tratamento biolÓgico de solo impactado...

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ESCOLA DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS

QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS

TRATAMENTO BIOLÓGICO DE SOLO IMPACTADO POR

RESÍDUOS OLEOSOS PROVENIENTES DO REFINO DE

PETRÓLEO

Teresa Cristina Ferreira do Nascimento

Fevereiro – 2013

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ESCOLA DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE

PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS

TRATAMENTO BIOLÓGICO DE SOLO IMPACTADO POR

RESÍDUOS OLEOSOS PROVENIENTES DO REFINO DE

PETRÓLEO

Teresa Cristina Ferreira do Nascimento

TESE APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-

GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS

QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS PARA OBTENÇÃO DO

GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS (DSc.)

Orientadores: Francisca Pessoa de França, D.Sc.

Fernando Jorge Santos de Oliveira, D.Sc.

Fevereiro – 2013

iii

Ficha catalográfica

N244t Nascimento, Teresa Cristina Ferreira do.

Tratamento Biológico de Solo Impactado por Resíduos Oleosos

Provenientes do Refino de Petróleo/ Teresa Cristina Ferreira do

Nascimento. – 2013.

xix, 140 f.: il.

Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) –

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro,

2013.

Orientadores: Francisca Pessoa de França e Fernando Jorge Santos de Oliveira

1. Biorremediação. 2. Landfarming. 3. Resíduos Oleosos. 4. Hidrocarbonetos

Policíclicos Aromáticos 5. Cossubstratos- glicerol e óleo de soja – Teses. I. França,

Francisca Pessôa de. (Orient.). II. Oliveira, Fernando Jorge Santos de (Orient.).

III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação em

Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química. IV. Título.

CDD: 628.5

v

“Manda a sabedoria desde o céu santo e a envia desde o teu trono glorioso, para

que ela me acompanhe e participe dos meus trabalhos, e me ensine o que é

agradável a ti”.

Livro da Sabedoria 9-10, Bíblia Sagrada

vi

Esta Tese é dedicada,

À Rita, minha mãe, pelo exemplo de vida, extremo amor e dedicação incondicional.

À José, meu pai (in memorian), pelo amor e pela calma.

À Maria do Socorro, minha querida tia, pelo amor e toda a ajuda possível e impossível.

À José Júnior, meu querido irmão, pelo amor que nos une.

vii

À Raquel e Rebecka

Fabiana, Camilla e Clara Eduarda (sobrinhas)

Por terem suprido o meu lado mãe, mesmo sem ter tido filhos

À Maria Eugênia (irmã- in memorian).

À Francisco Eduardo (primo- in memorian).

Elos importantes na minha jornada de vida.

viii

AGRADECIMENTOS

Como não se faz uma Tese sozinha, eu gostaria de agradecer a grande equipe que me

ajudou nessa conquista.

Primeiramente à Deus, que acredito ser a energia maior, sem a qual a minha vida não

teria o menor sentido.

Ao Divino Espírito Santo, pela iluminação nos momentos de completa escuridão.

À Jesus Cristo, pelo exemplo a seguir sempre, e pelo seu extremo sacrifício por nós,

na figura de um ser humano.

À mãe de Jesus Cristo e mãe de todos nós, que me houve e atende sempre. Obrigada,

minha Nossa Senhora de todas as horas.

À Nossa Senhora de Guadalupe, pelo milagre da aceitação do trabalho do México a

bom tempo, quando parecia não haver a menor possibilidade.

Aos meus orientadores; a Professora Doutora Francisca Pessôa de França e ao Dr.

Fernando Jorge Santos de Oliveira, pelo apoio e auxílio na execução e andamento deste

trabalho. Um agradecimento especial à Professora Francisca pelo convite, pela amizade,

sinceridade e liberdade a mim concedidas.

Aos meus amigos de fé e grandes incentivadores, em especial a amiga Ana Nilce

(Meméia), aos amigos Graça e Joselias (Bolota), Edson Leão (Didinho), Ubiratan Mynssem

(Bira), Carlos Alberto (Pinha) e demais amigos e amigas; pela amizade, pelos momentos de

relax e descontração, com muita música e boas gargalhadas.

Aos primos Cida Veloso, pelo carinho, e ao querido primo e parceiro de todas as

horas, Francisco Veloso, sempre cobrindo as minhas ausências.

Ao Carlinhos e Luizão da Geotecnia, pelas análises de solo, sempre sorrindo e de bom

grado, mesmo com suas agendas lotadas.

Ao Prof. Luiz Guilherme Marques, pela amostra de glicerol bruto.

Ao pessoal do CETEM, em especial a Dra. Andréa Rizzo, Eliane Carollo e Renata

Santos, pelo auxílio nas primeiras tentativas de ensaios de TPH.

Ao pessoal (equipe) do professor D’Ávila, em especial à Amanda Pereira e ao técnico

Estevan Padini, pelas análises de densidade e viscosidade, e também ao Rafael, pelas análises

de FTIR.

À Química Isabel Lopes, pelas sugestões e empenho nas análises de SARA, e aos

técnicos Santiago e Grazielli, pela execução e esclarecimentos.

ix

As professoras Cheila Mothé e Érica Chrisman, pelas sugestões e apoio em alguns

ensaios preliminares, e à professora e amiga Maria José, pelo incentivo no ingresso deste

curso.

Ao pessoal do IMA, à Dra. Bluma e à técnica Dalva, pela disponibilidade na

realização de alguns ensaios.

À professora Maria Cláudia da Geotecnia, pelo apoio e sugestões importantíssimas.

Ao professor Leon Rabinovitch, pela identificação de estirpes de bactérias, e à Jeane

Quintanilha Chaves, da equipe do professor Leon, do CCGB da FIOCRUZ.

À professora Maria Inês Sarquis, pela identificação de fungos e também por sua

atenção, dedicação e sugestões valiosas.

À professora doutora Lucy Seldim do Laboratório de Genética Microbiana, por

encaminhar para identificação de estirpes de bactérias, e à Renata Vollu, pela atenção,

trabalho com o preparo, envio e identificação das cepas.

À equipe de técnicos do laboratório das professoras Magali e Denise, em especial à

Verônica, pelo suporte nas análises preliminares de óleos e graxas.

À professora Eliana Flávia, pelo apoio logístico em seu laboratório e na confecção de

inúmeras análises. Obrigada pelo carinho, atenção e colaboração.

Ao professor Nei Pereira Jr., pelos bons conselhos e disponibilidade do seu laboratório

para a execução de algumas tarefas.

Aos amigos do Laboratório 107, pelos bons momentos de comemorações e trabalho de

equipe, entre eles: Cristiane D`Arco, José Vitor, Diego e Juliana, e Verônica, do Lab. 103,

pelas fotografias dos micro-organismos.

Aos amigos Paulo Santana e Iracema Marques da Silva, pelo suporte em momentos

difíceis. Ele viabilizando a execução de tarefas e ela com suas mãos mágicas no preparo de

culturas de fungos e bactérias para identificação.

Aos amigos do Laboratório 109 com quem eu tive a oportunidade de conviver ao

longo desses anos de forma divertida e prazerosa e que, direta ou indiretamente, me ajudaram

em momentos preciosos desse trabalho: Aike Costa, Diogo Simas, Denise, Jamille Lima,

Camilla Gonzales, Renata Calixto, Carlos Eduardo (Cadu), Leonardo Jordão, Kally Sousa,

Adilza (Dill), Milton, Rafael, Rafael Bittencourt, Virginia, Daniel Serwy, Daniel II, Igor, Eni,

Felisberto, Danadara. E quero agradecer especialmente aos amigos de jornada, companheiros

de todas as horas e de decisões acadêmicas importantes, Dr. Ulrich Vasconcelos, Dra.

Ivanilda Melo e Dra. Flávia Padilha.

x

Um agradecimento especial à amiga Moema Ungarelli Gonzaga que, amavelmente,

me presenteou com as correções de português.

Ao pessoal da Secretaria de Pós-Graduação, pela atenção e paciência no repasse de

todas as informações, em especial ao Júlio, Roselli, Marlene e Natália, o meu muito obrigado.

Ao amigo e químico Eric Tiago Neiva, pelo apoio nas minhas ausências no trabalho.

Ao Sr. José Antônio Roque Neto, da empresa INCOME Indústria e Comércio de

Metais Ltda., pela liberdade de trabalho.

À ESSENCIS Soluções Ambientais, pela destinação do resíduo sólido utilizado e

gerado neste estudo.

À CAPES e ao CNPQ.

xi

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS xiv

LISTA DE TABELAS xvi

LISTA DE QUADROS xvi

LISTA DE ABREVIATURAS xvii

RESUMO xviii

ABSTRACT xix

CAPÍTULO 1 – Introdução 20

CAPÍTULO 2 – Objetivos 24

2.1. Objetivo Geral 24

2.2. Objetivos Específicos 24

CAPÍTULO 3 – Revisão Bibliográfica 25

3.1- Aspectos gerais sobre a complexidade da contaminação de solos por

petróleo, derivados e resíduos oleosos

25

3.2- Refino de óleo cru e a geração de resíduos 28

3.3- Sistemas de Tratamento de solos impactados com resíduos oleosos oriundos

de refinarias de petróleo

33

3.3.1- Processos térmicos 33

3.3.2- Processos químicos 36

3.3.3– Processos biológicos 39

3.3.3.1- Landfarming 40

3.3.3.2 – Biopilhas 43

3.3.3.3- Biorreatores 44

3.4- Biodegradação de hidrocarbonetos: microrganismos envolvidos e

metabolismo

45

3.4.1. Microrganismos 46

3.4.2- Metabolismo microbiano 48

3.5. Fatores que influenciam a biodegração de hidrocarbonetos 52

xii

3.5.1. pH e Nutrientes 52

3.5.2 Temperatura 54

3.5.3 Umidade e aeração 54

3.5.4. Tipo dos contaminantes e grau de intemperismo 55

3.5.5 Quantidade do contaminante 58

3.5.6. Tipo de solo 59

3.5.7. Presença de biosurfactantes 61

3.6. Uso de Cossubstratos na biorremediação de solos impactados 62

CAPÍTULO 4 - Materiais e Métodos 66

4.1 – Solo 66

4.1.1- Amostragem

66

4.2- Ensaios físicos e físico-químicos

67

4.2.1 – Umidade

67

4.2.2 - Capacidade de retenção de água

68

4.2.3 – Granulometria

68

4.2.4 – pH

69

4.2.5. Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (TPH)

69

4.2.6. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA)

70

4.2.7 – Nitrogênio total e fósforo total

70

4.2.8 – Determinação de SARA

70

4.3 – Quantificações microbianas

71

4.4 – Etapas Experimentais

72

4.4.1 – Influência da concentração inicial do contaminante na biorremediação

72

4.4.2 – Efeito do tipo e concentração inicial de cossubstratos na

biorremediação

73

4.4.3 – Efeito do uso de glicerol bruto na biorremediação

73

xiii

4.5 – Fitotoxicidade dos solos remediados

74

4.6 – Identificação de bactérias e fungos filamentosos

75

CAPÍTULO 5 – Resultados e Discussão 77

5.1 – Caracterização do solo

77

5.2 – Caracterização do contaminante

79

5.3 – Efeito da concentração inicial do resíduo na Biorremediação 83

5.4 – Emprego de cossubstratos renováveis como alternativa para aumentar a

biodegradação dos hidrocarbonetos

93

5.5 – Biorremediação de solo contaminado com TPH 60 g/kg, empregando

glicerol bruto como cossubstrato

100

5.6 – Fitotoxicidade do solo 106

5.7 – Micro-organismos isolados durante os 60 dias de processo em laboratório 108

