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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

LUARA ALINE PIRES

Resposta in vitro de células pré-osteoblásticas em cerâmica de

Hidroxiapatita

BAURU 2015

LUARA ALINE PIRES

Resposta in vitro de células pré-osteoblásticas em cerâmica de

Hidroxiapatita

Dissertação apresentada a Faculdade de

Odontologia de Bauru, da Universidade de São

Paulo, para obtenção do título de Mestre em

Ciências Odontológicas Aplicadas, na área de

concentração Dentística.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Flávia Sanches Borges

Versão corrigida

BAURU

2015

Pires, Luara Aline

Resposta in vitro de células pré-osteoblásticas em

cerâmica de Hidroxiapatita / Luara Aline Pires – Bauru,

2015.

103 p. : il. ; 31cm.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo

Orientadora: Profa. Dra. Ana Flávia Sanches Borges

P665r

Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total

ou parcial desta dissertação/tese, por processos fotocopiadores e outros meios

eletrônicos.

Assinatura do autor:

Data:

Nota: A versão original desta dissertação/tese encontra-se disponível no Serviço de

Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Bauru - FOB/USP.

DEDICATÓRIA

À minha família, que sempre me apoiou em minhas escolhas e me proporciona amor

incondicional.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À minha orientadora Professora Dra. Ana Flávia Sanches Borges

Por todo incentivo, amizade, força e paciência que teve ao longo desse tempo. Pelo

suporte, ideias e ajuda na realização deste trabalho. Obrigada principalmente por

confiar na minha capacidade e por ser inspiração sempre com bons exemplos de

alegria e de leveza em ver a vida. Tenho imensa admiração e respeito pela pessoa

que é. Que nossos vínculos de afeto, que vão além da relação aluna-orientadora,

permaneçam. Muito Obrigada!

AGRADECIMENTOS

À Deus pela vida concedida e por me dar força diariamente para jamais desistir dos

meus propósitos.

Aos meus pais José e Maria Sueli, por tudo que fizeram e continuam fazendo por

mim. Por acreditarem nos meus sonhos e ajudarem a torna-los realidade. Pelos

conselhos e palavras de conforto em todos os momentos que precisei. Sem vocês

esse momento não teria sido possível. Muito obrigada! Amo vocês!

À minha irmã Luana. É incontável o tanto de coisas que tenho a agradecer. Por toda

amizade e cumplicidade que temos. Pelas inúmeras vezes que me ajudou. Muito

obrigada! Amo-te!

Ao meu cunhado Mário por todo apoio e conselhos.

Aos meus queridos avós, tios e primos que estão sempre me incentivando e

torcendo para que meus objetivos sejam alcançados.

Ao professor Dr. Rodrigo Cardoso de Oliveira, do Departamento de Bioquímica da

FOB pela parceria, confiança na realização do trabalho e pelos auxílios todas as

vezes que precisamos. Obrigada por ter sido sempre acessível e disposto a ajudar.

Por isso minha admiração e eterna gratidão. Muito obrigada!

Às alunas Flávia, Cíntia e Márcia do Departamento de Bioquímica da FOB por toda

atenção, ajuda e participação na realização dos testes. Vocês foram fundamentais!

Obrigada!

Ao professor Carlos Alberto Fortulan da Faculdade de Engenharia de São Carlos

pela parceria no fornecimento das amostras e confiança depositada. Pela

acessibilidade, apoio e simpatia. Foi um prazer trabalharmos juntos! Muito obrigada!

À aluna Camila Roberta de Meira da Faculdade de Engenharia de São Carlos por

toda ajuda e por juntamente ao professor Carlos Alberto Fortulan tornar possível e

agradável nossa parceria na realização do trabalho. Obrigada!

Aos professores do Departamento de Dentística da FOB Rafael Mondelli, Sérgio

Ishikiriama, Linda Wang, Maria Teresa Atta, Juliana Bombonatti, Adilson

Furuse, José Mondelli e Maria Fidela Navarro, e aos professores do

Departamento de Materiais Odontológicos Paulo Francisconi e César Antunes de

Freitas meus sinceros agradecimentos por todos os ensinamentos passados, pelos

bons exemplos e por toda dedicação.

Ao professor Marco Antônio Hungaro Duarte do Departamento de Endodontia da

FOB por permitir o uso do Microscópio Eletrônico.

Aos professores Paulo Noronha e Luis Rocha da UNESP de Bauru por toda ajuda

e disponibilização de equipamentos quando necessário. Muito obrigada!

À amiga e dupla querida Melody, por toda colaboração, companheirismo, ajuda e

amizade que mantivemos nesses anos. Que tenha muito sucesso nessa nova etapa!

Muito obrigada por tudo!

Às amigas que fiz ao longo desses anos em Bauru Thais, Estefania e Angie. Vocês

tornaram meus dias muito melhores e mais divertidos. Obrigada pelos bons

momentos, pela amizade e pelo apoio meninas!

Às amigas Letícia e Thaise, que mesmo longe sempre estiveram presentes em

cada momento da minha vida desde a época da faculdade. Muito obrigada pelas

conversas, risadas, apoio e tantos conselhos. Amo vocês!

Aos amigos distantes que estarão sempre presentes no meu coração. Obrigada!

Aos amigos da turma de mestrado Ligia, Marlyni, Maria Angélica, Tamires,

Leticia, Marina, Adriana, Elaine, Martha, Fábio e Mayara. Foi um grande

aprendizado a convivência e cada momento em que estivemos juntos. De coração

desejo a todos muito sucesso. Obrigada a todos!

As doutorandas Carla Müller e Raphaela Rodrigues, por sempre me tratarem muito

bem, por tantas conversas, ajudas, conselhos e risadas no departamento de

Materiais Odontológicos. Vocês são excelentes no que fazem e muito queridas.

Obrigada!

Aos demais alunos de graduação, mestrado e doutorado da FOB que tive o prazer

de conhecer. Muito obrigada!

Aos funcionários do Departamento de Materiais Odontológicos, Alcides e Sandra,

meu agradecimento por toda simpatia, auxílio e colaboração em diversos momentos.

Aos Funcionários do Departamento de Dentística, Audria, Charlene, Rita, Elízio,

Natália, Nelson e Zuleica por toda dedicação e apoio aos alunos.

Ao funcionário do Departamento de Endodontia, Edimauro, pela ajuda com os

equipamentos de microscopia eletrônica de varredura.

Às funcionárias da clínica de pós, Hebe e Cleusa, pessoas queridas e receptivas,

sempre dispostas a nos ajudar.

Aos funcionários do Centro Integrado de Pesquisas, CIP, Marcelo Melanda Ribeiro

Lopes e Renato Pereira Murback, pela ajuda e suporte na realização do trabalho.

À querida Denise (alegria) por todo seu carisma, carinho e dedicação ao que faz.

Ao grupo University Chapter Biomaterials pela oportunidade de participação,

conhecimento, aprendizado e experiências compartilhadas.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq pela

bolsa concedida.

Aos queridos pacientes que contribuíram para o aumento de nossos conhecimentos

durante essa etapa. Obrigada!

À Universidade Estadual do Oeste do Paraná, local onde me formei como cirurgiã

dentista e onde surgiu meu grande interesse em me tornar docente. Muito obrigada!

À professora Silvia Sbeghen e amigos da Associação Maringaense de

Odontologia pelo convívio, bons momentos durante a especialização. Tenho por

vocês meu sincero carinho e agradecimento.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para execução deste trabalho,

muito obrigada!

“Que os vossos esforços desafiem as

impossibilidades. Lembrai-vos de que as grandes

coisas do homem foram conquistadas do que

parecia impossível”.

Charles Chaplin

RESUMO

Com a evolução do Biomateriais houve melhorias nas opções de tratamentos e

atualmente são utilizados em substituição de partes do corpo que foram perdidas e

promovem a recuperação de funções biológicas. Dentre eles existem as chamadas

Biocerâmicas, que incluem alumina, zircônia e derivadas de fosfato de cálcio. A

hidroxiapatita possui composição e estrutura minerais semelhantes à fase mineral

óssea e apresenta como propriedades a biocompatibilidade, osteocondutividade e

bioatividade. O trabalho avaliou a viabilidade celular em cerâmica de hidroxiapatita

experimental de origem bovina em comparação com dois tipos de zircônia

comerciais e liga de titânio comercialmente puro, para que futuramente possa ser

utilizada como material base para implantes dentários. A avaliação in vitro foi

realizada por meio de testes nos quais células pré-osteoblásticas cultivadas de

linhagem murina MC3T3-E1 foram colocadas em contato indireto e direto com estes

materiais. Para viabilidade celular (n=8) foram feitos testes de ensaio MTT e Cristal

Violeta em duplicata e após 24, 48 e 72 horas os níveis de absorbâncias foram

analisados por meio de espectrofotometria no leitor de Elisa. Para as analises por

microscopia eletrônica de varredura (n=6) as células foram plaqueadas diretamente

sobre as superfícies dos discos, fixadas em vapor de tetróxido de ósmio 2% após 24

e 48 horas, seguido da metalização após 48 horas da fixação das células para

análise em Microscópio Eletrônico de Varredura. Os resultados para viabilidade

indireta foram submetidos ao teste paramétrico ANOVA, seguido de teste de Tukey

(p<0,05). Tanto no teste de MTT quanto no Cristal Violeta, de acordo com o grupo

controle positivo, todos os grupos apresentaram resultados satisfatórios. A cerâmica

de hidroxiapatita não apresentou diferença estatística significante, demonstrando

não ser um material citotóxico. Pelas imagens geradas no MEV do teste de

viabilidade direta, verificou-se que houve adesão e proliferação das células nos dois

períodos sobre as superfícies dos materiais. Portanto, pode-se afirmar que a

cerâmica de hidroxiapatita apresentou-se como um material biocompatível.

Palavras-chave: Durapatita, sobrevivência celular, materiais biocompatíveis.

ABSTRACT

With the evolution biomaterials there were improvements in treatment options, and

are currently used in replacement body parts that were lost and promote the recovery

of biological functions. Among them are the bioceramic which include alumina,

zirconia and calcium phosphate derivative. Hydroxyapatite has mineral composition

and structure similar to bone mineral phase and can be used as a biomaterial having

biocompatibility, osteoconductivity and bioactivity. The study evaluated the cell

viability in experimental hydroxyapatite ceramic bovine compared the two types of

commercial zirconia and titanium alloy commercially pure, so that in future it can be

used as base material for dental implants. In vitro evaluation was carried by means of

tests in which the pre-osteoblastic cells MC3T3-E1 murine lineage cultured were

placed in indirect and direct contact with these materials. For cell viability (n=8) were

carried MTT assay and Crystal Violet tests in duplicate and after 24, 48 and 72 hours

the absorbance levels were analyzed by spectrophotometry Elisa reader. For

analysis by Scanning Electron Microscope variable pressure (n = 6) cells were plated

directly on the discs surfaces, fixed in osmium tetroxide steam 2% after 24 and 48

hours, followed by metallization after 48 of cells fixation. The results for the cell

viability were submitted to parametric test ANOVA, followed by Tukey test (p<0.05).

Both in the MTT assay as Crystal Violet all groups exhibited satisfactory results

absent cytotoxicity. By means of the SEM images produced, it was found that there

was adhesion and proliferation of cells on the materials surfaces in the two periods.

Therefore, it can be stated that the hydroxyapatite ceramic was presented as a

biocompatible material.

