universidade de sÃo paulo instituto de quÍmica … · ao paulo, à débora e à fefa, agradeço...
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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE QUMICA
Programa de Ps-Graduao em Cincias (Bioqumica)
LAURA FARKUH
ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE LIPOSSOMAS COM
POTENCIAL PARA APLICAO EM BASE COSMTICA
Verso corrigida da Dissertao conforme Resoluo CoPGr 5890
O original se encontra disponvel na Secretaria de Ps-Graduao do IQ-USP
So Paulo
Data do Depsito na SPG:
04/04/2016
LAURA FARKUH
ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE LIPOSSOMAS COM
POTENCIAL PARA APLICAO EM BASE COSMTICA
Dissertao apresentada ao
Instituto de Qumica da
Universidade de So Paulo
para obteno do ttulo de
Mestre em Cincias
(Bioqumica)
Orientadora: Prof Dr Iolanda Midea Cuccovia
So Paulo
2016
Ficha Catalogrfica
Elaborada pela Diviso de Biblioteca e
Documentao do Conjunto das Qumicas da USP.
Farkuh, Laura
F229e Estudo e desenvolviment o d e l ipossomas com potencial para
aplicao em base cosmtica / Laura Farkuh. -- So Paulo, 2015.
88p.
Dissertao (mestrado) Instituto de Qumica da Universidade de
So Paulo. Departamento de Bioqumica.
Orientador : Cuccovia , Iolanda Midea
1 . Biomimetico I. T. II . Cuccovia, Iolanda Midea, orientador.
574.192 CDD
Aos meus grandes amigos Catarina e Filipe, que estiveram comigo todos os dias
ao longo dessa jornada. Amo vocs.
AGRADECIMENTOS
Profa Iolanda, muito obrigada por tudo! Por ter me recebido em seu laboratrio de
braos abertos, com pacincia e disposta a ensinar desde o primeiro dia em que cheguei. Io,
voc uma pessoa maravilhosa e me sinto muito honrada em ser sua aluna! Com certeza voc
a melhor orientadora que eu poderia ter escolhido.
Ao Prof. Hernan, obrigada pelos inmeros conselhos, abraos, incentivo e at mesmo
pelas palavras muitas vezes duras de serem escutadas, porm sinceras e cheias de cuidado.
Quero que guarde com voc minha eterna admirao pela pessoa que voc !
Aos meus pais Alinete e Rogrio, muito obrigada por sempre sustentarem meus sonhos
e fazerem o possvel para que eu possa alcana-los. Obrigada por sempre me dizerem que no
importam as escolhas que eu faa, vocs s querem que eu seja feliz... vocs me fazem muito
feliz apenas por existirem na minha vida!
Aos meus irmos Aline e Alberto, obrigada pelos timos momentos que passamos
juntos, muito bom saber que seremos amigos para a vida inteira. Obrigada tambm pelos
irmos que vocs me deram, meus cunhados Cleiton e Juliana, que s vieram para completar
nossa famlia. E no posso esquecer das minhas lindas sobrinhas, Jlia e Isabela, princesas do
meu corao.
Aos meus familiares agradeo pelo apoio, pela fora, pelo cuidado! Em especial
agradeo s minhas duas avs, Maria e Nely, por quem tenho enorme respeito e carinho.
Ao Renato, obrigada por ser meu melhor companheiro! Por estar comigo na minha
louca rotina, por me incluir na sua vida e por participar da minha. Nunca vou esquecer o quo
importante voc foi (e ainda tem sido) nessa fase, o quanto me deu foras para continuar
quando eu achei que no iria conseguir mais. Agradeo tambm aos seus pais, Lcia e Thales,
que sempre me recebem muito bem e que de alguma forma tambm contriburam durante a
escrita desse trabalho.
Catarina e ao Filipe gostaria de dizer que vocs so duas das pessoas mais
importantes em minha vida. No consigo pensar em nada para escrever aqui alm das coisas
que costumo dizer a vocs para expressar o que eu sinto. Todos os dias eu agradeo por ter
vocs como amigos. Vocs me do fora, inspirao e fazem meu corao transbordar de
bons sentimentos. Vocs estaro sempre vivos em meu corao, assim como todos os
momentos que partilhamos. Obrigada por sempre me aceitarem como sou.
Aos meus amigos Clauden, Bia, Mari, Pricles, Matheus, Monique e Roger agradeo
por sempre estarem presentes em minha vida de alguma forma, nunca me deixando esquecer
dos laos que criamos.
Aos meus amigos que considero famlia, Juju, Thiago e Renatinha, obrigada pela
convivncia, pelas risadas e choros, por todos os momentos que dividimos ao longo destes
ltimos anos. Vocs so muito especiais!
minha amiga Greice, muito obrigada, infinitamente obrigada. Nunca esquecerei que
voc me ensinou tudo quando cheguei ao laboratrio e que at hoje me ensina um milho de
coisas. muito bom sempre contar com voc! Espero que voc saiba que tambm pode contar
comigo. Quero ser sua amiga por todos os anos que ainda viro.
Marcela, agradeo por ter me dado suporte em diversos momentos ao longo do meu
mestrado, pela amizade e carinho, pelos conselhos e pela sinceridade sempre.
Aos meus amigos Lu, Ray e Joo, agradeo por estarem comigo no dia-a-dia, pelas
histrias divertidas que vocs me proporcionaram e at mesmo pelos momentos mais tensos e
srios em que dividimos as angstias. A amizade de vocs me d nimo e alegria ao longo dos
dias!
A todos os meus colegas de laboratrio quero agradecer pela convivncia e por toda a
compreenso e apoio com o meu trabalho. Obrigada por tornarem esse ambiente onde
passamos a maior parte de nossos dias nico e especial.
Mrcia, nossa tcnica de laboratrio, agradeo por toda a assistncia durante a minha
estadia no laboratrio e tambm pelas inmeras risadas, almoos e pela companhia dentro e
fora do nosso ambiente de trabalho.
Ao Gustavo Battesini, obrigada por me aguentar por muitos desses dias (no foi fcil,
eu sei), com todos os meus humores, me fazendo rir em todos os momentos. Obrigada pelo
empenho em me ajudar durante os experimentos, na escrita deste trabalho e pelas inmeras
dicas que voc me deu (desculpe, no pude usar as 5 pginas).
Profa Flvia, agradeo pelos abraos, pelo carinho, pelos conselhos, cuidados...e por
simplesmente estar na minha vida! Ter voc por perto torna os meus dias muito melhores!
Ao Paulo, Dbora e Fefa, agradeo pelo incentivo para a concluso deste trabalho e
pelo incentivo que me deram de diversas formas. Agradeo especialmente ao Paulo por ter
contribudo ativamente na idealizao e concretizao do meu projeto de mestrado.
Profa Salette Reis, obrigada por ter me recebido em seu laboratrio na Universidade
do Porto em Portugal e por ter contribudo com o meu trabalho. Cludia Nunes, que me
orientou, ajudou e partilhou comigo um pouco do muito o que sabe. Agradeo tambm
Profa. Marcela Segundo e Lusa Barreiros, que tanto se esforaram com a quantificao do
cido lurico.
Gostaria de agradecer a alguns professores que me inspiraram durante a minha estadia
no IQ e por quem tenho enorme admirao. So eles: Profa Cllia, Prof. Bayardo e Profa
Bianca. Tambm agradeo a Profa Shirley Schreier pela participao que teve durante o meu
trabalho e pela pessoa genial que !
Ao Prof. Cristiano Luis Pinto de Oliveira, do Instituto de Fsica da USP, agradeo pelo
auxlio para os experimentos de SAXS. Agradeo tambm ao Pedro Oseliero e a Brbara
Gerbelli, que muito contriburam me enviando materiais, discutindo resultados comigo e se
disponibilizando a me ajudar.
Ao Dr. Rodrigo Portugal e ao Dr. Alexandre Cassago do LNNano agradeo pelas
anlises de Crio-microscopia.
Ao CNPQ pela bolsa de mestrado concedida durante a realizao do meu trabalho no
IQ-USP.
RESUMO
Farkuh, L. Estudo e Desenvolvimento de Lipossomas com Potencial para Aplicao em
Base Cosmtica. 2016. 88 p. Dissertao- Programa de Ps-Graduao em Cincias
(Bioqumica). Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.
A acne vulgar uma das doenas cutneas mais comuns, apresentando como um de seus
fatores fisiopatolgicos primrios a colonizao pelo microrganismo Propionibacterium
acnes. Atualmente, tm-se buscado terapias alternativas para o combate ao P. acnes,
destacando-se alguns cidos graxos, como o cido larico (LA). O LA uma molcula pouco
solvel em gua, sendo possvel sua incorporao em lipossomas. Os lipossomas apresentam
capacidade de encapsulao/ liberao de ativos e impedem a desidratao da pele, tornando-
se ingredientes inovadores na rea de cosmticos. Foram preparados lipossomas de
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) contendo diferentes concentraes de LA, que variaram de
0 a 50% da concentrao total em mol, em quatro pHs: 9,0, 7,4, 5,0 e 3,0. Nestes pHs o estado
de protonao do LA muda variando de 0 a -1. Os lipossomas foram extrusados por filtros
com poros de 100 nm de dimetro visando obteno de vesculas unilamelares grandes
(LUV). As LUV foram caracterizadas quanto a sua estabilidade em condies de prateleira,
temperatura de transio de fase da bicamada, encapsulamento no interior aquoso, liberao
do LA, difuso das vesculas na pele e seus aspectos morfolgicos foram caracterizados por
espalhamento de raios-X a baixo ngulo (SAXS) e crio-microscopia eletrnica de
transmisso. Estudos de estabilidade mostraram que independentemente da concentrao de
LA, as formulaes so mais estveis em pHs mais altos, quando LA est em sua maioria na
forma de laurato. Os experimentos de DSC revelaram que em pHs 3,0 e 5,0 e concentraes
maiores de LA, a interao deste cido graxo com as bicamadas favorecida, havendo um
aumento da temperatura de transio de fase (Tm) e diminuio da cooperatividade. Anlises
de taxa de incorporao de sondas hidroflicas confirmaram a presena de um compartimento
aquoso interno para as vesculas de DPPC:LA. O LA conseguiu permear a pele no perodo
avaliado e pouco LA foi liberado das vesculas em condies de temperatura ambiente. A
morfologia das LUV se mostrou bem diferente da esperada e se observaram vesculas com
mais de uma bicamada e outros formatos que no o esfrico. Estes resultados podem auxiliar
na otimizao das condies para uma formulao que poder ser usada no tratamento da
acne, aumentando a eficcia do LA no stio alvo.
