamente consumidos pela população,
aumentando assim suas propriedades funcionais, o presente estudo avaliou as
características físico-químicas do tomate roxo obtido por piramidação e a
atividade anti-inflamatória do seu extrato fenólico em camundongo em modelo
de peritonite induzido pelo lipopolissacarídeo (LPS).
20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. FLAVONOIDES
2.1.1. Características estruturais
Estudos outorgam que os benefícios desempenhados pelos compostos
bioativos estão relacionados com propriedades biológicas promotoras de saúde,
tais como a ação anti-inflamatória, hipocolesterolêmica e antioxidante,
destacando-se as vitaminas A, E e C, bem como os compostos fenólicos
(GARCÍA-TIRADO et al., 2012).
Os compostos fenólicos são moléculas amplamente distribuídas entre os
vegetais, tais como frutas, hortaliças e cereais, cujas funções nas plantas são de
pigmentação, fotoproteção e defesa contra agentes externos. Estes compostos
constituem um grande grupo de moléculas que contribuem por uma parte
considerável da dieta humana. Dentro deste grande grupo estão os ácidos
fenólicos, os estilbenos, os taninos e os flavonoides (DORNAS et al., 2007).
Os flavonoides são compostos polifenólicos caracterizados por
apresentarem 15 carbonos no seu núcleo fundamental, constituídos por dois
anéis aromáticos unidos por uma cadeia de três átomos de carbono que pode
ou não formar um terceiro anel (C6-C3-C6) (Figura 1) (DORNAS et al., 2007).
Figura 1: Estrutura básica dos flavonoides. Fonte: DORNAS et al., 2007.
21
As principais subclasses dos flavonoides podem ser diferenciadas com
base na oxidação do anel pirano central e também pela posição do anel B em
flavonols, flavonas, flavanol ou flavan-3-ol, flavanonas, antocianidinas e
isoflavonas (Figura 2) (CROZIER et al., 2009).
Os flavonoides são encontrados na forma aglicona ou conjugado à
molécula de carboidrato (forma glicosilada). Em decorrência da glicosilação os
flavonoides apresentam menor reatividade e maior solubilidade em água
(SANTOS, 2009). Por mais que todos os grupos hidroxila possam ser
glicosilados, as posições 3, 5 e 7 são as mais comumente encontradas, uma vez
que correspondem às hidroxilas mais ácidas (CROZZIER et al., 2009).
A ingestão diária de flavonoides começou a ser debatida na década de 60
em vários países, variando de 3mg/dia na Finlândia a 65mg/dia no Japão
(ARABBI et al., 2004). Já em 1976, nos Estados Unidos foi considerada uma
ingestão diária de aproximadamente 1g, sendo que 160-175 mg seriam de
flavonas, flavonona e flavonols, entretanto estes valores não podem ser
considerados fidedignos, pois utilizaram técnicas hoje avaliadas como
imprecisas e inadequadas. Atualmente, a ingestão diária de flavonoides totais,
estimada para adultos americanos e espanhóis, é de 189,7 mg/dia
(principalmente flavan-3-ol) e 313,26 mg/dia (principalmente procianidina),
respectivamente (CHUN et al., 2007, ZAMORA-ROS et al., 2010). Com base em
uma análise sobre o consumo de flavonols e flavonas em hortaliças e bebidas
na população holandesa, realizado no período de 1987-1988, este foi estimado
em 23mg/dia (ROSS & KASUM, 2002).
No Brasil, a ingestão média diária de flavonoides pela população foi
estimada entre 60 a 106 mg/dia, quando considerada a divisão por sexo esta foi
de 79 mg/dia para mulheres e 86 mg/dia para homens, sendo a maior parte
glicosídeos de quercetina (ARABBI et al., 2004).
22
Flavonol
quercetina,
kaempferol, miricetina
Cor: amarelo
Alimentos: couve,
cebola e brócolis
Flavan-3-ol
catequina, epicate-quina, galocatequina
Cor: incolor
Alimentos: chá verde,
cacau e maçã
Flavona
apigenina, luteolina, diomestina
Cor: incolor
Alimentos: salsa, aipo,
tomilho
Flavanona
naringenina, hesperidina
Cor: incolor ou
amarelo
Alimentos: cítricos
Antocianidina
cianidina, malvidina, petunidina
Cor: azul
Alimentos: uva,
morango e berinjela
Isoflavona
genisteína, daidzeína
Cor: incolor
Alimentos: soja, feijões
e legumes
Chalcona
floretina
Cor: incolor
Alimentos: frutas
Figura 2. Classificação dos flavonoides em subclasses.
23
As antocianinas correspondem ao maior grupo de pigmentos naturais e
possuem alta solubilidade em água. Até o momento, foram identificados mais de
635 tipos de antocianinas na natureza, sendo responsáveis pela pigmentação de
vegetais, frutas e flores nas tonalidades de azul, roxo e vermelho. Nas plantas,
apresentam função protetora contra os raios UV e atrativa para os animais
dispersores de sementes e polinizadores (HE e GIUSTI, 2010).
As antocianinas podem ser encontradas na forma aglicona, nomeada
antocianidina, ou na forma glicosilada. Em sua forma aglicona, as antocianidinas
apresentam coloração acentudada quando em pH ácido e absorção máxima no
espectro visível entre 465 e 550 nm. As antocianidinas mais comumente
encontradas em frutas e hortaliças são: cianidina, peonidina, pelargonidina,
petunidina, delfinidina e malvidina (Figura 3) (JAGNATH & CROZIER, 2010).
Figura 3. Estrutura básica das principais antocianidinas encontradas nos alimentos vegetais.
Diferentes tipos de açúcares podem ser conjugados às antocianidinas,
sendo os principais, a glicose e ramnose, além disso, são encontrados
glicosilados à galactose, arabinose, xilose, entre outros, podendo também, ser
encontradas aciladas a ácidos orgânicos (TALL et al., 2003).
As antocianinas possuem efeitos no organismo humano. Em decorrência
de sua atividade antioxidante, anti-inflamatória e anti-proliferativa, diversos
estudos apontam que o consumo dietético de antocianinas presentes nos
alimentos pode exercer efeitos positivos no controle a diversas DCNT, como o
diabetes, doenças cardiovasculares e câncer (BASSOLINO et al. 2013).
2.1.2. Biossíntese
Antocianidinas R1 R2 R3
Cianidina OH OH H
Peonidina OCH3 OH H
Delfinidina OH OH OH
Malvidina OCH3 OH OCH3
Petunidina OCH3 OH OH
Pelargonidina H OH H
24
Os flavonoides são produtos do metabolismo secundário dos vegetais,
decorrente das vias do ácido chiquímico e do acetato-malonato, a síntese dos
flavonoides pode ser dividida de acordo com a interação de duas vias
metabólicas distintas, a formação do anel aromático B se dá por uma unidade de
um fenilpropanóide, sintetizado a partir do ácido p-cumárico, enquanto o anel A
é um produto da condensação de três unidades de acetato (Figura 4) (CROZIER,
et al 2009, SCHREIBEIR et al., 2011).
Através da união dos produtos da via do ácido chiquímico e acetato-
malonato é formada a chalcona, principal precursor dos flavonoides. A junção do
ácido chiquímico com uma molécula de fosfoenolpiruvato forma o ácido
corísmico, responsável pela formação de aminoácidos aromáticos, como a
fenilalanina, que por sua vez, através da enzima fenilalanina amônio liase (PAL),
responsável por retirar uma amônia da fenilalanina, forma o ácido cinâmico, que
ao ser transformado em ácido para-cumárico, este por sua vez é alongado com
três moléculas de malonil-CoA. O fechamento da estrutura, catalisada pela
chacolna sintase (CHS), dá origem a chalcona (KARAM et al., 2013).
25
Figura 4. Rota biossintética dos flavonoides. PAL: fenilalanina amônio liase, CHS: chalcona sintetase.
26
2.1.3. Biodisponibilidade dos compostos fenólicos
O termo biodisponibilidade inicialmente era utilizado na área da
farmacologia com a finalidade de estimar a quantidade que uma substância ativa
era absorvida e alcançava seu sítio de ação. No decorrer da década de 1980
novas definições foram propostas, e gradativamente utilizada referindo-se à
nutrição. Em 1984, O’Dell definiu biodisponibilidade como “a proporção do
nutriente nos alimentos que é absorvida e utilizada nos processos de transporte,
assimilação e conversão à forma biologicamente ativa” (COZZOLINO, 2011).
A ingestão diária de compostos fenólicos é de cerca de 1g/dia, sendo que
1/3 é correspondente à ingestão de flavonoides. Diversos fatores parecem
influenciar na biodisponibilidade dos flavonoides, como a matriz alimentar,
processamento ou interação com outros nutrientes, porém o fator de maior
importância é a estrutura química apresentada pelo flavonoide (GEORGIEV et
al., 2014).
As formas glicosiladas dos flavonoides são as mais comumente
encontradas nos alimentos vegetais, geralmente conjugados aos açúcares
glicose e ramnose. Em algumas classes de flavonoides, a deglicolisação é
necessária para que o composto seja absorvido pela borda em escova das
vilosidades intestinais, uma vez que somente a forma aglicona e os conjugados
à glicose podem ser absorvidos no intestino delgado (KUMAR e PANDEY, 2013).
A Figura 5 esquematiza a via de absorção dos compostos fenólicos no
organismo humano.
De acordo com recentes estudos, o metabolismo dos flavonoides pode
ser iniciado já na cavidade oral, através de proteínas e enzimas presentes na
saliva, como a β-glicosidase proveniente de bactérias e células epiteliais. Porém,
a importância do papel da cavidade oral ainda é difícil de mensurar, uma vez que
os alimentos tem um tempo curto de permanência no local. Uma vez no
estômago, os flavonoides em sua forma aglicona são absorvidos por transporte
passivo, enquanto os glicosilados podem ser absorvidos pela ação
bilitranslocase expressa no epitélio estomacal (FERNANDES, et al., 2014).
Já na borda em escova do intestino delgado os glicosídeos podem ser
absorvidos através de mecanismos que podem envolver transporte de
membrana, associado ao transportador de glicose sódio-dependente (SGLT-1),
27
ou sofrem hidrólise pela ação da enzima lactase florizina hidrolase (LPH)
liberando então as agliconas para serem absorvidas. Os glicosídeos resistentes
às enzimas do intestino delgado, principalmente os ligados à ramnose, seguem
para o cólon. (HRIBAR & ULRICH, 2014).
A microbiota colônica desempenha papel primordial na absorção dos
flavonoides. Os glicosídeos que alcançam o cólon sofrem a ação de enzimas
provenientes da microbiota local, como a β-glucoronidase, sofrem degradação e
são absorvidos na forma de seus metabólitos (aglicona ⁄ ácidos fenólicos), via
sistema porta-hepática (THILAKARATHNA & RUPASINGHE, 2013).
No enterócitos e/ou hepatócitos, os flavonoides e seus metabólitos
(ácidos fenólicos) absorvidos podem sofrer o processo de conjugação. Tal
processo pode ser por meio de metilação, sulfatação e/ou glucuronidação
(conjução ao ácido glucurônico), reações comuns aos xenobióticos a fim de
aumentar sua hidrofilicidade e, por consequência, facilitando sua excreção
(CROZIER et al., 2009).
Na corrente sanguínea os flavonoides são ligados às proteínas de
transporte, como a albumina. Essa característica é fundamental no transporte
plasmático, já que ao ligar-se à proteína, o flavonoide é distribuído por todo
sistema. Entretanto, o modo no qual funciona o mecanismo de interação entre
flavonoide-proteína ainda não é totalmente esclarecido (BOLLI et al., 2010).
A excreção pode ser realizada por meio da bile ou pelo sistema urinário.
No rim, os flavonoides também podem também sofrer conjugação e serem
excretados pela urina. Já a excreção biliar pode contribuir pela reabsorção
intestinal devido à ação enzimática bacteriana, alterando a meia vida dos
flavonoides (BOHN, 2014).
Usualmente é atribuída às antocianinas uma baixa biodisponibilidade,
sabe-se que cerca de 1% dos compostos absorvidos são encontrados na
corrente sanguínea. Todavia, a maior parte dos estudos sobre a absorção de
antocianinas envolvia apenas os compostos conjugados como metabólitos no
sangue. Entretanto, os estudos mais recentes sugerem que os metabólitos das
antocianinas possivelmente provenientes da fermentação microbiana, dentre
eles os ácidos fenólicos (ácido protocatecuíco, ferúlico, vanílico), podem ser
encontrados no sangue (FERRARS et al. 2014).
28
Figura 5. Via da absorção dos flavonoides. SGLT-1: transporte de glicose sódio dependente-1. LPH: enzima lactase florizina hidrolase. (Adaptado de THILAKARATHNA & RUPASINGHE, 2013 e HRIBAR & ULRICH, 2014).