CAPÍTULO 6 – Conclusões 114

Referências Bibliográficas 116

ANEXO A – Declaração de Destinação de Resíduos

ANEXO B– Produção Bibliográfica

ANEXO C – Trabalhos Publicados

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 Esquema Simplificado do processo de refino de petróleo e a

geração de resíduos

30

Figura 3.1 Fluxograma de processo de incineração de solos contaminados

com resíduos oleosos

35

Figura 3.3 Metabolismo bacteriano da ruptura orto ou meta do anel

aromático

50

Figura 3.4 Degradação de naftaleno por bactérias aeróbicas 51

Figura 3.5 Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos por fungos 52

Figura 4.1 Foto mostrando o landfarming, o local de origem das amostras

de solo

66

Figura 4.2 Os reatores usados em escala de bancada 72

Figura 5.1 Curva granulométrica de uma das amostras de solo 78

Figura 5.2 Cronograma de TPH de solo contaminado antes da

biorremediação, TPH=29,2 g/kg

81

Figura 5.3 Perfil cromatográfico do resíduo oleoso que contaminou os solos,

em coluna delgada, usando TLC-FID para análise SARA

83

Figura 5.4 Porcentagem de biodegradação de TPH, em 30 e 60 dias de

processo, nos ensaios de biorremediação com TPH inicial 15,3,

19,0 e 29,2 g/kg de solo

85

Figura 5.5 Evolucão do crescimento microbiano durante a biorremediacão

(a) BHT; (b) FT

91

Figura 5.6 Valores de pH dos reatores contendo glicerol, óleo de soja como

cossubstratos

94

Figura 5.7 Percentual de degradação com suplementação dos cossubstratos

glicerol e de óleo de soja após 60 dias

95

Figura 5.8 Perfil cromatográfico do extrato orgânico do solo de landfarming

com teor de HTP igual a 29,2g/kg de solo, suplementado com os

cossubstratos glicerol e de óleo de soja após 60 dias

96

Figura 5.9 Monitoramento microbiano solos suplementados com glicerol e

óleo de soja a 750 mg/kg e HTP de 29,2 g/kg (TPH/Cossubstrato,

igual a 40:1)

99

xv

Figura 5.10 Valores de pH e Umidade em solos suplementados com glicerol

comercial e glicerol bruto e THP inicial de 60 g/kg na relação

(TPH:Cossubstrato, igual a 40:1).

101

Figura 5.11 Percentual de degradação de solos com HTP de 60 g/kg,

suplementados com cossubstratos, glicerol comercial e glicerol

bruto na relação (TPH:Cossubstrato, igual a 40:1)

102

Figura 5.12 Monitoramento Microbiano em solos suplementados com

glicerol comercial e glicerol bruto na relação (TPH/Cossubstrato,

igual a 40:1) e TPH inicial de 60g/kg

105

Figura 5.13 Colônias de fungos e bactérias com distintos aspectos 109

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 Características de borra oleosa 32

Tabela 3.2 Alguns gêneros microbianos hidrocarbonoclásticos 47

Tabela 3.3 Constantes físico-químicas dos 16 HPA listados pela USEPA 57

Tabela 5.1 Resultados da caracterização física e química do solo 77

Tabela 5.2 Capacidade de troca catiônica de solo de landfarming 79

Tabela 5.3 Caracterização por polaridade do resíduo oleoso contido no solo 82

Tabela 5.4 Comparações múltiplas das médias de biodegradação do TPH em

30 e em 60 dias de processo

86

Tabela 5.5 Lista CONAMA de valores orientadores para solos (Brasil,

2009)

88

Tabela 5.6 Biodegradação de criseno e de benzo[a]pireno em função da

concentração inicial de HPA no solo

89

Tabela 5.7 Características físico-químicas dos cossubstratos 93

Tabela 5.8 Monitoramento da umidade dos solos 94

Tabela 5.9 Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno nas

concentrações de 350, 750 e 1500 mg/kg dos cossubstratos

glicerol e óleo de soja e HTP igual a 29,2 g/kg de solo

97

Tabela 5.10 Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno – HTP igual a

60g/kg de solo e cossubstratos glicerol comercial e glicerol bruto

na relação HTP/Cossubstrato de (40/1).

103

Tabela 5.11 Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno reportados da

literatura

103

Tabela 5.12 Fitotoxidade do solo antes e depois do biotratamento 107

Tabela 5.13 Isolados bacterianos em solo contaminado com resíduos oleosos 109

Tabela 5.14 Fungos Filamentosos isolados de solo contaminado com resíduos

oleosos

110

LISTA DE QUADROS

Quadro 4.1 Representação da divisão do landfarming em células 67

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

BHT Bactérias Heterotróficas Totais

FT Fungos Totais

UFC/g Unidades Formadoras de Colônias por grama de solo

HPA Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

HTP Hidrocarbonetos Totais de Petróleo

TPH Hidrocarbonetos Totais de Petróleo

USEPA United States Environmental Protection Agency

CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente

CRA Capacidade de Retenção de Água

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Kow Constante de partição em octanol/água

CTC Capacidade de Troca Catiônica

pb Pares de base

TPH DRO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Diesel

TPH ORO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Óleo Lubrificante

TPH GRO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Gasolina

TPH KRO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Querosene

xviii

RESUMO

NASCIMENTO, Teresa Cristina Ferreira. Tratamento biológico de solo impactado por

resíduos oleosos provenientes do refino de petróleo. Rio de Janeiro, 2013. Tese

(Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013

Os solos contaminados com hidrocarbonetos de petróleo constituem uma parcela significativa dos

resíduos gerados pelo setor de óleo e gás (O&G). Dada a toxicidade e a grande quantidade gerada,

trata-se de resíduos críticos. A viabilização do negócio do O&G pressupõe o adequado gerenciamento

dos resíduos gerados, que é uma tarefa ainda mais difícil quando se trabalha com materiais tóxicos, em

grandes quantidades e em áreas distantes dos grandes centros de disposição final e de tratamento de

resíduos. Neste contexto, avaliou-se a biodegradação de hidrocarbonetos em solo amazônico, oriundo

de um landfarming instalado em uma unidade do setor de O&G, em escala de biorreator de bancada.

A inovação deste trabalho de tese abrangeu: i) a avaliação da influência da concentração inicial de

hidrocarbonetos intemperizados de petróleo na biodegradação e, ii) o estudo da influência da

suplementação de fontes adicionais de carbono, óleo vegetal e glicerol sobre a biodegradação dos

hidrocarbonetos intemperizados. Os ensaios e os testes controles foram monitorados durante 60 dias,

promovendo-se sistemática aeração e umectação. Dos solos, foram isoladas linhagens de Aspergillus,

Cunninghamella, Serratia, Rhodococcus, Micrococcus e Bacillus, como micro-organismos

predominantes nos solos contendo altas concentrações de hidrocarbonetos. Verificou-se que o

aumento da concentração de hidrocarbonetos de 15,3 g/kg para 29,2 promoveu uma redução de 29%

na biodegradação. Também foi verificado que o aumento da concentração inicial do TPH do solo de

15,3 para 29,2 g/kg influenciou negativamente a biodegradação do criseno, que passou de 66% para

19%. Já para o caso do benzo(a)pireno, não foi verificado qualquer efeito do TPH inicial na

biodegradação. Visando a melhoria da biodegradação, foram feitos testes com uso de cossubstratos

renováveis e de baixo custo. Os testes foram conduzidos com solo contendo TPH inicial de 29,2 g/kg.

A suplementação com glicerol comercial ou com óleo de soja, na concentração de 750 mg/kg,

promoveu a manutenção da população dos micro-organismos presentes no solo e remoção de

hidrocarbonetos totais de petróleo, do criseno e também do benzo(a)pireno, que são compostos tóxicos

de alta massa molecular. Em seguida, visando a redução dos custos dos processos numa ampliação de

escala, testes foram conduzidos com emprego de glicerol residual da produção de biodiesel e glicerol

comercial, na proporção de (40:1) e um solo contendo TPH inicial de 60 g/kg. Não foi verificada

diferença significativa na biodegradação dos hidrocarbonetos totais de petróleo pela suplementação

com glicerol comercial ou bruto. Observou-se uma remoção de aproximadamente 80 % dos

hidrocarbonetos totais do solo, de aproximadamente 78% para o criseno e de 56% para

benzo(a)pireno. Em conclusão, contribuiu-se com o conhecimento de variáveis operacionais

importantes para a otimização da biodegradação de hidrocarbonetos recalcitrantes e intemperizados

em solo amazônico.

Palavras-chaves: Biorremediação, Landfarming, Resíduos Oleosos, Hidrocarbonetos

Policíclicos Aromáticos, Cossubstratos, Glicerol e Óleo de Soja.

xix

ABSTRACT

NASCIMENTO, Teresa Cristina Ferreira. Biological treatment of weathered oily-sludge

contaminated soil from oil refinery. Rio de Janeiro, 2013. Thesis (Post-Graduation in

Technology of Chemical and Biochemical Processes) – Escola de Química, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, 2013

Petroleum hydrocarbons contaminated soil constitute a significant portion of the waste generated by

the oil and gas sector (O & G). It is critical residues due to toxicity and generated amount. The

feasibility of the O & G business requires proper management of generated waste, which is an even

more difficult task when working with toxic materials in large quantities and in areas far from main

centers of disposal and treatment of waste. In this context, we evaluated the biodegradation of

hydrocarbons in a soil from Amazon, by a landfarming installed on a facility of O & G sector, in

bench scale bioreactor. The innovation of this thesis included: i) the evaluation of the influence of

initial concentration of weathered hydrocarbons in oil biodegradation, and ii) the study of influence of

supplementation of additional carbon sources, vegetable oil and glycerol on the biodegradation of

weathered hydrocarbons . Assays and control tests were monitored for 60 days, promoting systematic

aeration and wetting. From the soil were isolated strains of Aspergillus, Cunninghamella, Serratia,

Rhodococcus, Micrococcus and Bacillus, such as micro-organisms predominant in soils containing

high concentrations of hydrocarbons. It was found that increasing the concentration of hydrocarbons

of 15.3 g/kg to 29.2 promoted a 29% reduction in biodegradation. It was also shown that increasing

the initial concentration of TPH of the soil from 15.3 to 29.2 g/kg negatively influenced

biodegradation of chrysene, which increased from 66% to 19%. For the case of benzo (a) pyrene it

was not observed any effect of the TPH initial biodegradation. Aiming biodegradation improvement,

tests were carried out using low cost and renewable co-substrates. Tests were conducted with initial

TPH soil containing 29.2 g/kg. Supplementation with glycerol or with commercial soybean oil at a

concentration of 750 mg/kg promoted maintenance of the population of micro-organisms present in

soil and total petroleum hydrocarbons removal, as also chrysene and benzo (a) pyrene removal, which

are high molecular weight and toxic compounds. Then, in order to reduce the costs of scale-up

processes, tests were conducted with use of residual glycerol from biodiesel production and

commercial glycerol in the proportion of (40:1) and an initial soil containing TPH of 60 g/kg. There

was no significant difference in the biodegradation of total petroleum hydrocarbons by

supplementation with residual or commercial glycerol. There was a removal of approximately 80% of

total hydrocarbons from the soil and approximately 78% for chrysene and 56% for benzo(a)pyrene. In

conclusion, we contributed with knowledge of important operational variables for the biodegradation

of recalcitrant and weathered hydrocarbons optimization in a soil from Amazon region.