Keywords: Durapatite, cell survival, biocompatible materials.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURAS

Figura 1 - Desenho representativo do osso compacto e osso

esponjoso. Fonte: CASTRO M. Disponível em:

http://faarmacia.blogspot.com.br. ........................................................... 28

Figura 2 - Osso trabecular e suas estruturas. Fonte: U.S. National

Cancer Institute's Surveillance, Epidemiology and End

Results (SEER). ..................................................................................... 29

Figura 3 - Células ósseas: Célula osteogênica, que se desenvolve

em osteoblasto, formador da matriz óssea, que

posteriormente se diferencia em osteócito, mantenedor

do tecido ósseo e osteoclasto, responsável pela

reabsorção óssea. Fonte: Adaptado de "Bone Structure"

Disponível em: https://www.boundless.com .......................................... 30

Figura 4 - Esquema de evolução das cerâmicas. Adaptado de

WANG et al., 2012 ................................................................................. 38

Figura 5 - Estrutura da hidroxiapatita ao longo do eixo c (ELLIOT,

1994). ..................................................................................................... 39

Figura 6 - Aplicações da hidroxiapatita. Adaptado de Hench e

Wilson, 1993 e Human Body, 2007 (VAZ, 2007) .................................... 41

Figura 7 - Comparação entre dente natural e implante dental ................................ 44

Figura 8 - Disco de cerâmica de Hidroxiapatita ...................................................... 56

Figura 9 - Disco de titânio ....................................................................................... 56


Figura 10 - A) Bloco de zircônia IPS e.max ZirCAD para CAD/CAM;

B) Blocos torneados em formato cilíndrico; C) Corte dos

cilindros na máquina de corte; D) Disco pré-sinterizado

obtido da zircônia ZirCAD; E) Disco pré-sinterizado da

zircônia Zirklein ...................................................................................... 57

Figura 11 - A) Máquina automática Exakt para acabamento e

polimento com lixas; B) Discos pré-sinterizados de

zircônia fixados com godiva em lâmina de vidro, que foi

inserida e fixada à vácuo na Exakt; C) Discos de titânio

fixados com godiva em lâmina de vidro.................................................. 57

Figura 12 - Lavadora ultrassônica computadorizada USC 700

(Unique) e Becker contendo amostras para lavagem ............................ 58

Figura 13 - Desenho esquemático do plaqueamento indireto nas

microplacas. Extratos dos materiais (ZirKlein, Cerâmica

de hidroxiapatita, ZirCAD e Titânio, respectivamente) a

100 % e diluídos a 50 %; controles positivo e negativo e

Blank. ..................................................................................................... 60

Figura 14 - A) Adição do MTT nos micropoços; B) Armazenagem

das microplacas em estufa a 37 °C por 4 horas envoltas

no papel alumínio; C) Placas com adição de DMSO nos

micropoços para leitura das absorbâncias ............................................. 61

Figura 15 - A) Aparelho de espectrofotometria FLUOstar OPTIMA

(BMG LABTECH, Offenburg, Alemanha), no qual foi

realizada a leitura de absorbância nos micropoços; B)

Compartimento de inserção das microplacas ......................................... 61


Figura 16 - Esquema simplificado da absorbância por meio do

espectrofotômetro. Um feixe de luz (comprimento de

onda 570 nm) é disparado e atravessa o micropoço.

Parte da luz é absorvida e outra parte é transmitida ao

receptor, e então, calculado o valor da concentração dos

corantes.................................................................................................. 62

Figura 17 - A) Materiais utilizados no teste colorimétrico com cristal

violeta; B) Adição do metanol 100 % com auxílio de

micropipetas; C) Inserção do cristal violeta 0,2 % diluído

em etanol 2 %; D) Lavagem do corante com PBS para

remoção de excessos; E) Adição de citrato de sódio 0,05

mol/L diluído em etanol 50 %; F) Após 10 minutos,

microplacas prontas para leitura no leitor de ELISA ............................... 63

Figura 18- A) Análise da confluência celular; B) Contagem celular

na Câmara de Neubauer por meio de microscopia óptica...................... 64

Figura 19 - – A) Placas de 24 poços contendo 3 discos de cada

grupo para os período de 24 e 48 horas; B) Células em

meio MEM inseridas diretamente sobre os discos; C)

Poços preenchidos com meio MEM, submergindo os

discos ..................................................................................................... 64

Figura 20 - A) Manipulação e inserção do tetróxido de ósmio 2% na

placa de Petri contendo as amostras; B) Discos de

Titânio e Cerâmica de hidroxiapatita na placa de Petri

devidamente vedada para contato com o vapor do

tetróxido de ósmio; C) Discos das zircônias Z-CAD e Z-

klein ........................................................................................................ 65


Figura 21 - A) Dessecadora contendo as placas de Petri abertas,

onde permaneceram por 3 horas; B) Metalizadora

(DENTON VACUUM Desk IV, CTC); C) Discos fixados

em stubs no momento da metalização por deposição de

ouro; D) Discos metalizados ................................................................... 65

Figura 22 - Microscópio Eletrônico de Varredura por pressão

variável: A) e B) Discos metalizados sobre os stubs

inseridos no MEV para leitura das imagens. C) Luz

laranja indicando que a pressão ideal não foi atingida; D)

Pressão ideal sinalizada por luz verde ................................................... 66

Figura 23 - Imagem de microscopia eletrônica de varredura por

pressão variável. A) e B) Células pré-osteoblásticas na

superfície da cerâmica de Hidroxiapatita após 24 horas

do plaqueamento em regiões distintas sobre a superfície

da amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos

de 500x. Nota-se a grande quantidade de células

aderidas.................................................................................................. 74



superfície do Titânio após 24 horas do plaqueamento em

regiões distintas da superfície da amostra, em aumentos

de 250x; C) e D) Aumentos de 500x ...................................................... 75




superfície da zircônia Z-CAD após 24 horas do

plaqueamento em regiões distintas da superfície da

amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de

500x........................................................................................................ 76



superfície da zircônia Z-Klein após 24 horas do

plaqueamento em regiões distintas da superfície da


500x........................................................................................................ 77



superfície da cerâmica de Hidroxiapatita após 48 horas

do plaqueamento em regiões diferentes da superfície da


500x........................................................................................................ 78



superfície do Titânio após 48 horas do plaqueamento em

regiões diferentes da superfície da amostra, em

aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de 500x ...................................... 79




superfície da zircônia Z-CAD após 48 horas do

plaqueamento em regiões diferentes da superfície da


500x........................................................................................................ 80



superfície da zircônia Z-Klein após 48 horas do

plaqueamento em diferentes regiões da superfície da

amostra, em aumentos de 250X; C) e D) Aumentos de

500X ....................................................................................................... 81

GRÁFICOS

Gráfico 1 - Avaliação intergrupos da viabilidade celular utilizando

ensaio de MTT ao longo de 24, 48 e 72h para os grupos

CH, CH 50%, Z-Klein, Z-Klein 50%, Z-CAD, Z-CAD 50%,

Ti, Ti 50% e C1%, normalizados com os valores do

grupo controle positivo (C 10%), considerado 100 %. Os

dados são expressos a partir da média e desvio padrão ....................... 70

Gráfico 2 - Avaliação intragrupos com ensaio de MTT; comparação

entre os períodos. .................................................................................. 71


Gráfico 3 - Avaliação intergrupos da viabilidade celular utilizando

ensaio de cristal violeta ao longo de 24, 48 e 72 horas

para os grupos CH, CH 50%, Z-Klein, Z-Klein 50%, Z-

CAD, Z-CAD 50%, Ti, Ti 50% e C1%, normalizados com

os valores do grupo controle positivo (C 10%). Os dados

são expressos a partir da média e desvio padrão. ................................. 72

Gráfico 4 - Avaliação intragrupos no teste com cristal violeta;

comparação entre os períodos ............................................................... 73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Médias ± desvio padrão dos grupos nos diferentes

períodos nos testes com MTT e cristal violeta (CV),

normalizados com os valores do grupo controle positivo

(C 10%) .................................................................................................. 69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CAD Computer Aided Desing

CAM Computer Aided Manufacturing

CH Cerâmica de Hidroxiapatita

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl Sulfoxide

MEM Minimum Essential Medium

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

DRX Difratometria de Raios X

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy

PABA Ácido para-aminobenzóico

POP Procedimentos Operacionais Padrão

PVAl Álcool polivinílico

PVB Polivinil Butiral

SFB Soro Fetal Bovino

SISBOV Sistema Brasileiro de Rastreabilidade Bovina e Bubalina

Ti Titânio comercialmente puro (Sandinox)

Z-CAD Zircônia ZirCAD (Ivoclar Vivadent)

Z-Klein Zircônia Zirklein (Biodinâmica)

WDXRF Wavelength Dispersive X-Ray Fluorescence

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 21

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 25

2.1 TECIDO ÓSSEO .......................................................................................... 27

2.2 BIOMATERIAIS ............................................................................................ 33

2.3 BIOCERÂMICAS .......................................................................................... 36

2.3.1 Hidroxiapatita .............................................................................................. 38

2.4 BIOCOMPATIBILIDADE ............................................................................... 41

2.4.1 Testes in vitro de biocompatibilidade ....................................................... 42

2.5 IMPLANTES OSSEOINTEGRADOS ............................................................ 43

3 PROPOSIÇÃO ............................................................................................. 47

3.1 OBJETIVO .................................................................................................... 49

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 49

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 51

4.1 CONFECÇÃO E PREPARO DAS AMOSTRAS ............................................ 53

4.1.1 Cerâmica de hidroxiapatita ........................................................................ 53

4.1.2 Titânio comercialmente puro ..................................................................... 56

4.1.3 Zircônias ZirCAD e Zirklein ........................................................................ 56

4.2 CULTURA DE CÉLULAS.............................................................................. 58

4.3 VIABILIDADE CELULAR .............................................................................. 59

4.3.1 Teste com MTT ............................................................................................ 60

4.3.2 Teste com cristal violeta ............................................................................ 62

4.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ....................................... 63

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................... 66

5 RESULTADOS ............................................................................................. 67

5.1 VIABILIDADE CELULAR .............................................................................. 69

5.1.1 MTT .............................................................................................................. 69

5.1.2 Cristal violeta .............................................................................................. 71

5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ....................................... 73

5.2.1 Período: 24 horas ...................................................................................... 74

5.2.2 Período: 48 horas ....................................................................................... 78

6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 83

7 CONCLUSÕES ............................................................................................ 89

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 93

1 INTRODUÇÃO

23

1 INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

Buscando a melhoria da qualidade de vida, a ciência desenvolveu os

Biomateriais. O termo Biomaterial é utilizado para definir qualquer substância ou

combinação destas que não sejam fármacos, de origem natural ou sintética, que

pode ser usada por qualquer que seja o período de tempo, aumentando ou

substituindo parcial ou totalmente qualquer tecido, órgão ou função do corpo, com a

finalidade de manter e ou alterar a qualidade de vida do paciente (WILLIANS, 1987).

Com o avanço e melhora de suas propriedades, as cerâmicas passaram a ser

materiais de grande interesse nas áreas Médica e Odontológica. As chamadas

Biocerâmicas, classificadas como Biomateriais, são utilizadas especialmente na

reparação, reconstrução e substituição de porções ósseas acometidas por alguma

patologia ou traumatismos diversos (HENCH; WILSON, 1993).

Materiais cerâmicos como o dióxido de zircônio, conhecido como zircônia,

estabilizada por ítria (Y2O3, óxido de ítrio), apresenta propriedades mecânicas

similares às ligas metálicas de Ti utilizadas para implantes dentários e ortopédicos

(OH et al., 2010; KRALEVA et al., 2010), tornando-se um material de potencial

utilização para a confecção de implantes dentários. A zircônia foi adaptada para uso

em sistemas cerâmicos CAD/CAM, com o objetivo de facilitar a obtenção de um

material cerâmico mais estético e que apresentasse resistência e tenacidade à

fratura, consideradas suficientes para ser empregado como material de

infraestrutura protética (GLAUSER et al., 2004; TAN, DUNNE JUNIOR, 2004;

BORBA et al., 2011).

A cerâmica de Hidroxiapatita (CH) é um tipo de Biocerâmica de fosfato de

cálcio. A Hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) tem composição e estrutura minerais

semelhantes ao osso natural, sendo um componente majoritário da fase mineral dos

ossos e dentes humanos, e possui como características a biocompatibilidade,

osteocondutividade e bioatividade (EANES, 1980; KAWACHI et al., 2000;

RODRIGUES et al.,2003). É conhecida por unir-se química e diretamente ao osso,

quando implantada (BAGAMBISA et al, 1993). As características químicas e

estruturais possibilitam seu uso na área médica como material biocompatível em

24

1 INTRODUÇÃO

implantes e próteses (EANES, 1980). Na odontologia a Hidroxiapatita é utilizada

para evitar perda óssea após extração de um ou vários elementos dentários, como

também, recuperação de áreas com reabsorção ósseas. Ela também é utilizada

como revestimento em implantes de titânio para a substituição da raiz

(MAVROPOULOS, 1999).

Nos estudos dos Biomateriais os testes in vitro caracterizam a resposta

celular frente ao substrato estudado. A utilização do modelo in vitro, além de poder

apresentar uma rápida resposta, avalia fatores como a biocompatibilidade,

citotoxicidade, proliferação e viabilidade celular. Entre as vantagens do modelo in

vitro, comparado ao in vivo, podemos incluir: a reprodutibilidade, rapidez de

resultados, alta sensibilidade, custo reduzido e bom controle de variáveis (HACKING

et al, 2008).

Neste trabalho foi realizada a avaliação do comportamento biológico, por meio

de testes in vitro de viabilidade de pré-osteoblastos por contato indireto e direto em

cerâmicas de Hidroxiapatita comparada com dois tipos de zircônias estabilizadas por

ítria e uma liga de titânio comercialmente puro, que são materiais atualmente

utilizados na confecção de implantes dentários.

