troca genética entre bactérias -...

Conteúdos

￭ Mutações – bases moleculares; point mutation; rearrangements; mutações induzidas; taxa de mutação

￭ Troca Genética entre Bactérias – recombinação; transformação; transdução; conjugação; complementação

￭ Sequênciação e síntese de DNA

￭ Clonagem Molecular

Mutações

Mutação - Qualquer alteração permanente no material genético

Selvagem - Estirpe portadora do genótipo anterior à mutação

Mutante - Estripe portadora de uma mutação

Causas

Erros de replicação durante a divisão celular;

Exposição a radiação;

Exposição a agentes químicos;Vírus;

Deliberadamente sobe controlo celular em processos como a meioseou hipermutação;

Mutações

Auxotróficos para Leucina tratados com nitrosoguanina ou U.V.

Apenas os mutantes crescem

Genótipo- “set” de genes

Fenótipo- “aparência”

-LEU +LEU

Auxotróficospara Leucina

-LEU +LEU

Mutação

Selectiva (p.e. resitência a antibióticos)Confere qualquer tipo de vantagem ao organismo portador;

Não Selectiva (p.e. pigmento)Apesar de apresentarem um fenótipo diferente, não possuemqualquer vantagem;

Mutação

Espontânea Radiação Natural, Recombinação e Replicação;Frequência muito baixa

Induzida (Mutagénicos)Agentes químicos, físicos e biológicos aumentam a frequência de mutação

Mutações

Bases Moleculares das Mutações

MutaçãoEspontânea

“Point Mutation” (Replicação)Alterações subtis, que envolvem 1 ou poucos nucleótidos;

“Rearrangements” (Recombinação)Alterações mais extensas que envolvem segmentos de centenas ou milhões de nucleótido;

“Point Mutation”

Substituição de pares de bases

“Frameshift Mutation”

Transições- Substituição entre purinas ou entre pirimidinas;

Transversões- Substituição entre uma purina e uma pirimidina, ou vice-versa;

Microdelecção- delecção de uma base;

Microinsersão- insersão de uma base;

“Point Mutation” Substituição de pares de bases

O efeito de uma mutação depende do seu contexto genético

Substituição fora de um gene

Mutação silenciosa

Dentro de um gene

Nonsense Protein

Missense ProteinFibrose cistica

sickle-cell disease

“Point Mutation” Substituição de pares de bases

5´• • • T A C • • •

• • • A T G • • • 5´

Faultyprotein

Incompleteprotein

Normal protein

Normal protein

T A CA T G

U A C

Tyrosincodon

T A TA T A

U A T

Tyrosincodon

T A GA T C

U A G

STOPcodon

A A GT T C

A A C

Asparaginecodon

MutationNormal

Replication

Missenesemutation

Nonsensemutation

Silentmutation

Wild type

Transcription

Translation

“Point Mutation” “Open Reading Frame” ORF

RBSTATA Box

AGAGTATCTATATAATGGACATACAATATAAGCTTTTATAATAAAGGGAATTTCAAATGATATTATACA

“Point Mutation” “Operon”

An operon is a group of key nucleotide sequences including an operator,a common promoter, and one or more structural genes that are controlled as a unit to produce messenger RNA (mRNA). Operons occur primarily in prokaryotes and nematodes

“Point Mutation” “Frameshift Mutation”

As microinserções ou as microdelecções só são mutações “frameshift” se ocorrerem numa região codificante, ou seja, dentro de uma “Open Reading Frame”.

Missense Protein

Val Pro Cys

Val Pro Val

Val Leu

“Rearrangements”

5´• • • T A T C • • •

5´• • • T A G C T G C A T C • • •

Regiões do DNA que são eliminadas, podendo levar à perda de informação.

Papel muito importante na diversidade bacteriana.

Delecções

Infertilidade

Distrofia muscular Duchenne

Novas bases são adicionadas ao DNA, inactivando o gene no qual são inseridas.