Keywords: Bioremediation, Landfarming, Oily Waste, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,

Co-substrates - Glycerol and Soybean Oil.

Nascimento, T.C.F. Introdução 20

CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO

Petróleo é o termo utilizado para designar óleo e gás natural. É uma substância

viscosa, inflamável, menos densa que a água, com cheiro característico e cor variando entre o

negro e o castanho-escuro (THOMAS, 2001). Também pode ser definido como uma mistura

de várias substâncias orgânicas e inorgânicas com predominância de hidrocarbonetos mais

impurezas (SZKLO e ULLER, 2008). Mais especificamente, deve-se considerar que todo o

tipo de petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos, compostos sulfurados,

compostos nitrogenados, compostos oxigenados, elementos químicos diversos (ex: Ni, V, Hg,

Na, Ba e S), água e outras substâncias.

O uso de petróleo remonta a tempos muito antigos, há cerca de 3000 anos na China,

decorrente de um vazamento de gás na superfície, o que possibilitava a sua coleta e transporte

através de tubulações de bambu. Desta forma, nota-se que, desde o princípio, o uso para fins

energéticos é a principal aplicação deste recurso natural e finito. Atualmente o Brasil é o

segundo maior produtor de petróleo da América do Sul, e passa por constante crescimento no

setor. Em 2009 alcançou a marca de dois milhões de barris diários (ANP, 2011), constituindo

um dos pilares da matriz energética do país e da economia local.

A indústria do petróleo e gás natural possui vários ramos de atuação: exploração,

produção, refino, transporte e comercialização. Algumas empresas desse setor produtivo

possuem ainda operações envolvendo a produção, o transporte e a comercialização de

biocombustíveis. Há ainda empresas que se dedicam ao mercado produtor de energia a partir

de combustíveis diversos, como gás natural, diesel e carvão. Todas essas atividades geram

resíduos sólidos perigosos e não perigosos. Desta forma, fica claro o largo espectro de

materiais que devem ser gerenciados como resíduos.

Refinarias de petróleo são sistemas complexos com múltiplas operações que

dependem das propriedades do insumo ou da mistura de insumos e também dos produtos que

se deseja produzir, por isso a composição da carga das refinarias pode variar

significativamente. Assim, não existem duas refinarias iguais no mundo, (SZKLO e ULLER,

2008). Dentre os processos de refino destacam-se: a separação, a conversão, o tratamento e

processos auxiliares. De todos os segmentos do setor de petróleo e gás, as operações de refino

e petroquímicas são reconhecidas como grandes geradoras de resíduos perigosos e de manejo

complexo (CUNHA, 2009).


As refinarias em geral são planejadas e dimensionadas para recebimentos de misturas

de petróleos, com vistas à produção de frações ricas em hidrocarbonetos com características

específicas, como, por exemplo, gasolina, diesel, corrente de propeno, correntes de

aromáticos, etc. Ocorre que, com o passar do tempo, há uma natural modificação da

composição do óleo cru recebido. Essas modificações geram perturbações no processo

produtivo e incrementam os resíduos. Além disso, a diversidade de produtos requer o uso de

processos térmicos, catalíticos e de equilíbrio de fases, e, conseqüentemente, aumenta-se a

complexidade do processo de refino, o que também pode promover aumento na geração de

resíduos.

Dentre os resíduos perigosos gerados nas refinarias encontram-se os resíduos oleosos,

como as borras de fundo de tanque, as borras geradas nas unidades de processo e os líquidos

drenados em canaletas dos pátios. Assim, a adequada gestão desses resíduos e os custos

relacionados com essas operações são uma preocupação do setor industrial e acadêmico.

Devido à composição química e à elevada quantidade em todo o planeta, o petróleo,

combustíveis derivados do petróleo, os óleos lubrificantes e os resíduos oleosos são

reconhecidos como materiais com alto risco de contaminação ambiental e de danos à saúde do

ser humano (THAPA et al. 2012, STEMPVOORT e BIGGAR, 2008). Detendo-se no ponto

de vista ambiental, sabe-se que o solo é um dos compartimentos do planeta impactados pelo

petróleo, derivados e resíduos oleosos (SHERR et al. 2007). Vários acidentes ambientais

envolvendo vazamento de petróleo ou derivados em tanques, dutos e refinarias já ocorreram

nas últimas décadas. No entanto, a contaminação não acidental, também denominada

contaminação crônica, é uma das preocupações atuais, constituindo uma das principais rotas

de contaminação por hidrocarbonetos (MUTECA, 2012).

Uma das questões contemporâneas é a sustentabilidade ambiental dos processos

industriais. Hoje a sociedade valoriza a necessidade de produtos e processos sustentáveis, que

não comprometam a qualidade de vida no planeta para as próximas gerações.

Para atender aos anseios da sociedade civil, da legislação e visando a manutenção das

suas operações, as empresas do setor de petróleo e gás vêm investindo no desenvolvimento de

tecnologias limpas, bem como no correto manejo, tratamento e disposição final dos resíduos.

Atualmente existem várias alternativas para o tratamento de resíduos oleosos, dentre elas a

disposição destes resíduos no solo. Os métodos empregados para o tratamento de solos

contaminados por petróleo e derivados são os processos físicos, químicos e biológicos. A

tecnologia de tratamento biológico de solos, também conhecida como biorremediação, é um


processo que envolve degradação de contaminantes do solo, água e sedimentos através de

micro-organismos autóctones ou exógenos (MAO et al. 2012). Em geral os custos de um

tratamento biológico são menores em relação aos tratamentos químicos ou físicos

(CUNNINGHAN et al. 2004; SARKAR et al. 2005; PALA et al. 2006; YANG et al. 2009).

A incorporação de resíduos oleosos em solos objetiva usar o potencial da microbiota

natural desses ambientes para degradar os contaminantes orgânicos presentes. Essa rota de

tratamento apresenta resultados satisfatórios na eliminação da fração orgânica dos resíduos

oleosos, quando são oferecidas condições físico-químicas adequadas para a biodegradação

pela população microbiana do solo (da SILVA et al. 2012, HUANG, et al. 2004). Os

tratamentos biotecnológicos em geral envolvem, além da alta eficácia, custos reduzidos e

aplicabilidade em faixas amplas de concentração e de tipos de contaminantes (OLIVEIRA e

de FRANÇA, 2005).

Além dos nutrientes aceptores finais de elétrons, a cinética de biorremediação é

influenciada pela concentração do contaminante e presença de substâncias tóxicas, como

metais pesados e recalcitrantes, parafinas de alta massa molecular e hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos (MARÍN, et al. 2005).

A tecnologia de landfarming é uma das tecnologias de biorremediação que consiste na

aplicação do resíduo na superfície do solo, para promover a degradação microbiana dos

derivados do petróleo. O espalhamento do material oleoso contaminante sobre o solo e a

incorporação na camada arável, também denominada camada reativa (USEPA, 2000), pode

afetar diretamente e de modo diferenciado os micro-organismos responsáveis pela

biodegradação (FRANCO, 2004).

A literatura apresenta vários trabalhos sobre a remediação de solos contaminados com

hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, com uso da tecnologia de landfarming e outras

técnicas biológicas (da SILVA et al. 2012; STELIGA et al. 2009). No entanto, quando se trata

de solos oriundos da região amazônica do Brasil e impactados com hidrocarbonetos, os

estudos de biodegradação são escassos (LIMA, 2002), embora essa região do país seja

estratégica, relevante, de notória visibilidade internacional e englobe várias atividades do

setor de petróleo e gás.

Os solos intemperizados, como aqueles encontrados nas regiões tropicais, apresentam

frações de argila e silte, que afetam negativamente a biorremediação por questões de


diminuição de bioacesso, incrementando a problemática do tratamento (CAHAÎNEAU et al.

2003; GONG et al. 2008).

Estudos recentes demonstram que a adição de óleo vegetal à matriz de um solo da

Malásia, promoveu a dessorção dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) da fase

sólida do solo e a sorção na fase óleo, capacitando a assimilação dos mesmos pelos micro-

organismos, devido à facilidade de dessorção da interface óleo/água ou da interface óleo/solo

(Yap et al. 2010).

Considerando todo o exposto, tem-se a hipótese de que a adição de cossubstratos

renováveis e de baixo custo pode ser uma possível rota para melhoria do desempenho do

biotratamento de solos tropicais contaminados com hidrocarbonetos alifáticos, aromáticos e

policíclicos aromáticos.

Nascimento, T.C.F. Objetivos 24

CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS

2.2- Objetivo Geral

Verificar a eficácia do biotratamento de solo natural da Região Amazônica Brasileira

impactado com resíduos oleosos e intemperizados provenientes do refino de petróleo, em

condições de altas concentrações iniciais dos contaminantes, avaliando a influência da

suplementação de cossubstratos renováveis.

2.3-Objetivos Específicos

Caracterizar o solo impactado e avaliar o potencial da microbiota indígena em

biodegradar hidrocarbonetos, em especial os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos,

HPA; em diferentes concentrações de resíduos oleosos.

Estudar o efeito do uso de glicerol comercial e de óleo de soja, cossubstratos

renováveis, na biodegradação de hidrocarbonetos em solos contaminados com diferentes

concentrações de resíduos oleosos.

Verificar o efeito da suplementação com glicerol bruto (resíduo da produção de

biodiesel) na biodegradação de hidrocarbonetos em solos contendo alta concentração de

resíduos oleosos.

Isolar microrganismos nativos da Amazônia e degradadores de hidrocarbonetos de

petróleo.

Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 25

CAPÍTULO 3 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1- Aspectos gerais sobre a complexidade da contaminação de solos por petróleo,

derivados e resíduos oleosos.

O petróleo é constituído por uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outros

compostos orgânicos, incluindo alguns constituintes organometálicos notadamente complexos

de vanádio e níquel (VAN HAME; SINGH e WARD, 2003). Como o petróleo contém

compostos químicos tóxicos, tais como benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno, HPA e outros, a

contaminação por petróleo ou seus derivados pode ser danosa à saúde humana e ao ambiente

(VASUDEVAN e RAJARAM 2001, SARKAR et al. 2005).

A contaminação ambiental por óleo e derivados ocorre, principalmente, durante as

operações de estocagem e transporte das matérias primas, produtos acabados, bem como dos

resíduos oleosos gerados nos diversos processos (OLLIVIER e MAGOT, 2005).

No caso dos derramamentos de óleos e resíduos oleosos em solos, a contaminação se

caracteriza por movimentos verticais, e não pela propagação horizontal com a mancha de

petróleo, como acontece em águas (JUHASZ e NAIDU, 2000). Sendo assim, a infiltração do

óleo no solo dificulta as perdas por evaporação dos hidrocarbonetos voláteis, que podem ser

tóxicos para os micro-organismos, dificultando o processo de recuperação do local impactado.

Além disso, os compostos semi-voláteis e as substâncias não-voláteis presentes nos óleos

crus, derivados e também nos resíduos oleosos, permeiam pelas camadas dos solos,

preenchem alguns espaços vazios da coluna de solo e podem alcançar os corpos hídricos do

local, incrementando o estado crítico dos eventos de contaminação ambiental em solos.