Palavras-chave: cido Lurico, Vesculas Unilamelares Grandes, Acne.
ABSTRACT
Farkuh, L. Study and Development of Liposomes with Potencial Cosmetic Application.
2016. 88 p. Master Thesis- Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Qumica,
Universidade de So Paulo, So Paulo.
Acne vulgaris is one of the most common skin diseases, presenting as one of its causes the
microorganism Propionibacterium acnes colonization. Currently, it has been sought
alternatives therapies against P. acnes, especially some fatty acids, like the lauric acid (LA).
LA is a molecule with low water solubility, allowing its incorporation in liposomes.
Liposomes have encapsulation/release capacity of drugs and promote skin lipids regeneration,
becoming an innovative ingredient in cosmetics area. Dipalmitoylphosphatidylcholine
(DPPC) vesicles containing different LA concentrations were prepared at pHs: 9.0, 7.4, 5.0
and 3.0. At these pHs the LA protonation changes and its charge varies from 0 to -1. The
vesicles were extruded through filters containing pores of 100 nm to obtain large unilamellar
vesicles (LUV) that were characterized for stability in shelf conditions, bilayer phase
transition temperature, aqueous internal compartment encapsulation, LA release and in vitro
skin permeation. Its morphological features were characterized by small angle X-ray
scattering (SAXS) and cryo-electron transmission microscopy. Stability assays showed that,
regardless LA concentration, formulations were more long-term stable in higher pHs, when
LA is mostly in the form of laurate. The differential scanning calorimetry, DSC, experiments
showed that, at pHs 3.0 and 5.0 and higher LA concentrations, the interaction between the
bilayer and LA is favored, increasing phase transition temperature (Tm) and reducing
cooperativity. Incorporation of hydrophilic probes confirmed the presence of an internal
aqueous compartment in DPPC:LA vesicles. The LA managed to permeate the skin on the
period evaluated and, in ambient conditions, low LA concentration was released from the
vesicles. LUV containing more than one bilayer and non-spherical structures were observed.
The obtained results may help in the optimization of the conditions for a formulation that can
be used in the treatment of acne and improving the effectiveness of LA delivery to the target
site.
Keywords: Lauric acid, Large Unilamellar Vesicles, Acne.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Eventos desencadeados pela acne vulgar.................................................................. 14
Figura 2- Estgios de desenvolvimento da acne vulgar. .......................................................... 16
Figura 3- Propionibacterium acnes. ......................................................................................... 17
Figura 4- Imagem de microscopia de biofilme formado pelo microrganismo
Propionibacterium acnes. ......................................................................................................... 18
Figura 5- Perxido de Benzola. ............................................................................................... 20
Figura 6- Atividade do BPO comparado ao cido lurico (Nakatsuji et al., 2009). ................. 22
Figura 7- Representao de lipossoma e da bicamada lipdica. ............................................... 23
Figura 8- Diferentes tipos de estruturao das vesculas. ......................................................... 24
Figura 9-Agregados formados por molculas anfipticas de diferentes geometrias. ............... 25
Figura 10- Estruturas do (a) DPPC e do (b) cido lurico. ...................................................... 29
Figura 11- Esquema de preparo de vesculas pelo mtodo de hidratao do filme lipdico. ... 30
Figura 12- Extruso de MLV para se obter vesculas unilamelares grandes, LUV. ................ 30
Figura 13- Membrana na fase gel e depois na fase lquido-cristalina, acima da tem0peratura de
transio de fase........................................................................................................................ 32
Figura 14- Calormetro Diferencial de Varredura. ................................................................... 33
Figura 15- Equipamento Nanostar Bruker utilizado nas medidas de SAXS. ........................... 35
Figura 16- Modelo de deconvoluo de gaussianas. ................................................................ 36
Figura 17- Perfil de densidade eletrnica da bicamada, indicando em vermelho a espessura da
bicamada. .................................................................................................................................. 37
Figura 18- Exemplo de imagem 2-D para uma amostra vitrificada. ........................................ 38
Figura 19- Preparo das amostras para Crio-TEM pelo Dr. Alexandre Cassago no LNNano-
Campinas. ................................................................................................................................. 39
Figura 20- Estrutura da molcula de 5(6)-carboxifluorescena. ............................................... 40
Figura 21- Estrutura da molcula do Pireno Tetrasulfonato de Sdio. .................................... 41
Figura 22- Cromatografia de permeao em gel por excluso de tamanho. ............................ 41
Figura 23- Cromatograma obtido para o encapsulamento de sonda fluorescente. O primeiro e
menor pico corresponde s vesculas contendo fluorforo em seu interior e o pico maior, ao
fluorforo no encapsulado. No inserto mostrada a fluorescencia das amostras contendo as
LUV com CF. ........................................................................................................................... 42
Figura 24- Esquema mostrando o prncipio da tcnica de EPR com a transio entre os nveis
de energia do momento magntico de spin. ............................................................................. 43
Figura 25- Reduo da molcula de ascorbato. ........................................................................ 44
Figura 26- Reao entre o marcador de spin CAT1 e o ascorbato. .......................................... 44
Figura 27- Estrutura molecular do CAT1. ................................................................................ 45
Figura 28- Esquema do experimento de liberao do LA. ....................................................... 46
Figura 29- Dispositivo de dilise. ............................................................................................. 47
Figura 30- Sistema de difuso de Franz ................................................................................... 48
Figura 31- Variao nos valores de Dh e PdI em funo do tempo para LUV diferentes
concentraes de LA em tampo borato 10 mM, pH 9,0. ........................................................ 52
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Figura 32- Variao nos valores de Dh e PdI ao em funo do tempo para LUV com
diferentes concentraes de LA em tampo tris-HCl 10 mM pH 7,4. .................................... 53
Figura 33- Valores de Dh e PdI para LUV com diferentes %de LA em tampo acetato 10 mM,
pH 5,0. ...................................................................................................................................... 54
Figura 34- Efeito do tempo de incubao nos valores de Dh e PdI para LUV com diferentes
concentraes de LA em tampo acetato 10 mM pH 5,0. ........................................................ 55
Figura 35- Valores de Dh e PdI para LUV com diferentes % de LA em tampo formiato 10
mM, pH 3,0 ............................................................................................................................... 56
Figura 36- Efeito do tempo de incubao nos valores de Dh e PdI para LUV com diferentes
concentraes de LA em tampo formiato 10 mM, pH 3,0. .................................................... 56
Figura 37- Amostra de LUV com formao de precipitados em: a) Tampo acetato, 10 mM,
pH 5,0; b) Tampo formiato 10 mM, pH 3,0 . ......................................................................... 57
Figura 38- Termogramas das LUV de DPPC/LA nos tampes (a)borato 10mM pH 9,0, (b)
tris-HCl 10 mM pH 7,4, (c) acetato 10 mM pH 5,0 e (d) formiato 10 mM pH 3,0. ................ 58
Figura 39- Valores de Tm de LUV de DPPC:LA obtidos para cada concentrao de LA em
diferentes pHs. .......................................................................................................................... 59
Figura 40- Dados experimentais de SAXS (crculos abertos) e ajuste com o modelo (linha
cheia). Os ajustes so bastante satisfatrios em toda a regio de q considerada. As LUV de
DPPC:LA foram preparadas em tampo Tris-HCl, 10 mM, pH 7,4. A concentrao das LUV
era 10 mM. ................................................................................................................................ 61
Figura 41- A curva experimental de SAXS mostrando vesculas A) multilamelares e B)
unilamelares. ............................................................................................................................. 62
Figura 42- Perfil de contraste de densidade eletrnico da bicamada lipdica de LUV em pH
7,4 contendo diferentes razes DPPC:LA obtido a partir do ajuste dos dados experimentais de
SAXS. ....................................................................................................................................... 63
Figura 43- Comportamento da espessura da bicamada em funo da % de LA nas LUV em
vrios pHs; barras de erros com desvio padro esto representadas verticalmente. ................ 65
Figura 44- Comportamento da periodicidade lamelar em funo da % de LA das LUV; barras
de erros com desvio padro esto representadas verticalmente. .............................................. 66
Figura 45- Comportamento do Parmetro de Caill em funo da % LA de LUV de DPPC:LA
da amostra; barras de erros com desvio padro esto representadas verticalmente. ................ 67
Figura 46- Comportamento do nmero mdio de bicamadas correlatas, N, em funo %de LA
das LUV; barras de erros com desvio padro esto representadas verticalmente. ................... 68
Figura 47- Imagens de Crio-EM de LUV de DPPC em pH 7,4 (acima) e pH 5,0 (abaixo). .... 70
Figura 48- Imagens de Crio-EM de LUV de DPPC:LA 70:30 em pH 7,4 (acima) e pH 5,0
(abaixo). .................................................................................................................................... 71
Figura 49- Imagens de Crio-EM de LUV de DPPC:LA 50:50 em pH 7,4 (acima) e pH 5,0
(abaixo). .................................................................................................................................... 72
Figura 50- Comparao da porcentagem de encapsulamento de CF com o obtido usando
CAT1 em LUV de DPPC:LA, ambos em tampo Tris-HCl 50 mM, pH 7,4. .......................... 77
Figura 51- Comparao da porcentagem de encapsulamento de PTS com o obtido usando
CAT1 em LUV de DPPC:LA, ambos em tampo acetato 50 mM, pH 5,0. ............................. 77
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Figura 52- Concentrao de LA liberado com o tempo das LUV de (a) DPPC:LA 90:10; (b)
DPPC:LA 70:30 e (c) DPPC:LA 50:50 nos tampes acetato, 0.01 M pH 5,0 e tampo Tris-
HCl 0.01 M 7,4. A concentrao de LUV 0.5 mM................................................................ 79
Figura 53- Porcentagem de permeao de LA com o tempo de LUV de DPPC:LA em tampo
