triatoma infestans (h : r - institut de recherche pour le...
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i
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS PURAS Y NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA
MICRO-ESTRUCTURACIÓN GENÉTICA DE
TRIATOMA INFESTANS (HEMÍPTERA: REDUVIIDAE)EN VIVIENDAS DE LA BRECHA (PROVINCIA
CORDILLERA, SANTA CRUZ)
Alex Juan Cornejo Pinto
Tutor académico: Ms. Sc. Rolando Sánchez (UMSA, Biología molecular)
Asesor de investigación: Dr. Frédéric Lardeux (IRD)
LA PAZ – 2015
ii
ÍNDICE
Índice de tablas ............................................................................................................................... v
Índice de figuras............................................................................................................................ vii
Lista de abreviaturas ...................................................................................................................... ix
Hoja de Firmas............................................................................................................................... xi
Resumen........................................................................................................................................ xii
Agradecimientos .......................................................................................................................... xiii
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
1.1. Antecedentes ............................................................................................................... 1
1.2. Justificación ................................................................................................................ 7
1.3. Marco teórico .............................................................................................................. 8
1.3.1. Estructuración genética de T. infestans.................................................................... 8
1.3.2. Unidades de Rociado (RU) ..................................................................................... 10
1.4. Pregunta de investigación ......................................................................................... 12
1.5. Hipótesis ................................................................................................................... 12
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 13
2.1. Objetivo general........................................................................................................ 13
2.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 13
3. METODOLOGÍA ...................................................................................................................... 14
3.1. Área de estudio ......................................................................................................... 14
3.2. Poblaciones de triatominos ....................................................................................... 15
3.3. Genotipado de Microsatelites ................................................................................... 19
iii
3.3.1. Extracción de DNA ................................................................................................. 19
3.3.2. Amplificación por PCR........................................................................................... 19
3.3.3. Determinación del tamaño de los amplificados...................................................... 21
3.4. Análisis genealógico ................................................................................................. 23
3.4.1. Identificación de familias (Full-sib) y colonias (Half-sib) ..................................... 23
3.4.2. Cálculo de la tasa finita de crecimiento (λ)............................................................ 24
3.5. Estructuración genética de T. infestans..................................................................... 25
3.5.1. Estimación del nivel de variación genética ............................................................ 25
3.5.2. Test de Heterocigosidad ......................................................................................... 26
3.5.3. Estimación del grado de diferenciación genética................................................... 26
3.6. Unidades de Rociado ................................................................................................ 26
3.6.1. Estimación del número de migrantes...................................................................... 26
3.6.2. Análisis individual de auto-correlación espacial ................................................... 27
4. RESULTADOS ......................................................................................................................... 29
4.1. Análisis genealógico ................................................................................................. 29
4.1.1. Identificación de familias (Full-sib) y colonias (Half-sib) ..................................... 29
4.1.2. Cálculo de la tasa finita de crecimiento (λ)............................................................ 32
4.2. Estructuración genética de T. infestans..................................................................... 33
4.2.1. Estimación del nivel de variación genética ............................................................ 33
4.2.2. Test de Heterocigosidad ......................................................................................... 37
4.2.3. Estimación del grado de diferenciación genética................................................... 40
4.3. Unidades de rociado RU ........................................................................................... 42
4.3.1. Estimación del número de migrantes...................................................................... 42
4.3.2. Análisis individual de auto-correlación espacial ................................................... 44
iv
5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 49
Análisis genealógico ................................................................................................................ 49
Estructuración genética de T. infestans .................................................................................... 50
Unidades de Rociado (UR) ...................................................................................................... 53
6. CONCLUSIÓN.......................................................................................................................... 56
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 58
Anexos .......................................................................................................................................... 66
Anexo 1. Protocolo de extracción de DNA de Triatominos con CTAB 2% ................................ 67
Anexo 2. Pedigree de patrilinias y matrilinias de T. infestans...................................................... 68
Anexo 3. Cambio de logaritmo likelihood.................................................................................... 71
Anexo 4. Análisis de auto correlación espacial según estadios .................................................... 72
Anexo 6. Tabla de genotipos ........................................................................................................ 77
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tiempo de desarrollo de T. infestans (Catalá et al. 2007). ................................... 5
Tabla 2. Estructura demográfica de la población A.......................................................... 16
Tabla 3. Estructura demográfica de la población B.......................................................... 17
Tabla 4. Estructura demográfica de la población C. ......................................................... 18
Tabla 5. Lista de cebadores de loci microsatelites de T. infestans ................................... 20
Tabla 6. Opciones usadas para la ejecución del programa Colony................................... 23
Tabla 7. Opciones usadas para la ejecución del programa Geneclass .............................. 27
Tabla 8. Sistema de relacionamiento entre progenitores de T. infestans .......................... 30
Tabla 9. Proporción de familias T. infestans según estructura domiciliaria ..................... 31
Tabla 10. Cálculo de la tasa finita de crecimiento ............................................................ 33
Tabla 11. Variación genética dentro la colonia de T. infestans ........................................ 34
Tabla 12. Variación genética dentro las familias de T. infestans...................................... 35
Tabla 13. Variación genética dentro las poblaciones T. infestans analizadas .................. 36
Tabla 14. Test de heterocigosidad de la colonia de T. infestans....................................... 37
Tabla 15. Test de heterocigosidad según familias de T. infestans .................................... 38
Tabla 16. Test de heterocigosidad según estadios de desarrollo ...................................... 39
Tabla 17. Test de heterocigosidad a nivel Espacial .......................................................... 40
Tabla 18. Estimación de la diferenciación genética FST y RST entre familias. ................ 41
vi
Tabla 19. Estimación del grado de diferenciación genética espacial................................ 41
Tabla 20. Migrantes de primera generación entre familias............................................... 42
Tabla 21. Estimación del número de migrantes a nivel espacial ...................................... 43
Tabla 22. Migrantes de primera generación entre sitios de colecta .................................. 44
Tabla 23. Rango de dispersión según estadio de desarrollo ............................................. 45
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Área de distribución de T. infestans en Bolivia................................................... 3
Figura 2. Vivienda hecha de tabique y adobe (precaria) en La Brecha .............................. 4
Figura 3. Corral peri domiciliar en la Brecha, Chaco boliviano ......................................... 4
Figura 4. Estadios de desarrollo de T. infestans.................................................................. 5
Figura 5. Área de estudio. Localidad de La Brecha.......................................................... 14
Figura 6. Distancias geográficas entre estructuras (dormitorios A-C y gallinero B)........ 15
Figura 7. (a) Casa-dormitorio A y (b) distribución espacial............................................. 16
Figura 8. Gallinero B peri-domiciliar ............................................................................... 17
Figura 9. (a) Casa-dormitorio C y (b) distribución espacial ............................................. 18
Figura 10. Visualización de los ocho cebadores amplificados. ........................................ 21
Figura 11. Determinación de genotipos. ........................................................................... 22
Figura 12. Pedigrí de la colonia de T. infestans ................................................................ 29
Figura 13. Abundancia de triatominos según familia ....................................................... 31
Figura 14. Abundancia de triatominos según familia y lugar de captura ......................... 32
Figura 15. Aislamiento por distancia entre estructuras..................................................... 43
Figura 16 Auto-correlación de una colonia de T. infestans .............................................. 46
Figura 17. Auto-correlación de hembras Adultas de T. infestans..................................... 47
Figura 18. Auto-correlación de machos Adultos de T. infestans ...................................... 48
viii
Figura 19. Cambios del Log likelihood ........................................................................... 71
Figura 20. Auto-correlación de ninfas N1 de T. infestans. ............................................... 72
Figura 21. Auto-correlación de ninfas N2 de T. infestans. ............................................... 73
Figura 22. Auto-correlación de ninfas N3 de T. infestans ............................................... 74
Figura 23. Auto-correlación de ninfas N4 de T. infestans ................................................ 75
Figura 24. Auto-correlación de ninfas N5 de T. infestans ................................................ 76
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
A. Número de alelos.
ADN. Ácido desoxirribonucleico.
CTAB. Buffer de extracción.
DNAsa. Desoxirribonucleasa.
dNTP. Desoxirribonucleotido.
FIS. Tasa de reproducción cruzada.
FST. Varianza estandarizada de la frecuencia génica.
Full-sib. Familia.
Half-sib. Colonia.
HE. Heterocigosidad esperada basada en frecuencias alelicas.
HE. Heterocigosidad Esperada.
HE<Heq. Déficit de heterocigosis, población en proceso de expansión.
HE>Heq. Exceso de heterocigosis, población saliendo de un reciente cuello de botella.
Heq. Heterocigosidad esperada basada en el número de alelos y el tamaño de la muestra.
HO. Heterocigosidad Observada.
HW. Equilibrio de Hardy Weinberg.
IAM. Modelo mutacional de alelos infinitos.
ITS. Secuencias inter-génicas entre espaciadores de transcriptos internos.
LD. Desequilibrio de ligamiento.
MU. (Management Unit) Unidad de Manejo.
Nm. Número de migrantes por generación.
PCR. (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa.
RAPD. ADN polimórfico amplificado al azar.
x
RST. Fracción de la varianza entre poblaciones por diferentes tamaños de alelos.
SMM. Modelo mutacional paso a paso.
TPM. Modelo mutacional intermedio a dos pasos.
UR. Unidad de Rociado.
WHO. (World Health Organization) Organización Mundial de la salud.
xi
HOJA DE FIRMAS
Ms. Sc. Rolando Sánchez
Tutor académico
Dr. Frédéric Lardeux ………………………………………
Asesor de investigación
Dra. Volga Íñiguez
Tribunal
Dra. Julia Barreta
Tribunal
Lic. Esther Valenzuela
Directora de carrera
La Paz - Bolivia
xi
HOJA DE FIRMAS
Ms. Sc. Rolando Sánchez
Tutor académico
Dr. Frédéric Lardeux ………………………………………
Asesor de investigación
Dra. Volga Íñiguez
Tribunal
Dra. Julia Barreta
Tribunal
Lic. Esther Valenzuela
Directora de carrera
La Paz - Bolivia
xi
HOJA DE FIRMAS
Ms. Sc. Rolando Sánchez
Tutor académico
Dr. Frédéric Lardeux ………………………………………
Asesor de investigación
Dra. Volga Íñiguez
Tribunal
Dra. Julia Barreta
Tribunal
Lic. Esther Valenzuela
Directora de carrera
La Paz - Bolivia
xii
RESUMEN
Se ha examinado el tipo de organización y el grado de estructuración genética de
Triatoma infestans principal vector de la enfermedad de Chagas a una escala micro-geográfica,
con el fin de poder delimitar unidades de rociado (U.R.) como alternativas al rociado general de
una comunidad. En la comunidad de La Brecha (Departamento Santa Cruz, Provincia
Cordillera), un total de 381 insectos se colectaron de dos casas-dormitorios (casa A y C)
distantes a 50 m y un gallinero (B) distante a 10 m de la primera casa A. Los insectos fueron
tipificados con 8 loci microsatelites. Se realizó primeramente el análisis genealógico en base al
método de máxima verosimilitud para asignar/inferir el número de familias y colonias presentes
en la población total, se examino su modo de relacionamiento y se estimo la tasa finita de
crecimiento para cada familia y la colonia en su conjunto. Posteriormente se realizó el análisis de
genética poblacional estándar calculando los índices usuales (test HW, Fis, Fst, Rst), agrupando
a los insectos según su sitio de captura (análisis espacial) y según familias y colonias de T.
infestans (análisis genealógico). Por último se delimito unidades de rociado calculando el
número de migrantes Nm con tres métodos y se estimo los rangos de dispersión activa por
caminata según estadio de desarrollo con el análisis de auto-correlación espacial. El análisis
genealógico sugiere que toda la población muestreada representa a una sola colonia, conformada
por 42 familias que se originan a partir de relaciones polígamas (poliandria-poliginia) de 21
progenitores 11 hembras y 10 machos adultos. Dos familias presentan la mayor abundancia de
triatominos (>100 individuos), estando distribuidas en las tres estructuras analizadas, los
diferentes valores obtenidos de la tasa finita de crecimiento entre familias denotan que estas
poblaciones presentan un crecimiento positivo y compiten entre ellas. Por otro lado el análisis
espacial muestra un patrón de aislamiento por distancia donde triatominos colectados a distancias
≤10 metros, presentan un bajo nivel de diferenciación genética, mientras que insectos colectados
a distancias ≥50 metros, presentan de un moderado a un alto grado de diferenciación genética
entre ellas. La capacidad de dispersión por caminata de T. infestans aumenta a medida que estos
cambian de estadio en rangos que varían desde los 6 hasta los 48 metros. Ambos análisis denotan
que la unidad de rociado debe extenderse a más de 50 metros de un sitio infestado. Los datos de
la tesis no permiten ampliar con exactitud esta estimación preliminar, por lo que se sugiere
investigar las relaciones genealógicas entre individuos de T. infestans colectados en casas
alejadas a más de 50 metros dentro de una misma comunidad y entre comunidades cercanas.
xiii
AGRADECIMIENTOS
Quiero dar gracias a varias instituciones y personas ya que sin su colaboración y apoyo
no se hubiera podido llevar a cabo este proyecto de tesis.
Al Instituto de Biología Molecular y Biotecnología (IBMB) de la carrera de Biología, que
me abrió las puertas para ingresar en el conocimiento de la biología molecular. A la Dra. Volga
Iñiguez que me inspiro en sus clases al mostrarme la grandeza y complejidad de la vida a nivel
molecular. Al Ms. Sc. Rolando Sánchez quien amablemente acepto ser nuestro tutor, también
agradecerle por los concejos, ánimos en la perseverancia durante la ejecución de la tesis.
Al Dr. Frédéric Lardeux del Instituto de Desarrollo para la Investigación (IRD) por
haberme incursionado en el área de la entomología, revelándome el impacto social, económico y
ecosistémico de la enfermedad de Chagas en nuestro país, también agradecerle por la guía y
paciencia que me brindo como asesor en el transcurso de la elaboración de la tesis. A la Dra.
Tamara Chávez directora del Laboratorio de Entomología Medica perteneciente al Instituto de
Laboratorios en Salud (INLASA), quien amablemente me abrió las puertas del laboratorio para
el desarrollo de la tesis. A la Lic. Renata Salas quien me colaboro y guio en la bioseguridad y
desarrollo práctico en el laboratorio de Entomología Medica.
Un agradecimiento grato por el financiamiento “Al programa Nacional de la
Investigación” Francesa (ANR), bajo la subvención (ANR-2010 CESA 018 01) “Que
alternativas hay ante el control químico de Triatoma infestans” y a la OMS-TDR/IDRC bajo la
subvención EBS-LAC n° A90281 “Un acercamiento eco-bio-social para implementar e integrar
técnicas para controlar a T. infestans en comunidades pobres de Bolivia”. Agradecer también a la
Plateforme Génomique Environnementale du Labex « Centre Méditerranéen Environnement
Biodiversité », Université de Montpellier II, Francia, donde se determinaron los tamaños de los
productos de la PCR.
Agradecer a Natalie por estar siempre ahí en los momentos altos y bajos de la vida,
alentándome para la conclusión de la tesis. Por último agradecer a mi madre Jacqueline a mi
padre Omar, a mis hermanos Benjamín, Sebastián. Quienes nunca perdieron la fe en mí y me
apoyaron siempre en mis decisiones.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es considerada como una parásito
antropozoonosis endémica de 21 países del continente Americano (Jansen &Rodrigues 2010).