Nesse processo de movimentação, fica claro que as partículas do solo podem

contribuir para a sorção dos constituintes contaminantes e, portanto, devido à redução da

mobilidade, pode se diminuir a toxicidade efetiva dos contaminantes aos seres vivos. Tal

redução de mobilidade de contaminantes nos solos se dá por meio de fenômenos como a

absorção e adsorção. No entanto, é provável que a adsorção de hidrocarbonetos à matéria


húmica promova a formação de resíduos persistentes, contribuindo para a complexidade do

seu tratamento (JUHASZ e NAIDU, 2000).

A literatura reporta que há uma baixa mobilidade de hidrocarbonetos nos solos

argilosos, devido à alta área superficial das partículas de argila e silte dos solos, que contribui

para o fenômeno da sorção dos contaminantes, e também devido à viscosidade dos fluidos.

Salienta-se, no entanto, a permanência da fração mais viscosa dos resíduos oleosos e de óleos

crus na superfície dos solos, favorecendo o contato dérmico com animais e,

consequentemente, o risco ecológico (GONG et al. 2005, ZHANG et al. 2006, HAMDI et al.

2007).

Os solos arenosos, por sua vez, apresentam menores áreas superficiais e, caso não haja

a presença de elevados teores de material orgânico, os contaminantes percolam as camadas

dos solos com maiores velocidades de deslocamento, incrementando a problemática de

contaminação de lençóis freáticos (GABARDO, 2007).

No Brasil, a maioria dos solos são intemperizados, ou seja, são solos que sofreram

elevados graus de ação do clima e com formação antiga e, portanto, apresentam elevados

teores de materiais finos como a argila e o silte (GABARDO,2007). Em muitos casos, os

solos possuem uma fração orgânica que pode ter características diversas. A matéria húmica

compõe um dos principais componentes da matriz orgânica do solo, representando cerca de

2/3 do carbono orgânico, e é constituída de ácidos orgânicos, como por exemplo, os ácidos

húmico e fúlvico. Como atuam sobre as condições químicas e físicas do solo, um melhor

entendimento das propriedades funcionais e estruturais da matéria húmica do solo pode

auxiliar na compreensão de mecanismos responsáveis pela complexação, redução,

mobilização ou imobilização de compostos químicos tóxicos no solo, que podem influenciar

de forma significativa na biodegradação dos hidrocarbonetos (FERREIRA et al. 2004).

Dentre os hidrocarbonetos do petróleo, é reconhecido que benzeno, tolueno,

etilbenzeno e xileno (BTEX), representam alguns dos compostos que possuem maior

mobilidade em solos. Isso se deve à maior solubilidade dessas moléculas em água e pela

menor massa molecular, maior polaridade e menor coeficiente de partição (MILENA et al.

2007). Os BTEX são tóxicos, mesmo em baixas concentrações, e podem proporcionar vários

danos à flora, à fauna e aos seres humanos (PATUREAU et al. 2008, BERNARDO et al.

2009), porém, estudos demonstram a biodegradação satisfatória destes compostos, por micro-


organismos, em solos com diferentes texturas (PRENAFETA-BOLDU et al. 2004, ORTIZ et

al. 2006, GENOVESE et al. 2008).

Outra classe importante de compostos orgânicos presentes nos óleos crus, derivados e

resíduos oleosos, são os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, HPA, (MENICONI et al.

2002, HANDI et al. 2006a, HARMSEN, 2007). Os HPA são moléculas que contém dois ou

mais anéis benzênicos condensados ou ciclopentanos arranjados de forma linear, angular ou

em grupo (MUCKIAN et al. 2007). Eles são formados durante a decomposição térmica de

moléculas orgânicas e sua subsequente recombinação, na combustão incompleta a altas

temperaturas (500-800ºC), ou por subinjeção de material orgânico em temperaturas em torno

de 100-300ºC por longos períodos (HARITASH e KAUSHIK, 2009). Os HPA são

introduzidos no ambiente através de fontes naturais ou antropogênicas. Como exemplos de

fontes naturais, temos florestas, erupções vulcânicas, derrames de óleo e exudatos de árvores.

A queima de combustíveis fósseis, carvão, madeira, lixo, resíduo, o uso de óleos lubrificantes

e filtros de óleo, são exemplos de fontes antropogênicas de HPA (KAUSHIK e HARITASH,

2006).

Embora semi-voláteis, os HPA tendem a ser sorvidos pela matriz dos solos, sobretudo

nos solos intemperizados, dificultando sua biodegradação. Os HPA também são compostos

tóxicos de difícil biodegradação, e incrementam a dificuldade da biorremediação de solos

impactados com esses contaminantes (ENNEL et al. 2005, GONG et al. 2007).

O conteúdo de matéria orgânica é a característica que mais influencia a sorção dos

HPA no solo. Diversos autores demonstraram efeitos nas relações lineares positivas entre o

conteúdo de carbono orgânico do solo e a capacidade de sorção de HPA (JACKES et al.

2007).

Ressalta-se, no entanto, que a biodisponibilidade é inversamente proporcional ao

número de anéis condensados compreendidos na molécula do contaminante, e é diretamente

proporcional à sua solubilidade em água (JUHASZ e NAIDU, 2000, CONTE et al. 2001).

Um estudo realizado em 1996 pela Agência de Proteção Americana (USEPA) relatou

que existem vinte e nove tipos diferentes de resíduos oleosos, gerados por 180 refinarias

espalhadas pelo território americano (URURAHY, 1998). Dentre os diferentes tipos de

resíduos oleosos gerados no setor de petróleo e gás, destacam-se as borras oleosas que são

formadas em praticamente todas as operações envolvidas nesse setor produtivo. Borras


oleosas são sistemas multifásicos, compostos basicamente de emulsões água-óleo, sólidos

(orgânicos e inorgânicos) e tensoativos (naturais e adicionais), e são formados segundo

mecanismos de floculação. São constituídas de óleo, água e sólidos em concentrações

variando de 5 a 100% de óleo; de 10 a 90% de água e de 10 a 90% de sólidos (URURAHY,

1998). De uma maneira geral, pode-se dizer que as borras são frequentemente detectadas em

fundos de tanques de armazenamento de óleo e em separadores de água-óleo (SAO),

justamente nas regiões interfaciais entre o petróleo e a fase aquosa. A viscosidade elevada

desses resíduos favorece a sorção de seus constituintes na matriz dos solos e acúmulo na

superfície dos sistemas terrestres e, juntamente com sua complexidade química, desfavorece o

biotratamento de solos impactados com esses resíduos.

Assim, a complexidade desses resíduos, somada à diversidade de solos, incrementa a

problemática dos processos de recuperação de ambientes contaminados e compreendem,

dessa forma, um tema contemporâneo das pesquisas em diversas partes do globo terrestre

(COELHO, 2002, OLIVEIRA e DE FRANÇA, 2005, MARCHETTINI; RIDOLF e RUSTICI,

2007).

3. 2 - Refino de óleo cru e a geração de resíduos

Define-se por refinaria de petróleo um conjunto de unidades de processos físicos,

químicos e térmicos, que objetivam a separação de componentes do óleo cru em frações com

misturas de hidrocarbonetos.

Tavares (2005) descreve que há basicamente três tipos de refinarias de petróleo:

topping, hydroskimming e de craqueamento térmico. As refinarias do tipo topping são plantas

industriais que apresentam apenas unidades de destilação atmosférica e de tratamento de

produtos. Já as refinarias do tipo hydroskimming apresentam uma unidade de reforma

catalítica e de hidrotratamento, além das unidades de destilação atmosférica e a vácuo. As

refinarias de craqueamento térmico são consideradas mais complexas, e sua principal

finalidade é a produção de frações diesel.

Independente do grau de complexidade, para que as operações de refino possam ser

realizadas, são necessárias Unidades de Processo (UP) e Unidades de Serviços (US). Dentre

as UP destacam-se os reatores, as colunas de destilação e as colunas de absorção. Dentre as


US destacam-se as unidades para geração de vapor, para adução de água, para tratamento de

efluentes e os escritórios.

A disposição dos equipamentos, o número de UP e US, a configuração dessas

unidades, o objetivo e a eficiência de cada instalação do refino do óleo cru, fazem com que

cada refinaria seja única. No entanto, em todos os casos, independente da localização

geográfica e de fatores inerentes ao local em estudo, no refino sempre se parte do óleo cru, e

se objetiva obter produtos de maior valor agregado. A Figura 2.1 apresenta um esquema

simplificado do processo de refino de petróleo e a geração de resíduos.

A Figura 3.1 demonstra que, de forma geral, existem correntes de entrada de matéria-

prima e insumos, e de saída de produtos, subprodutos e de resíduos. No Brasil, os resíduos

gerados pelas indústrias devem ser classificados em dois grandes grupos, perigosos e não

perigosos. Essa classificação é feita em conformidade com o disposto na norma 10004 da

ABNT (2004).


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Destilação

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Unidades de Processo

Unidades de Serviço

FCC- Craqueamento Fluido Catalítico; HDT- Hidrotratamento; UCR - Coqueamento Retardado; UGH – Geração de H2;

URE – Recuperação de Enxofre; UTE – Tratamento de Emissões; UTAA – Tratamento de Águas Ácidas; ETDI –

Tratamento de Efluentes; ETA – Tratamento de Água e, CTR – Central de Resíduos

Figura 3.1: Esquema simplificado do processo de refino de petróleo e a geração de resíduos.

Fonte: Adaptado de Szklo e Uller, 2008

Para classificar um resíduo como perigoso ou não perigoso, a legislação considera os

aspectos fonte de geração, inflamabilidade, toxicidade, corrosividade e reatividade com o ar e

com água, bem como as concentrações de várias substâncias e elementos químicos

transferidos para uma solução após contato estático e dinâmico com os resíduos. Estes testes

são denominados, respectivamente, de testes de solubilização e de lixiviação de resíduos e são

semelhantes aos descritos no “Título 40 do Code of Federal Regulations dos EUA” (USEPA,

2001).


Convém salientar que, de acordo com a norma da ABNT- NBR 10004 (2004), os

resíduos sólidos compreendem, ainda, quaisquer líquidos ou rejeitos semissólidos que

resultem das atividades de origem industrial ou de serviços associados, e cujas

particularidades tornam inviável o seu descarte na rede de esgotos ou corpos de água, ou

exijam, para isso, soluções técnicas e economicamente inviáveis, em face às operações

convencionais de tratamento de efluentes disponíveis. Dessa forma, considerando o exposto

na legislação, e a quantidade de UP e US, o refino de petróleo gera grande quantidade e

diversidade de resíduos. Daí surge a necessidade de classificar adequadamente os resíduos,

identificando-os e obtendo informações para a eficiente destinação destes materiais

(MARCHETTINI et al. 2007).

Dentre os vários resíduos sólidos gerados no refino destacam-se: soluções ácidas ou

alcalinas exauridas, produtos químicos fora de especificação, sucatas metálicas, trapos e

estopas contaminados, EPI contaminados, solos contendo hidrocarbonetos, borras oleosas,

catalisadores gastos e sólidos contaminados.

Os catalisadores gastos são resíduos abundantes nas refinarias, e, atualmente, o

consumo mundial de catalisadores nas indústrias químicas, especialmente a petroquímica, é

cerca de 243.000 toneladas. Dos processos de refino, o de obtenção de gasolina, o

hidrotratamento, a hidrogenação e a desidrogenação, estão entre os exemplos mais

representativos no uso de catalisadores (MARAFI e STANISLAUS, 2003, AFONSO et al.

