U N I V E R S I D A D E D E S Ã O P A U L O E S C O L A D E E N G E N H A R I A D E L O R E N A – E E L

PRISCILA VAZ DE ARRUDA

Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura

Candida guilliermondii FTI 20037

Lorena – SP 2007

PRISCILA VAZ DE ARRUDA

Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura

Candida guilliermondii FTI 20037

Lorena – SP 2007

Dissertação apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre

em Biotecnologia Industrial.

Área de concentração: Conversão de Biomassa Orientadora: Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na Publicação

Biblioteca Universitária Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

Arruda, Priscila Vaz de

Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii FTI 20037 / Priscila Vaz de Arruda ; orientadora Maria das Graças de Almeida Felipe.-- 2007

75 f: fig.

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de Biomassa) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo.

1. Biotecnologia 2. Xilitol 3. Hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar 4. Glicerol 5. Candida guilliermondii 6. Fermentação. I. Título.

574.6 - CDU

Aos meus queridos pais, Dora e Clóves, a minha

adorada Graça e ao meu amado Fernando.

AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente a Deus pelo dom da vida e por ter colocado anjos no meu

caminho.

A Profª. Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe, a qual tenho muito a agradecer

pelo apoio, orientação, paciência e dedicação com que me orientou a realizar este trabalho.

Sem deixar de mencionar a confiança e amizade, com a qual sempre pude contar nas horas em

que me acolheu com muito carinho em sua casa. Obrigada Graça, Humberto, Cláudia e Nê.

A doce e querida Rita de Cássia pela amizade e pelo grande auxílio durante a

realização dos experimentos, pois mesmo agora, à distância, ela não deixou de me apoiar.

As experientes Jussara, pelas análises cromatográficas e Lilian Marton, pelas

traduções.

As amigas conselheiras e “quebradoras de galhos e árvores” Tais, Débora e Carol,

por estarem sempre ao meu lado, me escutando, dando sugestões e ajudando no que fosse

preciso.

A todos os amigos que estão ou já passaram pelo DEBIQ: Aline, João Paulo,

Rogério, Tânia, Priscila (Volta Redonda), Juliana, Herbert, Ciro, Lilian Pivetta, Fernanda

Bernardi, Lili, Fran, Dani Cortez, Dani Borba, Adriana, Arismar, Larissa, Waltinho, Soninha,

Giovani, Boutrus, Juan, Ricardo, Talita, Kátia, Martha, Rimenys e Marton, pelo incentivo e

agradável convívio dentro e fora dos laboratórios.

Aos amigos Andressa Rabelo e Willian Barbosa que acompanharam de perto os

cinco anos de “FAENQUIL” e agora à distância, nesses últimos dois anos, continuaram me

incentivando e apoiando.

Ao Departamento de Biotecnologia e à Escola de Engenharia de Lorena.

A todos os professores e funcionários do DEBIQ, pela colaboração e amizade.

A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

bolsa de estudos concedida.

Aos meus pais, familiares, Fernando e Dudu pelo incansável carinho, apoio

emocional, incentivo e compreensão em todos os momentos.

A todos aqueles que de forma direta ou indireta estiveram presentes nesses sete

anos da minha eterna “FAENQUIL”.

“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem.

Por isso existem momentos inesquecíveis e pessoas incomparáveis.”

(Fernando Pessoa)

RESUMO

ARRUDA, P. V. Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii FTI 20037. 2006. 75f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo. O bagaço de cana-de-açúcar, subproduto do setor sucroalcooleiro, vem se destacando em várias pesquisas como matéria-prima em diferentes processos fermentativos por sua fração hemicelulósica ser formada na sua maior parte pelo açúcar D-xilose. As leveduras fermentadoras de D-xilose, como as do gênero Candida, destacam-se por excretarem xilitol no meio, um açúcar-álcool que possui propriedades peculiares como alto poder adoçante, semelhante ao da sacarose; anticariogenicidade e metabolismo independente de insulina. É um aditivo em alimentos, substância “GRAS” (Generally Regraded as Safe) pelo Food and Drug Administration dos Estados Unidos. Pesquisas para a obtenção biotecnológica de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos demonstraram que este processo é influenciado por vários fatores, tais como tipo de hidrolisado hemicelulósico empregado e condições de fermentação como temperatura, pH, disponibilidade de oxigênio, concentração de nutrientes no meio de fermentação, concentração de xilose, presença de compostos tóxicos ao micorganismo. Muitos dos parâmetros importantes para o desenvolvimento deste bioprocesso já estão estabelecidos, mas ainda são necessários estudos para melhor entendimento das vias metabólicas envolvidas nesta bioconversão; principalmente em relação à formação de subprodutos deste metabolismo, como o glicerol. A formação desse subproduto é relatada como uma resposta ao estresse celular provocado pelas condições ambientais impostas ao microrganismo. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a fermentação de meio semi-sintético e do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar contendo diferentes concentrações de glicerol (0,3; 0,7; 1,0; 3,5 e 6,5 g/L) sobre a bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii. As fermentações foram realizadas em frascos agitados a 200 rpm com 50 mL de meio, pH inicial de 5,5, a 30°C, durante 72h. Foram utilizados também meios sem adição de glicerol (controle) e meio contendo glicerol (53 g/L) em substituição aos açúcares. Nas condições experimentais avaliadas, a presença de 0,7 g/L de glicerol em meio semi-sintético, favoreceu não só a conversão de xilose em xilitol (YP/S=0,79 g/g) pela levedura, bem como a produtividade de xilitol (QP=1,13 g/L.h). Já em experimento realizado em hidrolisado foram necessárias concentrações de glicerol superiores à adicionda ao meio semi-sintético para se obter o máximo de fator de conversão e de produtividade de xilitol (YP/S=0,78 g/g e QP=0,71 g/L.h), os quais foram obtidos quando as concentrações de glicerol no meio de fermentação foram 6,5 g/L e 1,0 g/L, respectivamente. Em relação ao crescimento celular não se observou diferenças marcantes nas fermentações dos meios semi-sintético e de hidrolisado, porém a máxima concentração (6,08 g/L) foi obtida em hidrolisado na presença de 0,7 g/L de glicerol, condição esta que também coincidiu com aquela em que se observou maior consumo de ácido acético e menor formação deste álcool. A formação do etanol como subproduto deste metabolismo foi observada para todas as condições de fermentação avaliadas.

Palavras-chave: Xilitol. Glicerol. Xilose. Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Candida guilliermondii. Fermentação.

ABSTRACT

ARRUDA, P. V. Effect of glycerol on the xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii FTI 20037 yeast. 2006. 75f. Dissertation (Master of Science in Industrial Biotechnology) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo. The sugarcane bagasse, by-product of sugar alcohol sector, has been stood out in several researches as raw material in different fermentative processes because its hemicellulosic fraction is mainly formed by D-xylose sugar. The D-xylose fermenting yeasts, like the Candida species, stand out by releasing xylitol in the medium, a sugar alcohol with peculiar properties, power similar to that of sucrose, anticariogenicity and an insulin-independent metabolism. Xylitol is a food additive classified as a GRAS substance (Generally Regarded as Safe) by the USA Food and Drug Administration. Studies on the biotechnological production of xylitol from lignocellulosic residues have demonstrated that this process can be influenced by the type of hemicellulosic hydrolysate as well as by the fermentation conditions employed in the process (temperature, pH, oxygen availability, nutrients concentration in the fermentation medium, xylose concentration and the presence of compounds toxic to the microbial metabolism). Although many of the parameters that are important for accomplishing this process have already been established, further studies are still necessary for a better understanding of the metabolic paths involved in the xylose-to-xylitol bioconversion, mainly those concerning the formation of metabolism by-products such as glycerol. The formation of this by-product has been regarded as a response to the cellular stress provoked by the environmental conditions inflicted on the microorganism. By this way, this work aimed to evaluate the fermentation of semi-synthetic medium and of the sugarcane hemicellulosic hydrolysate containing different glycerol concentrations (0.3; 0.7; 1.0; 3.5 and 6.5 g/L) on the xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii. The fermentations were performed in shaked flasks at 200 rpm with 50 ml of medium, 5.5 initial pH, at 30ºC for 72 h. Medium without glycerol addition (control) and medium containing glycerol (53 g/L) in substitution to the sugars were also used. Under the evaluated experimental conditions, the presence of 0.7 g/L glycerol in semi-synthetic medium favored not only the xylose-to-xylitol conversion by the yeast (YP/S = 0.79 g/g), but also the xylitol productivity (QP = 1.13 g/L.h). In the assay using the hydrolysate, glycerol concentrations higher than those added to the semi-synthetic medium were necessary to obtain the maximum values of conversion factor and xylitol productivity (YP/S = 0.78 g/g and QP = 0.71 g/L.h). These values were obtained when the glycerol concentrations in the fermentation medium were 6.5 g/L and 1.0 g/L, respectively. In relation to the cellular growth, there was no significant difference in the fermentation for the semi-synthetic and hydrolysate media. In the hydrolysate with 0.7 g/L glycerol, the maximum cellular concentration (6.08 g/L), the highest acetic acid consumption and the lowest formation of glycerol as a by-product of this metabolism were observed for all the evaluated fermentation conditions. Key-words: Xylitol. Glycerol. Xylose. Sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate. Candida guilliermondii. Fermentation.

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................................10

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 12

2.1 Xilitol 12 2.1.1 Propriedades e Aplicações ........................................................................................ 12 2.1.2 Tolerância e Toxicidade ............................................................................................ 15

2.2 Ocorrência e obtenção do xilitol ................................................................................................15 2.2.1 Ocorrência................................................................................................................. 15 2.2.2 Obtenção.................................................................................................................... 16

2.3 Bioconversão de xilose em xilitol................................................................................................17

2.4 Recuperação de xilitol..................................................................................................................22

2.5 Glicerol...........................................................................................................................................23

2.6 Matérias-primas para a obtenção microbiológica de xilitol ..................................................29 2.6.1 Bagaço de Cana-de-Açúcar....................................................................................... 30

3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 31

3.1 Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana........................................................................31

3.2 Microrganismo e preparo do inóculo........................................................................................32

3.3 Meios e condições de fermentação.............................................................................................32

3.4 Métodos analíticos ........................................................................................................................33 3.4.1 Viabilidade e Pureza da Cultura ............................................................................... 33 3.4.2 Determinação das Concentrações de Açúcares, Ácido acético, Glicerol, Butanol, 1,3 Propanodiol, Butirato, Etanol e Xilitol............................................................................ 33 3.4.3 Determinação das Concentrações de Furfural e Hidroximetilfurfural..................... 34 3.4.4 Determinação das Concentrações de Compostos fenólicos ...................................... 34 3.4.5 Determinação da Concentração Celular .................................................................. 34 3.4.6 Determinação do pH ................................................................................................. 35

3.5 Metodologia de análise dos resultados ......................................................................................35 3.5.1 Determinação dos Parâmetros Fermentativos .......................................................... 35

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 36

4.1 Efeito do glicerol na fermentação em meio semi-sintético por C. guilliermondii ...........36 4.1.1 Consumo de xilose por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético................................................................................................................. 37 4.1.2 Formação de glicerol e etanol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético.............................................................................................. 39 4.1.3 Formação de xilitol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético................................................................................................................. 41 4.1.4 Crescimento celular de C. guilliermondii e variação do pH em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético .................................................................. 45

4.2 Efeito do glicerol na fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii ..................................................................................................................................47

4.2.1 Caracterização do hidrolisado hemicelulósico empregado nas fermentações ........ 47 4.2.2 Consumo de açúcares e ácido acético por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana ....................... 49

4.2.3 Formação de glicerol e etanol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana................................................... 53 4.2.4 Formação de xilitol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana ..................................................................... 55 4.2.5 Crescimento celular de C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana ..................................................................... 59

5 CONCLUSÕES....................................................................................................................... 60

6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS................................................................. 62

7 REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 63

10

1 INTRODUÇÃO

Cresce a cada dia o número de pessoas que, por motivos diversos, necessitam

diminuir ou cessar o consumo diário de açúcares. Devido a este fato, muitos estudos estão

sendo realizados a fim de se desenvolver produtos que possam, satisfatoriamente, atuar como

seus substitutos. Dentre esses produtos, o xilitol vêm adquirindo importância por apresentar

certas vantagens em relação aos demais, principalmente pelas suas características peculiares

como poder adoçante semelhante à sacarose, não calórico, adequado à dieta de diabéticos e

obesos e indicado na prevenção de osteoporose, otites e fibrose cística. Estudos buscam o

desenvolvimento de uma tecnologia alternativa ao processo químico (catálise química de

xilose), pelo qual o xilitol é comercialmente produzido a partir de materiais com alto teor de

xilana (polímero de xilose). Este processo é de elevado custo pelas extensivas etapas de

purificação da solução de xilose requerida para a catálise, bem como para a remoção do

catalisador e purificação do xilitol. Neste sentido, o grupo de Microbiologia Aplicada e

Bioprocessos (GMBio) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL/USP) vem há anos

concentrando esforços para o desenvolvimento de uma tecnologia de produção de xilitol por

via biotecnológica a partir de resíduos lignocelulósicos. Estas pesquisas são intensificadas

principalmente pela abundância renovável destes materiais e aplicação do xilitol em vários

segmentos industriais, em particular na área da saúde.

Os trabalhos dos pesquisadores da EEL/USP se iniciaram em 1985 com a seleção de

leveduras fermentadoras de xilose, destacando-se a Candida guilliermondii como promissora

para essa bioconversão. Até a presente data várias pesquisas já foram realizadas para o

estabelecimento da melhor condição de hidrólise de diferentes materiais lignocelulósicos

como bagaço de cana, palha de arroz, trigo e de cevada, aparas de eucalipto e mais

recentemente casca de aveia. Nestas pesquisas tem sido avaliados os parâmetros como a

concentração e a idade do inóculo, concentração de xilose, a temperatura, a disponibilidade de

oxigênio, o pH, a suplementação nutricional do meio e a relação glicose:xilose. Também a

avaliação da concentração de compostos tóxicos à levedura, os quais são provenientes do

processo de hidrólise ácida, como o ácido acético e compostos fenólicos vem sendo feita,

principalmente em relação aos efeitos tóxicos destes na formação de xilitol e em alguns casos

nas atividades enzimáticas de xilose redutase e xilitol desidrogenase. Estas enzimas são

chaves nesta bioconversão por participarem dos passos iniciais do metabolismo de xilose.