2 REVISÃO DE LITERATURA

27



2.1 TECIDO ÓSSEO

O tecido ósseo é o constituinte principal do esqueleto humano. É um tecido

vivo mineralizado, altamente organizado, servindo como suporte estrutural do

organismo na proteção de órgãos vitais, no alojamento da medula óssea formadora

de células sanguíneas e na sustentação dos músculos para a locomoção. Além

disso, constitui o maior reservatório de íons cálcio e fosfatos (CUI et al., 2007). O

osso é uma estrutura hierárquica cujas propriedades mudam de acordo com a

mudança de escala. Este deve ser estudado a cada nível, nano, micro e

macroestrutural para poder entender seu comportamento intrínseco bem como

determinar as considerações apropriadas para a utilização de materiais compósitos

na substituição óssea (KATZ et al., 2007).

O osso existe sob duas formas: osso imaturo e osso lamelar. O osso imaturo

é um osso primitivo formado durante o desenvolvimento ósseo, no reparo de fraturas

e em certas patologias com uma organização irregular das fibras de colágeno. As

células se arranjam desordenadamente e a calcificação se dá de forma irregular

sendo gradualmente substituído pelo osso lamelar organizado. O osso lamelar é a

forma que constitui a maior parte do esqueleto maduro. É composto por sucessivas

camadas de fibras de colágeno orientadas numa direção preferencial que alternadas

dão uma estrutura típica lamelar. A calcificação se dá de forma ordenada. O osso

lamelar pode ser formado como osso cortical (compacto) ou trabecular (esponjoso),

representados na Figura 1. O osso cortical tem 80-90% do seu volume calcificado. O

espaço interno dos ossos é preenchido por uma rede de trabéculas finas no qual 15-

25% do volume é calcificado. Ele constitui 85% da massa óssea e um terço do

volume do esqueleto. Localiza-se na região externa de ossos longos, apresentando

espessura variada. Ele é revestido externamente por um tecido conectivo, periósteo,

cuja camada mais externa é rica em fibras colágenas, fibras de Sharpey, que

penetram na matriz mineralizada e a camada mais interna rica em células

osteoprogenitoras e colágeno. O osso cortical apresenta fibras colágenas

densamente compactadas, formando lamelas concêntricas em torno dos canais de

Haverst. Estes canais interconectam-se entre si com a cavidade medular e com a

28


superfície externa do osso através dos canais de Volkmann (JUNQUEIRA e

CARNEIRO, 2006).

Fonte: CASTRO M. Disponível em: http://faarmacia.blogspot.com.br.

Figura 1 – Desenho representativo do osso compacto e osso esponjoso.

O osso trabecular constitui cerca de 15 % da massa óssea e dois terços do

volume total do esqueleto. É revestido por uma camada unicelular, o endósteo, que

é um tecido conjuntivo frouxo com células ósseas revestindo cavidades (canal

medular e canais de Volkman e de Havers) (Figura 2). Possui uma matriz colagênica

pouco organizada e porosa, que delimita as cavidades interconectadas as quais são

preenchidas pela medula óssea, que possui precursores de células ósseas

(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2006).

O osso cortical desempenha as funções mecânicas e protetoras enquanto

que o osso trabecular desempenha as funções metabólicas. Este último possui uma

grande área de superfície possuindo baixa resistência mecânica (SIMÕES et al.,

1995).

http://faarmacia.blogspot.com.br/

29


Fonte: U.S. National Cancer Institute's Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER). Disponível em:

http://pt.wikipedia.org

Figura 2 – Osso trabecular e suas estruturas.

O osso tem como principais componentes uma fase mineral inorgânica

(apatita) e uma fase orgânica (colágeno). Muitas das funções fisiológicas e

mecânicas do osso dependem do tamanho do cristal de apatita e da sua relação

espacial com as moléculas de colágeno na matriz extracelular. Esses cristais são

depositados dentro das fibrilas de colágeno e essa relação estrutural vai depender

da quantidade e distribuição dessa fase mineral o que afeta a conformação das

moléculas de colágeno. Essa interação entre a fase mineral e orgânica é

determinante nas suas propriedades biomecânicas e biológicas o que dará suporte

às funções atribuídas aos vários tipos de ossos (KATZ et al., 2007).

As células que compõem o tecido ósseo, algumas representadas na Figura 3,

são: osteoblastos, produtores da parte orgânica da matriz; osteócitos, que se situam

em cavidades ou lacunas no interior da matriz; osteoclastos, células gigantes,

móveis e multinucleadas que reabsorvem o tecido ósseo (remodelação óssea);

fibroblastos, produtores das cadeias fibrosas de colágeno (JILKA, 2003;

JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2006).

30


Fonte: Adaptado de "Bone Structure" em http://cnx.org/content/m46281/latest/?collection=col11496/latest. Disponível em:

https://www.boundless.com

Figura 3 – Células ósseas: Célula osteogênica, que se desenvolve em osteoblasto, formador da

matriz óssea, que posteriormente se diferencia em osteócito, mantenedor do tecido ósseo e

osteoclasto, responsável pela reabsorção óssea.

Os osteoblastos são células mononucleadas, de origem mesenquimal, que se

apresentam como células polarizadas, com núcleo esférico e citoplasma basófilo.

São cubóides ou ligeiramente alongadas e formam uma camada celular contínua

sobre a superfície óssea que está sendo formada (osteóide). São as células

responsáveis pela produção da matriz orgânica do osso bem como pela sua

mineralização (MACKIE, 2003; CERRI, 2005). Quando ativas, possuem um

citoplasma rico em organelas de síntese e secreção, com o retículo endoplasmático

rugoso e complexo de Golgi desenvolvidos, grânulos de secreção, mitocôndrias,

vesículas de transporte, vesículas endossômicas, lisossoma, além das proteínas do

citoesqueleto (RAISZ, RODAN, 1998; SODEK, MCKEE, 2000; KATCHBURIAN,

ARANA, 2004). Sintetizam a matriz orgânica, constituída de várias proteínas

colágenas e não colágenas, tais como colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina,

proteoglicanas, fosfoproteínas e citocinas. Estes componentes interagem entre si e

organizam-se, fornecendo um arcabouço que permite a deposição de sais minerais,

além do fato de algumas destas moléculas atuarem diretamente na mineralização

(RAISZ, RODAN, 1998; KATCHBURIAN, CERRI, 2002).

http://cnx.org/content/m46281/latest/?collection=col11496/latest

31


Osteoblastos e pré-osteoblastos exibem níveis elevados da enzima fosfatase

alcalina na superfície de suas membranas citoplasmáticas, a qual, quando liberada,

contribui para o início da mineralização e o progressivo crescimento dos cristais de

hidroxiapatita (MUNDY, 1991; KATCHBURIAN, CERRI, 2002; KATCHBURIAN,

ARANA, 2004). No processo inicial de formação do tecido ósseo, os osteoblastos,

após secretarem a primeira camada de matriz orgânica, parecem assumir um

importante papel na sua mineralização. A partir dos osteoblastos adjacentes à matriz

orgânica óssea recentemente sintetizada, brotam pequenas vesículas de sua

superfície. Estas vesículas desprendem-se dos osteoblastos e, portanto, são

observadas entre os constituintes orgânicos da matriz óssea. Assim, são estruturas

arredondadas, que se originam da membrana plasmática dos osteoblastos, sendo

denominadas de vesículas da matriz (KATCHBURIAN, CERRI, 2002). Estas

vesículas, que permanecem na matriz extracelular, totalmente dissociadas das

células, contêm glicoproteínas e exibem forte marcação em sua membrana para a

fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina é uma família de enzimas que hidrolisam os

íons fosfatos, fornecendo-os para o interior das vesículas. Ocorre, também, um

aumento da concentração de íons cálcio no interior dessas vesículas, provavelmente

através dos fosfolipídios em suas membranas. Sendo assim, ocorre uma

supersaturação de fosfato e cálcio, resultando na precipitação de fosfato de cálcio

no interior das vesículas. Posteriormente, ocorre o rompimento da membrana das

vesículas e a mineralização espalha-se pela matriz. Este processo é característico

dos locais onde está ocorrendo pela primeira vez a formação e mineralização do

tecido ósseo (ARANA-CHAVES, SOARES, KATCHBURIAN, 1995; KATCHBURIAN,

CERRI, 2002). Deve-se ressaltar que as vesículas da matriz também são liberadas

pelos condrócitos durante a mineralização da cartilagem (ANDERSON, 1969), bem

como pelos odontoblastos, durante a formação da primeira camada de dentina

(KATCHBURIAN, 1973; ARANA-CHAVEZ, MASSA, 2004).

Os osteoblastos também funcionam como receptores e transmissores de

sinais para remodelação, pois possuem receptores para hormônios, como o da

tireóide, da paratireoide, estrogênios, glicocorticóides, insulina, Vitamina D (1,25

Dihidroxivitamina D3). Secretam fatores de regulação como Interleucina-6 (IL-6) e

fatores de crescimento como TGF-β que são fatores locais que agem na

proliferação, diferenciação e atividade osteoblástica (RAISZ, RODAN, 1998; TEN

32


CATE, 2001; KATCHBURIAN, ARANA, 2004). Além disso, os osteoblastos têm a

capacidade de modificar a matriz adjacente, removendo ou alterando as

proteoglicanas ou glicoproteínas. Inicia, então, a mineralização da matriz, através da

secreção de vários reguladores como IL-6, TGF-β e Interferon-γ (INF-γ) (MUNDY,

1991).

Assim, os fatores sistêmicos e locais controlam a proliferação, atividade e

sobrevivência dos osteoblastos. Alguns estudos mostram que os osteoblastos e/ou

osteócitos podem sofrer apoptose, em consequência, por exemplo, a trauma

mecânico ou deficiência de estrogênio (TOMKINSON et al., 1998; GARCIA-

MORENO et al., 2004). Em condições fisiológicas, a apoptose de osteoblastos

parece exercer um importante papel no controle do crescimento ósseo (PALUMBO,

FERRETTI, DE POL, 2003). A apoptose é um mecanismo de morte celular, sendo,

portanto, responsável pelo equilíbrio populacional de células nos tecidos e em

órgãos. A apoptose, quando desencadeada, ativa uma complexa cascata proteolítica

intracelular que coordena todo o processo de morte celular. Como consequência da

ativação das proteínas intracelulares promotoras da apoptose, a célula fragmenta-se

originando os corpos apoptóticos, que expressam em sua membrana plasmática,

entre outras moléculas, a fosfatidilserina que atrai os fagócitos e estes rapidamente

internalizam os corpos apoptóticos. Os osteoblastos, além de participar na formação

e mineralização da matriz óssea, podem também fagocitar os corpos apoptóticos

oriundos de osteoblastos e/ou células de revestimento ósseo, durante o início da

formação óssea (CERRI, 2005).

O processo de formação óssea inicia pela ação de osteoblastos, as células

especiais que sintetizam e liberam a matriz colágena na forma de uma substância

gelatinosa, o osteóide, que é subsequentemente mineralizada pela deposição

controlada de fosfato de cálcio. Os osteoblastos permanecem presos dentro da fase

mineral, passando a ser osteócitos, que mantem continuamente a atividade de

formação óssea. Enquanto isso, os osteoclastos catabolizam o osso destruindo-o.

Este processo dinâmico de formação óssea e destruição é responsável pelo

crescimento durante as fases de desenvolvimento do corpo, preservando sua forma

33


e consistência e permitindo sua regeneração em caso de fratura. Ele constitui

também um armazenamento e mecanismo para transportar cálcio e fósforo,

elementos essenciais, que são principalmente armazenados nos ossos (VALLET-

REGÍ, GONZÁLEZ-CALBET, 2004).

2.2 BIOMATERIAIS

A definição de Biomateriais mais aceita foi dada em 1982 na Conferência de

Consenso em Biomateriais para aplicações clínicas, a qual os conceitua como sendo

toda substância, com exceção aos fármacos, ou combinação de substâncias, de

origem sintética ou natural, que durante um período de tempo indeterminado é

empregada como um todo ou parte de um sistema para tratamento, ampliação ou

substituição de quaisquer tecidos, órgãos ou funções do corpo (WILLIAMS, 1987).

Dentre os Biomateriais estão os polímeros sintéticos, biopolímeros, metais,

biocerâmicas e compósitos. O critério para seleção de um biomaterial depende

principalmente da aplicação a que se destinam (PARK, 1984).

O sucesso na aplicação de um Biomaterial depende de alguns fatores: rota de

síntese, formas variadas de processamento, qualidade, propriedades e

biocompatibilidade do implante, condições do leito receptor do implante, esterilidade

clínica e competência do cirurgião que implanta e monitora o progresso do implante

(KAWACHI et al., 2000; PARK, 1980).

Os Biomateriais podem ser classificados quanto a sua origem como

(CAMILO, 2006):

- Autógenos: retirados do próprio indivíduo e transplantados de um local para

outro. Os tipos podem ser ossos corticais ou trabeculado medular, retirados de sítios

intra ou extra bucais (CAMILO, 2006).

