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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

AVALIAO DO TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM RIBAVIRINA, PREDNISONA E DMSO ATRAVS DA

RT-PCR

SIMONE HENRIQUES MANGIA

BOTUCATU SP

2011

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

AVALIAO DO TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES

NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE

NEUROLGICA COM RIBAVIRINA, PREDNISONA E DMSO ATRAVS DA

RT-PCR

SIMONE HENRIQUES MANGIA

Tese apresentada junto ao Programa de

Ps-Graduao em Medicina Veterinria

para obteno de ttulo de Doutor.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Paes

3

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAO DIVISO TCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECRIA RESPONSVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Mangia, Simone Henriques. Avaliao do tratamento experimental de ces naturalmente infectados com vrus da cinomose com ribavirina, DMSO e prednisona atravs da RT-PCR / Simone Henriques Mangia. Botucatu : [s.n.], 2011 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia Orientador: Antonio Carlos Paes Capes: 50502034 1. Co Doenas. 2. Encefalite - Tratamento. 3. Virologia veterinria. Palavras-chave: Antiviral; Corticide; Encefalite; hn-PCR; Morbillivirus; Teraputica.

4

Nome do Autor: Simone Henriques Mangia

Ttulo: AVALIAO DO TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES

NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE

NEUROLGICA COM RIBAVIRINA, PREDNISONA E DMSO ATRAVS DA

RT-PCR.

COMISSO EXAMINADORA

Prof. Dr. Antonio Carlos Paes

Presidente e Orientador

Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica

FMVZ UNESP Botucatu

Prof.Dr. Mrcio Garcia Ribeiro

Membro

Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica

FMVZ UNESP Botucatu

Profa. Titular Dr. Hlio Langoni

Membro

Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica

FMVZ UNESP Botucatu

Prof. Dr. Christian Hirsch

Membro

Departamento de Medicina Veterinria

Universidade Federal de Lavras - UFLA

Prof. Dr. Osimar de Carvalho Sanches

Membro

Departamento de Patologia Animal

Faculdade de Cincias Agrrias da Universidade do Oeste Paulista -

UNOESTE

Data da Defesa: 16 de dezembro de 2011.

5

Dedicatria

Dedico esta pesquisa a todos os ces que participaram e a todos os outros que

sofrem com a cinomose.

Dedico a todos os proprietrios que perderam ou que lutaram contra a

cinomose, que por algum motivo cruzaram com a minha vida e me fizeram ter

foras para seguir em frente no trabalho. Esta dedicatria serve como

agradecimento por todo o carinho que venho recebendo.

Dedico esta pesquisa ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Paes que foi

o grande idealizador do estudo e que sonhou ao meu lado em fazer um

trabalho como este, me apoiando e guiando frente as dificuldades.

6

Agradecimentos Agradeo a Deus pela oportunidade de enriquecer meus conhecimentos

nesta inestimvel universidade.

Agradeo a minha me Sandra da Cunha Henriques pelo apoio que

recebi desde o incio quando cheguei em Botucatu, pelos valores que me

ensinou, pelo amor e dedicao, alm de toda compreenso pela minha

ausncia. Obrigada por toda ajuda que me deu nesse perodo, permitindo

terminar mais uma fase da minha vida.

Agradeo ao Prof. Dr. Antonio Carlos Paes no s pela orientao

profissional, mas tambm por se tornar um grande amigo, que me apoiou em

todos os momentos que precisei aqui em Botucatu.

Agradeo ao meu namorado Leonardo Simes Pinho pelo apoio, carinho

e compreenso pelos momentos de ausncia. Obrigada por estar do meu lado

neste momento to importante para mim, pela sua dedicao no trmino da

tese e por me trazer momentos de alegria e paz, quando parecia ser to difcil,

e que foram fundamentais na reta final.

Agradeo aos Pretos, Loiro e Marrom, Nina, Holly, Lut, Skol e

Johnnie a companhia para escrever a tese e por serem a minha inspirao do

dia-a-dia.

Agradeo a todos os ces e proprietrios que colaboraram com a

pesquisa e foram de fundamental importncia para a concluso de mais uma

fase da minha vida.

Agradeo a todas as pessoas que desejaram que o trabalho no

atingisse os seus objetivos e que dificultaram sua realizao, pois estas

dificuldades me fizeram uma pessoa mais forte para as tormentas da vida.

Agradeo a toda minha famlia por estarem sempre por perto nos

momentos mais importantes da minha vida, pelos ensinamentos e amor que

sempre recebi. Obrigada pela compreenso pela minha ausncia nos

momentos que tambm so importantes para vocs.

Agradeo s minhas amigas eternas, Danielle, Mrian e Cheryl pelo

apoio que recebi durante todo esse perodo, pelos maravilhosos e

inesquecveis momentos de diverso e pelo apoio nas horas tristes. Obrigada

7

pela compreenso pela minha ausncia nos momentos que foram importantes

e eu no pude estar l.

Agradeo s minhas amigas Leila e Marlia por estarem sempre

presentes na minha vida de forma to agradvel, pelos momentos de diverso

e desabafo.

Agradeo s residentes e amigas, Anna Paula e Isabella por

transformarem os momentos de tenso e trabalho em momentos to alegres e

divertidos; foi maravilhoso conhecer e trabalhar com vocs. Espero que nossa

amizade continue por muito tempo.

Agradeo Profa. Regina Kiomi Takahira, Lvia e residentes do

Laboratrio Clnico Veterinrio da UNESP Botucatu, pela realizao dos

exames complementares da pesquisa, trabalhos cientficos e pela boa

convivncia.

Agradeo Profa. Jane Megid por disponibilizar o Laboratrio de

Biologia Molecular da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais da

UNESP Botucatu para a realizao das reaes de PCR. Agradeo ao Clvis

pelo auxlio e dedicao para a realizao destas tcnicas que foram

fundamentais na execuo da pesquisa.

Aos professores, Hlio Langoni, Mrcio Garcia Ribeiro, Jane Megid,

Rafael Modolo, Paulo Francisco Domingues, Cassiano Victria, agradeo pelos

ensinamentos, por me receberem no Departamento e por me apoiarem nessa

pesquisa.

Agradeo a todos os ps-graduandos do Departamento pela

colaborao e auxlio na realizao da pesquisa.

Agradeo a todos os residentes da Disciplina de Enfermidades

Infecciosas dos Animais que colaboraram com o desenvolvimento da pesquisa.

Agradeo aos funcionrios Adilson e Roberto por toda ajuda que

ofereceram para melhor execuo da pesquisa; sem vocs no teria

conseguido concluir o experimento.

Aos residentes da Disciplina de Zoonoses e ao Prof. Dr. Hlio Langoni,

obrigada pela ajuda e orientao no diagnstico de toxoplasmose.

Aos funcionrios do Departamento de Higiene Veterinria e Sade

Pblica e da FMVZ UNESP Botucatu, obrigada pela inestimvel ajuda.

8

Agradeo ao Prof. Dr. Aristeu Vieira da Silva a contribuio para a

realizao e interpretao das anlises estatsticas desta pesquisa.

Agradeo a Blausigel Farmacutica por fornecer o medicamento antiviral

no preo acessvel para a realizao da pesquisa.

Agradeo a CAPES pelo apoio financeiro e fundamental para a estadia

na cidade de Botucatu.

Agradeo ao CNPq pelo auxlio financeiro para a realizao da

pesquisa.

A todos aqueles que me ajudaram e por um lapso de memria no citei,

muito obrigada!

9

Epgrafe Nosso Mundo Baro Vermelho Compositor: Maurcio Barros e Guto Goffi

Se eu ainda soubesse

Como mudar o mundo

Se eu ainda pudesse

Saber um pouco de tudo

Eu voltaria atrs do tempo

Eu no te deixaria

Presa no passado

E arrumaria um jeito

Pra voc estar ao meu lado de novo

Eu voltaria no tempo

Pra voltar pra ontem

Sem temer o futuro

E olhar pra hoje

Cheio de orgulho

Eu voltaria atrs do tempo

Eu voltaria atrs

Atrs do tempo

Os nossos erros

Seriam apagados

Nossos primeiros desejos

Ressuscitados

E de novo eu voltaria no tempo

Eu no te deixaria desistir to fcil

E no te negaria nenhum abrao

De novo

Eu voltaria no tempo

10

...Eu andarei vestido e armado, com as armas de So Jorge. Para que meus

inimigos tendo ps no me alcancem, tendo mos no me peguem, tendo

olhos no me enxerguem e nem pensamentos eles possam ter, para me

fazerem mal...

(Orao de So Jorge)

11

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Descrio da sequncia de nucleotdeos iniciadores

utilizados na reao de RT-PCR e hn-PCR no diagnstico da cinomose em ces. Botucatu, SP, 2011.........................

77

Tabela 2 - Frequncia de ces machos e fmeas com cinomose includos nos respectivos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..............................................................................

79

Tabela 3 - Mdia, desvio padro, mediana das idades em meses dos ces com cinomose includos na pesquisa, divididos nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011................................

80

Tabela 4 - Mdia, desvio padro e mediana dos dias de evoluo dos sinais clnicos neurolgicos dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011.........................

81

Tabela 5 - Frequncia dos sinais oculares em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..

82

Tabela 6 - Frequncia dos sinais respiratrios em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..............................................................................

83

Tabela 7 - Frequncia dos sinais gastroentricos em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..............................................................................

84

Tabela 8 - Frequncia dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose includos na pesquisa nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.....................................

85

Tabela 9 - Frequncia da vacinao dos ces com cinomose includos na pesquisa, segundo o grupo experimental. Botucatu, SP, 2011..............................................................

88

Tabela 10 - Mdia, desvio padro, mediana do tempo de tratamento dos ces com cinomose para cada grupo experimental. Botucatu, SP, 2011..............................................................

90

Tabela 11 - Avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011..............................................................