Transposões, sequências de 700-1400 pb


Inserções

5´• • • T A G C T G C A T C • • •

5´• • • T A G C T T C A G G G C A T C • • •


Translocações

Grandes porções de um cromossama são colocados num outro.


5´• • • G C T A C G A A T C • • •

5´• • • G C T A C T C A G G G A A T C • • •


Inversões

A orientação de um dado segmento de DNA é invertida, em relação ao DNA vizinho.


5´• • • T A G C T G G A C T G C A T C • • •

Taxa de Mutação

Replicação de DNA - 10-7-10-11/base durante um ciclo de replicação (DNA polimerase)

Gene - 10-4-10-8/geração

Cultura de 108 células/ml vários mutantes/ml

Transposições 10-4 (mais frequentes)

Mutações “Non-sense” 10-6-10-8

Sequências de DNA – “short repeat” – “hot spots”

Mutações Induzidas

Agentes químicos e biológicos mutagénicos

ROS

Agentes alquilantes

Análogos de bases

Agentes intercalaresIntercalam-se entre 2 bases

Microinserções/MicrodelecçõesBrometo de etídeo

Actuam directamente no DNA, alterando o emparelhamento das bases

Mitomicina, Nitosoguanidine.

Análogos a purinas e pirimidinas, mas com diferentes propriedades de ligação

Mutações Induzidas

Radiação Mutagénica

IonizanteRaios X, raios cósmicos, radiação gamaNão Ionizante

Radiação U.V. Ioniza água produzindo ROS – OH.Dímeros de piridimidinas

Troca Genética entre Bactérias

As bactérias não têm reprodução sexuada como os eucariótas

A essência do sexo nas bactérias é a Recombinação

Quanto + distantes se encontram 2 bactérias + difícil é a ocorrência de Recombinação

Transferência de genes Horizontal ou lateral (não sexual)

Vertical (sexual)

Mecanismos de evolução de genomas

Erros na replicação de DNA

Danos provocados no DNA por “stress” físico ou químico

Transferência horizontal de genes (HGT ou LGT) que inclui:♣vírus que integram o seu genoma num hospedeiro (transdução)♦elementos genéticos (transposões)♥aquisição de genes do ambiente (transformação)♠transferência de material genético entre indivíduos (conjugação, sexo)

A composição dos genomas bacterianos pode ser alterada rapida e drasticamente num processo de HGT ou LGT por incorporação de DNA transferido de outro organismo directamente para o genoma

Recombinação Homóloga ou Geral

Troca física de material genético (DNA) entre sequências homólogas, num mesmo cromossoma, ou entre cromossomas distintos

Essa troca é precisa, sem que ocorra adição ou delecção de nucleótidos, e pode ocorrer em qualquer porção de DNA

Conjugação

Transformação

Transducção

Fragmentos de DNA homologo são transferidos de um cromossoma dador para um receptor

Recombinação

Mecanismos Moleculares

Nuclease Helicase

SSB

RecA

Complexo

“Pairing” sequências homologas

Trocas de segmentos homologos

DNA recombinante

Formação de novos genótipos

Qt › a distância 2 genes

› probabilidade de ocorrer recombinação

Detecção de Recombinantes

Recombinantes

Fenótipo ≠

Resistência a antibióticos, requisitos nutricionais

Conjugação

É um processo no qual um plasmídeo ou um elemento genético étransferido de célula dadora para célula receptora por contacto directo, normalmente mediada por um pilus sexual.

102 – 103 pb

Pode ocorrer conjugação entre bactérias da mesma espécie, de espécies distintas, e mesmo entre bactérias e plantas.

Conjugação

Sendo um processo replicativo, ambas as células ficam com uma cópia do plasmídeo

Alguns plasmídeos controlam o processo de conjugação - conjugativos, sendo regulado por um conjunto de genes presentes no plasmídeo – tra.