Alguns estudos também foram realizados para a recuperação do xilitol do meio fermentado e

11

das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase. Estudos recentes têm enfocado a

recuperação do xilitol do meio e a avaliação do custo do processo biotecnológico.

Embora até o momento os valores dos parâmetros fermentativos como o fator de

conversão de xilose em xilitol e a produtividade do xilitol são ainda baixos se comparados aos

obtidos em outros bioprocessos, os resultados são promissores quanto à possibilidade de

obtenção biotecnológica de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos. Neste sentido, os

pesquisadores são impulsionados a realizarem pesquisas que busquem melhor esclarecer a via

metabólica de conversão de xilose em xilitol pela levedura C. guilliermondii, em particular no

caso do presente trabalho, quanto ao efeito do glicerol nesta bioconversão. O glicerol tem sido

detectado em diferentes ensaios fermentativos nos quais foram utilizados meios semi-sintético

e também aqueles formulados à base de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar com vistas à produção de xilitol.

É conhecido que o glicerol tem um papel fundamental em vários processos

fisiológicos vitais em procariontes e eucariontes, sendo também um importante intermediário

do metabolismo energético. O glicerol é um soluto compatível, formado tanto como uma

estratégia para a regeneração de NAD+ quanto em condições de estresse celular. No caso da

bioconversão de xilose em xilitol a regeneração do NAD+ a partir da formação de glicerol,

além de desviar a utilização da fonte de carbono (xilose) para a formação deste subproduto

proporcionaria também uma menor disponibilidade do NADH2, cofator essencial para a

enzima xilose redutase, a qual participa do primeiro passo deste metabolismo.

Apesar do metabolismo do glicerol estar bem documentado, poucos estudos têm

enfocado diretamente o seu papel durante a bioconversão de xilose em xilitol. No que se

refere ao efeito do glicerol neste bioprocesso, os relatos da literatura apresentam os resultados

de ensaios preliminares realizados nos laboratórios do GMBio, os quais mencionam a

formação deste por Candida guilliermondii durante as fermentações de meio semi-sintético e

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Considerando a importância do glicerol em

múltiplos processos fisiológicos vitais e o fato deste ter sido detectado nas fermentações em

que se empregou C. guilliermondii, o presente trabalho avaliou o efeito do glicerol, em função

de sua concentração, sobre a bioconversão de xilose em xilitol por esta levedura cultivada

tanto em meio semi-sintético, quanto em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar.

12

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Xilitol

2.1.1 Propriedades e Aplicações

O xilitol, um álcool pentahidroxilado (C5H12O5) de massa molar 152,15g/mol, tem

poder adoçante semelhante ao da sacarose e superior ao de polióis comuns, além de valor

calórico reduzido (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973; HYVÖNEN; KOIVISTOINEN;

VOIROL, 1982). O modelo molecular deste poliol está representado na Figura 1.

Figura 1. Modelo molecular do xilitol – Software ACD/ChemSketch – vs. 4.55 (MARTON, 2002)

Outra propriedade do xilitol que merece destaque é a sua não cariogenicidade, uma

vez que este não é utilizado pelos microrganismos da flora bucal, principalmente pela bactéria

Streptococcus mutans, impedindo assim a formação de ácidos que atacam o esmalte dos

dentes, além deste promover a remineralização dos mesmos, revertendo lesões recém

formadas (MÄKINEN, 1976; MÄKINEN, 1992; SHEN et al., 2001). O esquema da Figura 2

proposto por Wen, Browngardt e Burne (2001), representa o mecanismo de ação do xilitol

nesta bactéria. Neste esquema, o xilitol entra na célula pelo sistema fosfotransferase, e uma

vez no interior da célula este é fosforilado pela frutose fosfotransferase formando então

xilitol-5P. A bactéria não consegue metabolizar o xilitol-5P, pois este é tóxico a ela, o que

resulta na expulsão do metabólito formado através do gasto de energia e seu acúmulo no

citoplasma. Desta forma o acúmulo de xilitol-5P inibe o consumo de outros açúcares e o

crescimento bacteriano (WEN; BROWNGARDT; BURNE, 2001; GRILLAUD et al., 2005).

Segundo Kandelman (2003) a diminuição do número de S. mutans na saliva e/ou na placa

pode ser devido tanto à redução da quantidade de açúcar extracelular como pela perda da

capacidade de adesão destas bactérias na cavidade bucal. Pesquisas clínicas com crianças em

Carbono Oxigênio Hidrogênio

13

idade escolar, as quais utilizaram doces e gomas de mascar contendo xilitol, evidenciaram a

capacidade deste poliol em prevenir a cárie dentária e manter a higiene-oral (ALANEN;

ISOKANGAS; GUTMANN, 2000; MÄKINEN et al., 2001).

Expulsão

Fru = Frutose; SFT = Sistema Fosfotransferase

Figura 2. Esquema do efeito do xilitol em Streptococcus mutans (Baseado em WEN;

BROWNGARDT; BURNE, 2001)

O xilitol também não participa de reações do tipo Maillard por não apresentar

grupos aldeídicos ou cetônicos em sua molécula, responsáveis por escurecimento e redução

do valor nutricional de proteínas, o que possibilita seu uso na indústria alimentícia no

processamento de produtos em que estas reações não são desejáveis (MANZ; VANNINEN;

VOIROL, 1973).

Uma outra característica importante do xilitol é o seu metabolismo independente de

insulina, tornando-o um substituto de outros açúcares na dieta de diabéticos (PEPPER;

OLINGER, 1988). Este adoçante também pode ser empregado no tratamento de outras

desordens metabólicas como a deficiência da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase e na

dieta de obesos, uma vez que este exerce pequena contribuição para a formação de tecidos

gordurosos quando comparado a outros açúcares (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973; van

EYS et al., 1974). Em estudos realizados com ratos foi constatado que a ingestão de xilitol

reduziu o ganho de peso e o consumo de alimento e também diminuiu os níveis plasmáticos

de triglicerídeos e colesterol nestes animais (ELLWOOD et at., 1999).

Outras aplicações clínicas do xilitol têm sido descritas como, por exemplo, sua

utilização na prevenção de osteoporose, relatada por Mattila, Knuuttila e Svanberg (1998).

Segundo esses autores, experimentos com ratos evidenciaram que a administração oral de

xilitol impediu a progressão da osteoporose proporcionando aumentos da massa óssea e das

Xilitol-5P Efeitos Tóxicos

XILITOL Fru SFT . Inibição do crescimento e

perturbação na síntese de proteínas.

ATPADP

14

propriedades biomecânicas de ossos enfraquecidos naqueles ratos, apontando ainda que, a

utilização de xilitol torna-se uma nova alternativa que amplia os tratamentos clínicos na

prevenção desta doença. Recentemente foi demonstrado por Mattila, Kamgasmaa e Knuuttila

(2005) que a administração simultânea em ratos de 10% de xilitol aliada a 10% de etanol

aumentou o volume ósseo e o conteúdo mineral dos mesmos. Esses efeitos foram maiores do

que aqueles induzidos pela única suplementação de 10% de xilitol (MATTILA;

KANGASMAA; KNUUTTILA, 2005).

Outra aplicação do xilitol é no tratamento da fibrose cística, uma doença que afeta

principalmente os pulmões e o sistema digestivo, pois a sua utilização teve efeito satisfatório

no controle desta doença (ZABNER et al., 2000). Esses autores constataram em testes com

humanos, que o uso inalatório do xilitol em “spray” resultou na diminuição da concentração

salina da camada superficial da membrana respiratória, o que favoreceu a imunidade própria

desta superfície e, como conseqüência, reduziu o número de bactérias do gênero

Staphylococcus coagulase-negativa na cavidade nasal de voluntários, diminuindo o risco de

infecções bacterianas pulmonares. Sajjan et al. (2004) relataram que o xilitol inibiu o

crescimento da bactéria Burkholderia cepaciae, uma das principais bactérias responsáveis por

infecções e morte em pacientes com fibrose cística.

O xilitol tem também a sua eficácia comprovada no tratamento de pacientes com

otite e isto é atribuído à inibição do crescimento de Streptococcus pneumoniae em função do

impedimento da adesão desta bactéria sobre as células nasofaringeais (UHARI; TAPIAINEN;

KONTIOKARI, 2001; TAPIAINEN et al., 2002). Esta propriedade foi observada em

experimentos clínicos em crianças, onde o xilitol mostrou-se eficaz na prevenção do

desenvolvimento de otite com a utilização de uma dose variando entre 8,4 a 10 g/dia dividida

em cinco porções. Estes autores observaram ainda que o uso de xilitol na prevenção desta

doença reduziu consideravelmente a utilização de antibióticos empregados no tratamento,

contribuindo para a redução de um problema mundial, que é resistência de bactérias a agentes

antimicrobianos causada justamente pelo uso descontrolado dos mesmos.

A combinação do xilitol com farnesol, tem sido também testada como forma de

controlar o balanço da microbiota da pele, pela inibição da formação de biofilme da bactéria

Staphylococcus aureus além de dissolver aquele já existente (MASAKO et al., 2005a e b)

Segundo os mesmos autores, a formação de biofilme, constituído principalmente de glicocálix

e fibras de fibrina, é impedida pela inibição da formação de glicocálix causada pelo xilitol e a

dissolução das fibras de fibrina causada pelo farnesol. Entretanto, não se observa a inibição do

crescimento da bactéria Staphylococcus epidermidis, a qual é a principal constituinte da

15

microflora da epiderme de pessoas saudáveis protegendo-as contra o crescimento de bactérias

patogênicas como no caso de S. aureus.

2.1.2 Tolerância e Toxicidade

O xilitol é bem tolerado pelo corpo humano podendo ser consumido até 20g por

dose, ou 60g por dia se ingerido em várias refeições, por isso, a ingestão acima dessa porção

pode apresentar efeito laxativo devido ao desbalanço osmótico causado no intestino grosso

pela baixa taxa de assimilação (EMODI, 1978; CULBERT et al., 1986).

Quanto à segurança do consumo e utilização por humanos, o xilitol já é aceito pela

European Economic Community – EEC desde 1984, enquanto a Food and Drug

Administration – FDA dos Estados Unidos o classifica como “geralmente reconhecido como

seguro” (Generally Regarded as Safe – GRAS) desde 1986 e “seguro para os dentes” (Safe

for Teeth) desde 1994. A Joint Expert Comitte on Food Additives (JECFA), uma divisão

prestigiada da World Health Organization, classificou o xilitol como aceitável para consumo

diário (Acceptable Daily Intake – ADI).

Todas as características apresentadas pelo xilitol têm garantido seu uso com

demanda crescente nas indústrias alimentícia, farmacêutica e odontológica em países como

Alemanha, Argentina, Bélgica, Canadá, Estados Unidos, Finlândia, França, Holanda,

Inglaterra, Japão, México, Suécia, Suíça e Rússia (CCC – Calorie Control Concil, 2005). No

Brasil, a sua utilização está voltada principalmente a produtos como creme dental, gomas de

mascar e pastilhas.

2.2 Ocorrência e obtenção do xilitol

2.2.1 Ocorrência

Na natureza, o xilitol é encontrado, por exemplo, em frutas, legumes, leveduras,

liquens, algas e cogumelos (Psalliota campestris) e a sua extração diretamente dessas fontes

não é economicamente viável pelas baixas quantidades presentes nestes materiais

(900mg/100g), o que torna este processo de obtenção economicamente inviável (HYVÖNEN;

KOIVISTOINEN; VOIROL, 1982; PEPPER; OLINGER, 1988).

O xilitol também aparece como um produto intermediário durante o metabolismo de

carboidratos em mamíferos, inclusive no homem (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973;

YLIKAHRI, 1979). Um humano adulto produz, por exemplo, entre 5 e 15g de xilitol por dia

16

durante o metabolismo normal (PEPPER; OLINGER, 1988) e a sua concentração no sangue

encontra-se na faixa de 0,03 a 0,06 mg/100mL (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973;

YLIKAHRI, 1979).

Em organismos superiores o metabolismo do xilitol ocorre principalmente no fígado,

onde pode ser transformado em glicose a uma taxa entre 20 e 80%, dependendo da

necessidade. Sua absorção é lenta e, por isso, também pode ser metabolizado indiretamente

pela biota intestinal (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a; MAKINEN, 2000).

2.2.2 Obtenção

Em escala comercial o xilitol é obtido por via química, porém, pesquisas têm sido

extensivamente conduzidas com o objetivo de desenvolver uma via alternativa de obtenção

microbiológica deste adoçante. De acordo com Winkelhausen e Kusmanova (1998) e Parajó,

Domínguez e Domínguez (1998a), na via química o rendimento deste processo é baixo (50-

60% baseado na xilana convertida), sendo difícil alcançar alto rendimento pela quantidade

considerável de subprodutos formada e pelo alto custo dos processos de recuperação e

purificação do xilitol, enquanto na produção microbiana, altos rendimentos são alcançados a

partir de xilose (65-85%).

A produção de xilitol por processo químico iniciou-se na Finlândia pela Finnish

Sugar Co. Ltda., Helsink, com capacidade para produzir acima de 3000 ton/ano, processo

patenteado em 1977 (Patente # 4.008.285) (MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977). Este processo

consiste na hidrogenação catalítica da xilose pura obtida através da hidrólise de materiais

lignocelulósicos. De modo geral, são necessárias quatro etapas básicas para a realização do

processo químico: (1) desintegração de materiais lignocelulósicos ricos em xilana através de

uma hidrólise ácida, (2) separação da xilose do hidrolisado, por cromatografia, para a

obtenção de uma solução de xilose de elevada pureza, (3) hidrogenação catalítica da xilose

pura em xilitol na presença de níquel como catalisador e (4) purificação e cristalização do

xilitol (MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977).