- Alógenos: retirados de seres da mesma espécie que diferem geneticamente.

É obtido de banco de ossos humanos, a partir de doadores vivos que estão tendo

ossos retirados durante cirurgia ou cadáveres. Para evitar reação de corpo estranho,

os aloenxertos são pré-tratados por congelamento, radiação ou agentes químicos

(CAMILO, 2006).

34


- Xenógenos: retirados de seres de espécies diferentes, como por exemplo,

bovinos, que tem se mostrado como uma alternativa para diversas modalidades de

implantes, existindo uma variedade de estudos que demonstram suas indicações

(BERGLUNDH, LINDHE, 1997; PIATELLI et al., 1999; MAIORANA et al., 2005).

- Aloplásticos (sintéticos): são dispositivos de origem sintética utilizada para

implantação em tecido vivo, como polímeros, biocerâmicas, hidroxiapatita sintética,

trifosfato de cálcio e os vidros bioativos (CAMILO, 2006).

Esses materiais também podem ser classificados de acordo com seu

comportamento biológico, baseado na resposta do tecido hospedeiro em (HENCH,

WILSON, 1993):

- Biotoleráveis: materiais apenas tolerados pelo organismo, sendo isolados

dos tecidos adjacentes por meio da formação de camada de tecido fibroso, que é

resultante da liberação de compostos químicos, íons, produtos de corrosão por parte

do material implantado. Quanto maior a espessura dessa camada fibrosa formada,

menor a tolerância dos tecidos adjacentes ao material. Os materiais biotoleráveis

são basicamente todos os polímeros sintéticos e a grande maioria dos metais

(HENCH, WILSON, 1993).

- Bioinertes: materiais também tolerados pelo organismo, porém a formação

de camada fibrosa é mínima. O material não libera componentes químicos ou o faz

em quantidades mínimas. A quantidade de células fagocitárias na interface é

mínima, a resposta fagocítica será passageira e uma fina cápsula tomará lugar após

o implante. Em alguns lugares essa camada é praticamente imperceptível (HENCH,

WILSON, 1993).

- Bioativos: materiais em que ocorrem ligações químicas com o tecido ósseo

(osseointegração). Em função da similaridade química entre estes materiais e a

parte mineral óssea, os tecidos se ligam a eles, permitindo a osteocondução por

meio do recobrimento por células ósseas. Os principais materiais desta classe são

35


os vidros e as vitrocerâmicas à base de fosfato de cálcio, a hidroxiapatita e os

compostos de fosfato de cálcio (HENCH, WILSON, 1993).

- Reabsorvíveis: reabsorvidos e substituídos por osso, podendo ser

degradados ou fagocitados pelo organismo. Como exemplo tem o fosfato tricálcico

(TCP) (HENCH, WILSON, 1993).

Devido a grande variedade de biomateriais, sintéticos ou biológicos, com

tamanhos variáveis de partículas eles também podem ser classificados quanto ao

seu modo de ação em: osteoindutores, osteocondutores, osteogênicos ou

osteopromotores.

Os osteoindutores são os materiais capazes de induzir neoformação óssea

em um local não ósseo. A osteoindução ocorre quando os materiais possuem a

capacidade de atrair células mesenquimais, que mais tarde se diferenciará em

osteoblastos, devido à presença de proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) entre

seus componentes (DALAPICULA et al., 2006).

Os osteocondutores são materiais que possuem a capacidade de fornecer um

scaffold para formação de novo osso em um ambiente ósseo, mesmo na ausência

de fatores oteoindutivos implantados (RHEE, BODEN, 2005). A osteocondução se

caracteriza por um processo de invasão e crescimento de vasos sanguíneos, de

tecidos perivasculares e de células osteoprogenitoras do sítio receptor para o

enxerto (BAUER, MUSCHELER, 2000; CARVALHO et al., 2004).

Os osteogênicos são os materiais que carregam consigo células ósseas e por

isso são capazes de promover a formação de um novo osso. Estas são encontradas

na medula óssea, no periósteo e nos tecidos moles peritrabeculares, pois derivam

de células estaminais indiferenciadas do tecido conectivo (VACCARO et al., 2002).

Os osteopromotores são caracterizados pelo uso de meios físicos

(membranas ou barreiras) que promovem o isolamento anatômico de um local

permitindo a seleção e proliferação de um grupo de células, predominantemente,

osteoblastos nos casos de leito ósseo, a partir do leito receptor, e simultaneamente

impedem a ação de fatores concorrentes inibitórios ao processo de regeneração

(NOVAES JUNIOR, NOVAES, 1999).

36


A regeneração óssea por meio da utilização do Biomaterial está relacionada a

diversos fatores como a estabilidade do material, irrigação sanguínea,

proporcionando nutrientes e células para a região, presença de um arcabouço

tridimensional e tamanho do defeito ósseo. Em regiões em que a morfologia e

dimensão do defeito são extensas e críticas ao reparo, o mecanismo regenerativo

torna-se limitado e, desta forma, há formação de uma cicatriz fibrosa (KIM et al.,

2006).

Os Biomateriais que são utilizados como substitutos do tecido ósseo devem

possuir características peculiares, sendo biocompatíveis, biodegradáveis e

osteocondutivos. Tais materiais devem proporcionar a condução de osteoblastos ou

de células precursoras de osteoblastos para o sítio lesado e de fatores regulatórios

que promovam esse recrutamento, assim como o crescimento celular neste sítio

(LIU et al., 2004; WAN et al., 2006; CHEN et al., 2009). Além disso, precisam

proporcionar uma estrutura adequada, que servirá de suporte para a neoformação

óssea (PRECHEUR, 2007).

2.3 BIOCERÂMICAS

A utilização de cerâmicas como Biomateriais remonta a 1894, quando

Dreesman relatou o uso de gesso (CaS04(H20)2) como um possível substituto para

ossos. Em 1985, depois de extensos testes e aperfeiçoamentos a Food & Drug

Administration (FDA) aprovou a petição da U.S. Biomaterials Corp., de Baltimore, de

utilizar o Bioglass, como agora é chamado, para substituir os ossos do ouvido

médio, restaurando a audição. Hench havia descoberto uma nova c1asse de

materiais médicos, também conhecidos como Biomateriais: a Biocerâmica

(KRIEGER, 2003).

Biocerâmicas são cerâmicas especialmente utilizadas na Medicina e

Odontologia para a substituição ou reconstrução de partes afetadas ou destruídas

do sistema esquelético. Podem ser classificadas em reabsorvíveis (fosfato tri-cálcio),

bioativas (biovidros, biovitro-cerâmicas e hidroxiapatita) e bioinertes (carbono,

alumina sinterizada e zircônia estabilizada com ítria) (KUNES et al., 2000).

37


A primeira Biocerâmica com uso muito difundido na década de 70 foi a

alumina densa (α-Al2O3) (HULBERT, COOKE, 1970), que se apresenta como

bioinerte. Devido a sua boa biocompatibilidade e elevada resistência mecânica, vem

sendo utilizada com frequência em próteses ortopédicas que substituam ossos ou

parte deles que são submetidos, na sua atividade funcional, a esforços elevados.

As Biocerâmicas inertes são usadas principalmente na substituição de ossos,

próteses de quadril e implantes dentários. As mais utilizadas em implantes cirúrgicos

são a alumina e a zircônia. Estas cerâmicas atendem a esta demanda em função de

suas propriedades mecânicas e de corrosão, pureza química e biocompatibilidade.

Elas apresentam uma pequena ou nenhuma alteração química durante longo tempo

de exposição ao ambiente fisiológico. Mesmo nos casos em que estas Biocerâmicas

apresentam degradação química ou mecânica com o tempo, a concentração de

produtos de degradação em tecidos adjacentes é facilmente controlada por

mecanismos reguladores naturais do corpo humano. A resposta dos tecidos envolve

a formação de uma membrana fibrosa muito fina, micrométrica, ao redor do material

do implante (HULBERT, 1993).

A zircônia foi introduzida na área médica para a construção de próteses

ortopédicas devido ao seu ótimo desempenho mecânico e biocompatibilidade

(CHRISTEL et al., 1989; PICONI; MACCAURO, 1999; MANICONE et al., 2007). Na

odontologia teve seu uso impulsionado com a introdução da tecnologia Computer

Aided Design/Computer Aided Manufacturing (CAD/CAM) e com indicação para

infraestrutura de coroas e próteses parciais fixas em todas as regiões da cavidade

bucal, como alternativa para o metal (WHITE et al., 2005). As infraestruturas

cerâmicas apresentam vantagens em relação às metálicas, como a possibilidade de

posicionar o término cervical do preparo cavitários na mesma altura da margem

gengival livre, resultando em reabilitação mais estética e sem o risco de invasão do

espaço biológico (RAIGRODSKY; CHICHE, 2001). Atualmente também é utilizada

na confecção de pinos intrarradiculares, bráquetes ortodônticos e em sistemas de

implantes dentários (MEYENBERG; LUTHY; SCHARER, 1995; RAIGRODSKI,

2004).

A Figura 4 representa um esquema da evolução das cerâmicas e sua

utilização como Biomateriais.

38


Figura 4 – Esquema de evolução das cerâmicas. Adaptado de WANG et al., 2012.

2.3.1 Hidroxiapatita

A Hidroxiapatita e sua utilização têm sido pesquisadas desde seu surgimento

como Biomaterial, em 1970. Ela é um fosfato de cálcio hidratado, principal

componente da fase mineral dos ossos e dentes humanos (cerca de 95%). É o

material presente nos vertebrados, compondo o esqueleto ósseo e atuando como

reserva de cálcio e fósforo (SANTOS, 2002).

A hidroxiapatita possui fórmula molecular Ca10(PO4)6(OH)2 e apresenta uma

estrutura cristalina com parâmetros de rede a/b e c iguais a 0,95 nm e 0,68 nm,

respectivamente. É provável que sua célula unitária esteja organizada ao longo do

eixo c, o que poderia justificar uma orientação preferencial que gera um crescimento

em forma de agulha (Figura 5) (VALLET-REGÍ, GONZÁLEZ-CALBET, 2004; AOKI,

1991).

39


Figura 5 - Estrutura da hidroxiapatita ao longo do eixo c (ELLIOT, 1994).

A estrutura cristalina da hidroxiapatita lhe confere uma de suas propriedades

mais importantes, que é a facilidade de substituições catiônicas e aniônicas, sendo

referida como tendo capacidade de incorporar metade dos elementos da tabela

periódica em sua estrutura. Íons Ca2+ podem ser substituídos por um grande número

de cátions metálicos mono e bivalentes, tais como K+, Na+, Mg2+, Mn2+, Ni2+, Co2+,

Cu2+, Zn2+, Sr2+, Ba2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+, e íons trivalentes de elementos terra rara. A

diferença de valência causada por qualquer substituição requer uma redução na

carga aniônica para manter o balanço de carga. Íons PO43- podem ser substituídos

por íons AsO43-, SO4

2-, CO32-, SiO4

4-, VO43- e os íons OH- por íons CO3

2-, F-, Cl-.

Todas as substituições podem alterar a cristalinidade, os parâmetros de rede, as

dimensões dos cristais, a textura superficial, a estabilidade e a solubilidade da

hidroxiapatita que, por sua vez, alteram a degradação e o comportamento in vivo. O

íon CO32- pode fazer tanto substituições no sítio do OH-, originando a denominada

hidroxiapatita carbonatada do tipo A, quanto no sítio do PO43-, originando

hidroxiapatita carbonatada do tipo B. Para estas substituições ocorrem efeitos

40


opostos nos parâmetros de rede: substituição do tipo A causa expansão no eixo a e

contração no eixo c, enquanto que a substituição do tipo B causa contração no eixo

a e expansão no eixo c. Além disso, a substituição do tipo B acarreta também a

diminuição do tamanho dos cristais e da cristalinidade. As substituições catiônicas

por Sr2+ e Mg2+ causam aumento da solubilidade (REY et al., 2007).

Nos organismos vivos, sua facilidade de substituições catiônicas e aniônicas

faz com que a hidroxiapatita atue como reserva de cálcio e fósforo e um sistema

regulador de diferentes íons nos líquidos corporais por meio de sua liberação ou

armazenamento (CAMPBELL, 2003).

Outra propriedade da hidroxiapatita é a adsorção de proteínas em sua

superfície. Proteínas com ponto isoelétrico maior que 8 são adsorvidas na superfície

da hidroxiapatita devido à interação elétrica entre os grupos PO4 da hidroxiapatita

com grupos NH4 da proteína. Esta propriedade é responsável pela utilização da

hidroxiapatita como adsorvente em cromatografia líquida de alto desempenho

(HPLC) para a separação de proteínas e ácidos nucleicos (REY et al., 2007).