Estes genes também permitem a integração do plasmídeo no cromossoma, podendo o plasmídeo mobilizar a transferência de DNA cromossómico entre células. Estirpes Hfr (high frequency of recombination)

Conjugação Macho Fêmea

Para ocorrer transferência de DNA é necessário haver síntese

Uma das cadeias é derivada da célula dadora e a outra é sintetizada de novo pela célula receptora

O processo de transferência de plasmídeos é muito eficiente

Importância ecológica

Conjugação

Conjugação Estirpes Hfr plasmídeo F

Integração cromossoma

(insert sequences)

Hfr

Síntese do pili

Como o plasmídeo está integrado, alguns segmentos do cromossoma são transferidos

Conjugação Hfr Selecção

Para seleccionar durante o processo de conjugação o dador e o receptor

Conjugação

“Interrupted matting”

A transferência de genes do cromossoma numa estirpe Hfr ocorre sempre na mesma ordem a partir de uma origem definida

Estirpes Hfr

Os genes que se encontram + próximos da origem entram + depressa na estirpe F-

Método para determinar a ordem dos genes num cromossoma – mapa genético

Thr+ Leu+ Gal+ Trp+

Transformação é uma alteração genética de uma célula

como resultado da introdução, “uptake” e expressão de

material genético estranho.

É uma técnica frequentemente utilizada em biologia

molecular. Por exemplo, a produção de milho trangénico

requer a inserção de nova informação genética no

genoma do milho, utilizando mecanismo.

TransformaçãoÉ um processo no qual DNA livre éincorporado e assimilado por uma célula receptora, sendo posteriormente expresso.

TransformaçãoÉ um processo no qual DNA livre éincorporado e assimilado por uma célula receptora, sendo posteriormente expresso.

Ligação do DNA de dupla cadeia àmembrana externa por uma DNA “binding protein”

Entrada de uma das cadeias e degradação da outra por uma nuclease

A cadeia de DNA é ligada a proteínas específicas, e ocorre recombinação entre regiões homologas do cromossoma, mediada por RecA.

Célula transformada

Transformação

DNA Cromossómico

Célula incapaz de crescer em Ampicilina

Gene Ampr

Célula capaz de crescer em Ampicilina

Amp

Amp

Célula Competente

Transformação

Transfecção

Bactérias podem ser transformadas com DNA extraído de vírus que infectam bactérias

Utilizada para estudar os mecanismos de transformação e recombinação

Transformação

Competência induzida artificialmente

Tratamento das células com soluções concentradas de cálcio que tornam as membranas mais permeáveis ao DNA de dupla cadeia – plasmídeos (biotecnologia)

Na electroporação as células são sujeitas a um campo eléctrico que induz a abertura de pequenos poros nas membranas. Quando moléculas de DNA estão na proximidade desses poros são assimiladas.

Algumas espécies de procariotas são naturalmente transformáveis.

Frequência de transformação é de 10-3 para a maioria das espécies

Transducção

É um processo no qual DNA é transferido de célula para célula utilizando um vírus como veículo transportador -Bacteriófago

LíticoLisogénico

Transducção

O DNA derivado de qualquer porção do genoma do hospedeiro substitui o DNA viral, virtualmente qualquer gene pode ser transferido.

DNA do hospedeiro incorporado

“temperate” ou “virulente” Vírus

Síntese de DNA e proteínas virais

Generalizada

Transducção

A qt de DNA transportado depende do tamanho do capsídeo:p.e. o fago P11 de Samonella typhymurium transporta em média 1% do genoma da bactéria

Generalizada

Transducção

Ocorre apenas em vírus “temperate”, na qual genes do hospedeiro localizados nas vizinhanças dos locais de ligação dos vírus são transferidos.

Quando uma célula é infectada pelo fago lambda, o seu genoma éintegrado num local específico do genoma do hospedeiro.

Especializada

Transducção Especializada

Transposões são elementos móveis do genoma que não possuem a capa protéica que os vírus possuem, sendo dependentes da célula hospedeira e confinados a multiplicarem-se dentro do limite da mesma célula.