91

Tabela 12 - Avaliao do tratamento experimental atravs da sobrevida dos ces com cinomose includos nos grupos 1, 2 e 3. Botucatu, SP, 2011....................................................

92

12

Tabela 13 - Avaliao do tratamento experimental atravs da sobrevida dos ces com cinomose includos nos grupos 3, 4, 5 e 6. Botucatu, SP, 2011................................................

93

Tabela 14 - Avaliao da sobrevida dos ces com cinomose frente ao histrico de vacinao independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.......................................

94

Tabela 15 - Avaliao da sobrevida dos ces com cinomose em cada grupo experimental frente ao histrico de vacinao. Botucatu, SP, 2011..............................................................

98

Tabela 16 - Mdia, desvio padro e mediana da idade dos ces com cinomose em relao sobrevida, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.......................................

99

Tabela 17 - Mdia, desvio padro e mediana da idade dos ces com cinomose nos grupos experimentais frente evoluo clnica. Botucatu, SP, 2011..................................................

100

Tabela 18 - Frequncia de acometimento ocular dos ces com cinomose em relao sobrevida. Botucatu, SP, 2011......

101

Tabela 19 - Frequncia dos sinais oculares em relao sobrevida dos ces com cinomose em cada grupo experimental. Botucatu, SP, 2011..............................................................

102

Tabela 20 - Frequncia dos sinais gastroentricos em relao sobrevida dos ces com cinomose. Botucatu, SP, 2011.....

103

Tabela 21 - Frequncia dos sinais gastroentricos em relao sobrevida dos ces com cinomose nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.....................................

104

Tabela 22 - Frequncia dos sinais respiratrios em relao sobrevida dos ces com cinomose. Botucatu, SP, 2011.....

105

Tabela 23 - Frequncia dos sinais respiratrios em relao sobrevida dos ces com cinomose nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.....................................

106

Tabela 24 - Mdia, desvio padro, mediana e percentis da quantidade de sinais neurolgicos nos ces com cinomose includos na pesquisa em relao sobrevida. Botucatu, SP, 2011..

107

Tabela 25 - Mdia, desvio padro, mediana e percentis da soma dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose em cada grupo experimental em relao evoluo clnica. Botucatu, SP, 2011.............................................................

108

13

Tabela 26 - Frequncia da soma de sinais neurolgicos em relao evoluo clnica dos ces com cinomose independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.............................

111

Tabela 27 - Frequncia da soma de sinais neurolgicos nos ces com cinomose em relao evoluo clnica nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.........................

112

Tabela 28 - Frequncia dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose em relao evoluo clnica, independente dos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011...................

115

Tabela 29 - Valor absoluto de linfcitos do hemograma dos ces com cinomose em mdia, desvio padro, mediana e percentis no dcimo quinto dia nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011.....................................................................................

123

Tabela 30 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais, no dcimo dia de tratamento. Botucatu, SP, 2011..............................................................

142

Tabela 31 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais, no dcimo quinto dia de tratamento. Botucatu, SP, 2011...........................................

142

Tabela 32 - Mediana e percentis da dosagem de protena no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento. Botucatu, SP, 2011..

150

Tabela 33 - Mediana e percentis da dosagem de protena no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011.......

151

Tabela 34 - Mediana e percentis em escore do teste de Pandy no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011.......

154

Tabela 35 - Mediana e percentis da contagem de clulas nucleadas do lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento de colheita de material. Botucatu, SP, 2011...............................................

156

Tabela 36 - Mediana e percentis da contagem de clulas nucleadas no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011.......

157

14

Tabela 37 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de linfcitos na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais antes do tratamento. Botucatu, SP, 2011..............................................................

159

Tabela 38 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de linfcitos na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011..............................................................

160

Tabela 39 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de clulas mononucleares na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.....................................................................................

162

Tabela 40 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de clulas mononucleares na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011.......................................

163

Tabela 41 - Relao das amostras positivas e negativas na PCR no diagnstico da cinomose em ces antes do tratamento experimental, independente do grupo. Botucatu, SP, 2011.....................................................................................

164

Tabela 42 - Relao das amostras positivas e negativas de ces na RT-PCR aps o tratamento experimental, independente do grupo. Botucatu, SP, 2011..............................................

165

Tabela 43 - Resultados positivos e negativos da RT-PCR para deteco do vrus da cinomose do lquor dos ces nos diferentes grupos, aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011..............................................................

166

Tabela 44 - Resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces nos diferentes grupos experimentais independente do momento de colheita do material. Botucatu, SP, 2011........

169

Tabela 45 - Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em relao ao tipo de amostra de ces, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011..............................................................

170

Tabela 46 - Relao dos resultados da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em cada tipo de amostra de ces nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.........

172

15

Tabela 47 - Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces, realizadas antes e aps o tratamento experimental independente do grupo. Botucatu, SP, 2011.......................

173

Tabela 48 - Resultados da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces, antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..............................................................

174

16

LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Representao grfica da avaliao do tratamento

experimental segundo a sobrevida dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011.............................

92

Figura 2 - Representao grfica dos valores de mediana da soma de sinais neurolgicos dos ces com cinomose em relao evoluo clnica em cada grupo experiemental. Botucatu, SP, 2011.................................................................................

110

Figura 3 - Representao grfica das medianas da contagem de hemcias dos ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.................................................................................

118

Figura 4 - Representao grfica das medianas da dosagem de hemoglobina dos ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.................................................................................

119

Figura 5 - Representao grfica das medianas do volume globular das hemcias de ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.................................................................................

120

Figura 6 - Representao grfica das medianas da contagem total de leuccitos dos ces com cinomose nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................

122

Figura 7 - Representao grfica da mediana dos valores absolutos de linfcitos no hemograma dos ces com cinomose de cada grupo nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................................

124

Figura 8 - Representao grfica do nmero de ces com cinomose que apresentaram moncitos ativados no hemograma nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011........................................................................................

127

Figura 9 - Representao grfica das medianas das dosagens de uria srica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................................

130

17

Figura 10 - Representao grfica das medianas da dosagem de creatinina dos ces com cinomose nos grupos experimentais e nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................................

131

Figura 11 - Representao grfica das medianas da dosagem de fosfatase alcalina (FA) dos ces com cinomose nos grupos e nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................................

133

Figura 12 - Representao grfica das medianas da dosagem de gama-glutamiltransferase (GGT) dos ces com cinomose nos grupos e nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................................

134

Figura 13 - Representao grfica das medianas da dosagem de protenas totais sricas dos ces com cinomose nos grupos experimentais e nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................................

135

Figura 14 - Representao grfica das medianas da dosagem de albumina srica dos ces com cinomose nos grupos experimentais nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011..................................................

137

Figura 15 - Representao grfica das medianas da dosagem de globulina srica dos ces com cinomose nos grupos experimentais nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011..................................................

138

Figura 16 - Representao grfica das medianas da dosagem de protenas no lquor dos ces com cinomose includos na pesquisa, antes e aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011.................................................................

152

Figura 17 - Representao grfica dos valores de medianas da contagem de clulas nucleadas do lquor dos ces com cinomose, antes e aps o tratamento experimental.Botucatu, SP, 2011............................................

158

Figura 18 - Representao grfica das medianas de valores absolutos de linfcitos no lquor dos ces com cinomsoe, nos diferentes grupos, antes e aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011...............................................................

161

18

Figura 19 - Representao grfica dos resultados positivos para o vrus da cinomose nas diferentes amostras de ces, antes e aps o tratamento, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.................................................................

167

Figura 20 - Eletroforese aps RT-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de sangue, medula ssea e lquor de ces. Botucatu, SP, 2011........................................................

168

Figura 21 - Eletroforese aps hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de sangue e medula ssea de ces. Botucatu, SP, 2011.................................................................

169

Figura 22 - Representao grfica dos valores percentuais dos resultados positivos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em amostras de ces, antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.....

175

19

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

% - porcentagem

C graus Celsius

< - menor que

> - maior que

L microlitro

mg miligramas

mL - mililitros

dL - decilitro

- marca registrada

alfa

- beta

A+ - amostra positiva

A- - amostra negativa

ALT alanina-aminotransferase

ATP adenosina trifosfato

C+ - controle positivo

C- - controle negativo

CPK creatinina fosfo-quinase

CDV vrus da cinomose (Canine Distemper Virus)

COX cicloxigenase

CSD depresso cortical difusa

cDNA cpias de DNA

DDT Dicloro-Difenil-Tricloroetano

DL 50 dose letal 50

DMSO Dimetil Sulfxido

DMSO2 dimetil sulfone

DMS dimetil sulfide

dNTP desoxirribonucleotdeos fosfatados

DUSP fosfatase de especificidade dupla

EDTA cido etilenodiaminotetractico

20

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

et al. - colaboradores

EUA Estados Unidos da Amrica

F protena de fuso

FA fosfatase alcalina

Fc receptor de anticorpos de alta afinidade de macrfagos

FDA Food and Drug Administration

GABA cido gama-aminobutrico

gama

G1 grupo 1

G2 grupo 2

G3 grupo 3

G4 grupo 4

G5 grupo 5

G6 grupo 6

GGT gama-glutamiltransferase

GTP guanosina tri-fosfato

g/dL gramar por decilitro

g/Kg gramas por quilo

g/dia gramas por dia

H - hemaglutinina

HIV vrus da imunodeficincia humana

hn-PCR Hemi-nested PCR

HSV Herpes Simplex Vrus

IFN interferon

IgG imunoglobulina G

IgG1 imunoglobulina G1

IgG2 imunoglobulina G2

IgM imunoglobulina M

IL interleucina

IMP inosina mono-fosfato

IMPDH inosina-monofosfato desidrogenase

IND Investigated new drugs

ITPA inosina trifosfato

21

JNK c-Jun N-terminal quinase

L polimerase ou grande

LCR lquido cefalorraquidiano

MAPK protena quinase ativada por mitgeno (mitogen-activated protein

kinase)

mg/dL miligrama por decilitro

mg/Kg miligramas por quilo

L microlitros mL militros

mM - milimolar

g/mL microgramas por militro

MgCl2 cloreto de magnsio

M protena de matrix ou marcador (loading foto do gel de eletroforese)

MHC Complexo de histocompatibilidade principal

M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus

mRNA RNA mensageiro

n nmero de animais

N ou NP nucleoprotena

g/L nanograma por microlitro P fosfoprotena

pb pares de bases

P25 percentil 25

P75 percentil 75

PCR reao em cadeia pela polimerase

PGE2 prostaglandina E2 PLA - fosfolipase

pH presso de hidrognio

recCDV ou rD vacina recombinante contra a cinomose

ROS radicais livres de oxignio

RT-PCR reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa

rpm rotao por minuto

SHV sem histrico vacinal

SNC Sistema nervoso central

spp. espcie

22

SRD sem raa definida

SSPE paencefalite subaguda esclerosante

SV sem vacinao

U.S. United States

Th1 clula T helper 1

Th2 clula T helper 2

TNF fator de necrose tumoral

UI/L unidades internacionais por litro

VI Vacinao incompleta

VSO vacinao sem orientao veterinria

WHO Organizao Mundial da Sade (Word Health Organization)

* Em virtude do uso consagrado na literatura tcnica, algumas abreviaturas

seguem sua grafia no ingls.