29
2.2. PROPRIEDADES DOS FLAVONOIDES
Estudos epidemiológicos apontam que o consumo de frutas e hortaliças
assume efeito positivo na redução do risco de desenvolvimento de diversas
doenças, como por exemplo, o câncer e doenças cardiovasculares. Este efeito
protetor constatado é usualmente atribuído a uma diversidade de constituintes
vegetais, como os compostos bioativos, dentre eles, os flavonoides; destacando-
se a ação antioxidante e anti-inflamatória, porém, há escassez de informações
que fundamentem tais mecanismos de ação no organismo humano (HOLDT &
KRAAN, 2011).
2.2.1. Atividade antioxidante
A função das células depende do metabolismo oxidativo haja vista que os
processos envolvidos possuem um papel fundamental no esquema de fluxo de
elétrons e, por conseguinte, na obtenção de energia na forma de ATP
(ROBARDS et al.,2002). Como seguimento a este processo metabólico se dá a
produção de radicais livres, espécies que possuem um ou mais elétrons não
pareados, e outras espécies reativas de oxigênio/nitrogênio (ERO/ERN) que
podem provocar danos oxidativos à macromoléculas, tais como o DNA ou
lipídeos,. A formação intensa das EROs podem conduzir a saturação das
enzimas antioxidantes endógenas tais como a superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), levando a injúria e possível morte
celular (ABRAHIM et al., 2012).
Os compostos antioxidantes são elementos que, em pequena
concentração, quando relacionados a um substrato oxidável pode inibir ou
retardar a oxidação deste. Os antioxidantes dividem-se em primários, ou
interruptor de cadeia, e secundários, ou preventivos (VEIGA, 2008). Os
antioxidantes primários são caracterizados por compostos que podem agir
diminuindo ou inibindo a fase inicial da reação em cadeia da oxidação lipídica ao
reagir com radicais lipofílicos, ou inibindo a fase de propagação ao reagir com
radicais peroxila ou alcoxila. Já os secundários, como o sulfito e fosfito, são
aqueles que diminuem a velocidade da oxidação (ROBARDS et al.,2002).
30
Dentre os elementos naturais que possuem potencial antioxidante
encontram-se os flavonoides. Estes compostos apresentam capacidade de
capturar e neutralizar espécies oxidantes como radical superóxido, radical
hidroxila e radical peróxido (SAHREEN et al., 2010).
Suas características físico-químicas lhes atribuem capacidade
antioxidante. O átomo de hidrogênio do grupamento hidroxila presente na
estrutura dos flavonoides pode ser doado ao radical livre, neutralizando-o (Figura
6). (ROSS e KASUM, 2002; HASSIMOTO, 2005).
Figura 6. Reação redox entre um flavonoide e um grupamento peroxil.
A participação dos flavonoides de maneira direta nos processos de
oxirredução acarreta na conservação das enzimas antioxidantes endógenas e,
consequentemente, incrementando o sistema antioxidante do organismo ao
deixá-las livres para participar de processos posteriores. Além disso, os
flavonoides podem se complexar a íons metálicos, tal como ferro, formando
quelatos. (KUMARAPPAN , THILAGAM & MANDAL, 2012).
Deste modo, os flavonoides podem ser capazes de agir na neutralização
dos radicais livres, reduzindo os danos sobre o DNA e outras macromoléculas,
e através do controle de ERO/ERN auxiliam na expressão de genes que atuam
nas vias sinalização celular (FERNADEZ-PANCHÓN et al., 2008;
KUMARAPPAN, THILAGAM & MANDAL, 2012).
Estudos clínicos em humanos e em animais apontam que o consumo de
alimentos ricos ou a forma isolada de compostos fenólicos podem aumentar a
proteção antioxidante do organismo, também, de maneira indireta, através da
31
modulação das enzimas antioxidantes (KRAJKA-KUZNIAK et al., 2008;
SARVESTANI et al., 2013; QUIRANTES-PINÉ et al., 2013).
Por exemplo, ao induzir a expressão da enzima glutationa S-transferase
(GST), os flavonoides podem mitigar o estresse oxidativo ao preservar as células
de possíveis danos causados pelos radicais livres, em especial o peróxido de
hidrogênio (ROSS e KASUM, 2002).
Logo, acredita-se que o aumento do suporte ao sistema antioxidante pela
modulação da expressão de enzimas antioxidantes ou, diretamente, pela
neutralização de EROs, acarretaria em diminuição a danos em macromoléculas,
e por consequência o risco de desenvolvimento de condições que favoreçam o
surgimento de DCNT (DENIS et al., 2013).
2.2.2. Atividade anti-inflamatória
O processo inflamatório pode ser definido como o conjunto de
modificações bioquímicas, fisiológicas e imunológicas decorrentes de estímulos
adversos ao organismo. Na fase aguda, cujo início se dá rapidamente após a
agressão, há aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular, com
recrutamento de leucócitos no foco da lesão e liberação de mediadores
inflamatórios. A passagem para a fase crônica é configurada pelo
desenvolvimento da resposta humoral específica e da resposta imune celular
(SILVA & MACEDO, 2011).
Em ambas as fases, os mediadores inflamatórios atuam localmente ou
sistemicamente, ativando outras células relacionadas com o processo
inflamatório, aumentando a resposta inicial ao agente danoso. A maneira pelo
qual tais mediadores pró-inflamatórios conduzem à manifestação das DCNT
aparenta englobar a diminuição da atividade insulínica, mobilização de gorduras,
disfunção endotelial e estresse oxidativo (LAHOZA & MOSTAZAA, 2007).
Dentre os principais mediadores da inflamação, destacam-se as citocinas,
os metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas, tromboxanos e
leucotrienos), a histamina, o fator de ativação plaquetária, a bradicinina, o óxido
nítrico e os neuropeptídios (CALDER, 2009; COUTINHO et al., 2009; SILVA,
2012).
32
O ácido araquidônico é liberado pelos fosfolipídios das membranas
celulares por meio de estímulos físicos/mecânicos, químicos ou através de
outros mediadores, pela via de ativação da enzima fosfolipase A. Em sua forma
livre, o ácido araquidônico pode ser metabolizado por duas classes principais de
enzimas: pelas ciclo-oxigenases (COX), na forma COX-1 e COX-2, sendo que a
isoforma COX-2 está estritamente relacionada à inflamação, iniciando a
biossíntese de prostaglandinas e tromboxanos (prostanoides); e pelas lipo-
oxigenases (LOX), originando a síntese de leucotrienos (MARKWORTH &
CAMERON-SMITH, 2012).
O óxido nítrico (NO), sintetizado pelas células endoteliais do tecido
lesionado, apresenta potente atividade vasodilatadora, ocasionando uma maior
permeabilidade vascular. Além disso, tem ação regulatória no recrutamento de
leucócitos e função citotóxica contra micro-organismos. É produzido pela NO
sintase (NOS), enzima que apresenta três isoformas, sendo a forma indutível
(iNOS) a relacionada às reações inflamatórias (FÖRSTERMANN & SESSA,
2012).
As citocinas são liberadas de forma a controlar a ação das células imunes
e inflamatórias. Dentre as citocinas pró-inflamatórias destacam-se o Fator de
Necrose Tumoral α (TNF-α) e a interleucina-1 (IL-1), que são liberadas por
macrófagos ativados. Tais citocinas contribuem para a aderência leucocitária ao
endotélio, aumento da síntese de prostaciclina e iniciam uma cascata de
citocinas secundárias (quimiocinas). Já as citocinas secundárias atraem e ativam
as células inflamatórias móveis, tais como o linfócito T (COUTINHO et al., 2009).
Diversos mediadores inflamatórios vêm sendo utilizados na prática clínica
e em estudos associados à patogênese das DCNT como marcadores
específicos do processo inflamatório, destacando-se as moléculas de adesão
solúveis (E-selectina, P-selectina, molécula de adesão intracelular-1 (ICAM-1),
molécula de adesão de célula vascular-1 (VCAM-1)), e as citocinas TNF-α e as
interleucinas (IL-1-beta, -6, -8, -10) (GERALDO & ALFENAS, 2008).
Estudos recentes demonstram que os flavonoides podem agir de forma
anti-inflamatória, inibindo de maneira eficaz a expressão de citocinas pró-
inflamatórias, tais como TNF-α e a interleucina6 (IL-6) (XIE et al., 2012).
33
Diversos estudos apontam que o consumo de flavonoides pode estar
associado com a prevenção das DCNT, dentre elas, as doenças inflamatórias,
como por exemplo, a aterosclerose (PALAFOX-CARLOS et al., 2011). A relação
entre o processo inflamatório crônico e o desenvolvimento de doenças crônicas
está exemplificada na Figura 7.
Figura 7. Relação entre o processo inflamatório crônico e o desenvolvimento de doenças crônicas (Adaptado de GERALDO & ALFENAS, 2008). TNF-α = fator de necrose tumoral α; IL = interleucina; ICAM-1 = molécula de adesão intracelular-1; VCAM-1 = molécula de adesão de célula vascular-1; MCP-1 = proteína quimiotática de monócito-1.
Segundo pesquisas recentes, algumas antocianinas têm demonstrado
inibir o crescimento de células cancerosas, diminuir os níveis hiperglicêmicos e
promover os efeitos antiobesidade. Além disso, as antocianinas possuem
propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Tais compostos tem
demonstrado ação modulatória no processo de inflamação, dependente de COX-
2, tanto em modelos experimentais in vitro quanto in vivo (HASSIMOTTO et al.,
2012; LU et al., 2012; HWANG et al., 2011; BACHOUAL et al., 2011; ISHIMOTO
et al., 2011; ROSILLO et al., 2012; HASSIMOTO et al., 2013).
A atividade anti-inflamatória dos flavonoides consiste em modular células
relacionadas com a inflamação (coibindo a proliferação de linfócitos T),
34
diminuindo a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1, IL-6, IL-8),
modulando a atividade das enzimas da via do ácido araquidônico, tais como
fosfolipase A2, COX e LOX, além de regularem a iNOS, enzima formadora de
NO (COUTINHO et al., 2009; TSAO et al., 2012).
Outro fator relacionado à ação anti-inflamatória dos flavonoides seria a
regulação da cascata de inflamação por meio de bloqueio da via de sinalização
NF-κB. A presença de agentes inflamatórios, tais como ácidos graxos saturados
(AGS) e o lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, induz a via de sinalização do fator
nuclear kappa B, enquanto a presença de TNF-α induz tanto a via da proteína
ativadora-1 (AP-1) quanto do NF-κB. Ambas as vias resultam na ativação de
genes que iniciam a produção de citocinas e enzimas pró-inflamatórias. Sugere-
se que os flavonoides atuem bloqueando a fosforilação do IκBα e AP-1 e
consequentemente controlando a inflamação, conforme demonstrado na Figura
8 (QUILLIOT et al., 2005).
Assim, os flavonoides estão intimamente ligados ao processo de
regulação dos sistemas oxidativos e inflamatórios através da estimulação do
complexo enzimático e no controle da expressão de citocinas pró-inflamatórias.
(GARCÍA-LAFUENTE et al., 2009) e a modulação destes processos poderia ser
um dos mecanismos para a ação protetora à saúde, principalmente da redução
do risco de desenvolvimentos de DCNT.
35
Figura 8. Possível papel dos flavonoides nas vias de sinalização da cascata inflamatória induzida por LPS/AGS.
LPS: lipolissacarídeo; AGS: ácido graxo saturado; TRL4: receptor do tipo Toll-4; IκBα: inibidor de κB; NF-κB: fator nuclear kappa B; TNF-α: fator de necrose tumoral α; TNFR: receptor de fator de necrose tumoral α; AP-1: proteína-1 ativadora; COX: ciclo-oxigenase; LOX: lipo-oxigenase; iNOS: óxido nítrico sintetase indutível; IL-1: interleucina 1; IL-6: interleucina 6; IL-8: interleucina 8 .
36
2.3. TOMATE ROXO
O tomate (Solanum Lycopersicum L.) é um dos vegetais mais consumidos
no Brasil e no mundo. Segundo dados recentes, a produção brasileira do fruto
em 2012 atingiu 3,8 milhões de toneladas, sendo os maiores produtores a China,
EUA e Turquia. (FAO, 2014). O fruto do tomateiro é caracterizado por sua cor
avermelhada, é rico em carotenoides, como o licopeno, mas também
apresentam outros compostos bioativos, como os flavonoides (SLIMESTAD e
VERHEUL, 2009)
Pertencente à família das solanáceas (berinjela, pimenta e batata-
inglesa), o tomateiro é capaz de produzir frutos de diversas colorações, do verde
ao amarelo, sendo o vermelho o mais reconhecido e apreciado. Todavia existem
algumas espécies de tomateiros capazes de produzir tomates arroxeados, como
por exemplo, o gênero Solanum chilense Dunal (GONZALI et al. 2009; JONES
et al., 2003).