O rendimento do processo químico, bem como a qualidade do xilitol, são

dependentes da pureza da solução inicial de xilose, uma vez que a presença de impurezas

interfere no processo de catálise. Além disto, a produção de xilitol por via química exige

várias etapas de purificação para remoção de resíduos do catalisador, o qual é um metal tóxico

e prejudicial à saúde humana, e de subprodutos gerados durante o processo de hidrogenação

17

(MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977), resultando no aumento de tempo de processamento e

encarecimento do produto (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a).

Apesar da produção química de xilitol ser um processo já bem estabelecido, o uso

comercial deste adoçante tem sido limitado devido ao seu custo relativamente alto (cerca de

10 vezes o custo de produção da sacarose e do sorbitol) (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ;

DOMÍNGUEZ, 1998a). Como alternativa ao processo químico, pesquisas têm sido

conduzidas para o desenvolvimento de processos biotecnológicos utilizando microrganismos

para a conversão de xilose em xilitol sem a necessidade de uso de solução inicial de xilose

pura (ONISHI; SUZUKI, 1966; FELIPE et al., 1997a; PARAJÓ; DOMÍNGUEZ;

DOMÍNGUEZ, 1998b; FELIPE, 2004a).

Vários microrganismos já foram identificados como fermentadores de xilose em

xilitol, destacando-se as leveduras, especialmente o gênero Candida pela maior eficiência de

conversão (SIRISANSANEEYAKUL; STANISZEWSKI; RIZZI, 1995; WINKELHAUSEN;

KUSMANOVA, 1998; PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998b). Atualmente não se

tem encontrado na literatura, pesquisas com fungos filamentosos e bactérias produtoras de

xilitol, mas há relatos anteriores de trabalhos com fungos filamentosos como os dos gêneros

Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Gliocladium, Byssochlamys, Myrothecium e Neurospora

spp. (CHIANG; KNIGHT, 1961), Petromyces albertensis (DAHIYA, 1991), Mucor sp. e

Fusarium oxysporum (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a) e bactérias, como

Corynebacterium sp., Enterobacter liquefaciens e Mycobacterium smegmatis

(WINKELHAUSEN; KUSMANOVA, 1998).

Existem ainda microrganismos, nos quais o xilitol é formado a partir de arabinose ou

arabitol como é o caso do fungo filamentoso Aspergillus niger (WITTEVEEN et al., 1994), da

levedura Pichia stipitis (HALLBORN et al., 1995) e da bactéria Gluconobacter oxydans

(SUZUKI et al., 2002). O rendimento de xilitol alcançado com esta bactéria foi 0,98 g

xilitol/g arabitol, quando o etanol e a glicose também estavam presentes no meio de cultura

(SUZUKI et al., 2002).

2.3 Bioconversão de xilose em xilitol

O metabolismo da xilose inicia-se com o seu transporte através da membrana celular

por diferentes mecanismos (WINKELHAUSEN; KUSMANOVA, 1998) e uma vez no

interior das células, esta é reduzida em xilitol, por uma reação catalisada pela enzima xilose

redutase (E.C. 1.1.1.21) ligada a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatada ou não, em sua

18

forma reduzida (NADPH/NADH). Em seguida ocorre a oxidação do xilitol em xilulose pela

enzima xilitol desidrogenase (E.C. 1.1.1.9) ligada a nicotinamida adenina dinucleotídeo

fosfatada ou não em sua forma oxidada (NADP+/NAD+). A xilulose é então fosforilada a

xilulose-5-fosfato que pode ser convertida em piruvato através da conexão da via das

fosfopentoses com a via Embden-Meyerhof (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994).

As enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) podem ter

especificidades diferentes em relação aos cofatores oxidados e reduzidos dependendo da

espécie da levedura. Para Candida utilis a enzima XR requer como cofator NADPH, enquanto

a XDH é dependente da NAD+. Em Pichia stipitis e Pachysolen tonnophilus estas enzimas

são específicas para ambos os cofatores reduzidos (NADH/NADPH) e oxidados

(NAD+/NADP+) (BRUINENBERG et al., 1984). Em C. guilliermondii FTI 20037 a enzima

XR é NADPH-dependente e a enzima XDH é NAD+ ou NADP+- dependente (SILVA et al.,

1996). Yokoyama et al. (1995) sugerem que microrganismos que apresentam a enzima XR

dependente de NADH são melhores produtores de etanol e ao contrário, aqueles que

apresentam xilose redutase dependente de NADPH, acumulam xilitol ao invés de produzir

etanol. Além disso, a disponibilidade de oxigênio influencia fortemente o requerimento dos

cofatores desta enzima. Condições de anaerobiose ou limitadas de oxigênio causam um

desbalanço redox o qual interfere com a produção de xilitol e dos subprodutos deste

metabolismo, etanol e/ou glicerol (FELIPE, 2004a).

Ko, Rhee e Kim (2006) avaliaram o aumento da produtividade e rendimento de

xilitol a partir da deleção do gene da enzima xilitol desidrogenase (XLY2) da levedura

C. tropicalis cultivada em meio constituído por xilose e diferentes concentrações de glicerol

como fontes de carbono. Os valores de fator de rendimento e de produtividade foram 0,97 g/g

e 3,2 g/L respectivamente, quando 20 g/L de glicerol foi empregada juntamente com 50 g/L

de xilose. Os mesmo autores sugerem que o passo metabólico da transformação de xilitol em

D-xilulose em Candida sp. pode ser bloqueado pela deleção do gene da enzima responsável

por esse passo e o emprego de glicerol como co-substrato para crescimento celular e

regeneração de NADPH foram responsáveis pelo elevado valor de rendimento e

produtividade alcançados.

As atividades de xilose redutase e xilitol desidrogenase podem ser também

influenciadas por outros carboidratos como a arabinose e glicose, presentes juntamente à

xilose nos hidrolisados hemicelulósicos como o de bagaço de cana-de-açúcar (FELIPE,

2004b; SILVA e FELIPE, 2006).

19

Outros fatores devem ser também considerados como parâmetros interferentes na

bioconversão de xilose em xilitol como o pH (LAWFORD; ROUSSEAU, 1993; FELIPE et

al., 1997b; SENE et al., 2000; RODRIGUES et al., 2003c), a repressão catabólica exercida

pela D-glicose (YAHASHI et al., 1996; BICHO et al., 1998; LEE; RYU; SEO, 2000), a idade

e concentração do inóculo (PFEIFER et al., 1996; FELIPE et al., 1997a), a concentração

inicial de xilose (SILVA; AFSCHAR, 1994; FELIPE et al., 1997a), a temperatura (PARAJÓ;

DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998b; SENE et al., 2000) e a relação glicose:xilose no meio

de fermentação (SILVA; FELIPE, 2006). Porém, quando da utilização de hidrolisados

hemicelulósicos é importante considerar além desses fatores acima mencionados a influência

exercida por compostos tóxicos aos microrganismos, como fenóis, ácido acético, furfural e

5-hidroximetilfurfural, presentes nos hidrolisados, os quais são provenientes do processo de

hidrólise de biomassa vegetal (FELIPE, 2004a). Estes compostos inibem o metabolismo

microbiano em função da concentração em que estes se encontram no meio (FELIPE et al.,

1997a; ALVES et al., 1998; RODRIGUES et al., 2001; CONVERT et al., 2000; LARSSON

et al., 2000; PALMQVIST, HAHN-HÄGERDAL, 2000; NILVEBRANT; REIMANN;

LARSSON, 2001; SILVA et al., 2004a).

Os primeiros passos da formação de xilitol por C. guilliermondii a partir dos

açúcares presentes em hidrolisados obtidos de materiais lignocelulósicos, estão

esquematizados na Figura 3.

20

Figura 3. Fluxograma simplificado da via biotecnológica de obtenção de xilitol a partir de glicose, xilose e arabinose presente nos hidrolisados

obtidos de materiais lignocelulósicos (Baseado em MATOS, 2004)

D-Xilose

Xilose Redutase

XXIILLIITTOOLL

D-Xilulose

Xilulose 5P

Xilitol Desidrogenase

XiluloseQuinase

VViiaa PPeennttoossee FFoossffaattoo

NADPH2

NADH2

NAD+ H2O

O2

Cadeia Respiratória

ADP

ATP

L-Arabinose

L-Arabitol

L- Xilulose

MEMBRANA CELULAR MEMBRANA CELULAR MEMBRANA CELULAR

D-Glicose

Frutose 1,6diP

Dihidroxicetona P Gliceraldeído 3P

Piruvato

Acetil Coa Acetaldeído

GGLLIICCEERROOLL CICLO DE KREBS

EEttaannooll

D-Glicose D-Xilose L-Arabinose

Frutose 6 P NAD+

NADH + H

NAD+

Glicerol 3P

Glicerol 3P desidrogenase

Glicerol 3 fosfatase

21

No processo biotecnológico de obtenção de xilitol a partir de C. guilliermondii

cultivada em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar já foram estabelecidos

parâmetros como concentração (0,1 a 1,0 g/L) e idade do inóculo (24 h) (PFEIFER et al.,

1996; FELIPE et al., 1997a), pH (5,5 a 6,5) (FELIPE et al., 1997b); temperatura (30 ºC)

(BARBOSA et al., 1988; FELIPE et al., 1997a; SENE et al., 2000), concentração de xilose

(50 a 60 g/L) (FELIPE et al.,1997a), relação glicose:xilose (1:5) (SILVA; FELIPE, 2006),

concentração de ácido acético (FELIPE et al., 1995; SILVA, 2001; SILVA et al., 2004c).

Também a adaptação e reciclagem do inóculo ao próprio hidrolisado (FELIPE, 2004a;

MATOS, 2004; RODRIGUES et al., 2006), bem como o preparo do inóculo na presença de

baixa concentração de glicose (SILVA, 2004; SILVA; FELIPE, 2006) ou arabinose (MATOS,

2004) junto à xilose foram condições de fermentação que propiciaram o favorecimento da

produção de xilitol nas pesquisas realizadas com C. guilliermondii.

Dentre os vários parâmetros avaliados, encontrou-se ser a velocidade de

transferência de oxigênio um dos fatores mais importantes na bioconversão de xilose em

xilitol por C. guilliermondii, uma vez que a variação acima ou abaixo de um valor ótimo leva

a uma diminuição significativa do fator de conversão e/ou produtividade em xilitol (SILVA;

FELIPE; MANCILHA, 1998). Para C. guilliermondi a condição de transferência de oxigênio

empregada para a produção de xilitol, em frascos agitados (125 mL contendo 50 mL de meio)

tem sido 200 rpm (FELIPE et al., 1997a; SENE et al., 2000; SILVA et al., 2004c;

RODRIGUES et al., 2006), enquanto em fermentadores de bancada a utilização de um

coeficiente volumétrico de transferência de O2 (KLa) próximo de 20 h-1 têm sido o empregado

(MARTÍNEZ; SILVA; FELIPE, 2000; RODRIGUES et al.,2003c; RODRIGUES, 2005).

Como já foi mencionado anteriormente, o hidrolisado hemicelulósico obtido por

hidrólise do bagaço de cana contém compostos tóxicos à levedura e nesse sentido várias

técnicas de tratamento do hidrolisado vem sendo avaliadas com vistas a reduzir o teor destes

compostos e aumentar a fermentabilidade do hidrolisado. Dentre estas técnicas, destacam-se o

ajuste do pH com adição de ácidos e bases (ALVES et al., 1998; MARTINEZ et al., 2001), a

adsorção em carvão ativo (GINORIS, 2001; MARTON, 2002), a retenção em resinas de troca

iônica (CANILHA; ALMEIDA E SILVA; SOLENZAL, 2004; MARTON, 2005) e a

utilização de células adaptadas ao próprio hidrolisado (FELIPE et al., 1996; SENE et al.,

2001a; MATOS, 2004; RODRIGUES et al., 2006).

A partir do esquema apresentado na Figura 4 podem ser observadas as etapas

comparativas da produção de xilitol por ambos processos químico e microbiológico.

22

Cristalização

Redução Catalítica (Ni)

Purificação

Recuperação

XILITOL

LeveduraNutrientes

Fermentação

Hidrolisado Concentrado e Tratado

Solução de Xilose Pura

Materiais Lignocelulósicos Ricos em Xilana

Hidrólise

Hidrolisado Hemicelulósico(açúcares e compostos tóxicos)

Tratamento

Concentração

Figura 4. Esquema comparativo entre os processos químico (▪▪▪) e microbiológico ( ) de obtenção de

xilitol (Baseado em SILVA, 2004)

2.4 Recuperação de xilitol

A recuperação do xilitol é o passo mais complexo de todo o processo fermentativo

devido à sua baixa concentração e complexa composição do caldo fermentado (polipeptídeos,

açúcares, sais inorgânicos, álcoois) (DE FAVERI et al., 2004).

A utilização de técnicas de separação do xilitol por diferentes tipos membranas

permitiu cristalizar mais de 87% deste produto proveniente da fermentação, por

Candida tropicalis, de hidrolisado hemicelulósico de palha de milho (AFFLECK, 2000). A

máxima pureza obtida neste trabalho foi de 90,3% utilizando-se membrana polisulfônica

HG19.

Santos (2004) realizou pesquisas com diferentes zeólitas, na tentativa de recuperar

xilitol da fermentação por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-

de-açúcar. Os resultados dessa pesquisa revelaram a eficácia desta técnica, sendo a maior

XILOSE

23

eficiência de recuperação do xilitol (94,5%) encontrada com a utilização de um sistema

composto por coluna de leito fixo empacotada com a zeólita BaWE.