2006). Os catalisadores gastos são materiais ricos em Si e Al, com presença de vários outros

elementos químicos, a depender da sua aplicação como: Co, Ni, Mo e Pt. A presença de V, As

e Hg, se dá pela remoção desses elementos das correntes de hidrocarbonetos. Considerando a

grande quantidade gerada e a toxicidade desses resíduos, eles podem ser considerados críticos

para a indústria do petróleo (MAFARI e STANISLAU, 2008a, MAFARI e STANISLAU,

2008b).

As borras oleosas são outro exemplo de resíduos críticos do refino de petróleo. Esses

resíduos são gerados em grandes quantidades nas operações de armazenagem de petróleo e

derivados, nos reatores e colunas do processo. Estima-se que a geração de borras oleosas no

refino é de, aproximadamente, 1% volume do óleo refinado (URURAHY et al. 1998). São

materiais muito complexos e apresentam em sua composição uma série de contaminantes,

com destaque para os HPA, asfaltenos, resinas, metais pesados, elementos químicos diversos


(URURAHY et al. 1998, AL-FUTAISI et al. 2007). A Tabela 3.1 apresenta dados da

composição típica de borras oleosas geradas no refino de petróleo.

Tabela 3.1: Características de borra oleosa

Análises F. Sólida F. aquosa F. Orgânica Borra oleosa

Concentração (%p/p) 7 24 69 100

Íons (mg/L)

Nitrato - 45 Nd 10,8

Fosfato - <0,03 Nd -

Amônio - 25,6 Nd 6,2

N total (%p/p) Nd 0,4 0,2 0,1

Água 0,00 100 0,05 24,0

SARA (%p/p)

Saturados --- Nd 28,0 9,3

Aromáticos --- Nd 44,0 30,4

Resinas --- Nd 21,0 14,5

Asfaltenos --- Nd 7,0 4,8

HPA total (%p/p) --- Nd 13,51 9,32

Densidade (g/cm3) 0,6635 1,0000 0,8746 0,9576

F. dest (ºC) --- --- --- 289 a 550

pH --- 6,2-6,3 Nd 5,0-6,0

Viscosidade (cP)

30ºC 3 rpm - Nd Nd 885,5

50ºC 12 rpm - Nd Nd 207,7

70ºC 30 rpm - Nd Nd 70,8

Fontes: Ururahy et al. (1998); Ferrari; Albornoz e Neirotti (1994).

Nd – Não detectado; F. - Fase.


3.3- Sistemas de Tratamento de solos impactados com resíduos oleosos oriundos de

refinarias de petróleo

Considerando a grande quantidade de resíduos gerada e a toxicidade dos solos

impactados com resíduos oleosos oriundos das operações de refino de petróleo, a busca por

alternativas de minimização e para o correto tratamento desses materiais é uma das questões

contemporâneas do setor. Além disso, as alternativas de tratamento a serem implementadas

devem ter um custo acessível, o que incrementa a problemática do programa de

gerenciamento de resíduos da indústria do petróleo e gás (FERRARI et al. 1994, DANDO e

MARTIN, 2003, ELSHORBAGYA e ALKAMALI, 2005, MAFARI e STANISLAU, 2008b).

Os métodos mais empregados no tratamento de solos contaminados por petróleo e

derivados são os processos físicos, químicos, e biológicos. Dentre os processos químicos, os

processos térmicos são os mais aplicados. São exemplos de processos térmicos, a incineração

em fornos e o co-processamento em fornos de clinquerização. A oxidação química é uma rota

bastante estudada atualmente para o tratamento de solos contaminados com recalcitrantes

como, por exemplo, os HPA (RIVAS, 2006).

Dentre os processos físicos, destacam-se as operações para separação de fases, como a

centrifugação, a filtração sob pressão e a dessorção térmica. Dada a complexidade dos

resíduos oleosos, sistemas combinando alternativas físicas, químicas e/ou biológicas têm sido

estudados e também executados. Um exemplo é a incorporação em materiais cerâmicos e a

solidificação/estabilização como pré-tratamento, antes da disposição em aterros industriais

(OLIVEIRA, 2003, ROJAS; CONSOLI e HEINECK, 2007).

Os tratamentos biológicos, por sua vez, são reconhecidos como eficientes e de menor

custo. Os tratamentos biológicos envolvem a quebra de contaminantes, utilizando micro-

organismos (SARKAR, 2005).

Dentre os processos biológicos adotados para o tratamento de resíduos da indústria de

petróleo, destacam-se os landfarming, compostagem/biopilhas e reatores biológicos (BAIRD,

2002; SEABRA, 2006; ROJAS; CONSOLI e HEINECK, 2007).

A seguir, são delineados os principais processos de tratamento de solos impactados

com petróleo, derivados e resíduos oleosos.

3.3.1- Processos térmicos


A incineração compreende um dos processos térmicos mais amplamente utilizados.

Esse processo pode ser definido como uma combustão controlada de resíduos que são

combustíveis e de gases, em presença de oxigênio, resultando em cinzas (COELHO, 2002,

DA SILVA; ALVES e DE FRANÇA, 2012). Nos dias de hoje, considerando as exigências da

legislação ambiental, consciência ecológica dos consumidores, geradores e fornecedores e as

questões relacionadas com o aquecimento global, a incineração requer um controle rígido,

tendo que se tratar também as emissões e os materiais particulados que são liberados para a

atmosfera, apresentando, portanto, um custo energético muito elevado. Outro inconveniente

está no fato de poder ocorrer a geração de cinzas ricas em metais pesados, que devem ser

destinadas a aterros classe I (DEL’ARCO, 1999, ABNT, 2004, SILVA e LANGE, 2008).

Considerando a textura dos solos, o grau de contaminação e o tipo do contaminante, os

solos impactados necessitam ser preparados antes da entrada no processo térmico. Essa etapa

de preparação é denominada de blendagem e visa obter uma mistura de poder calorífico

homogêneo, evitando explosões no interior dos fornos. Essa etapa é essencial para o sucesso

de qualquer tratamento térmico de resíduos.

A Figura 3.2 apresenta um fluxograma do processo de incineração e considera o

exposto na Resolução n° 316/02 do CONAMA (BRASIL, 2002), que regulamenta o

funcionamento de unidades de tratamento térmico de resíduos. De acordo com essa

Resolução, na operação dos incineradores os resíduos a serem admitidos devem ser

preparados e analisados, o forno deve estar em temperatura superior a 800ºC e a câmara de

pós-combustão, em temperatura acima de 1200ºC. Essas temperaturas visam à completa

oxidação dos resíduos e gases emanados na combustão. Essa legislação preconiza, ainda, uma

série de limitações para o descarte de efluentes gasosos, entre outros importantes para o

controle ambiental.


Figura 3.2: Fluxograma do processo de incineração de solos contaminados com resíduos

oleosos. Fonte: Adaptado de Abreu e Souza (2005)

O co-processamento em fornos de cimento é alternativa do processo térmico para o

tratamento de solos contaminados por hidrocarbonetos. Neste processo, enquanto os resíduos

estão sendo destruídos no interior do forno, está acontecendo a produção de clínquer, para a

fabricação do cimento; ou seja, o co-processamento ocorre nos fornos para a produção do

clínquer e, por isso, o processo é denominado co-processamento em fornos de clinquerização.

Nesse processo, os resíduos oleosos atuam como combustíveis alternativos, aproveitando-se o

poder calorífico desses materiais.

Os fornos das cimenteiras possuem, em média, 60 m de comprimento e 4 m de

diâmetro, e operam na temperatura de 1.400ºC na zona de clinquerização, com um tempo de

residência para os gases de até 10 segundos, assegurando a completa destruição dos resíduos.

A eficiência de destruição e remoção, em média, para os fornos de clínquer, é de 99,99%, o

que mostra uma eficiência bastante elevada (ABREU e SOUSA, 2005).

No Brasil, o processo de co-processamento de resíduos em fornos de clinquerização é

regulamentado pela Resolução n° 264/99 do CONAMA (BRASIL, 1999). De acordo com

essa Resolução, solos contaminados com hidrocarbonetos podem ser processados, assim


como outros resíduos oleosos, mas não podem ser admitidos em unidades de co-

processamentos, resíduos do serviço de saúde e materiais radioativos.

Outra opção de tratamento térmico é a chamada Dessorção Térmica, que tem mostrado

grande eficiência na redução de contaminantes da indústria de petróleo. Na Dessorção

Térmica, o solo contaminado é escavado, peneirado e aquecido para liberar os

hidrocarbonetos do petróleo de seus interstícios (USEPA, 1995b, HEYDENRYCH et al.

2002, VASCONCELOS et al. 2010). O método é baseado no fenômeno da volatilização dos

constituintes do contaminante, o que envolve o equilíbrio de fases, transporte e transferência

de massa, sendo a temperatura um dos principais fatores no processo, ficando claro que o tipo

dos contaminantes e do solo, a granulometria e o tempo de residência nos equipamentos,

também são fatores importantes ao sucesso da dessorção térmica (BUCALÁ et al. 1994,

GEORGE et al. 1995). As temperaturas de dessorção variam na faixa de 100 a 600ºC, para

que os compostos orgânicos sejam apenas volatilizados, pois o aquecimento não objetiva

destruir os compostos orgânicos, e sim transformá-los em compostos de mais fácil degradação

(PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).

3.3.2- Processos químicos

Muitos dos contaminantes orgânicos podem ser parcial ou completamente oxidados

através de processos químicos de tratamento. Dentre os métodos químicos mais comumente

empregados estão a neutralização, a precipitação, a oxidação, a aplicação de surfactantes, e a

extração por solventes (PINA et al. 2002, YERUSHALMI et al. 2003, SANTOS, 2007,

PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).

A extração química consiste em misturar o solo com um solvente num reator,

promovendo-se, assim, a dissolução dos contaminantes. A fase líquida é então transportada

para um separador, onde se dá a separação dos contaminantes e do solvente, que são,

posteriormente, tratados e reutilizados respectivamente. Essa tecnologia não destrói os

contaminantes, sendo seu objetivo reduzir a massa de resíduo a ser tratada.

Dentre os processos químicos, destacam-se os processos oxidativos avançados

(POAs). A oxidação com reativo de Fenton (mistura de peróxido de hidrogênio e sulfato

ferroso) e a oxidação por permanganato de potássio são as tecnologias de oxidação mais


comumente usadas. A reação de Fenton gera radicais hidroxilas, que reagem com HPA

sorvidos, gerando produtos oxidados. A oxidação com permanganato é altamente dependente

da reatividade química do composto alvo (BROWN; BARTON e THOMSON, 2003). O

contaminante é degradado através de uma série de reações químicas, tendo como produtos

finais dióxido de carbono, água e íons inorgânicos (MILLIOLI, 2009).

Os Processos Oxidativos Avançados (POAs), são uma excelente alternativa para a

remediação de solos, pois envolvem um oxidante forte capaz de destruir ou hidrolisar os

contaminantes, num curto período de tempo (MILLIOLI; FREIRE e CAMMAROTA, 2003).

Estudos em escala de laboratório demonstraram que a oxidação química de HPA pelo

permanganato, pode ocorrer com diferentes reatividades químicas para diferentes espécies de

HPA dependendo da estrutura molecular, embora haja certa dificuldade do permanganato em

atacar o anel benzênico (BROWN; BARTON e THOMSON, 2003).