Entre los 21 países, la enfermedad de Chagas es un serio problema de salud pública, estimándose
aproximadamente que entre seis a ocho millones de personas están infectadas con T. cruzi y que
más de 109 millones de habitantes viven bajo riesgo en zonas endémicas (OMS 2015).
En los seres humanos, la enfermedad de Chagas se presenta como una infección
parasitaria sistémica-crónica, que conlleva del 20% al 30% de los infectados a formas graves de
cardiopatía, un 10% padeciendo alteraciones del tracto digestivo (megacolon), neurológicas o
combinadas (OMS 2015).
El parásito agente de la enfermedad es el protozoario Trypanosoma cruzi el cual se
desarrolla en un gran número de huéspedes: mamíferos, marsupiales e insectos hemípteros de la
familia Reduviidae (Triatominae) que se constituyen en los principales vectores (Rojas et al.
2007a). Otras vías de transmisión del parasito se da por medio de transfusión sanguínea,
transmisión de la madre infectada al hijo, durante el embarazo o el parto, por trasplante de
órganos provenientes de personas infectadas, accidentes de laboratorio e ingestión de alimentos
contaminados por las heces del vector (Schofield 1994b).
La transmisión vectorial es responsable del 80% de los casos reportados en humanos
(Schofield 1994a). El insecto vector adquiere los parásitos al succionar sangre de un humano o
animal infectado en periodo agudo o fase crónica. Los Trypanosomas sufren a lo largo de su
recorrido por el tracto digestivo del insecto, transformaciones que tienen como resultado la
aparición de formas infectantes (tripomastigotes metacíclicos) los cuales se alojan en el recto o
intestino posterior del vector (García &Azambuja 1991, García et al. 2007). Al volver a picar
para alimentarse de sangre, el vector defeca sobre la piel del huésped, los parásitos ingresan al
organismo cuando la persona picada se frota instintivamente y empuja las heces hacia la
picadura, una lesión cutánea abierta, los ojos, la boca o cualquier mucosa (Zeledon 1974).
2
La transmisión vectorial de T. cruzi al ser humano depende de varios factores: la
capacidad de los triatominos para poder vivir en viviendas “grado de domiciliación” (Schofield
et al. 1999, Dujardin et al. 2000, Gourbière et al. 2008), la preferencia trófica de sangre, la
rapidez con la que defeca después de una ingesta de sangre (Zeledon 1974) y la densidad del
insecto dentro una vivienda (Schofield et al. 1986).
Muchas especies de Triatominos, ocupan predominantemente hábitats silvestres (ej. nidos
de aves, madrigueras de roedores), los cuales ofrecen temporalmente refugio ante climas
extremos y proveen a su vez acceso a fuentes de sangre (Catalá et al. 2007). La interacción de los
humanos con los triatominos, ha permitido que algunas de estas especies puedan invadir hábitats
peri-domésticos (tales como gallineros o corrales de cabras), pudiendo incluso algunas colonizar
domicilios humanos. Estos hábitats a diferencia de los silvestres, ofrecen refugios permanentes
para su establecimiento, a su vez que son fuentes seguras de alimentación. Este instinto de
colonizar viviendas humanas es considerado como un factor muy importante que debe tomarse
en cuenta en términos de la transmisión de la enfermedad hacia los humanos (Lardeux 2013).
Triatoma infestans es el principal vector de la enfermedad de Chagas en Sud América
debido a su amplia distribución y estar presente casi exclusivamente en hábitats domésticos
(Schofield 1994b), por tales características es blanco de programas de control por parte de la
Iniciativa del Cono Sur. Como resultado de esta iniciativa, Chile (Lorca et al. 2001), Brasil
(Silveira &Vinhaes 1999) y Uruguay (Organization 1994) han sido declaradas como áreas libres
de la transmisión de la enfermedad de Chagas por T. infestans.
No obstante el control vectorial aun presenta dificultades, en parte como consecuencia de
la variabilidad y extensión de las áreas endémicas, y también por causa de dificultades en la
implementación de una vigilancia entomológica sostenida para evitar el restablecimiento de
poblaciones de insectos en áreas tratadas (Pérez De Rosas et al. 2013). Altos niveles de re-
infestación después de los rociados han sido detectados en Argentina, Bolivia y Paraguay
(Gürtler et al. 2007).
3
En Bolivia Triatoma infestans (Hemíptera: Reduviidae) es el principal vector domiciliado
de T. cruzi, esta especie está ampliamente distribuida en el territorio nacional alcanzando un 60%
(seis de los nueve departamentos, siendo ausente en Beni, Pando y Oruro) (WHO 1991) (Figura
1).
Figura 1. Área de distribución de T. infestans en Bolivia
Las viviendas más susceptibles a la infestación por este insecto son las viviendas
precarias hechas con paredes de tabique o adobe (Figura 2), aquí los triatominos encuentran
grietas y huecos en los cuales se pueden desarrollar y reproducir (Kroeger 1980, Torrico 2007).
Estos insectos también pueden cumplir su ciclo de vida en estructuras peri-domiciliadas (Figura
3), tales como corrales de animales, gallineros, conejeros, etc.(Schofield &White 1984).
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En Bolivia Triatoma infestans (Hemíptera: Reduviidae) es el principal vector domiciliado
de T. cruzi, esta especie está ampliamente distribuida en el territorio nacional alcanzando un 60%
(seis de los nueve departamentos, siendo ausente en Beni, Pando y Oruro) (WHO 1991) (Figura
1).
Figura 1. Área de distribución de T. infestans en Bolivia
Las viviendas más susceptibles a la infestación por este insecto son las viviendas
precarias hechas con paredes de tabique o adobe (Figura 2), aquí los triatominos encuentran
grietas y huecos en los cuales se pueden desarrollar y reproducir (Kroeger 1980, Torrico 2007).
Estos insectos también pueden cumplir su ciclo de vida en estructuras peri-domiciliadas (Figura
3), tales como corrales de animales, gallineros, conejeros, etc.(Schofield &White 1984).
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En Bolivia Triatoma infestans (Hemíptera: Reduviidae) es el principal vector domiciliado
de T. cruzi, esta especie está ampliamente distribuida en el territorio nacional alcanzando un 60%
(seis de los nueve departamentos, siendo ausente en Beni, Pando y Oruro) (WHO 1991) (Figura
1).
Figura 1. Área de distribución de T. infestans en Bolivia
Las viviendas más susceptibles a la infestación por este insecto son las viviendas
precarias hechas con paredes de tabique o adobe (Figura 2), aquí los triatominos encuentran
grietas y huecos en los cuales se pueden desarrollar y reproducir (Kroeger 1980, Torrico 2007).
Estos insectos también pueden cumplir su ciclo de vida en estructuras peri-domiciliadas (Figura
3), tales como corrales de animales, gallineros, conejeros, etc.(Schofield &White 1984).
4
Figura 2. Vivienda hecha de tabique y adobe (precaria) en La Brecha, Chaco
boliviano
Figura 3. Corral peri domiciliar en la Brecha, Chaco boliviano
4
Figura 2. Vivienda hecha de tabique y adobe (precaria) en La Brecha, Chaco
boliviano
Figura 3. Corral peri domiciliar en la Brecha, Chaco boliviano
4
Figura 2. Vivienda hecha de tabique y adobe (precaria) en La Brecha, Chaco
boliviano
Figura 3. Corral peri domiciliar en la Brecha, Chaco boliviano
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Triatoma infestans se reproduce por huevos, que miden de 2 a 3 mm, son de color blanco
y cambian de color a rozado cuando se completa la evolución del embrión. Desde que sale del
huevo hasta que alcanza el estado adulto (forma alada), T. infestans pasa por cinco estadios
ninfales (de N1 a N5), con cambios graduales de tamaño y ausencia de alas (Figura 4).
Figura 4. Estadios de desarrollo de T. infestans. (De izquierda a derecha Huevos,
Ninfa 1, Ninfa 2, Ninfa 3, Ninfa 4, Ninfa 5, Adulto Macho y Adulta Hembra)
Este ciclo toma en promedio un año para cumplirse en condiciones estándar (27°C,
70%HR) (Tabla 1), pero dependiendo de las condiciones ambientales (temperatura, humedad),
puede tardar solamente unos seis meses y así llegar a tener hasta dos generaciones en un solo año
(Schofield 1980). A partir del estado adulto, la vida del insecto se prolonga de uno a dos años
(Catalá et al. 2007). Generalmente los triatominos se desarrollan en colonias con una pobre
capacidad de dispersión (Breniere et al. 1997, Breniere et al. 1998, Pizarro et al. 2008).
Tabla 1. Tiempo de desarrollo de T. infestans (Catalá et al. 2007).
Estadios Tiempo de cambio deestadio (en días)
Huevo – N1 33,3
N1 – N2 27,4
N2 –N3 28,6
N3 – N4 34,7
N4 – N5 58,4
N5 - Adulto 183,5
Total 365,9
6
La actividad dispersiva de los triatominos tiene gran importancia para la difusión de la
enfermedad de Chagas (Schofield 1994b), en especial aquellas especies que tienen particular
afinidad por el hábitat humano. Estos insectos presentan dos mecanismos de dispersión:
dispersión pasiva a través de los hospederos vertebrados, y la dispersión activa por caminata y en
el caso de los adultos alados por vuelo (Catalá et al. 2007).
Se asevera que la dispersión pasiva es ante todo una función comportamental del huésped
(Miles 1976), otros autores afirman que es una consecuencia de la adaptación de los triatominos
a la hematofagia, la cual genera una progresiva dependencia del hospedador a tal punto de
dispersarse por acarreo juntos (Schofield &Dolling 1993).
La dispersión activa por vuelo, está asociado normalmente con un pobre estado
nutricional del insecto adulto y está ligada a la regulación de la densidad poblacional del insecto.
(Schofield 1994b). Cuando una población de triatominos en un hábitat alcanza su capacidad de
carga, la irritación que producen al hospedador al picar es tan importante que no consiguen una
alimentación completa, lo cual conduce a los triatominos a un estado de ayuno prolongado
(Lehane &Schofield 1982). Las reservas energéticas parecen entonces direccionarse hacia los
músculos del vuelo, capacitando al insecto para dispersarse de manera eficiente.
Otro factor clave en la iniciación del vuelo es la temperatura ambiente, para T. infestans
la temperatura debe ser elevada, al atardecer momento en que ocurre el pico de actividad daría de
estos insectos (Catalá et al. 2007). En T. infestans una especie domiciliada con una amplia área
de distribución, la dispersión por vuelo es frecuentemente considerada como el mecanismo más
importante de re-infestación de las viviendas, particularmente después de un rociado (Vasquez-
Prokopec et al. 2004).
La dispersión activa por caminata viene dada por algunas especies de triatominos que
tienen buena capacidad de dispersarse caminando, principalmente en los estadios ninfales
superiores (Zeledon et al. 1973). Se ha sugerido en Argentina la posibilidad de invasión activa de
ecotopos por T. infestans, al encontrarse sangre humana en estos insectos colectados en sitios
peri-domésticos ubicados hasta 12 metros de la vivienda analizada (Lopez et al. 1999).
7
La vigilancia de la transmisión en Bolivia se la realiza principalmente a través del control
vectorial, cuyo objetivo es reducir la abundancia domiciliaria del vector a un nivel debajo del
riesgo epidemiológico, el monitoreo de bancos de sangre y la vigilancia a mujeres embarazadas
(WHO 1991). El control vectorial consiste en rociados con insecticidas de poder residual
(piretroides) dentro de las casas y en los espacios peri-domiciliares donde vive T. infestans
(Rojas et al. 2007b).
1.2. Justificación
Normalmente, el control vectorial de una localidad se la realiza a través del rociado
general, el cual consiste en el rociado de todas las viviendas, sus estructuras intra y peri-
domiciliares en áreas determinadas como infestadas (Schofield 1994b). Este tipo de estrategia
resulta un tanto costosa y poco efectiva, debido a problemas como: la entrega de material
(insecticidas) oportuna, recursos humanos (técnicos rociadores) y tiempo. Recientemente, se han
propuesto estrategias alternativas como ser los rociados “focales”, los cuales consisten en rociar
solamente aquellas viviendas y estructuras detectadas como positivas por T. infestans (Rojas et
al. 2007b). Lamentablemente, los resultados de los rociados tanto focales como generales no son
tan efectivos como se esperaba, ya que poco después se denuncian aun viviendas positivas
(Gurtler et al. 2004, Gürtler et al. 2007).
En base a estudios en genética de poblaciones de T. infestans, se ha detectado que las
viviendas rociadas son re-colonizadas en pocos meses por poblaciones residuales (Gürtler et al.
2007, Pérez De Rosas et al. 2007, Pérez De Rosas et al. 2008, Pizarro et al. 2008), estas
poblaciones residuales pertenecen al lugar (Marcet et al. 2006, Marcet et al. 2008) pero no se
sabe con certeza si en una determinada casa las poblaciones que se encuentran surgen de la
misma ó provienen de casas vecinas (Noireau et al. 2005). Si poblaciones residuales vecinas
colonizan casas cercanas, no sería aconsejable el uso de una estrategia de rociado focal como
estrategia alternativa al rociado general.
Por tanto dilucidar la estructuración genética del vector T. infestans a escalas micro-
geográficas es muy importante, ya que estos conocimientos nos aportarán pistas para proponer
nuevas estrategias de control, permitiéndonos delimitar poblaciones demográficamente distintas
8
de T. infestans, las cuales podrán ser manejadas independientemente como unidades de rociado
(UR) (Ver parágrafo 1.3.2 abajo).
1.3. Marco teórico
1.3.1. Estructuración genética de T. infestans
Los análisis sobre estructuración genética de las poblaciones de T. infestans han sido
realizados a partir de diferentes herramientas moleculares y a distintos niveles geográficos.
En cuanto a las herramientas moleculares, se han empleado varias técnicas como ser
marcadores de las variaciones intra e inter específicas en poblaciones de triatominos: isoenzimas
(Dujardin &Tibayrenc 1985, Dujardin et al. 1987), RAPD (ADN polimórfico amplificado al
azar) (Carlier et al. 1996), análisis de ADN mitocondrial (mtADN) (Monteiro et al. 1999),
estudios citogenéticos (Panzera et al. 1992), morfometría (Dujardin et al. 1997), entre otros.
Recientemente se han aislado y caracterizado marcadores loci microsatelites procedentes del
genoma nuclear de T. infestans (García et al. 2004, Marcet et al. 2006).
Estos estudios genéticos a partir de diferentes herramientas moleculares sugieren que las
poblaciones de T. infestans están estructuradas a distintos niveles geográficos:
- A nivel regional, estudios basados en la diversidad haplotípica de secuencias inter-
génicas entre espaciadores de transcriptos internos (ITS-1; ITS-2) sugieren que las
poblaciones de T. infestans presentan dos clados, uno asociado a la región Andina y el
otro asociado a la región del Chaco (tierras bajas) (Bargues et al. 2006), con aéreas de
mezclas entre los dos (Quisberth et al. 2011).