Os íons presentes na superfície do cristal de hidroxiapatita são hidratados

formando uma camada de água e íons em volta do cristal, chamada capa de

hidratação, que facilita a troca de íons entre o cristal e o líquido intersticial

(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 1995).

Desde que surgiram no mercado, no início dos anos 80, as cerâmicas de

fosfato de cálcio foram consideradas os materiais por excelência para a

remodelação e reconstrução de defeitos ósseos em decorrência de certas vantagens

por elas apresentadas. Essa preferência deve-se principalmente às suas

inigualáveis propriedades de biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade,

o que significa que, ao serem implantadas no sítio ósseo, não induzem resposta

imunológica; são capazes de ligar-se diretamente ao tecido ósseo e permitem o

crescimento do osso ao longo de sua superfície (LIU et al., 1997; CARRODEGUAS

et al., 1999).

Existem várias formas de Hidroxiapatita disponíveis, incluindo absorvíveis ou

não, particuladas ou em blocos, densas ou porosas (TONG et al., 1998).

41


A hidroxiapatita e os fosfatos de cálcio são utilizados em diferentes aplicações

clínicas, abrangendo várias áreas do esqueleto, incluindo fusão espinhal,

reconstrução craniomaxilofacial, tratamento de defeitos ósseos, tratamento de

fraturas, substituição articular e cirurgias de revisão (BEST et al., 2008). Sua

bioatividade proporcionou a utilização também de forma direta sobre a superfície de

implantes metálicos, permitindo uma ligação direta do osso com o implante. Dentre

as técnicas de deposição estão o plasma spray, sol-gel, íon sputtering, eletrolítico,

biomimético (RIGO et al., 1999). Exemplos das aplicações da hidroxiapatita estão

apresentados na Figura 6.

Figura 6 – Aplicações da hidroxiapatita. Adaptado de Hench e Wilson, 1993 e Human Body, 2007

(VAZ, 2007).

2.4 BIOCOMPATIBILIDADE

42


Com o objetivo de unificar e ampliar os conceitos de biocompatibilidade, em

2008 foi proposto o seguinte conceito: biocompatibilidade é a habilidade de um

biomaterial desempenhar sua função desejada em relação a uma terapia médica,

sem induzir qualquer efeito local ou sistêmico indesejável ao beneficiário da terapia;

mas, gerando as respostas celulares e teciduais mais benéficas naquela situação

específica e otimizando as respostas clinicamente relevantes daquela terapia

(WILLIAMS, 2008).

2.4.1 Testes in vitro de biocompatibilidade

No desenvolvimento de materiais, antes de serem testados como implantes,

os materiais devem ser avaliados quanto à citotoxicidade. Normalmente, um

biomaterial é avaliado, de início, por testes in vitro, que são caracterizados por

apresentarem fácil controle e alta reprodutibilidade, fornecerem dados de maneira

rápida e precisa sobre interações biológicas, além da vantagem de serem mais

acessíveis financeiramente e eliminarem a necessidade de animais em pesquisa

(GROTH, FALCK, MIETHKE, 1995).

Muitos testes de citotoxicidade in vitro foram padronizados utilizando culturas

celulares. Eles consistem em colocar o material direta ou indiretamente em contato

com uma cultura de células de mamíferos, verificando-se alterações celulares por

diferentes mecanismos, dentre ele a incorporação de corantes vitais ou a inibição da

formação de colônias celulares (ROGERO et al., 2000).

Os testes de citotoxicidade in vitro são classificados na ISO 10993-5, como

testes de avaliação inicial que utiliza técnicas de cultura celular. Estes testes

fornecem informações de caráter qualitativo e quantitativo do material em estudo,

com respeito às reações sistêmicas do organismo, como hipersensibilidade,

toxicidade e carcinogenicidade. São efetuados como testes de triagem na fase de

avaliação da biocompatibilidade. Em caso de reprovação no teste, o material é dito

incompatível, geralmente não merecendo uma avaliação in vivo (GROTH, FALCK,

MIETHKE, 1995).

43


Uma das caracterizações in vitro mais usuais é testar a biocompatibilidade do

implante com osteoblastos humanos frescos, macrófagos ou qualquer outro teste de

linhagens celulares (TRENTZ et al., 2003), avaliando-se também mutações e/ou

alterações sensíveis no metabolismo celular. Sabe-se que as células tem a

capacidade de interagir com o ambiente ao seu redor de diferentes modos: através

dos receptores de membrana que absorvem os sinais externos (químicos ou físicos)

do meio extracelular, e por mecanismos que podem ocorrer estimulados no interior

da célula. Por sua vez, as células respondem a esta ação alterando o modo como os

genes expressam e adaptando-se as novas configurações ao seu redor. Portanto,

quando estas células ficam em contato com a superfície quimicamente ativa como

num meio de cultura, podem revelar mudanças significativas no sinergismo celular.

Para os materiais cerâmicos bioativos, ocorre a formação de uma camada de

hidroxiapatita carbonada na superfície do implante (LEGEROS et al., 1967;

LEGEROS, 1988; HENCH, 1991).

Na ausência de incompatibilidade do material, alteração ou morte celular,

modificação na permeabilidade da membrana ou inibição enzimática, pode ser dada

sequência aos experimentos, envolvendo então testes in vivo, que podem fazer uso

de diferentes espécies de animais (GROTH, FALCK, MIETHKE, 1995).

2. 5 IMPLANTES OSSEOINTEGRADOS

Em 1974, Branemark, considerado o pai da Implantodontia, realizou os

primeiros trabalhos sobre osseointegração através de estudos na tíbia de coelhos;

resultado de uma filosofia que evoluiu no decorrer dos anos. Início dos anos 80:

Conceito de osseointegração e a utilização de um implante em titânio (implante de

Branemark) "Conexão direta estrutural e funcional entre tecido ósseo vivo ordenado

e a superfície de um implante submetido à carga funcional" (LINDHE, KARRING,

LANG 2010).

A osseointegração define-se como o processo de conexão direta, estrutural e

funcional entre o osso vivo e a superfície de um implante submetido a uma carga

oclusal (BRÄNEMARK et al., 1969).

44


A aceitação internacional de implantes osseointegráveis de titânio ocorrida na

Conferência Internacional de Toronto em 1982 (ALBREKTSSON, SENNERBY,

WENNERBERG, 2008) impulsionou a utilização dos mesmos no campo

odontológico. A osseointegração, fundamental para o sucesso dos implantes

odontológicos, é definida experimentalmente como o contato íntimo entre o osso e o

material do implante em secções histológicas (ALBREKTSSON, ZARB, 1993;

ALBREKTSSON, JOHANSSON, 2001). Já a definição clínica reporta-se a

estabilidade e a anquilose do implante no osso (ALBREKTSSON, ZARB, 1993;

ALBREKTSSON, JOHANSSON, 2001). As reações biológicas começam assim que

o implante entra em contato com o tecido ósseo. Quando há a formação de células

ósseas na superfície do implante, proliferando-se e diferenciando-se, sucede-se a

sequência de eventos que resultam na osseointegração (LIN et al., 2009;

CASTELANI et al., 2011).

Fonte: Adaptado de http://www.deardoctor.com.

Figura 7 – Comparação entre dente natural e implante dental.

http://www.deardoctor.com/

45


Os metais mais utilizadas nos implantes comercializados atualmente são o

titânio comercialmente puro e a liga Ti-6Al-4V (titânio-6 alumínio-4 vanádio)

(JOKSTAD et al., 2003; BELLO et al., 2010). O titânio puro apresenta características

desejáveis como alta relação resistência/peso, boa resistência à corrosão e

biocompatibilidade. Esta última depende em grande parte da resistência à corrosão

do metal imerso nos fluidos do corpo e da toxicidade dos produtos de corrosão no

tecido circundante (OLIVEIRA et al., 2007; OLIVEIRA, GUASTALDI, 2009).

Biologicamente é indiscutível a possibilidade de se considerar a colocação de

um implante para reposição de dentes perdidos. Com o sucesso dos implantes

houve uma preocupação muito grande em se solucionar esteticamente o tratamento

restaurador. Os principais problemas apresentados eram justificados na posição do

implante, no intermediário ou no abutment e a sua inclinação (BOTTINO et al.,

2005). Porém, a cor cinza do titânio pode ser desvantajosa e dar origem a

problemas estéticos, especialmente se a situação dos tecidos moles não for ideal e

a cor escura transparecer através da mucosa peri-implantares fina (DEPPRICH et

al., 2008).

Nos implantes dentários metálicos a hidroxiapatita é utilizada para

recobrimento das superfícies, sendo este realizado mais comumente através do

método plasma-spray e, da deposição biomimética (JUNKER et al., 2009;

APARECIDA, FOOK, GUASTALDI, 2009). O método plasma-spray foi o primeiro a

ser desenvolvido e comercializado. Entretanto algumas desvantagens são descritas

na literatura, tais como: decomposição termal parcial da Hidroxiapatita devida à alta

temperatura do plasma; morfologia extremamente irregular do recobrimento; baixa

aderência do recobrimento quando a camada aplicada é mais fina do que os 50 µm

recomendados; controle pobre das propriedades físico-químicas e, portanto, da

estabilidade biológica do recobrimento; além de pouco controle quanto a espessura

do recobrimento (LUSQUINOS et al., 2003).

O implante dentário feito com uma Biocerâmica vem sendo utilizado com a

finalidade de evitar os problemas inerentes aos implantes tradicionais (metálicos,

poliméricos), como a liberação de íons e/ou fratura do osso (gradiente dos módulos

de elasticidade), ou ainda com a sensibilidade do organismo com a maioria dos

46


materiais estranhos, podendo resultar na formação de uma camada não aderente de

substância fibrosa ao redor do implante (HENCH, 1986).

3 PROPOSIÇÃO

49

3 PROPOSIÇÃO

3 PROPOSIÇÃO

3.1 OBJETIVO

O objetivo deste estudo in vitro é avaliar a viabilidade celular pré-osteoblástica

de forma indireta e direta de uma cerâmica à base de hidroxiapatita de composição

experimental de origem nacional como material base promissor de implantes

dentários.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Avaliar indiretamente a viabilidade celular de pré-osteoblastos frente à cerâmica à

base de hidroxiapatita experimental por meio do método de redução do MTT e

coloração com cristal violeta.

2) Avaliar a adesão e proliferação de pré-osteoblastos diretamente sobre as

superfícies, fixados com tetróxido de ósmio 2%, para análise em Microscópio

Eletrônico de Varredura.

4 MATERIAL E MÉTODOS

53

4 MATERIAL E MËTODOS

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CONFECÇÃO E PREPARO DAS AMOSTRAS

4.1.1 Cerâmica de Hidroxiapatita (MEIRA, 2014)

A etapa de obtenção da cerâmica de hidroxiapatita (CH) foi realizada na

cidade de São Carlos, na Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São

Paulo (EESC/USP). A hidroxiapatita foi obtida a partir de fêmures bovinos,

provenientes de animais rastreados através do Sistema Brasileiro de Rastreabilidade

Bovina e Bubalina (SISBOV).

O processamento do tecido ósseo para obtenção da Hidroxiapatita seguiu os

procedimentos operacionais padrão (POP) da empresa Critéria Indústria e Comércio

de Produtos Medicinais e Odontológicos Ltda. (São Carlos, SP, Brasil) e foi realizado

nas instalações da empresa para evitar a contaminação e garantir a qualidade do

material. Passou por processos químicos para retirada da matéria orgânica. Após

este processo, amostras foram enviadas para laboratório credenciado pelo Ministério

da Saúde para realização de análise química para comprovar a ausência de metais

pesados na composição do osso e análise citotóxica para comprovar a ausência de

contaminação biológica. Uma vez que o resultado da análise não apresentou metais

pesados na composição do tecido ósseo e ausência de citotoxicidade, este foi

liberado para ser utilizado na produção da hidroxiapatita em grânulos.

Para caracterização da Hidroxiapatita foram realizadas análises de

difratometria de raios X (DRX) e espectroscopia de infravermelho por transformada

de Fourier (FTIR). Os dados foram comparados com os valores da hidroxiapatita

padrão na forma de pó (Sigma-Aldrich). Também foi realizada a análise de

fluorescência de raios X por dispersão de comprimento de onda (WDXRF) para

verificar se a composição química estava de acordo com a norma ASTM F1185-03,

que determina a concentração máxima de metais pesados permitidos para a

hidroxiapatita obtida de origem animal.

54


Os materiais utilizados na manufatura dos discos de Hidroxiapatita foram:

álcool polivinílico (PVAl) como agente ligante; poliacrilato de amônia como

defloculante do sistema aquoso; polivinil butiral (PVB) (Butvar B98) como agente

ligante; ácido para-aminobenzóico (PABA) como defloculante do sistema alcoólico;

álcool isopropílico como solvente do ligante do meio líquido da barbotina.