Entretanto, em alguns frutos denominados como “pretos” ou “roxos” tal
coloração é decorrente de mutações que acarretam a degradação da clorofila e
dos carotenoides, e neste caso, tal coloração não está relacionada com a
produção pigmentos, tais como as antocianinas (MES et al.,2008; GONZALI et
al., 2009).
A crescente importância dos compostos bioativos nos alimentos
despertou o interesse dos pesquisadores sobre os mecanismos envolvidos na
produção de flavonoides no tomate. Logo, foram realizados experimentos
envolvendo duas linhas distintas: o melhoramento genético convencional
(piramidação), onde cruzamentos interespecíficos entre gêneros da mesma
espécie são cruzados com a finalidade de acumular uma característica desejada;
e a transgenia, processo no qual ocorre inserção de genes de outra espécie a
fim de que se obtenha um vegetal com características da espécie doadora
(GONZALI et al., 2009; SCHREIBER et al., 2011).
Os primeiros genes estudados na obtenção do tomate roxo, através da
piramidação, foram: Anthocyanin Fruit (Aft), Aubergine (Abg) e atroviolaceum
(atv). O gene dominante Aft, identificado na espécie S. chilense é responsável
pela pigmentação, principalmente da casca, quando o fruto é exposto à alta
incidência de luz, semelhante ao gene Abg, obtido através da espécie Solanum
37
lycopersicoides Dunal. Já o gene recessivo atv, oriundo do Solanum
cheesmaniae (L. Riley) Fosberg, é capaz de pigmentar toda a planta, em
especial, os tecidos vegetativos (GONZALI et al. 2009; MES et al., 2008).
A piramidação de genes, ou cruzamentos interespecíficos, é um dos
principais meios de obtenção do tomate roxo. Este processo consiste em
cruzamento de tomates que possuam os genes interesse, resultando em um
fruto com acumulação das características desejadas. A Figura 9 mostra um
hipotético esquema de piramidação.
Figura 9. Piramidação de genes para obtenção do tomate roxo. Cada triângulo representa um tomate com gene interesse. Os tomates são cruzados para acúmulo das características desejadas, obtendo-se, no final do processo, o tomate roxo.
Certas enzimas podem estar relacionadas à expressão de antocianinas
no tomate. O conhecimento da biossíntese dos flavonoides no tomate foi
primordial na tentativa de identificar as enzimas de transcrição que auxiliam na
produção de antocianinas. Apesar de obscuro, especula-se que alguma mutação
genética no ancestral do tomate tenha ocasionado a não-expressão da enzima
chalcona isomerase (CHI), o que explicaria o acúmulo de naringenina chalcona
na casca do tomate (Figura 10) (POVERO et al., 2011; GONZALI et al. 2009).
Há duas classes de genes envolvidos na biossíntese de antocianinas: (1)
os que codificam as enzimas que participam nas diversas etapas do processo
(genes estruturais) e (2) os que regulam a expressão dos genes estruturais
(genes reguladores). Assim sendo, a manipulação genética leva a uma
38
regulação dos genes responsáveis pela expressão de enzimas essenciais na
produção de antocianinas. Os genes inseridos no processo de obtenção do
tomate roxo piramidado atuam como genes reguladores acarretando na
expressão das enzimas responsáveis pela produção de antocianinas (LI et al.,
2011; GONZALI et al., 2009).
Figura 10. Rota biossintética das antocianinas no tomate roxo obtido por
piramidação dos genes Aft, Abg e atv. Nome dos compostos em itálico e nome das enzimas envolvidas em negrito. ANS, antocianidina sintase; CHI, chalcona isomerase; CHS, chalcona sintase; DFR, dihidroflavonol 4-redutase; F3H, flavanona 3-hidroxilase; FLS, flavonol sintase; PAL, fenilalanina amônio liase.
39
3. OBJETIVO
Em virtude do crescente interesse sobre a relação entre os flavonoides e
seus benefícios à saúde humana o presente trabalho teve como:
3.1. Objetivo geral
Avaliar a ação anti-inflamatória do extrato de tomate roxo, rico em
antocianinas, obtido por melhoramento genético, em camundongos submetidos
ao modelo de peritonite induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS).
3.2. Objetivos específicos
Caracterizar os compostos fenólicos do tomate roxo e do tomate vermelho
MicroTom (MT);
Avaliar a ação anti-inflamatória do extrato fenólico do tomate roxo (MT
piramidado) em processo inflamatório induzido por LPS em camundongo;
Correlacionar a absorção dos compostos fenólicos presentes no tomate
roxo com a atividade anti-inflamatória.
40
4. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO TOMATE ROXO
4.1. MATERIAL E MÉTODOS
4.1.1. MATERIAL
4.1.1.1. Amostra
O tomate vermelho (Solanum lycopersicon cv Micro Tom) e o tomate roxo,
MT piramidado com os genes Aubergine (Abg), Anthocyan fruit (Aft),
atroviolaceum (atv), foram fornecidos pelo Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Peres,
Escola Superior de Agricultura ¨Luiz de Queiroz¨, da Universidade de São Paulo
(ESALq). O tomateiro foi mantido em estufa com irrigação automática (quatro
vezes por dia), a temperatura média de 28 °C, fotoperíodo de 11,5 h/13 h
(inverno/verão) e 250-350 mmol m-2 s-1 PAR irradiância (radiação natural
reduzida com um malha refletora). Para os ensaios, foram obtidos cerca de 550
g de tomate roxo e 550 g de tomate vermelho, colhidos em novembro de 2013.
4.1.1.2. Preparo da amostra
Os tomates foram primeiramente higienizados em água corrente, cada
fruto foi manualmente fracionado em polpa e casca, com auxílio de uma faca, e
congelado imediatamente em nitrogênio líquido. A proporção casca/polpa foi de
1/4. A casca e polpa do tomate roxo e vermelho foram trituradas em almofariz e
pistilo juntamente com nitrogênio líquido. As frações foram mantidas em ultra-
freezer à temperatura de -70ºC até análise.
4.1.2. MÉTODOS
4.1.2.1. Extração de compostos fenólicos
Quantidades de aproximadamente 0,5 g de amostra foram
homogeneizadas por um minuto utilizando Ultra-Turrax (Polytron-Kinematica
GmbH, Kriens-Luzern, Suíça) em metanol 70% (tomate MT) ou
metanol/água/ácido acético (70:30:5 v/v) (tomate MT piramidado) O extrato
assim obtido foi posteriormente mantido sob agitação a 300 rpm/30 min/4°C e
41
filtrado, obtendo-se assim o extrato fenólico. Este extrato foi utilizado para as
análises de fenólicos totais e capacidade antioxidante. As extrações foram
realizadas em triplicata.
4.1.2.2. Determinação de fenólicos totais
A determinação de fenólicos totais foi realizada pelo método de Swain e
Hillis (1959), utilizando o reagente de Folin-ciocalteu e ácido gálico (AG) como
padrão. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro (Hewlett Packard,
modelo 8453) no comprimento de onda de 765 nm. Os resultados foram
expressos como mg AG/g.
4.1.2.3. Capacidade antioxidante
A determinação da capacidade antioxidante foi realizada pelas
metodologias Oxygen radical assay capacity (ORAC) segundo protocolo descrito
por DAVALOS et al. (2004) e pelo método sequestro do radical α,α-difenil-β-
picrilhidrazina (DPPH) proposto por BRAND -WILLIAMS et al. (1995).
4.1.2.3.1. Método Oxygen radical assay capacity (ORAC)
No método ORAC todos os reagentes foram preparados em tampão
fosfato 75 mM, pH 7,1. Foram utilizadas: solução de fluoresceína 40 nM (Sigma
Chemical Co., St. Louis, EUA) e 2,2’-azobis 153 mM (2-amidinopropano)
dihidrocloreto AAPH (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA).
Aliquotas de 25µL de tampão (branco), ou 25µL de solução Trolox (curva
de calibração) ou 25µL de extrato, devidamente diluída quando necessário,
foram distribuídas em placa de 96 poços seguidas da adição automática de
150µL de solução de fluoresceína e incubada a 37°C por 30 minutos.
Posteriomente, a reação foi iniciada pela adição de 25µL de AAPH seguido de
agitação por 10 segundos. O decaimento da intensidade de fluorescência (485
nmex / 525 nmem) foi realizado a cada 1 minuto durante 60 minutos de reação. A
determinação de fluorescência foi realizada utilizando-se leitor de microplaca
multidetecção Synergy H1 (Biotek Instruments, Winooski, VT, USA).
42
A capacidade antioxidante foi obtida através do cálculo da área abaixo da
curva de uma amostra subtraindo-se da área correspondente à do branco e
utilizando-se curva padrão de trolox, efetuada a cada ensaio, nas concentrações
de 12,5 a 100 μM. Os resultados foram expressos em µmol Trolox equivalente/g.
A análise foi realizada em triplicata.
4.1.2.3.2. Método DPPH
Para o método DPPH, foi preparada uma solução metanólica de DPPH
(0,05 mM) de modo que apresentasse absorbância aproximada de 0,4 em
comprimento de onda a 517 nm. As leituras foram realizadas em microplaca de
poliestireno com 96 cavidades para uso em comprimento de onda entre 340 e
800 nm, no qual cada cavidade foi preenchida com 200 µL da solução de DPPH,
40 µL de metanol como branco, ou o mesmo volume para a solução-padrão de
Trolox para a curva de calibração ou extratos das amostras, devidamente
diluídos, quando necessário. A leitura de absorbância foi realizada a 517 nm,
após 20 minutos de incubação ao abrigo da luz, utilizando-se espectrofotômetro
Benchmark Plus (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
A curva de calibração foi preparada com uma solução de Trolox em
diferentes concentrações (20 - 70µM) e suas respectivas porcentagens de
descoramento. Os cálculos utilizaram a seguinte fórmula:
% descoramento do DPPH = A(Branco) – A(Amostra) x 100
A(Branco)
onde, A (Branco) refere-se à absorbância do branco (metanol) A-
(Amostra) refere-se à absorbância da amostra. Os resultados foram expressos
em µmol Trolox equivalente/g amostra.
4.1.2.4. Extração de flavonoides
Quantidades de aproximadamente 1,5g para casca e 5g para polpa do
tomate foram homogeneizadas por um minuto utilizando Ultra-Turrax (Polytron-
Kinematica GmbH, Kriens-Luzern, Suíça) em 100 mL de metanol 70% (tomate
MT) ou metanol/água/ácido acético (70:30:5 v/v) (tomate MT piramidado),
43
filtradas à vácuo em funil de buchner, utilizando papel de filtro de qualitativo de
80g/m². O sedimento foi recuperado e realizado mais duas reextrações com 50
mL de metanol ou metanol acidificado. Os extratos assim obtidos foram
agrupados obtendo-se e concentrados em rotaevaporador (Rotavapor® 120,
Büchi, Flawil, Suíca) à temperatura de 40 °C até a remoção do metanol para a
etapa de separação em fase sólida. As extrações foram realizadas em duplicata.
4.1.2.5. Extração de fase sólida
A amostra livre de metanol foi passada em coluna de 1 g de poliamida
(CC 6, Macherey-Nagel, Germany), preparada em seringa própria de 6 mL
(HPLC Technology) e pré-condicionada pela passagem de 20 mL de metanol e
60 mL de água destilada. Após aplicação do extrato, a coluna foi lavada com 20
mL de água e a eluição dos flavonoides foi feita com 50 mL de metanol
acidificado com ácido clorídrico 0,1% (PRICE et al., 1999). O fluxo através da
coluna foi controlado por meio de manifold (Visiprep 24 DL Supelco, Bellefonte,
PA).
Os eluatos assim obtidos foram secos completamente em rotaevaporador
a 40°C sob vácuo e ressuspendidos em 1 mL de metanol (grau HPLC) ou
metanol:ácido acético (95:5 v/v) para as amostras contendo antocianina, filtrados
com membrana de PDVF para análise por CLAE-DAD e LC-ESI-MS/MS.
4.1.2.6. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – DAD
A quantificação e a identificação parcial dos flavonoides foi realizada
através de cromatografia líquida de alta eficiência. O cromatógrafo utilizado foi o
da marca Agilent (modelo Infinity 1120), equipado com injetor automático de
amostras, bomba quaternária e detector com arranjo de diodo (DAD), controlado
pelo software próprio da Agilent. A coluna utilizada foi a Prodigy 5 ODS3 (250
x 4,60 mm) (Phenomenex Ltd., Reino Unido) com fluxo de 1 mL/min, 25 C, e a
eluição sendo realizada com gradiente de solventes constituído por A: ácido
fórmico 0,5 % em água e B:acetonitrila adicionado de 0,5% ácido fórmico. O
gradiente de concentração dos solventes consistiu em 8% de B no início, 10%
em 5 min, 17% em 10 min, 25% em 15 min, 50% a 25 min, de 90% em 30 min,
50% em 32 minutos, 8% em 35 minutos (tempo de corrida, 35 min). A corrida foi
44
monitorada nos comprimentos de onda de 270 e 525 nm. A identificação dos
picos foi realizada por comparação do tempo de retenção e similaridade com
espectro de absorção de padrões comerciais e os espectros contidos na
biblioteca do próprio equipamento, previamente inseridos no método. Para
quantificação foram utilizados os padrões dos flavonoides petunidina, delfinidina
e rutina e do ácido fenólico ácido clorogênico (derivados do ácido
hidróxicinâmico) (Sigma, Chemical Co., St. Louis, EUA). Os resultados foram
expressos como mg de aglicona por 100 g de peso fresco.