- A un nivel geográfico más reducido (entre localidades o dentro de una misma
localidad) estudios realizados en Bolivia, (departamento de Chuquisaca) y norte de la
Argentina (departamento de Patiño y Santiago del Estero) utilizando marcadores
microsatelites, muestran que las poblaciones de T. infestans presentan un alto grado
de estructuración genética y déficit de heterozigosis para ambos niveles analizados, lo
cual sugiere una limitada capacidad de dispersión y por tanto de flujo génico a
distancias ≥100 Km. (García et al. 2004, Marcet et al. 2006, Marcet et al. 2008,
9
Pizarro et al. 2008). También en base al test de heterocigosidad, se ha detectado que
las poblaciones presentan evidencia de haber sufrido recientes eventos de cuello de
botella (Pérez De Rosas et al. 2007, Marcet et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2008,
Pérez De Rosas et al. 2011). Varias hipótesis se han sugerido para explicar estos
frecuentes eventos de cuello de botella encontrados, como ser migraciones pasivas
por transporte humano ó reducciones drásticas de las poblaciones por rociados
insecticidas.
- Al nivel micro geográfico (una vivienda y estructuras peri-domiciliarias como
gallineros y corrales), los análisis morfométricos del fenotipo antenal y del ala
realizados en poblaciones provenientes de Bolivia (departamentos: Tarija,
Cochabamba) y la Argentina (provincias La Rioja, Chaco, Santiago del Estero),
sugieren diferentes grados de aislamiento entre estos hábitats (Schachter-Broide et al.
2004, Abrahan et al. 2008, Schachter-Broide et al. 2009). Los análisis morfometricos
presentan problemas en cuanto a la determinación de grados de aislamiento o
estructuración poblacional, debido a que las variaciones fenotípicas encontradas entre
poblaciones de T. infestans domesticas y peri-domesticas derivan de caracteres
complejos (multifactoriales), en los cuales no existe un solo fenotipo particular sino
un rango de ellos como consecuencia de la acción genética y las influencias
ambientales. Un ejemplo resaltante es el carácter continuo “tamaño” el cual está
parcialmente determinado por el genotipo, y que está influenciada por factores
ambientales como la nutrición (Slatkin 1985, Klug et al. 2006, Aguirre 2007). Por lo
tanto los grados de aislamiento detectados por morfometría entre poblaciones de
triatominos provenientes de habitas domésticos y peri domésticos, están influenciados
por el tipo de alimentación (fuentes de sangre) que tenían acceso en sus primeros
estadios de desarrollo, lo cual no determina que el flujo génico entre estas
poblaciones sea restringido.
Nuevos estudios en estructuración genética a fina escala (una vivienda y estructuras
peri-domiciliarias como gallineros y corrales), utilizando marcadores microsatelites
en poblaciones provenientes de Bolivia (departamento de Chuquisaca) y la Argentina
(provincias Santiago del Estero y Catamarca), sugieren que las poblaciones de T.
10
infestans presentan déficit de heterocigosis y un alto grado de consanguinidad,
sugiriendo una sub estructuración y un nivel de estratificación entre estructuras
domésticas y peri-domesticas dentro una vivienda (Marcet et al. 2008, Pérez De
Rosas et al. 2008, Pizarro et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2013).
Cabe resaltar que el déficit de heterocigosis y el alto grado de consanguinidad
detectado en las poblaciones de T. infestans por los autores mencionados, se deben a
la presencia de alelos nulos y en mayor grado al efecto Wahlund causado por el bajo
tamaño poblacional analizado (de entre 2 a 78 insectos) por sitio muestreado
(Lehmann et al. 2003). Este problema del bajo tamaño poblacional o error de
muestreo, conlleva a considerar a las viviendas y estructuras cercanas positivas como
unidades independientes, que tal vez no lo son.
1.3.2. Unidades de Rociado (RU)
Rociar implica la eliminación total de las poblaciones de T. infestans en áreas tratadas,
con riesgo limitado o lento de re-introducción. Si la eliminación de las poblaciones es solamente
parcial y si estas poblaciones presentan intercambios frecuentes y abundantes, entonces el
rociado no sirve de mucho. De ahí radica la importancia de poder delimitar unidades de rociado,
las cuales puedan controlarse sin peligro de re-introducción por inmigración. Este concepto ya ha
sido usado en ecología y genética de poblaciones bajo el término de Unidades de Manejo
(Management Units, o MU (Moritz 1994)). Una MU queda definida como “…poblaciones con
divergencia significativa de frecuencias alélicas de loci nucleares y mitocondriales, a pesar de la
cualidad distintiva filogenética de los alelos…”(Moritz 1994). La expresión “divergencia
significativa” desde entonces se dedujo como el rechazo estadístico a la panmixia, la cual
continua siendo la forma de medir, usada para designar el estatus de MU dentro de poblaciones a
partir de datos genéticos. Una MU también se puede definir como una población
demográficamente independiente cuya dinámica poblacional (e.g. tasa de crecimiento
poblacional) depende mayormente de las tasas locales de nacimientos y muertes que de la
inmigración (Palsboll et al. 2006). Los análisis demográficos usando marcadores genéticos como
los microsatelites se han incrementado sustancialmente como una manera indirecta de inferir si
sub-poblaciones se constituyen parte de una misma MU (Palsboll et al. 2006). Este concepto
aplicado al rociado de viviendas para combatir T. infestans puede ser llamado “unidades de
11
rociado (UR)”. Dado que una UR representa a unidades demográficamente aisladas, su
delimitación requiere una estimación de la tasa de dispersión entre poblaciones.
Variós estudios han aportado datos interesantes para tratar de delimitar unidades
poblacionales de T. infestans, se puede destacar por ejemplo Brasil, realizando simulaciones en
computadora sobre la capacidad de dispersión activa por vuelo de T. infestans, en el cual se
indica que el área de dispersión es de 200 metros (Schofield &Matthews 1985). Otro
experimento de vuelo en campo de T. infestans se realizó en Argentina, donde observaron desde
vuelos triviales de pocos metros hasta más de 600 metros (Schofield et al. 1992).
También en la Argentina (provincia Santiago del Estero) en base a datos morfométricos
de poblaciones de T. infestans, se ha sugerido que el área de dispersión activa por vuelo de T.
infestans es aproximadamente de 400 metros (Cecere et al. 2004). Recientemente, en base a
datos de estructura genética a fina escala de T. infestans en la Argentina (provincia Catamarca)
usando microsatelites, se demostró que la dispersión activa por vuelo ocurre dentro de este rango
de distancia (400 metros) (Pérez De Rosas et al. 2013).
Estos estudios de rango de dispersión de T. infestans, nos aportan pistas para la
delimitación de unidades de rociado, sin embargo aún no todo está resuelto. Para poder delimitar
una UR es imprescindible primero determinar la tasa de migración entre poblaciones distantes a
estos rangos de dispersión, para confirmar si un área de 400 metros representa efectivamente una
UR. Además la detección en estas aéreas de subdivisión poblacional de T. infestans, altos grados
de consanguinidad y una restringida dispersión entre sitios de colecta domésticos y peri-
domésticos (Marcet et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2008, Pizarro et al. 2008, Pérez De Rosas
et al. 2013), sugieren que dentro una UR de 400 metros existen sub unidades poblacionales que
pueden ser tratados como stocks independientes.
Por tanto para poder delimitar efectivamente una UR, es de suma importancia dilucidar
tanto la estructuración genética espacial, como la tasa de dispersión activa en poblaciones de T.
infestans en aéreas menores a 400 metros, con tamaños muéstrales poblaciones significativas.
12
1.4. Pregunta de investigación
El trabajo de la tesis se enfocara en dilucidar a escala micro-geográfica la organización y
estructuración genética de T. infestans. Por esta razón, la pregunta científica más sobresaliente
es:
¿Cómo están organizadas y estructuradas las poblaciones de T. infestans a nivel micro-
geográfico, dentro una vivienda, entre dos viviendas vecinas distantes a 50 m y entre
sus estructuras cercanas (un gallinero) a 10 m de la primera vivienda?
1.5. Hipótesis
H0: Las poblaciones de T. infestans a nivel micro-geográfico dentro una vivienda,
entre dos viviendas vecinas distantes a 50 m y entre sus estructuras cercanas (un
gallinero) a 10 m de la primera vivienda, se encuentran estructuradas
espacialmente, presentan altos niveles de consanguinidad y un bajo nivel de flujo
génico entre ellas (Marcet et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2008, Pizarro et al.
2008, Pérez De Rosas et al. 2013).
H1: Las poblaciones de T. infestans a nivel micro-geográfico dentro de una
vivienda, entre dos viviendas vecinas distantes a 50 m y entre sus estructuras
cercanas (un gallinero) a 10 m de la primera vivienda, representan en su conjunto
a una sola colonia constituida por familias, las cuales se encuentran distribuidas
en las tres estructuras analizadas y presentan un bajo nivel de estructuración
genética entre ellas.
13
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Identificar familias y colonias de T. infestans en triatominos capturados de dos viviendas
cercanas (50 m) y un gallinero vecino (distante de 10 m de la primera vivienda) por análisis
genealógico, y determinar el grado de estructuración genética en dos niveles de análisis: espacial
(usando poblaciones determinadas según lugar de captura) y según familias y colonias de T.
infestans, con el fin de poder delimitar unidades de rociado.
2.2. Objetivos específicos
O1: Identificar en base al método de máxima verosimilitud el número de familias y
colonias presentes en la población total de T. infestans:
Analizar su tipo de relacionamiento (monogamia-poligamia),
Calcular su tasa de crecimiento poblacional finita.
O2. Deducir a partir de dos niveles de análisis (espacial, y según familias - colonias):
El grado de variación genética dentro las poblaciones,
Eventos recientes de cuello de botella,
El nivel de diferenciación genética entre pares de poblaciones.
O3. Delimitar unidades de rociado (UR) a razón de:
El cálculo del número de migrantes (Nm) en base a tres métodos indirectos,
La estimación del rango de dispersión activa por caminata.
14
3. METODOLOGÍA
3.1. Área de estudio
Las poblaciones de T. infestans para el estudio fueron colectadas en marzo 2011 en la
localidad de la Brecha (Lat.:-19.50°; Long.: -62.56°), perteneciente al Municipio de Charagua,
Provincia Cordillera, Departamento de Santa Cruz (Figura 5).
Figura 5. Área de estudio. Localidad de La Brecha
La Brecha es una localidad compuesta de unas 120 viviendas, pertenece al eco-región del
Gran Chaco, la cual abarca cerca de 1,3 millones de km2 desde el norte de Argentina, Bolivia y
Paraguay. Este eco-región se caracteriza por presentar altos niveles de pobreza y por ser un área
híper-endémica de la enfermedad del Chagas (Gurtler 2009).
15
3.2. Poblaciones de triatominos
Los insectos fueron capturados por la técnica de búsqueda activa en todos los lugares
posibles (en grietas de las paredes o detrás de los colgados (ropa, cuadros etc.), en los catres y
colchones de las camas, etc.), agarrándolos con pinzas.
Los lugares de colecta fueron (Figura 6):
Una casa dormitorio (casa A)
Una casa dormitorio (casa C) a unos 50m de la casa A
Un gallinero (B) a unos 10 m de la casa A
Figura 6. Distancias geográficas entre estructuras (dormitorios A-C y gallinero B)
16
La población A fue capturada dentro de la casa-dormitorio A, con un área 4×2 m2 en la
cual se encontraban cuatro camas. Los insectos fueron colectados tanto de las grietas de las
camas como de las paredes. (Figura 7). La población de la casa A (población A) está compuesta
de 112 triatominos, la estructuración demográfica de esta población se encuentra en la (Tabla 2).
Figura 7. (a) Casa-dormitorio A y (b) distribución espacial dentro de la casa-
dormitorio.
Tabla 2. Estructura demográfica de la población A
Lugar decaptura
Estadios de desarrolloTotal
N1 N2 N3 N4 N5 Macho Hembra
Cama1 6 7 8 2 1 0 0 24
Cama 2 1 4 1 1 0 0 0 7
Cama 3 2 1 3 1 0 1 0 8
Cama 4 2 22 6 2 0 1 0 33
Paredes 0 0 2 4 18 9 7 40
Total 11 34 20 10 19 11 7 112
17
La población B fue capturada dentro de un gallinero con un área de 3×2 m2, situado a
unos 10 m de la casa A. Este gallinero esta hecho de tabique y barro, los insectos fueron
colectados dentro de grietas en las paredes y cerca de donde empollan las gallinas (Figura 8). La
población del gallinero B (población B) está compuesta de 96 triatominos, la estructuración
demográfica de esta población se encuentra en la (Tabla 3).
Figura 8. Gallinero B peri-domiciliar
Tabla 3. Estructura demográfica de la población B
Lugar decaptura
Estadios de desarrolloTotal
N1 N2 N3 N4 N5 Macho Hembra
Gallinero 0 0 0 3 41 28 24 96
18
La población C fue capturada dentro de una casa-dormitorio de un área de 4×2 m2, en la
cual se encontraban cuatro camas. Los insectos fueron colectados tanto de las grietas de las
camas como de las paredes (Figura 9). La población de la casa C (población C) está compuesta
de 169 triatominos. La estructuración demográfica de esta población se encuentra en la (Tabla 4).
Figura 9. (a) Casa-dormitorio C y (b) distribución espacial dentro de la casa-
dormitorio
Tabla 4. Estructura demográfica de la población C.
Lugar decaptura
Estadios de desarrolloTotal
N1 N2 N3 N4 N5 Macho Hembra
Cama1 6 13 1 0 0 0 0 20
Cama 2 1 0 0 0 0 0 0 1
Cama 3 44 36 28 6 6 8 2 130
Cama 4 4 1 2 4 0 0 0 8
Paredes 0 0 1 0 2 4 3 10
Total 52 50 32 10 8 12 5 169
19
Los triatominos colectados fueron codificados y guardados individualmente en tubos
Eppendorf con etanol al 70% hasta su procesamiento en el laboratorio de entomología del
INLASA. Instituto Nacional de Laboratorios de Salud (La Paz).
3.3. Genotipado de Microsatelites
3.3.1. Extracción de DNA
El ADN genómico se extrajo de cada población de triatominos a partir del tejido de sus
patas con el protocolo siguiente: Se homogenizo las patas de cada insecto colectado en 200 µl de
solución CTAB al 2% y se los incubo por toda la noche a 37 °C. Se aisló los ácidos nucleicos del
resto del material celular (proteínas y lípidos) añadiendo 200 µl de cloroformo y
centrifugándolas a 12000 rpm, luego se paso a purificar e inhibir a las desoxirribonucleasas
(Dnasa) del material genético a través de lavados y centrifugaciones sucesivas con isopropanol y
etanol al 70% a 13000 rpm (ver protocolo extenso en Anexo 1).
El ADN genómico purificado de las poblaciones de triatominos se visualizo en geles de
agarosa al 1%, luego se lo cuantifico utilizando el espectrofotómetro Biomate 3 (Thermo, USA).
En base a los datos obtenidos de la cuantificación llevamos todas las muestras a una sola
concentración (20 ng/µl).
3.3.2. Amplificación por PCR
Se amplifico por PCR 8 regiones especificas del DNA genómico de T. infestans
utilizando marcadores designados por García et al. (2004). El cebador delantero de cada par esta
marcado en el extremo 5’ por flúoro-cromos (Applied Biosystems): 6-FAM (azul), NED (negro),
VIC (verde) y PET (rojo), (Tabla 5).