A moagem da Hidroxiapatita foi realizada para diminuir o tamanho das

partículas e aumentar a reatividade entre elas, reduzindo assim, a temperatura e o

tempo necessário da sinterização e também a porosidade final da cerâmica. Foram

adicionados os ligantes (PVAl e PVB), pois estes conferem plastificação e

resistência a verde após a conformação. Para a moagem e obtenção de um pó

submicrométrico foi utilizado um jarro de polietileno com altura de 85 mm e volume

de 300 cm3 carregado com 40 vol% (500 g) de elementos de moagem, no caso,

esferas de zircônia 3Y com 10 mm de diâmetro perfazendo um volume útil de 100

mL. O jarro foi carregado com uma barbotina numa concentração de 30 vol% de

sólidos e colocado em moinho de bolas com velocidade de 104 rpm por 24, 48, 72 e

96 horas e em moinho vibratório por 24 e 48 horas.

Primeiramente foi realizada a moagem em meio aquoso e o jarro foi

carregado com barbotina de composição: 30 vol% de hidroxiapatita, 0,5 vol% de

etileno glicol, 0,5 vol% de poliacrilato de amônia e 69 vol% de água destilada. Após

as 96 horas de moagem em moinho de bolas e 48 horas em moinho vibratório foi

adicionado 1,5 % em peso (da Hidroxiapatita) de álcool polivinílico (PVAl), já

solubilizado na relação 1:10 PVA/água, e o jarro foi colocado por duas horas no

moinho de bolas para homogeneização, em seguida o jarro foi descarregado e a

barbotina seca em banho-maria.

Em meio alcoólico foram realizados dois tipos de moagens. Na primeira

moagem o jarro foi carregado com 30 vol% de Hidroxiapatita, 70 vol% de álcool

isopropílico e 0,05 wt% de PABA (ácido para-aminobenzóico) e foi colocado por 96

horas em moinho de bolas. Após esse período foi adicionado 1,2% em peso de PVB

(polivinil butiral) sobre o peso de hidroxiapatita, que foi misturado e homogeneizado

em moinho de bolas por duas horas. O jarro foi descarregado e a barbotina seca

com soprador de ar quente a aproximadamente 80 °C.

55


Na outra moagem o jarro foi carregado com a mesma proporção e foi

colocado por 48 horas em moinho de bolas e 48 horas em moinho vibratório. Nesta

moagem, para a manutenção da baixa viscosidade da barbotina foi adicionado mais

defloculante (PABA) após 24 horas de moagem no moinho vibratório. Após 96 horas

de moagem foi adicionado 1,2% em peso de PVB sobre o peso de Hidroxiapatita e

novamente foi necessário a adição de PABA na barbotina para manutenção da baixa

viscosidade. A quantidade total de PABA utilizado durante a moagem em moinho de

bolas e vibratório foi de 0,32 % em peso de hidroxiapatita. Após a mistura e

homogeneização por duas horas em moinho de bolas foi realizado o

descarregamento do jarro e a barbotina foi seca com soprador de ar quente.

Todos os pós preparados foram granulados e classificados em malhas

(peneiras) de aço inoxidável de #200 mesh≤75 µm.

Peças cilíndricas com 15 mm de diâmetro e espessura 4 mm foram obtidas a

partir da prensagem uniaxial dos pós com pressão de 100 MPa durante 30

segundos.

As superfícies dos discos foram desgastadas com lixas de carbeto de silício

de #240, #320, #400, #600 e #1500 mesh, respectivamente e o polidas com pastas

diamantadas de 9 µm e 1 µm.

A sinterização da Hidroxiapatita foi feita para consolidação das partículas,

densificação (redução da porosidade e aumento da densidade volumétrica) e

aumento da resistência mecânica. Foi realizada em forno tipo câmara de Lindberg

Blue/M em atmosfera de ar, da temperatura ambiente até 160 °C com taxa de

aquecimento de 2,7 °C/min, depois até 600 °C a 4 °C/min, em seguida até 1100 °C a

5 °C/min e, finalmente até a temperatura máxima (1300 °C) a 6 °C/min, com patamar

de 120 minutos seguido de resfriamento do forno até a temperatura ambiente. A

Figura 8 mostra um disco de cerâmica de hidroxiapatita sinterizado.

Para o estudo foram utilizados 2 discos para os testes de viabilidade indireta e

6 discos para viabilidade direta.

56


Figura 8 – Disco de cerâmica de Hidroxiapatita.

4.1.2 Titânio comercialmente puro

O titânio foi fornecido pela empresa Sandinox (Sorocaba, São Paulo) em

barras cilíndricas. O diâmetro do cilindro de 13 mm foi mantido. Os discos foram

cortados numa espessura de 4,5 mm. Para acabamento e polimento da superfície

foram utilizadas lixas de granulação 800, 1000 e 1200 por meio da máquina de

polimento Exakt 400 CS (Exakt, Hamburgo, Alemanha) (Figura 9).

Figura 9 – Disco de titânio.

Para o estudo foram utilizados 2 discos para os testes de viabilidade indireta e


4.1.3 Zircônias ZirCAD e Zirklein

Blocos pré-sinterizados de zircônias estabilizadas por óxido de ítrio IPS e.max

ZirCAD (Ivoclar Vivadent) e Zirklein (Biodinâmica), ambos para o sistema CAD/CAM,

57


foram torneados e reduzidos ao formato cilíndrico de 13 mm. Por meio da máquina

de corte Isomet 1000 (Buehler, LakeBluff, IL, EUA) os cilindros foram cortados numa

espessura de 5,7 mm (Figura 10).

Figura 10 – A) Bloco de zircônia IPS e.max ZirCAD para CAD/CAM; B) Blocos torneados em formato

cilíndrico; C) Corte dos cilindros na máquina de corte; D) Disco pré-sinterizado obtido da zircônia

ZirCAD; E) Disco pré-sinterizado da zircônia Zirklein.

Os discos foram presos com godiva sobre uma lâmina de vidro em pares para

realização do acabamento com lixas de granulação 1000 e 1200 por meio da

maquina automática Exakt (Figura 11). O polimento foi feito com discos de feltro de

granulações média, fina e extra-fina e pasta diamantada por meio da politriz.

Figura 11 – A) Máquina automática Exakt para acabamento e polimento com lixas; B) Discos pré-

sinterizados de zircônia fixados com godiva em lâmina de vidro, que foi inserida e fixada à vácuo na

Exakt; C) Discos de titânio fixados com godiva em lâmina de vidro.

58


Para o estudo foram utilizados 2 disco para os testes de viabilidade indireta e


Posteriormente os discos foram lavados com água destilada em lavadora

ultrassônica computadorizada (USC 700 – Unique Indústria e Comércio de Produtos

Eletrônicos Ltda, São Paulo, SP, Brasil), (Figura 12) e enviados ao laboratório para

sinterização.

Figura 12 – Lavadora ultrassônica computadorizada USC 700 (Unique) e Becker contendo

amostras para lavagem.

4.2 CULTURA DE CÉLULAS

Células pré-osteoblásticas de linhagem murina MC3T3-E1, originária da

American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas em meio Minimum

Essential Medium (MEM) (Nutricell) contendo nucleosídeos adenosina, citidina,

deoxycitidina, deoxyadenosina, deoxyguanosina, guanosina, timidina e uridina

(Sigma) e 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Para a expansão, as células foram

tripsinizadas com EDTA (1mM) e tripsina (0,25%) armazenadas por 5 minutos em

estufa a 37 °C seguida de inativação da tripsina com meio contendo SFB. Após

centrifugação a 500g por 10 minutos, o pellet foi ressuspendido em meio MEM 10%

SFB e cultivadas em garrafas na densidade de 0,5 x 104 células/cm2. Para a

confecção do banco de células, as mesmas foram congeladas em meio contendo

20% SFB e 5% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) (1 x 106) a -80°C por 24h e a seguir,

armazenadas em nitrogênio líquido. Para os experimentos, alíquotas foram

59


descongeladas em meio MEM contendo 10% SFB e cultivadas conforme descrito

acima.

4. 3 VIABILIDADE CELULAR

Os testes in vitro para a análise da citotoxicidade, através dos métodos de

redução por MTT e incorporação do cristal violeta, foram realizados de acordo com a

norma ISO 10993-5.

Previamente os discos foram pesados para avaliar a quantidade a ser inserida

em cada meio. Com os materiais previamente esterilizados, para cada 1g de

material, 10 mL de meio α-MEM foi utilizado para preparar o extrato e essa solução

foi incubada a 37°C por 48 horas antes de ser colocada nas placas de cultura para

atingir a confluência desejada.

O plaqueamento celular (Figura 13) foi realizado em 12 placas de 96

micropoços na densidade de 2x103 células/poço em meio Dulbecco’s Modified Eagle

Medium (DMEM) a 10% SFB em contato com os extratos dos materiais previamente

preparados. Em cada placa 8 micropoços de cada grupo foram preenchidos com

extratos diluídos a 50%.

Para a avaliação in vitro da citotoxicidade foram escolhidos os testes de

redução do MTT e cristal violeta. Ambos foram feitos em duplicata nos períodos de

24, 48 e 72h após o plaqueamento. Os poços como controle positivo (C 10 %)

receberam o meio DMEM com adição de 10% de soro fetal bovino, correspondendo

a 100% de viabilidade celular. Nos poços para controle negativo (C 1 %) foi

adicionado meio DMEM e Fenol a 1% para indicar a toxicidade.

Simplificadamente os grupos foram assim denominados: CH (Cerâmica de

Hidroxiapatita); CH 50 % (Cerâmica de Hidroxiapatita diluída a 50 %); Ti (Titânio

comercialmente puro); Ti 50 % (Titânio comercialmente puro diluído a 50 %); Z-CAD

(zircônia ZirCAD); Z-CAD 50 % (zircônia ZirCAD diluída a 50 %); Z-Klein (zircônia

Zirklein); Z-Klein 50 % (zircônia Zirklein diluída a 50 %).

60


Figura 13 – Desenho esquemático do plaqueamento indireto nas microplacas. Extratos dos materiais

(ZirKlein, Cerâmica de hidroxiapatita, ZirCAD e Titânio, respectivamente) a 100 % e diluídos a 50 %;

controles positivo e negativo e Blank.

4.3.1 Teste com MTT

O ensaio colorimétrico da redução do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-

il)-2,5- difeniltetrazólio) analisa a atividade mitocondrial das células (MOSMANN,

1983). O MTT, um sal de coloração amarelada, solúvel em água, é reduzido pela

atividade da enzima desidrogenase em um composto chamado formazan, insolúvel

e de coloração púrpura. Essa redução só ocorre em células vivas.

Em cada micropoço, após a remoção do meio e lavagem com PBS (Solução

Tampão de Fosfato), foi adicionado 110µL de solução contendo 0,5mg de MTT/mL

(Figura 14 A) e as placas foram embrulhadas em papel alumínio para proteção

contra luminosidade e armazenadas em estufa por 4 horas a 37 °C e 5 % de CO2

(Figura 14 B). Após a remoção do sobrenadante e descarte da solução, foram

adicionados 200µL de Dimethyl Sulfoxide (DMSO) em cada poço (Figura 14 C). A

citotoxicidade dos materiais foi avaliada pela absorbância medida por

espectrofotometria no aparelho leitor de Elisa (FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH,

Offenburg, Alemanha), em comprimento de onda de 570 nm (Figura 15).

61


Figura 14 – A) Adição do MTT nos micropoços; B) Armazenagem das microplacas em estufa a 37 °C

por 4 horas envoltas no papel alumínio; C) Placas com adição de DMSO nos micropoços para leitura

das absorbâncias.

Figura 15 – A) Aparelho de espectrofotometria FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Offenburg,

Alemanha), no qual foi realizada a leitura de absorbância nos micropoços; B) Compartimento de

inserção das microplacas.

Por meio da intensidade da cor presente nos micropoços das placas utilizadas

nesses ensaios, contendo células tratadas com diferentes diluições do extrato de

cada material, foi possível analisar se houve ou não morte das células. Quando há

morte celular a coloração tornar-se mais clara, pois ocorre menor incorporação do

MTT e cristal violeta; caso contrário, micropoços onde há células vivas, a coloração

é mais intensa. A Figura 16 demonstra simplificadamente a leitura da densidade

óptica por meio do espectrofotômetro.

62


Figura 16 - Esquema simplificado da absorbância por meio do espectrofotômetro. Um feixe de luz

(comprimento de onda 570 nm) é disparado e atravessa o micropoço. Parte da luz é absorvida e

outra parte é transmitida ao receptor, e então, calculado o valor da concentração dos corantes.

4.3.2 Teste com Cristal violeta

Este teste avalia a densidade celular por meio da pigmentação do DNA com

corante cristal violeta. Foi feito ao mesmo tempo do teste do MTT.