Recentemente, Martinez (2005) recuperou o xilitol por cristalização tanto do caldo

fermentado obtido a partir de solução sintética quanto deste obtido da fermentação do

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, obtendo-se cristais com 98-99% e

92-94% de pureza respectivamente. Resultados de recuperação semelhante ao de Martinez

(2005) foram obtidos a partir de hidrolisado hemicelulósico de palha de trigo (CANILHA,

2006).

2.5 Glicerol

O glicerol, também denominado glicerina, é um álcool (1,2,3–propanotriol), cujo

modelo estrutural está apresentado na Figura 5. No caso da utilização do glicerol em humanos,

para fins terapêuticos, como em remédios, por exemplo, a terminologia encontrada em sua

especificação deve ser glicerol USP (MORRISON, 1994). Embora o glicerol seja encontrado

em diferentes espécies, como protistas unicelulares e mamíferos (BRISSON et al., 2001), é

difícil o encontrarmos na sua forma “livre” nesses organismos, já que geralmente este se

encontra como um triglicerídeo combinado, por exemplo, com ácidos graxos (oléico,

palmítico e esteárico) (MORRISON, 1994). Grandes quantidades de glicerol podem ser

encontradas também em óleos ou azeites como o de coco, dendê, soja, algodão e oliva, bem

como em gorduras de animais como a banha de porco e sebo (MORRISON, 1994).

Figura 5. Modelo estrutural do glicerol (UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, 2005)

Dentre as características físico-químicas do glicerol (Tabela 1) destacam-se as

propriedades de ser um líquido oleoso, incolor, viscoso e de sabor doce, solúvel em água e

24

álcool em todas as proporções e pouco solúvel em éter, acetato de etila e dioxano, enquanto

em hidrocarbonetos este é insolúvel (LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999).

Tabela 1 - Propriedades físico-químicas do glicerol (JACKOBSON; KATHAGEN; KLATT, 1989;

MORRISON, 1994; LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999):

Peso Molecular 92,09

Densidade (glicerol 100%) 25 ºC 1,262 Kg/m3

Viscosidade 20 ºC 939 cps

Ponto de ebulição (101.3 KPa) 290 ºC

Ponto de fusão 18 ºC

Ponto de inflamação 177 ºC

Tensão superficial 20 ºC 63,4 mN/m

Calor específico (glicerol 99.94%) 26 ºC 2,435 J/g

Calor de evaporação 55 ºC 88,12 J/mol

Calor de formação 667,8 KJ/mol

Condutividade térmica 0,28 W/(m.K)

Devido à combinação de propriedades físico-químicas como não toxicidade,

ausência de cor e odor, o glicerol é uma substância com grande variedade de aplicações,

conforme ilustrado na Figura 6 (REHM, 1988; MORRISON, 1994; BRISSON et al., 2001).

25

Figura 6. Diferentes aplicações do glicerol (ARRUDA; RODRIGUES; FELIPE, 2006)

Dentre as diferentes aplicações do glicerol, destaca-se seu papel como agente

crioprotetor em microrganismos, uma vez que ele não permite a formação de cristais de gelo

na célula e mantêm a estabilidade da parede celular permitindo a vitalidade da mesma durante

o processo de congelamento para a conservação celular (NEVOIGT; STAHL, 1997;

BRISSON et al., 2002).

Outra característica do glicerol é seu papel como osmorregulador, importante

mecanismo que ocorre nas células como reação a fatores ambientais, como por exemplo, o

aumento da pressão osmótica. Assim, em resposta a estas alterações e como forma de

manutenção da estabilidade celular, a mesma responde através de mecanismos de

osmorregulação como no caso a produção de glicerol pela célula, o que acarreta em

diminuição da permeabilidade da membrana e restabelecimento da atividade celular (SAN

JOSÉ et al., 1996; NEVOIGT; STAHL, 1997; REP et al., 1999).

Na indústria de alimentos o glicerol é utilizado como aditivo alimentar em função de

suas propriedades estabilizantes, antioxidantes, sequestrantes, emulsificantes e umectantes.

Como produto farmacêutico sua aplicação se deve à sua alta viscosidade, o que permite sua

utilização em xaropes (MORRISON, 1994; RESOLUÇÃO Nº 386).

GLICEROL

Aplicações terapeuticas

Aplicações em

diagnósticos

Aplicações industriais

Controla a osmolaridade sanguínea

Xaropes

Agente purgativo

Agente hidratante

Agente Crioprotetor

Doenças Renais

Desordem do metabolismo de carboidratos

Aditivo

Tinta

Explosivos

Indústria Alimentícia

Indústria Textil

Indústria Química

Papel Detergente

Emulsificante

Adesivo

Antioxidante Estabilizante

Sequestrante

Indústria Farmacêutica

Remédio

Doenças gastrointestinais e constipações Edemas cerebral e intraocular

Tabaco

Maquiagem

Pasta de Dente Cosmético

Umectante

Sua ingestão aumenta a resistência a atividades

físicas em atletas

Agente Osmorregulador

Agente Termorregulador

26

Além das aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica, o glicerol é ainda

empregado para produção de resinas e poliésteres devido à sua reatividade polifuncional e

também como lubrificante na indústria têxtil (MORRISON, 1994). Tem também um

importante papel no processamento do tabaco, pois este ajuda a manter a umidade prevenindo

o ressecamento deste produto, além deste poder ser utilizado como solvente de muitos

compostos (MORRISON, 1994; BRISSON et al., 2001; WANG et al., 2001).

Recentemente novas aplicações do glicerol vem sendo descobertas, como seu

emprego como substrato para fermentações bacterianas com a finalidade de se obter produtos

de alto valor agregado como polímeros biodegradáveis, raminolipídeos, biosurfactantes,

dentre outros (97th AOCS ANNUAL MEETING & EXPO, 2006).

Tradicionalmente o glicerol é produzido por saponificação dos óleos, gorduras ou

sebos utilizando lixívias alcalinas, sendo obtido como subproduto na fabricação de sabão. No

entanto, esse processo não tem sido mais utilizado a nível industrial devido à substituição do

sabão por detergentes (REHM, 1988; AGARWAL, 1990; LÓPES; REVILLA; MUNILLA,

1999; WANG et al., 2001). A sua obtenção pode ser a partir de derivados do petróleo por

cloração a altas temperaturas, mas devido à formação de subprodutos prejudiciais ao meio

ambiente essa rota entrou em declínio (REHM, 1988; HESTER, 2000).

Devido às diferentes possibilidades de aplicações do glicerol na indústria e a sua

ocorrência em vários processos fisiológicos vitais tanto em procarióticos quanto em

eucarióticos, vem aumentando o número de pesquisas para a sua produção por via

fermentativa a partir de fontes renováveis de energia, cujos resultados destas pesquisas tem

sido patenteados (MORRISON, 1994; WANG et al., 2001). No processo fermentativo a

matéria-prima empregada incide apreciavelmente nos custos de fabricação do glicerol

(JACKOBSON; KATHAGEN; KLATT, 1989; MORRISON, 1994). É importante considerar

também que os processos com leveduras freqüentemente resultam em altos rendimentos de

glicerol, além do que é muito difícil a sua recuperação do caldo fermentado, especialmente

quando esses caldos contêm matérias-primas sem valor e não refinadas. Essas dificuldades são

o maior problema durante o processo de obtenção microbiológica de glicerol (REHM, 1988;

AGARWAL, 1990; MORRISON, 1994).

Diferentes matérias-primas são empregadas para produção fermentativa do glicerol

como melaço de cana e de beterraba, caldo de cana, cereais, bagaço de cana, palha de trigo e

arroz (MORRISON, 1994; LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999). Vários microrganismos

como bactérias, leveduras, fungos e também algas e alguns protozoários (Tabela 2), são

27

mencionados na literatura como produtores desse álcool (WANG et al., 2001;

TAHERZADEH et al., 2002).

Tabela 2 - Alguns organismos produtores de glicerol (WANG et al., 2001; TAHERZADEH; ADLER;

LIDÉN, 2002)

Bactérias Leveduras Fungos Algas Protozoários

B.1 subtilis S.3 cerevisiae Aspergillus niger D.6 tertiolecta Trypanosoma cruzi

B.1 coli S.3 ellipsoideus R.5 nigricans D.6 bioculata Leishmania mexic

B.2 orleanense S.3 mellis R.5 javanicus D.6 salina

B.2 pasteurianum C.4 stellata Botrytis cinerea D.6 viridis

Lactobacillus lycopersici

C.4 boidinii

C.4 kefyr

Hanseniaspora guilliermondii

1Bacillus; 2Bacterium; 3Saccharomyces; 4Candida; 5Rhizopus; 6Dunaliella.

A biosíntese de glicerol em S. cerevisiae, ocorre pela redução de didroxicetona

fosfato a glicerol 3-fosfato, catalisado por adenina dinucleotídeo na sua forma oxidada

(NAD+), seguida pela desfosforilação do glicerol 3-fosfato a glicerol (GANCEDO;

GANCEDO e SOLS, 1968 apud NEVOIGT; STAHL, 1997). Segundo Nevoigt e Stahl

(1997), a formação de glicerol é um mecanismo no qual o microrganismo evita a perda de

água para o meio extracelular, enquanto que, no meio intracelular, a sua formação permite a

manutenção do equilíbrio redox, principalmente na ausência de oxigênio. A formação deste

subproduto a partir do metabolismo de xilose em meio sintético foi observada durante o

cultivo das leveduras C. boidinii, C. shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus

(VANDESKA et al., 1995), Candida tropicalis (YAHASHI et al., 1996), e S. cerevisiae

(ANDERLUND; RÅDSTRÖN; HAHN-HÄGERDAL, 2001), bem como nos diferentes

hidrolisados cultivados com Candida guilliermondii como hidrolisados de bagaço de cana-de-

açúcar (RODRIGUES et al., 2003c, MATOS; FELIPE; SIVA, 2003) e de casca de aveia

(FELIPE et al.,2003). Rodrigues et al. (2003c) encontraram que a formação de glicerol por C.

guilliermondii cultivada em bagaço de cana, está associada ao pH, sendo favorecida em pH

7,5, diferente ao observado para o xilitol já que este foi favorecido em pH 5,5.

Não só o pH foi encontrado como um parâmetro que interferiu na formação de

glicerol por C. guilliermondii, mas a proporção de glicose:xilose no meio também interferiu

28

neste metabolismo, já que o aumento desta relação no hidrolisado hemicelulósico de bagaço

de cana favoreceu a formação deste composto pela levedura (SILVA, 2004).

A concentração de açúcares no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

também interferiu na produção de glicerol por C. guilliermondii, pois se verificou tendência

de aumento na formação do glicerol com o aumento do teor de açúcares no hidrolisado sem

tratamento prévio para a sua destoxificação (MATOS, 2004). Entretanto, esse mesmo autor

constatou que a adaptação das células ao hidrolisado durante o preparo do inóculo resultou em

menor formação de glicerol em relação à utilização do inóculo obtido do cultivo da levedura

em meio semi-sintético e sugeriu que a técnica de adaptação poderia promover uma

diminuição do efeito dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados sobre a levedura,

levando ao consumo do glicerol. Silva et al. (2004b), também constataram a formação e

posterior consumo do glicerol por C. guilliermondii durante o cultivo desta em hidrolisado de

bagaço de cana, principalmente com o esgotamento da xilose.

As Figuras 7 e 8 apresentam esquemas da assimilação microbiana de glicerol como

fonte de carbono e energia (AHRENS et al., 1998; WALKER, 1998; FLORES et al., 2000;

BIEBL, 2001). Em leveduras o metabolismo de glicerol na presença de oxigênio (vias

oxidativas) é proposto em dois principais passos: (1) em S. cerevisiae ou C. utilis o glicerol é

fosforilado por uma glicerol quinase e o L-glicerol-3-fosfato formado é oxidado por uma

glicerol fosfato ubiquinona oxirredutase mitocondrial; (2) em Schizosaccharomyces pombe a

desidrogenação do glicerol por uma glicerol desidrogenase dependente de NAD+ forma

dihidroxiacetona, a qual é então fosforilada por uma dihidroxicetona quinase (GANCEDO;

GANCEDO e SOLS, 1968 apud FLORES et al., 2000). Ahrens et al., 1998, sugere além

dessas vias oxidativas, uma terceira via, via redutiva, que ocorre em condições limitadas de

oxigênio, relatada para Klebsiella pneumoniae, que consiste na desidratação do glicerol por

uma glicerol desidratase formando 3-hidroxi-propionaldeído, seguido da conversão deste a

1-3 propanodiol pela enzima 1-3 propanodiol oxirredutase dependente de NADH2.

No caso da bactéria Clostridium pasteurianum (Figura 8) o metabolismo de glicerol

resultou na formação de produtos como 1,3 propanodiol, butirato, butanol e etanol (BIEBL,

2001).

29

Figura 8. Esquema do metabolismo de glicerol por Clostridium pasteurianum (Baseado em BIEBL,

2001)

Figura 7. Esquema do metabolismo de glicerol pelas vias oxidativas e redutiva de alguns microrganismos (Baseado em Ahrens et al., 1998)

30

2.6 Matérias-primas para a obtenção microbiológica de xilitol

A biomassa vegetal constitui uma fonte em potencial de carbono e energia que pode

ser empregada em bioprocessos para a produção de diversos produtos de valor agregado, uma

vez que é abundante, renovável e de baixo custo (TSAO, 1986; LEE, 1997; CHANDRAKAT;

BISARIA, 1998). Para se ter uma idéia da produção mundial de biomassa, cita-se o trabalho

de Hon e Shiraishi (2001), que estimaram uma produção em torno de 172 bilhões de toneladas

por ano, destes 82% são materiais lignocelulósicos florestais, como madeira, resíduos

agrícolas, plantas aquáticas, gramíneas e outros.