23

SUMRIO RESUMO................................................................................................... 1 ABSTRACT............................................................................................... 2 INTRODUO.......................................................................................... 3 REVISO DE LITERATURA.................................................................... 6 1 CINOMOSE................................................................. 7

2 RT-PCR........................................................................... 25

3 TRATAMENTO DE CES COM CINOMOSE E

PROFILAXIA...................................................................

27

4 RIBAVIRINA.................................................................... 31

5 APLICAES DA RIBAVIRINA NA MEDICINA

VETERINRIA.................................................................

43

6 PREDNISONA................................................................. 44

7 DIMETIL-SULFXIDO (DMSO)...................................... 54

OBJETIVOS.............................................................................................. 62 MATERIAIS E MTODOS........................................................................ 64 1 ANIMAIS.................................. 65

1.1 Critrios de incluso 65

1.2 Critrios de excluso.. 66

2 GRUPOS EXPERIMENTAIS.......................................... 66

3 FRMACOS EXPERIMENTAIS...................................... 67

4 AMBIENTE E ALIMENTAO DOS CES.................... 68

5 COLHEITA DE MATERIAL E EXAMES

COMPLEMENTARES.....................................................

69

5.1 Colheita de lquor................................................. 69

5.2 Exame do lquor. 70

5.3 Colheita de sangue e urina.................................. 71

5.4 Hemograma........................................ 72

5.5 Anlises bioqumicas 73

5.6 Exame de urina tipo I.... 73

5.7 Colheita de medula ssea... 74

6 TCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR.............. 74

24

6.1 Extrao do RNA 74

6.2 Converso para cDNA.. 75

6.3 RT-PCR 76

6.4 Hemi-Nested RT-PCR... 76

7 ANLISE ESTATSTICA................................................. 77

RESULTADOS.......................................................................................... 78 1 ANIMAIS E DADOS EPIDEMIOLGICOS.............. 79

2 DADOS RELACIONADOS COM A EVOLUO

CLNICA.......................................................................... 89

3 EXAMES COMPLEMENTARES..................................... 117

3.1 Hemograma......................................................... 117

3.2 Outras alteraes hematolgicas........................ 126

3.3 Dosagens bioqumicas......................................... 129

3.4 Exame de urina tipo I.......................................... 139

3.5 Exame do lquor................................................... 148

4 BIOLOGIA MOLECULAR................................................ 164

DISCUSSO............................................................................................. 178 CONCLUSES......................................................................................... 211 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................... 214 ARTIGO PARA PUBLICAO 1............................................................. 241 ARTIGO PARA PUBLICAO 2............................................................. 260 ANEXO 1 280

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MANGIA, S. H. Avaliao do tratamento experimental de ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose com ribavirina, DMSO e prednisona atravs da RT-PCR. Botucatu, 2011. 282 p. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista, SP.

RESUMO O estudo objetivou identificar efeitos do tratamento com ribavirina, prednisona e DMSO na cinomose; identificar a presena viral no sangue, medula ssea e lquor antes e aps o tratamento, os efeitos colaterais dos frmacos experimentais e associaes. Foram utilizados 60 ces apresentando sinais neurolgicos da cinomose com evoluo de dez dias. Animais foram internados para tratamento de suporte; avaliados diariamente e submetidos ao hemograma e dosagens bioqumicas. Os grupos 1 e 2 foram tratados com ribavirina associada ao DMSO; os grupos 3 e 4 foram tratados com DMSO e prednisona e os grupos 5 e 6 foram tratados com ribavirina e prednisona, ribavirina, prednisona e DMSO. Os animais foram anestesiados e colhidos lquor, medula ssea e sangue, antes e aps o tratamento e realizada a RT-PCR das amostras; as negativas foram analisadas pela tcnica de hn-PCR. O vrus foi encontrado em 95% das amostras de sangue, 90% de medula ssea e 53,3% de lquor pr-tratamento. O efeito adverso da ribavirina quando associada com a prednisona foi anemia. A prednisona na dose imunossupressora causou aumento da dosagem de protena e diminuio da celularidade liqurica, leucocitose. J a dose antinflamatria causou diminuio de protena no lquor. Baseado nos ndices de sobrevida e melhora clnica, o tratamento mais efetivo foi o G2 (80%); seguido do G1, G5 e G3 (70%); o G6 (60%); o G4 com o pior ndice (30%). Ps-tratamento, a frequncia viral foi 97,7% no sangue, 86,4% na medula ssea e 27,3% no lquor.

PALAVRAS-CHAVE: encefalite, Morbillivirus, antiviral, hn-PCR, teraputica, corticide.

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MANGIA, S. H. The RT-PCR based assessment of experimental treatment of dogs naturally infected with canine distemper vrus by the use of ribavirin, DMSO and prednisone. Botucatu, 2011. 282 p. Thesis (Doctorate) College of Veterinary Medicine and Animal Science, Campus of Botucatu, So Paulo State University, SP. ABSTRACT The present study aims at the identification of ribavirin, prednisone and DMSOs treatment effects in dogs with canine distemper, at the identification of the viral presence in the blood, bone marrow and cerebrospinal fluid (CSF) before and after the treatment and also at the identification of side effects of the experimental drugs and its combinations. Sixty dogs presenting canine distemper with neurological signs about ten days evolution were observed. The animals were hospitalized for the support treatment, assessed on daily basis and subjected to blood cells count and biochemical analysis. Groups 1 and 2 were treated with ribavirin and its combination with DMSO; Groups 3 and 4 treated with prednisone and DMSO, Group 5 treated with ribavirin and prednisone, while Group 6 with ribavirin, prednisone and DMSO. The animals were anesthetized for the cerebrospinal fluid, bone marrow and blood samples collection before and after the treatment, then the RT-PCR of the samples was proceeded. The negative were analysed according to the hn-PCR technique. The canine distemper virus were found in 95% of blood samples, 90% of bone marrow and 53,3% of CSF before the treatment. The adverse effect of ribavirin and its association with prednisone was anemia. Prednisone, at its immunosuppressive dose, led to the increase of protein and decrease of cellularity in CSF, and increase of leukocytes blood count. The anti-inflammatory dose led to the CSF protein concentrations decrease. Considering the survival and clinical improvement rates, the most successful treatment was the one applied to the G2 (80%); followed by G1 (70%); G5 (70%) and G3 (70%); G6 (60%); and the lowest rate G4 (30%). After the treatment, the virus frequency was 97,7% in the blood, 86,4% in the bone marrow and 27,3% in the CSF. KEY-WORDS: Encephalitis, Morbillivirus, antiviral, hn-PCR, therapeutic, corticosteroids.

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Introduo

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A cinomose uma doena viral antiga que afeta ces e outros carnvoros em todo o mundo. Mesmo com uso de estratgias vacinais, ela ainda uma doena importante na populao canina, apresentando a maior taxa de mortalidade depois da raiva (SUMMERS & APPEL, 1994).

uma enfermidade infectocontagiosa, causada por RNA vrus da ordem Mononegavirales, famlia Paramyxovirus, subfamlia Paramyxovirinae, gnero Morbillivirus. Possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. So descritas basicamente trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (CORRA & CORRA, 1992).

Embora a vacinao contra a cinomose venha sendo utilizada amplamente por vrias dcadas, a doena ainda prevalente e surtos foram recentemente relatados em vrios pases como Dinamarca, Estados Unidos, Japo, Finlndia e Alemanha (JZWIK & FRYMUS, 2005; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No Brasil, alguns relatos clnico-patolgicos e sorolgicos indicam a elevada ocorrncia da infeco na populao canina (HEADLEY & GRAA, 2000; SILVA et al., 2004). Alguns fatores como a contaminao do ambiente e em animais portadores, o aparecimento de novas cepas e o desenvolvimento de infeco e doena mesmo em animais vacinados tm contribudo para a manuteno do carter enzotico da enfermidade com ocorrncia ocasional de surtos (BHM et al., 2004).

A ribavirina vem sendo considerada como frmaco no tratamento da cinomose, aps o referido trabalho de Elia et al. (2008), que testou a mesma frente o vrus da cinomose in vitro. Segundo os autores a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose e estas levam a um erro catastrfico no RNA do genoma viral.

Os corticoesterides so utilizados na cinomose por causa da imunopatologia das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral causados pelo vrus, mantendo a terapia com doses antinflamatrias (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Os glicocorticides ainda so considerados como um dos mais potentes antinflamatrios, podendo ser utilizados no tratamento de doenas nas quais estejam envolvidos mecanismos imunes e inflamatrios (CROXTALL et al., 2002; LONGUI, 2007).