O meio foi removido dos micropoços, os quais foram lavados com PBS.

Adicionou-se metanol a 100% e aguardou-se 10 minutos. O metanol foi removido e

então as células foram coradas com o cristal violeta 0,2% diluído em etanol 2% e

aguardou-se 3 minutos. O corante foi removido e novamente os poços foram

lavados com PBS. Adicionou-se citrato de sódio 0,05 mol/L em etanol 50%, agindo

por 10 minutos. Por fim, assim como no ensaio com MTT, foi realizada a leitura das

densidades ópticas dos micropoços no leitor de ELISA, em comprimento de onda de

570 nm.

Os materiais utilizados e a sequência do ensaio com cristal violeta estão

descritos na Figura 17.

63


Figura 17 – A) Materiais utilizados no teste colorimétrico com cristal violeta; B) Adição do metanol 100

% com auxílio de micropipetas; C) Inserção do cristal violeta 0,2 % diluído em etanol 2 %; D)

Lavagem do corante com PBS para remoção de excessos; E) Adição de citrato de sódio 0,05 mol/L

diluído em etanol 50 %; F) Após 10 minutos, microplacas prontas para leitura no leitor de ELISA.

4.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Para este teste por contato direto, 6 discos de cada grupo foram lavados

previamente em lavadora ultrassônica computadorizada com Metanol 100% e água

destilada e posteriormente esterilizados em autoclave.

No primeiro momento, as células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 cultivadas

foram avaliadas em microscópio óptico para verificar a confluência e então

adicionadas à Câmara de Neubauer para contagem celular também por meio do

microscópio (Figura 18).

64


Figura 18 – A) Análise da confluência celular; B) Contagem celular na Câmara de Neubauer

por meio de microscopia óptica.

Foram utilizadas duas placas com 24 poços para acomodar 3 discos de cada

grupo para 24 horas e 3 discos em 48 horas. As células pré-osteoblásticas

previamente cultivadas em meio MEM foram inseridas sobre os discos em

densidade de 2x104 células/poço. Os poços foram preenchidos com meio MEM até

recobrir os discos e as placas incubadas por 24 e 48 horas a 37°C em 5% de CO2.

Posteriormente o meio foi delicadamente removido por aspiração e então, feita a

lavagem com PBS para remoção das células não aderentes (Figura 19).

Figura 19 – A) Placas de 24 poços contendo 3 discos de cada grupo para os período de 24 e

48 horas; B) Células em meio MEM inseridas diretamente sobre os discos; C) Poços preenchidos

com meio MEM, submergindo os discos.

Para cada período foi feita a fixação das células aderentes em vapor de

tetróxido de ósmio (KITAJIMA, LEITE, 1997) (Figura 20). Em capela de exaustão de

65


gases, os discos sobre lâmina de vidro foram depositados em placas de Petri

forradas com papel filtro umedecido (câmara úmida). A seguir, foi coletado 1 ml de

tetróxido de ósmio a 2%, colocado em tampinha de plástico e inserido também nas

placas de Petri, juntamente com os discos. As placas foram vedadas permaneceram

na capela por 48 horas, referente ao período necessário para volatilizar o tetróxido

de ósmio, promovendo a fixação das células sobre os discos.

Figura 20 – A) Manipulação e inserção do tetróxido de ósmio 2% na placa de Petri contendo

as amostras; B) Discos de Titânio e Cerâmica de hidroxiapatita na placa de Petri devidamente vedada

para contato com o vapor do tetróxido de ósmio; C) Discos das zircônias Z-CAD e Z-klein.

Após a fixação por 48 horas, as placas de Petri foram abertas e colocadas na

dessecadora por 3 horas (Figura 21 A). Posteriormente os discos foram fixados em

stubs por meio de esmalte de unha e por meio de aparelho metalizador (DENTON

VACUUM Desk IV, CTC) (Figura 21 B) eles foram metalizados por deposição de

ouro (Figuras 21 C e D).

Figura 21 – A) Dessecadora contendo as placas de Petri abertas, onde permaneceram por 3

horas; B) Metalizadora (DENTON VACUUM Desk IV, CTC); C) Discos fixados em stubs no momento

da metalização por deposição de ouro; D) Discos metalizados.

66


Para avaliar adesão, proliferação e morfologia das células, as imagens foram

geradas por meio do Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) por pressão

variável APEX Express (APEX Corporation, Delmont, Estados Unidos) (Figura 22).

Figura 22 – Microscópio Eletrônico de Varredura por pressão variável: A) e B) Discos

metalizados sobre os stubs inseridos no MEV para leitura das imagens. C) Luz laranja indicando que

a pressão ideal não foi atingida; D) Pressão ideal sinalizada por luz verde.

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados obtidos na viabilidade indireta foram expressos como porcentagens

do total de células viáveis para cada micropoço calculadas em relação ao grupo

controle positivo (C 10%). A percentagem de viabilidade celular indireta foi calculada

com a seguinte fórmula:

A média e desvio padrão dos valores percentuais para cada material e

períodos foram calculados e analisados estatisticamente pelo método paramétrico

ANOVA um critério, com pós teste de Tukey, sendo estes executados com auxílio do

programa Graph Pad Prism version 4.00 para o Windows (Graph Pad Software, San

Diego, Califórnia, USA). As diferenças estatísticas foram consideradas significativas

para p < 0,05.

5 RESULTADOS

69

5 RESULTADOS

5 RESULTADOS

5.1 VIABILIDADE CELULAR

A análise quantitativa foi realizada de modo que os dados obtidos foram

transformados em porcentagem em relação ao grupo controle positivo, considerado

100%. Dessa forma, as porcentagens de absorbância dos grupos foram comparadas

estatisticamente entre si dentro de cada período e também foram avaliadas as

diferenças dentro de cada grupo entre os períodos de 24, 48 e 72 horas.

Na Tabela 1 estão especificados os valores da média e desvio padrão de

todos os grupos em ambos os testes, nos diferentes períodos.

Tabela 1: Médias ± desvio padrão dos grupos nos diferentes períodos nos testes com MTT e cristal

violeta (CV), normalizados com os valores do grupo controle positivo (C 10%).

5.1.1 MTT

No período de 24 horas os valores de viabilidade (%) dos grupos avaliados

ficaram todos próximos ao grupo controle positivo (100%), com exceção do grupo

controle negativo (48,82 ± 13,59), demonstrando assim uma biocompatibilidade de

todas as amostras estudadas. Em 48 horas o perfil de viabilidade se manteve com

valores próximos ao controle (100%) e o grupo negativo semelhante ao período

anterior (56,34 ± 7,97). O mesmo observou-se em 72 horas, confirmando a

70

5 RESULTADOS

biocompatibilidade dos materiais e o controle negativo como um inibidor do

crescimento celular (55,12 ± 17,66).

Gráfico 1: Avaliação intergrupos da viabilidade celular utilizando ensaio de MTT ao longo de 24, 48 e

72h para os grupos CH, CH 50%, Z-Klein, Z-Klein 50%, Z-CAD, Z-CAD 50%, Ti, Ti 50% e C1%,

normalizados com os valores do grupo controle positivo (C 10%), considerado 100 %. Os dados são

expressos a partir da média e desvio padrão.

Na análise entre os grupos, no período de 24 horas, comparando com a CH

houve diferença estatística significante (p<0,05) maior para os grupos Z-CAD 50 %,

Ti e Ti 50% e menor para o C 1%, representada no Gráfico 1 pelo asterisco (*). Em

comparação à CH 50% houve diferença maior para Ti 50% e menor para C 1%,

representada no Gráfico 1 pela cerquilha (#). Para os demais grupos, em 24 horas

houve diferença estatística nos seguintes casos: Z-Klein menor que Z-CAD 50%; Z-

Klein menor que Ti; Z-Klein menor que Ti 50%; Z-Klein 50% menor que Ti 50%; Z-

Klein 50% maior que C1%; Z-CAD maior que C1%; Z-CAD 50% maior que C 1%; Ti

maior que C 1%; Ti 50% maior que C 1%.

No período de 48 horas tanto a CH quanto a CH 50 % obtiveram diferenças

estatisticamente significantes maiores em relação ao grupo negativo C 1 %. Não

houve diferença destas com os outros grupos. Entre os demais grupos para 48

horas as diferenças estatísticas encontradas foram: Z-Klein menor que Z-Klein 50%;

Z-Klein menor que Z-CAD 50%; Z-Klein maior que C 1%; Z-Klein 50% maior que Z-

CAD; Z-CAD menor que Z-CAD 50%; Z-CAD maior que C1%; Z-CAD 50% maior que

Ti; Z-CAD 50% maior que Ti 50%; Z-CAD 50% maior que C1%; Ti maior que C 1%;

Ti 50% maior que C 1%.

71

5 RESULTADOS

Em 72 horas, assim como no período de 48 horas, observaram-se diferenças

estatísticas menores do grupo controle C 1 % em comparação com a CH e a CH 50

%. Entre os demais grupos dentro deste período as diferenças foram vistas em: Z-

Klein maior que Ti 50%; Z-Klein maior que C 1%; Z-Klein 50% maior que C1%; Z-

CAD maior que C1%; Z-CAD 50% maior que C1%; Ti maior que C 1%; Ti 50% maior

que C 1%.

Gráfico 2 – Avaliação intragrupos com ensaio de MTT; comparação entre os períodos.

No ensaio com MTT os resultados da análise intragrupos, ou seja,

comparação de um mesmo grupo para os diferentes períodos, representada no

Gráfico 2, tanto a CH quanto a CH 50 % não apresentaram diferenças estatística

significativas. Apenas os grupos Z-Klein (24h menor que 72h e 48h menor que 72h)

e Z-Klein 50 % (24h menor que 48h e 24h menor que 72h) apresentaram

significâncias em comparação no decorrer dos períodos.

5.1.2 Cristal Violeta

No Gráfico 3 estão representados os resultados dos percentuais de cada

grupo dentro dos períodos, os quais foram normalizados com os valores do grupo

controle positivo (C 10%), considerado 100%.

Pode ser observado que todos os grupos testados apresentaram viabilidade

celular bem acima do índice de citotoxicidade, representado pelo controle negativo

72

5 RESULTADOS

(C 1%) em 24 horas (45,51 ± 14,83), 48 horas (50,75 ± 19,35) e 72 horas (53,64 ±

27,59), indicando que estas amostras não mostraram efeitos citotóxicos, assim como

no teste com MTT.

Gráfico 3: Avaliação intergrupos da viabilidade celular utilizando ensaio de cristal violeta ao longo de

24, 48 e 72 horas para os grupos CH, CH 50%, Z-Klein, Z-Klein 50%, Z-CAD, Z-CAD 50%, Ti, Ti 50%

e C1%, normalizados com os valores do grupo controle positivo (C 10%), considerado 100%. Os

dados são expressos a partir da média e desvio padrão.

Em 24 horas os grupos que apresentaram diferença estatística significante

em relação à CH foram: valores maiores para Z-CAD 50%, Ti e Ti 50% e valor

menor para C 1%, representada no Gráfico 3 pelo asterisco (*). Comparados à CH

50%, o grupo Ti 50% apresentou maior significância, enquanto o C 1% foi menor

representada no Gráfico 3 pela cerquilha (#). Para os demais grupos, as

comparações entre eles geraram as seguintes diferenças estatísticas: Z-Klein menor

valor que Z-CAD 50%; Z-Klein menor que Ti; Z-Klein menor que Ti 50%; Z-Klein 50%

menor que Ti 50%; Z-Klein 50% maior que C 1%; Z-CAD maior que C1%; Z-CAD

50% maior que C 1%; Ti maior que C 1%; Ti 50% maior que C 1%.

Em 48 horas tanto a CH quanto a CH 50 % obtiveram diferenças

estatisticamente significantes maiores em relação ao grupo negativo C 1 %. Não

houve diferenças destas com os outros grupos. Entre os demais grupos em 48 horas

as diferenças estatísticas encontradas foram: Z-Klein menor que Z-Klein 50%; Z-

Klein menor que Z-CAD 50%; Z-Klein maior que C 1%; Z-Klein 50% maior que Z-

CAD; Z-Klein 50% maior que Ti; Z-Klein 50% maior que Ti 50%; Z-Klein 50% maior

73

5 RESULTADOS

que C 1%; Z-CAD menor que Z-CAD 50%; Z-CAD maior que C1%; Z-CAD 50%

maior que Ti; Z-CAD 50% maior que Ti 50%; Z-CAD 50% maior que C1%; Ti maior

que C 1%; Ti 50% maior que C 1%.

Em 72 horas houve diferenças estatísticas menores do grupo controle C 1 %

em comparação com a CH e a CH 50 %. Para os demais grupos, neste período as

diferenças significativas foram vistas em: Z-Klein maior que Ti 50%; Z-Klein maior

que C 1%; Z-Klein 50% maior que C1%; Z-CAD maior que C1%; Z-CAD 50% maior

que C1%; Ti maior que C 1%; Ti 50% maior que C 1%.