4.1.2.7. LC-ESI-MS/MS
A identificação de flavonoides e outros compostos fenólicos foi conduzido
em aparelho de cromatografia líquida modelo Prominence (Shimadzu, Japão)
acoplado ao espectrômetro de massas do tipo íon trap, modelo Esquire HCT
(Bruker Daltonics, Alemanha) (LC-MS, do inglês LiquidChromatography – Mass
Spectrometry) e interface de ionização por electrospray (ESI, do inglês Electron
spray Ionization). As condições de separação foram as mesmas utilizadas para
a CLAEDAD, descrito no item 4.1.1.5. Após a passagem pelo DAD, o fluxo foi
alterado para 0,2 mLmin para a passagem no espectrômetro de massas. O ESI
foi mantido em modo positivo para antocianinas e modo negativo para os demais
flavonoides e ácidos fenólicos. O detector de massas foi programado para
realizar full scan entre m/z 100-1000. A energia de ionização para o modo
negativo foi de 3000 V e para o modo positivo de 3500 V.
A identidade dos compostos foi realizada pela comparação do espectro
de massas obtido com o de padrões comerciais e/ou dados de literatura. Para a
confirmação da identidade, comparou-se com o tempo de retenção de padrões
comerciais.
45
4.1.2.8. Determinação de ácido ascórbico
O conteúdo de ácido ascórbico foi determinado após extração com ácido
metafosfórico 0,3% e adicionado de ditiotreitol (DTT) para a redução do ácido
dehidroascórbico (PASTERNAK et al. 2005). A quantificação foi realizada por
CLAE (Hewlett-Packard 1100, Agilent), em coluna μBondpack C18 (300mm x 3.9
mm i.d., Waters, Milford, MA). A fase móvel foi constituída de tampão KCl 2 mM,
pH 2,5 com fluxo de 1,5 mL/min e a detecção realizada em 262 nm. O ácido
ascórbico foi identificado a partir do tempo de retenção e identidade de espectro.
O ácido dehidroascórbico foi calculado pela diferença entre o conteúdo de ácido
ascórbico total (extrato tratado com DTT) e o conteúdo de ácido ascórbico
reduzido (sem DTT).
4.1.2.9. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Para
verificação da normalidade da distribuição dos dados foi utilizado o teste de
Shapiro-Wilk (SHAPIRO; WILK, 1965) e homogeneidade das variâncias o teste
de Levene (LEVENE, 1960). Para análise dos dados foi realizada Análise de
Variância simples (One way ANOVA) e teste de Tukey para comparação de
médias. As análises foram realizadas com auxílio do programa GraphPad Prism
5.0 (Graph Pad Software®, La Jolla, CA, EUA) sendo estabelecido p<0,05 para
significância estatística.
46
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As frações, polpa e casca, do tomate roxo piramidado e tomate vermelho-
MT foram analisadas quanto ao seu conteúdo de fenólicos totais e capacidade
antioxidante, avaliada pelos métodos DPPH e ORAC (Tabela 01).
Tabela 01. Conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante avaliada pelos métodos DPPH e ORACde tomate roxo, obtido por piramidação dos genes Aft, Abg e atv, e de tomate vermelho-Micro Tom.
Fenólicos
totais¹ DPPH² ORAC²
Tomate roxo
casca 38,16A ± 0,68 13,27A ± 0,29 128,12A ± 5,80
polpa 1,71C ± 0,06 2,18C ± 0,09 13,55C ± 0,24
Tomate vermelho
casca 3,85B ± 0,21 4,37B ± 0,31 29,99B ± 1,64
polpa 1,65C ± 0,05 2,84C ± 0,21 11,18C ± 0,84
1 Expresso como mg AG eq./g, 2 Expresso como μmol Trolox eq./g. Resultados expressos como média ± DP, ANOVA e Teste de Tukey como post-hoc. A/B(p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da casca do tomate vermelho e roxo. C/D (p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da polpa do tomate vermelho e roxo.
Em relação ao conteúdo de fenólicos totais, o maior concentração foi
apresentado na casca do tomate roxo, 38,16 mg AG eq./g, teor dez vezes maior
(p < 0,05) quando comparado com a casca do tomate vermelho, 3,85 mg AG
eq./g. Já em relação à polpa, os valores apresentados são estatisticamente
iguais em ambos os tomates.
O mesmo padrão é destacado quando observados os resultados de
capacidade antioxidante da casca do tomate roxo, onde os valores de 13,27 μmol
Trolox eq/g e 128,12 μmol Trolox eq/g avaliados pelos métodos DPPH e ORAC
47
respectivamente, foram significativamente maiores (p < 0,05) quando
comparado à capacidade antioxidante da casca do tomate vermelho.
Novamente, não se observou diferença significativa para a capacidade
antioxidante da polpa do tomate vermelho e tomate roxo.
Considerando que a proporção de casca/polpa do tomate roxo piramidado
é de 1/4, os valores da Tabela 01 ajustados para ORAC (42,19 μmol Trolox eq./g)
e fenólicos totais (10,82 mg AG eq./g) foram inferiores e superiores,
respectivamente, quando comparados aos resultados encontrados por Li et al.
(2011), nos quais os valores descritos para uma variedade diferente de tomate
roxo foram de 6,59 mg AG eq./g para fenólicos totais e 323,23 μmol Trolox eq./g
para ORAC, valores representados em base seca .
Em relação ao conteúdo de ácido ascórbico (AsA), a casca e a polpa do
tomate roxo apresentaram valores superiores quando comparado ao do tomate
vermelho (p < 0,05) (Tabela 02). Por conseguinte, a piramidação dos genes pode
ter, também, ocasionado acúmulo de ácido ascórbico no tomate roxo.
48
Tabela 02. Conteúdo de ácido ascórbico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv e de tomate vermelho-Micro Tom.
ácido
ascórbico reduzido
ácido ascórbico oxidado
Total
Tomate roxo
casca 12,51 ± 0,31 2,60 ± 0,16 15,11A# ± 0,02
polpa 10,41 ± 0,23 1,50 ± 0,04 11,91D# ± 0,24
Tomate vermelho
casca 6,25 ± 0,28 1,74 ± 0,10 7,99B* ± 0,29
polpa 6,3 ± 0,15 0,56 ± 0,003 6,86C* ± 0,16
Valores expressos como mg/100g. Resultados expressos como média ± DP, ANOVA e Teste de Tukey como post-hoc. A/B(p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da casca do tomate vermelho e roxo. C/D (p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da polpa do tomate vermelho e roxo. # (p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da casca e polpa do tomate roxo. * (p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da casca e polpa do tomate vermelho.
Os valores de AsA total apresentado pelo tomate roxo e vermelho-, estão
abaixo dos valores apresentados pela Tabela Brasileira de Composição de
Alimentos – Unicamp, para tomate comercial, que foi de 21,2 mg/100g; e 34,3
mg/100g apresentados pela e Tabela de Composição Nutricional de Hortaliças
– EMBRAPA. A inferioridade dos valores apresentados pelo tomate MT poderia
ser explicada pela diferença na escolha da amostra, uma vez que, as variedades
utilizadas como amostras para confecção das tabelas são de uma cultivar
diferente da MT.
No que concerne aos flavonoides presentes no tomate roxo, os principais
flavonoides identificados na casca, por CLAE-DAD, foram as antocianidinas
petunidina, delfinidina e o flavonol quercetina. Já os compostos detectados na
polpa foram a quercetina e derivado do ácido hidroxicinâmico, não sendo foi
possível quantificar o conteúdo de antocianidinas na polpa (Tabela 03).
49
Tabela 03. Conteúdo dos flavonoides e ácidos fenólicos do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv.
petunidina delfinidina quercetina ácido
hidroxicinâmico
casca 86,5 ± 4,91 6,85 ± 0,5 106,25A ± 10,08 ND
polpa Tr ND 1,22B ± 0,08 1,86 ± 0,07
Resultados expresso como mg/100g, média ± DP, ANOVA e Teste de Tukey como post-hoc. A/B(p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da casca e polpa do tomate roxo. Tr: traço, nd: não identificado.
Nota-se que o flavonoide mais abundante é a quercetina, representando
mais de 50% do conteúdo total dos flavonoides da casca Entretanto, a
concentração de antocianidinas na casca é sensivelmente superior ao da polpa.
Os cromatogramas com os perfis dos flavonoides da casca e polpa do
tomate roxo piramidado estão apresentados na Figura 11.
Na casca foram encontrados dois derivados de delfinidina, um derivado
de petunidina e um de derivado de quercetina, enquanto na polpa foram
encontrados um derivado de petunidina, um derivado de quercetina e um
derivado do ácido hidroxicinâmico.
50
Figura 11. Cromatogramas obtidos por CLAE-DAD (270 nm) dos flavonoides presentes na casca (A) e polpa (B) do tomate roxo. Picos: 1A – Delfinidina, 1B- Petunidina, 2 - Petunidina, 3 – Quercetina, 4 – Ácido hidroxicinâmico, 5 e 6 – Ácido cafeico, 7 – ácido feruloilquínico, 8 – Malvidina.
A composição de antocianinas da casca de tomate roxo foi caracterizada
pela presença de três agliconas, entre elas a petunidina (m/z 317), delfinidina
(m/z 303) e malvidina (m/z 331), além de um flavonol, a quercetina (m/z 303)
(Figura 12). As antocianinas se apresentaram principalmente na forma acilada e
ácidos fenólicos (Tabela 04).
3
2
1 A/B
3 2 4 5
6 7
A
B
51
Figura 12. Principais compostos fenólicos encontrados no tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv.
Tabela 04. Composição de compostos fenólicos da casca do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv
identificados por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo.
52
Pico RT (min) Íon molecular MS² (m/z) Composto proposto
1A 16,8 933 771/479/317
petunidina-
(p-coumaroil)-rutinosideo-
hexosideo
1B 16,8 919 757/465/303
delfinidina 3-O-
(p-coumaroil)-rutinosídeo-5-O-
glicosídeo
2B 18,4 933 771/479/317/301
petunidina-
(p-coumaroil)-rutinosideo-
hexosideo
2C 18,8 963 801/625/479/317/301 petunidina 3-O-(cafeoil)-
rutinosídeo-5-O-glicosídeo
3 19,9 611 465/303 *quercetina-3-O-rutinosídeo
8 20,0 947 785/493/331
malvidina 3-O-
(p-coumaroil)-rutinosídeo-5-O-
glicosídeo
*Identidade confirmada pela co-eluição com padrão comercial.
53
A Figura 13 apresenta os compostos fenólicos da casca do tomate roxo
juntamente com seus fragmentos identificados em LC-ESI-MS/MS.
A antocianidina predominante na casca (pico 2B) foi identificada como
petunidina-(p-coumaroil)-rutinosideo-hexosideo, apresentando íon molecular a
m/z 933 e fragmentos MS2 771 [M-162]+ , 479 [H-454]+ e 317 [H-454-162]+. Neste
caso, a perda do fragmento 162 u e 454 u, respectivamente, corresponde a uma
unidade de hexose e uma unidade de coumaroil-rutinosideo (146 u + 308 u), e o
fragmento a m/z 317 é característico da aglicona petunidina. O mesmo padrão
de fragmentação foi observado para o pico 1A (Figura 12 A e C, respectivamente),
provavelmente um isômero.
O segundo composto majoritário encontrado na casca (pico 3) foi
identificado como quercetina 3-rutinosídeo, apresentando íon molecular a m/z 611
e fragmento MS2 a m/z 465 e m/z 303 (Figura 12 E). Neste caso a perda do
fragmento 146 u e 162 u corresponde a um resíduo de ramnose e hexose,
respectivamente. Este flavonol teve sua identidade confirmada pela co-eluição
com o padrão comercial.
Os compostos identificados como pico 1A e 1B se apresentaram co-eluídos.
O mesmo ocorrendo para os compostos 3 e 8.