A solubilizao de nucleotdeos em solventes orgnicos importante para a entrada de drogas nucleotdeas em membranas celulares. Pelos estudos de West et al. (1994), a base guanosina hidrofbica e sua interao com DMSO pode torn-la permevel a substncia lipoflicas, indicando que este pode servir como veculo de transporte de drogas nucleotdeas por membranas celulares .

O presente estudo tem como objetivo criar novos protocolos de tratamento para a referida enfermidade utilizando-se dos frmacos supracitados. Com a caracterstica de doena re-emergente o tratamento da cinomose deve ser considerado em novas pesquisas e o atual estudo refere-se ao tratamento de ces com encefalite, a forma mais agressiva da enfermidade, naturalmente infectados com o vrus da cinomose.

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Reviso de Literatura

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1. Cinomose

Durante sculos, as infeces pelo Morbillivirus tm tido imenso impacto na vida de humanos e animais. Entre os carnvoros, o vrus da cinomose causa sria doena em vrias espcies, selvagens e domsticas. Mesmo sendo controlada com vacinao em ces domsticos e animais de cativeiro, a cinomose uma doena de difcil erradicao j que o vrus possui distribuio global e ampla variedade de hospedeiros (BARRETT, 1999).

Enfermidade que afeta animais das famlias Canidae, Mustelidae, Hyaenidae, Procyonidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae, Ursidae, Phocidae, Tayassuidae e Cercopithecidae. A patogenia da infeco pelo vrus da cinomose varia de acordo com a espcie e pode resultar em infeces inaparentes ou causar alta mortalidade (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; van MOLL et al., 1995; HEADLEY & GRAA, 2000; GEBARA et al., 2004; CHO & PARK, 2005).

A ocorrncia da enfermidade em ces vacinados corretamente bastante citada na literatura, conforme mostram os estudos a seguir.

Amude (2005) encontrou quatro ces positivos, dentre 20 selecionados, que foram corretamente vacinados com vacina de vrus vivo modificado. O autor utilizou das tcnicas de RT-PCR e histologia do encfalo para confirmao dos casos de cinomose.

Em 2002, numerosos casos de cinomose foram relatados em Windhoek, capital da Namibia, onde cerca de 100 ces foram eutanasiados. Em abril do mesmo ano, veterinrios da costa de Swakopmund, no mesmo pas, reportaram o surto de cinomose com 50 ou mais animais tratados, acima de 100 ces eutanasiados e estima-se cerca de 200 casos no confirmados. Neste mesmo ms um chacal apresentou sinais clnicos, bem como vrios outros animais selvagens. Em algumas localizaes a prevalncia em ces domsticos foi de 72%, e destes 91% eram ces sintomticos. A sequncia encontrada da cepa viral na Namibia foi similar encontrada nos lees africanos (GOWTAGE-SEQUEIRA et al., 2009).

O vrus da cinomose foi responsvel pela infeco e mortalidade de ces domsticos e chacais na costa da Namibia entre 2001 e 2003. Este estudo foi a primeira descrio do surto de cinomose em Canis mesomelas (Black-backed Jackals) e a primeira descrio da clnica e achados histopatolgicos nestas espcies (GOWTAGE-SEQUEIRA et al., 2009).

Em um surto ocorrido na Finlndia, amostras de clulas epiteliais de 3649 ces foram testadas e 865 casos foram confirmados por testes indiretos de anticorpos fluorescentes. Os sinais clnicos variaram de conjuntivite, febre e anorexia aos sinais respiratrios e gastrintestinais, com estimativa de letalidade de 30% dos ces acometidos. Dos casos confirmados, 631 (73%) tinham entre trs e 24 meses de idade. Destes, 487 tinham sido vacinados pelo menos uma vez e 351 (41%) tinham uma histria completa de vacinao (EK-KOMMONEN et al., 1997).

Foi relatado neurite ptica pelo vrus da cinomose em co vacinado, com nove anos de idade, fmea, da raa Jack Russell terrier, onde a apresentao clnica foi o surgimento de sinais neurolgicos de caractersticas agudas e progressivas, apresentando positividade na marcao pela imunoistoqumica do encfalo. Este relato ocorreu em novembro de 2007, em Ontrio, Canad e

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pode estar relacionado com os surtos de cinomose em guaxinim que ocorre periodicamente na regio (RICHARDS et al., 2011).

Outro caso relatado foi de um bulldog francs, macho, de oito anos de idade, somente com apresentao neurolgica, animal vacinado (cepa Rockborn), no Texas, EUA. Os pesquisadores realizaram PCR e sequenciamento para identificao do vrus da cinomose e comprovaram seu resultado pela imunoistoqumica pela marcao do vrus em neurnios no encfalo do animal. Foi descartada a doena ps-vacinal porque o animal apresentou sinais clnicos aps trs meses da vacinao e os achados histopatolgicos no foram compatveis com a encefalite ps-vacinal. Sugere-se que o animal no desenvolveu resposta imune adequada vacinao, j que no sequenciamento foi detectada cepa selvagem do vrus da cinomose, embora os autores no exclussem possvel mutao na cepa vacinal (SCHATZBERG et al., 2009).

Evidncias sugerem que existam diferenas antignicas em reas geogrficas distintas, entre os tipos virais selvagens com relao s cepas vacinais, responsveis pelo ressurgimento da doena. O sequenciamento gentico e anlise filogentica so mtodos que indicam a relao evolucionria entre linhagens coletadas em diversas regies geogrficas e ajudam a entender as diferenas antignicas entre cepas biolgicamente distintas (CASTILLO et al., 2007).

O vrus tambm afetar mamferos marinhos da ordem Pinnipedia e Famlia Phocidae (focas), bem como animais da ordem Artiodactyla (Famlia Tayasssuidae) como o caititu e primatas da Famlia Cercopithecidae (van MOLL et al., 1995; HARDER & OSTERHAUS, 1997; FORSYTH et al., 1998). Gatos domsticos e sunos so suscetveis ao vrus, porm nestas espcies no h o desenvolvimento da doena clnica (GASKIN, 1974).

Para o vrus da cinomose foi demonstrado que a adaptao molecular ao receptor celular ocorre por alterao no gene H (hemaglutinina) levando a disseminao do vrus para novos hospedeiros no candeos no ambiente selvagem (McCARTHY et al., 2007).

Surto de doena respiratria foi descrito em macacos rhesus (Macaca mulatta) causado pelo vrus da cinomose. Em 2006, doena respiratria em macacos rhesus ocorreu em uma fazenda no sudeste da China. Aproximadamente 10.000 macacos contraram a doena e 4.250 morreram. A morbidade em macacos jovens chegou a 60%, com taxa de letalidade de 30%. Em adultos, a taxa de morbidade foi de 25% e letalidade de 5%. No ano de 2007, os macacos foram vacinados com cepa inativada de pulmes e fgados de macacos mortos. Aps esta vacinao, entre 2007 e 2008 o nmero de casos diminuiu para aproximadamente 100 a 200 casos por ano (QIU et al., 2011).

A cinomose se espalhou pela China, particularmente em animais experimentais em Wuhan, Kunming e Beijing (SUN et al., 2010). A doena tambm foi introduzida em pequenos zoolgicos na China. A doena foi descoberta pela sorologia de macacos adultos que sobreviveram doena. Aps esta descoberta, os macacos passaram a ser vacinados com vacina viva atenuada para o vrus da cinomose em 2009. O nmero de casos chegou a aproximadamente 130 em 2009 e reduziu para 20 a 30 em 2010 (QIU et al., 2011).

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A doena clnica foi parecida com sarampo em humanos, incluindo sinais respiratrios, anorexia, febre, erupo de pele por todo o corpo, vermelhido e inchao dos coxins, conjuntivite e descarga nasal mucide espessa, com coma precedendo a morte. Aps a identificao com o sarampo foi realizada reao em cadeia pela polimerase precedida da transcrio reversa (RT-PCR) para o vrus do sarampo e para o vrus da cinomose. Amostras de pulmo foram utilizadas para o diagnstico, sendo que foram negativas para o vrus do sarampo e positivas para o vrus da cinomose. O genoma encontrado foi sequenciado e os resultados mostraram grande similaridade com isolados de ferret e racoons nos EUA (QIU et al., 2011).

Os autores no conseguiram achar explicaes para a epidemia na China, pode ter sido pelo contato com guaxinim, ou pelo contato com macacos selvagens, sendo outra possibilidade o contato com grande massa antignica de vrus de ces que sofreram adaptao para novos hospedeiros. Concluram que, embora a vacinao seja amplamente utilizada e a cinomose encontre-se controlada pela vacina viva atenuada. Casos espordicos ainda ocorrem e grande nmero de mutaes so encontradas no vrus tornando futuras transmisses imprevisveis. Portanto, a vigilncia para cinomose deve ser considerada na populao de macacos e nos humanos que entram em contato direto com ces (QIU et al., 2011).

O vrus da cinomose pantrpico. Porm, existem diversas cepas, algumas mais neurotrpicas e virulentas que outras. As mais patognicas so a Snyder Hill e R252, que so altamente neurotrpicas e imunossupressoras (CORRA & CORRA, 1992; MORO & VASCONCELOS, 1998; ALVES et al., 2006).

Todos os vrus isolados pertencem a um mesmo sorotipo. As vrias cepas isoladas produzem afeces com durao e sinais clnicos distintos: algumas causam enfermidade de mediana patogenicidade, enquanto outras causam enfermidade aguda, altamente mortal, com ou sem encefalite aguda. Outras, ainda, causam encefalite tardia, aps doena branda, ou mesmo aps a recuperao da forma aguda. H ainda cepas que levam muito tempo para exteriorizar seus efeitos encefalitognicos, como o que ocorre na encefalite do co velho ou na hard pad disease (CORRA & CORRA, 1992).