Segundo GAN et al. (2009), o permanganato de potássio é largamente utilizado para

oxidação de águas e tem mostrado aplicabilidade também na redução de solos contaminados

com HPA. O ânion permanganato é um agente oxidante com potencial de oxidação E0= 1,7 V.

Ele é efetivo na remediação de muitos hidrocarbonetos de petróleo e tem sido largamente

aplicado em remediações in situ e ex situ nos últimos anos. Ambos, permanganato de potássio

e de sódio, podem ser usados em aplicações ambientais, com resultados similares

(FERRARESE; ANDREOTTOLA e OPREA, 2008).

De Souza e Silva et al. (2009) estudaram a oxidação de solos contaminados com

fenantreno e pireno utilizando permanganato de potássio, observando que o mesmo reduziu

significativamente a concentração de HPA, chegando-se a valores abaixo do limite

estabelecidos pela legislação holandesa. Em relação à seletividade entre fenantreno e pireno, o

permanganato de potássio exibiu maior dificuldade em degradar pireno, provavelmente

devido ao seu maior peso molecular.

Persulfato de sódio é o mais recente agente oxidante utilizado na forma de sal

(Na2S2O8) para remediação de solos. A baixa solubilidade do persulfato de potássio (K2S2O8)

limita a sua aplicação como agente de remediação (ITRC, 2005, EPA, 2006). Em água, ocorre

a dissociação do persulfato em ânions persulfato (S2O82-

), que é um potente agente oxidante

com potencial de oxidação E0=2,0 V, mas cineticamente lento em destruir compostos

orgânicos. Uma adição de íons metálicos como, por exemplo, o ferroso, como no caso do


reativo de Fenton modificado, poderia ativar o íon persulfato, pela liberação de um poderoso

agente oxidante o (SO42-

) (LIANG et al., 2007b).

Os radicais sulfato livres têm um potencial redox E0=2,6 V e têm capacidade de oxidar

um maior número de poluentes orgânicos (EPA, 2006, LIANG et al. 2004). Estudos de

laboratório realizados por Ferrarese et al. (2008) com sedimentos contaminados com HPA,

verificando a eficiência de remoção utilizando os três agentes oxidantes em várias

combinações, mostraram que a oxidação química é uma tecnologia de remediação eficaz

facilmente aplicável à remediação ex-situ em sedimentos, e que reagentes diferentes

apresentaram eficiências de remoção diferentes. Os melhores resultados de eficiência foram

obtidos com o reagente de Fenton modificado, peróxido de hidrogênio e permanganato de

potássio 100 mol do agente oxidante, por 30 g de amostra de sedimento. Esse estudo mostrou

que são necessárias condições de oxidação muito enérgicas para solos e sedimentos

contaminados com altos teores de matéria orgânica.

O reagente de Fenton destaca-se frente aos outros processos, pois é capaz de gerar o

radical HO- mesmo na ausência de luz, e isto é uma vantagem em relação aos outros

processos oxidativos que utilizam luz ultravioleta para catalisar a reação.

Alguns autores verificaram que uma relação 5:1 de H2O2: Fe2+

é condição ótima para o

processo de oxidação de matéria orgânica em solos (RIBEIRO, 2003, MILLIOLI et al. 2009).

Muitos contaminantes orgânicos podem ser parcial ou completamente oxidados

através de processos de oxidação avançados, os (POAs), para aumentar a possibilidade de

posterior biodegradação. A USEPA (2001) identifica a oxidação química in situ como uma

das tecnologias inovadoras de remediação de solos contaminados por resíduos da indústria do

petróleo. Muitas pesquisas têm sido conduzidas para avançar e melhorar a eficácia dos

processos de limpeza de sítios contaminados. Muitos trabalhos foram realizados enfocando o

reagente Fenton (GOZMEN et al. 2003, MALIK, 2004) e oxidação por permanganato (YAN

e SCHWARTZ, 2000, GATES et al. 2001, HUANG et al. 2001).

Uma das vantagens das tecnologias de oxidação química é a sua capacidade de

sobrepor as limitações impostas pela baixa solubilidade de HPA em solução aquosa, nas

baixas taxas de biodegradação e/ou dissolução; deste modo, os produtos de oxidação

poderiam ser mais polares do que os compostos de origem (BROWN; BARTON E

THOMSON, 2003, MILLIOLI; FREIRE e CAMMAROTA, 2003). Por outro lado, a


qualidade do solo tem sido investigada através da análise de metabólitos tóxicos (SIRGUEY;

DE SOUZA e SILVA, P. T. e SCHWARTZ, 2008).

Os tratamentos químicos também podem ser combinados a processos de tratamento

biológico, por possibilitarem uma oxidação prévia dos compostos xenobióticos, isto é, um

pré-tratamento, sendo este um tema pouco estudado (PALMROTH et al. 2006,

VALDERRAMA et al. 2009).

2.3.3– Processos biológicos

Processos biológicos de tratamento de resíduos são também conhecidos como

bioprocessos, e têm a vantagem de degradar contaminantes do solo, água e sedimentos através

de micro-organismos autóctones ou exógenos. Em geral, os custos dos bioprocessos são

menores do que os dos processos físicos e, por isso, são mais vantajosos em relação a muitos

outros processos de tratamento (NANO et al. 2003, SARKAR et al. 2005, PALA et al. 2006).

A biorremediação de solos impactados com resíduos oleosos, petróleo e derivados,

pode ser conduzida com uso de diversas estratégias, sendo a bioaumentação ou bioaumento, e

bioestimulação ou bioestímulo, as mais empregadas normalmente. A bioaumentação envolve

a adição de micro-organismos, geralmente isolados da própria área impactada e reinoculados

sob a forma de suspensão ou encapsulados, para que, com a população aumentada em

número, possam ser capaz de degradar os poluentes presentes (OLIVEIRA, 2001). Neste

caso, a utilização de consórcios microbianos permite a degradação por via co-metabólica, isto

é, o substrato de um grupo gera produtos que servirão como substratos para outros grupos de

microrganismos. Os consórcios microbianos podem ser exclusivamente bacterianos

(AYOTAMUNO et al. 2007, JACQUES et al. 2008), compostos apenas por fungos

(MEYSAMI e BAHERI, 2003) e também podem ser mistos, ou seja, consórcios constituídos

por fungos e bactérias (BOONCHAN et al. 2000).

O bioestimulo, por sua vez, pode ser definido como a adequação ou suplementação de

nutrientes ou aceptores finais de elétrons no meio, para a melhoria ou viabilização do

metabolismo dos contaminantes. Quando se enfoca o caso de resíduos do setor de petróleo e

gás, verificam-se, em geral, altas concentrações de carbono, em detrimento a baixas

concentrações de N e P, essenciais à vida. Assim, em muitos casos, faz-se necessário corrigir


os teores de nutrientes nos solos, para o adequado tratamento (OLIVEIRA e DE FRANÇA,

2005, VASCONCELOS et al. 2011, CHAGAS-SPINELLI et al. 2012). Neste sentido, muitos

trabalhos de pesquisas atuais tratam da influência do uso de fontes alternativas de macro e de

micro-nutrientes, objetivando, sobretudo, a otimização de custos dos bioprocessos

(MUTECA, 2012).

As tecnologias de biorremediação podem ser divididas em duas categorias, in situ e ex

situ. Os processos são classificados como in situ quando as operações são realizadas nos

locais contaminados, ou seja, sem que haja a remoção do material. Quando o tratamento

ocorre fora do local atingido, classifica-se o processo como ex situ (USEPA, 2009). As

técnicas in-situ apresentam baixo custo, e requerem o uso de poucos equipamentos e técnicos.

No entanto, apresentam a dificuldade de aplicação em solos argilosos, principalmente quando

estes têm elevado grau de compactação e elevado teor de umidade, o que dificulta a passagem

do ar, devido ao aumento da perda de carga (BOOPATHY, 2000).

Dentre os processos biológicos adotados para o tratamento de resíduos da indústria do

petróleo, destacam-se os landfarming, as biopilhas e os biorreatores (SEABRA et al. 2006).

3.3.3.1- Landfarming

O landfarming caracteriza-se como um sistema de tratamento de resíduos em que estes

são aplicados na camada superficial do solo onde se encontra a maioria dos micro-organismos

heterotróficos, também conhecida como camada reativa do solo. É nesta camada do solo que

ocorrem os processos de biodegradação (BOOPATHY, 2000).

No sistema de landfarming os compostos de petróleo são removidos por volatilização,

biodegradação e adsorção (MAILA e CLOET, 2004, STEMPVOOP e BIGGAR, 2008,

SILVA, 2009, Da SILVA; ALVES e De FRANÇA, 2012).

No Brasil, para a confecção de projeto e operação desta forma de tratamento, deve-se

observar o estabelecido na norma ABNT NBR 13.894. Esta técnica é apropriada para dispor

resíduos oleosos não passíveis de recuperação, como materiais absorventes impregnados

(palha, serragem e turfa), e as emulsões água em óleo (CETESB, 2009).


A operação de um landfarming consiste em três etapas: i) aplicação e mistura do

resíduo no solo, através das operações com máquinas de preparo como tratores e arados; ii)

irrigação com água e adição de nutrientes; iii) revolvimentos periódicos para possibilitar a

aeração e a mistura das camadas superficiais do solo (SILVA, 2009).

Em sistemas de landfarming geralmente são tratados resíduos perigosos, e a área de

tratamento destes resíduos é normalmente utilizada apenas para esse fim (JAQUES et al.

2007). Esta rota tecnológica é amplamente adotada mundialmente, pois tem baixo custo e

promove a redução na concentração dos contaminantes pela ação dos micro-organismos na

camada superficial do solo. O processo de biorremediação por landfarming é considerado

eficaz quando conduzido através de operações adequadas de manejo e gerenciamento

(MAILA e CLOETE, 2004, PAULA et al. 2006, LORS et al. 2012).

A utilização do solo para o tratamento de resíduo teve início na Europa no final do

século XIX, com a técnica de irrigação de áreas cultivadas com águas residuárias sanitárias.

No início dos anos 50, o processo de tratamento no solo despertou interesse nas empresas de

refino de petróleo dos Estados Unidos, sendo as primeiras a desenvolver e praticar o

tratamento no solo para seus resíduos e, a este processo de tratamento específico, deram o

nome de landfarming (GENOUW et al. 1994). No período de 1960 até 1987, a Alemanha

utilizou uma área de 20.000 hectares para tratamento de resíduos em solo (LINE et al. 1996).

A Holanda, em 1989, iniciou o funcionamento do primeiro landfarming para tratar 500 m³ de

resíduo contaminado com HPA e óleo mineral. Nesse país, a legislação vigente prescreve as

medidas de prevenção contra a percolação de contaminantes para o subsolo, lençol freático e

águas superficiais (MARIJKE e VAN VLERKEN, 1998).

Jatar et al. (1993) avaliaram a aplicação de landfarming em condições de clima

tropical, na Venezuela. Trabalharam em uma área de um hectare e usaram técnicas de

umidificação, homogeneização, bioaumentação e fertilização. O teor de hidrocarbonetos totais

de petróleo (HTP) reduziu em 80%, após um período de nove meses de tratamento.

Segundo Al-Awadhi et al. (1996), durante a crise do Golfo, o Kuwait sofreu ataques

bélicos, resultando em perdas de seus poços de petróleo, o que levou à formação de 300 lagos

de óleo em uma área de 49 km², com penetração no subsolo até a profundidade de 2,5 m. Foi

estimado um derrame de 9x106 m³ de óleo, equivalente a 25x10

6 m³ de solo contaminado. A

recuperação via biorremediação da área contaminada com óleo iniciou-se em novembro de


1992, com a implantação de 16 unidades de landfarming. Após 15 meses de operação, a

redução da carga poluente atingiu 80%.