Vários materiais lignocelulósicos (Tabela 3) são utilizados para obtenção de

hidrolisados hemicelulósicos com o objetivo de produzir xilitol. Dentre eles podemos

destacar: o bagaço de cana-de-açúcar (FELIPE et al., 1996, 1997a e b; ALVES et al., 1998;

SENE et al., 2001a; VIÑALS, 2001; MARTON, 2002; RODRIGUES et al., 2003a e b;

MARTON et al., 2006), o eucalipto (PARAJÓ; DOMÍNGUES; DOMÍNGUEZ, 1996a e b,

1997 e 1998a; CANETTIERI; ALMEIDA E SLVA; CARVALHO JR, 2003), a palha de arroz

(ROBERTO et al.,1994 e 1995, MUSSATO; ROBERTO, 2005), a de trigo (CANILHA,

2006), a de cevada (CÂNDIDO et al., 2004) e a casca de aveia (TAMANINI et al., 2004).

A composição química dos materiais lignocelulósicos é complexa, sendo constituída

principalmente por celulose, hemicelulose, lignina e compostos de baixa massa molar como

extrativos (FENGEL, WEGENER, 1989).

Tabela 3 - Composição de alguns materiais lignocelulósicos

Material Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Referência

Palha de sorgo 34,00 44,00 20,00 Herrera et al. (2003)

Bagaço de cana 40,00 35,00 15,00 Rodrigues (2005)

Palha de cevada 23,00 32,70 24,40 Cândido et al. (2004)

Palha de trigo 33,81 31,83 20,12 Canilha (2006)

Casca de aveia 30,51 28,63 23,09 Felipe et al. (2003)

Palha de arroz 43,50 22,00 17,20 Mussato e Roberto

(2002)

Eucaliptus

grandis 40,20 15,67 26,90 Canettieri (2004)

31

2.6.1 Bagaço de Cana-de-Açúcar

O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, destacando-se o estado de

São Paulo como o maior contribuidor nessa produção (59,9% da produção nacional). O

aumento do consumo de álcool combustível e o crescimento da produção de carros com motor

bicombustível deve refletir no campo este ano, pois segundo a CONAB, a safra de 2005/2006

no país produziu 431,4 milhões de toneladas e a previsão para a safra 2006/2007 é de 471,2

milhões de toneladas, um aumento de 9,2% na produção (CONAB, 2006). Tendo em vista que

cada tonelada de cana-de-açúcar processada gera de 180 a 280 Kg de bagaço de cana

(SANTANA; SOUZA, 1984), pode-se estimar que somente na safra 2006/2007 serão gerados

entre 84 e 132 milhões de toneladas de bagaço. Embora o bagaço gerado durante a produção

de açúcar e álcool seja utilizado em grande parte pela própria indústria sucroalcooleira como

fonte energética, produção de vapor, existe ainda um excedente deste material, em torno de

10%, que gera problemas de estocagem e poluição ambiental (PROCKNOR, 2000).

As fibras do bagaço da cana contêm, como principais componentes, cerca de 40% de

celulose, 35% de hemicelulose e 15% de lignina (RODRIGUES, 2005). A celulose é um

polímero linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β-1→4,

enquanto a hemicelulose é um heteropolímero composto predominantemente por hexoses e

pentoses com curtas ramificações tais como D-xilose, D-glicose, L-arabinose e D-galactose e

a lignina, uma macromolécula polifenólica, é constituída por unidades básicas de

3-5-dimetoxi-4-hidroxi-fenilpropano, 3 metoxi-4-hidroxi-fenilpropano e 4-hidroxi-

fenilpropano (FENGEL; WEGENER, 1989). A elevada concentração de xilose na fração

hemicelulósica do bagaço, o que corresponde em até 80% do total de açúcar nesta fração

(RODRIGUES et al., 2001) e a capacidade de assimilação desta pentose por várias leveduras

são os principais fatores que impulsionam o aproveitamento deste resíduo em diferentes

processos de bioconversão como para a produção de xilitol (BARBOSA et al., 1988;

PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUES, 1998a) .

Para a utilização do bagaço de cana como matéria-prima na produção biotecnológica

de xilitol faz-se necessário sua hidrólise para a liberação de monossacarídeos fermentescíveis

da fração hemicelulósica. A hidrólise ácida é o processo pelo qual tem-se obtido o hidrolisado

hemicelulósico de bagaço utilizando-se a temperatura de 121 oC, por 10 minutos,

empregando-se 100 mg de H2SO4 por grama de matéria seca para uma relação sólido-líquido

de 1:10 (PESSOA JÚNIOR; MANCILHA; SATO, 1997).

32

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

O hidrolisado empregado nas fermentações foi obtido por hidrólise ácida e

concentração a vácuo durante pesquisas realizadas por Matos, 2004 e Silva, 2004. No presente

trabalho os volumes de cada hidrolisado foram misturados para a homogeneização do mesmo

e posterior caracterização quanto ao pH, à concentração de açúcares (xilose, glicose e

arabinose) e dos compostos tóxicos (ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural,

ρ-hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido siríngico, vanilina, seringaldeído e ácido ferúlico).

Após a caracterização, o mesmo foi tratado, visando reduzir o teor de compostos tóxicos,

segundo metodologia estabelecida por Marton (2002). O procedimento realizado consistiu na

alteração do pH do hidrolisado, combinada com adsorção em carvão vegetal ativado

(Carbonato delta-A) produzido pela BRASILAC. A alteração do pH ocorreu por adição ao

hidrolisado de óxido de cálcio comercial (CaO) até pH 7,0 seguido da redução para 2,5 com

ácido fosfórico (H3PO4). Após esta etapa, o hidrolisado foi misturado ao carvão (1%) sob

agitação em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) à 100rpm, à

60oC durante 30 minutos. Ao final de cada etapa de tratamento (alteração de pH e adsorção) o

hidrolisado foi filtrado em papel de filtro qualitativo para remoção do precipitado formado.

Após o tratamento do hidrolisado este foi autoclavado a 111 ºC por 15 minutos e

novamente caracterizado quanto ao pH, à concentração dos açúcares e compostos tóxicos.

3.2 Microrganismo e preparo do inóculo

Os ensaios foram realizados com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037,

selecionada por BARBOSA et al. (1988) para produção de xilitol, mantida a 4 ºC em tubos

inclinados com ágar extrato de malte.

Para o preparo do inóculo foi empregado o meio semi-sintético, contendo 50 mL do meio,

composto de xilose (30 g/L) como fonte de carbono, suplementado com sulfato de amônio (2 g/L),

cloreto de cálcio dihidratado (0,1 g/L) e extrato de farelo de arroz (20 g/L). As soluções estoques de

sulfato de amônio e cloreto de cálcio dihidratado foram preparadas separadamente nas

concentrações de 250 e 50 g/L, respectivamente, e esterilizadas a 121 ºC por 20 minutos. Para a

utilização do farelo de arroz como nutriente, foi empregado 200 g de farelo para um volume de

33

1 L de água destilada, o qual foi autoclavado por 15 minutos a 111°C. Após o resfriamento

dessa suspensão, esta foi centrifugada por 30 minutos em condições assépticas a 2000 X g

(Cu-500 – Damon/IEC Division). A fração líquida (extrato de farelo de arroz) foi transferida

para um frasco previamente esterilizado e conservada em geladeira até a sua utilização, num

prazo máximo de uma semana após o seu preparo, conforme metodologia empregada por Felipe

et al. (1997a); Alves et al. (1998) e Rodrigues (1999).

O cultivo da levedura foi feito em frascos Erlenmeyer (125 mL) em incubadora de

movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) com agitação de 200 rpm, a 30 oC por

24 horas. Após este período as células foram recuperadas por centrifugação a 2000 x g (Cu-500 –

Damon/IEC Division), lavadas com água destilada esterilizada, sob nova centrifugação para o

descarte do sobrenadante e utilização das células para o preparo de uma suspensão com água

esterilizada, a qual foi empregada como inóculo. A concentração inicial de células nas fermentações

foi de 1,0 g/L, em função desta ter sido a considerada como favorável à esta bioconversão (FELIPE

et al., 1997a).

3.3 Meios e condições de fermentação

Os experimentos para avaliação do efeito do glicerol foram realizados empregando-

se como meios de fermentação o meio semi-sintético, composto somente de xilose como única

fonte de carbono (concentração determinada em função do seu teor presente no hidrolisado) e

o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar (obtido conforme itens 3.1). Foram

utilizados também meios sem adição de glicerol e meio contendo glicerol (53 g/L) em

substituição aos açúcares. Estes meios foram suplementados com os mesmos nutrientes

utilizados para o preparo do inóculo, exceto a xilose (item 3.2).

Para a avaliação do glicerol nas fermentações, este foi adicionado aos meios (semi-

sintético e hidrolisado) nas seguintes concentrações: 0,3; 0,7; 1,0; 3,5 e 6,5 g/L. A solução

estoque de glicerol, este da marca Synth, U.S.P. e densidade equivalente a 1,3696 g/L, foi preparada

na concentração de 200 g/L e em seguida foi esterilizada a 121 ºC por 20 minutos.

Para todas as condições avaliadas o pH inicial de fermentação foi 5,5 e quando

necessário este foi corrigido com solução de NaOH-3N durante o preparo do meio. As

fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer (125 mL) em triplicata, com 50 mL dos

meios, a 30°C, sob agitação de 200 rpm em incubadora de movimento rotatório (New

Brunswick, Scientific Co.) por 72 horas. Amostras correspondentes ao volume de cada

Erlenmeyer foram retiradas no início de cada fermentação e após 10, 24, 34, 48, 58 e 72 horas de

34

incubação para serem imediatamente avaliadas quanto à concentração celular, viabilidade e pureza

da cultura. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 2000 x g (Cu-500 – Damon/IEC

Division) por 15 minutos, sendo que o sobrenadante foi separado das células e utilizado para

determinação do pH, das concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético,

glicerol, butanol, 1,3 propanodiol, butirato, etanol e xilitol.

3.4 Métodos analíticos

3.4.1 Viabilidade e Pureza da Cultura

A viabilidade da cultura foi verificada a partir de visualizações microscópicas de

lâminas preparadas a fresco, nas quais as células foram coradas pela adição de igual volume

de uma solução 0,01% (p/v) de azul de metileno dissolvido em citrato de sódio 2% (p/v)

(ODUMERO et al., 1992), enquanto a pureza foi verificada a partir de lâminas fixadas e

coradas com fucsina. As observações foram realizadas em microscópio óptico Leitz.

3.4.2 Determinação das Concentrações de Açúcares, Ácido acético, Glicerol, Butanol,

1,3 Propanodiol, Butirato, Etanol e Xilitol.

As concentrações dos açúcares (D-xilose, D-glicose e L-arabinose), bem como de

ácido acético, glicerol, butanol, 1,3 propanodiol, butirato, etanol e xilitol foram determinadas

por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), nas seguintes condições: coluna “Bio-

Rad Aminex” HPX-87H mantida a 45 ºC; detector de índice de refração RID 6A; eluente

ácido sulfúrico 0,01N, fluxo de 0,6 mL/min.; volume da amostra injetada, 20 μL. As amostras

foram previamente diluídas e filtradas em filtro “Sep Pack” C18 (MILLIPORE).

3.4.3 Determinação das Concentrações de Furfural e Hidroximetilfurfural

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) nos hidrolisados foram

determinadas por HPLC, nas seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP18 mantida a 25

ºC; detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS; eluente, solução de acetonitrila/água (1:8) com

1% de ácido acético; fluxo de 0,8 mL/min; volume da amostra injetada 20 μL. As amostras

foram previamente filtradas em membrana Minisart 0,22 μm (MILLIPORE).

35

3.4.4 Determinação das Concentrações de Compostos fenólicos

As concentrações dos fenólicos como os ácidos ρ-hidroxibenzóico, vanílico,

siríngico ferúlico e os aldeídos siringaldeído e vanilina, foram determinadas por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (WATERS), segundo metodologia empregada por

Morales (2005), nas seguintes condições: coluna Waters Resolve C18 5μm (3,9 x 300 mm);

temperatura ambiente, detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS a 276 nm; eluente, solução

de acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; fluxo 0,9 mL/min e volume da amostra

injetada 20μL. As amostras foram previamente diluídas e filtradas em filtro “Sep Pack” C18

(MILLIPORE).

3.4.5 Determinação da Concentração Celular

A concentração celular foi determinada por espectrofotometria a 600 nm, onde a

concentração de células em g/L foi calculada por uma curva padrão que correlaciona a

absorbância a 600 nm e o peso seco das células obtidas do cultivo por 24 horas em meio semi-

sintético empregado no preparo do inóculo.

3.4.6 Determinação do pH

Os valores de pH das amostras foram determinados por potenciometria, por meio de

um aparelho da marca Micronal modelo B 474, com correção de temperatura.

3.5 Metodologia de análise dos resultados

3.5.1 Determinação dos Parâmetros Fermentativos

• Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (YP/S)

O fator de conversão ou fator de rendimento, é aquele que expressa a massa de xilitol

produzido por massa de xilose consumida, em gramas, foi calculado pela equação 1:

YP/S = ΔP = Pf – Pi (1) ΔS Sf - Si

Em que:

Si e Sf correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L);

Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L).

36

• Produtividade Volumétrica de Xilitol (Qp)

A produtividade volumétrica de xilitol expressa a concentração de xilitol produzido

(g/L) por tempo (h), e foi calculada de acordo com a equação 2:

Qp = ΔP = Pf – Pi (2) ΔT Tf - Ti

Em que:

Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L);

Ti e Tf correspondem aos tempos inicial e final de fermentação (h).

• Eficiência de Conversão (η)

Este parâmetro fermentativo expresso em %, representa a razão entre o fator de

rendimento (YP/S) obtido experimentalmente e o fator de rendimento teórico de

0,917gxilitol/gxilose calculado segundo BARBOSA et al. (1988) seguindo a equação 3:

η = (Pf – Pi * 100) (3) (Sf - Si)* 0,917

Em que: Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L);

Si e Sf correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L).

• Velocidade de Consumo

Este parâmetro representa a velocidade de consumo de um composto, calculado pela

variação da sua concentração (g/L) dividida pelo tempo (h) de fermentação, representado pela

equação 4:

V = Cf – Ci (4) Tf - Ti

Em que: Ci e Cf correspondem às concentrações inicial e final do composto analisado (g/L);

Ti e Tf correspondem aos tempos inicial e final de fermentação (h).