Tris-HCl 10 mM, pH 7,4. [LUV]= 0.5 mM. ............................................................................ 80
Figura 54- Porcentagem de permeao de LA com o tempo de LUV de DPPC:LA em tampo
acetato 10 mM, pH 5,0. [LUV]= 0.5 mM. ............................................................................... 81
file:///C:/Users/Laura/Downloads/Laura-%20Dissertao%20Laura_CORRIGIDA%20(2)%20(2).docx%23_Toc447450656file:///C:/Users/Laura/Downloads/Laura-%20Dissertao%20Laura_CORRIGIDA%20(2)%20(2).docx%23_Toc447450656file:///C:/Users/Laura/Downloads/Laura-%20Dissertao%20Laura_CORRIGIDA%20(2)%20(2).docx%23_Toc447450656
SUMRIO
1 INTRODUO ..... 14
1.1 ACNE VULGAR .... 14
1.1.2 Propionibacterium acnes .... 17
1.1.3 Terapias no tratamento da acne vulgar ....... 19
1.1.3.1 Retinides ... 19
1.1.3.2 Perxido de Benzola (BPO) ..... 19
1.1.3.3 Tratamento hormonal .. 20
1.1.3.4 Antibiticos .. 20
1.1.3.5 Outras estratgias no tratamento da acne ..... 21
1.2 CIDO LURICO .... 21
1.3 LIPOSSOMAS ... 23
1.4 LIPOSSOMAS E CIDOS GRAXOS ............... 25
2 OBJETIVOS ........ 28
3 MATERIAIS E MTODOS ..... 29
3.1 MATERIAIS . 29
3.2 PREPARO DOS LIPOSSOMAS .............. 29
3.3 ESTABILIDADE DAS VESCULAS COM CIDO LURICO .. 30
3.3.1 Medidas do Dimetro Hidrodinmico e do ndice de Polidispersidade .............. 32
3.4 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA ............................................. 32
3.4.1 Determinao da Tm e Cooperatividade por DSC ................................................ 34
3.5 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO NGULO (SAXS) .............................. 34
3.5.1 Medidas de SAXS e Ajuste dos Dados Experimentais .......................................... 35
3.5.1.1 Ajuste das Curvas de Espalhamento........................................................................ 35
3.5.1.2 Fator de Estrutura ..................................................................................................... 36
3.5.1.3 Fator de Forma ......................................................................................................... 36
3.5.1.4 Espessura da Bicamada ............................................................................................ 37
3.6 CRIO-MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO ................................... 37
3.6.1 Preparo das Amostras para Crio-TEM e Aquisio das Imagens ...................... 38
3.7 ENCAPSULAMENTO DE SONDAS NO COMPARTIMENTO AQUOSO
INTERNO DAS LUV ......................................................................................................... 39
3.7.1 Encapsulamento de Sondas Fluorescentes ............................................................. 39
3.7.1.1 Vesculas com CF/PTS e Medidas de Fluorescncia ............................................. 41
3.7.2 Encapsulamento de Marcador de Spin .................................................................. 43
3.7.2.1 Vesculas com CAT1 e Medidas de EPR ................................................................ 44
3.8 LIBERAO DO CIDO LURICO MEDIDA POR DILISE .............................. 46
3.9 DIFUSO DO CIDO LURICO POR CLULA DE FRANZ ................................ 47
3.10 QUANTIFICAO DOS FOSFOLIPDIOS ............................................................ 48
3.11 QUANTIFICAO DO CIDO LURICO ............................................................. 49
4 RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................... 51
4.1 ESTABILIDADE DAS VESCULAS COM CIDO LURICO ................................ 51
4.2 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA .............................................. 57
4.3 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO NGULO (SAXS) .............................. 61
4.3.1 Espessura da Bicamada ............................................................................................ 65
4.3.2 Periodicidade Lamelar ............................................................................................. 66
4.3.3 Parmetro de Caill .................................................................................................. 66
4.3.4 Nmero Mdio de Camadas Correlatas .................................................................. 68
4.4 CRIO-MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO .................................... 69
4.5 ENCAPSULAMENTO DE SONDAS NO COMPARTIMENTO AQUOSO
INTERNO DAS LUV ........................................................................................................... 73
4.5.1 Encapsulamento de CF em pH 7,4 ........................................................................... 73
4.5.2 Encapsulamento de PTS em pH 5,0 ......................................................................... 74
4.5.3 Encapsulamento de CAT1 nas LUV ......................................................................... 75
4.6 LIBERAO DO CIDO LURICO MEDIDA POR DILISE ................................ 78
4.7 DIFUSO DO CIDO LURICO POR CLULA DE FRANZ .................................. 80
5 CONCLUSES ................................................................................................................ 83
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................ 85
14
1 INTRODUO
1.1 ACNE VULGAR
A acne vulgar uma das doenas de pele mais comuns que afeta cerca de 85% da
populao em algum momento de sua vida. A acne uma doena do folculo pilossebceo,
que possui como caractersticas a hiperproduo sebcea, a hiperqueratinizao folicular, o
aumento da colonizao pelo microrganismo Propionibacterium acnes e a inflamao
drmica (FIGURA 1). A sequncia exata dos eventos e como eles interagem ainda so
desconhecidos.
Figura 1- Eventos desencadeados pela acne vulgar.
As caractersticas clnicas da acne incluem excesso de oleosidade da pele, leses no
inflamatrias (comedes abertos e fechados) e leses inflamatrias (ppulas e pstulas) que
podem deixar cicatrizes na pele. Geralmente a acne ocorre nos locais do corpo com maior
concentrao de unidades pilosebceas como a face, o pescoo e a parte superior do tronco.
15
As unidades pilosebceas so caracterizadas como canais foliculares dilatados, preenchidos
com queratina, lipdios e microrganismos (STRAUSS; KLIGMAN, 1960).
Apesar de se manifestar com menor intensidade em orientais e em pessoas de pele negra,
a acne ocorre em todas as raas, sendo que os casos mais graves tendem a se manifestar em
indivduos do sexo masculino (afetando 95% de indivduos do sexo masculino contra 83% do
sexo feminino) devido influncia dos hormnios andrgenos. Aps os 20 anos de idade a
doena tende a regredir espontaneamente mas, em alguns casos, pode persistir tambm na fase
adulta (GOLDBLUM, 2003).
A influncia gentica na acne muito importante, acreditando-se que ela seja proporcional
ao grau de dermatose; essa influncia ocorre sobre o controle hormonal, hiperqueratinizao
folicular e secreo sebcea, mas no na infeco bacteriana.
A hiperqueratinizao folicular o primeiro fator para o desenvolvimento da acne vulgar.
Com ela se forma um tampo crneo que retm o contedo sebceo no interior da glndula.
No interior dessa leso, as proteases produzidas pelo P. acnes agem sobre o epitlio glandular
rompendo-o, o que facilita a expulso do contedo sebceo para a derme (BOJAR;
HOLLAND, 2004).
Referindo-se aos fatores etiopatognicos da acne, h alterao nos componentes do sebo
dos portadores da doena em comparao com os indivduos sos. Em ambos os grupos, a
proporo de cidos graxos livres (11%- 18%), esqualeno (10%-12%), colesterol e seus
steres (juntos, menor que 5%) similar. No entanto, a proporo de triglicrides no primeiro
de 46%-52%, contra 60%-68% no segundo, e a de steres de cidos graxos maior entre os
acnicos (20%-26%) em relao aos no acnicos (9%-12%) (MCGINLEY et al., 1980).
Ultimamente, discute-se a participao dos cidos graxos livres, obtidos pela hidrlise de
triglicrides atravs das lipases do P. acnes, na etipatognese da acne vulgar. Acredita-se que
estes cidos graxos acumulam-se no infundbulo glandular por um longo perodo de tempo e
que teriam a capacidade de irritar o epitlio acarretando, assim, a hiperqueratinizao (estgio
inicial da comedognese) e, por fim, a inflamao (BOJAR; HOLLAND, 2004).
De todos os componentes do sebo alterados em portadores da acne, o cido linoleico um
dos principais. O cido linoleico, que est reduzido nos comedes, um cido graxo
essencial, com importante papel na manuteno da funo de barreira epidrmica. A alterao
na barreira epidrmica facilita a penetrao na derme de microrganismos e cidos graxos pr-
inflamatrios presentes no sebo, promovendo infeco e inflamao. Weeks et al. mostrou
que os inibidores de lipase levaram a uma reduo da quantidade de cidos graxos na pele,
16
mas no foram capazes de tratar completamente a acne. Fraes lipdicas no sebo, geradas por
outro mecanismo alm do bacteriano, tambm parecem ser responsveis pelo
desenvolvimento da inflamao na acne (JAPPE, 2003).
Os andrgenos, por si, estimulam as glndulas sebceas a produzirem sebo atravs de suas
aes sobre receptores celulares (WEBSTER, 1995).
Historicamente, discute-se a possvel relao entre a ingesto oral de algumas substncias
e a acne vulgar, mas os estudos ainda no conseguiram estabelec-la. As crticas que se fazem
a tais estudos com seres humanos so, muitas vezes, em funo de limitaes metodolgicas
no s na avaliao subjetiva, mas, tambm, na interpretao e confirmao dos resultados
obtidos.
A acne pode ser classificada clinicamente em quatro nveis (FIGURA 2), de acordo com o
seu grau de desenvolvimento:
Grau I: forma mais leve, no inflamatria, caracterizada pela presena de comedes
abertos e fechados;
Grau II: acne inflamatria, presena de ppulas e pstulas, de contedo purulento;
Grau III: acne ndulo cstica, com ndulos mais salientes;
Grau IV: acne conglobata, com a formao de abcessos.
Figura 2- Estgios de desenvolvimento da acne vulgar.
17
As complicaes mais relevantes da acne vulgar so cicatrizes fsicas e sequelas
psicossociais, que podem persistir aps o desaparecimento das leses ativas. Os sintomas da
acne afetam principalmente a qualidade de vida, sendo a segunda maior causa de suicdio
entre as doenas de pele. A acne afeta a aparncia da pele, um importante rgo relacionado
autoestima das pessoas e suas relaes sociais (GOLDBLUM, 2003).
1.1.2 Propionibacterium acnes
O folculo pilosebceo um ambiente anaerbico e rico em lipdios, propcio ao
desenvolvimento de microrganismos (P. acnes, P. avidum, P. granulosum, P. propionicum,
and P. lymphophilum) comensais na pele. Estas bactrias so gram positivas e anaerbias,
geralmente com condio ideal de desenvolvimento a 35C (STRAUSS; KLIGMAN, 1960).
A pele normal capaz de tolerar um nmero limitado de microrganismos. Geralmente
as espcies gram positivas conseguem se estabelecer melhor nas condies desta regio (pH,
disponibilidade de oxignio e gua, radiao ultravioleta, concentrao de ons, etc), devido a
sua parede celular que lhe confere alta estabilidade estrutural.
As populaes de propionibacteria que se estabelecem na pele geralmente tm um
efeito positivo sobre ela, criando um ambiente protegido contra a colonizao de outros
microrganismos patognicos. Entretanto, quando o hospedeiro submetido a algumas
condies como trauma, baixa imunidade, entre outras, a propionibacteria pode desenvolver
patogenicidade (MCDOWELL et al., 2005). A maioria dos trabalhos publicados sobre a
microflora da pele diz respeito ao microrganismo P. acnes (FIGURA 3), um dos maiores
desafios a ser superado para o tratamento da acne vulgar (NEWTON et al., 1997).