54
479.0
771.1
317.0
+MS2(933.7), 16.8min #1047
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
465.1
757.2
921.2
303.1
+MS2(919.8), 16.8min #1046
0.0
0.5
1.0
1.5
6x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
479.1
625.2
801.2
965.2
317.2
+MS2(963.5), 18.8min #1146
0
1
2
3
4
55x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
479.0
771.2
935.1
317.2
+MS2(933.7), 18.4min #1126
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
7x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
464.9
302.9
+MS2(611.0), 19.9min #1202
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
7x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
A B
C D
F E
493.1
785.3
949.2
331.2
+MS2(947.7), 20.0min #1208
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
6x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Figura 13. Espectro de massas (MS2) de Flavonoides encontrados na casca do tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv obtidos por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo. Sendo: petunidina- (p-coumaroil)-rutinosideo-hexosideo (A
delfinidina 3-O-(p-coumaroil)-rutinosídeo-5-O-glicosídeo (B), petunidina- (p-coumaroil)-rutinosideo-hexosideo (C), petunidina 3-O-(cafeoil)-rutinosídeo-5-O-glicosídeo (D), quercetina-3-O-rutinosídeo (E) e malvidina 3-O-(p-coumaroil)-rutinosídeo-5-O-glicosídeo (F).
55
Os compostos identificados na polpa através de CL-MS foram derivados do
ácido cafeico (m/z 179/529/734), ácido feruoilquinico (m/z 367).
Tabela 05. Composição de compostos fenólicos da polpa do tomate roxo obtido
por piramidação do genes Aft, Abg e atv detectados por LC-ESI-MS/MS, em modo
negativo.
Pico RT
(min)
Íon
molecular
Fragmentos dos
íons negativos
(m/z)
Composto
proposto
4 7 683 341/179 ácido cafeico
(dímero)
5A 11,4 179 - ácido cafeico
5B 12,1 771 609/301
quercetina-3-O-
rutinosídeo-
hexosídeo
6 15,6 529 367/179 ácido cafeico-
hexosídeo
7 17,2 367 161 ácido
feruloilquínico
3 19,9 609 301/179 *quercetina-3-O-
rutinosídeo
*Identidade confirmada pela co-eluição com padrão comercial.
A Figura 14 apresenta os compostos fenólicos da polpa do tomate roxo
juntamente com seus fragmentos identificados em LC-ESI-MS/MS.
O composto majoritário encontrado na polpa (pico 4) foi identificado como
um dímero de ácido cafeico-hexosídeo, apresentando íon molecular a m/z 683 e
fragmento MS2 a m/z 341 [M-341]- e m/z 179 (Figura 14 A), correspondendo a
fragmento 162 u e 179 u, respectivamente, corresponde a uma unidade de hexose
e uma unidade de íon de ácido cafeico, respectivamente. Sendo os derivados
caracterizados com íon de ácido cafeico (pico 5) (Figura 14 B) e um ácido cafeico
glicosilado (pico 6) (Figura 14 D).
56
Assim como na casca, o segundo composto majoritário encontrado na
polpa (pico 3) foi identificado como quercetina 3-O-rutinosídeo, apresentando íon
molecular a m/z 609 e fragmento MS2 a m/z 301 e m/z 179 (Figura 14 E).
Os compostos identificados como pico 5A e 5B se apresentaram co-eluídos.
57
177.8
134.9
-MS2(179.0), 11.4min #718
0
1000
2000
3000
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
300.8
609.1
-MS2(771.5), 12.2min #763
0
1
2
34x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
178.8 424.5496.9
367.0
-MS2(529.5), 15.7min #995
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
366.9
160.9
-MS2(367.1), 17.3min #1100
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
178.8
609.0
300.7
-MS2(609.3), 19.9min #1264
0
2
4
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Figura 14. Espectro de massas (MS2) de Flavonoides encontrados na polpa do tomate roxo obtidos por LC-ESI-MS/MS, em modo negativo. Sendo: ácido cafeico dímero (A), ácido cafeico (B), quercetina-3-O-rutinosídeo-hexosídeo (C), ácido cafeico-hexosídeo (D), ácido feruloilquínico (E) e quercetina-3-O-rutinosídeo (F).
A B
C D
F E
340.8
-MS2(682.9), 7.0min #433
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
58
A Figura 15 apresenta os cromatogramas obtidos da casca e polpa do tomate MT.
Figura 15. Cromatogramas obtidos por CLAE-DAD (270 nm) dos flavonoides presentes na casca (A) e polpa (B) do tomate vermelho. Picos: 1 – Quercetina dihexose, 2 - Quercetina, 3 – Luteolina, 4 – Naringenina-glicosídeo, 5 Naringenina-glicosideo-ramnosideo, 6 – Ácido cafeico, 7 – Naringenina chalcona, 8 – Ácido feruloilquínico.
No tomate vermelho MT, os principais flavonoides identificados na casca,
por CLAE-DAD, foram os flavonols quercetina e luteolina. Já os compostos
apresentados na polpa foram quercetina e derivado do ácido hidroxicinâmico
(Tabela 06).
B
6
2
8
7
3
1
4
2
5
A
B
59
Tabela 06. Conteúdo dos flavonoides e ácidos fenólicos do tomate vermelho MT.
luteolina naringenina quercetina ácido
hidroxicinâmico
casca 5,62 ± 0,19
10,48 ± 0,41 73,3A ± 2,26 ND
polpa Tr Tr 0,57B ± 0,05 0,79 ± 0,83
Resultados expresso como mg/100g, média ± DP, ANOVA e Teste de Tukey como post-hoc. A/B(p < 0,05) quando comparados com os valores correspondentes da casca e polpa do tomate roxo. Tr: traço, nd: não identificado.
Assim como no tomate roxo piramidado, a quercetina foi o flavonoide mais
abundante no tomate MT.
A Figura 16 apresenta os espectros de massas dos flavonoides da casca
do tomate vermelho identificados em CL-MS.
Os flavonoides predominantes na casca do tomate vermelho foram
identificada como: naringenina chalcona, com íon molecular a m/z 273, miricetina
aglicona, com íon molecular a m/z 319 e glicosídeos de luteolina e naringenina
(Tabela 07).
Sendo que o luteolina-glicosídeo-ramnosídeo apresentou íon molecular a
m/z 595 e fragmentos MS2 287 [M-146-162]+. Neste caso, a perda do fragmento
146 u e 162 u, respectivamente, corresponde a uma unidade de ramnose e uma
unidade de hexose.
Já a naringenina-O-hexosídeo, apresentou íon molecular a m/z 435 e
fragmentos MS2 273 [M-162]+. Representando nesse caso, a perda do fragmento
162 u correspondendo a uma unidade de hexose.
60
O segundo composto majoritário encontrado na casca, assim como no
tomate roxo, também foi identificado como quercetina 3-rutinosídeo, apresentando
íon molecular a m/z 611 e fragmento MS2 a m/z 465 e m/z 303. Sendo a perda do
fragmento 146 u e 162 u corresponde a um resíduo de ramnose e hexose,
respectivamente.
Tabela 07. Composição de compostos fenólicos da casca do tomate vermelho
detectados por LC-MS em modo positivo.
Pico RT
(min)
Íon
molecular MS² (m/z)
Composto
proposto
1 12 771 465/303 Quercetina dihexose
2 15,9 273 - Naringenina
chalcona
3 19,9 611 465/303 Quercetina 3-
rutinosídeo
4 22,8 595 449/287
Luteolina-
glicosídeo-
ramnosídeo
5 25,4 435 273 Naringenina-
hexosídeo
9 40,1 579 417/273
Naringenina-
hexosideo-
ramnosideo
61
Figura 16. Espectro de massas (MS2) de flavonoides encontrados na casca do tomate vermelho obtidos por LC-ESI-MS/MS, em
modo positivo. Sendo: Quercetina dihexose (A), Quercetina 3-rutinosídeo (B), Naringenina chalcona (C), Luteolina-glicosídeo-
ramnosídeo (D), Naringenina-hexosideo-ramnosideo (E) e Naringenina-hexosídeo (F).
303.2 627.1
465.3
+MS2(773.1), 12.1min #815
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
449.0
287.1
+MS2(595.2), 22.8min #1498
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
465.0
303.1
+MS2(610.4), 19.9min #1330
0
1
2
3
4
5x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
1344.3
273.1
+MS2(435.2), 25.4min #1634
0.0
0.5
1.0
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
A B
C D
F E
149.7
273.6
393.3459.2 584.7
693.9 786.9 960.0 1440.1
+MS, 15.9min #1071
0.0
0.5
1.0
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
273.2
561.2
417.4
+MS2(579.5), 40.1min #2455
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
62
Tabela 08. Composição de compostos fenólicos da polpa do tomate vermelho
detectados por LC-MS em modo positivo.
Em relação à polpa do tomate vermelho, os principais compostos fenólicos
identificados foi o ácido cafeico (m/z 181), sendo os compostos que se
diferenciaram da casca do tomate vermelho. Também foram identificados na polpa
naringenina chalcona e o glicosídeo de luteolina (Tabela 08).
Os mesmos compostos identificados no tomate roxo, sendo um derivado
de ácido feruloylquínico e um de quercetina, foram encontrados no MT.
Pico RT
(min)
Íon
molecular MS² (m/z)
Composto
proposto
6 11,4 181 - Ácido cafeico
7 15,9 273 - Naringenina
chalcona
8 17,3 369 163 Ácido feruloilquínico
2 19,9 611 465/303 Quercetina 3-
rutinosídeo
63
181.5
365.3
684.9
+MS, 11.4min #766
2000
3000
4000
5000
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
351.1
163.1
+MS2(369.6), 17.3min #1156
0
2
4
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
465.0
303.0
+MS2(610.9), 19.9min #1317
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
A B
C D
Figura 17. Espectro de massas (MS2) de flavonoides encontrados na polpa do tomate vermelho obtidos por LC-ESI-MS/MS, em
modo positivo. Sendo: ácido cafeico (A), ácido feruloilquínico (B), naringenina chalcona (C) e quercetina-3-O-rutinosídeo (D).
64
A Figura 18 mostra o comparativo entre os dois tipos de tomate
analisados. Nota-se uma maior concentração de antocianinas na casca em
relação ao tomate vermelho.
Figura 18. Comparação entre tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv (A) e tomate vermelho- MT (B).
De acordo com os resultados obtidos, o gene atv não se mostrou eficiente
em acumular antocianinas na polpa, visto que só foi detectado em quantidade
traços. Entretanto, estudo anterior, como o de Sestari et al. (2014), demonstrou
que uma variante de tomate piramidado somente com os genes Aft/Abg
apresentou menor teor de antocianinas total em relação ao tomate piramidados
com os três genes, logo, a adição do gene atv parece também contribuir para o
aumento do conteúdo de antocianinas. Também neste estudo, o perfil fenólico
encontrado foi semelhante, tanto para o tomate roxo piramidado, quanto para o
MT.
O aumento da concentração das antocianinas, principalmente na casca,
corrobora com a não detecção de naringenina no tomate roxo, uma vez que na
rota biossintética desta classe nos fruto do tomateiro a flavonona serve como
substrato para a produção das antocianinas, como demonstrado na Figura 10.
Estudos que envolvem a manipulação genética para obtenção de tomate
roxo, embora escassos, apontam que a inserção de genes no fruto provoca
A
B
65
acúmulo de antocianidinas, principalmente na casca. Dentre as antocianinas
comumente encontradas estão: petunidina, delfinidina e malvidina (JONES et al.,
2003; MES et al., 2008; WILLITS et al., 2005; GONZALI et al., 2009;
SCHREIBER et al., 2011; LI et al., 2011).
O total de antocianinas presentes no tomate roxo piramidado,
considerando a proporção casca/polpa, é de 23,34 mg/100g de fruto, sendo a
petunidina 3-O-(p-coumaroyl)-rutinosídeo-5-O-glicosídeo a principal fonte. O
tomate roxo apresenta valores inferiores de antocianinas totais quando
comparados com outros frutos, como, por exemplo, o mirtilo que apresenta 28,2
mg/100g (NICOUÉ et al., 2007). Porém, o tomate roxo pode ser considerado
como uma potencial fonte de petunidina, pois possui teores semelhantes ao do
mirtilo (29 mg/100g) (Phenol-Database). Segundo He e Giusti (2010), a
petunidina corresponde a cerca de 5% do total de antocianinas ingeridas uma
vez que não é comumente encontrada nos alimentos vegetais, porém podem ser
encontradas em na uva, no vinho e na cranberry (Phenol-Database).
Entretanto, ponderando que o consumo de tomate é maior quando
comparado ao de frutas sazonais, a produção em escala comercial de um
alimento frequentemente consumido que apresente características que possam
trazer benefícios à saúde é uma estratégia atraente quando pretendido um
aumento no consumo de compostos bioativos.
Logo, pode-se inferir que a inserção dos genes Aft, Abg e atv no processo
de obtenção do tomate roxo foi responsável por aumentar o conteúdo de
antocianinas, principalmente na casca, quando comparado com o tomate
vermelho-MT.