37

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Efeito do glicerol na fermentação em meio semi-sintético por C. guilliermondii

O efeito de diferentes concentrações de glicerol (0,3; 0,7; 1,0; 3,5 e 6,5 g/L) sobre a

fermentação de meio semi-sintético por C. guilliermondii foi avaliado empregando-se os

meios de fermentação apresentados na Tabela 4.

Tabela 4 - Características dos meios de cultura contendo diferentes concentrações de glicerol

empregado nas fermentações em meio semi-sintético por C. guilliermondii

Meios de Fermentação Componentes

no meio Controle II III IV V VI

Glicerol (g/L) 0,0 0,34 0,64 1,24 3,33 6,59

Xilose (g/L) 54,61 53,07 53,98 54,03 54,21 55,70

pH 5,78 5,73 5,74 5,82 5,83 5,77

Experimento ausente de xilose e contendo glicerol como única fonte de carbono foi

também realizado, com a finalidade de se verificar o comportamento da levedura frente a essa

nova condição. A concentração inicial de glicerol empregada nesse experimento foi de

52,67 g/L e pH inicial de 5,28.

4.1.1 Consumo de xilose por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em

meio semi-sintético

O efeito de diferentes concentrações de glicerol na fermentação de meio semi-

sintético contendo xilose como fonte de carbono para C. guilliermondii pode ser verificado

pelas variações no consumo desta pentose (Figura 9). Verifica-se nesta figura que o aumento

da concentração de glicerol no meio, particularmente nas concentrações superiores a 1,0 g/L

(3,5 e 6,5 g/L) resultou em maior efeito na assimilação de xilose, já que o consumo desta

pentose, já nas primeiras 10 horas, foi em média 38,2% inferior ao observado nas

fermentações em que o glicerol se encontrava em concentrações mais baixas (0,3 e 0,7 g/L).

Da mesma forma, tal desfavorecimento de consumo de xilose também foi observado nos

meios ausente de glicerol e concentração de 1,0 g/L do mesmo (Figura 10). Nota-se ainda, que

independente da concentração de glicerol no meio, após 48h de fermentação os maiores e

38

menores valores de consumo foram equivalentes a 97,8% e 83,9%, quando as concentrações

de glicerol foram de 0,7 e 6,5 g/L, respectivamente.

Analisando as equações obtidas através da regressão linear do gráfico apresentado na

Figura 9, utilizando o intervalo de maior linearidade (0-48 horas), nota-se que os valores dos

coeficientes lineares se aproximam da concentração inicial de xilose, enquanto os coeficientes

angulares representam a taxa de consumo deste açúcar, os quais apresentam diferenças,

demonstrando que a taxa de consumo de xilose depende das concentrações de glicerol

adicionadas no meio de fermentação.

O favorecimento da assimilação de xilose pela presença de baixas concentrações de

glicerol no meio também pode ser constatada na Tabela 5, em função das maiores velocidades

de consumo de xilose (1,38 e 1,43 g/L.h) verificadas principalmente após 24h nas

fermentações nas quais as concentrações de glicerol foram 0,3 e 0,7 g/L, respectivamente.

Figura 9. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e

6,5 ( ) sobre o consumo de xilose por C. guilliermondii durante fermentação em meio semi-sintético

y = – 1,0682x + 54,345

(R2 = 0,9977)

y = – 1,1288x + 50,789

(R2 = 0,9832)

y = – 1,1490x + 51, 239

(R2 = 0,9817)

y = – 1,0645x + 53,858

(R2 = 0,9960)

y = – 0,9912x + 54,875

(R2 = 0,9983)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Xilo

se (g

/L)

Tempo (h)

y = – 1,005x + 56,153

(R2 = 0,9979)

39

Tabela 5 - Velocidade de consumo de xilose durante fermentação de meio semi-sintético por

C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no meio de fermentação

Velocidade de consumo de xilose (g/L.h)

Adição de glicerol (g/L) Tempo (h)

0,0 0,3 0,7 1,0 3,5 6,5

10 0,99 1,24 1,35 0,94 0,77 0,81

24 1,13 1,38 1,43 1,13 0,98 1,01

34 1,12 1,33 1,36 1,14 1,01 1,04

48 1,04 1,08 1,10 1,03 0,96 0,97

58 0,92 0,91 0,93 0,91 0,88 0,90

72 0,76 0,73 0,75 0,75 0,74 0,76

Em função dos resultados apresentados na Figura 9 e na Tabela 5 é nítido, nas

primeiras 48 h de fermentação, o favorecimento do consumo de xilose (97,8%) pela levedura

com o aumento da concentração de glicerol no meio até 0,7 g/L, sendo que concentrações

superiores a esta promoveram uma redução neste consumo a valores próximos ou inferiores

aos obtidos na fermentações ausente de glicerol.

No caso de um mutante de C. tropicalis, o efeito benéfico do glicerol sobre o

consumo de xilose também foi constatado em fermentador de bancada (KO; RHEE; KIM,

2006). Estes autores observaram que apenas 82% de xilose (50 g/L) foi consumida na

presença de 10 g/L de glicerol, enquanto que aumentos dessa concentração para 20 ou 30 g/L

proporcionaram 100% de consumo no mesmo período. Esse comportamento é semelhante ao

ocorrido no presente trabalho, embora para C. tropicalis se observa que o favorecimento

ocorreu um maior concentração de glicerol.

O favorecimento da assimilação de xilose pela levedura em função da presença de

glicerol no meio também pode estar relacionada à sua capacidade de proteção celular. De

acordo com a literatura o glicerol reduz a quantidade de água na superfície das proteínas

presentes na parede celular dos microrganismos, pela formação de pontes de hidrogênio com

estas proteínas, substituindo a água e mantendo a estabilidade celular (ABADIAS et al.,

2001).

40

4.1.2 Formação de glicerol e etanol por C. guilliermondii em função da concentração de

glicerol em meio semi-sintético

O glicerol e etanol, subprodutos do metabolismo de xilose por C. guilliermondii,

também tiveram suas concentrações no meio influenciadas pela concentração de glicerol

adicionada (Figuras 10 e 11). Estes dois compostos, subprodutos do metabolismo secundário

da bioconversão de xilose em xilitol, foram também encontrados durante diferentes formas de

cultivo de C. guilliermondii em meio sintético (GRANSTRÖN; OJAMO; LEISOLA, 2001;

CORTEZ, 2005).

A produção de glicerol pela levedura ocorreu independente da concentração de

glicerol no meio (Figura 10) e mostrou-se comportar conforme foi verificado na literatura

(NEVOIGT; STAHL, 1997), constatando-se um decréscimo na sua formação com o aumento

da concentração de glicerol adicionada ao meio de fermentação. De fato na Figura 10,

verifica-se que a máxima formação de glicerol (1,71 g/L) observada no experimento controle

(sem adição de glicerol) foi 52% superior à encontrada no meio em que a concentração deste

era máxima (6,5 g/L).

Verifica-se ainda na Figura 10 que o glicerol foi assimilado pela levedura sendo esta

assimilação favorecida nas condições em que este se encontrava em concentrações mais

baixas (0,3 e 0,7 g/L), o que ocorreu coincidentemente com o esgotamento da xilose do meio

nestas condições (Figura 9). Matos (2004) e Silva (2004) também constataram a capacidade

de formação de glicerol pela C. guilliermondii e seu posterior consumo relacionado à escassez

da xilose. É importante relatar também que na fermentação em que o glicerol era a única fonte

de carbono, houve assimilação deste pela levedura (dados não apresentados).

Os possíveis compostos resultantes do metabolismo do glicerol como o butanol,

1,3 propanodiol e butirato conforme descrito na literatura (BIEBL, 2001), não foram

detectados em todas as condições de fermentação empregadas.

41

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Glic

erol

pro

duzi

do (g

/L)

Tempo (h) Figura 10. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e

6,5 ( ) sobre a sua formação por C. guilliermondii durante fermentação em meio semi-sintético

Com relação ao etanol (Figura 11) observa-se a sua formação, a qual foi máxima

(0,47 g/L) quando a concentração de glicerol foi 0,7 g/L, seguido de sua assimilação pela

levedura independente da concentração de glicerol adicionada ao meio. Verifica-se que a

máxima assimilação deste álcool (91,7%) também ocorreu quando a concentração de glicerol

no meio foi 0,7 g/L. O favorecimento da formação de etanol pela levedura na presença de

glicerol (0,7 g/L), pode estar relacionado ao fato desta concentração ter favorecido o consumo

de xilose, obtendo-se o máximo consumo nesta condição (Figura 9). Nota-se ainda na Figura

11, que o aumento da concentração de glicerol para 3,5 ou 6,5 g/L, resultou em concentrações

mais baixas de etanol no meio. Matos (2004) em experimentos com esta mesma levedura em

meio semi-sintético também constatou a formação de etanol como subproduto do metabolismo

de xilose por esta levedura, sendo a máxima concentração obtida quatro vezes superior à

observada no presente trabalho.

42

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Etan

ol (g

/L)

Tempo (h) Figura 11. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e

6,5 ( ) sobre a formação de etanol por C. guilliermondii durante fermentação em meio semi-sintético

4.1.3 Formação de xilitol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em

meio semi-sintético

A concentração de glicerol adicionada ao meio de fermentação também influenciou a

formação de xilitol por C. guilliermondii, semelhante ao ocorrido para formação de glicerol e

etanol (Figura 12). A máxima produção de xilitol (38,72 g/L), observada após 58 h, foi

alcançada na fermentação controle (ausente de glicerol). Pela análise das equações obtidas

através da regressão linear do gráfico apresentado na Figura 12 e utilizando o intervalo de

maior linearidade (0-34 horas), nota-se através dos valores dos coeficientes angulares obtidos,

que a velocidade de formação de xilitol foi dependente da concentração de glicerol

adicionada, sendo esta favorecida pela adição de baixas concentrações do mesmo, semelhante

ao observado para a velocidade de consumo de xilose (Figura 9) e de formação dos

subprodutos glicerol (Figura 10) e etanol (Figura 11). O maior efeito exercido pelas baixas

concentrações de glicerol (0,3 e 0,7 g/L) pode ser verificado após 34 h de fermentação,

encontrando-se aumentos de 17,8% e 18,8%, respectivamente na formação de xilitol, em

comparação à fermentação ausente deste. Ainda na Figura 12, verifica-se que nas

fermentações em que as concentrações de glicerol adicionadas ao meio foram inferiores a

3,5 g/L ocorreu pequeno decréscimo na concentração de xilitol, sugerindo a sua assimilação

pela levedura. De acordo com os resultados o decréscimo da concentração de xilitol foi abaixo

43

de 1,5% (Figura 12), notando-se nesse período uma tendência de estabilidade na produção de

xilitol, coincidindo com o esgotamento de xilose. A utilização do xilitol por C. guilliermondii

em meio semi-sintético foi também constatada por outros autores (FELIPE et al., 1995;

PALLADINO; SILVA; FELIPE, 2003), bem como durante o crescimento desta levedura em

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana (RODRIGUES et al., 2003c; MATOS, 2004).

As leveduras Pichia guilliermondii (LEATHERS; GUPTA, 1997) e C. tropicalis

(WALTHER; HENSIRISAK; AGBLEVOR, 2001) também foram relatadas como capazes de

assimilar o xilitol nas fermentações de meio sintético.

É importante mencionar que não foi verificado formação de xilitol em meio no qual

o glicerol foi utilizado como única fonte de carbono (dados não apresentados).

* y = 0,8643x -0,737 (R2 = 0,9982)

* y = 1,0515x – 0,169 (R2 = 0,9991)

* y = 1,0750x – 0,143 (R2 = 0,9976)

* y = 0,8746x – 0,674 (R2 = 0,9984)

* y = 0,7772x – 0,835 (R2 = 0,9972)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720

5

10

15

20

25

30

35

40

Xilit

ol (g

/L)

Tempo (h)

* y = 0,7849x – 0,8179 (R2 = 0,9974)

Figura 12. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 (*); 0,3 (*); 0,7 (*); 1,0 (*); 3,5 (*) e 6,5 (*)

sobre a formação de xilitol por C. guilliermondii durante fermentação em meio semi-sintético

O favorecimento da bioconversão de xilose em xilitol pela presença de glicerol no

meio semi-sintético é confirmado pelos valores de fator de conversão de xilose em xilitol e

produtividade apresentados na Figura 13. Semelhante ao ocorrido para o consumo de xilose,

formação de glicerol e etanol, a adição de baixas concentrações de glicerol (0,3 e 0,7 g/L) ao

meio de fermentação resultou em favorecimento destes parâmetros, sendo que o tempo 24 h

resultou nos máximos valores de fator de conversão (YP/S = 0,78 g/g e YP/S = 0,79 g/g) e de

produtividade volumétrica (QP = 1,08 g/L.h e QP = 1,13 g/L.h) de xilitol. Nota-se ainda uma

44

tendência de decréscimo destes valores com o decorrer das fermentações, bem como se

observa menor variação nos valores destes parâmetros após 48 h pra as diferentes

concentrações de glicerol empregadas. É importante verificar também nesta figura que os

máximos valores destes parâmetros (YP/S e QP) foram em média 5,7% e 24,2%

respectivamente maiores, em relação à fermentação na qual o glicerol não foi adicionado e

que a produtividade foi o parâmetro mais influenciado pela adição de glicerol no meio.

O efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol foi também avaliado nas

pesquisas com C. tropicalis, nas quais foi empregada um mutante desta levedura obtido da

deleção do gene da enzima xilitol desidrogenase (XLY2), o qual foi cultivado em meio

constituído por xilose e diferentes concentrações de glicerol (KO; RHEE; KIM, 2006). Nestas

condições foram alcançados fator de rendimento e produtividade de 0,97 g/g e 3,2 g/L.h

respectivamente, quando 20 g/L de glicerol foi empregado juntamente com 50 g/L de xilose,

confirmando também que para esta levedura o maior efeito do glicerol foi sobre a

produtividade. Os mesmos autores sugerem que o passo metabólico da transformação de

xilitol em D-xilulose em Candida sp. poderia ser bloqueado pela deleção do gene da enzima

responsável por esse passo e o emprego de glicerol como co-substrato para crescimento

celular e regeneração de NADPH foram responsáveis pelo elevado valor de rendimento e

produtividade alcançados.

45

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

0 ,7

0 ,8

0 ,9

1 ,0

6,5

g/L

6,5

g/L

6,5

g/L

6,5

g/L

6,5

g/L

6,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L1,0

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L0,

7 g/

L

0,7

g/L

0,7

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L0,3

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L

0 g/

L

0 g/

L

0 g/

L0 g/

L

0 g/

L

0 g/

L

QP (g/L.h)

Y P/S (g

/g)

T e m p o ( h )0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

1 ,4

1 ,6

1 ,8

2 ,0

7 25 84 83 42 41 0

Figura 13. Efeito de diferentes concentrações de glicerol sobre o fator de conversão de xilose em xilitol (YP/S ) e produtividade de xilitol (QP ) durante

fermentação no meio semi-sintético por C. guilliermondii

46

4.1.4 Crescimento celular de C. guilliermondii e variação do pH em função da

concentração de glicerol em meio semi-sintético

O crescimento de C. guilliermondii foi diferentemente influenciado pela

concentração de glicerol no meio, uma vez que pela Figura 14 verifica-se já nas primeiras 10

horas de cultivo, aumento de 35% na concentração celular em meio contendo somente

glicerol como fonte de carbono em relação à fermentação contendo apenas xilose. Após 72 h

encontrou-se que a fermentação na qual o glicerol foi a única fonte de carbono, obteve-se a

máxima concentração celular (5,34 g/L) (Figura 14).

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

Con

cent

raçã

o ce

lula

r (g/

L)

Tempo (h) Figura 14. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ) ; 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( );

6,5 ( ) e 53,0 ( ) sobre a concentração celular de C. guilliermondii durante fermentação em meio

semi-sintético

Estes resultados indicam que o glicerol é melhor fonte de carbono para crescimento

de C. guilliermondii em relação à xilose. Em trabalhos prévios com esta mesma levedura

realizados por Arruda et al. (2005) ficou evidenciado o papel benéfico do glicerol para o

crescimento da levedura em meio semi-sintético, uma vez que no meio em que este foi

empregado como única fonte de carbono, a formação de biomassa foi 34,44% superior a

encontrada em meio contendo apenas xilose.

Ko, Rhee e Kim (2006) constataram que o aumento da concentração de 10 g/L para

30 g/L de glicerol no meio de fermentação contendo 50 g/L de xilose proporcionou a

formação do dobro de biomassa de um mutante de C. tropicalis, evidenciando mais uma vez

47

que o glicerol é uma excelente fonte de carbono para crescimento celular. Experimentos com

as leveduras Candida boidini, Candida shehatae, Pichia stipitis (VANDESKA et al., 1995) e

Candida tropicalis (YAHASHI et al., 1996) também revelaram a capacidade dessas leveduras

em assimilar o glicerol.

Análises microscópicas ao final das fermentações realizadas no presente trabalho

revelaram que a viabilidade das células se manteve constante (100%) para todas as condições

avaliadas.

Com relação ao pH nota-se na Figura 15 uma rápida diminuição deste para valores

próximos a 2,7, já nas primeiras 10 h de fermentação, seguido de um lento decréscimo ao

longo do período, alcançando após 72 h valores de pH próximos a 2,2, independente da

presença ou não de glicerol no meio. Este decréscimo do pH já foi observado nas

fermentações de meio semi-sintético por esta levedura (FELIPE et al., 1995; ARRUDA et al.,

2005).

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

pH

Tempo (h) Figura 15. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( );

6,5 ( ) e 53,0 ( ) sobre o pH durante fermentação em meio semi-sintético por C. guilliermondii

48

4.2 Efeito do glicerol na fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

por C. guilliermondii

4.2.1 Caracterização do hidrolisado hemicelulósico empregado nas fermentações

As características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar

empregado como meio de fermentação com a finalidade de se avaliar o efeito do glicerol

sobre a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii pode ser vista na Tabela 6.

Este hidrolisado obtido do processo de hidrólise ácida de bagaço de cana-de-açúcar (MATOS,

2004; SILVA, 2004), se encontrava concentrado a vácuo, cujo teor inicial de xilose foi

aumentado em 4 vezes e em seguida este foi submetido ao tratamento descrito na metodologia

(item 3.1) visando a sua destoxificação.

Tabela 6 - Caracterização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar anterior e

posterior ao tratamento.

Características Concentrado Tratado

pH 0,53 5,84

Açúcares (g/L)

Xilose 71,01 58,53

Glicose 3,90 3,08

Arabinose 4,67 4,09

Ácidos carboxílicos (g/L)

Ácido acético 3,68 2,98

Furanos (g/L)

Furfural 0,074 0,010

Hidroximetilfurfural 0,012 0,0035

Compostos fenólicos (g/L)

ρ-hidroxibenzóico Nd Nd

Ácido vanílico 0,022 0,0097

Ácido siríngico 0,012 0,0055

Vanilina 0,053 0,0115

Seringaldeído 0,813 0,1068

Ácido Ferúlico 0,316 0,0549

Nd: não detectado por cromatografia líquida

Os dados da Tabela 6 confirmam ser a xilose o açúcar predominante no hidrolisado

de bagaço de cana, seguido da arabinose e da glicose, conforme já relatado por Matos (2004)

e Silva (2004). Nota-se que as concentrações de arabinose e glicose são 15 e 18 vezes

49

respectivamente inferiores à de xilose presente no hidrolisado concentrado. A glicose, hexose

considerada inibitória à bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii em função de

sua concentração no meio (FELIPE et al., 1993; ROSA et al., 1998; SILVA, 2004) está

presente em baixas concentrações no hidrolisado (Tabela 6). Segundo Yahashi et al. (1996)

esta hexose favorece o processo fermentativo, uma vez que é fonte de carbono preferencial

para a levedura no início do seu crescimento. Segundo Kim et al. (1999), o consumo inicial de

glicose pela levedura e conseqüente aumento de massa celular favorece a utilização de xilose

para a produção de xilitol e segundo Silva e Felipe (2006) o favorecimento de xilitol durante

fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii foi

observado quando a proporção entre glicose:xilose foi 1:5.

Verifica-se ainda na Tabela 6, que além dos açúcares estão presentes também

compostos tóxicos aos microrganismos como ácido acético (3,68 g/L), furfural (0,074 g/L),

hidroximetilfurfural (0,012 g/L), ácido vanílico (0,022 g/L), ácido siríngico (0,012 g/L),

vanilina (0,053 g/L), seringaldeído (0,813 g/L) e ácido ferúlico (0,316 g/L), originados

durante o processo de hidrólise da biomassa lignocelulósica (FELIPE, 2004a).

Uma vez que o hidrolisado foi tratado com carvão ativado para a sua destoxificação,

os teores de compostos tóxicos e açúcares foram novamente determinados e os resultados da

Tabela 6 mostram redução nos teores desses compostos após o tratamento tornando o

hidrolisado um meio de cultivo mais favorável para o crescimento da levedura, em função da

redução principalmente dos compostos fenólicos.

As características dos meios formulados a base do hidrolisado tratado, os quais

continham diferentes concentrações de glicerol para se avaliar o efeito deste na bioconversão

de xilose em xilitol, podem ser vistas na Tabela 7.

Tabela 7 - Características dos meios de cultura contendo diferentes concentrações de glicerol

empregado nas fermentações em hidrolisado por C. guilliermondii.

Meios de Fermentação Componentes

no meio Controle II III IV V VI

Glicerol (g/L) 0,0 0,279 0,652 1,232 3,430 6,704

Xilose (g/L) 54,00 54,30 54,11 54,79 59,73 59,07

Glicose (g/L) 3,55 3,59 3,56 3,77 3,64 3,67

Arabinose (g/L) 3,68 3,83 3,77 3,92 4,15 4,14

Ácido acético (g/L) 3,38 3,27 3,32 3,30 3,64 3,57

pH 5,97 5,81 5,85 6,05 5,82 5,82

50

4.2.2 Consumo de açúcares e ácido acético por C. guilliermondii em função da

concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

A assimilação de xilose por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana também foi influenciada pela concentração de glicerol no

meio (Figura 16), sendo que o máximo consumo de xilose (97,8%) foi observado após 72 h

quando se utilizou 1,0 g/L de glicerol. Nesta concentração, verifica-se aumento superior a

22,6% no consumo desta pentose após 58 h, em relação à fermentação em que o glicerol se

encontrava em menor concentração (0,3 g/L), a qual propiciou ao final da fermentação menor

consumo dessa pentose (88,5%), embora valor semelhante de consumo (91,9%) foi observado

quando se empregou 0,7 g/L de glicerol.

Analisando as equações obtidas através da regressão linear do gráfico apresentado

na Figura 16, utilizando o intervalo de maior linearidade (0-58 horas), nota-se que os valores

dos coeficientes lineares se aproximam da concentração inicial de xilose, enquanto os

coeficientes angulares representam a taxa de consumo deste açúcar, os quais apresentam

diferenças, demonstrando mais uma vez que a taxa de consumo de xilose foi dependente das

concentrações de glicerol no meio de fermentação, como já foi observado durante

fermentações de meio semi-sintético. A velocidade de consumo de xilose (aproximadamente

0,70 g/L.h) foi baixa na presença de baixas concentrações de glicerol (0,3 e 0,7 g/L), enquanto

que o aumento dessas concentrações para 1,0 g/L resultou em valor próximo a 0,90 g/L.h.

Pode-se verificar também pela Figura 16 e Tabela 8 que nas primeiras 10 h, a

velocidade de consumo de xilose é baixa, aumentando após esse tempo, quando toda a glicose

já havia sido consumida do meio (Figura 17), conforme já constatado em outros trabalhos

com esta levedura (SILVA, 2004).

Nota-se após 10 h (Tabela 8) que quando se utilizou 1,0 g/L de glicerol a máxima

velocidade de consumo de xilose foi 30,4% maior em relação à fermentação em que se

empregou somente 0,3 g/L de glicerol, coincidente com a menor velocidade de consumo. O

consumo mais lento de xilose na presença de menores concentrações de glicerol pode estar

relacionado ao papel desse composto como protetor celular em condição de estresse

(NEVOIGT; STAHL, 1997), já que o hidrolisado continha compostos tóxicos à levedura

mesmo após o tratamento (Tabela 6). Os resultados do presente trabalho evidenciam o papel

do glicerol como protetor celular, uma vez que a fermentação do hidrolisado requereu maior

concentração de glicerol (1,0 g/L) para favorecer a assimilação de xilose (97,8%) pela

levedura em comparação à necessária quando se utilizou meio semi-sintético (ausente de

51

compostos tóxicos) no qual o máximo consumo desta pentose (99,7%) ocorreu quando em

concentração inferior de glicerol.

y = – 0,8795x + 55,613

(R2 = 0,9972)

y = – 0,7112x + 56,822

(R2 = 0,9945)

y = – 0,7566x + 56,449

(R2 = 0,9960)

y = – 0,9188x + 55,818

(R2 = 0,9980)

y = – 0,8423x + 61,331

(R2 = 0,9983)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Xilo

se (g

/L)

Tempo (h)

y = – 0,8862x + 61,114

(R2 = 0,9977)

Figura 16. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e

6,5 ( ) sobre o consumo de xilose por C. guilliermondii durante fermentação no hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana

Tabela 8 - Velocidade de consumo de xilose durante fermentação de hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no meio de fermentação.

Velocidade de consumo de xilose (g/L.h)

Adição de glicerol (g/L) Tempo (h)

0,0 0,3 0,7 1,0 3,5 6,5

10 0,50 0,27 0,35 0,64 0,59 0,50

24 0,79 0,53 0,62 0,87 0,74 0,76

34 0,86 0,64 0,66 0,92 0,77 0,83

48 0,87 0,67 0,72 0,92 0,82 0,84

58 0,84 0,68 0,73 0,88 0,83 0,86

72 0,73 0,67 0,69 0,74 0,78 0,79

52

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Arabinose (g/L)G

licos

e (g

/L)

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Figura 17. Efeito da adição de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e 6,5 ( )

sobre o consumo de glicose ( ) e arabinose ( ) por C. guilliermondii durante fermentação no

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

Com relação ao efeito do glicerol sobre a assimilação de arabinose (Figura 17),

observa-se um lento consumo desta pentose no início das fermentações, no entanto ocorreu

aumento da velocidade de consumo desta pentose, atingindo o máximo valor de 18,5%

quando se empregou 1,0 g/L de glicerol ao final da fermentação (72 h). O aumento da

velocidade de consumo de arabinose possivelmente se deve ao esgotamento inicial de glicose

e a diminuição da concentração de xilose (Figura 16), levando a levedura a recorrer de outras

fontes de carbono para a sua manutenção. O lento consumo de arabinose no início da

fermentação seguido do aumento da velocidade deste ao final do processo já foi observado em

fermentações de outros hidrolisados por esta mesma levedura, como no de casca de aveia

(TAMANINI et al., 2004), aparas de eucalipto (CANETTIERI; ALMEIDA E SLVA;

CARVALHO JR, 2003) e palha de arroz (ROBERTO et al., 1994), assim como em

hidrolisado de bagaço de cana (SENE et al., 2001b; RODRIGUES et al., 2003b).