20
Tabla 5. Lista de cebadores de loci microsatelites de T. infestans
Locus Secuencia del cebador (5’3’) Colección derepeticiones
Tamaño delfragmento
(pb)
Fluoro-cromo
TiA02F:GGAAACTCATGTTATGGACACG
(GT)6G(GT)8AT(GT)3 197 VICR:AAACCTTATTGTTAGTTCGTTTTGG
TiC02F:CTCTGGGGATCATCGTTCTG
(GT)10 159 PETR:TTTAGGATTCATACCGCCTTT
TiC08F:TTACTGCCACATTGCGTCAT
(GT)11ATGTATT(GT)2 203 NEDR:TCGTGATTGCAAGGAGGAAT
TiC09F:TTTGCCACATTTACCATTTCC
(GT)9 139 VICR:TCAAGAGAAGCCGTCCAACT
TiD09F:TGGACATAAGCCCCCTGTAA
(GT)14(ATGT)3 208 6-FAMR:GGATCCTACTGTGCGGATGT
TiE02F:AGCACGGTTTGCAACTTTTC
(GT)13CTGCCT(GTGC)2 147 NEDR:TGTGGAATTGAAGGAGCACA
TiE12F:CCTTTAATTTCCCTTTGCCATC
(GT)9GGGA(GT)9 301 6-FAMR:CCTACACGAAATGCCCAAGT
TiFO3F:AAAATGGCGGACAAACATTC
(GT)17 176 PETR:TTCCTCAACACAAACACAAACC
La reacción en cadena de la polimerasa PCR, se realizó en el termociclador Px2 Thermal
Cycler (Thermo, USA) en 21 µl de la solución que contenía 1.5 mM de Buffer 1X/MgCl, 200
µM de cada dNTP, 100 µM de cada cebador, de 10 a 50 ng de ADN genómico y 3 U/µl de Taq
Polimerasa (Amplitaq Gold, Perkin-Elmer Cetus). Las condiciones de corrida consiste en una
primera etapa de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de unos 34 ciclos de 30 s
a 94 °C (desnaturalización), 30 s a 55 °C (alineamiento) y 30 s a 72 °C (extensión), por último un
ciclo final de extensión de 10 min a 72 °C y 5 min a 4 °C. Los productos del amplificado fueron
visualizados en geles de agarosa al 1.5 % (Figura 10).
21
Figura 10. Visualización de los ocho cebadores amplificados.
3.3.3. Determinación del tamaño de los amplificados
Se alícuoto 1 ml. de HiDi (formamide) (Applied Biosystems, UK), en tubos eppendorf de
1.5 ml, a los cuales se añadió 12 µl de Genescan 500 LIZ (Applied Biosystems, UK), luego se lo
mezclo bien y se lo repartió en un volumen de 16 µl de la mezcla más 1 µl del ADN amplificado
en las respectivas placas de envío.
Se rotulo y envolvió con papel estañado cada placa, las cuales fueron enviadas a la
Plateforme Génomique Environnementale du Labex « Centre Méditerranéen Environnement
Biodiversité », Université de Montpellier II, Francia, donde se determinaron los tamaños de los
productos de la PCR relativo a un estándar interno (GeneScan-500 ROX) en geles de
poliacrilamida utilizando un secuenciador de ADN automático ABI PRIMS 377. Los resultados
del análisis fueron enviados en formato (.fsa) como electro-ferogramas vía correo electrónico.
21
Figura 10. Visualización de los ocho cebadores amplificados.
3.3.3. Determinación del tamaño de los amplificados
Se alícuoto 1 ml. de HiDi (formamide) (Applied Biosystems, UK), en tubos eppendorf de
1.5 ml, a los cuales se añadió 12 µl de Genescan 500 LIZ (Applied Biosystems, UK), luego se lo
mezclo bien y se lo repartió en un volumen de 16 µl de la mezcla más 1 µl del ADN amplificado
en las respectivas placas de envío.
Se rotulo y envolvió con papel estañado cada placa, las cuales fueron enviadas a la
Plateforme Génomique Environnementale du Labex « Centre Méditerranéen Environnement
Biodiversité », Université de Montpellier II, Francia, donde se determinaron los tamaños de los
productos de la PCR relativo a un estándar interno (GeneScan-500 ROX) en geles de
poliacrilamida utilizando un secuenciador de ADN automático ABI PRIMS 377. Los resultados
del análisis fueron enviados en formato (.fsa) como electro-ferogramas vía correo electrónico.
21
Figura 10. Visualización de los ocho cebadores amplificados.
3.3.3. Determinación del tamaño de los amplificados
Se alícuoto 1 ml. de HiDi (formamide) (Applied Biosystems, UK), en tubos eppendorf de
1.5 ml, a los cuales se añadió 12 µl de Genescan 500 LIZ (Applied Biosystems, UK), luego se lo
mezclo bien y se lo repartió en un volumen de 16 µl de la mezcla más 1 µl del ADN amplificado
en las respectivas placas de envío.
Se rotulo y envolvió con papel estañado cada placa, las cuales fueron enviadas a la
Plateforme Génomique Environnementale du Labex « Centre Méditerranéen Environnement
Biodiversité », Université de Montpellier II, Francia, donde se determinaron los tamaños de los
productos de la PCR relativo a un estándar interno (GeneScan-500 ROX) en geles de
poliacrilamida utilizando un secuenciador de ADN automático ABI PRIMS 377. Los resultados
del análisis fueron enviados en formato (.fsa) como electro-ferogramas vía correo electrónico.
22
La lectura de los electroferogramas (Figura 11) y el armado de las tablas de genotipos se
realizó utilizando la aplicación Genious Microsatellite del programa Genious Pro 5.6
(BiomattersLtd).
Figura 11. Determinación de genotipos (visor de la plataforma Genious
Microsatellite).
23
3.4. Análisis genealógico
3.4.1. Identificación de familias (Full-sib) y colonias (Half-sib)
El número de familias y colonias presentes en la población total se ha estimado utilizando
el programa COLONY v2.0 (Owen &Wang 2010), a través del método de asignación por
máxima probabilidad para asignar y/o inferir paternidad y determinar unidades familiares entre
individuos usando genotipos multilocus, en una simple generación. El programa asigna a los
individuos dentro de “Full-sib” (familias) anidadas en “Half-sib” (colonias). Las opciones de
corrida del programa se describen en la (Tabla 6).
Tabla 6. Opciones usadas para la ejecución del programa Colony
Opción del programa Descripción
Mating system I Poligamia para ambos sexos (poliandria ypoliginia)
Mating system II Ausencia de consanguinidad
Dioceous Especie diploide
Largo de corrida Media
Método de análisis Full-likelihood (método exacto y verificado poranálisis de datos empíricos (Wang 2004, Wang&Santure 2009, Wang 2012)
Precisión de verosimilitud Alta
Especificaciones de Corrida Sin actualización de frecuencias alelicas
Número de corridas 1
Sed de números aleatorios 1234 criterio basado en el método Monte Carlo
Sibship Prior No prior
Se considero también a todos los adultos hembras y machos de T. infestans colectados en
la población total, como posibles padres en el análisis. Por último los resultados obtenidos de
paternidad y maternidad se visualizaron en un gráfico de pedigrí utilizando el programa Pedigree
Viewer versión 6.5b (Kinghorn &Kinghorn 2010).
24
3.4.2. Cálculo de la tasa finita de crecimiento (λ)
Se ha calculado el promedio la tasa de crecimiento (λ) de T. infestans a partir de la
abundancia relativa de triatominos según estadio de desarrollo en el tiempo, según la siguiente
fórmula:
= ( + 1)/ ( )Donde λ indica cuan rápida o lentamente aumenta o se reduce el tamaño poblacional, si
(λ>1) la población aumenta, si (λ=1) la población se mantiene por ultimo si (λ<1) la población se
reduce. N(t) representa a la abundancia de triatominos según cada estadio de desarrollo y
N(t+1)representa a la abundancia de triatominos del estadio superior inmediato.
Por ejemplo para obtener la tasa de crecimiento para las ninfas N1, se ha dividido la
abundancia del estadio inmediato superior N2 respecto a la abundancia de ninfas N1:
( 1) = ( 2)/ ( 1)Después de obtener la tasa de crecimiento (λ) para cada estadio ninfal desde N1 hasta las
N5, se ha proseguido a calcular la media geométrica de las familias y la colonia.
= (0) ∗ (1)… ( )Por ejemplo para obtener la media geométrica de la familia 1 de T. infestans se ha
multiplicado las tasas de crecimiento (λ) mensuales de cada estadio ninfal presente en la familia
= [ ( 1) ∗ ( 2) ∗ ( 3) ∗ ( 4) ∗ ( 5)]Por último se ha aplicado raíz quinta al resultado obtenido de la multiplicación:
= ( 1) ∗ ( 2) ∗ ( 3) ∗ ( 4) ∗ ( 5)
25
3.5. Estructuración genética de T. infestans
La estructuración genética en las poblaciones de T. infestans a una escala micro-
geográfica, se la analizo en dos niveles:
Espacial, usando poblaciones determinadas según lugar de captura,
Según familias y colonias.
En cada caso se determino el nivel de variación genética, eventos recientes de cuello de
botella, el grado de diferenciación genética y la estructura espacial de la población.
3.5.1. Estimación del nivel de variación genética
La variación genética en los dos niveles (espacial y según familias –colonias) se estimó a
través de la heterocigosidad observada promedio (Ho), la heterocigosidad esperada promedio
(He), y el número promedio de alelos por locus (A). La He se ha calculado usando el estimador
basado y descrito por Nei (1987) usando el programa ARLEQUIN versión 3.5 (Excoffier et al.
2005).
El equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) ha sido calculado en base al coeficiente de
consanguinidad FIS (Wright 1951) usando el estimador ƒ de Weir & Cockerham (1984) y por una
prueba exacta de HW usando el método de aleatorización en cadena de Markov (Guo
&Thompson 1992). Los valores exactos de significancia se obtuvieron en base al método de
enumeración completa (Louis &Dempster 1987). Ambos métodos se realizaron usando el
programa GENEPOP versión 4.2 (Rousset 2008).
Los valores de FIS por cada locus y por cada sub-población, se ha calculado en base a los
estimadores de (Weir &Cockerham 1984) y (Robertson &Hill 1984). La significancia de FIS (IC
95%) se obtuvo después del muestreo con remplazo (1000) de los individuos con la totalidad de
los loci para cada oblación, ambos procesos realizados en el programa GENETIX v4.05.2
(Belkhir et al. 2000).
26
3.5.2. Test de Heterocigosidad
El test de heterocigosidad se ha calculado en dos niveles (espacial y según familias –
colonias), a través de la comparación de dos estimaciones de la heterocigosidad esperada: la
primera basada en las frecuencias alelicas (HE), y la segunda basada en el número de alelos y el
tamaño de la muestra (Heq) (Cornuet &Luikart 1996). Si una población experimenta un cuello de
botella, pierde alelos raros y Heq decrece rápidamente respecto a HE. Este aparente exceso de
heterocigosidad [HE > Heq], es un indicador de un reciente evento de cuello de botella. Por el
contrario [HE < Heq], nos indica un evento reciente de expansión poblacional.
Se utilizo la prueba de asignamiento de rango Wilcoxon para determinar la significancia
del número de loci con [HE > Heq] o [HE < Heq]. La estimación de Heq se ha basado en tres
modelos mutacionales: modelo de mutación paso a paso (SMM), modelo de mutación de alelos
infinitos (IAM) y el modelo de mutación intermedia a dos pasos (TPM) con una fracción de
mutación posible con repetición al 10%, 20% y 30%. Todo este proceso se ha realizado en el
programa BOTTELNECK versión 1.2.02 (Cornuet &Luikart 1996).
3.5.3. Estimación del grado de diferenciación genética
El grado de diferenciación genética en los dos niveles analizados (espacial y según
familias), se lo ha evaluado a través del cálculo del estimador FST global (en todos las
poblaciones), FST entre pares (Weir &Cockerham 1984) y RST entre pares (Michalakis
&Excoffier 1996) usando el programa Genepop 4.2 ((Rousset 2008). La significancia de la
diferenciación genética ha sido probada usando el test de diferenciación génica en Genepop 4.2,
los P-valores fueron ajustados por múltiple comparación usando la corrección secuencial de
Bonferroni (Rice 1989).
3.6. Unidades de Rociado
3.6.1. Estimación del número de migrantes
El número de migrantes por generación (Nm) se ha estimado en dos niveles de análisis
espacial y según familias-colonias de T. infestans, utilizando tres métodos indirectos:
27
a) Nm a partir de la formula FST ≈ 1/(4Nm + 1) (Wright 1969), Este parámetro nos
aportara información valiosa acerca del nivel de flujo génico entre poblaciones de
T. infestans. Este proceso se ha computado usando el programa GENETIX
versión 4.03 (Belkhir et al. 2000).
b) Nm utilizando el método de alelos privados con corrección por tamaño de muestra
(Barton &Slatkin 1986), en el que con base a muestras de diferentes localidades
obtiene p(1), que es la frecuencia promedio de alelos que solo están en una
muestra. Este proceso se lo ha realizado usando el programa Genepop versión 4.2
(Rousset, 2008).
c) Nm usando el test de migrantes en primera generación del programa
GENECLASS2 (Piry et al. 2004). La cual está basada en el criterio bayesiano
derivado del método (Rannala & Mountain 1997). Las opciones de corrida del
programa se describen en la (Tabla 7).
Tabla 7. Opciones usadas para la ejecución del programa Geneclass2
Opción del programa Descripción
Meta computacional Aplicación: Detección de migrantes en primera
generación. Calculo de probabilidad L=L_home /
L_max (Paetkau et al. 2004).
Criterio de Computación Métodos bayesianos (Rannala &Mountain 1997)
Probabilidad de computación Habilitar probabilidad de computación (re-
muestreo Monte-Carlo. Algoritmo de simulación
(Paetkau et al. 2004). Número de simulaciones
individuales 10000. Tipo de error 1 (α=0,01).
3.6.2. Análisis individual de auto-correlación espacial
El análisis de auto-correlación espacial para loci microsatelites multialélicos
codominantes (Smouse &Peakall 1999) se lo ha realizado para cada estadio de desarrollo de T.
infestans incluidos hembras y machos adultos en el programa GENEALEX versión 6.2 (Peakall
&Smouse 2006). Este programa calcula el coeficiente de auto-correlación multilocus r entre
28
genotipos individuales basados en pares de distancias geográficas y genéticas. El coeficiente de
auto-correlación r es estimado para un número específico de clases de distancia, las cuales
proveen una medida de similitud genética entre pares de individuos que decae con cada distancia
de clase.
El análisis de auto correlación espacial esta focalizado en un radio de 50 metros,
involucrando tres poblaciones de T. infestans provenientes de dos casas dormitorios (A-C) y un
gallinero (B). Los datos utilizados para el análisis consisten en 376 insectos de todos los estadios
N1 (61), N2 (85), N3 (52), N4 (22), N5 (68), hembras adultas (38) y machos adultos (50).
Primero se ha calculado dos matrices, una de distancia genética y una de distancia
geográfica, para la colonia y para cada uno de los estadios de T. infestans, luego se ha
introducido el número de permutaciones igual a 999 (valor máximo autorizado por el programa)
y un número de secuencia de instrucciones igual 999 para poder obtener un intervalo de
confianza del 95% para r. Por último se utilizo la opción de clases de distancias variables, los
intervalos de clase utilizados fueron de: 0.5m, 1m, 3m, 5m, 10m, 20m, 30m, 40m, 45m, 48m y
50m.