66
5. ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO FENÓLICO DE
TOMATE ROXO
5.1. MÉTODOS
5.1.1. Preparação do extrato aquoso
A amostra (cerca de 5 g, respeitando a proporção de 3 partes de polpa
para 1 de casca) foi extraído três vezes com 100 mL de metanol : água : ácido
acético (70:30:5, v:v:v) com auxílio de um Ultra-Turrax (Polytron-Kinematica
GmbH, Kriens-Luzern, Suíça). O extrato foi filtrado sob pressão reduzida através
de papel de filtro (Whatman número 06), sendo o extrato metanólico obtido
concentrado, sob vácuo, utilizando um evaporador rotativo (Rotavapor RE 120,
Buchi , Flawil , Suécia ) e ressuspendido em 50 mL com água destilada. Na etapa
seguinte, 25 mL do extrato foram passados em coluna de 10g de poliamida (CC-
6 , acherey - Nagel , Alemanha ) em uma seringa de 60 mL, previamente
condicionado com 50 mL de metanol e 100 mL de água destilada. As impurezas
foram lavadas com água destilada e os flavonoides remanescentes foram
eluidos com 120 ml de metanol acidificado com ácido clorídrico a 0,1%. O eluato
resultante foi evaporado até secura, sob pressão reduzida, a 40ºC e dissolvido
em água destilada (EA), antes de administração aos animais.
5.1.2. Delineamento experimental
Foram utilizados camundongos Balb C machos, de peso compreendido
entre 18 e 20 gramas (6 semanas de idade), obtidos do Biotério da FCF. Os
camundongos foram mantidos sob condições padronizadas, em salas com
temperatura entre 23 a 25C e ciclo de claro escuro de 12 h, com alimentação e
água ad libitum. Protocolo n 430 na Comissão de Ética do Uso de Animais, FCF-
USP.
67
5.1.2.1. Estudo de inflamação
Para estudo de inflamação, os animais (n=10/grupo) foram mantidos em
jejum por 6 h e submetidos aos tratamentos abaixo:
Grupo 2mg (G2): Os animais receberam 200 μL de EA (concentração 2
mg petunidina eq./100 g peso corpóreo), por via oral 30 min antes da injeção
intraperitoneal de 500 L de LPS (0,2 μg).
Grupo 4mg (G4): Os animais receberam 200 μL de EA (concentração 4
mg petunidina eq./100 g peso corpóreo), por via oral 30 min antes da injeção
intraperitoneal de 500 L de LPS (0,2 μg).
Grupo Salina (GS): Os animais receberam 200 μL solução salina por via
oral 30 min antes da injeção intraperitoneal de 500 L de LPS (0,2 μg).
Grupo Salina controle (GSC): Os animais receberam 200 μL de solução
salina por via oral 30 min antes da injeção intraperitoneal de 500 L de salina.
Grupo Controle (GC): Os animais receberam 200 μL de dexametasona
(40 μg/20 g de peso corpóreo) por via oral 30 min antes da injeção intraperitoneal
de 500 L de LPS (0,2 μg).
Três horas após a injeção de LPS, os animais foram submetidos à
eutanásia pela exposição a CO2 e a cavidade peritoneal lavada com 2 mL de
salina estéril. Após a coleta do exsudato e homogeneização do líquido de
lavagem, uma alíquota foi diluída em solução de Turk (1:20; v/v), para a
contagem do número total de leucócitos, em câmara de Neubauer e microscopia
de luz.
Duas outras alíquotas de 1x106 células foram centrifugadas a 800 g/6
min/22 C. O precipitado de leucócitos foi usado na análise de expressão de
COX-2 por Real Time-PCR. O sobrenadante foi acondicionado em ultrafreezer -
70ºC e será utilizado para a quantificação de citocinas.
Para a contagem de células diferenciais, uma alíquota foi concentrada em
cytospin (Tharmac) e corada com hematoxilina e eosina. A contagem diferencial
foi realizada através da contagem de pelo menos 100 células, que foram
classificadas como polimorfonucleares ou mononucleares, com base em critérios
morfológicos convencionais em microscópio óptico.
68
5.1.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As células (3 x 106) foram lavadas uma vez com solução salina estéril e
então misturadas a 500 μL de reagente Trizol (Invitrogen, Rockville, MD, EUA) e
o RNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante.
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando um sistema
Improm-II de Transcrição Reversa (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com
as instruções do fabricante e conduzidos a um termociclador Gene Amp (PCR
System 2400, Applied Biosystems). A PCR foi realizada por desnaturação a 94°C
durante 60 s, emparelhamento a 57°C (COX-2) e 60°C (GADPH) durante 1 min
e, por extensão, a 72°C durante 60 s.
Foram utilizados para a amplificação do cDNA trinta ciclos adicionais para
COX-2 e 25 ciclos para a GADPH. Os pares de iniciadores usados para análise
foram: 5'-TTTGTTGAGTCGTTCGCCGGACGGA-3' e 5'-
CGGTATTGAGGAGAAGAGATGGGATT-3' para os iniciadores sense e anti-
sense do gene da COX-2, respectivamente, 5'-
TGGAATCCTGTGGCGTCCGTGAAAC-3' e
5'TAAAACGCGGCTCGGTAACGGTCCG-3' para os iniciadores com sense e
anti-sense do gene GADPH, respectivamente, utilizado como um controle
interno.
5.1.4. Determinação da concentração de citocinas do exsudato peritoneal
As concentrações das citocinas (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17,
MCP-1, MKC e TNF-α) foram quantificadas por meio do kit Milliplex (Millipore
Ltd., Bedford, EUA). O kit constitui-se em imunoensaio e na tecnologia Luminex
TM MAGPIx no qual anticorpos de captura específicos para cada analito estão
fixados à microesferas (beads) através de ligações covalentes não reversíveis.
Estas microsferas são coradas com proporções diferentes de dois fluoróforos,
atribuindo códigos de cores distintos. Após que o analito se agrega aos
anticorpos de captura situados na superfície das microesferas, a fixação final é
feita por meio de um terceiro marcador fluorescente, ficoeritrina (PE) conjugada
ao anticorpo de detecção. Então, o equipamento Luminex 200 move as esferas
em fila única por meio de feixes de dois lasers diferentes em citômetro de fluxo.
69
O primeiro feixe de laser detecta e classifica a microsfera (o código de cor para
o ensaio) e o segundo laser quantifica o sinal transmitido por cada microesfera.
5.1.5. Estudo de absorção
Já para o estudo de absorção, o seguinte modelo de estudo foi realizado
para avaliar a absorção dos compostos fenólicos presentes no tomate roxo.
Os animais foram mantidos em jejum por 6 h e submetidos aos
tratamentos abaixo:
Grupo 0: os animais (n=5) foram imediatamente eutanasiados após receberem
200 μL de solução salina por via oral.
Grupo 30 minutos: os animais (n=8) foram eutanasiados 30 minutos após
receberem 200 μL de EA (concentração 4 mg petunidina eq./100 g peso
corpóreo) por via oral.
Grupo 1 hora: os animais (n=8) foram eutanasiados 1 hora após receberem 200
μL de EA (concentração 4 mg petunidina eq./100 g peso corpóreo) por via oral.
Grupo 3 horas: os animais (n=8) foram eutanasiados 3 horas após receberem
200 μL de EA (concentração 4 mg petunidina eq./100 g peso corpóreo) por via
oral.
Foram coletadas amostras de sangue e fígado de todos os animais. O
sangue foi coletado em microtubos contendo EDTA através de punção
submandibular causando a eutanásia dos animais por hipovolemia. Os
microtubos foram armazenados em gelo até posterior processamento. Após
eutanásia, os animais foram fixados em uma superfície de isopor onde tiveram
a cavidade torácica aberta com auxílio de tesoura cirúrgica para retirada do
fígado, sendo este lavado em solução salina estéril, pesado em papel alumínio
previamente identificado e imediatamente congelado em nitrogênio líquido.
5.1.6. Extração de flavonoides do fígado de camundongo
O fígado de cada animal foi homogeneizado por um minuto utilizando
Ultra-Turrax (Polytron-Kinematica GmbH, Kriens-Luzern, Suíça) em 100 mL de
metanol/água/ácido acético (70:30:5 v/v), centrifugadas em 500 rpm/1 min/22 C.
70
O sedimento foi recuperado e realizado mais duas reextrações com 50 mL de
metanol ou metanol acidificado. Os extratos assim obtidos foram agrupados
obtendo-se e concentrados em rotaevaporador (Rotavapor® 120, Büchi, Flawil,
Suíca) à temperatura de 40 °C até a remoção do metanol para a etapa de
separação em fase sólida, semelhantes ao item 4.1.2.5. As condições de análise
por CLAE-DAD e LS-MS/MS foram as mesmas dos itens 4.1.2.6. e 4.1.2.7.,
respectivamente.
5.1.7. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Para
verificação da normalidade da distribuição dos dados foi utilizado o teste de
Shapiro-Wilk (SHAPIRO; WILK, 1965) e homogeneidade das variâncias o teste
de Levene (LEVENE, 1960). Para análise dos dados foi realizada Análise de
Variância simples (One way ANOVA) e teste de Tukey para comparação de
médias. As análises foram realizadas com auxílio do programa GraphPad Prism
5.0 (Graph Pad Software®, La Jolla, CA, EUA). Sendo estabelecido p<0,05 para
significância estatística.
71
5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.2.1. Influxo leucocitário
De acordo com os resultados obtidos na caracterização do tomate roxo,
foi proposto um estudo de atividade anti-inflamatória do extrato fenólico,
utilizando um modelo de peritonite, em camundongos, induzida pelo LPS; sendo
o extrato fenólico administrado, por via oral, nas concentrações de 2 e 4 mg
petunidina eq./100 g peso corpóreo.
A Figura 19 apresenta o comportamento do influxo leucocitário na
cavidade peritoneal dos animais tratados.
A administração intraperitoneal de LPS resultou em um incremento na
permeabilidade vascular dos capilares, ocasionando em acréscimo de 65%
neutrófilos no infiltrado celular, já que o influxo leucocitário no grupo salina (com
estímulo de LPS-GS) apresentou média 115,63 ± 10,84 x 105 células/mL e o
grupo salina controle (sem estímulo de LPS-GSC) 69,38 ± 9,8 x 105 células/mL.
Observou-se uma redução significativa (p < 0,05) de aproximadamente
37% no número de leucócitos totais no exsudato peritoneal no grupo que
recebeu 4 mg (G4) quando comparado ao grupo estimulado com LPS (GS). O
mesmo efeito não foi observado para o grupo de 2 mg (G2).
Em relação ao grupo tratado com dexametasona (controle anti-
inflamatório-GC) não houve diferença estatística, quando comparado ao grupo
estímulo LPS. Porém ao comparar o grupo tratado com 4 mg do extrato aquoso
de tomate com o grupo dexametasona observa-se uma diferença de 17%, não
significativa, no influxo leucocitário.
Na contagem diferencial de células (poliformonuclear e mononucleares) o
grupo 4 mg apresentou queda nas células PMN. Quando comparado a
quantidade de células PMN do grupo 4mg (27,32 ± 5,83 x 105 células/mL) com
o grupo salina com estímulo (63,84 ± 9,37 x 105 células/mL) observa-se uma
redução significativa (p < 0,05) de 57%. Já ao relacioná-lo ao grupo salina sem
estímulo (24,03 ± 3,1 x 105 células/mL) não se observa diferença estatística.
Para células mononucleares foi notada redução significativa de 20% entre o
grupo salina controle em relação ao grupo 4 mg.
72
Figura 19. Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv no influxo leucocitário em
modelo de peritonite induzida por LPS. Grupos: GSC: salina + salina (salina sem estímulo), GS salina + LPS (salina com estímulo),
Grupo 2 e 4 mg petunidina equivalente/100 g de peso corporal) e GC dexametasona (4 mg/100 g de peso corporal). # (p < 0,05)
diferente quando comparado com o grupo com estímulo com LPS (GS) (n=10 animais/grupo). * (p < 0,05) diferente quando
comparado com o grupo sem estímulo com LPS (GSC) (n=10 animais/grupo).
73
5.2.2. Expressão gênica de mRNA de COX-2
A Figura 20 apresenta a expressão gênica da enzima COX-2 dos grupos
tratados com extrato fenólico de tomate roxo.
Figura 20. Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv na expressão de mRNA de COX-2 em modelo de peritonite induzida por LPS. Grupos: GSC: salina + salina (salina sem estímulo), GS salina + LPS (salina com estímulo), Grupo 2 e 4 mg petunidina equivalente/100 g de peso corporal) e GC dexametasona (4 mg/100 g de peso corporal). # (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo com estímulo com LPS (GS) (n=10 animais/grupo). * (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo sem estímulo com LPS (GSC) (n=5 animais/grupo).