No Brasil, o landfarming foi introduzido pela PETROBRAS quando, no ano de 1982,

colocou em funcionamento uma unidade na Refinaria Henrique Lage, na cidade de São José

dos Campos, Estado de São Paulo. Desde então, a PETROBRAS iniciou a implantação de

landfarming em outras refinarias (CASTRO et al. 2005).

No ano de 1984, a Central de Tratamento de Efluentes Líquidos (CETREL), em

Camaçari (BA), implantou duas unidades de landfarming em uma área de 20 hectares, para o

pós-tratamento do resíduo originado dos tratamentos químico e biológico dos efluentes

gerados no complexo industrial de Camaçari (ALVES et al. 1996).

Castro et al. (2005) estudaram a otimização do landfarming da RPBC (Refinaria

Presidente Bernardes): e a correção do pH do solo e fertilização da camada reativa resultaram

em aumento da população microbiana, e consequente maximização da biodegradação de

hidrocarbonetos.

Paudyn et al. (2007) estabeleceram quatro sistemáticas de operação em um

landfarming canadense, sob condição de baixa temperatura: atenuação natural; aeração em

intervalos de quatros dias; aeração diária e adição de fertilizante. O resultado do efeito

sinérgico de adição de fertilizante acrescida de aeração foi a redução de 90% de HTP em 700

dias. Ressaltam ainda que compostos orgânicos recalcitrantes, como pristano e fitano, foram

degradados.

Silva (2009) obteve reduções de HTP de 89,6% e 88,6% de HPA em uma área de

lanfarming de 1000 m2 refinaria de petróleo após 240 dias de processo; adotando medidas

sistemáticas de controle e monitoramento como aeração regular, adição de água, correção de

pH e adição de nutrientes.

A tecnologia de landfarming tem sido conduzida com sucesso tanto em países de

clima tropical como em países de clima frio, regiões semiáridas e desertas (JATAR et al.1993,

LINE; GALAND e CROWELWY, 1996, BALBA; AL-DAHER e AL-AWADHI, 1998;

MAILA e CLOETE, 2004, MARIN et al. 2005, JAQUES et al. 2005, PAULA et al. 2006,

SOARES e SIQUEIRA, 2007, MACIEL et al. 2007, CASTRO et al. 2007, PAUDYN et al.

2007, CERQUEIRA et al. 2011). Pesquisas têm revelado a presença de organismos adaptados


a condições de clima frio (MOHN e STEWART, 2000); microrganismos extremófilos são

candidatos ideais para tratamento biológico de poluentes no ártico (RIKE et al. 2003, MOHN

e STUART, 2000). Uma vasta variedade de micro-organismos tem sido detectada na camada

ativa em solo Ártico, norte do Canadá e Alasca (DEMING, 2000, PAUDYN et al. 2008).

3.3.3.2- Biopilhas

Tratamento de solos contaminados com hidrocarbonetos em biopilhas é um sistema

(FES) de fermentação sólida de substrato de tecnologia ex-situ ou off-site, baseada na

capacidade dos micro-organismos degradarem compostos de hidrocarbonetos

(ALEXANDER, 1999, BARUCH et al. 2007).

As biopilhas também são conhecidas pela denominação biocélulas e biomontes, e vêm

sendo utilizadas para reduzir a concentração de constituintes do petróleo em solos por meio de

biodegradação (USEPA, 2004).

De forma sucinta, a tecnologia de biopilhas envolve o amontoamento de solos em

pilhas, com estimulação da biodegradação por meio da aeração, umidificação e/ou adição de

nutrientes. Funcionam com o mesmo princípio da compostagem, sendo que, no caso das

biopilhas, a aeração é feita por injeção de ar ou por sucção do ar atmosférico, enquanto no

landfarming, a aeração é feita por meio da aragem dos solos. Pode-se dizer que o sistema de

biopilha é uma variação da técnica de compostagem de materiais orgânicos. Porém, na

compostagem, o resíduo orgânico é metabolizado e transformado em húmus e em

subprodutos inertes, tais como dióxido de carbono, água e sais minerais, tanto em condições

aeróbias como anaeróbias sob condições termofílicas (50 a 65°C). No entanto, essas

condições termófilas não ocorrem com os solos contaminados (SEABRA, 2005).

O sistema de biopilha é uma tecnologia já desenvolvida em escala industrial,

basicamente para solos arenosos. O solo escavado contaminado é colocado em pilhas ou

células, cujo teor do contaminante presente é reduzido por biodegradação. Umidade,

nutrientes, oxigênio, temperatura e pH podem ser controlados para estimular a atividade

degradativa dos micro-organismos presentes no solo (DOD, 1994, OFFICE OF

UNDERGROUND STORAGE TANKS, 1995) apud SEABRA 2005.


As biopilhas são normalmente dispostas em locais impermeabilizados com mantas

para reduzir os riscos de migração do lixiviado para regiões de subsuperfície não

contaminados. No processo estático, o oxigênio é fornecido por meio de uma rede de tubos

perfurados instalada acima da base e conectada a um soprador ou bomba a vácuo.

Usualmente, as biopilhas são cobertas com mantas impermeáveis para minimizar o

escape de poluentes, principalmente voláteis, além de proteger o solo do vento e das chuvas

(VON FAHNESTOCK et al.1998). A altura típica de uma biopilha varia de 2 a 3 metros,

largura entre 5 e 10 metros e comprimento máximo de 30 m. A inclinação deve ter um ângulo

inferior a 35°, dependendo da textura do solo.

De uma forma geral, a biopilha é usada em tratamentos de curta duração, de 3 a 6

meses, em condições otimizadas. O sistema de biopilha é de projeto e construção

relativamente simples. Na sua construção, o solo pode ser misturado com: (a) esterco maduro

ou composto, para aumentar a população microbiana e ser um suprimento adicional de

nutrientes; (b) corretivo de solo (ex. sulfato de cálcio hidratado - gesso); (c) material

estruturante (serragem ou palha, por exemplo), para garantir que o meio tenha uma textura

mais permeável; e (d) substância química para ajuste do pH do solo, que deve estar dentro da

faixa de 6 a 8 (SEABRA, 2005).

Devido à presença de compostos voláteis no contaminante, estes tendem a se evaporar

durante a extração ou injeção de ar, necessitando-se de um sistema de captura e tratamento

dos vapores. Isto pode ser obtido com a colocação de uma cobertura na biopilha e com a

instalação de um sistema de coleta dos vapores (USEPA, 1994). As biopilhas podem ser

estáticas ou dinâmicas. O sistema de biopilhas não permite a frequência de mistura necessária

para suprir as limitações referentes à heterogeneidade e à disponibilização de nutrientes e

contaminantes (RIZZO, 2008, RIZZO et al. 2009).

3.3.3.3- Biorreatores

Os biorreatores são outra alternativa interessante para o tratamento de solos

impactados. Define-se biorreator como um ambiente controlado que permite o crescimento

adequado de células para obtenção do produto (WARD, 1981). Nesse sentido, várias


configurações de biorreatores têm sido estudadas para o tratamento de solos contaminados

com resíduos oleosos.

Trabalhos envolvendo o uso de biorreatores para o tratamento de solo contaminado

estão reportados na literatura (URURAHY, 1998, NANO et al. 2003, TROQUET et al. 2003,

WARD et al. 2003, PURWANINGSIHA et al. 2004, COLLINA et al. 2005, ARRAR et al.

2007). De uma maneira geral os biorreatores podem ser operados por batelada simples,

batelada alimentada, batelada sequencial, processos contínuos e em série; sendo que os modos

operacionais têm grande influencia na eficiência do processo (PEREIRA Jr; GOMES e

SORIANO, 2009).

Os tipos de biorreatores mais comuns para o tratamento de solos contaminados são os

reatores em fase sólida, os reatores de lama ou “slurry reactors”. Neste último tipo de

biorreator, o solo contaminado é misturado a uma fase aquosa (que pode conter

microrganismos e/ou nutrientes e/ou surfactantes). Esse sistema gera, como resultado do

tratamento, uma lama com 10 a 40% de sólidos, dependendo do tipo de solo. Essa lama do

tratamento normalmente é desidratada, ou pode ser submetida à biorremediação em fase

sólida, em que se trabalha com teores reduzidos de umidade de 10 a 20%.

Os reatores em fase sólida trabalham com um teor de umidade muito inferior aos

reatores de lama, e a água é usada para viabilizar o metabolismo microbiano. Em

conseqüência do menor teor de umidade requerido, esses biorreatores de fase sólida operam

com maior quantidade de solo (RIZZO, 2008).

3.4- Biodegradação de hidrocarbonetos: micro-organismos envolvidos e metabolismo

Considerando as particularidades das estruturas químicas, os hidrocarbonetos e os

demais constituintes orgânicos do petróleo, combustíveis e resíduos oleosos diferem quanto à

sua susceptibilidade ao ataque microbiano (SALANITRO, 2001). Estima-se que a

biodegradabilidade de diferentes tipos de óleo cru encontra-se na faixa de 70 a 97%. A fração

de baixa biodegradabilidade do óleo corresponde aos asfaltenos e às resinas, que são

considerados compostos biologicamente inertes (PRICE et al. 1999).


3.4.1. Microrganismos

As bactérias constituem os microrganismos mais estudados, dentre os quais as

Pseudomonas foram as primeiras a serem postas em evidência em função da sua capacidade

de degradar (HPA). Mais tarde, outros gêneros (Alcaligenes, Mycobacterium, Rhodococcus)

foram também aplicados na degradação destes compostos (BOUCHEZ et al.1996).

Sabe-se que as bactérias são as grandes responsáveis pela biodegradação da maioria

dos hidrocarbonetos, mas algumas espécies de fungos filamentosos e leveduras têm

habilidade de degradar esses compostos (BOOPATHY, 2000).

Atualmente, sabe-se também que os fungos são capazes de degradar moléculas de

HPA de alta massa molecular (quatro ou mais anéis), enquanto que a maioria das bactérias

limita-se à degradação de HPA de baixa massa molecular (DRITSA et al. 2007, LEONARDI

et al. 2007).

A grande contribuição dos fungos reside no fato de que, sob condições adversas,

como, por exemplo, valores extremos de pH, limitação de nutrientes e baixos teores de

umidade, os fungos filamentosos demonstram maior habilidade para degradação de

hidrocarbonetos. Os fungos filamentosos têm a capacidade de excretar enzimas que atacam

diretamente os HPAs, enquanto as bactérias possuem um sistema enzimático intracelular.

April et al. (2000) isolaram 64 linhagens de fungos filamentosos de solos canadenses e os

cultivaram em óleo cru como única fonte de carbono. Os resultados mostraram que 32

linhagens pertencentes à classe dos Ascomicetos apresentaram capacidade para degradar

hidrocarbonetos de petróleo. No Brasil, também foram desenvolvidos trabalhos de isolamento

de fungos degradadores de hidrocarbonetos provenientes de óleo cru e resíduos oleosos.

Araújo e Lemos (2002) e Reiche e Lemos (2006) isolaram várias linhagens de fungos

filamentosos, e, dentre estas, se destacaram os gêneros Aspergillus, Penicillium, Percilomyces

e Fusarium, pelo número de relatos. A Tabela 3.2 apresenta alguns gêneros de micro-

organismos hábeis na degradação de hidrocarbonetos.