As estirpes Onderstepoort e Rockborn so as mais utilizadas em todo o mundo para a elaborao de vacinas contra o vrus da cinomose (MOCHIZUKI et al., 2002).Devido ao grande potencial neurotrpico, a cepa Snyder Hill a mais utilizada em experimentos de inoculao intraenceflica, tanto em estudos da patognese viral quanto em desafios ps-vacinais (NEGRO et al., 2006 apud SLATER, 1970).

A cinomose pode ocorrer em qualquer poca do ano, mas no inverno h elevao na ocorrncia da enfermidade. O co representa o principal reservatrio para o vrus da cinomose e serve como fonte de infeco para animais selvagens. No h diferena de susceptibilidade da infeco entre machos e fmeas. No entanto, ces das raas dolicoceflicas so mais afetados que os braquioceflicos (CORRA & CORRA, 1992; GRANCHER et al., 2004; GREENE, 2006).

A idade de maior incidncia da cinomose nos ces coincide com a poca em que diminui a taxa de anticorpos maternos transmitidos passivamente pelo colostro, entre 60 e 90 dias de idade, demonstrando a relao entre susceptibilidade e a idade. No entanto, o vrus pode acometer animais de todas

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as idades (CORRA & CORRA, 1992; BIAZZONO et al., 2001; GEBARA et al., 2004). Sonne (2008) encontrou 78,5% dos ces acometidos pelo vrus da cinomose em animais cuja idade variava de dois a seis meses.

No Rio Grande do Sul, de 3.659 necropsias de caninos realizadas, em 582 (16%) o diagnstico foi de doenas virais e, entre estas, a cinomose foi responsvel por 39% (227/582) dos diagnsticos (SONNE, 2008).

Mais de 50% das infeces nos ces so subclnicas ou com sinais clnicos moderados (SILVA et al., 2007), ou seja, a taxa de infeco maior do que o nmero dos animais que manifestam a enfermidade, estimando-se em at 75% de ces suscetveis que eliminam o vrus sem qualquer sinal clnico da doena (CORRA & CORRA, 1992; GEBARA et al., 2004). Acima de 30% dos ces exibem sinais de envolvimento neurolgico durante ou aps a infeco sistmica pelo vrus da cinomose e a maior parte dos carnvoros selvagens que morrem pela doena possuem evidncias de infeco no sistema nervoso central (SNC) (RUDD et al., 2006).

A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas contaminadas com partculas virais em secrees respiratrias, e tambm pelas fezes e urina (CORRA & CORRA, 1992).

Durante a exposio natural, o vrus da cinomose se propaga por gotas de aerossis e entra em contato com o epitlio do trato respiratrio superior. No perodo de 24 horas, as partculas virais se replicam nos macrfagos e se disseminam pela via linftica local, para as tonsilas e linfonodos bronquiais (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006).

Entre 2 a 4 dias ps-infeco, o nmero de partculas virais aumenta nas tonsilas, linfonodos retrofarngeos e bronquiais, mas nmero baixo de clulas mononucleares infectadas encontrado em outros rgos linfides. No perodo de quatro a seis dias ocorre a replicao viral no sistema linfide, medula ssea, timo, bao, linfonodos mesentricos, placas de Peyer, clulas estomacais, clulas de Kupffer e clulas mononucleares ao redor dos vasos pulmonares e bronquiais. A ampla proliferao viral nos rgos linfides induz um aumento inicial na temperatura corporal, entre o segundo e o sexto dia, determinando leucopenia, causada por danos virais nas clulas linfides, afetando as clulas T e B (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; GREENE, 2006).

A disseminao do vrus no epitlio e no tecido nervoso ocorre entre 8 a 10 dias ps-infeco, por via hematgena e/ou pelo lquor dependendo da resposta imune humoral ou celular do animal (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; JONES et al., 2000; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006).

Ttulos intermedirios de anticorpos podem proteger o animal da doena sistmica, mas no so suficientes para bloquear a infeco do SNC (TIPOLD et al., 1992).

Nos ces com nveis intermedirios de resposta imune mediada por clulas e com ttulos de anticorpos que aparecem tardiamente aps 9 a 14 dias, o vrus se dissemina pelos tecidos. Os sinais clnicos podem desaparecer com o aumento da titulao de anticorpos e o vrus eliminado da maioria dos tecidos, assim que os ttulos de anticorpos aumentam, mas podem persistir por

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longos perodos em tecidos uveais, e em neurnios e tegumentos, como nos coxins plantares. A recuperao da infeco est associada com a imunidade a longo prazo e interrupo da replicao viral. A proteo pode ser comprometida se o co for exposto cepa altamente virulenta, dose infectante elevada e/ou sofrer imunossupresso (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

Sugere-se que a infeco do SNC ocorre precocemente na fase sistmica da doena. Neste caso, a cinomose progride da doena sistmica para neurolgica, aparentemente por falha do sistema imune em conter a invaso viral no crebro e na medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

Os sinais neurolgicos da cinomose quando acomete o SNC so polimrficos. O curso clnico e neuropatolgico da encefalomielite est relacionado com a variedade da cepa viral e a idade do animal afetado (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

Silva et al. (2007) afirmaram que a diferena entre o tipo de leso desenvolvida por filhotes e adultos pode ser tnue, e que embora possa haver maior frequncia de desmielinizao em filhotes, deve-se levar em considerao que os mesmos tambm desenvolvem leses mais crnicas, assim como ces adultos podem desenvolver leses agudas.

A difuso viral depende do grau de resposta imune sistmica do hospedeiro e a presena de anticorpos antivirais. Alm disso, a deposio de imunocomplexos pode facilitar a difuso no endotlio vascular do SNC. Livre ou associado s plaquetas ou linfcitos, o vrus penetra nas clulas endoteliais vasculares das meninges, nas clulas do plexo coride do quarto ventrculo e nas clulas ependimrias lineares do sistema ventricular (GREENE, 2006). A ocorrncia frequente de leses periventriculares e subpiais, e o fato do vrus ser encontrado facilmente nas clulas do plexo coride e do epndima, sugerem que penetre nos tecidos cerebrais pelo lquor. Neste, o agente pode ser encontrado em clulas mononucleares fundidas com clulas ependimrias (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). Em contraste, Rudd et al. (2006) encontraram evidncias de que o vrus invade o SNC pelo bulbo olfatrio nos casos de infeco por via aergena.

Quando resposta imune antiviral neutralizante est ausente na fase aguda da cinomose, imunoglobulinas da classe IgM anti-vrus aparecem nas duas primeiras semanas da infeco. Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, sendo que estas clulas no esto correlacionadas com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de IL-8 foram encontrados, sugerindo que a ativao inicial das clulas da micrglia serve como precursora da invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

A encefalite aguda, que ocorre inicialmente no curso da infeco em animais jovens ou imunossuprimidos, caracterizada por injria viral direta (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O vrus causa leso multifocal nas substncias cinzenta e branca. Leses na substncia cinzenta so resultados de infeco neuronal e necrose, e podem levar a uma poliencefalomalcia. Leses na substncia branca so caracterizadas por danos mielnicos e esto associadas com replicao viral nas clulas da glia.

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Mudanas inflamatrias so mnimas devido imunodeficincia resultante de imaturidade fisiolgica do sistema imune e/ou da imunossupresso viral induzida (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006).

Durante a fase inicial da encefalite a expresso de RNAs mensageiros (mRNAs) e das protenas virais so elevadas nas reas afetadas e uma possvel consequncia o aumento da produo do Fator de Necrose Tumoral (TNF) pelos astrcitos. A progresso das leses cerebrais tambm sustentada pela abundncia do vrus na forma imunorreativa presente nas leses no inflamatrias, que se caracterizam pela desmielinizao. O TNF tem sido evidenciado como causador da destruio de oligodendrcitos e perda de mielina em ces com cinomose (GRNE et al., 2000).

Vandevelde & Zurbriggen (1995) sugerem que o fenmeno de desmielinizao,decorre da infeco de oligodendrcitos, que so clulas produtoras de mielina. Porm, outros autores observaram que a maioria das clulas infectadas so astrcitos. Estudos de microscopia eletrnica por estes autores revelaram que a infeco de oligodentrcitos rara na cinomose, propondo que o vrus causa infeco discreta nos oligodentrcitos, mas que mesmo assim pode ser responsvel pelo fenmeno de desmielinizao.

Estudo ultra-estrutural revelou microvacuolizao e perda de organelas e degenerao de oligodentrcitos. As mudanas morfolgicas so precedidas por disfunes metablicas nestas clulas, com a diminuio drstica da atividade da cerebrosdeo sulfo-transferase (uma enzima especfica de oligodentrcitos) aps infeco do vrus. possvel que a transcrio do vrus interfira nas funes especializadas destas clulas, que so necessrias para a manuteno das membranas mielnicas (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

Nos achados de Stein et al. (2004), o vrus induziu a ativao das clulas da micrglia, que podem ter relevncia na patognese da desmielinizao aguda na cinomose, devido ao aumento difuso da regulao do MHC na substncia branca. A ativao destas clulas libera fatores txicos que podem induzir a destruio da mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; STEIN et al., 2006).

A formao de radicais livres de oxignio (ROS) pela micrglia pode alterar a transmisso sinptica e destruir diretamente os neurnios. Esta formao de ROS pode ser considerada responsvel pela atividade convulsiva em alguns animais (STEIN et al., 2006).

A encefalite multifocal em ces adultos acomete frequentemente animais entre 4 e 6 anos, com curso crnico. A doena no precedida nem coincide com os sinais sistmicos que so observados nos ces jovens (CORRA & CORRA, 1992). O antgeno viral fica restrito a poucos astrcitos. A expresso do MHC classe II proeminente em todas as clulas da micrglia, sendo responsvel pela desmielinizao contnua e disseminada infiltrao mononuclear perivascular. As alteraes se iniciam com hiperplasia dos astrcitos e proliferao microglial em estruturas subpiais e subependimrias na substncia branca. Esta forma tambm est associada com a concentrao elevada de anticorpos antimielnicos, uma provvel reao secundria ao processo inflamatrio. Anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de radicais livres de oxignio. Esta atividade por sua vez pode levar destruio

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de oligodendrcitos e da bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006).