Figura 3- Propionibacterium acnes.
18
A populao de P. acnes costuma ser maior na face e no tronco superior do corpo,
locais com maior concentrao lipdica, indicando uma relao direta entre populao
bacteriana e seborria local. Pressupe-se que o aumento da populao de P. acnes na
superfcie cutnea esteja relacionado com o aumento da produo de triglicrides e, talvez, de
colesterol. Alteraes na composio lipdica podem determinar a sobrevida da P. acnes.
Apesar dos demais fatores que contribuem para o desenvolvimento da acne, a hiptese
de que o papel do microrganismo P. acnes fundamental sustentada pelo sucesso obtido em
terapias que fazem uso de antibiticos e pela reduo de sua eficcia demonstrada em
tratamentos contra cepas de P. acnes resistentes a estes mesmos antibiticos. Ainda que
diversos antibiticos possuam ao contra o P. acnes in vitro, seu uso no combate a acne
geralmente limitado devido sua solubilidade, que desfavorece sua permeao na pele
(BOJAR; HOLLAND, 2004).
Leyden et al. (1983) mostraram que a resistncia da P. acnes frequentemente
desenvolvida em pacientes que fazem uso a longo prazo de antibiticos por via sistmica.
Porm, nas ltimas dcadas, tem sido discutida tambm uma possvel relao entre o aumento
de cepas resistentes de P. acnes e o uso de antibiticos tpicos (LEYDEN et al., 1983). Alm
do fator de resistncia, ensaios in vitro mostraram que o P. acnes pode formar um biofilme no
folculo (FIGURA 4), levando a uma diminuio da resposta aos agentes antimicrobianos.
O importante papel do P. acnes na inflamao da acne se d por sua fagocitose por
leuccitos polimorfonucleares no lmen glandular, acarretando liberao de enzimas
hidrolticas intracelulares e mantendo sua integridade. Alm disso, os anticorpos especficos
contra a P. acnes, presentes nos microcomedes, interagem com essas bactrias, liberando as
Figura 4- Imagem de microscopia de biofilme formado pelo microrganismo Propionibacterium acnes.
19
proteases hidrolticas na parede epitelial infundibular fragilizando-a e levando sada de
substncias irritantes para a derme subjacente, desencadeando o processo inflamatrio local
(WEBSTER, 1995).
1.1.3 Terapias no tratamento da acne vulgar
As terapias atuais utilizadas para o tratamento da acne consistem em ativos que
previnem a formao dos comedes e tenham ao anti-inflamatria e antimicrobiana. Na
maioria das vezes esses ativos so retinides de uso tpico (tetinona, adapaleno, entre outros)
e isotretinona por via oral.
1.1.3.1 Retinides
Os retinides possuem ao queratoltica e anti-inflamatria, alm de impedirem a
proliferao e diferenciao celular.
A isotretinona, administrada via oral, induz a glndula sebcea a reduzir seu tamanho
atravs da diminuio da proliferao dos sebcitos, suprimindo assim a produo do sebo.
Recentemente, tm sido relatados casos de depresso em pacientes tratados com isotretinona,
mas at o momento no foi estabelecida claramente a relao entre a terapia e a depresso. A
isotretinona recomendada na maioria das vezes para casos de acne severa, com ndulos e
que no respondem ao tratamento tpico (GOLLNICK; SCHRAMM, 1998).
O adapaleno, retinide administrado via tpica, vantajoso comparado aos demais
retinides, pois altamente lipoflico e causa pouca irritao pele. Apesar destas vantagens,
o adapaleno no possui atividade contra o microrganismo P. acnes (JAPPE, 2003).
Os retinides so contraindicados durante a gravidez e os efeitos adversos incluem
ressecamento da pele, irritao, coceira e formigamento, principalmente nas fases iniciais do
tratamento.
1.1.3.2 Perxido de Benzola (BPO)
O Perxido de Benzola (FIGURA 5) efetivo na reduo de colnias de P. acnes,
inibindo o seu crescimento e sem risco de resistncia relatada at o momento. So
20
recomendadas concentraes de BPO de at 5%, por ser menos irritante pele (EADY et al.,
1996).
Figura 5- Perxido de Benzola.
A atividade do BPO no tratamento da acne e os baixos riscos que ele apresenta para a
pele o tornam um dos ativos principais para pacientes com acne de grau leve a moderado
(WEISS, 1997).
Estudos mostraram que a atividade do BPO pode ser ainda melhor quando combinado a
outras terapias como retinides de uso tpico e antibiticos.
1.1.3.3 Tratamento hormonal
Os tratamentos hormonais consistem na supresso da produo de andrgenos pelo
ovrio, atravs de contraceptivos de uso oral, bloqueadores dos receptores andrognicos.
Este tipo de terapia no sempre a primeira opo, sendo indicado na maioria das vezes
apenas para mulheres com acne leve ou sinais de produo em excesso de hormnios
andrognicos e que pedem por contraceptivo (KATSAMBAS; PAPAKONSTANTINOU,
2004).
1.1.3.4 Antibiticos
Os antibiticos so capazes de reduzir a colonizao bacteriana pela P. acnes no
folculo piloso, porm apenas ativos lipoflicos so eficazes, tais como: clindamicina,
tetraciclina, minociclina, eritromicina e gentamicina. Estes antibiticos em especial tambm
possuem propriedades anti-inflamatrias, principalmente a minociclina (TOYODA;
MOROHASHI, 1998).
21
Os antibiticos de uso tpico atuam diminuindo a quantidade de cidos graxos livres
que contribuem para a inflamao, regulando o metabolismo da P. acnes e a produo
extracelular de lipases. Entretanto, no recomendado o uso desses antibiticos tpicos
devido ao risco do microrganismo desenvolver resistncia (KATSAMBAS;
PAPAKONSTANTINOU, 2004).
Geralmente, os antibiticos so utilizados por via oral e combinados com outras terapias
de uso tpico, como aquelas contendo BPO, que tambm possuem atividade antimicrobiana.
1.1.3.5 Outras estratgias no tratamento da acne
A maioria dos retinides no tem efeito direto contra o P. acnes e, desta forma, no
possuem eficincia no combate a todos os eventos relacionados acne vulgar.
Alternativa bastante utilizada em produtos para a acne o cido saliclico, um
componente esfoliante adicionado a produtos de uso tpico, que auxilia na atividade de outros
ativos que podem ser usados em conjunto.
O desenvolvimento de novos ativos e terapias tm sido bastante abordados, de forma a
superar as dificuldades encontradas para o tratamento da acne, que obteve pouco progresso
nos ltimos 50 anos (ELMAN; LEBZELTER, 2004).
1.2 CIDO LURICO
Os cidos graxos livres (FFAs, do ingls Free Fatty Acids) desempenham diferentes
papis na defesa do organismo, impedindo a entrada de patgenos ou microrganismos
oportunistas. Eles criam um ambiente de pH cido, com condies desfavorveis para o
desenvolvimento de determinadas bactrias e podem impedir seu crescimento ou lev-las
morte. Alm disso, os cidos graxos, saturados ou insaturados, impedem a adeso bacteriana e
subsequente formao de biofilme. A ao dos cidos graxos tipicamente comparvel de
peptdeos antimicrobianos naturais in vitro (NAKATSUJI et al., 2009).
Os cidos graxos so os agentes antimicrobianos mais efetivos presentes na pele humana.
Eles so produzidos por clivagem de lipdios secretados das glndulas sebceas e a sua
presena na pele suficiente para controlar a microbiota bacteriana.
A atividade antibacteriana de cada cido graxo influenciada pelo comprimento da cadeia
alqulica e estrutura. O grupo OH da carboxila parece ser importante para a atividade
22
antibacteriana uma vez que cidos graxos metilados geralmente apresentam pouca ou
nenhuma atividade antibacteriana. Para cidos graxos saturados, os mais ativos possuem entre
10 e 12 carbonos em sua cadeia (FISCHER et al., 2012).
O amplo espectro de atividades e modo de ao no especfico de pelo menos alguns
cidos graxos os tornam atrativos agentes antibacterianos para vrias aplicaes na medicina,
agricultura, preservao de alimentos e formulaes cosmticas, especialmente aquelas em
que a presena de antibiticos indesejvel ou proibida (DESBOIS; SMITH, 2010).
Vrios FFAs possuem atividade contra bactrias Gram-positivas, mas no Gram-
negativas. O cido lurico (LA), presente em pequena quantidade no sebo, o cido graxo
saturado com maior potencial antimicrobiano. Ele comumente encontrado em produtos
naturais como leo de coco e leite. Alm de o LA apresentar boa atividade contra diversas
bactrias Gram-positivas ele possui ao in vivo contra o microrganismo P. acnes, podendo
ser utilizado como agente antibacteriano natural no tratamento da acne (YANG et al., 2009).
Nakatsuji et al. demonstrou que a concentrao inibitria mnima (MIC) do LA, a menor
concentrao para inibir o crescimento bacteriano, at 15 vezes menor do que a do BPO
(FIGURA 6).
Figura 6- Atividade do BPO comparado ao cido lurico (Nakatsuji et al., 2009).
Os resultados de Nakatsuji et al. mostraram que o LA possui atividade superior a do BPO,
um agente antioxidante utilizado frequentemente no tratamento da acne contra as bactrias da
pele P. acnes, S. aureus, e S. epidermidis. Alm disso, os resultados mostraram que o P. acnes
a bactria mais sensvel ao LA entre outros microrganismos testados.
Em uma avaliao da atividade antimicrobiana dos cidos lurico, oleico e palmtico
contra a P. acnes in vitro o cido graxo com maior ao bactericida foi o LA.
23
O mecanismo de ao do cido lurico contra o P. acnes envolve a separao das
monocamadas de sua membrana, matando assim o microrganismo. Os FFAs antimicrobianos
tendem a um menor desenvolvimento de resistncia comparado a outros tratamentos com os
antibiticos frequentemente utilizados (NAKATSUJI et al., 2009).
O grande desafio no uso do LA em uma formulao para o tratamento da acne est
relacionado sua solubilidade. O LA pouco solvel em gua e solventes como dimetil
sufxido (DMSO), que podem ser txicos a pele, so necessrios para solubiliz-lo.