Los resultados se observan en diagramas de auto-correlación espacial, estos son
mostrados en gráficos, en los cuales el coeficiente r es calculado en función a la distancia
genética y geográfica. Se determino el intervalo de confianza de r corriendo 1000 permutaciones
aleatorias (Peakall et al. 2003). El coeficiente r es significativo cuando el valor cero no cae en el
intervalo de confianza.
29
4. RESULTADOS
Un total de 381 insectos provenientes de dos dormitorios y un gallinero han sido
tipificados con 8 loci microsatelites.
4.1. Análisis genealógico
4.1.1. Identificación de familias (Full-sib) y colonias (Half-sib)
Los resultados obtenidos por el programa COLONY v2., indican que las tres poblaciones
colectadas (dormitorios + gallinero) representan a una sola colonia compuesta por 42 familias
(Figura 12).
Figura 12. Pedigrí de la colonia de T. infestans; Líneas paternales de color rojo y
líneas maternales de color amarillo. Los números representan los individuos.
Números con* = padres *, y números con # = madres.
Las 42 familias se originan del cruce de 21 progenitores (11 madres y 10 padres), a partir
de relaciones de poliandria como de poliginia para ambos sexos (
Tabla 8).
29
4. RESULTADOS
Un total de 381 insectos provenientes de dos dormitorios y un gallinero han sido
tipificados con 8 loci microsatelites.
4.1. Análisis genealógico
4.1.1. Identificación de familias (Full-sib) y colonias (Half-sib)
Los resultados obtenidos por el programa COLONY v2., indican que las tres poblaciones
colectadas (dormitorios + gallinero) representan a una sola colonia compuesta por 42 familias
(Figura 12).
Figura 12. Pedigrí de la colonia de T. infestans; Líneas paternales de color rojo y
líneas maternales de color amarillo. Los números representan los individuos.
Números con* = padres *, y números con # = madres.
Las 42 familias se originan del cruce de 21 progenitores (11 madres y 10 padres), a partir
de relaciones de poliandria como de poliginia para ambos sexos (
Tabla 8).
29
4. RESULTADOS
Un total de 381 insectos provenientes de dos dormitorios y un gallinero han sido
tipificados con 8 loci microsatelites.
4.1. Análisis genealógico
4.1.1. Identificación de familias (Full-sib) y colonias (Half-sib)
Los resultados obtenidos por el programa COLONY v2., indican que las tres poblaciones
colectadas (dormitorios + gallinero) representan a una sola colonia compuesta por 42 familias
(Figura 12).
Figura 12. Pedigrí de la colonia de T. infestans; Líneas paternales de color rojo y
líneas maternales de color amarillo. Los números representan los individuos.
Números con* = padres *, y números con # = madres.
Las 42 familias se originan del cruce de 21 progenitores (11 madres y 10 padres), a partir
de relaciones de poliandria como de poliginia para ambos sexos (
Tabla 8).
30
Tabla 8. Sistema de relacionamiento entre progenitores de T. infestans
PADRES# M × H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 322
MA
DR
ES
1 232 1 1 3
2 88 1
3 2 1 1 1 1 5
4 1 1 1 3
5 1 1 2
6 1 1 1 1 4 5
7 3 1 3 1 4
8 1 1 1 1 4
9 3 1 1 1 4
10 1 1 2 1 4
11 3 2 2 1 4
184 1 1 1 3
# H × M 3 2 3 4 3 5 2 5 5 3 6
# M × H Número de machos por hembra (Poliandria); # H × M Número de hembras
por macho (Poliginia)
De las 42 familias detectadas las mas abundantes son la familia F1 con 232 triatominos,
seguida por la familia F2 con 88 triatominos, ambas provienen de relaciones prioritariamente
monogamas, mientras que el resto desde la F3 hasta la F42 presentan una abundancia mínima (de
entre 1 a 4) triatominos por familia, estas provienen de relaciones poligamas (Figura 13).
31
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43
Familia
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Núm
ero
deT.
infe
stan
s
Figura 13. Abundancia de triatominos según familia
Las familias no están distribuidas de forma equitativa en las tres estructuras analizadas,
de estas el mayor número están presentes en la casa dormitorio C, seguido del gallinero B y por
último la casa dormitorio A (Tabla 9).
Tabla 9. Proporción de familias T. infestans según estructura domiciliaria
N° FEST
A B C
EST
A 6
B 13
C 29
TOTAL 42
N° F Número de familias EST Estructura de colecta: casa dormitorio A, gallinero B,casa dormitorio C
32
Las familias F1 y F2 que presentan la mayor abundancia (>80 individuos), están
distribuidos en las tres estructuras analizadas (Figura 14), mientras que el resto muestran su
mayor abundancia en el dormitorio C.
Figura 14. Abundancia de triatominos según familia y lugar de captura
4.1.2. Cálculo de la tasa finita de crecimiento (λ)
El caculo de la tasa finita de crecimiento muestra que la colonia presenta una tasa de crecimiento
positiva aumentando un 7%/mes (λ=1,07). A nivel de las familias los resultados revelan que la
familia F2 presenta una mayor tasa de crecimiento 22%/mes (λ=1,22) respecto a la familia F1 de
mayor abundancia de insectos con un 3%/mes (λ=1,03) (Tabla 10).
33
Tabla 10. Cálculo de la tasa finita de crecimiento
AÑO MES ESTADIOF1 F2 COLONIA
N(t) λ N(t) Λ N(t) λ
2010
Octubre
Adultos 46 34 88
Noviembre
Diciembre Ninfas 5 37 1.24 23 1.47 68 1.29
2011
Enero Ninfas 4 12 3.08 3 7.67 19 3.58
Febrero Ninfas 3 41 0.29 2 1.5 54 0.35
Marzo Ninfas 2 58 0.70 14 0.14 85 0.63
Abril Ninfas 1 38 1.53 12 1.16 62 1.37
MEDIA GEOMETRICA λ (F1) = 1.03 λ (F2) = 1.22 λ (COL) = 1.07
4.2. Estructuración genética de T. infestans
4.2.1. Estimación del nivel de variación genética
Half-sib (Colonia)
Dentro la colonia, el número promedio de alelos por locus es de 8,625±3,583. El test
exacto de HW indica que la heterocigosidad observada en la colonia presenta un significativo
déficit de heterocigotos (Tabla 11).
Por consiguiente el cálculo del coeficiente de consanguinidad FIS acorde al test exacto de
HW nos indica que la colonia de T. infestans presenta un significativo grado de endogamia o
apareamientos entre individuos emparentados (FIS = 0.0015*).
34
Tabla 11. Variación genética dentro la colonia de T. infestans
POBLACIÓNLOCUS
PROMEDIO FIS
A02 E12 F03 C08 E02 C02 D09 C09
COL (376)
NA 11 5 8 5 5 15 10 10 8,625±3,583
0,0015*HO 0.63380* 0.81233 0.93867 0.36461* 0.72118* 0.70509* 0.73262* 0.48396* 0,67403*
HE 0.77525 0.56229 0.76111 0.60070 0.65116 0.75697 0.74112 0.55205 0,67508
NA número de alelos por locus; HO heterocigosidad observada; HE heterocigosidad
esperada; y FIS coeficiente de consanguinidad. Significancia del coeficiente FIS (IC
95%) 1000 permutaciones de corrida: *P<0,05 NSP. Significancia del exceso de
heterocigotos usando el test de permutación Cadena de Markof 100.000
permutaciones: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001
Full-sibs (Familias)
Las familias analizadas presentaron una variación en el promedio del número de alelos
por locus que varía de entre 6,500 a 8,125 (Tabla 12).
El test exacto de HW indica que las familias 1 y 2 presentan un significativo exceso de
heterocigotos. El cálculo del coeficiente de consanguinidad FIS acorde al test exacto de HW,
indica que ambas familias presentan exogamia o reproducción cruzada (FIS=-0.0250NS y FIS=-
0.0150NS respectivamente) (Tabla 12).
35
Tabla 12. Variación genética dentro las familias de T. infestans
POBLACIÓNLOCUS
PROMEDIO FIS
A02 E12 F03 C08 E02 C02 D09 C09
F1 (232)
NA 11 5 8 5 5 13 9 9 8,125±2,997
-0,0250NSHO 0.68950* 0.79565 0.94805 0.34783* 0.70000* 0.75217* 0.70259* 0.49565* 0,67893*
HE 0.75726 0.56850 0.73684 0.58697 0.64743 0.75312 0.70910 0.53982 0,66238
F2 (88)
NA 8 4 7 3 3 12 8 7 6,500±3,071
-0,0150NSHO 0.59524* 0.81609 0.90909 0.31818* 0.77011** 0.57955* 0.81395* 0.36364* 0,64573*
HE 0.62839 0.54315 0.72786 0.55032 0.66514 0.70331 0.76928 0.50221 0,63621
NA número de alelos por locus; HO heterocigosidad observada; HE heterocigosidad
esperada; y FIS coeficiente de consanguinidad. Significancia del coeficiente FIS (IC
95%) 1000 permutaciones de corrida: *P<0,05 NSP. Significancia del exceso de
heterocigotos usando el test de permutación Cadena de Markof 100.000
permutaciones: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Espacial entre estructuras domiciliares: casa dormitorio (A-C) y gallinero (B).
De las tres poblaciones analizadas, el promedio del número de alelos por locus varió de
entre 5,875 a 7,250. El test exacto de HW muestra que la heterocigosidad observada en ambas
casas dormitorios A y C presentan un exceso significativo de heterocigotos, en cambio el
gallinero B presenta déficit de heterocigotos (Tabla 13).
El cálculo del coeficiente de consanguinidad FIS acorde al test exacto de HW nos indica
que para ambas casas dormitorios las poblaciones de T. infestans presentan un no significante
grado de exogamia o reproducción cruzada (FIS=-0.0800NS y FIS=-0.0669NS respectivamente).
Por el contrario la población proveniente del gallinero presenta un significativo grado de
endogamia o apareamientos entre individuos emparentados (FIS=0.0048*) (Tabla 13).
36
Tabla 13. Variación genética dentro las poblaciones T. infestans analizadas
ESTRUCTURALOCUS
PROMEDIO FIS
A02 E12 F03 C08 E02 C02 D09 C09
A (111)
NA 10 5 5 3 3 8 7 6 5,875±2,416
-0.0800NSHO 0.63810* 0.75229* 0.92793 0.27928* 0.75676 0.66667* 0.73874* 0.51351* 0,65916*
HE 0.75489 0.54593 0.70747 0.25678 0.61490 0.73425 0.72333 0.54674 0,61054
B (96)
NA 10 4 6 3 4 13 10 8 7,250±3,576
0.0048*HO 0.62105* 0.85859 0.92929 0.38384* 0.70707* 0.60204* 0.70707* 0.43434* 0,65541*
HE 0.74820 0.55873 0.72235 0.52541 0.67379 0.78995 0.71599 0.53438 0,6586
C(166)
NA 10 4 7 3 4 9 8 6 6,375±2,560
-0.0669NSHO 0.63871* 0.82424 0.95152 0.41104* 0.70552** 0.79268** 0.74390* 0.49390* 0,69519*
HE 0.78367 0.57690 0.78480 0.36982 0.65210 0.73232 0.76279 0.55100 0,65168
NA número de alelos por locus; HO heterocigosidad observada; HE heterocigosidad
esperada; y FIS coeficiente de consanguinidad. Significancia del coeficiente FIS (IC
95%) 1000 permutaciones de corrida: *P<0,05 NSP. Significancia del exceso de
heterocigotos usando el test de permutación Cadena de Markof 100.000
permutaciones: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
37
4.2.2. Test de Heterocigosidad
Half-sib (Colonia)
A nivel de la colonia los resultados del análisis muestran un significante exceso de
heterocigosis bajo los modelos de mutación IAM y TPM al 70%, lo cual implica que la colonia
ha sufrido un evento reciente de cuello de botella (Tabla 14).
Tabla 14. Test de heterocigosidad de la colonia de T. infestans
POBLACIÓNSMM TPM (90%) TPM (80%) TPM (70%) IAM
HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq
COL (376) 1* 7** 3* 5* 4* 4* 6* 2* 7** 1*
HE: Estimación de la media no sesgada de la heterocigosidad esperada; Heq:Heterocigosidad esperada a partir del número de alelos observados. SMM: Modelo
de mutación paso a paso; TPM: Modelo de mutación en 2-pasos y IAM: Modelo de
alelos infinitos. HE˃Heq número de loci que presentan (Exceso de heterocigotos);HE˂Heq número de loci que presentan (déficit de heterocigotos). Significancia del
test Wilcoxon a una cola de los rangos asignados para el déficit y exceso de
heterocigotos. NS no-significante, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Los valores
significantes de exceso de heterocigotos están indicados en negrita y subrayados.
Full-sibs (Familias)
En la familia 1 (F1), los resultados del test muestran un significativo déficit de
heterocigosis en dos de los tres modelos de mutación analizados SMM y TPM al (90%)
apuntando a que la familia ha sufrido un evento reciente de expansión poblacional (Tabla 15).
Por el contrario el análisis de la familia 2 (F2), muestra un significante exceso de heterocigosis
bajo dos de los tres modelos de mutación analizados IAM y TPM al (70%, 80%) indicando que
esta familia ha sufrido un reciente evento de cuello de botella.
38
Tabla 15. Test de heterocigosidad según familias de T. infestans
POBLACIÓNSMM TPM (90%) TPM (80%) TPM (70%) IAM
HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq
F1 (232) 1* 7** 1* 7** 4* 4* 4* 4* 7** 1*
F2 (88) 2* 6* 4* 4* 5* 3* 5* 3* 5** 3*
HE: Estimación de la media no sesgada de la heterocigosidad esperada; Heq:Heterocigosidad esperada a partir del número de alelos observados. SMM: Modelo
de mutación paso a paso; TPM: Modelo de mutación en 2-pasos y IAM: Modelo de
alelos infinitos. HE˃Heq número de loci que presentan (Exceso de heterocigotos);HE˂Heq número de loci que presentan (déficit de heterocigotos). Significancia del
test Wilcoxon a una cola de los rangos asignados para el déficit y exceso de
heterocigotos. NS no-significante, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Los valores
significantes de exceso de heterocigotos están indicados en negrita y subrayados.
Según estadio de desarrollo
A nivel de los estadios dentro la colonia de T. infestans, notamos que todos los estadios
ninfales e incluso machos y hembras adultas presentan un significante exceso de heterocigosis en
dos de los tres modelos de mutación analizados IAM y TPM al (70%, 80%) (Tabla 16), lo cual
revela que estos triatominos han sufrido un evento reciente de cuello de botella.
Cabe resaltar que la señal más marcada de haber sufrido un evento de cuello de botella lo
presentan las ninfas N2 con un significante exceso de heterocigosis en los tres modelos de
mutación utilizados analizados IAM, TPM al (70%, 80%, 90%) y SMM.