A IL-1 importante na patognese de todos os tipos de leses neurolgicas causadas pelo vrus da cinomose. responsvel por estimular a proliferao de astrcitos, que podem iniciar as leses, como as encontradas na cinomose no inflamatria subaguda, que evidenciam frequentemente astrogliose reativa. Encontrada principalmente nos espaos perivasculares da inflamao subaguda e nas leses crnicas, a IL-1 age de forma importante na evoluo da doena (GRNE et al., 2000).

Brge et al. (1989) demonstrou que os anticorpos antivirais estimulam a produo de radicais livres de oxignio (ROS) em culturas de clulas cerebrais de ces infectadas com o vrus da cinomose. O mecanismo de produo de ROS depende da expresso do antgeno viral na superfcie de clulas infectadas marcadas com receptores Fc (receptor de anticorpos de alta afinidade) nos macrfagos. Os ROS fazem degradao de fosfolipdios na parte cortical do crebro, destruindo protenas da bainha de mielina, interferindo na produo da mesma.

Nesta fase da doena, nos infiltrados perivasculares do SNC so encontradas clulas CD8+, CD4+ e linfcitos B, e citocinas pro-inflamatrias, IL-1, IL-6 e IL-12, indicando resposta imune-mediada (WNSCHMANN et al., 1999; MARKUS et al., 2002).

A produo de TNF e tambm de IL-1 e IL-6 pelas clulas locais resulta na induo de molculas de adeso endotelial, como pr-requisito para a migrao de clulas inflamatrias para o SNC e a progresso das leses no estgio crnico, caracterizado por inflamao intensa. Alm disso, a produo de TNF por clulas inflamatrias no responsvel apenas pelo processo de desmielinizao, pela destruio direta de oligodendrcitos resultando na perda de mielina, mas pode levar, tambm, ao recrutamento de mais leuccitos (GRNE et al., 2000).

A desmielinizao crnica coincide com a recuperao do sistema imune, entre 6 a 7 semanas ps-infeco, que se apresentam inicialmente nas leses induzidas pelo vrus no crebro como manguitos perivasculares linfocitrios, plasmcitos e moncitos. A resposta inflamatria nas leses desmielinizantes pode levar a progresso da destruio tecidual. Citocinas pr-inflamatrias esto aumentadas, mas as citocinas antinflamatrias permanecem em nveis normais. possvel que astrcitos, o primeiro alvo do vrus, participem da amplificao da resposta imune (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

Leses crnicas desmielinizantes so caracterizadas pela reduo ou possvel perda das protenas virais no tecido nervoso, com aumento da regulao do MHC e infiltrao massiva de clulas CD8+, CD4+ e clulas B (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004).

O estgio crnico da doena caracterizado por complicaes imunolgicas. A inflamao est associada com a sntese de anticorpos citotxicos-dependentes, que podem induzir a desmielinizao por ao dos anticorpos anti-mielina. Vandevelde & Zurbriggen (1995) concluram que as reaes auto-imunes na cinomose so provavelmente um epifenmeno e que no so primrias no processo de desmielinizao (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE, 2004).

Anticorpos antivirais destinados a superfcies de clulas infectadas com o vrus interagem com os receptores Fc de macrfagos e essa interao resulta

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numa exploso respiratria dos mesmos que liberam ROS. Esses radicais podem ser responsveis pela destruio de oligodendrcitos e compartimentos de mielina. Quimicamente a produo de ROS no sistema xantina/xantina-oxidase, destri seletivamente culturas de oligodendrcitos (VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

Evidncias experimentais apontam que o vrus induz alteraes nas funes de macrfagos, que esto em grande nmero nas leses de cinomose e possuem papel importante na patogenia da enfermidade. A fagocitose, dependente ou independente de receptores Fc, assim como a habilidade de liberar ROS e a atividade procoagulante dos macrfagos tambm so alteradas aps a infeco. Considerando a relao entre o sistema de coagulao e funes inflamatrias, essas observaes mostram que a infeco pelo vrus da cinomose pode desencadear um potencial destrutivo dos macrfagos e, alm disso, suportar a hiptese de que a desmielinizao espectadora ocorra na cinomose crnica (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

Os ces clinicamente acometidos encontram-se com as seguintes caractersticas: falta de vacinao ou doses incompletas, vacinas inapropriadas, colostro da me com ttulos inadequados de anticorpos ou a falta do mesmo, imunossupresso e histria de exposio a ces infectados (GREENE, 2006).

Aps perodo de incubao de seis dias ou mais, surge a primeira fase clnica da doena, que corresponde ao pico febril e localizao nos rgos linfides, culminando com hipertermia at 41C, anorexia, congesto conjuntival discreta e corrimento seroso ocular e nasal, sendo que geralmente esta fase passa despercebida ao proprietrio. Aps 2 a 3 dias, se houver progresso do vrus por falta de anticorpos, haver disseminao viral para as clulas epiteliais e o segundo pico febril, com sinais caractersticos (CORRA & CORRA, 1992).

Podero ocorrer sinais clnicos digestrios, respiratrios ou neurolgicos isoladamente, conjuntamente ou alternadamente. Ocasionalmente surgem sinais neurolgicos aps 1 a 2 semanas do incio dos sinais sistmicos (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006; AMUDE et al., 2007). As alteraes neurolgicas podem ter incio aps 3 a 4 meses, ao final dos sinais sistmicos (AMUDE, 2008). De acordo com Tipold et al. (1992) o envolvimento sistmico acontece em um tero dos casos com alteraes neurolgicas, e a mioclonia encontrada em apenas metade desses. Ao contrrio, Amude (2005) encontrou 40% dos ces com apresentao neurolgica sem mioclonias e sem apresentao sistmica, no momento do atendimento hospitalar, em encefalites causadas pelo vrus da cinomose.

Os principais sinais oculares e no sistema respiratrio so rinite, conjuntivite, descarga nasocular serosa e mucopurulenta, pneumonia intersticial no incio e posterior evoluo para broncopneumonia devido infeco secundria, caracterizada por tosse mida e produtiva, alm de crepitaes na auscultao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

No sistema gastrintestinal h ocorrncia de vmitos intermitentes, anorexia, diarria pastosa a lquida, escura, com ou sem presena de sangue, podendo levar a sinais de desidratao nos animais (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

Podem ser observadas pstulas na pele do abdomen e, em alguns casos, hiperqueratose dos coxins digitais (GREENE, 2006).

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Os sinais neurolgicos so mltiplos, decorrentes da replicao viral em neurnios e clulas gliais, refletindo, desta forma, a distribuio do vrus e das leses no SNC (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Animais com apresentao clnica neurolgica focal, no diagnstico pos mortem tiveram uma avaliao neuropatolgica com leses multifocais difusas em vrios stios neuroanatmicos. Em contraste, ces com sinais multifocais tinham leses focais em apenas um stio neuroanatmico (AMUDE, 2008).

Independente da ocorrncia de leses neuropatolgicas, a infeco do sistema nervoso pelo vrus da cinomose pode levar a uma variedade de sinais neurolgicos. A infeco pelo vrus determina disfuno molecular dos neurotransmissores nas clulas nervosas, que pode ser responsvel por alguns sinais neurolgicos em ces com cinomose, mesmo que as leses correspondentes em stios neuroanatmicos estejam ausentes (DINTINO et al., 2006; AMUDE et al., 2010a).

A cinomose em ces jovens a forma de apresentao mais comum e caracterizada por convulses, sem mioclonias (THOMAS et al., 1993). Em ces adultos com cinomose a convulso menos frequente que outros sinais clnicos (THOMAS et al., 1993; AMUDE et al., 2007).

Convulses e mioclonias so sinais tpicos de leses da substncia cinzenta do SNC, ao passo que dficits visuais e dificuldades motoras, so sinais de leses na substncia branca (GREENE, 2006).

Hiperestesia e rigidez cervical e para-espinhal podem ser encontradas em ces como resultado de inflamao das meninges. Entretanto, sinais de leses enceflicas so predominantes em relao aos sinais meningeais (GREENE, 2006).

O vrus da cinomose tem predileo pelo ngulo pontinocerebelo e so observados dficits cerebelares e vestibulares. Esses sinais so observados isoladamente ou associados no mesmo animal. No entanto, a combinao dos sinais mais frequente (AMUDE et al., 2006; AMUDE et al., 2007; AMUDE, 2008). Os sinais cerebelares e vestibulares podem representar disfuno na camada cinzenta ou na substncia branca. As regies ndulo e flculo do cerebelo possuem relao com o vestbulo, e os sinais vestibulares podem ocorrer por leses na substncia branca dos pednculos cerebelares, que fazem a conexo entre essas duas reas (AMUDE, 2008; DEWEY, 2006).

Quando h acometimento da medula espinhal, a paresia e incordenao de membros so os nicos sinais neurolgicos. As manifestaes comuns incluem a doena vestibular com movimento de cabea, nistagmo, dficits em outros nervos cranianos e da propriocepo. Na doena cerebelar aparecem ataxia com hipermetria e cabea pendente. Cegueira uni ou bilateral e midrase ocorrem tambm devido ao envolvimento do trato e nervo pticos. Atrofia muscular generalizada rara como apresentao clnica de leso focal no crtex (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Podem ocorrer convulses parciais ou generalizadas. Porm, a convulso do tipo goma de mascar, classicamente associada com a infeco pelo vrus da cinomose, ocorre frequentemente em ces que desenvolvem poliencefalomalcea dos lobos temporais (GREENE, 2006).

Outros sinais neurolgicos incluem: apatia, estupor, alteraes de comportamento, reflexos espinhais anormais, hiperestesia, mioclonias e incontinncia urinria (MORO et al., 2003).