Os lipossomas tm sido amplamente estudados como carreadores de frmacos,
apresentando grande potencial para veiculao de drogas (drug delivery) de aplicao
tpica, levando o princpio ativo ao stio de interesse em maiores concentraes do que as
formulaes convencionais.
Os resultados de Yang et al. mostraram que o uso de lipossomas favoreceu a ao do LA,
que foi eficaz at em baixas concentraes. O LipoLA ( nome dado por Yang para lipossoma
com cido lurico) foi capaz de se fundir com a membrana do P. acnes e liberar o LA na
membrana da bactria (YANG et al., 2009).
1.3 LIPOSSOMAS
Os lipossomas so vesculas formadas por fosfolipdios, constitudas de uma ou mais
bicamadas orientadas em torno de um compartimento interno aquoso (FIGURA 7). Usaremos
aqui as palavras lipossoma e vescula como sendo equivalentes. Os lipossomas, ou vesculas,
podem ser classificados de acordo com o seu tamanho, nmero de lamelas (bicamadas),
constituio lipdica e mtodo de preparo.
Figura 7- Representao de lipossoma e da bicamada lipdica.
24
As vesculas podem ser preparadas por extruso, sonicao, agitao, liofilizao,
congelamento e descongelamento, evaporao em fase reversa, entre outros. O dimetro das
vesculas determinado pelo mtodo de preparao e pode variar de 20 a 5000 nm.
A nomenclatura dos lipossomas baseada em seu nmero de lamelas e tamanho
(FIGURA 8), podendo ser divididas nas seguintes categorias:
a) Vesculas unilamelares pequenas (Small Unilamellar Vesicles SUV): formadas
por uma nica bicamada, so as menores, com dimetro variando de 20 a 80 nm;
b) Vesculas unilamelares grandes (Large Unilamellar Vesicles LUV): formadas
por uma nica bicamada lipdica, com tamanho intermedirio e dimetro entre 80 e
1m;
c) Vesculas multilamelares (Multilamellar Vesicles MLV): formadas por vrias
bicamadas lipdicas, com tamanho mdio e dimetro que varia de 400 nm a alguns
micrometros;
d) Vesculas gigantes (Giants Unillamelars Vesicles GUV): normalmente formadas
por uma nica bicamada lipdica, apresentam dimetro superior a 1 m.
A princpio os lipossomas eram utilizados como modelos biomimticos de membranas
biolgicas. A partir da dcada de 70, outras aplicaes prticas dos lipossomas obtiveram
destaque, como seu uso em drug delivery (LASIC, 1998).
Os lipossomas apresentam diversas propriedades que os tornam atraentes para seu uso e
aplicao, tais como:
Figura 8- Diferentes tipos de estruturao das vesculas.
25
Biocompatibilidade;
So capazes de encapsular ativos em seu interior aquoso, quando hidroflicos, ou
na membrana, caso este ativo seja hidrofbico;
O ativo de interesse se torna protegido das condies externas do organismo,
evitando tambm reaes adversas indesejveis;
O tamanho, a carga e as propriedades dos lipossomas podem ser controlados
facilmente, selecionando-se os lipdios e mtodo de preparo adequado.
Estratgias tm sido traadas para prolongar o tempo de permanncia dos lipossomas
no organismo, garantindo sua estabilidade e eficcia (BLUME; CEVC, 1990).
Entre as vias de administrao de lipossomas, que tem se mostrado cada vez mais
promissora com o passar dos anos, est a sua aplicao tpica (TORCHILIN, 2005). Um dos
maiores desafios no desenvolvimento de sistemas de drug delivery para serem ministrados via
tpica est a baixa permeao de substncias na pele. A maior barreira para a difuso de
ativos o estrato crneo, camada mais superficial da pele, constituda por clulas agrupadas
de forma bastante coesa. O uso de vesculas lipdicas facilita o transporte de ativos sobre a
pele (MEZEI; GULASEKHARAM, 1980).
1.4 LIPOSSOMAS E CIDOS GRAXOS
cidos graxos so molculas anfipticas, capazes de se incorporar nas membranas
lipdicas e alterar suas propriedades fsico-qumicas. Quando em gua, os sais dos cidos
graxos tendem a formar micelas e no bicamadas, dada a sua geometria cnica (FIGURA 9).
A forma protonada do cido graxo pouco solvel e em gua no forma micelas.
Dependendo da composio lipdica e de seu estado fsico (fase lquido-cristalina, fase
gel), a bicamada pode incorporar at 60% (em mol) de cidos graxos. A incorporao de at
Figura 9-Agregados formados por molculas anfipticas de diferentes geometrias.
26
mesmo uma pequena quantidade (1% em mol) nas membranas pode levar a alteraes na
permeabilidade transmembranar (CROWE; MCKERSIE; CROWE, 1989).
Os cidos graxos, devido a sua geometria molecular, induzem um maior grau de
curvatura das membranas, aumentando a sua propenso de formar poros. Eles tambm afetam
a espessura da bicamada, podendo lev-la ao rompimento. Todos esses efeitos tendem a
aumentar a permeabilidade das membranas. Essas alteraes na permeabilidade podem ser
usadas como vantagem no desenvolvimento de sistemas drug delivery, favorecendo a
liberao do ativo. (JESPERSEN et al., 2012)
Os efeitos que os cidos graxos exercem sobre a membrana, apesar de serem
frequentemente descritos na literatura, ainda no so bem compreendidos. Acredita-se que
dependem do tipo de cido graxo, em especial, do seu grau de insaturao e comprimento da
cadeia carbnica. Alm disso, sabe-se que esses efeitos observados dependem se o cido
graxo misturado previamente com os outros componentes que iro formar as bicamadas ou
se so adicionados a elas posteriormente, j prontas. No caso de serem adicionados
previamente o seu efeito menor, pois eles conseguem se arranjar e se adaptar espacialmente
com todos os demais lipdios da membrana durante sua formao. No caso de serem
adicionados posteriormente, os cidos graxos induzem um efeito maior de rompimento das
membranas, dificultando um possvel rearranjo dos demais lipdios da bicamada para
compensar as alteraes na sua curvatura (AROURI; MOURITSEN, 2013).
Os sais dos cidos graxos so capazes de formar agregados micelares em
concentraes acima de sua concentrao micelar crtica (CMC) e so incorporados nas
bicamadas tanto na sua forma protonada quanto na forma dissociada. A incorporao de
cidos graxos pode levar a formao de diferentes estruturas de agregados, com regies
heterogneas na membrana em funo da composio lipdica (DAVIDSEN; MOURITSEN;
JRGENSEN, 2002).
Uma das principais caractersticas das vesculas contendo cidos graxos a sua
dinmica, induzida por mudanas nas condies do meio. O fato de que diferentes agregados
com cidos graxos podem ser formados apenas se alterando seu estado de protonao e
concentrao uma excelente oportunidade para estudar as propriedades fsico-qumicas das
diferentes estruturas (MORIGAKI; WALDE, 2007).
Os benefcios dos lipossomas relacionados sua capacidade de encapsulao/
liberao de ativos, de impedir a desidratao e promover a regenerao de lipdios da
27
pele, os tornam ingredientes inovadores e efetivos na rea de cosmticos. Em geral, os
lipossomas so mais compatveis com a estrutura da pele do que as emulses
convencionais.
O estudo de lipossomas contendo LA, com potencial para aplicao dermatolgica
na preveno e tratamento da acne, pode auxiliar na elucidao do papel do LA na
estrutura dos lipossomas, modulao de suas propriedades de reteno de ativos e
contribuir com uma alternativa ao combate acne.
28
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Desenvolver e caracterizar lipossomas contendo cido lurico, que possuam potencial
para uso na rea de cosmticos.
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Produzir lipossomas de diferentes composies, contendo cido lurico;
Realizar caracterizao fsico-qumica dos lipossomas por mtodos como: medida do
tamanho mdio de partculas/ distribuio de tamanhos, eficincia de encapsulao e
determinao de temperatura de transio de fase (Tm);
Verificar o efeito do pH sobre as caractersticas fsico-qumicas dos lipossomas
contendo cido lurico.
29
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 MATERIAIS
O fosfolipdeo 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (FIGURA 10a) foi
obtido da Avanti Polar Lipids e o cido lurico (LA) (FIGURA 10b) da Sigma Aldrich. As
membranas de policarbonato com dimetro de poro de 100 nm, utilizadas para a extruso,
eram da Whatman (Nucleopore Track-Etch Membrane). O Tris Base (Trizma Hydrochloride),
a 5(6)-Carboxifluorescena (CF), a resina Sephadex G-25 e o cido perclrico 70% eram da
Sigma Aldrich. Os cidos clordrico, ascrbico, actico, brico e frmico e o hidrxido de
sdio eram da Merck. O 4-trimetilamnio-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1oxiliodeto, CAT1, e o
pireno tetrasulfonato de sdio, PTS, eram da Molecular Probes. Os solventes clorofrmio e
metanol eram reagentes de grau analtico da J. T. Baker Chemicals. A CF foi purificada
segundo o mtodo de Weinstein et al., 1977.
Figura 10- Estruturas do (a) DPPC e do (b) cido lurico.
3.2 PREPARO DOS LIPOSSOMAS
Os lipossomas foram preparados pelo mtodo de hidratao do filme lipdico (FIGURA
11). A frao de LA nas amostras variou de 0 a 50% em moles da concentrao total. Desta
forma, obtivemos as seguintes preparaes: DPPC, DPPC:LA 90:10, DPPC:LA 80:20,
DPPC:LA 70:30, DPPC:LA 60:40 e DPPC:LA 50:50.
O DPPC e o LA foram pesados nas quantidades desejadas em um tubo de ensaio de
fundo largo e solubilizados com uma mistura clorofrmio:metanol 3:2. Em seguida, o tubo de
(a) (b)
30
ensaio com os lipdios foi submetido a um fluxo de N2 juntamente com rotao manual,
volatilizando a mistura de solventes orgnicos e formando um filme fino seco, aderido
parede do tudo. Os filmes foram colocados em um dessecador sob vcuo por cerca de 1 hora
para garantir a retirada completa dos solventes.
Para ressuspender o filme e formar os lipossomas, adiciona-se o volume desejado da
soluo tampo com pH de interesse ou soluo contendo CF, PTS ou CAT1 e agita-se a
suspenso em vrtex. Desta forma obtemos as chamadas MLV, que so vesculas
multilamelares, com dimetros variados.
Figura 11- Esquema de preparo de vesculas pelo mtodo de hidratao do filme lipdico.