39
Tabla 16. Test de heterocigosidad según estadios de desarrollo
ESTADIOSSMM TPM (90%) TPM (80%) TPM (70%) IAM
HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq
N1 (62) 4* 4* 4* 4* 5* 3* 5* 3* 7** 1*
N2 (85) 5* 3* 5* 3* 6* 2* 6** 2* 7** 1*
N3 (54) 2 6** 2* 6* 5* 3* 6* 2* 8*** 0*
N4 (19) 4* 4* 4* 4* 6* 2* 6* 2* 6** 2*
N5 (68) 2* 6* 3* 5* 4* 4* 5* 3* 7** 1*
HA (38) 2* 6* 4* 4* 4* 4* 5* 3* 7* 1*
MA (50) 2* 6** 3* 5* 4* 4* 5* 3* 7** 1*
HE: Estimación de la media no sesgada de la heterocigosidad esperada; Heq:Heterocigosidad esperada a partir del número de alelos observados. SMM: Modelo
de mutación paso a paso; TPM: Modelo de mutación en 2-pasos y IAM: Modelo de
alelos infinitos. HE˃Heq número de loci que presentan (Exceso de heterocigotos);HE˂Heq número de loci que presentan (déficit de heterocigotos). Significancia del
test Wilcoxon a una cola de los rangos asignados para el déficit y exceso de
heterocigotos. NS no-significante, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Los valores
significantes de exceso de heterocigotos están indicados en negrita y subrayados.
Espacial entre estructuras domiciliares: casa dormitorio (A-C) y gallinero (B)
El resultado del test indica que la población de T. infestans colectada dentro de la casa
dormitorio A, proviene de un reciente evento de expansión poblacional (Tabla 17), el
significativo déficit de heterocigotos en dos de los tres modelos de mutación analizados SMM
y TPM (70%, 80% y 90%) confirman la significancia del evento de expansión poblacional.
40
Tabla 17. Test de heterocigosidad a nivel Espacial
ESPACIALSMM TPM (90%) TPM (80%) TPM (70%) IAM
HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq HE˃Heq HE˂Heq
A (111) 2* 6** 3* 5* 3* 5* 4* 4* 7** 1*
B (96) 3* 5* 4* 4* 4* 4* 4* 4* 7** 1*
C (166) 3* 5* 4* 4* 6* 2* 7** 1* 8*** 0*
HE: Estimación de la media no sesgada de la heterocigosidad esperada; Heq:Heterocigosidad esperada a partir del número de alelos observados. SMM: Modelo
de mutación paso a paso; TPM: Modelo de mutación en 2-pasos y IAM: Modelo de
alelos infinitos. HE˃Heq número de loci que presentan (Exceso de heterocigotos);HE˂Heq número de loci que presentan (déficit de heterocigotos). Significancia del
test Wilcoxon a una cola de los rangos asignados para el déficit y exceso de
heterocigotos. NS no-significante, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Los valores
significantes de exceso de heterocigotos están indicados en negrita y subrayados.
Por otro lado las poblaciones colectadas dentro del gallinero B y la casa dormitorio C
muestran evidencia de haber sufrido ambas un reciente cuello de botella, el significativo exceso
de heterocigotos detectado en dos de los tres modelos de mutación analizados IAM y TPM (70%,
80% y 90%) confirman que estas poblaciones han sufrido un reciente evento de cuello de botella.
4.2.3. Estimación del grado de diferenciación genética
Full-sibs (Familias)
En lo que respecta a la diferenciación genética, los resultados de los estimadores FST y
RST indican que las familias de T. infestans no presentan diferenciación genética entre ellas
(Tabla 18).
41
Tabla 18. Estimación de la diferenciación genética FST y RST entre familias.
Rst
F1 F2Fst
F1 0,027
F2 0,024
Poblaciones: Familia 1 (F1), Familia 2 (F2). Valores subrayados muestran pares de
poblaciones no diferenciadas (Test exacto de Fisher p ≥ 0,05 y corrección
secuencial de Bonferroni p ≥ 0,000023).
Espacial entre estructuras domiciliares: casa dormitorios (A-C) y gallinero (B).
A nivel espacial, los resultados del estimador FST como RST están correlacionadas describiendo
ambas un patrón de aislamiento por distancia, poblaciones de T. infestans colectadas de la casa
dormitorio A y el gallinero B distantes a 10 metros presentan un bajo grado de diferenciación
genética entre ellas (FST = 0,0230 y RST = 0,0180) mientras que entre las poblaciones de T.
infestans provenientes de casas dormitorios distantes a 50 m (A-C), se ha detectado un moderado
grado de estructuración genética (FST= 0,1144 y RST =0,0180) (Tabla 19).
Tabla 19. Estimación del grado de diferenciación genética espacial.
Rst
A B CFst
A 0.0049 0.0180
B 0.0230 0.0161
C 0.1144 0.0636
Poblaciones: Dormitorio A, Dormitorio C y Gallinero B; Valores subrayados
muestran pares de poblaciones no diferenciadas (Test exacto de Fisher p ≥ 0,05 y
corrección secuencial de Bonferroni p ≥ 0,000023).
42
4.3. Unidades de rociado RU
4.3.1. Estimación del número de migrantes
Full-sibs (Familias)
Método Test de migrantes en primera generación: La estimación de migrantes en
primera generación usando el método bayesiano descrito por Rennala & Mountain 1997,
identifica 2 migrantes Machos adultos en primera generación (Tabla 20).
Tabla 20. Migrantes de primera generación entre familias
NmF1 F2
FAM
F1 232 2
F2 2M 88
Diagonal superior: número de migrantes en primera generación; Diagonal central:tamaño de la población; Diagonal inferior: estadios de los migrantes.
Espacial entre estructuras domiciliares: casa dormitorios (A-C) y gallinero B.
Método Nm ≈ 1/4 (1/Fst - 1): La estimación del número de migrantes Nm en base al
modelo de Wright 1969, muestra que el flujo génico entre estructuras domiciliares situadas a 10
metros (A-B) es de aproximadamente 11 migrantes por generación, mientras que el flujo génico
entre estructuras situadas a 50 metros (A-C) es de solamente 2 migrantes por generación.
43
Tabla 21. Estimación del número de migrantes a nivel espacial
DISA B C
Nm
A 10 50
B 11 40
C 2 4
Diagonal inferior: Estimación del número de migrantes (Nm); Diagonal superior:Distancia entre las estructuras (DIS).
En la (Figura 15) se puede observar una relación inversamente proporcional entre la
distancia geográfica y el número de migrantes R2=0,99.
Figura 15. Aislamiento por distancia entre estructuras; Número de migrantes por
generación (Nm) y distancia entre estructuras (DIS).
Método alelos privados: El número de migrantes calculado en base al método de alelos
privados Barton & Slatkin 1986 y corrección por tamaño de la muestra, indica que entre
estructuras domiciliares en un radio de 50 metros existe un número aproximado de 2 migrantes
por generación entre ellas.
Método Test de migrantes en primera generación: La estimación de migrantes en
primera generación usando el método bayesiano descrito por Rennala & Mountain 1997,
0
2
4
6
8
10
12
0Núm
ero
de m
igra
ntes
(Nm
)
43
Tabla 21. Estimación del número de migrantes a nivel espacial
DISA B C
Nm
A 10 50
B 11 40
C 2 4
Diagonal inferior: Estimación del número de migrantes (Nm); Diagonal superior:Distancia entre las estructuras (DIS).
En la (Figura 15) se puede observar una relación inversamente proporcional entre la
distancia geográfica y el número de migrantes R2=0,99.
Figura 15. Aislamiento por distancia entre estructuras; Número de migrantes por
generación (Nm) y distancia entre estructuras (DIS).
Método alelos privados: El número de migrantes calculado en base al método de alelos
privados Barton & Slatkin 1986 y corrección por tamaño de la muestra, indica que entre
estructuras domiciliares en un radio de 50 metros existe un número aproximado de 2 migrantes
por generación entre ellas.
Método Test de migrantes en primera generación: La estimación de migrantes en
primera generación usando el método bayesiano descrito por Rennala & Mountain 1997,
10 20 30 40 50 60
Distancia geográfica (m)
43
Tabla 21. Estimación del número de migrantes a nivel espacial
DISA B C
Nm
A 10 50
B 11 40
C 2 4
Diagonal inferior: Estimación del número de migrantes (Nm); Diagonal superior:Distancia entre las estructuras (DIS).
En la (Figura 15) se puede observar una relación inversamente proporcional entre la
distancia geográfica y el número de migrantes R2=0,99.
Figura 15. Aislamiento por distancia entre estructuras; Número de migrantes por
generación (Nm) y distancia entre estructuras (DIS).
Método alelos privados: El número de migrantes calculado en base al método de alelos
privados Barton & Slatkin 1986 y corrección por tamaño de la muestra, indica que entre
estructuras domiciliares en un radio de 50 metros existe un número aproximado de 2 migrantes
por generación entre ellas.
Método Test de migrantes en primera generación: La estimación de migrantes en
primera generación usando el método bayesiano descrito por Rennala & Mountain 1997,
44
identifica 6 migrantes en primera generación, 4 de ellos entre estructuras domiciliares situadas a
10 metros (A-B) y a un migrante entre estructuras situadas entre 40 y 50 metros (Tabla 22).
Tabla 22. Migrantes de primera generación entre sitios de colecta
NmA B C
EST
A 111 1 1
B N5 96 4
C N1 M-3N5 166
Diagonal superior: número de migrantes en primera generación; Diagonal central:tamaño de la población; Diagonal inferior: estadios de los migrantes
4.3.2. Análisis individual de auto-correlación espacial
El análisis de auto-correlación espacial en un área de 50 metros, con puntos de muestreo
a 10, 40 y 50 metros, sugieren que la capacidad de dispersión activa por caminata de una colonia
de T. infestans es aproximadamente de entre 30 a 40 metros (Tabla 23).
45
Tabla 23. Rango de dispersión según estadio de desarrollo
EstadioRango de dispersión
(metros)
N1 6
N2 18
N3 19
N4 35
N5 48
AH 36
AM 33
Colonia 30-40
En lo que respecta a la dispersión activa por caminata de tanto hembras adultas como
machos adultos estos presentan un rango de dispersión menor que los de estadio ninfal N5.
El análisis de auto correlación espacial a nivel de la colonia, indica una primera
significante positiva auto correlación a (0.5 m, r = 0.099, 95% CI 0.101, 0.096) y una segunda
distancia de clase a (20 m, r = 0.003, 95% CI 0.048, 0.040), donde x es interceptado a los 30.5
metros. Estos resultados muestran que el rango de dispersión de los triatominos en la colonia por
caminata es de aproximadamente de entre 30 a unos 40 metros (Figura 16).
46
Figura 16 Auto-correlación de una colonia de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
Por otro lado el análisis de 38 hembras adultas, muestra una primera significante positiva
auto correlación a (0.5 m, r = 0.015, 95% CI 0.042, -0.012) y una segunda distancia de clase a
(20 m, r = 0.010, 95% CI 0.039, -0.019), donde x es interceptado a los 36 metros. Por tanto el
rango de dispersión de una hembra adulta de T. infestans es de entre 36 a 40 metros (Figura 17).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmínima= 30Dmáxima= 40
r
47
Figura 17. Auto-correlación de hembras Adultas de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
El análisis de 50 machos adultos, muestra una primera significante positiva auto
correlación a (0.5 m, r = 0.054, 95% CI 0.074, 0.034) y una segunda distancia de clase a (20 m, r
= 0.017, 95% CI 0.020, 0.041), donde x es interceptado a los 33 metros Por tanto el rango de
dispersión de un macho adulto de T. infestans es de entre 33 hasta 40 metros (Figura 18).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmáxima= 40
Dmínima= 36
r
48
Figura 18. Auto-correlación de machos Adultos de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
El análisis de auto-correlación de los estadios ninfales N1, N2, N3, N4 y N5 están en el
(Anexo 4).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
D mínima= 33
D máxima= 40
r
49
5. DISCUSIÓN
Análisis genealógico
Los datos obtenidos con la tesis indican que la población de T. infestans, está organizada
por 42 familias anidadas en una sola colonia. Estas familias se originan a partir de
relacionamientos polígamos (poliandria – poliginia) entre insectos adultos de ambos sexos. Las
familias con abundancias mayores a > 80 triatominos por el contrario presentan un tipo de
relacionamiento prioritariamente monógamo. Estas diferencias en el tipo de relacionamiento de
T. infestans pueden denotar distintas estrategias comportamentales a la hora de invadir nuevos
nichos o ser aptitudes biológicas en cuanto a selección espermática mediada por la hembra,
ambas situaciones es necesario poder confirmarlas con mas estudios. Es importante destacar que
estos resultados acerca del tipo de relacionamiento de T. infestans no han sido descritos antes.
Las familias de triatominos detectadas están constituidas de entre tres a diez miembros
por familia, excepto dos familias las cuales presentan la mayor abundancia de triatominos 232 y
88 respectivamente. Ambas se encuentran distribuidas en las tres estructuras analizadas, mientras
que el resto de familias están distribuidas solamente en una de las estructuras. Estas diferencias
respecto a la abundancia y distribución de las familias de T. infestans denota que estas pueden
invadir y coexistir un mismo nicho o estructura domiciliar. Además los distintos valores
obtenidos a partir de la tasa de crecimiento finito (λ) a nivel de las familias, apuntan a que existe
competencia entre las hembras T. infestans por colonizar nuevas fuentes de alimento para su
progenie. Cuando una hembra detecta fuentes de alimento seguras y cercanas deposita en ellas
huevos de manera constante hasta alcanzar su capacidad de carga. El resto de familias que
acceden a las mismas fuentes de alimento pueden coexistir pero deben competir con la más
abundante por lo que deben obligatoriamente migrar en busca de nuevas fuentes de alimento para
sobrevivir.
Este comportamiento de las familias se asemeja al modelo de Invasión de nicho,
competencia y coexistencia entre poblaciones silvestres y domesticas de T. infestans descrito por
(Lardeux 2013), en la cual se indica que ambas poblaciones de triatominos silvestres y
domesticas son muy competitivas y pueden coexistir en un mismo nicho ecológico bajo
condiciones particulares, incrementándose así el riesgo potencial de las poblaciones silvestres
50
para invadir domicilios humanos. Los resultados de la tesis sugieren que ambos grupos de T.
infestans silvestres y domesticas pueden ser consideradas como familias de triatominos
pertenecientes de una misma colonia o varias, y no así normalmente consideradas como dos
grupos distintos o especies distintas.
La implicancia de estos resultados en la delimitación de unidades de rociado para T.
infestans es crucial, ya que sin conocer bien su modo de organización social y su dinámica de
dispersión, se puede cometer el error de considerar pequeñas poblaciones domiciliares de
triatominos como poblaciones independientes (rociado focal), siendo que estas pertenecen en
realidad una sola colonia o unidad de rociado UR
Estructuración genética de T. infestans
Nivel de variación genética
El exceso de heterocigosis detectado en las familias 1 - 2 y a nivel espacial en ambos
dormitorios (población A y C) sugiere eventos de ruptura del aislamiento, debido al
apareamiento entre poblaciones separadas que expresaban exceso de homocigosis. Además el
cierto grado de exogamia o reproducción cruzada detectada en estas poblaciones apunta a que
estas surgieron del cruce de padres no emparentados.
Por el contrario el déficit de heterocigosis y el significativo grado de consanguinidad
detectado en la colonia y a nivel espacial en la población B colectada dentro del gallinero,
denotan subdivisión de la variación genética debido a subdivisión en la estructura poblacional.