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As mioclonias ou contraes tnico-clnicas so sinais comuns na cinomose e podem estar presentes quando no h outros sinais neurolgicos. Acometem um msculo ou grupo de msculos, como auriculares, temporais, retro-abdominal e flexores dos membros (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O mecanismo neural para as mioclonias se origina pela irritao local de neurnios motores da medula espinhal ou de ncleos de nervos cranianos. considerado um sinal caracterstico da cinomose. Porm, tambm pode ser observada em outras doenas inflamatrias do sistema nervoso dos ces (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

A resposta hematolgica na cinomose varia entre os ces, de acordo com a fase da infeco viral (SILVA et al., 2005). A anemia pode ser atribuda ao aumento da destruio dos eritrcitos ou pela diminuio de sua produo. A destruio determinada pela presena do vrus em eritrcitos ou pela deposio de imunocomplexos na membrana destas clulas. A queda da produo pode ser atribuda falncia da medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Na maioria dos casos, os eritrcitos apresentam-se normocticos e normocrmicos e no h sinais de regenerao medular, como hemcias nucleadas, policromasia, anisocitose ou corpsculos de Howell-Jolly (SILVA et al., 2005).

Os achados hematolgicos frequentes na cinomose em ces so linfopenia, em combinao com leucopenia ou leucocitose, anemia, monocitose e raramente trombocitopenia (TIPOLD et al., 1992). O leucograma mais varivel e as infeces bacterianas oportunistas no trato digestrio e respiratrio determinam leucocitose por neutrofilia e o desvio a esquerda (SILVA et al., 2005).

A linfopenia uma caracterstica consistente, mas pode estar ausente em alguns casos. Silva et al. (2005) observaram que ces jovens infectados experimentalmente com o vrus da cinomose desenvolveram marcada linfopenia.

Segundo Corra & Corra (1992) a linfopenia absoluta causada pela depleo dos tecidos linfides e depende da caracterstica imunossupressora da cepa viral.

Silva et al. (2005) referiram que a trombocitopenia achado frequente na doena em ces. Sugerem que na infeco pelo Morbillivirus ocorre aumento de anticorpos antiplaquetas e a trombocitopenia imunomediada com remoo das plaquetas pelo sistema reticuloendotelial.

As incluses citoplasmticas denominadas corpsculo de Lentz ou de Sinigaglia-Lentz, que aparecem em algumas clulas do sangue, em pequeno nmero nos linfcitos, neutrfilos e hemcias, possuem particular relevncia no diagnstico clnico da cinomose. A ocorrncia dessas incluses em leuccitos evidencia a presena do vrus, mas quando no encontradas possuem pouco valor na determinao da ausncia do vrus, j que so observadas somente na fase virmica da doena (CORRA & CORRA, 1992; JONES et al., 2000).

No exame bioqumico os achados no so especficos na cinomose, porm pode ocorrer hipoalbuminemia ou hiperglobulinemia. Evidente hipoglobulinemia encontrada em filhotes infectados antes de nascer ou neonatos com imunossupresso persistente causada pelo vrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

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A anlise do lquido cefalorraquidiano (LCR) um dos melhores mtodos de diagnstico das afeces do encfalo e da medula espinhal. O exame do LCR indicado em todo animal com doena neurolgica na qual no h diagnstico conclusivo, incluindo casos com suspeita de afeco intracraniana (PELLEGRINO et al., 2003).

Segundo Gama et al. (2005), as caractersticas fsico-qumicas do lquor tais como, colorao, aspecto, densidade, pH e glicose no indicam qualquer anormalidade liqurica nas diferentes fases da cinomose. Por outro lado, o componente protico e a celularidade liqurica mostraram alteraes significativas na presena de sinais neurolgicos. Porm, na ausncia destas alteraes, no adicionam informaes suficientes para a deteco precoce de leses do SNC.

Durante o estgio de desmielinizao aguda no ocorrem reaes inflamatrias e, consequentemente, as protenas e as clulas do lquor podem estar normais (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

No estgio crnico da cinomose, a inflamao determina aumento de protena (> 25 mg/dL), principalmente representado por IgG-antivrus e aumento da celularidade (> 10/l), com predomnio de linfcitos (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006).

O aumento dos anticorpos antivrus no lquor oferece evidncia da encefalite pela cinomose, pois estes anticorpos so produzidos no local, e este aumento no encontrado em animais vacinados ou na cinomose sistmica sem alteraes neurolgicas (GREENE, 2006).

O prognstico da doena reservado na fase sistmica, pois pode progredir para a fase neurolgica. Nesta fase torna-se desfavorvel, pois comumente progressiva, raramente estacionando, levando morte em curso agudo ou crnico. Os animais que se recuperam podem ficar com sequelas inabilitantes (CORRA & CORRA, 1992).

Segundo Kim et al. (2006), a combinao de alguns sinais como inflamao conjuntival, secreo respiratria, diarria e sinais nervosos e curso da doena com trs semanas ou mais sugerem diagnstico presuntivo da cinomose. Em regies endmicas para cinomose, a mesma deve sempre ser considerada no diagnstico de ces com alteraes neurolgicas, independente do tipo, curso, extenso e natureza da doena (AMUDE et al., 2010a).

Vrios testes foram avaliados em todo mundo para o diagnstico do vrus da cinomose, como reao de imunofluorescncia indireta, isolamento viral, teste de soro neutralizao, reao em cadeia pela polimerase e ELISA. Os mtodos sorolgicos, que mensuram em amostras de soro IgG ou IgM especficos para o vrus, so indicados quando o animal est na fase aguda da doena (KIM et al., 2006; LATHA et al., 2007). No entanto, segundo Greene (2006), o aumento dos ttulos de IgM e de IgG no soro so ambguos e podem, ambos, indicar infeces anteriores e recentes em ces com ou sem vacinao para cinomose. J a anlise dos nveis de IgG especfica no lquor pode ser usado para mensurar anticorpos na fase crnica da infeco do SNC.

No intuito de oferecer novas tcnicas de diagnstico, Latha et al. (2007) identificaram uma nucleoprotena que aparece nos estgios iniciais da infeco nas clulas hospedeiras e em infeces naturais h produo de anticorpos diretos. Ento, o desenvolvimento de ELISA com nucleoprotena recombinante

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se mostrou superior a outros mtodos sorolgicos, oferecendo alta reprodutibilidade, ausncia de reaes cruzadas, facilidade de realizao em relao deteco de anticorpos pela imunofluorescncia indireta, alm disso, esse mtodo no requer o cultivo viral. Pode ser utilizado para detectar o aumento do ttulo de IgG ou nveis de IgM especficos visando monitorar a eficcia do programa de vacinao.

No SNC o vrus causa leses caracterizadas por reas de necrose bem delimitadas, desmielinizao e incluses intranucleares principalmente em astrcitos. A observao dessas leses em cortes histolgicos confirma o diagnstico da infeco pelo vrus (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O estudo de Damin et al. (2005) mostrou que a imunoistoqumica mais sensvel que a histopatologia de corpsculos de incluso, considerada complemento do diagnstico histopatolgico.

Sonne (2008) analisou o encfalo de 54 ces e observou que 29 deles apresentavam alguma leso microscpica. Na marcao imunoistoqumica dos 54 animais utilizados, 51 ces apresentaram marcao positiva em pelo menos um rgo, demonstrando que 94,4% dos animais com diagnstico macroscpico e microscpico de cinomose tiveram marcao positiva na imunoistoqumica. importante ressaltar que, no mesmo estudo, foram encontrados dois animais que no apresentaram alteraes microscpicas no crebro, porm o antgeno viral foi visualizado por teste imunoistoqumico.

No diagnstico post-mortem a imunoistoqumica tem sido utilizada para detectar o gene da protena do nucleocapsdeo, que uma protena interna e mais transcrita em clulas infectadas, considerado bom indicador de infeco (SHIN et al., 1995). Os astrcitos so as principais clulas marcadas pela imunoistoqumica para detectar o vrus da cinomose, chegando a 95% de clulas infectadas (MUTINELLI et al., 1998).

Haines et al. (1999) detectaram o antgeno no epitlio da mucosa nasal, dos coxins digitais e da pele, sugerindo a utilizao da tcnica de imunoistoqumica para o diagnstico ante-mortem da cinomose.

Na cinomose aguda, com leses no inflamatrias, encontra-se grande quantidade de antgeno viral no centro das leses. A medida que a resposta imune comea a agir nas leses crnicas mais difcil de encontrar o antgeno viral, podendo resultar em marcao negativa na imunoistoqumica (VANDEVELDE et al., 1985; BOLLO et al., 1986; BAUMGRTNER et al., 1989; MULLER et al., 1995).

A tcnica de isolamento viral em cultivo celular altamente especfica, porm demorada e pode resultar em falso-negativo se o animal no estiver na fase aguda da doena. O sucesso da replicao viral ocorre durante o cultivo direto de tecidos infectados do hospedeiro. Culturas de macrfagos detectam o vrus entre 24 a 48 horas, porm foram substitudas pela cultura de linfcitos caninos para o isolamento do vrus. A formao de clulas gigantes, considerada citoptica do vrus da cinomose em vrias culturas de tecido, detectada com dois a cinco dias (BARRETT, 1999; GEBARA et al., 2004).

O diagnstico de rotina do vrus da cinomose pela imunfluorescncia aplicado em vrias amostras, conjuntival, nasal e vaginal, usando anticorpos policlonais ou monoclonais. Este teste pouco sensvel e detecta o antgeno viral somente em infeces com trs semanas, quando o vrus est presente em clulas epiteliais (ELIA et al., 2008 apud APPEL, 1987).

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O uso do imunoensaio cromatogrfico para pesquisa de antgenos da cinomose foi descrito por Santos (2008). Neste estudo foram utilizados 38 animais saudveis, sendo que apenas um apresentou positividade no teste rpido.