Em relação à expressão gênica de RNA mensageiro da enzima COX-2, o
grupo 4 mg apresentou uma redução significativa (p < 0,05) de 64% na expressão
gênica de COX-2 quando comparado ao grupo salina (salina + LPS) e redução de
10% em relação ao grupo controle (dexametasona). Enquanto o grupo 2 mg
apresentou redução não significativa de 35% em comparação ao grupo salina.
O mesmo padrão foi observado em estudo realizado por Li et al. (2014),
onde extrato de framboesa também apresentou redução significativa na
expressão gênica de COX-2 tanto em modelo de colite de inflamação quanto em
modelo de macrófagos ativados (RAW 264.7). Esta diminuição pode ser explicada
pelo eventual controle das antocianinas na cascata de sinalização do NF-ĸB, por
74
meio do bloqueio da fosforilação e ativação das proteínas envolvidas, tais como
IKK, IĸBα e JNK, no processo de liberação do fator de transcrição.
5.2.3. Concentração de citocinas no exsudato peritoneal
A concentração das citocinas pró-inflamatórias no exsudato peritoneal dos
animais tratados estão apresentadas na Figura 21.
Observa-se que a concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α,
sigla em inglês) no exsudato peritoneal do grupo 4 mg apresentou uma
concentração de 5,7 ± 3,5 pg/mL da citocina, sendo então oito vezes menor (p <
0,05) em relação ao grupo salina (50,8 ± 21,5 pg/mL) e 7% menor do que o grupo
controle (6,1 ± 6,9 pg/mL).
Para interleucina-1β (IL-1β) o do grupo tratado com 4 mg de extrato fenólico
apresentou diminuição de 52% na concentração no exsudato peritoneal ao
compará-lo ao grupo salina. A IL-1β está intimamente ligada ao processo
inflamatório uma vez que ativa a produção de COX-2, NO (através da ativação da
iNOS), moléculas de adesão e PGE2 (DINARELLO, 2007).
Já para IL-2 nota-se que o G4 apresentou (2,7 ± 0,55 pg/mL) concentração
33% menor da citocina em relação ao grupo salina (4,1 ± 1,46 pg/mL). A IL-2 é
produzida por linfócitos T CD4+ e atua na ativação de células do sistema imune
como as células natural killer (NK).
A interleucina IL-6 também apresentou o mesmo comportamento,
apresentando decréscimo significativo (p < 0,05) de 87% ao comparar com o grupo
salina positivo. Esta citocina é um dos principais mediadores do processo
inflamatório, pois pode controlar a síntese de proteínas de fase aguda (proteína C
reativa) e da ativação de neutrófilos (diferenciação de linfócitos T citotóxicos e
maturação de macrófagos) (HEINRICH et al., 2003).
Igualmente as citocinas anteriores, IL-12 e IL-17, também apresentaram
diminuição na concentração no lavado peritoneal do grupo 4 mg de 28 e 50%,
respectivamente, em relação ao grupo salina. Ambas citocinas apresentam papel
pró-inflamatório, por exemplo, a IL-17 ocasiona incremento da produção de IL-6 e
IL-8, para a IL-17; enquanto o estímulo para produção de IFN-γ e TNF-α nas
células NK e linfócitos T, pode ser proveniente da ação da IL-12 (VENKATESHA
et al. 2015).
75
Figura 21. Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv na concentração de citocinas pró-inflamatórias no exsudato em modelo de peritonite induzida por LPS. Grupos: GSC: salina + salina (salina sem estímulo), GS: salina + LPS (salina com estímulo), Grupo 2 e 4 mg (petunidina equivalente/100 g de peso corporal) e GC: dexametasona (4 mg/100 g de peso corporal). # (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo com estímulo com LPS (GS) (n=10 animais/grupo). * (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo sem estímulo com LPS (GSC) (n=10 animais/grupo).
76
A Figura 22 apresenta as concentrações de proteína quimiotática para
monócito -1 (MCP-1) e da quimiocina específica para neutrófico (mKC) nos
grupos.
Ambos os valores obtidos para as concentrações da MCP-1 e da mKC
apresentaram redução significativa (p < 0,05) no grupo 4 mg de extrato em
comparação ao grupo salina, destacando-se redução de 62% para mKC.
Figura 22. Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv na concentração de MCP-1 e mKC no exsudato em modelo de peritonite induzida por LPS. Grupos: GSC: salina + salina (salina sem estímulo), GS: salina + LPS (salina com estímulo), Grupo 2 e 4 mg petunidina equivalente/100 g de peso corporal) e GC: dexametasona (4 mg/100 g de peso corporal). # (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo com estímulo com LPS (GS) (n=10 animais/grupo). * (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo sem estímulo com LPS (GSC) (n=10 animais/grupo).
MCP-1 é responsável pela migração de linfócitos T e monócitos presentes
no sangue e pela diferenciação de macrófagos em células espumosas
(CARDOSO et al, 2011). Já a mKC contribui para o aumento do estado
inflamatório, pois está relacionada com migração de leucócitos (ZERFAOUI, et
al., 2009).
77
A Figura 23 apresenta o efeito dos tratamentos nas concentrações das
citocinas anti-inflamatórias analisadas no exsudato peritoneal dos animais.
Figura 23. Efeito do extrato fenólico de tomate roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv na concentração das citocinas anti-inflamatórias no exsudato em modelo de peritonite induzida por LPS. Grupos: GSC: salina + salina (salina sem estímulo), GS: salina + LPS (salina com estímulo), Grupo 2 e 4 mg petunidina equivalente/100 g de peso corporal) e GC: dexametasona (4 mg/100 g de peso corporal). # (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo com estímulo com LPS (GS) (n=10 animais/grupo). * (p < 0,05) diferente quando comparado com o grupo sem estímulo com LPS (GSC) (n=10 animais/grupo).
A concentração de IL-4 apresentada pelo grupo 4 mg foi de 1,1 ± 0,64
pg/mL, 15% menor em relação ao grupo salina positivo (1,3 ± 0,39 pg/mL),
entretanto, foi 24% maior do que o grupo controle (dexametasona).
Entretanto, para a IL-10, importante citocina anti-inflamatória, a
concentração no grupo 4 mg apresentou um aumento significativo (p < 0,05) de
seis e vinte e três vezes ao compararmos com o grupo salina e grupo controle,
respectivamente.
A IL-4 é conhecida pelo seu papel anti-inflamatório por regular
negativamente a produção de IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-8; além de estimular o
peristaltismo (OLIVEIRA et al, 2011). Por outro lado, a IL-10 está relacionada ao
bloqueio da produção de IFN-γ pelas células NK, aumento da proliferação de
mastócitos e diminuição na produção de TNF-α, IL-6 e IL-1 em macrófagos e
monócitos ativados (MITTAL & ROCHE, 2015).
Muito é estudado em relação ao papel das antocianinas, e seus
metabólitos, no controle do processo inflamatório. Sabe-se que esta classe dos
78
flavonoides pode atuar exercendo controle da via de sinalização do fator de
transcrição NF-ĸB, controlando assim, a expressão das citocinas inflamatórias,
do mesmo modo que eleva a síntese de mediadores anti-inflamatórios
(SPECIALE et al., 2014; KAKKAR & BAIS, 2014). Mykkänen et al. (2014), em
estudo sobre atividade anti-inflamatória do mirtilo, observou que em
camundongos (C57BL) submetidos a uma dieta rica do fruto as concentrações
séricas de IL-1β, IL-6, MCP-1 e TNF-α diminuíram após três meses de consumo.
No presente estudo, a diminuição na expressão gênica de COX-2
observada pode estar diretamente associada com a diminuição das
concentrações de citocinas com ação pró-inflamatória, em especial a IL-1β e
TNF-α, Uma vez que essa diminuição está intimamente relacionada com
supressão da via de sinalização do NF-ĸB.
Considerando as funções exercidas pela IL-10 no processo inflamatório,
o aumento observado na concentração desta citocina no grupo de 4 mg estaria
modulando negativamente a ativação do NF-ĸB, corroborando com a diminuição
de IL-1β, IL-6 e TNF-α. Assim como a redução dos níveis de mKC e MCP-1 está
fortemente relacionada com a diminuição no influxo de células
polimorfonucleares (neutrófilo) e mononucleares (monócito) na cavidade
peritoneal dos animais tratados com 4 mg petunidina eq/100 g peso corpóreo.
Sendo assim, ao considerarmos as citocinas analisadas, observa-se que,
de modo geral, houve uma diminuição na concentração de todas as citocinas
consideradas pró-inflamatórias, destacando-se o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e interleucina 6 (IL-6), assim como aumento na citocina IL-10,
considerada como anti-inflamatória, no grupo que recebeu 4 mg de extrato
fenólico. O mesmo padrão de comportamento não foi observado no grupo tratado
com 2 mg de extrato, podendo-se inferir que esta dosagem não apresentou
atividade sobre a síntese de citocinas. O grupo salina controle (sem estímulo de
LPS) demonstrou não aumentar a concentração de nenhuma das citocinas
analisadas.
Em vista disso, ao ponderarmos que as citocinas pró-inflamatórias, NO e
aminas vasoativas, produzidas por células do sistema imune (mastócito e
macrófago), células endoteliais, bem como os leucócitos migrados, são
responsáveis pelo recrutamento de células da circulação sanguínea para locais
de inflamação, pode-se inferir que a diminuição desses fatores quimiotáticos
79
através da ação dos flavonoides presentes no extrato de tomate roxo pode ter
auxiliado no decréscimo no influxo leucocitário no grupo 4 mg.
Estudos realizados para avaliar a atividade anti-inflamatória de extratos
fenólicos ricos em antocianinas de diversos vegetais também observaram uma
diminuição semelhante no recrutamento leucocitário e consequentemente na
resposta inflamatória. Hassimotto et al. (2013), observou uma redução
significativa do influxo peritoneal de leucócitos em camundongos tratados com
extrato de amora silvestre. Desta forma, as antocianinas podem então atuar
suprimindo a produção de citocinas pró-inflamatórias, TNF-α e IL-8, mediadores
inflamatórios, NO e PGE2, do mesmo modo que diminuir a expressão dos genes
iNOS e COX-2, através do bloqueio da cascata de ativação do via de sinalização
NF-κB. (KARLSEN et al., 2007; KHAN et al., 2012; ROSILLO et al., 2012;
ISHIMOTO et al., 2011, HWANG et al., 2011; TALL et al., 2004; MIN et al, 2010).
Então, ao suprimir a ativação via LPS da cascata de sinalização do NF-
ĸB, as antocianinas presentes no tomate roxo, e seus metabólitos, exercem
papel primordial no que se diz respeito aos mecanismos regulatórios da resposta
inflamatória. Uma vez que podem modular a expressão gênica de diversos
fatores pró-inflamatórios, tais como as citocinas/quimiocinas, receptores de
membrana e moléculas de adesão. Ou seja, as antocianinas podem diminuir a
expressão de iNOS e COX-2 acarretando em decréscimo nas concentrações de
NO e citocinas, que por sua vez ocasiona em menor adesão e influxo de
leucócitos, controlando assim, a resposta inflamatória.
Portanto, o extrato fenólico de tomate roxo parece ser responsável pela
redução do (1) influxo leucocitário na cavidade peritoneal, (2) concentração das
citocinas e (3) expressão gênica de COX-2, quando estimulado com LPS.
80
5.2.4. Absorção dos compostos fenólicos do tomate roxo
Consideração o perfil do extrato fenólico do tomate roxo piramidado e sua
atividade biológica observada foi proposto um estudo de absorção dos
compostos visando correlacioná-los a atividade anti-inflamatória.
Os principais metabólitos identificados por LC-ESI-MS/MS no fígado dos
animais tratados estão descritos na Tabela 09 e os respectivos espectros de
massas apresentados na Figura 24.
Tabela 09. Composição dos metabólitos presentes no fígado dos animais
eutanasiados após 30 minutos de administração do extrato fenólico do tomate
roxo obtido por piramidação do genes Aft, Abg e atv. Detectados por LC-ESI-
MS/MS, em modo positivo.
RT (min) Íon
molecular
Fragmentos dos íons
negativos (m/z) Composto proposto
15,6 303 - Delfinidina aglicona
16,7 481 303 Delfinidina
glucurodinada
16,9 332 272 Malvidina
Os metabólitos detectados por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo, no
fígado dos animais eutanasiados após 30 minutos de administração do extrato
fenólico do tomate (4 mg) foram: as antocianidinas delfinidina m/z 303 e uma
malvidina m/z 332 com fragmento MS2 272 [M-60]+. Neste caso, a perda do
fragmento 60 u, corresponde a perda de dois grupos metila. Também foi
detectada delfinidina glucurodinada, apresentando íon molecular a m/z 481 e
fragmento MS2 a m/z 303 [M-178]+, correspondendo a perda de um ácido
glucurônico.