“Transposable elements”

Estes transposões foram observados pela primeira vez em milho por Barbara McClintock, pelo qual recebeu o prémio Nobel em 1983.

Durante esse processo podem causar mutações e alterar a quantidade de DNA no genoma.

Transposões são também chamados de "jumping genes" ou"mobile genetic elements".


Transposição – é o processo pelo qual um gene se move num cromossoma(considerado um evento raro, sendo os genes de um organismo relativamente estáveis)

As suas extremidades são constituídas por sequencias identicas, não codificantes, mas em ordem reversa uma em relação à outra. Essas repetições invertidas servem para marcar as extremidades da sequência a ser transposta (sinais para as transposases) e também funcionam no processo de transposição.

Na presença da enzima transposase, deslocam-se no cromossomo ou muda de cromossomo numa mesma célula. Transposases são as integrase que iniciam a transposição



“Transposable elements”(elementos genéticos especiais)

insertion sequences

transposões

vírus

Transposase

Inverted terminal repeats

insertion sequences

transposão

+ simples, não transportam informação genética para além da necessária para se moverem

Transportam genes, resistência, conjugativos

“Transposable elements” Mecanismos

Transposase- reconhece, corta e liga o DNA “Transposable elements”

Alvo

inserção de um “Transposable element”dentro de um gene - Mutação

“Transposon Mutagenesis”

Plasmídeos Plasmids are (typically) circular double-stranded DNA molecules that are separate from the chromosomal DNA.

They usually occur in bacteria, sometimes in eukaryotic organisms (e.g., the 2-micrometre-ring in Saccharomyces cerevisiae).

Their size varies from 1 to over 400 kilobase pairs (kbp).

There are anywhere from one copy, for large plasmids, to hundreds of copies of the same plasmid present in a single cell.

Plasmídeos

São elementos genéticos que se replicam independentemente do cromossoma do hospedeiro

Codificam genes não essenciais

Muito mais pequenos que cromossomas e podem mover-se horizontalmente dentro e entre espécies

A maioria é de cadeia dupla circular com 1/20 do tamanho de um cromossoma

Uma célula pode ter + do que 1 cópia de um mesmo plasmídeo

Uma célula pode ter + do que 1 tipo de plasmídeo – “copy number”

Moléculas de plasmídeo/célula

Plasmídeos Replicação

Bidireccional – semelhante ao mecanismo de replicação dos cromossomas(origem de replicação, formação de uma bolha de replicação, replicação bidireccional)

Unidireccional

“Rolling circle mechanism” – idêntico ao mecanismo de replicação do fago φX174 (gera-se um intermediário de cadeia simples, sendo por x designados por plasmídeos de cadeia simples)

Plasmídeos Incompatibilidade

Plasmídeos incompativeis – existem grupos de plasmídeos incompatíveis entre si, mas que “convivem” com outros grupos.

Plasmídeos incompativeis entre si, possuem mecanismo de regulação da replicação muito semelhantes, sendo “parentes” entre si.

Uma célula pode possuir vários tipos de plasmídeos, mas estes não podem ser semelhantes entre si, já que têm que ser compatíveis.

Plasmídeos

EpissomasPlasmídeos que possuem a capacidade de se integrarem no cromossoma, e nessa condição a sua replicação é controlada pelo cromossoma

Curing Por x os plasmídeos podem ser eliminados das células hospedeiras, por inibição da sua replicação

Plasmídeo F“Fertility”

É uma molécula de DNA circular com 99,159 pb

Transposons

Replicação e segregação

tra -conjugação

Pode funcionar como um epissoma

Plasmídeos Significado Biológico

Pode ter uma profunda influência no fenótipo celular

Por x codificam propriedades fundamentais para a célula (p.e. interacção entre Rhizobium e plantas)

Podem transportam qualquer tipo de genes, desde que não interfiram com a sua replicação

Plasmídeos que conferem resistência a antibióticos ou a inibidores de crescimento


Importante significado em termos médicos, já que estirpes resistentes a antibióticos constituem um risco agravado em casos de doença, e transmitem muito facilmente essa resistência a estirpes sensíveis, por contacto directo. CloranfenicolOrigem

replicação conjugativa

Mercúrio

Sulfonamida

Streptomicina

Tetraciclina

Estes genes codificam proteínas que inactivam o antibiótico ou o seu efeito, ou o seu “uptake” pela célula.