Para formar vesculas unilamelares grandes, LUV, a suspenso de MLV foi submetida a
um processo chamado de extruso (FIGURA 12). Na extruso, as vesculas so foradas a
passarem por uma membrana, neste caso com tamanho de poro de 100 nm, repetidas vezes
(11 passagens quando utilizadas duas membranas). Este processo foi realizado a 60C,
temperatura acima da temperatura de transio de fase do DPPC.
Figura 12- Extruso de MLV para se obter vesculas unilamelares grandes, LUV.
3.3 ESTABILIDADE DAS VESCULAS COM CIDO LURICO
O dimetro hidrodinmico define o dimetro de uma esfera rgida que difunde com a
mesma velocidade da partcula que est sendo examinada pelo espalhamento de luz dinmico.
Ativo hidrofbico
31
Desta forma, o Dh representa o dimetro mdio de uma partcula dentro da sua dinmica de
difuso, considerando a camada de solvatao (ZAMARION, [s.d.]).
O ndice de polidispersidade (PdI) a razo que correlaciona a varincia amostral com
o quadrado do dimetro hidrodinmico mdio das partculas em uma curva de distribuio
(EQUAO 1).
= (
)
2
onde =varincia d=dimetro hidrodinmico mdio
Partculas suspensas em um meio lquido nunca esto em estado estacionrio,
movimentando-se constantemente. Esse movimento, denominado movimento Browniano,
ocorre devido coliso das molculas do lquido que circundam a partcula. Partculas
maiores se movimentam mais lentamente que as menores em uma mesma temperatura
(ZAMARION, [s.d.]).
A relao entre o tamanho e a velocidade do movimento Browniano da partcula
definida pela Equao de Stokes-Einstein. Essa medida feita com a iluminao das
partculas com um laser e analisa a intensidade de flutuao do espalhamento de luz. O
aparelho possui um correlator que mede o grau de similaridade entre dois sinais em um
perodo de tempo. A funo de correlao varia conforme o tamanho da partcula e assim que
a funo de correlao medida, essa informao utilizada para calcular a distribuio de
tamanhos (JIN et al., 1999).
As partculas, quando iluminadas, possuem a caracterstica de espalharem luz,
caracterizando o movimento Browniano (MANZINI, 2011). Assim, o espectro de luz que
atravessa uma amostra ser composto de reas claras e escuras, onde no h luz detectada. As
reas claras ocorrem onde o espalhamento de luz causado pelas partculas possui a mesma
fase de onda, resultando em uma interferncia construtiva. As reas escuras ocorrem onde as
ondas de luz, causadas pelo espalhamento, so destrutivas e cancelam umas s outras (JIN et
al., 1999). O pontilhado resultante das reas claras e escuras causadas pelo espalhamento de
luz que atravessa uma suspenso se mover devido ao movimento das partculas variando
com certa intensidade e ir caracterizar esse movimento com uma flutuao da intensidade
(MANZINI, 2011).
(Equao1)
32
3.3.1 Medidas do Dimetro Hidrodinmico e do ndice de Polidispersidade
As medidas foram realizadas em um aparelho Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments
Ltd.
Para estes ensaios foram utilizadas amostras de LUV com concentrao total final de
0,5 mM de lipdios em solues de tampo Borato pH 9,0, Tris-HCl pH 7,4, Acetato pH 5,0 e
Formiato pH 3,0, todas na concentrao 10 mM.
O Dh e o PdI dos lipossomas foi verificado por 30 dias, perodo no qual as amostras
ficaram incubadas a 25 C para mimetizar as condies ambientes de um produto em
prateleira.
3.4 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA
Os fosfolipdios constituintes de uma determinada membrana so caracterizados por
uma temperatura de transio da bicamada (Tm), na qual a membrana passa de uma fase gel
(L), para a fase lquido-cristalina (L). Ou seja, as cadeias hidrocarbnicas dos lipdios que
antes estavam ordenadas passam para um estado de movimentos mais livres e os radicais
hidroflicos tornam-se mais hidratados, resultando em um modelo mais fludo (FIGURA
13)(LEWIS et al., 2008).
Figura 13- Membrana na fase gel e depois na fase lquido-cristalina, acima da tem0peratura de transio de fase.
A presena do cido lurico na bicamada dos lipossomas pode causar perturbaes e
alterar a sua fluidez, modificando a temperatura de transio de fase do DPPC. Uma das
tcnicas mais utilizadas para verificar estas propriedades a Calorimetria Diferencial de
Varredura (DSC). Alm da Tm, o DSC tambm permite obter valores de entalpia e da
cooperatividade da transio de fase, que proporcional medida da largura a meia altura
33
() dos picos em curvas DSC. Uma perda na cooperatividade de um sistema, ou seja,
alargamento do pico corresponde a um decrscimo na quantidade mdia de lipdios que
transitam uniformemente de um estado a outro para um dado valor ou intervalo de
temperatura (VAN EKEREN, 2003).
Um equipamento de DSC (FIGURA 14) consiste em dois pequenos compartimentos
(celas) idnticos que so aquecidos eletricamente a uma taxa constante. Uma das celas
preenchida com a soluo que contm a amostra de interesse (protena, lipossoma, etc) e a
outra cela preenchida geralmente com gua ou com o tampo utilizado para preparar a
amostra. As celas so mantidas presso atmosfrica ou, em alguns casos, sob presso de gs
inerte para inibir a formao de bolhas durante o processo de aquecimento. Durante o
experimento, potncia fornecida pelo aquecedor principal para aumentar a temperatura das
celas a uma taxa estacionria, enquanto que diferenas de temperatura entre as celas de
referncia e de amostra (T1), e entre as clulas e a cmara adiabtica (T2) so monitoradas.
Atravs de circuitos de resposta, um aquecedor/resfriador localizado na cmara adiabtica
permite a esta atingir a mesma temperatura das celas e aquecedores de resposta localizados
nas celas compensam qualquer diferena de temperatura entre elas durante a varredura. Um
computador controla a potncia trmica dissipada nas celas e cmara adiabtica e faz a
aquisio dos dados (MELO, 2010).
Ao longo da varredura, em um intervalo que no contm nenhuma transio de fase, as
temperaturas das celas variam linearmente com o tempo na mesma taxa de aquecimento e a
Figura 14- Calormetro Diferencial de Varredura.
34
diferena de temperatura entre as celas zero. Isso se reflete de maneira ideal em uma linha
de base horizontal reta. Se ocorrer alguma mudana no sistema, a temperatura da cela com a
amostra muda significativamente em relao cela de referncia e, para manter a temperatura
de ambas as celas, o excesso de energia em forma de fluxo de calor deve ser compensado
pelos aquecedores (LEWIS et al., 2008).
3.4.1 Determinao da Tm e Cooperatividade por DSC
As determinaes de Tm foram realizadas em um calormetro MicroCal VP-DSC
Microcalorimeter, Malvern Instruments Ltd. As amostras de LUV tinham concentrao total
de 1 mM em solues tampo 10 mM, nos pHs 9,0 (tampo borato), 7,4 (tampo Tris-HCl),
5,0 (tampo acetato) e 3,0 (tampo formiato). As suspenses lipossomais (0,5173 mL) foram
colocadas no calormetro com auxlio de uma seringa e submetidas variao de temperatura
de 15 a 60C, com uma velocidade de varredura de 30 C/hora. Como referncia foi utilizada
gua desmineralizada. Para o tratamento dos dados foi utilizado o programa Origin 8.5.
3.5 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO NGULO (SAXS)
O SAXS consiste num processo de espalhamento elstico que ocorre quando os raios-X
de alta energia (de comprimento de onda de 1,5 ) atingem um material e interagem com os
eltrons do mesmo. Quando existe alta organizao a nvel atmico, com todas as unidades
espalhantes em fase, ocorre um espalhamento cooperativo, que produz um perfil de difrao
onde as chamadas reflexes de Bragg apresentam uma alta definio. Em um material que
apresenta desorganizao a nvel atmico, as unidades espalhantes estaro fora de fase, o que
resulta num espalhamento difuso, ou no-cooperativo, e de baixa intensidade, ocorrendo
numa ampla faixa angular (GERBELLI, 2012).
Supondo os centros espalhantes no vcuo, a amplitude de espalhamento proporcional
ao nmero de moles de eltrons por unidade de volume, ou seja, densidade eletrnica. Com
os centros espalhadores imersos em outro meio, apenas a diferena de densidade eletrnica
entre os meios ser considerada. No caso de anlise de partculas em suspenso ou solvente, o
espalhamento resultante do contraste de densidade eletrnica entre a partcula e o solvente
(GONALVES, 2008).
35
3.5.1 Medidas de SAXS e Ajuste dos Dados Experimentais
Para a tcnica de Espalhamento de Raios X a Baixo ngulo (SAXS) foi utilizada uma
mquina convencional Nanostar Bruker (com tica otimizada pela empresa Xenocs)
(FIGURA 15) instalada no Laboratrio de Cristalografia do Instituto de Fsica, sob orientao
do Prof. Dr. Cristiano Luis Pinto de Oliveira. As medidas foram realizadas pelo aluno Pedro
Oseliero.
Figura 15- Equipamento Nanostar Bruker utilizado nas medidas de SAXS.
Nestes experimentos foram utilizados capilares de vidro de 1,5 mm de dimetro onde
foram colocadas amostras de lipossomas de DPPC:LA na concentrao total de 10 mM,
preparadas nos tampes borato 50 mM pH 9,0, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, acetato 50 mM pH
5,0 e formiato 50 mM pH 3,0.
Na realizao de experimentos de SAXS utilizou-se um porta amostra que acomodava
at 3 capilares de vidro temperatura ambiente, cerca de 25 C. O controle das aquisies foi
realizado pelo programa interno da mquina onde a cada aquisio so geradas imagens
bidimensionais de formato ".gfrm". Para anlise desses arquivos foi utilizado o programa
SUPERSAXS que permite desde a subtrao de fundo at a reduo dessas imagens em
curvas unidimensionais (I(q)) com as respectivas incertezas dos dados experimentais.
3.5.1.1 Ajuste das curvas de espalhamento
A intensidade espalhada para uma fase lamelar pode ser descrita pela Equao 2:
Fonte de raios X
Amostrasem vcuoX Detector
36
() = ()|()2|
2
onde q o mdulo do vetor de espalhamento de raios X, S(q) refere-se funo do fator de
estrutura e P(q) ao fator de forma.
O fator de forma depende apenas do espalhamento produzido por uma nica bicamada,
enquanto o fator de estrutura corresponde ao espalhamento gerado por um conjunto de
bicamadas, espaadas periodicamente com orientao aleatria. Para descrever o fator de
forma foi utilizado o modelo de deconvoluo de gaussianas (4 gaussianas).