81
Não foram detectados metabólitos nas amostras de fígado dos animais
eutanasiados após 3 horas de administração oral do extrato fenólico. Do mesmo
que não foi possível detectar metabólitos nas amostras de plasma de nenhum
dos tratamentos realizados.
108.0
217.2
303.1
1185.11260.31303.2
1424.8
1488.5
+MS2(303.2), 15.6min #909
0
100
200
300
400
500
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
149.4
185.8
242.5
271.3
377.3490.9
561.5
620.7
689.5 741.3 801.9
873.0 918.6
999.11036.1 1085.2 1197.71241.1 1336.1 1446.7
332.3
+MS, 16.9min #975
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
+MS2(481.4), 16.6min #962
0
5
10
15
20
Intens.
300.0 302.5 305.0 307.5 310.0 312.5 315.0 317.5 320.0 m/z
Delfinidina glucuornidada
(m/z 481)
Delfinidina aglicona (m/z 303)
Malvidina aglicona (m/z 332)
Figura 24. Espectro de massas (MS2) dos metabólitos encontrados no fígado dos animais eutanasiados após 30 minutos de administração via oral do extrato fenólico de tomate roxo obtidos por LC-ESI-MS/MS, em modo positivo.
82
As formas agliconas de delfinidina e malvidina detectadas no organismo
dos animais tratados podem ser provenientes dos compostos presentes no
extrato do tomate roxo oferecido. Já a forma glucuornidada de delfinidina
encontrada é condizente com o processo que compostos, tais como os
flavonoides, sofrem nos hepatócitos⁄enterócitos a fim de estabilizar e distribuir as
moléculas. Em estudo de biodisponibilidade realizado por Milbury et al. (2010),
os metabólitos de cranberry identificados no sangue e urina de humanos
portadores de doença coronariana após ingestão de uma dose de suco poderiam
influenciar a transdução de sinal e modulação de genes envolvidos na produção
de espécies reativas de oxigênio.
Sabe-se que antocianinas aciladas são menos absorvidas do que as não
aciladas. Uma das hipóteses mais aceitas para tal fato é de que as antocianinas
aciladas possuem baixa afinidade com transportadores de íons, como a
bilitranslocase (PRIOR & WU, 2006).
Estudos sugerem que as formas não aciladas são absorvidas em uma
porção maior do trato gastrointestinal (TG) diferentemente das aciladas que por
serem absorvidas em uma fração menor do TG apresentam tempo de
transferência menor, acarretando em redução na meia-vida no plasma
(NOVOTNY et al., 2012).
A presença de acilação na estrutura das antocianinas também influencia
a sua eliminação do organismo. Enquanto as estruturas aciladas são
rapidamente eliminadas do organismo; as não aciladas, por apresentarem maior
afinidade com os transportadores permanecem maior tempo no organismo.
Em estudo realizado por Charron et al. (2009) as antocianinas aciladas
presentes em suco de cenoura roxa foram menos absorvidas do que as não
aciladas, sendo a sua concentração plasmática 4 vezes menor. Enquanto Wu et
al. (2004) aponta que em porcos tratados com extrato de amora, a recuperação
urinária das antocianinas aciladas foi menor quando comparadas às não
aciladas.
Todavia, a absorção das antocianinas presentes no suco de laranja
vermelha não apresentou diferença entre as diferentes estruturações das
moléculas, como demonstra os resultados obtidos por Felgindes et al. (2006).
Logo, o fato de não ter sido encontrados rutina e petunidina e/ou
metabólitos nas amostras pode ser explicada pela presença de acilações em
83
suas estruturas, uma vez que a relação estrutura/metabolismo parece ser
determinante para aumentar ou diminuir a absorção dos flavonoides.
Tendo em vista o conhecimento a respeito do metabolismo das
antocianinas, sabe-se que apenas uma pequena quantidade é considerada
biodisponível no organismo humano, pois apresenta rápida metabolização e
excreção. Portanto, tendo em vista da complexidade do metabolismo das
antocianinas, esta classe de flavonoides e seus metabólitos encontrados no
fígado dos animais tratados com extrato fenólico, parece ser o fator responsável
pelo controle da resposta inflamatória do presente estudo.
84
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados alcançados nas diferentes etapas no presente estudo
auxiliam no entendimento das questões acerca da atividade anti-inflamatória dos
flavonoides presentes no tomate roxo. Destarte, foi possível formular hipóteses
que auxiliem o entendimento da manipulação genética para obtenção de
alimentos ricos em compostos bioativos, bem como os mecanismos que
envolvem os processos inflamatórios com base nas seguintes constatações:
- A piramidação dos genes Aft, Abg e atv para a obtenção do tomate roxo
acarretou em sensível acréscimo no conteúdo de antocianinas, majoritariamente
na casca, quando comparados aos valores apresentados pelo tomate vermelho-
MT. Tal característica é determinada pela inserção de genes específicos, via
piramidação, no tomate que aumentam a expressão de enzimas envolvidas na
biossíntese do pigmento.
- O extrato fenólico obtido do tomate roxo tem atividade anti-inflamatória,
uma vez que diminuiu o influxo leucocitário (PMN e mononuclear) no exsudato
peritoneal, a concentração de citocinas pró-inflamatórias e expressão gênica de
COX-2, nos animais tratados com extrato de 4 mg (petunidina eq./100 g peso
corpóreo) em modelo de peritonite em camundongo induzido pelo LPS. Desse
modo, a mitigação do processo inflamatório pode estar relacionada ao fato de
que as antocianinas, provenientes do cruzamento genético acarreta em um
fenótipo diferente de tomate roxo, que por meio dos seus metabóltios, podem
atuar no controle da cascata de sinalização do NF-ĸB e, consequentemente, do
processo inflamatório.
85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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95
ANEXO I - Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado/Doutorado
96
ANEXO II – Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais
97
ANEXO III - Ficha do aluno
98
99
ANEXO IV - Currículo Lattes
Afonso Pinho da Silva Maia
Curriculum Vitae ____________________________________________________________________________
Dados pessoais
Nome Afonso Pinho da Silva Maia Nascimento 14/05/1988 - Volta Redonda/RJ - Brasil CPF 119.003.727-03 ___________________________________________________________________________
Formação acadêmica/titulação
2013 Mestrado em Ciências dos Alimentos. Universidade de São Paulo, USP, Sao Paulo, Brasil Título: Atividade anti-inflamatória de extrato fenólico de tomate roxo (Solanum
Lycopersicum L.) em camundongo em modelo de peritonite induzido pelo LPS Orientador: Neuza Mariko Aymoto Hassimotto 2007 - 2011 Graduação em Nutrição. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil Título: Uso de Prebióticos na Absorção de Ferro em Cirurgia Bariátrica Orientador: Alden dos Santos Neves ___________________________________________________________________________
Formação complementar
2012 - 2012 Curso de curta duração em Contagem de carboidratos. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2012 - 2012 Curso de curta duração em Mini-curso: Estratégias da Nutrição Esportiva. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2011 - 2011 Curso de curta duração em Suplementos e Fitoterápicos em Estética. Instituto de Pesquisas Ensino e Gestão em Saúde, IGPS, Brasil 2010 - 2010 Curso de curta duração em Nutrição e Adolescência. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2010 - 2010 Curso de curta duração em Nutrição e Fitoterapia. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2010 - 2010 Curso de curta duração em Aspectos Nutricionais do Envelhecimento. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2009 - 2009 Curso de curta duração em Interpretação de Exames Laboratoriais e
Semiologia. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2009 - 2009 Curso de curta duração em Nutrição Funcional Aplicado à Prática Clínica. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2008 - 2008 Curso de curta duração em Qualidade em Alimentação. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2008 - 2008 Curso de curta duração em Qualidade em Alimentação e Segurança
Alimentar. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Mini-curso: Utilização Integral dos Alimentos. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil
100
2007 - 2007 Curso de curta duração em Mini-curso: Alimentos Dietéticos e Lights. Centro Universitário de Volta Redonda, UniFOA, Volta Redonda, Brasil ____________________________________________________________________________
Atuação profissional
1. Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2010 - 2010 Vínculo: Colaborador , Enquadramento funcional: Colaborador ,
Carga horária: 4, Regime: Parcial
2. Centro Universitário de Volta Redonda - UniFOA __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2011 - 2011 Vínculo: Estágio , Enquadramento funcional: Estagiário , Carga
horária: 6, Regime: Parcial 2010 - 2010 Vínculo: Estágio , Enquadramento funcional: Estagiário , Carga
horária: 6, Regime: Parcial 2009 - 2009 Vínculo: Monitor-Nutrição e Dietética , Enquadramento
funcional: Monitor , Carga horária: 4, Regime: Parcial 2009 - 2009 Vínculo: Monitor-Nutrição e Metabolismo , Enquadramento
funcional: Monitor , Carga horária: 2, Regime: Parcial 2009 - 2009 Vínculo: Monitor-Nutrição e Metabolismo , Enquadramento
funcional: Monitor , Carga horária: 2, Regime: Parcial 2008 - 2008 Vínculo: Monitor - Fisiologia Geral , Enquadramento funcional:
Monitor , Carga horária: 4, Regime: Parcial
3. Prefeitura Municipal de Volta Redonda - PMVR __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2011 - 2011 Vínculo: Estágio , Enquadramento funcional: Estagiário , Carga
horária: 6, Regime: Parcial 2010 - 2010 Vínculo: Estágio , Enquadramento funcional: Estagiário , Carga
horária: 6, Regime: Parcial
4. Prefeitura Municipal de Pinheiral - PMP __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2011 - 2011 Vínculo: Estágio , Enquadramento funcional: Estagiário , Carga
horária: 6, Regime: Parcial
5. SAMA - SAMA __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2010 - 2010 Vínculo: Estágio , Enquadramento funcional: Estagiário , Carga
horária: 16, Regime: Parcial
Projetos
Projetos de pesquisaProjetos de pesquisa2010 - 2010 Perfil Antrompométrico e Estimativa do
Consumo de Antioxodantes pelos Adolescentes Escolares de Volta Redonda - RJ
101
Situação: Concluído Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (3); Integrantes: Afonso Pinho da Silva Maia; Margareth Lopes Galvao Saron (Responsável) 2010 - Atual Efeito dos ácidos graxos poliinsaturados em biomarcadores e estado de
depressão de idosos com síndrome metabólica genotipados para os polimorfismos C677T e A1298C no gene MTHFR
Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (5); Mestrado acadêmico (1); Integrantes: Afonso Pinho da Silva Maia; Ana Paula Alves Avelino (Responsável)
Producão
____________________________________________________________________________
Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. MAIA, A. P. S., Neves,A.S. Uso de Prebióticos na Absorção de Ferro em Cirurgia Bariátrica. Cadernos UniFOA (Impresso). , v.ESP, p.51 - 59, 2011. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. MAIA, A. P. S., Neves,A.S. USO DE PREBIÓTICOS NA ABSORÇÃO DE FERRO EM CIRURGIA BARIÁTRICA In: Ganepão, 2013, São Paulo. Revista Brasileira de Medicina. São Paulo: RBM, 2013. v.70. p.1 - 152 2. MAIA, A. P. S. ESTADO NUTRICIONAL E A IMAGEM CORPORAL DOS ADOLESCENTES DE UMA ESCOLA PÚBLICA In: III Congresso Internacional de Especialidades Pediátricas, 2010, Curitiba. III Congresso Internacional de Especialidades Pediátricas. , 2010. 3. MAIA, A. P. S. ESTADO NUTRICIONAL E PRÁTICA DE ATIVIDADE FÍSICA DOS ADOLESCENTES DE UMA ESCOLA PÚBLICA In: III Congresso Internacional de Especialidades Pediátricas, 2010, Curitiba. III Congresso Internacional de Especialidades Pediátricas. , 2010. 4. MAIA, A. P. S., SARON, M. L. G. Perfil Antrompométrico dos Adolescentes Escolares no Município de Volta Redonda - RJ In: IV Colóquio Técnico-Científico do Unifoa, 2010, Volta Redonda. Cadernos UniFOA (Online). Volta Redonda: FOA, 2010. p.123 - 123 Demais produções bibliográficas 1. MAIA, A. P. S. Importância do Nutricionista em Unidades de Alimentação e Nutrição Hospitalares. Artigo. , 2010. (Outra produção bibliográfica) 2. MAIA, A. P. S., ARAUJO, D. R., LIMA, F. M., FLORENTINO, B. C. Implicações Nutricionais do Uso Abusivo de Antiácidos por Idosos. Artigo. , 2009. (Outra produção bibliográfica) 3. MAIA, A. P. S., ARAUJO, D. R. Aspectos Fisiológicos do Trato Gastrointestinal de Portadores de Bulimia Nervosa. Artigo. , 2008. (Outra produção bibliográfica) Página gerada pelo sistema Currículo Lattes em 03/02/2015 as 09:19:57