O ácido acético presente junto aos açúcares no hidrolisado, também foi lentamente

assimilado pela levedura (Figura 18). Nota-se nesta figura que independente da concentração

de glicerol no meio, a velocidade de consumo deste foi semelhante para todas as condições

avaliadas, uma vez que o coeficiente angular se aproxima de 0,03 g/L.h. Verifica-se ainda

nesta figura que o máximo consumo deste ácido (67,1%) ocorreu após 72 h quando se

53

empregou 0,7 g/L de glicerol, enquanto que a condição de menor assimilação (57,8%) ocorreu

no meio em que se adicionou 3,5 g/L de glicerol. A capacidade de assimilação deste ácido por

C. guilliermondii já foi observada em meio semi-sintético (FELIPE et al., 1995) e também em

hidrolisado de bagaço de cana (FELIPE et al., 1997b; SENE et al., 2000; SILVA, 2001;

SILVA et al., 2004c).

Quanto ao pH de fermentação em função da concentração de glicerol no hidrolisado

hemicelulósico de bagaço (Figura 19), nota-se um rápido decréscimo nas primeiras 10 h para

todas condições avaliadas, seguido de aumento deste após este período. Este comportamento

também foi observado em trabalhos com esta mesma levedura durante a produção de xilitol a

partir de hidrolisado de bagaço de cana, porém em fermentador de bancada (MORITA;

SILVA; FELIPE, 2000). Segundo esses autores, a rápida diminuição do pH é comum em

leveduras por causa da alta permeabilidade da membrana celular à cátions e íons hidrogênio,

já o aumento deve-se ao consumo de ácido acético presente no hidrolisado.

y = -0,0327x + 3,4328

(R2 = 0,9952)

y = -0,0288x + 3,3366

(R2 = 0,9967)

y = -0,0330x + 3,3599

(R2 = 0,9955)

y = -0,02940 + 3,3545

(R2 = 0,9975)

y = -0,02989x + 3,6235

(R2 = 0,9957)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Ácid

o ac

étic

o (g

/L)

Tempo (h)

y = -0,03073x + 3,6049

(R2 = 0,9969)

Figura 18. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e

6,5 ( ) sobre o consumo de ácido acético por C. guilliermondii durante fermentação no hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana

54

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 725,7

5,8

5,9

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

pH

Tempo (h)

Figura 19. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 (*); 0,3 (*); 0,7 (*); 1,0 (*); 3,5 (*) e 6,5 (*)

sobre o pH durante fermentação no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por

C. guilliermondii

4.2.3 Formação de glicerol e etanol por C. guilliermondii em função da concentração de

glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

Os compostos glicerol e etanol também foram formados durante as fermentações do

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana nas quais diferentes concentrações de glicerol

foram adicionadas (Figuras 20 e 21).

Semelhante ao já observado durante as fermentações em meio semi-sintético (Figura

10), observa-se na Figura 20, que a produção de glicerol pela levedura foi verificada

independente da concentração de glicerol adicionada no meio. Ainda na Figura 20 pode ser

observado a rápida formação de glicerol já nas primeiras 10 h de fermentação, coincidente

com o esgotamento da glicose do meio nestas condições (Figura 17). Destaca-se, contudo que

o glicerol formado não é oriundo apenas desta hexose, já que nas fermentações em meio semi-

sintético, contendo apenas xilose como fonte de carbono, também foi constatado a sua

formação nas primeiras 10 h (Figura 10).

Nota-se ainda na Figura 20, uma relação direta entre o decréscimo da concentração

de glicerol formado e a redução da concentração de glicerol adicionada ao hidrolisado, exceto

na ausência deste. De fato, na condição de ausência de glicerol (controle), verifica-se que a

sua máxima formação (1,3 g/L), foi 33% superior à encontrada no meio em que a

concentração deste era de 0,7 g/L.

55

Matos (2004) verificou na fermentação de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana por esta mesma levedura que houve menor formação de glicerol ao se adaptar o inóculo

ao hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, indicando que essa técnica possivelmente

promoveu uma diminuição do efeito dos compostos tóxicos presente no hidrolisado.

Da mesma forma que já mencionado nas fermentações em meio semi-sintético, não

se detectou em todas as condições empregadas os compostos oriundos do metabolismo de

glicerol conforme descrito na literatura, como o butanol, 1,3 propanodiol e butirato (BIEBL,

2001).

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Glic

erol

pro

duzi

do (g

/L)

Tempo (h) Figura 20. Efeito da adição de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e 6,5 ( )

sobre a formação de glicerol por C. guilliermondii durante fermentação no hidrolisado hemicelulósico

de bagaço de cana

Com relação ao etanol, verifica-se que houve um rápido aumento de sua

concentração nas primeiras 10 h e decréscimo deste após 24 h independente da concentração

de glicerol no meio (Figura 21), semelhante ao verificado em meio semi-sintético (Figura 11).

A máxima formação de etanol (2,89 g/L) ocorreu em 24h para a condição em que foi

adicionada 3,5 g/L de glicerol, valor semelhante ao observado com o aumento da

concentração de glicerol no meio para 6,5 g/L. É importante mencionar ainda que o efeito da

concentração de glicerol na fermentação do hidrolisado difere do observado em meio semi-

sintético, pois no caso do hidrolisado a formação de etanol foi favorecida em altas

concentrações de glicerol e não em baixas como no meio semi-sintético (Figura 11). Além

56

disto, maior concentração de etanol (2,9 g/L) foi encontrada no hidrolisado, quando

comparado ao meio semi-sintético, no qual apenas 0,47 g/L foi a concentração máxima. Este

comportamento é possivelmente devido à presença no hidrolisado de glicose junto à xilose.

É importante considerar ainda que a máxima formação de etanol (24 h) foi 28,5%

maior em relação à condição de menor formação que ocorreu quando se utilizou 1,0 g/L de

glicerol (Figura 21).

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Etan

ol (g

/L)

Tempo (h) Figura 21. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( ); 3,5 ( ) e

6,5 ( ) sobre a formação de etanol por C. guilliermondii durante fermentação no hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana

4.2.4 Formação de xilitol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

A formação de xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado também foi influenciada

pela concentração de glicerol no meio, conforme pode ser verificado na Figura 22. Ainda

nessa figura observa-se que durante as 58 h de fermentação, a concentração de 1,0 g/L de

glicerol foi a que favoreceu a produção de xilitol, coincidindo com a mesma condição de

favorecimento de consumo de xilose (Figura 16). Esse favorecimento pode ser confirmado

pelos valores dos coeficientes angulares das equações obtidas fazendo regressão linear do

gráfico apresentado na Figura 22, utilizando intervalo de maior linearidade (10-48h).

Embora a máxima velocidade de produção de xilitol (0,78 g/L.h) tenha ocorrido na

condição em que 1,0 g/L de glicerol foi adicionado ao hidrolisado, a utilização de

57

concentrações superiores a esta propiciaram maiores concentrações de xilitol (41,2 g/L e

41,9 g/L) após 72 h, obtidos com utilização de 3,5 g/L e 6,5 g/L de glicerol, respectivamente

(Figura 22).

O efeito benéfico do aumento da concentração do glicerol no hidrolisado sobre a

formação de xilitol pela levedura é verificado desde o início das fermentações, pois a

utilização de concentrações mais baixas de glicerol (0,3 e 0,7 g/L) resultou em menores

concentrações de xilitol durante todo o cultivo (Figura 22), coincidente com a menor

velocidade de consumo de xilose nestas condições (Tabela 8).

Na Figura 23 pode ser observada a evolução dos valores de fator de conversão de

xilose em xilitol e produtividade de xilitol durante as fermentações em função das

concentrações de glicerol no meio. Nota-se ainda nesta figura que as condições que

favoreceram a produtividade de xilitol diferiram daquelas em que se obteve o máximo fator

de rendimento. Isto se justifica pelo fato de que a máxima produtividade (QP = 0,71 g/L.h)

ocorreu quando se utilizou 1,0 g/L de glicerol após 48 h e o máximo fator de conversão

(YP/S = 0,78 g/g) ocorreu na presença de máxima concentração de glicerol no hidrolisado

(6,5 g/L) neste mesmo período de tempo. Verifica-se que a adição de 1,0 g/L de glicerol ao

hidrolisado proporcionou os máximos valores de produtividade desde as primeiras horas de

fermentação, só diminuindo ao final do processo devido ao esgotamento da xilose do meio

(Figura 16). De acordo com os resultados apresentados, a máxima produtividade de xilitol

praticamente não diferiu daquela na qual o glicerol não foi adicionado, porém este parâmetro

foi 27,1% maior em relação à condição na qual a concentração de glicerol foi mínima

(0,3 g/L).

É importante destacar ainda na Figura 23, que a adição de glicerol ao hidrolisado no

início das fermentações foi primordial à obtenção de elevados parâmetros fermentativos, pois

seu efeito benéfico pode ser verificado até 58 h, uma vez que a partir desse tempo os valores

desses parâmetros se assemelham como conseqüência do esgotamento da xilose do meio

(Figura 16).

58

* y = 0,7172x – 3,436 (R2 = 0,9999)

* y = 0,5822x -3,731 (R2 = 0,9984)

* y = 0,6163x – 4,329 (R2 = 0,9980)

* y = 0,7790x – 3,374 (R2 = 0,9976)

* y = 0,6709x – 3,763 (R2 = 0,9982)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720

5

10

15

20

25

30

35

40

45X

ilitol

(g/L

)

Tempo (h)

* y = 0,7125x – 3,952 (R2 = 0,9975)

Figura 22. Efeito da adição de glicerol (g/L): 0,0 (*); 0,3 (*); 0,7 (*); 1,0 (*); 3,5 (*) e 6,5 (*) sobre a

formação de xilitol por C. guilliermondii durante fermentação no hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana

59

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

0 ,7

0 ,8

0 ,9

1 ,0

6,5

g/L

6,5

g/L6,5

g/L

6,5

g/L

6,5

g/L6,

5 g/

L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

3,5

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

1,0

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L

0,7

g/L 0,3

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L

0,3

g/L 0 g/

L

0 g/

L

0 g/

L

0 g/

L0 g/

L

0 g/

L

QP (g/L.h)

Y P/S (g

/g)

T e m p o (h )0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

1 ,4

1 ,6

1 ,8

2 ,0

7 25 84 83 42 41 0

Figura 23. Efeito da adição de diferentes concentrações de glicerol sobre o fator de conversão de xilose em xilitol (YP/S ) e produtividade de xilitol (QP )

durante fermentação no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii

60

4.2.5 Crescimento celular de C. guilliermondii em função da concentração de glicerol

no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

No geral, as diferentes concentrações de glicerol adicionadas ao hidrolisado

não resultaram em diferenças marcantes na concentração final de células (Figura 24),

semelhante ao observado em meio semi-sintético (Figura 14), porém o máximo

crescimento celular em hidrolisado (6,08 g/L) foi superior ao máximo valor encontrado

em meio semi-sintético (5,34 g/L), no qual somente glicerol foi empregado como fonte

de carbono. É importante considerar ainda que a condição que propiciou a máxima

concentração celular coincide com aquela em se se observou maoir consumo de ácido

acético (Figura 18) e menor formação de glicerol (Figura 20).

Não foi observado mortalidade de C. guilliermondii em todos as condições

empregadas, semelhante ao cultivo da mesma levedura em meio semi-sintético,

indicando a capacidade dessa de se adaptar e manter seu crescimento no hidrolisado

tratado conforme descrito anteriormente (item 3.1).

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 720,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

Con

cent

raçã

o ce

lula

r (g/

L)

Tempo (h) Figura 24. Efeito da concentração de glicerol (g/L): 0,0 ( ); 0,3 ( ); 0,7 ( ); 1,0 ( );

3,5 ( ) e 6,5 ( ) sobre a concentração celular de C. guilliermondii cultivada no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana.

61

5 CONCLUSÕES

Os resultados do presente trabalho permitem concluir que:

- O glicerol favoreceu a bioconversão de xilose em xilitol por

Candida guilliermondii FTI 20037 tanto em fermentação de meio semi-sintético quanto

de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.

- O efeito benéfico do glicerol nesse metabolismo foi dependente de sua

concentração nos meios de fermentação.

- O tipo de meio de fermentação interferiu na produtividade de xilitol uma vez

que a utilização de meio sintético resultou em aumento de 37% no valor deste parâmetro

(QP = 1,13 g/L.h) em comparação ao máximo obtido durante fermentação em

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana (QP = 0, 71 g/L.h). Por outro lado, não se

observou diferenças quanto ao fator conversão de xilose em xilitol em função do tipo de

meio empregado, já que a máxima produtividade em ambos os meios foram alcançados

valores próximos (YP/S = 0,78 e 0,79 g/g).

- A concentração de glicerol requerida para o favorecimento da bioconversão

de xilose em xilitol diferiu em função do tipo de meio de fermentação empregado, uma

vez que maiores concentrações de glicerol foram requeridas para o hidrolisado.

- O glicerol, subproduto da bioconvresão de xilose em xilitol por

C. guilliermondii, foi detectado em todas as condições avaliadas independente do tipo

de meio de fermentação, entretanto, seu máximo valor (1,7 g/L) ocorreu quando se

empregou meio sintético no qual este não foi adicionado no início do processo.

- A formação de baixas concentrações de etanol por C. guilliermondii foi

verificada em todas as condições avaliadas independente da concentração de glicerol

adicionada ao meio de fermentação.

62

- A levedura C. guilliermondii foi capaz de assimilar o ácido acético, presente

no hidrolisado independente da concentração de glicerol adicionada ao meio de

fermentação.

- Não foram verificadas diferenças marcantes nas concentrações finais de

células cultivadas em meio semi-sintético e hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana-de-açúcar em função presença de glicerol.

Dessa forma, os resultados alcançados permitiram evidenciar o efeito benéfico

do glicerol sobre a produção de xilitol independente do tipo de meio empregado,

entretanto, a concentração de glicerol adicionada aos meios interferiu nesse bioprocesso.

63

6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

- Avaliar a produção de xilitol por C. guilliermondii a partir de hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana em processo contínuo ou descontínuo-alimentado

com adição de glicerol em pulsos.

- Estudar a adaptação do inóculo ao próprio hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana contendo glicerol.

64

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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