3.5.1.2 Fator de Estrutura
Os parmetros que descrevem a estrutura e flexibilidade da bicamada lipdica podem ser
determinados pelos parmetros estabelecidos no ajuste das curvas experimentais, sendo os
principais: periodicidade lamelar (repetio de um padro que formado pela bicamada +
camada aquosa), nmero de camadas correlatas e parmetro de Caill.
3.5.1.3 Fator de Forma
A densidade do contraste eletrnico da bicamada descrita pelo fator de forma. Atravs
do modelo de deconvoluo de gaussianas, pode-se descrever a variao do contraste
eletrnico de maneira mais suave, como observado na Figura 16.
Figura 16- Modelo de deconvoluo de gaussianas.
(Equao2)
37
3.5.1.4 Espessura da Bicamada
Atravs do ajuste dos dados experimentais de espalhamento, obtemos a periodicidade
lamelar e o perfil de densidade eletrnica da bicamada. O pico representa a posio das
cabeas polares e o centro corresponde ao meio da bicamada (FIGURA 17). Uma funo
gaussiana descreve o contraste de densidade eletrnica da regio e, tomando-se a distncia do
centro da bicamada at o ponto que corresponde largura a meia altura da gaussiana, obtm-
se a metade da espessura da bicamada (GERBELLI, 2012).
Figura 17- Perfil de densidade eletrnica da bicamada, indicando em vermelho a espessura da bicamada.
3.6 CRIO-MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO
O microscpio eletrnico de transmisso um microscpio de luz invertido, no qual
um feixe de eltrons incide sobre a amostra. Apenas amostras em sees finas podem ser
estudadas, uma vez que os eltrons no penetram profundamente na matria (BIBI et al.,
2011).
O contraste entre as vesculas e o fundo ocorre por espalhamento de eltrons pela
matria e diretamente proporcional ao nmero atmico. Sendo assim, no existe emprego de
agente contrastante nesta tcnica. A imagem observada a projeo em duas dimenses de
um objeto de trs dimenses (FIGURA 18). A mesma obtida quando um feixe de eltrons
atravessa uma vescula tangencialmente ao seu volume (KUNTSCHE; HORST; BUNJES,
2011).
38
Os eltrons interagem com as molculas que constituem a vescula produzindo um
contraste mais elevado nas suas bordas que, consequentemente, visualizada como um anel
cinza.
3.6.1 Preparo das Amostras para Crio-TEM e Aquisio das Imagens
Os estudos de Crio-Microscopia Eletrnica de Transmisso foram efetuados para a
caracterizao estrutural das vesculas com cido lurico. Para a anlise Crio-TEM foram
utilizadas amostras de vesculas de DPPC, DPPC:LA 70:30 e DPPC:LA 50:50 com
concentrao total de lipdio de 2,5 mM nos tampes acetato 0,01M pH 5,0 e tris-HCl 0,01M
pH 7,4. Foi depositada uma gota de 3 L da amostra em grade Lacey de cobre (300 mesh)
revestida por carbono (TED Pella) previamente submetida a um tratamento de descarga
luminescente utilizando um sistema easiGlow (Pelco) com 15 mA de corrente negativa por 10
s. As amostras foram preparadas em ambiente controlado, com temperatura e umidade
ajustado para 22 C e 100%, respectivamente, num sistema de vitrificao automatizado
(Vitrobot Mark IV, FEI). Os parmetros do Vitrobot seguiram um tempo de blot de 3s, fora
de blot de 0 e 20 segundos de tempo de espera antes do incio do blot. As amostras foram
analisadas em condio de baixa dosagem, com uma gama de desfocagem de -2 a -4 m,
utilizando um equipamento Jeol JEM-2100 operando a 200 kV. As imagens foram adquiridas
usando uma cmera F-416 CMOS (TVIPS, Alemanha). A preparao das amostras e
aquisio de dados foram realizados no Laboratrio de Microscopia Eletrnica
Figura 18- Exemplo de imagem 2-D para uma amostra vitrificada.
39
(LME)/Laboratrio Nacional de Nanotecnologia (LNNano) pelo Dr. Alexandre Cassago
(FIGURA 19).
Figura 19- Preparo das amostras para Crio-TEM pelo Dr. Alexandre Cassago no LNNano- Campinas.
3.7 ENCAPSULAMENTO DE SONDAS NO COMPARTIMENTO AQUOSO INTERNO
DAS LUV
3.7.1 Encapsulamento de Sondas Fluorescentes
A luminescncia caracterizada pela emisso de ftons com energia na regio do UV,
visvel ou infravermelho de uma espcie eletronicamente excitada. Como casos particulares
da luminescncia, temos a fluorescncia e a fosforescncia. Para estes casos, a absoro de
um fton o modo de excitao que leva a espcie que absorveu para um estado eletrnico
excitado.
Na fluorescncia o estado excitado singlete, assim, o eltron no orbital excitado est
pareado com o eltron que se encontra no orbital do estado fundamental. O retorno para o
estado fundamental uma transio permitida e a emisso ocorre com velocidade na ordem
de 108 s-1 (MANZINI, 2011).
40
Os espectros de fluorescncia so apresentados como espectro de emisso, que uma
curva de intensidade de fluorescncia versus comprimento de onda (). O espectro de emisso
sensvel estrutura qumica do fluorforo e polaridade do solvente no qual ele est
dissolvido (PUC-RIO, 2006).
A CF (5(6)- carboxifluorescena) (FIGURA 20) sofre um processo de auto-supresso da
fluorescncia em altas concentraes e muito utilizada em estudos de atividade de molculas
sobre os lipossomas. Em concentraes baixas, utilizando-se um mximo de excitao em 490
nm, a CF tem um mximo de emisso em 520 nm. Utilizamos a CF tambm em experimentos
nos quais pretendemos verificar a porcentagem de incorporao da sonda no compartimento
aquoso interno dos lipossomas. A vantagem de se utilizar a CF que esta sonda carregada
negativamente, dependendo do pH (pka1= 4,20,2; pka2= 4,90,1 e pka3= 6,70,1). Isto
permite a incorporao em lipossomas sem que haja vazamento da sonda fluorescente
encapsulada no espao aquoso interno para o compartimento aquoso externo (ASCHI et al.,
2008).
Figura 20- Estrutura da molcula de 5(6)-carboxifluorescena.
Com a CF, para que ocorra a auto-supresso, h transferncia de energia entre os
monmeros de CF no estado excitado atravs de colises com outros monmeros ou dmeros
no estado fundamental. A concentrao de CF utilizada neste trabalho foi de 2 mM para a
qual no h auto-supresso e a CF j est bastante diluda.
O PTS (Figura 21) uma sonda fluorescente contendo quatro grupos carregados
negativamente e que pode ser utilizada em vrios pHs porque o pKa dos grupos sulfonatos
so muito baixos (pka 1) e o PTS mantm 4 cargas negativas numa faixa de pH bastante
ampla (SANTOS et al., 2007).
41
Figura 21- Estrutura da molcula do Pireno Tetrasulfonato de Sdio.
3.7.1.1 Vesculas com CF/PTS e Medidas de Fluorescncia
Para estes experimentos foi preparada uma soluo 2 mM de CF em tampo Tris-HCl
50 mM pH 7,4 ou 1 mM de PTS em tampo acetato 50 mM pH 5,0, dependendo do pH que se
pretendia estudar. Filmes lipdicos DPPC:LA 10 mM foram ressuspendidos em 500 L destas
solues contendo CF ou PTS e as vesculas multilamelares formadas foram extrusadas. Com
isso, foram obtidas LUV contendo fluorforo em seu interior e exterior. Uma coluna de
Sephadex G25 mdio, com volume de aproximadamente 79,5 cm3 (dimetro: 1,5 cm, altura:
45 cm), foi utilizada para separar os lipossomas contendo CF ou PTS do fluorforo livre, no
encapsulado. O volume de amostra colocada na coluna foi de 300 L. Nesta cromatografia de
excluso as LUV, por serem maiores que a CF ou PTS livre, so eludas primeiro, no volume
morto da coluna (V0). O fluorforo livre por sua vez, por ser pequeno, percorre um caminho
maior, pois permeia os poros do Sephadex (FIGURA 22) sendo eludo no volume interno da
coluna (Vi).
Figura 22- Cromatografia de permeao em gel por excluso de tamanho.
42
Foram coletadas todas as fraes eludas da coluna, de 1 em 1 mL, e a fluorescncia de
cada frao foi detectada em um Fluormetro Shimadzu RF-5301PC, com exc: 490 nm
e em: 520 nm para a CF e exc: 355 nm e em: 405 nm para o PTS. Para as fraes
coletadas contendo LUV as medidas de fluorescncia foram feitas aps a adio de 25
L de uma soluo 10% de Polidocanol amostra para evitar disperso da luz.
Foram feitos grficos de Fluorescncia vs. Volume (mL) eludo para identificar os
tubos contendo vesculas (eludas no Vo) e aqueles com CF ou PTS livre e determinar a
porcentagem de encapsulamento nos lipossomas com relao ao total de CF ou PTS
(FIGURA 23).
Figura 23- Cromatograma obtido para o encapsulamento de sonda fluorescente. O primeiro e menor pico
corresponde s vesculas contendo fluorforo em seu interior e o pico maior, ao fluorforo no encapsulado. No
inserto mostrada a fluorescencia das amostras contendo as LUV com CF.
No cromatograma acima so observados dois picos, o primeiro contendo LUV com
CF ou PTS (as amostras so turvas) e um segundo pico contendo apenas o fluorforo livre.
Calculamos o nmero de mols de CF ou PTS em todos os tubos. A porcentagem de
encapsulamento (%) a razo entre o nmero de mols do primeiro pico (Vo) dividido pelo
nmero total de mols de CF ou PTS (moles no Vo + moles Vi) multiplicado por 100 (Equao
3).
% = 0
0+ 100
(Equao3)
43
Para cada uma das formulaes foi determinada a % CF (pH 7,4) ou % PTS (pH 5,0) no
interior aquoso das vesculas.
3.7.2 Encapsulamento de Marcador de Spin
A tcnica de EPR muito especfica em suas aplicaes, pois depende da presena de
centros paramagnticos (eltron desemparelhados) nos sistemas estudados. Somente
molculas que possuem ao menos um eltron desemparelhado podem ser detectadas por EPR.
A tcnica se baseia na aplicao de um campo magntico (H), sob a ao do qual os nveis de
energia do momento magntico de spin do eltron (mS= ) se tornam divergentes.