Toxinas e virulência

Capacidade de um microrganismo aderir e colonizar locais específicos no hospedeiro

Formação de substâncias que causem danos ao hospedeiro (p.e. toxinas, enzimas,etc)

Transportadas em plasmídeosp.e. E. coli, Yersinia

Bactericidas São agentes produzidos por muitas bactérias que inibem ou matam espécies próximas ou mesmo estirpes da mesma espécie

Plasmídeos – vectores de clonagem

Pequeno tamanho (facilita o isolamento e manipulação)

Origem de replicação independente

Múltiplo “copy number”

Marcadores selectivos (resistência a antibióticos)

Insertional inactivation

Multiplecloning site

Probably the greatest strength of molecular biology is the ability to

manipulate genetic material, commonly called genetic engineering.

Specific fragments of DNA may be isolated, cut into discrete pieces

by the action of restriction endonucleases, and rejoined by the action

of DNA ligase to create novel genes and other genetic constructs.

This technology allows scientists to study the activity of genes to

understand their function. One of the applications of this technology

is the potential to treat genetic diseases, such as cancers, by gene

replacement

Enzimas de restricção

Reconhecem sequências específicas de DNA, de 4 a 6 pb e clivam-nas


Endonucleases do tipo II que cortam ambas as cadeias de DNA

Engenharia Genética

Função: proteger a célula destruindo o DNA de fagos após a sua entrada.

Palindrómicas

EcoRI Qd as duas cadeias são separadas contêm ssDNA complementares

Produção de moléculas de DNA recombinates

“Annealing” das extremidades complementares e ligação covalente – ligase



Restricção

Electroforese

Purificação de fragmentos

Clonagem

Hibridação

Clonagem Molecular Isolar grandes quantidades de um gene específico, ou de um fragmento de cromossoma, na forma pura

Deslocar o gene, ou a região, desejado do grande e complexo genoma para um menor e mais simples

Isolamento e fragmentação do DNA DNA genómico – enzimas de restricção –mistura de fragmentos;

Ligação dos fragmentos a um vector de clonagem - ligação por uma ligasedas extremidades complementares;

Transformação do vector num hospedeiro – replicação do vector

Biblioteca genómica

Clonagem Molecular

GPF GGH/GPGHGPGPGPGS

DNA clivado por enzimas de restricção

GPF GGH/GPGHGPGP

Vector clivado por enzimas de restricção

“Annealing” e ligação das sequências complementares de DNA

Sequênciação de DNA

The DNA to be sequenced is prepared as a single strand. This template DNA is supplied with

•a mixture of all four normal (deoxy) nucleotides in ample quantities

•dATP•dGTP•dCTP•dTTP

•a mixture of all four dideoxynucleotides, each present in limiting quantities and each labeled with a "tag" that fluoresces a different color:

•ddATP•ddGTP•ddCTP•ddTTP

•DNA polymerase I

Maxam e Gilbert

Sanger

Geram fragmentos de DNA que terminam em cada uma das 4 bases que são radioactivas.

Electroforese dos fragmentos

Fragmentos com uma base de diferença são separados

Autorradiografia

Químicos que quebram o DNA preferencialmente em cada um dos nucleótidos

A sequência é determinada pela produção de uma cópia de cadeia simples, utilizando uma DNA polimerase



Maxam e Gilbert


Sanger

Síntese de DNA

“primers”

troca genética entre bactérias -...

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