O diagnstico da cinomose pode ser realizado de forma rpida e especfica utilizando kit comercial de imunoensaio cromatogrfico para pesquisa do antgeno do vrus da cinomose na mucosa nasal, saliva, conjuntiva, urina, soro e plasma. Afirma-se que este teste atinja 98,8% de sensibilidade e 97,7% de especificidade, no causando reao cruzada com outras infeces (Antigen Rapid CDV Ag Test Kit, Bioesay).

A maior desvantagem deste teste a possibilidade de falso negativo, j que a amostra selecionada pode no conter o antgeno, sendo esta evidncia encontrada quando relacionada com a fase da enfermidade, ocorrendo comumente na fase neurolgica. Este mtodo no detecta o vrus vacinal, pela baixa titulao nas vacinas, do 1 ao 14 dia aps a vacinao (Antigen Rapid CDV Ag Test Kit, Bioesay).

O antgeno viral pode ser difcil de detectar em outros tecidos em casos de cinomose em fase nervosa, sem sinais sistmicos, mas pode ser detectado nas clulas do lquor com o teste de imunofluorescncia indireta usando anticorpos antivrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus da cinomose em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos (BARRETT, 1999; GEBARA et al., 2004). Segundo Gebara et al. (2004) possvel detectar o cido nuclico do vrus em urina de ces, tanto com encefalite aguda quanto crnica. Estes resultados demonstram que a tcnica de RT-PCR um mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (SAITO et al., 2006; SATO et al., 2006; ELIA et al., 2008).

2. RT-PCR

Segundo Frisk et al. (1999), o RT-PCR um mtodo rpido, sensvel e especfico para o diagnstico da infeco pelo vrus da cinomose em ces. Nos seus resultados, foi detectado o RNA viral pelo RT-PCR em 86% das amostras de soro sanguneo e 88% de sangue circulante e lquor de ces com cinomose confirmado pela imunoistoqumica. O RNA viral no foi encontrado na imunoistoqumica em animais antgeno-negativo ou em ces vacinados, sugerindo previamente que a vacinao no causa resultados falso-positivos. A degradao autoltica do RNA viral causada por RNAases endgenas deve ser considerada na possibilidade de resultado falso-negativo. No entanto, Sato et al. (2006) afirmam que o soro e o sangue perifrico no so boas amostras para a deteco do vrus da cinomose pela RT-PCR quando o co apresentar apenas distrbios neurolgicos sem envolvimento sistmico da doena. A baixa celularidade do lquor pode ser insuficiente para a preparao da amostra, que pode causar inadequado isolamento do RNA viral.

A sensibilidade da tcnica da PCR pode variar com a seleo dos primers, mtodo de extrao do RNA e amostra clnica analisada (AMUDE, 2005). A sequncia de genes do vrus da cinomose no sentido 3 a 5 pela protena do nucleocapsdeo (N), fosfoprotena (P), protena de matrix (M),

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protena de fuso (F), hemaglutinina (H) e protena grande (L) (AMUDE et al., 2010b).

A escolha do iniciador (primer) gene-especfico requer cuidado e conhecimento sobre a replicao dos Paramyxovirus. Genes distais (L, H e F) so os ltimos a serem transcritos durante a replicao e genes das protenas do ncleo (N e P) possuem maior frequncia na transcrio. O gene-alvo para a amplificao na RT-PCR deve ser preferencialmente do ncleo para evitar ou minimizar os resultados falso-negativos (AMUDE et al., 2010b).

O sequenciamento dos genes amplificados pela RT-PCR pode levar a classificao das cepas virais do vrus da cinomose e na diferenciao das cepas selvagens ou vacinais (HEADLEY et al., 2009; SCHATZBERG et al., 2009).

A maior vantagem da PCR em tempo real a habilidade de quantificar partculas virais em amostras clnicas, ao contrrio da RT-PCR convencional que uma anlise qualitativa. Alta carga viral foi demonstrada em tecidos linfides, como tonsilas, bao, linfonodos mesentricos; vsceras e urina. No SNC, no lobo frontal foi encontrada alta concentrao viral, sugerindo ser a rea mais sensvel para diagnstico (ELIA et al., 2008).

As amostras de sangue perifrico, swab conjuntival, secreo nasal, urina, lquor, e swab vaginal, tecido pulmonar, estomacal, intestinal e urinrio, podem ser utilizadas para o diagnstico de cinomose pela tcnica RT-PCR. Entretanto, o swab conjuntival o mais apropriado para o diagnstico in vivo da cinomose (KIM et al., 2006).

Shin et al. (2004) levantaram a hiptese de utilizao do nested PCR para diagnstico da cinomose. A efetividade da tcnica foi demonstrada em amostras de sangue, urina, swab nasal e saliva. Sendo um mtodo ideal para deteco do vrus da cinomose em amostras clnicas, apresentou alta sensibilidade e consistncia no desempenho laboratorial. Comparativamente RT-PCR, mostrou positividade em todas as amostras testadas (JZWIK & FRYMUS, 2005).

Segundo Jzwik & Frymus (2005), o resultado de ambos RT-PCR e reao de imunofluorescncia direta foram positivos em animais poucos dias aps a vacinao, e confirmou que ambos os mtodos podem levar ao diagnstico falso-positivo de cinomose em ces vacinados com vacina de vrus vivo modificado. Portanto, o tempo mnimo entre vacinao e o exame em ces doentes deve ser de seis semanas para excluir o resultado falso-positivo. Em seus resultados sugerem que a sensibilidade do teste de imunofluorescncia 50% menor que o nested PCR. Contudo, RT-PCR combinado com o nested PCR mostrou-se o mais especfico e sensvel mtodo para diagnstico ante-mortem da cinomose, especialmente nas formas subagudas e crnicas, quando o vrus no se encontra mais em epitlios e a reao de imunofluorescncia foi negativa.

3. Tratamento de ces com cinomose e Profilaxia

Ainda no existe tratamento efetivo para a cinomose, o que explica a importncia dessa enfermidade em medicina veterinria (TIPOLD et al., 1992; CORRA & CORRA, 1992; KAJITA et al., 2006).

Apesar de no existirem muitos estudos atuais sobre o assunto, Corra & Corra (1992) recomendavam a administrao de soro hiperimune (gama globulinas especficas) distribuindo-o em vrios locais por via subcutnea, em

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dose nica. A ao do soro hiperimune , fundamentalmente, de soroneutralizao de todos os vrus livres, e que se libertam eventualmente dos tecidos. O soro homlogo permanece ativo no animal por 15 a 30 dias, baixando seu ttulo gradualmente, formando complexos antgeno-anticorpo com o vrus, por metabolizao e eliminao progressiva. No entanto, quando h alteraes do sistema nervoso, o soro hiperimune pode no impedir o avano da doena, pois apenas neutraliza os vrus circulantes, no atuando sobre as partculas virais que ultrapassaram a barreira hematoenceflica. Se o animal j foi vacinado pelo menos uma vez, aplicar uma dose de vacina, que poder estimular clulas-memria e rapidamente produzir imunidade ativa (CORRA & CORRA, 1992).

Animais com infeco no trato respiratrio superior ou pneumonia, que frequentemente causada por complicaes bacterianas secundrias, devem ser tratados com antimicrobianos de amplo espectro, ativos principalmente contra Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. Os frmacos mais utilizados so amoxicilina, cloranfenicol, florfenicol, cefalosporinas, fluorquinolonas e aminoglicosdeos. A terapia antimicrobiana pode ser alterada quando realizado antibiograma de lavado transtraqueal ou quando no h resposta ao antimicrobiano de escolha. Podem ser utilizados tambm expectorantes ou nebulizao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

A hidratao dos animais com soluo de Ringer, para hidratar e ao mesmo tempo manter o equilbrio eletroltico. Pode-se adicionar 2,5 a 5% de glicose ao Ringer e administrar glicose como fonte energtica para animais anorxicos (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

Anticonvulsionantes devem ser utilizados, como o fenobarbital na dose de 2 mg/Kg pelas vias intravenosa, intramuscular ou oral, a cada 12 horas. Corticosterides, como a dexametasona na dose de 2,2 mg/Kg, por via intravenosa, podem ser utilizados devido a base imunopatolgica das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral, mantendo a terapia com doses antinflamatrias, posteriormente, reduzindo a dose at o final do tratamento. A imunossupresso causada pelos esterides a principal desvantagem, porque a resposta inflamatria responsvel pela retirada do vrus. Na encefalite multifocal progressiva causadora de tetraplegia, semicoma e incapacitao a eutansia recomendada (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). A mioclonia irreversvel (GREENE, 2006).

Como os macrfagos e seus produtos, especialmente radicais livres de oxignio, so importantes na induo da destruio do tecido nervoso na cinomose, antioxidantes como vitamina E e vitamina C podem ser utilizados terapeuticamente (TIPOLD et al., 1992).

O cido ascrbico no s considerado um simples anti-oxidante, mas tambm neuromodulador do sistema nervoso central (GRNEWALD, 1993; REBEC & PIERCE, 1994). Matsumoto et al. (2010) comprovaram que a quantidade de cido ascrbico no crebro aumenta em resposta ao excesso de glutamato, que encontrado em diversos modelos de destruio tecidual, incluindo convulses induzidas.

Outras medidas teraputicas apropriadas podem ser recomendadas ou executadas, conforme a gravidade da doena: vitamina A para a proteo e regenerao de epitlios, vitamina C como fator trfico dos tecidos mesenquimais, do retculoendotlio e indiretamente do sistema imunopoitico,

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vitaminas do complexo B como tnicas e regeneradoras da fisiologia nervosa, para antialgia e mielopoiese e estimulante de apetite (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

No incio do sculo XX as vacinas inativadas eram amplamente utilizadas, porm a cinomose ainda ocorria em ces e animais de zoolgico (APPEL & SUMMERS, 1995). A partir dos anos 60, com as vacinas atenuadas houve diminuio considervel na incidncia da cinomose