Nótese que la reducción de la heterocigosidad observada se da cuando por error de muestreo o
desconocimiento asumimos poblaciones independientes como si fueran una sola unidad
poblacional (efecto Wahlund). El déficit de heterocigosis detectado en la colonia de T. infestans
se debe a que esta no funciona como una unidad independiente como lo son las colonias de
termitas u hormigas, sino más bien se organiza en unidades familiares menores, donde sus
frecuencias alelicas independientes difieren entre ellas lo que causa una reducción de la
heterocigosidad observada. Por el contrario el déficit de heterocigosis detectado en la población
B del gallinero a nivel espacial, se debe principalmente al efecto Walhund, ya que por
desconocimiento asumimos a la población B como una unidad independiente, sin embargo como
51
vimos en los resultados del análisis genealógico dentro del gallinero coexisten alrededor de 13
familias. Por tanto el desconocimiento de la organización social de T. infestans y los bajos
tamaños poblacionales utilizados en análisis espaciales de estructuración genética a nivel micro
geográfico y a fina escala realizados por (Marcet et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2008, Pizarro
et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2013), pueden inducir a incorrectas aseveraciones respecto al
nivel de estructuración genética real de las poblaciones de T. infestans.
Test de heterocigosidad
La colonia de T. infestans muestra rastros de haber sufrido un evento reciente de cuello de
botella, sin embargo este resultado puede presentar cierto sesgo debido a que la colonia no
funciona como una unidad independiente, sino que está formada por familias con dinámicas
independientes. En este nivel de análisis el test de heterocigosidad muestra diferencias entre las
dos familias analizadas, la familia F1 con la mayor abundancia de triatominos (232) muestra
rastros significativos de haber sufrido un evento reciente de expansión poblacional, indicando
que la familia F1 proviene probablemente de progenitores migrantes de áreas no tratadas.
Mientras que la familia F2 compuesta por 88 triatominos tiene vestigios de haber sufrido un
evento reciente de cuello de botella, apuntando a que la familia F2 proviene de progenitores
sobrevivientes de rociado con insecticidas.
A nivel espacial el test de heterocigosidad muestra que la población del dormitorio A
presenta rastros de haber sufrido un evento reciente de expansión poblacional, mientras que las
poblaciones del dormitorio C y el gallinero B muestran rastros de haber sufrido un reciente
evento de cuello de botella. Nótese que cada estructura alberga a distintas familias, por ejemplo
para el caso de la población del dormitorio A, en este coexisten 6 familias de las cuales una
presenta un 90% de predominio en abundancia respecto a las otras cinco, además de llevar
rastros de haber sufrido un evento de expansión poblacional, mientras que el resto presenta
señales de haber sufrido un evento reciente de cuello de botella. Estos resultados obtenidos a
nivel espacial con el test de heterocigosidad denotan un cierto grado de sesgo al considerar a
cada estructura de colecta como unidades independientes.
Otra cualidad del test de heterocigosidad es que nos permite en el tiempo estimar la fecha
en la cual ocurrió el evento de cuello de botella, el análisis realizado en estadios de desarrollo de
52
la colonia de T. infestans, indica que todos los estadios presentan rastros significativos de haber
sufrido un reciente evento de cuello de botella, especialmente las ninfas N2 que muestran exceso
de heterocigosis en los tres modelos utilizados. La colecta de los triatominos se la realizó en
marzo del 2011 por tanto las ninfas N2 colectadas nacieron dos meses antes de la colecta (enero
del 2011), el rastro más fuerte de un evento de cuello de botella se relaciona con los registros del
SEDES Santa Cruz en los cuales se indica que se realizó una campaña de rociado con insecticida
en enero de ese año.
Grado de diferenciación genética.
Estudios recientes realizados a nivel espacial en poblaciones provenientes de Bolivia
(departamento de Chuquisaca) y la Argentina (provincias Santiago del Estero y Catamarca) de
estructuración genética a escala micro-geográfica, indican que las poblaciones de T. infestans
están subdivididas y presentan una restringida capacidad de dispersión entre sitios de muestreo,
además de un cierto grado de endogamia y estratificación dentro estructuras domésticas y peri-
domésticas (Marcet et al. 2008, Pérez De Rosas et al. 2008, Pizarro et al. 2008, Pérez De Rosas
et al. 2013).
Cabe resaltar que el déficit de heterocigosis y el alto grado de consanguinidad detectado
en las poblaciones de T. infestans por los autores mencionados, se deben a la presencia de alelos
nulos y en mayor grado al efecto Wahlund causado por el bajo tamaño poblacional analizado (de
entre 2 a 78 insectos) por sitio muestreado (Lehmann et al. 2003). Este problema del bajo tamaño
poblacional o error de muestreo, conlleva a considerar a las viviendas y estructuras cercanas
positivas como unidades independientes, que tal vez no lo son.
Los resultados de la tesis a nivel espacial, denotan que poblaciones provenientes de
estructuras distantes a 10 metros no están diferenciadas, comportándose ambas como una sola
unidad poblacional. Por otro lado las poblaciones provenientes de estructuras distantes a 50
metros muestran un moderado grado de diferenciación genética entre ellas, indicando una
restringida capacidad de dispersión por T. infestans a estas distancias. Ambos estimadores tanto
FST como RST muestran resultados significativos correlacionados, sugiriendo un patrón de
aislamiento por distancia entre estructuras domiciliares en un área de 50 metros.
53
Los análisis espaciales de estructuración genética conllevan a asumir por
desconocimiento del tipo de organización social de T. infestans, que poblaciones provenientes de
viviendas y estructuras cercanas funcionan como unidades poblacionales independientes.
Los resultados de la tesis a nivel genealógico muestran que las poblaciones provenientes
de las tres estructuras analizadas, conforman en su conjunto a una sola colonia de T. infestans
establecida por 42 familias que se encuentran distribuidas de forma no equitativa en las tres
estructuras analizadas. La estimación del grado de diferenciación genética muestra para ambos
estimadores FST y RST que las familias de T. infestans no están diferenciadas entre sí. La
significativa no diferenciación genética detectada entre familias de T. infestans denotan un cierto
grado de parentesco entre familias, debido probablemente a la relación parental entre
progenitores dentro la colonia, necesaria para la mantención del vinculo social dentro la misma.
Unidades de Rociado (UR)
Rociar implica la eliminación total de las poblaciones de T. infestans en áreas tratadas,
con riesgo limitado o lento de re-introducción. Si la eliminación de las poblaciones es solamente
parcial, y si estas poblaciones presentan intercambios frecuentes y abundantes, entonces, el
rociado no sirve de mucho. De ahí radica la importancia de poder delimitar unidades de rociado,
las cuales puedan controlarse sin peligro de re-introducción por inmigración. Dado que una
unidad de rociado UR representa a unidades demográficamente aisladas, su delimitación requiere
una estimación de la tasa de dispersión entre poblaciones.
En el presente trabajo se ha explorado la tasa de dispersión entre sitios de colecta de T.
infestans a nivel espacial en base a tres metodologías: el cálculo del número de migrantes (Nm) a
partir de FST (Wright 1969) en el cual se indica que existe un alto grado de flujo génico entre
estructuras cercanas a 10 metros y que esta disminuye a medida que aumenta la distancia entre
estructuras. El cálculo del número de migrantes (Nm) a partir del método de alelos privados
(Barton &Slatkin 1986) el cual denota un intercambio de dos migrantes por generación entre las
tres poblaciones de triatominos analizadas, siendo este valor de Nm suficiente para evitar la
divergencia entre las poblaciones de T. infestans. Es importante destacar que tanto el método de
alelos privados como la estimación de Nm a partir de FST son parecidos, al basarse en la
distribución de las frecuencias alelicas entre poblaciones. Sin embargo, simulaciones han
54
demostrado que el método de alelos privados es más sensible a errores en la colección de datos
(Slatkin 1994). Es por tanto en muchos aspectos FST un parámetro ideal que nos da una idea de la
historia de las poblaciones estudiadas, dando información acerca de la importancia evolutiva del
flujo génico y la deriva génica.
La dispersión activa de T. infestans por caminata no está muy bien documentada. Sin
embargo, este fenómeno tiene existencia cierta, algunas ninfas han sido capturas caminando a
unos metros de corales de animales (Catalá et al. 2004, Abrahan et al. 2011).
El tercer método para estimar el número de migrantes (Nm) utiliza el método bayesiano
(Rannala &Mountain 1997). A nivel espacial entre poblaciones de T. infestans, los resultados
denotan a 6 migrantes en primera generación, cinco de ellos (4 ninfas N5 y un adulto Macho)
confirman una alta capacidad de dispersión activa por caminata de los triatominos en áreas de 50
metros. Por otro lado la detección de un migrante de estadio ninfal N1 entre estructuras distantes
a 50 metros, sugiere un transporte pasivo mediado por la madre la cual puede ovopositar
progenie en distintas estructuras domiciliares, o puede ser facilitado por humanos a través de la
ropa, el cabello o el pelaje de los animales. A nivel de las familias el test denota dos machos
adultos migrantes en primera generación entre familias, este resultado indica que la descendencia
adulta de las familias pueden inter-relacionarse y conformar nuevas asociaciones familiares con
lazos de parentesco entre triatominos.
El análisis de auto correlación espacial en un área de 50 metros según estadios de
desarrollo de T. infestans, indican que la capacidad de dispersión activa por caminata aumenta a
medida que los triatominos cambian de estadio desde los 6 metros (dentro de una habitación)
hasta los 50 metros, distancia limite del área muestreada, pudiendo ser esta distancia máxima de
caminata aun mayor. La recaptura de adultos a distancias de 400 metros, es común y observada
tanto en análisis morfometricos (Cecere et al. 2004), como por análisis de auto correlación
espacial a partir de datos genéticos (Pérez De Rosas et al. 2013), cabe resaltar que este rango de
distancia revelado se lo realiza por transporte activo mediante vuelo. Aun son necesarios estudios
de dispersión activa mediante caminata a nivel de estadios de desarrollo en aéreas mayores a los
50 metros.
55
Los métodos actuales de rociados insecticidas no eliminan las poblaciones de T. infestans
de los domicilios. La re-infestación de las viviendas después de los rociados con insecticida es un
fenómeno bien documentado (Gürtler et al. 2007, Pérez De Rosas et al. 2007, Pérez De Rosas et
al. 2008, Pizarro et al. 2008). Los insectos pobladores han sido identificados como insectos del
lugar, probablemente siendo estas poblaciones sobrevivientes o resistentes al tratamiento con
insecticida (Marcet et al. 2006, Marcet et al. 2008). El rociado focal tal como se está ejecutando
actualmente no es una estrategia efectiva para eliminar poblaciones de T. infestans dentro un
domicilio. Los resultados de la tesis indican que una sola hembra fecundada puede fácilmente
recolonizar estructuras domiciliares distantes a 50 metros (y tal vez mucho más allá) por lo que
el domicilio fumigado podría ser re-infestado por insectos provenientes de estructuras alejadas a
más de 50 metros de distancia. Lamentablemente los rociados insecticidas no toman en cuenta
otros focos de infestación como estructuras en ruinas o abandonadas, que sirven de refugios a
animales domésticos como cerdos, perros, gallinas etc., y que son a menudo focos de
permanencia de poblaciones de T. infestans numerosas. Es por tanto que la unidad de rociado UR
insecticida debería tener un rango mínimo de 50 m a partir de una estructura infestada. Sin
embargo, los datos de la tesis aun no permiten determinar el rango máximo.
56
6. CONCLUSIÓN
Las poblaciones de T. infestans colectadas de 3 sitios domiciliares distantes de entre 10 a
50 metros uno del otro, constituyen en su conjunto una sola colonia formada por 42 familias, las
cuales se originan a partir del relacionamiento de 21 progenitores (11 hembras y 10 machos).
- Dos familias con la mayor abundancia de triatominos (232 – 88) respectivamente,
provienen de relaciones prioritariamente monógamas y se encuentran distribuidas en
las tres estructuras analizadas. El resto de las familias están constituidos de entre dos
a cuatro miembros, provienen de relaciones polígamas y se encuentran distribuidas de
forma no equitativa dentro cada una de las tres estructuras analizadas.
- La colonia de T. infestans presenta una tasa de crecimiento poblacional positiva
aumentando un 7% cada mes. Dentro la colonia las familias difieren en sus tasas de
crecimiento poblacional, pueden coexistir en un mismo nicho ecológico o estructura
analizada y compiten entre ellas por el predominio de la abundancia de triatominos
cerca de las fuentes de alimento.
La estructuración genética en las poblaciones de T. infestans en dos niveles de análisis:
Genealógico (dentro la colonia y entre familias) y Espacial (usando poblaciones determinadas
según lugar de captura) denota:
- Que el grado de variación genética, dentro la colonia de T. infestans presenta un
significativo déficit de heterocigotos además de exhibir un significativo grado de
consanguinidad, dentro las familias F1 y F2 estas presentan un significativo exceso
de heterocigosis y un cierto grado de exogamia. A nivel espacial las poblaciones A y
C procedentes de los dormitorios presentan un significativo exceso de heterocigosis y
un cierto grado de exogamia, mientras que la población B procedente del gallinero
presenta un significativo déficit de heterocigotos además de exhibir un significativo
grado de consanguinidad.
- El test de heterocigosis a nivel de la colonia denota rastros de haber sufrido un evento
reciente de cuello de botella, las familias expresan resultados distintos, la familia F1
con la mayor abundancia de triatominos presenta rastros de haber sufrido un evento
reciente de expansión poblacional mientras que el resto de las familias presentan
57
rastros de haber sufrido un evento reciente de cuello de botella. A partir del test de
heterocigosis realizado por cada estadio de desarrollo dentro la colonia se determino
también que ocurrió un evento de cuello de botella dos meses antes de la colecta de
los triatominos.
- El nivel de diferenciación genética en base a los estimadores FST y RST entre familias
de T. infestans denota que estas no están diferenciadas entre sí. Por otro lado a nivel
espacial las poblaciones provenientes de estructuras distantes a 10 metros no están
diferenciadas, mientras que poblaciones provenientes de estructuras distantes de 50
metros presentan un moderado nivel de diferenciación genética entre ellas.
En cuanto a la delimitación de Unidades de Rociado se denota:
- A nivel genealógico, en base al análisis de la distribución espacial de las familias, se
muestra una dispersión mediada por las hembras adultas fecundadas, ovipositando
mensualmente en estructuras domiciliares distantes de entre 10 a 50 metros.
- A nivel espacial, la estimación del número de migrantes Nm exhibe un patrón de
aislamiento por distancia e indica que existe un aislamiento parcial entre las
poblaciones analizadas. Se ha detectado a cuatro ninfas N5 y un adulto macho como
migrantes en primera generación. El análisis de auto correlación espacial según
estadios de desarrollo, indica que la capacidad de dispersión activa por caminata de T.
infestans aumenta a medida que los triatominos cambian de estadio, variando desde
los 6 metros (dentro de una habitación) hasta los 50 metros, distancia limite del área
muestreada.
El principal aporte de la tesis radica en el análisis genealógico, por el cual se ha llegado a
dilucidar el tipo organización social de T. infestans (familias y colonias), su modo de
relacionamiento (monogamia y poligamia) y la habilidad de esta especie de poder coexistir,
competir en un mismo nicho ecológico.
Con los datos de la tesis, no se pudo determinar la unidad de rociado, debido al reducido
rango geográfico analizado, se recomienda para estudios posteriores investigar las relaciones
genealógicas entre individuos de T. infestans colectados en casas alejadas a más de 50 metros
dentro de una misma comunidad y entre comunidades cercanas.