Gráfico 4 – Avaliação intragrupos no teste com cristal violeta; comparação entre os períodos.

No ensaio com cristal violeta os resultados da análise intragrupos,

representada no Gráfico 4, tanto a CH quanto a CH 50 % não apresentaram

diferenças estatística significativas. Apenas os grupos Z-Klein (24h menor que 72h e

48h menor que 72h) e Z-Klein 50 % (24h menor que 48h e 24h menor que 72h)

apresentaram significâncias no decorrer dos períodos.

5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

A influência da superfície dos materiais em células pré-osteoblásticas MC3T3-

E1 foram analisadas em microscópio eletrônico de varredura por pressão variável

após 24 e 48 horas do plaqueamento.

74

5 RESULTADOS

5.2.1 Período: 24 horas

Em 24 horas verificou-se que as células encontravam-se aderidas às

superfícies dos materiais.

Figura 23 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura por pressão variável. A) e B)

Células pré-osteoblásticas na superfície da cerâmica de Hidroxiapatita após 24 horas do

plaqueamento em regiões distintas sobre a superfície da amostra, em aumentos de 250x; C) e D)

Aumentos de 500x. Nota-se a grande quantidade de células aderidas.

75

5 RESULTADOS

Figura 24 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura por pressão variável. A) e B) Células pré-

osteoblásticas na superfície do Titânio após 24 horas do plaqueamento em regiões distintas da

superfície da amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de 500x.

76

5 RESULTADOS


osteoblásticas na superfície da zircônia Z-CAD após 24 horas do plaqueamento em regiões distintas

da superfície da amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de 500x.

77

5 RESULTADOS


osteoblásticas na superfície da zircônia Z-Klein após 24 horas do plaqueamento em regiões distintas


Na cerâmica de Hidroxiapatita houve proliferação (Figuras 23 A e B) e parece

haver uma menor evidenciação das células (Figuras 23 C e D) em comparação aos

demais materiais.

No titânio evidenciou-se a proliferação das células (Figuras 24 A e B), assim

como nas zircônias (Figuras 25 A e B, 26 A e B).

As células apresentaram características arredondadas na superfície do titânio

(Figura 24 C e D), enquanto nas zircônias ZirCAD (Figura 25 C e D) e Zirklein

(Figura 26 C e D) observou-se início da formação de prolongamentos filopodiais.

78

5 RESULTADOS

5.2.2 Período: 48 horas

Comparativamente ao período de 24 horas, após 48 horas em todos os

grupos houve proliferação e diferenciação morfológica das células.


osteoblásticas na superfície da cerâmica de Hidroxiapatita após 48 horas do plaqueamento em

regiões diferentes da superfície da amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de 500x.

79

5 RESULTADOS


osteoblásticas na superfície do Titânio após 48 horas do plaqueamento em regiões diferentes da

superfície da amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de 500x.

80

5 RESULTADOS


osteoblásticas na superfície da zircônia Z-CAD após 48 horas do plaqueamento em regiões diferentes


81

5 RESULTADOS


osteoblásticas na superfície da zircônia Z-Klein após 48 horas do plaqueamento em diferentes

regiões da superfície da amostra, em aumentos de 250x; C) e D) Aumentos de 500x.

Na análise após 48 horas podemos observar que as células apresentaram

características morfológicas mais definidas na Cerâmica de Hidroxiapatita (Figura

27). Os núcleos e citoplasmas ficaram mais evidentes. Estas características foram

semelhantes àquelas encontradas nas células aderidas na superfície do titânio

(Figura 28). Na zircônia ZirCAD (Figura 29) o processo de emissão de

prolongamentos filopodiais das células tornou-se mais evidente. As células aderidas

na superfície da zircônia Zirklein (Figura 30) apresentaram-se maiores,

caracterizando o processo de achatamento.

6 DISCUSSÃO

85

6 DISCUSSÃO

6 DISCUSSÃO

Os Biomateriais para implantes dentários devem apresentar

biocompatibilidade, possuindo características como baixa ou ausência de

citotoxicidade, boa adesão e ser suporte para diferenciação e proliferação celular

(SCHMALZ, ARENHOLT-BINDSLEV, 2007).

Culturas de células em placas de 96 micropoços são comumente empregadas

em metodologias de avaliação toxicológica de compostos em populações celulares

homogêneas, possibilitando a triagem de um grande número de amostras e análise

simultânea de diferentes condições experimentais. O cultivo em micropoços

proporciona uma área de crescimento celular de aproximadamente 0,32cm2/poço

para o volume total de 200µL, resultando em condições de tensão de oxigênio,

potencial de hidrogênio iônico e difusão de nutrientes significativamente diferentes

ao observado em escalas de cultura celular convencionais. Como consequência,

células mantidas nestes microambientes podem apresentar alterações da atividade

metabólica basal e perda de viabilidade, decorrentes de limitações espaciais,

estresse nutricional e/ou saturação do meio; tais implicações podem gerar erros de

interpretação ou baixa sensibilidade analítica em ensaios aplicados à microcultura

celular (EISENBRAND et al, 2002; MINGOIA et al., 2006; OLSSON et al., 2006;

COLLINGE et al., 2010). Por isso, a concentração inicial de 2x103 células/micropoço

e a escolha de intervalos de tempo de 24, 48 e 72 horas para os testes deste estudo

de viabilidade indireta foram fundamentais nos resultados que demonstraram a

biocompatibilidade dos materiais.

Os resultados do ensaio de redução do MTT refletem a atividade da enzima

mitocondrial. Portanto, se o metabolismo das células não for afetado pelo tratamento

experimental, o teste fornece a informação das células que estão metabolicamente

ativas. Uma vez que a quantidade inicial de células foi igual para todos os grupos e

previamente elas não foram expostas a nenhuma substância tóxica, os resultados

encontrados no ensaio com MTT podem ser indiretamente interpretados como

marcadores de viabilidade celular.

86

6 DISCUSSÃO

Por meio da pigmentação do DNA das células, o teste com cristal violeta

possibilitou a confirmação dos resultados encontrados no ensaio de MTT.

Nos testes de viabilidade celular indireta, tanto no ensaio de redução do MTT

quanto no de cristal violeta, as amostras de cerâmica de hidroxiapatita apresentaram

comportamentos semelhantes ao controle positivo, o qual a viabilidade foi

considerada 100%, ou seja, não apresentaram toxicidade, em nenhuma das

diferentes diluições e também em nenhum dos diferentes períodos. A semelhança

também foi evidenciada na comparação entre os grupos. Desta forma, é possível

afirmar que a cerâmica de hidroxiapatita densa desenvolvida não causa morte ou

prejuízo às células, sendo, portanto, caracterizados como não-citotóxicas.

Apesar da ocorrência de diferenças estatisticamente maiores para o titânio e

a zircônia ZirCAD em comparação com a cerâmica de Hidroxiapatita nas primeiras

24 horas nos dois ensaios de citotoxicidade, em 48 e 72 horas essas diferenças não

permaneceram, o que demonstrou a semelhança no resultado final do

comportamento dos materiais frente às células (Gráficos 1 e 3).

A manufatura da hidroxiapatita densa, com aditivos como álcool isopropílico,

defloculante PABA (ácido para-aminobenzóico) e PVB (polivinil butiral) somados a

prensagem isostática com pressão de 100 MPa durante 30 segundos

proporcionaram aparente estabilidade química inicial, não interferindo nas atividades

metabólicas das células pré-osteoblásticas, apesar da hidroxiapatita pura ter

facilidade de substituições catiônicas e aniônicas, sendo referida como tendo

capacidade de incorporar metade dos elementos da tabela periódica em sua

estrutura (REY et al., 2007). No processo de osseointegração, esta vulnerabilidade

pode ser benéfica para integração com o osso neoformado.

Ainda em relação à manufatura da hidroxiapatita densa, o tamanho dos grãos

submicrométricos durante a sua confecção pode ter influenciado positivamente na

adesão e proliferação das células. Em estudo com cerâmicas de hidroxiapatita

densas compostas por diferentes granulações, que variaram de micrometros,

submicrometros a nanômetros, BOSE et al., em 2010, concluíram que aquelas onde

os grãos eram mais finos e menores (na ordem de 168 nm, 0,5 µm e 1,16 µm)

tiveram melhores resultados, por consequência do maior contato das células

osteoblásticas nas superfícies desses grãos. No caso do presente estudo, o

87

6 DISCUSSÃO

tamanho dos grãos para confecção da cerâmica de hidroxiapatita foi em torno

de 0,35 µm, sendo submicrométricos, o que pode ter influenciado positivamente nos

resultados.

Apesar de estudos mostrarem que a rugosidade superficial dos materiais a

serem implantados influencia positivamente na adesão celular, diferenciação e

consequentemente na osseointegração (ORSINI et al., 2000; SHALABI et al., 2006,

CHO et al., 2014), este trabalho por meio da viabilidade direta, demonstrou que em

superfícies polidas, assim como dos materiais aos quais foram comparadas, como

padronização das amostras, as cerâmicas de hidroxiapatita possuem características

que favoreceram a proliferação das células. CHO e colaboradores, em 2014, em um

estudo feito comparando titânio e zircônia com diferentes tratamentos de superfície

também concluíram que as superfícies destes materiais polidas facilitaram a

proliferação das células pré-osteoblásticas.

Estudos pioneiros sobre as características visualizadas em células por meio

de microscopia óptica já evidenciavam a existência de alterações morfológicas que

as mesmas podem apresentar quando são aderidas a um substrato (TAYLOR, 1961;

PETHICA, 1961; GRINNELL, MILAM, SRERE, 1973). Todo o processo de adesão e

proliferação consiste de fixação celular, crescimento filopodial, teia citoplasmática,

achatamento da massa celular e o crescimento de franjas do citoplasma periférico

progredindo de forma sequencial (RAJAMARAM, 1974). No presente trabalho estas

mudanças na morfologia das células puderam ser observadas, porém foram mais

evidentes nas zircônias (Figuras 29 e 30) e no titânio (Figura 28).

A diferenciação dos pré-osteoblastos em osteoblastos caracteriza-se por

células polarizadas, com núcleo esférico e citoplasma basófilo. Os osteoblastos são

cubóides ou ligeiramente alongadas e formam uma camada celular contínua sobre a

superfície (MACKIE, 2003; CERRI, 2005). Então, podemos afirmar que para todos

os materiais estudados as células pré-osteoblásticas sofreram essa diferenciação, o

que capacita os mesmos da neoformação óssea.

Dentro dos estudos em Implantodontia, existe uma maior concentração em

aperfeiçoar as superfícies dos implantes dentários com a finalidade de potencializar

e acelerar a resposta osteoblástica (ALBREKTSSON, SENNERBY, WENNERBERG,

2000; GEURS et al., 2002; WEBER, 2006; WENNERBERG, 2006) e assim,

88

6 DISCUSSÃO

promover e diminuir o tempo de osseointegração. A criação de micro rugosidades,

assim como a incorporação de substâncias bioativas, como o fosfato de cálcio

(Hidroxiapatita), íons cálcio e magnésio ou proteínas ósseas morfogênicas, pode

acelerar e aumentar a formação óssea, envolta dos implantes (BIESBROCK,

EDGERTON, 1995; JEFFCOAT et al., 2003; SUL, JOHANSSON, ALBREKTSSON,

2006; CAPILLA et al., 2007).

Implantes dentários feitos com Biocerâmica (zircônia) são utilizados com a

finalidade de evitar os problemas inerentes aos implantes tradicionais (metálicos,

poliméricos), como a liberação de íons e/ou fratura do osso (gradiente dos módulos

de elasticidade), ou ainda com a sensibilidade do organismo com a maioria dos

materiais estranhos, podendo resultar na formação de uma camada não aderente de

substância fibrosa ao redor do implante (HENCH, 1986). Por isso o que se espera

com estudos futuros envolvendo a cerâmica de hidroxiapatita é melhorar suas

propriedades mecânicas, associando-as a outros materiais, estando em harmonia

com suas excelentes propriedades biológicas.

7 CONCLUSÕES

91

7 CONCLUSÕES

7 CONCLUSÕES

Os testes de citotoxicidade apresentaram ótimos resultados, mostrando que a

cerâmica de Hidroxiapatita bovina experimental apresenta-se como um material

biocompatível, assim como os demais materiais aos quais foi comparada.

A cerâmica de Hidroxiapatita também se mostrou um material favorável à

adesão e proliferação de pré-osteoblastos, envolvidas na osseointegração.

Estes resultados são de extrema importância, uma vez que a cerâmica de

Hidroxiapatita é um material visado para posterior aplicação como base na

confecção de implantes dentários.

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