Aplicando na amostra contendo uma sonda com eltron desemparelhado, e sob a ao de um
campo magntico, uma energia adequada na forma de radiao eletromagntica (h),
possvel induzir a transio entre os nveis de energia do momento magntico de spin, que
nessa condio no so degenerados (mS= + e mS= -) (FIGURA 24) (SCHREIER, 1979).
A quantidade de absoro da microonda proporcional concentrao do marcador na
amostra.
Figura 24- Esquema mostrando o prncipio da tcnica de EPR com a transio entre os nveis de energia do
momento magntico de spin.
44
Os radicais livres mais utilizados como marcadores de spin so os radicais nitrxido. O
uso dessas espcies deve-se ao fato de serem estveis em solventes com diferentes
propriedades fsico-qumicas, em uma ampla faixa de pH e de temperatura. A estabilizao
desses radicais deve-se presena de grupos metila, ligados aos tomos de carbonos vizinhos
ao tomo de nitrognio que estabilizam o radical (SCHREIER, 1979).
Quando um marcador de spin com grupamento N-O est em meio aquoso juntamente
com ascorbato (FIGURA 25), ocorre uma rpida reduo da espcie paramagntica (FIGURA
26) e o sinal da sonda desaparece.
Figura 25- Reduo da molcula de ascorbato.
Figura 26- Reao entre o marcador de spin CAT1 e o ascorbato.
3.7.2.1 Vesculas com CAT1 e Medidas de EPR
Para confirmar os resultados obtidos por fluorescncia, os experimentos de % de
encapsulamento foram repetidos, por EPR, sob orientao da Profa Dra Shirley Schreier e
auxlio do aluno de doutorado Gustavo Battesini, usando como sonda o CAT1 (FIGURA 27)
nos pHs 7,4 e 5,0.
45
Figura 27- Estrutura molecular do CAT1.
Foram preparadas solues de CAT1 3,75 mM nos tampes Tris-HCl 50 mM pH 7,4 e
Acetato 50 mM pH 5,0. As concentraes de CAT1 em soluo foram determinadas usando
Tempol como padro. Tambm foram preparadas solues de cido ascrbico 0,04 M, nestes
mesmos tampes, para suprimir o sinal do CAT1 atravs de uma reao de xido-reduo
(Figura 25). Filmes lipdicos de DPPC:LA 10 mM foram preparados, ressuspendidos nas
solues de CAT1, vortexados e extrusados.
Os espectros de EPR foram adquiridos a temperatura ambiente em um espectrmetro
Bruker EMX-200 com potncia de 5 mW, amplitude de modulao de 1 G, varrendo o campo
de 16 G centrado em 3455 G. O ganho foi ajustado de acordo com a concentrao do
marcador na amostra. Para as amostras sem adio de ascorbato, o ganho foi de 2,83x102 e
aps adio de ascorbato, 2,83x103.
As amostras de lipossomas contendo CAT1 (170 L) foram colocadas em celas de
quartzo planos (Wilmad, EUA) e os espectros de EPR foram registrados; em seguida,
adicionou-se 10 L do cido ascrbico, para reagir com o CAT1 no encapsulado, como
mostrado na Figura 26. O ascorbato no deve atravessar a bicamada dos lipossomas por ser
muito hidroflico.
Os espectros foram posteriormente analisados com o software WINEPR (Bruker). A
linha obtida foi integrada duas vezes para obteno do valor de absoro da microonda,
proporcional concentrao de CAT1 na amostra, e os valores obtidos normalizados pelo
ganho. O volume interno foi calculado pela Equao 4, onde, o sinal total refere-se ao valor
normalizado obtido sem a adio do ascorbato, e o sinal final aps a adio de ascorbato, com
seu valor corrigido de acordo com a diluio.
() = 170
Conhecendo-se o volume de CAT1 encapsulado foi calculada a porcentagem de
encapsulamento (Equao 5):
(Equao4)
(5)
46
% = 100 ()
170
Os experimentos a seguir, descritos nos itens 3.8 e 3.9 foram realizados durante um
estgio realizado na Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto em Portugal,
juntamente ao grupo de Biotecnologia e Biofsica Molecular, sob a superviso da Profa.
Dra. Salette Reis e da Dra. Cludia Nunes.
3.8 LIBERAO DO CIDO LURICO MEDIDA POR DILISE
Para verificar a cintica de liberao do LA incorporado nas vesculas de DPPC (T
25C, condies de prateleira) foram feitos experimentos de dilise. Neste experimento
esperado que apenas o cido lurico passe pela membrana de dilise e os lipossomas, que so
maiores (100 nm) fiquem em seu interior (FIGURA 28).
Figura 28- Esquema do experimento de liberao do LA.
Foram preparadas LUV DPPC:LA 0,5 mM nos tampes Tris-HCl 10 mM pH 7,4 e
Acetato 10 mM pH 5,0. Foi colocado 1 mL de amostra no interior de dispositivos de dilise
(Spectra/Por Float-A Lyzer G2 (Spectrum)) (FIGURA 29) com tamanho de poro 3,5 kD e, na
parte externa do dispositivo, 6 mL da mesma soluo tampo em que foi preparada a amostra,
sob agitao. Para calcular o volume de soluo tampo que se deve adicionar na parte
externa do dispositivo, foi considerada a solubilidade do LA em gua (0,0183 mg/L), uma vez
que deve-se garantir que a concentrao de LA no sistema seja pelo menos 3 vezes menor ou
Membrana de Dilise
Soluo Tampo
25 C
47
igual (0,0183 mg/mL) ao seu mximo de solubilidade em gua para evitar sua precipitao na
fase aquosa.
Figura 29- Dispositivo de dilise.
A cada 1 hora, 1 mL da frao externa foi coletada e colocada em um eppendorf. Para
manter as condies de sink, o mesmo volume retirado foi reposto com soluo tampo. A
coleta foi feita por um perodo de 3 dias e a quantificao do LA liberado foi feita por
espectrometria de massas.
3.9 DIFUSO DO CIDO LURICO POR CLULA DE FRANZ
A clula de difuso de Franz (FIGURA 30) uma clula de difuso esttica, de dose
finita, onde a pele montada e a derme fica em contato com uma soluo doadora,
mimetizando as condies in vivo. A temperatura do sistema deve ser controlada e mantida
por um banho termostatizado que envolve a cmara receptora; a distribuio homognea da
temperatura na soluo alcanada pelo emprego de barras magnticas controladas por
agitadores magnticos externos.
Como membrana para difuso das LUV com LA foi utilizada a pele de orelha de porco,
que foi limpa e armazenada em freezer at seu uso.
Antes de realizar os experimentos com as LUV, foi realizado um ensaio piloto, apenas
com soluo tampo, para verificar a quantidade de LA presente na pele de orelha de porco.
48
Os experimentos foram realizados nos pHs 7,4 e 5,0, usando os tampes Tris-HCl e Acetato,
respectivamente, ambos na concentrao de 10 mM.
Foram colocados 5 mL da soluo tampo na cmara receptora e 500 L de amostra ou
soluo tampo na cmara doadora. A clula de Franz foi colocada dentro de um bquer com
gua a 37 C. A temperatura se estabilizou em 15 minutos e o tempo de incubao foi de 8
horas, que considerado o tempo mximo de permanncia de um produto na pele. A cada 1
hora foi retirada uma alquota de 500 L de soluo da cmara receptora para quantificar o
LA e verificar sua permeao sobre a pele. Para manter as condies de sink, estes mesmos
500 L foram repostos, utilizando as solues tampo.
Figura 30- Sistema de difuso de Franz
3.10 QUANTIFICAO DOS FOSFOLIPDIOS
Alquotas das amostras de LUV de DPPC:LA foram adicionadas a tubos de ensaio
previamente tratados com HCl concentrado e foram secas em estufa a 120C. Aps secagem
adicionou-se 0,4 mL de cido perclrico 70 % a cada alquota. Os tubos foram mantidos por 1
hora em um digestor a 180 C, tempo necessrio para mineralizar os lipdios. Aps
resfriamento temperatura ambiente, adicionou-se 1 mL de gua e 0,4 mL de molibdato de
amnio 1,25 % (p/v) s amostras. Os tubos foram agitados num vrtex imediatamente aps
cada adio. Em seguida, adicionou-se s amostras 0,4 mL de uma soluo de cido ascrbico
3 % (p/v), agitaram-se os tubos em um vrtex novamente e as amostras foram mantidas em
banho fervente por cerca de 10 minutos. Aps esse perodo os tubos foram resfriados em gua
49
corrente e a absorbncia foi lida em 797 nm. A curva padro foi feita utilizando como padro
uma soluo de KH2PO4 0,001 M.
3.11 QUANTIFICAO DO CIDO LURICO
Para a quantificao do LA referente aos experimentos de liberao de LA e difuso por
clula de Franz foi utilizada a tcnica de cromatografia lquida acoplada ao espectrmetro de
massas (LC-MS). A anlise foi realizada em um sistema Nexera X2 UPLC, consistindo de
duas bombas LC-30AD, um degassificador DGU-20A5R, coletor de amostras SIL-30AC e
forno CTO-20AC (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japo). O sistema de MS era um LCMS-
8040 triplo quadripolo equipado com fonte de ionizao eletrospray (ESI) (Shimadzu
Corporation, Kyoto, Japo).
Antes da quantificao, foi necessria extrao do LA das amostras de lipossomas. As
amostras estavam armazenadas em eppendorfs de 1,5 mL, nos quais foram colocados 200 L
de clorofrmio com uma seringa de vidro. Agitaram-se os eppendorfs e a fase orgnica foi
retirada e transferida para tubos limpos. A extrao foi feita 3 vezes para cada uma das
amostras. Em seguida os tubos foram levados a um banho seco a 45 C com nitrognio para
que o clorofrmio fosse evaporado e restasse apenas a fase orgnica seca para ser
ressuspendida em 500 L de uma mistura acetonitrila:gua 80:20 (v/v).
A separao por cromatografia foi realizada utilizando uma coluna C8 de fase reversa
Kinetex core-shell (150 x 2.1 mm; 2.6 m particle size; 100 ) (Phenomenex, Torrance, CA,
USA). A temperatura da coluna foi mantida a 30C. A eluio foi realizada no modo
isocrtico, usando-se acetonitrila:gua 80:20 (v/v) em um fluxo de 0.2 mL min-1. O volume de
injeo foi de 2 L e o tempo total da anlise foi de 12 minutos. Como padro interno, foi
utilizado o cido mirstico, um C14.
O espectrmetro de massas foi operado no modo de ionizao negativa (ESI-) e o