58
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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66
ANEXOS
67
ANEXO 1. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE DNA DE TRIATOMINOS CON CTAB2%
1. Homogenizar la pata de triatomino en 200 µl en solución de extracción de CTAB al
2% mas 20 µl de proteinaza K.
2. Mezclar por vortex.
3. Incubar a 37° C por toda la noche en el termoblok.
3. Añadir 200 µl de cloroformo y mezclar por inversión.
4. Centrifugar 5 minutos a 12000 rpm a temperatura ambiente.
5. Recuperar el sobrenadante y vaciar a un nuevo tubo eppendorf limpio.
6. Añadir 200 µl de isopropanol sobre el sobre nadante y mezclar bien por inmersión.
7. Centrifugar 20 min a 13000 rpm.
8. Vaciar el isopropanol rápido por inversión.
9. Agregar 200 µl de etanol absoluto.
9. Guardar a -80 °C
9. Centrifugar 20 min a 13000 rpm.
10. Vaciar el etanol rápidamente por inversión y agregar 200 µl de alcohol al 70%.
11. Centrifugar 5 min a 13000 rpm.
12. Vaciar el alcohol rápidamente por inversión.
13. Dejar evaporar los restos de alcohol en el termoblok a 37°C.
14. Resuspender el pellet en 25 µl con agua tridestilada.
68
ANEXO 2. PEDIGREE DE PATRILINIAS Y MATRILINIAS DE T. INFESTANS
68
ANEXO 2. PEDIGREE DE PATRILINIAS Y MATRILINIAS DE T. INFESTANS
68
ANEXO 2. PEDIGREE DE PATRILINIAS Y MATRILINIAS DE T. INFESTANS
696969
70
Líneas paternales de color rojo y líneas maternales de color amarillo. Encima
números con (* o #) representan a los padres * - madres #.
70
Líneas paternales de color rojo y líneas maternales de color amarillo. Encima
números con (* o #) representan a los padres * - madres #.
70
Líneas paternales de color rojo y líneas maternales de color amarillo. Encima
números con (* o #) representan a los padres * - madres #.
71
ANEXO 3. CAMBIO DE LOGARITMO LIKELIHOOD
Figura 19. Cambios del Log likelihood (eje y) en función del número de
interacciones (eje x) con una réplica de corrida del set de datos.
72
ANEXO 4. ANÁLISIS DE AUTO CORRELACIÓN ESPACIAL SEGÚN ESTADIOS
Para las 61 ninfas N1 colectadas de dos dormitorios situados a 50 metros, el análisis de
auto-correlación indica una primera significante positiva auto correlación a (0.5 m, r = 0.029,
95% CI 0.044, 0.017), donde x es interceptado en dos puntos: a los 6 y los 48.5 metros (Figura
20).
Figura 20. Auto-correlación de ninfas N1 de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
Para las 85 ninfas N2 colectadas de dos dormitorios situados a 50 metros, el análisis de
auto-correlación indica una primera significante positiva auto-correlación a (0.5 m, r = 0.124,
95% CI 0.134, 0.115), donde x es interceptado en dos puntos: a los 18 y los 48.1 metros (Figura
21).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmínima= 6
Dmáxima= 48,5
73
Figura 21. Auto-correlación de ninfas N2 de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
Para las 52 ninfas N3 colectadas de dos dormitorios situados a 50 metros, el análisis de
auto correlación indica una primera significante positiva auto correlación a (0.5 m, r = 0.084,
95% CI 0.100, 0.068), donde x es interceptado en dos puntos: a los 19 y los 48.5 metros (Figura
22).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmínima= 18
Dmáxima= 48.1
74
Figura 22. Auto-correlación de ninfas N3 de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
Para las 22 ninfas N4 colectadas de dos dormitorios y un gallinero en un radio de 50
metros, indica una primera significante positiva auto correlación a (0.5 m, r = 0.104, 95% CI
0.150, 0.057) y una segunda distancia de clase a (20 m, r = 0.040, 95% CI 0.109, -0.020), donde
x es interceptado a los 35 metros (Figura 23).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmínima= 19
Dmáxima= 48.5
75
Figura 23. Auto-correlación de ninfas N4 de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
Para las 68 ninfas N5 colectadas de dos dormitorios y un gallinero en un radio de 50
metros, indica una primera significante positiva auto correlación a (0.5 m, r = 0.021, 95% CI
0.036, 0.008) y una segunda distancia de clase a (40 m, r = 0.001, 95% CI 0.26, -0.024), donde x
es interceptado en dos puntos a los 14 y 48.5 metros (Figura 24).
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmáxima= 40
Dmínima= 35
76
Figura 24. Auto-correlación de ninfas N5 de T. infestans; Gráfico de auto-
correlograma en base al coeficiente de correlación genética (r) en función de la
distancia de todos los individuos. Intervalos de confianza de permutaciones al 95%
(líneas punteadas) y barras de error de la inicialización tomada al 95% de confianza.
0.000
0.000
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0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
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0.000
0.000
0.000
0,5 1 3 5 10 20 30 40 45 48 50
Dmínima= 14 Dmáxima= 48,5
77
ANEXO 6. TABLA DE GENOTIPOS
IND EST POBMARCADORES
A02 E12 F03 C08 E02 C02 D09 C09
1 N1 A 192 192 300 312 172 204 205 205 157 161 183 183 209 209 133 135
2 N1 A 170 198 300 312 178 204 205 205 157 161 177 183 209 233 133 139
3 N1 A 170 182 300 314 172 202 203 205 149 161 177 183 205 209 133 139
4 N1 A 170 198 300 300 172 204 203 205 157 161 177 183 197 209 133 139
5 N1 A 170 198 300 300 172 178 205 205 149 161 177 183 197 205 139 139
6 N1 A 170 222 300 312 178 182 205 205 149 149 177 177 197 197 139 139
7 N2 A 170 222 300 312 172 202 203 205 149 149 173 177 197 217 139 159
8 N2 A 198 198 0 0 172 178 205 205 149 161 177 177 197 209 139 139
9 N2 A 170 198 308 308 172 178 205 205 149 161 177 183 197 209 139 139
10 N2 A 184 198 300 312 178 182 205 205 149 149 173 183 209 233 139 159
11 N2 A 170 198 300 312 172 204 205 205 149 157 183 183 209 233 133 139
12 N2 A 182 182 300 312 172 204 205 205 149 161 169 183 209 209 131 139
13 N2 A 198 198 300 312 172 178 205 205 149 161 173 177 209 241 139 139
14 N3 A 170 198 300 300 172 178 203 205 149 157 175 175 197 217 139 139
15 N3 A 170 224 300 312 172 182 203 205 149 149 175 183 197 205 139 139
16 N3 A 170 196 300 312 172 204 199 205 149 161 177 177 209 233 131 131
17 N3 A 0 0 300 312 172 204 205 205 149 157 177 199 197 209 139 139
18 N3 A 192 192 300 312 172 178 205 205 149 161 177 177 209 209 131 157
19 N3 A 170 198 312 312 172 178 203 205 149 149 169 173 209 209 139 157
20 N3 A 198 198 300 312 172 182 203 205 149 161 177 199 209 209 139 139
78
21 N3 A 170 224 300 312 172 204 205 205 149 157 177 183 197 209 139 139
22 N4 A 170 224 300 312 172 204 203 205 149 149 173 177 209 241 139 139
23 N4 A 192 192 300 312 178 204 205 205 157 161 169 177 209 209 139 139
24 N5 A 170 224 300 312 172 204 205 205 149 161 177 199 205 209 139 139
25 N1 A 182 182 300 312 172 172 203 205 149 161 169 183 197 209 157 159
26 N2 A 170 224 300 312 172 204 205 205 149 161 183 183 197 197 133 139
27 N2 A 198 198 300 300 172 178 205 205 149 161 169 183 197 213 139 157
28 N2 A 170 222 300 312 172 204 205 205 157 161 173 177 217 233 139 139
29 N2 A 0 0 300 312 172 202 203 203 149 161 177 199 209 233 133 139
30 N3 A 170 224 300 312 172 204 203 205 149 161 177 183 209 217 139 139
31 N4 A 170 224 300 312 172 204 203 205 149 149 177 183 209 209 139 139
32 M A 182 186 300 314 172 178 205 205 149 161 177 177 197 209 133 159
33 N1 A 170 224 312 312 204 204 203 205 149 157 177 183 209 209 139 139
34 N1 A 170 198 300 314 204 204 205 205 149 161 177 177 209 233 133 139
35 N2 A 170 224 300 308 204 204 205 205 149 161 173 183 197 241 139 139
36 N3 A 170 198 300 312 204 204 205 205 149 149 173 183 197 209 139 139
37 N3 A 170 198 300 312 172 182 203 205 149 149 161 183 209 209 139 139
38 N3 A 196 196 300 312 172 204 205 205 149 161 175 183 209 233 131 159
39 N4 A 170 192 300 300 172 178 203 205 149 149 173 183 197 205 139 139
40 M A 170 224 300 300 172 178 203 205 149 161 177 199 197 209 131 139
41 N1 A 192 198 300 300 172 204 205 205 157 161 183 183 197 209 131 135
42 N1 A 170 170 300 312 172 172 205 205 149 149 177 183 197 233 159 159
43 N2 A 170 198 300 312 172 178 205 205 149 161 173 175 209 217 139 139
79
44 N2 A 170 198 300 312 172 178 205 205 149 157 175 183 209 209 131 139
45 N2 A 198 198 312 312 172 182 203 205 149 157 183 183 217 233 139 159
46 N2 A 0 0 300 314 172 204 205 205 157 161 183 183 197 209 131 135
47 N2 A 198 198 300 312 178 182 205 205 149 157 173 183 213 233 139 159
48 N2 A 170 198 300 312 172 204 205 205 149 161 183 183 197 205 131 139
49 N2 A 170 222 300 312 172 204 205 205 149 149 173 183 209 209 133 159
50 N2 A 198 198 300 300 172 204 205 205 149 149 169 183 197 209 139 159
51 N2 A 198 198 300 312 172 204 205 205 149 149 177 183 197 233 139 139
52 N2 A 198 198 300 312 172 178 205 205 149 149 173 183 197 209 139 139
53 N2 A 198 198 300 300 178 204 205 205 149 149 183 183 209 209 139 159
54 N2 A 198 198 300 312 172 204 205 205 157 161 177 177 209 217 131 139
55 N2 A 170 198 300 312 172 204 203 205 157 161 177 183 197 209 131 139
56 N2 A 170 222 300 300 172 204 205 205 149 161 177 183 209 233 131 159
57 N2 A 170 198 300 300 172 178 205 205 149 161 183 183 209 209 131 139
58 N2 A 170 222 312 312 172 178 205 205 149 157 183 183 217 233 139 159
59 N2 A 170 170 300 312 172 182 205 205 149 161 183 183 197 217 131 159
60 N2 A 170 224 300 312 172 204 205 205 149 161 177 177 197 197 131 139
61 N2 A 170 224 300 312 172 172 203 205 149 157 183 199 233 241 139 159
62 N2 A 170 198 312 312 172 182 205 205 149 149 183 183 197 197 139 159
63 N2 A 196 196 300 300 172 204 205 205 149 161 177 199 197 241 131 139
64 N2 A 198 198 300 312 172 178 205 205 149 157 183 183 197 233 139 139
65 N3 A 170 192 300 312 172 182 205 205 149 149 177 183 209 241 159 159
66 N3 A 182 198 300 300 172 178 199 205 149 161 177 199 197 233 131 159
80
67 N3 A 192 198 300 312 172 178 205 205 157 161 183 183 209 209 139 139
68 N3 A 170 170 300 300 172 204 205 205 149 161 183 183 209 233 159 159
69 N3 A 198 198 312 314 172 204 205 205 149 157 177 177 197 233 139 159
70 N3 A 170 198 300 312 172 182 203 205 157 161 173 199 205 209 131 139
71 N4 A 0 0 300 312 172 204 205 205 157 161 177 177 209 233 131 159
72 N4 A 198 198 300 312 172 178 205 205 157 157 177 183 217 233 139 139
73 M A 170 222 300 312 172 182 203 205 149 149 183 199 209 209 139 139
74 M A 192 192 300 312 178 204 205 205 149 157 183 199 197 205 139 159
76 N5 A 170 192 300 300 172 182 203 205 149 161 183 183 197 197 139 139
77 N5 A 170 170 300 314 172 172 205 205 149 161 177 177 197 209 139 139
78 H A 170 222 300 300 172 204 205 205 157 161 177 177 197 213 131 139
79 H A 198 198 300 312 178 182 205 205 149 161 173 199 209 241 139 139
80 H A 192 192 300 312 172 178 205 205 149 161 163 173 209 209 139 139
81 M A 198 198 300 312 178 204 203 205 149 161 177 177 209 233 131 139
82 M A 0 0 300 312 172 178 205 205 157 161 183 199 209 241 139 139
83 N4 A 170 192 312 312 172 204 205 205 157 161 177 183 209 209 131 131
84 N5 A 170 222 300 312 172 178 203 205 157 161 177 183 197 209 139 139
85 N5 A 170 222 300 312 172 178 205 205 149 157 173 173 209 217 139 139
86 N5 A 198 198 300 312 172 178 205 205 149 157 177 183 217 233 139 139
87 N5 A 170 222 300 300 172 204 205 205 149 157 177 183 209 209 139 139
88 N5 A 192 198 300 312 172 178 205 205 149 161 177 177 197 209 139 159
89 N5 A 170 198 300 312 172 204 205 205 149 161 177 199 197 197 139 139
90 H A 198 198 300 312 178 204 205 205 157 161 173 183 197 209 139 139
81
91 M A 170 198 300 312 172 182 205 205 157 161 183 199 209 209 131 139
92 M A 192 192 300 312 172 178 205 205 149 149 163 183 209 233 139 159
93 N3 A 170 222 0 0 172 182 203 205 157 161 173 199 205 209 139 139
94 N4 A 0 0 312 312 172 182 205 205 149 149 177 177 217 241 139 159
95 N4 A 198 198 300 312 172 204 205 205 149 149 177 177 233 233 139 159
96 N5 A 170 224 300 312 172 182 203 205 149 149 183 183 197 209 139 159
97 N5 A 170 222 300 312 178 202 203 205 149 149 173 183 209 241 139 139
98 N5 A 198 198 306 308 172 204 205 205 149 157 183 199 197 209 139 139
99 H A 198 198 300 312 172 178 205 205 149 161 183 183 209 217 131 139
100 M A 170 198 300 312 178 182 203 205 149 161 177 199 209 209 139 139
101 M A 170 222 300 312 172 178 205 205 157 161 173 175 205 217 139 159
102 N4 A 170 198 300 312 172 182 205 205 149 161 183 199 233 241 139 159
103 H A 170 192 300 312 172 182 205 205 157 161 173 175 209 209 131 139
104 H A 170 192 300 312 178 204 205 205 149 157 169 169 197 209 139 139
105 N3 A 186 196 312 312 178 182 205 205 149 149 177 199 209 233 139 139
106 N5 A 170 222 300 312 172 178 203 205 149 161 183 199 205 209 139 139
107 N5 A 198 198 312 312 172 204 205 205 149 161 175 183 197 213 139 139
108 N5 A 192 198 300 312 172 182 205 205 149 161 177 183 209 213 131 139
109 N5 A 198 198 300 312 178 204 203 205 149 161 173 177 209 209 131 139
110 N5 A 170 198 300 312 172 182 205 205 149 161 173 199 197 209 139 139
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