Tabela 3.2: Alguns gêneros microbianos hidrocarbonoclásticos

Bactérias Fungos

Actinomicetos Leveduras Bolores

Achromobacter

Acinetobacter

Aeromonas

Agrobacterium

Alcaligenes

Arthrobacter

Bacillus

Burkholderia

Chromobacterium

Corynebacterium

Flavobacterium

Micrococcus

Mycobacterium

Proteus

Pseudomonas

Rhodococcus

Serratia

Xanthomonas

Actinomyces

Endomyces

Nocardia

Debaryomyces

Rhodotorula

Sporobolomyces

Yarrowia

Picchia

Acremonium

Aspergillus

Aureobasidium

Beauveria

Botrytis

Ceriporiopsis

Chrysosporium

Cladosporium

Cochliobolus

Colorospora

Coniothyrium

Coriolopsis

Cryphonectria

Cylindrocarpon

Dendosporium

Dendryphiella

Geotrichum

Gongronella

Drechslera

Fusarium

Graphium

Humicola

Lulwortria

Mortierella

Mucor

Paecilomyces

Penicillium

Phialophora

Rhizopus

Sprotrichum

Spicaria

Tolypocladium

Trametes

Trichoderma

Varicosporina

Verticilium

Fonte: Oliveira, (2001); Trindade, (2002); Silva, (2005); Pereira, (2008); Rizzo, (2008).

Em se tratando de leveduras, verifica-se nos estudos de Sá (2002) sobre a utilização de

hidrocarbonetos de petróleo por leveduras, que o gênero Candida apresenta preferência em

degradar hidrocarbonetos de cadeias lineares. Del’Arco (1999) demonstrou que leveduras

pertencentes ao gênero Sporolomyces e Rhodotorula são capazes de degradar hidrocarbonetos

alifáticos, cíclicos e aromáticos. Oliveira e de França (2001) isolaram linhagens de Pichia

gullermondii e de Yarrowia lipolytica de solo impactado com óleo cru, como degradadoras de

hexano.


Cianobactérias e Algas também demonstraram capacidade em degradar

hidrocarbonetos. De acordo com CERNIGLIA et al. (1992), nove cianobactérias foram

capazes de degradar naftaleno em meio líquido. Leahy e Colwell (1990) relataram que a alga

Protolheca zopfii degradou 40% dos hidrocarbonetos contidos no óleo cru, quando este foi

utilizado como substrato.

O fato das bactérias serem reconhecidamente os principais micro-organismos

degradadores de hidrocarbonetos envolvidos no processo de biorremediação de solos, vem da

observação de que com o aumento da profundidade do solo, o número de bactérias não é

drasticamente afetado, enquanto o número de fungos ou actinomicetos diminui. Este aumento

da população bacteriana é atribuído à habilidade das bactérias de utilizarem outros aceptores

de elétrons, além do oxigênio (BOOPATHY, 2000).

3.4.2- Metabolismo microbiano

Para que um micro-organismo utilize HPA como fonte de carbono e energia para o seu

crescimento, é necessário que possua várias enzimas que transformam as complexas

moléculas dos HPA em intermediários comuns das suas rotas metabólicas. Várias vias de

degradação de HPA já foram identificadas em diferentes micro-organismos, porém as mais

estudadas são as do metabolismo aeróbico realizado pelas bactérias, pelos fungos lignolíticos

e não-lignolíticos. No metabolismo bacteriano, a oxigenação inicial dos HPA é realizada por

uma enzima intracelular dioxigenase, que tem a função de reconhecer o HPA e adicionar dois

átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido à ressonância do anel aromático.

Após sucessivas oxidações, o último anel aromático é transformado em um dos

intermediários centrais da via de degradação dos HPA, que pode ser o catecol, o protocatecol

ou o gentisato. Até essa etapa, atuam as enzimas denominadas de periféricas, que têm a

função de conhecer as moléculas dos HPA e convertê-las nesses intermediários centrais. A

partir de então, atuam as enzimas de fissão, que converterão os intermediários centrais em

compostos que possam ser utilizados nas vias comuns de geração de carbono e energia da

bactéria.

Segundo Bamforth e Singleton (2005) as enzimas de fissão podem ser divididas em

dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central:


As enzimas intradiol abrem o anel aromático por via orto, originando o cis-

muconato, que por passos sucessivos, será convertido em succcinato e acetil-

coenzima.

As enzimas extradiol fazem a abertura do anel aromático por via meta, o

semialdeído 2-hidroximucônico, que, por passos sucessivos, será transformado

em ácido pirúvico e acetaldeído.

As bactérias oxidam hidrocarbonetos aromáticos a cis-dihidrodióis por meio das

referidas dioxigenases, as quais constituem um sistema enzimático multicomponente e que

catalisa as reações iniciais. A oxidação dos compostos aromáticos envolve a incorporação

enzimática do oxigênio no substrato, de tal forma que, por meio da produção de dioxigenases

pelas bactérias, incorporam-se dois átomos de oxigênio no núcleo aromático para dar início à

oxidação. Ou seja, as enzimas catalisam a adição de oxigênio molecular ao anel, quebrando

uma das ligações carbono-carbono. Normalmente a oxidação do anel inicial é considerada o

passo limitante na taxa de biodegradação de compostos aromáticos (CERNIGLIA, 1992). Os

cis-dihidrodióis formados inicialmente são rearranjados por meio da enzima cis-diidrodiol

desidrogenase, gerando um derivado diidroxilado (CERNIGLIA, 1984). A oxidação posterior

do cis-dihidrodiol conduz à formação de catecol, o substrato da dioxigenase que é responsável

pela ruptura inicial do anel aromático.

O catecol, por sua vez, pode ser oxidado por duas vias: a via orto, que envolve a

ruptura da ligação entre os átomos de carbono provenientes dos dois grupos hidroxila, para

gerar o ácido cis-mucônico; e a via meta, que envolve a ruptura de uma ligação entre átomos

de carbono, um deles proveniente de um dos grupos hidroxila e o outro proveniente de um

grupo adjacente, conduzindo à formação de um semi aldeído-2-hidroximucônico, Figura 3.3.

A ruptura do anel leva à produção dos ácidos succínico, fumárico, pirúvico e acético, bem

como à de aldeídos, os quais são todos empregados pelo microrganismo na síntese dos

constituintes celulares, gerando, concomitantemente, energia, dióxido de carbono e água, que

são produtos dessas reações (JUHASZ e NAIDU, 2000).


Figura 3.3: Metabolismo bacteriano da ruptura orto ou meta do anel aromático.

Fonte: Juhas e Naidu (2000)

A degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos HPA, em solo, é efetuada

por bactérias que pertencem a alguns grupos taxonômicos como, por exemplo, os gêneros

Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas e Mycobacterium, (ALBER et al. 2000,

BASTIAENS et al. 2003, JOHNSEN et al. 2005).

Banforth e Singleton (2005) estudaram a degradação de naftaleno por bactérias

aeróbicas. A via de degradação de naftaleno proposta por esses autores está ilustrada na

Figura 3.4. Nesse caso, também há a formação de catecol e outros compostos que seguem a

via metabólica aeróbica. Uma vez que o primeiro anel aromático do HPA é degradado (a

ácido pirúvico e dióxido de carbono), o segundo começa a ser atacado da mesma maneira, ou

seja, a degradação é sequencial.


Figura 3.4: Degradação de Naftaleno por bactérias aeróbicas

Fonte: Banforth e Singleton (2005)

Os fungos oxidam os HPA a óxido de areno pela enzima Citocromo P-450

monoxigenase. Os óxidos podem sofrer isomerização, para dar origem a fenóis, ou submeter-

se a desidratação enzimática, para formar transdihidrodióis (JUHASZ; NAIDU, 2000). Tanto

o Citocromo P-450 como as epóxido hidrolases já foram detectados em extratos fúngicos,

mais especificamente de Cunninghamella elegans. As ligninas peroxidases ionizam os

compostos aromáticos a radicais arila, que oxidam posteriormente para formar quinonas.

Também é possível supor que a hidroxilação inicial pode conduzir à formação de compostos

como glicuronídios, sulfatos e glicosídios. O isolamento desses metabólitos e a detecção da

atividade da aril-sulfo transferase, glutation S-transferase, UDP-glicuronosil transferase, e

UDP-glicosiltransferase são um indicativo de vias metabólicas de degradação dos HPA

(CERNIGLIA, 1997).

Várias enzimas estão envolvidas na metabolização de HPA: citocromo P-450, as

enzimas extracelulares lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase, Figura 2.5. Os


fungos não mineralizam ou metabolizam os HPA tão rápido como as bactérias e a produção

de intermediários poliidroxilados pode ser o passo limitante na degradação de HPA por

fungos.

Figura 3.5: Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos por fungos

(Fonte: adaptado de Wilson e Jones, 1993)

Além da mineralização dos HPA, os fungos produzem compostos altamente solúveis

em água, aumentando a sua reatividade química, o que pode facilitar o ataque por parte de

bactérias autóctones. Isso revela a importância de ambientes biodiversos na biodegradação de

compostos persistentes do petróleo.

3.5- Fatores que influenciam a biodegração de hidrocarbonetos

Muitos fatores influenciam os bioprocessos. No entanto, a eficiência dos processos de

biorremediação é determinada pela presença de micro-organismos apropriados, a

disponibilidade de nutrientes e oxigênio, a temperatura, o tipo e a concentração de

cossubstrato, pH, umidade (SCHERR et al. 2007, MEGHARAJ et al. 2011). A correta

otimização desses fatores é fundamental para o sucesso da implementação de sistemas de

biorremediação (COLLINA et al. 2005 e JONES et al. 2004).

3.5.1. pH e Nutrientes


O pH do solo afeta diretamente a atividade dos micro-organismos através dos efeitos

dos íons H+ na permeabilidade celular e na atividade, assim como, indiretamente, pela

influência na disponibilidade de macro e micronutrientes, e na solubilidade do alumínio e

demais metais pesados, que podem ser tóxicos aos micro-organismos (JAQUES et al. 2007).

Para a maioria dos micro-organismos envolvidos no processo de biorremediação, a

faixa de pH mais favorável para o seu crescimento se situa entre 6,0 a 8,0, com um valor

ótimo em torno de 7,0, sendo que os fungos são mais tolerantes a condições ácidas

(URURAHY,1998, YEMASH et al. 2007, PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).

Segundo Alexander (1999), a biodegradação tende a ser mais efetiva nas faixas de pH em

torno da neutralidade.

A atividade microbiana é fortemente dependente do pH do meio, influenciando a

solubilidade dos contaminantes e a sorção destes no solo (RIZZO, 2008).

Os micro-organismos necessitam de nitrogênio e fósforo para o seu metabolismo de

síntese e para o seu crescimento, como, por exemplo, a síntese de fosfolipídeos e ácidos

nucléicos, mas sabe-se também que a administração de quantidades elevadas de nutrientes ao

local de contaminação pode causar inibição ao processo de biodegradação do contaminante

(DEL’ ARCO, 1999).

Em ambientes naturais, o nutriente que normalmente limita o crescimento microbiano

é o carbono, sendo que os nutrientes inorgânicos estão presentes em quantidades que

normalmente excedem as demandas das comunidades microbianas (ALEXANDER, 1999). A

presença de elevadas concentrações de HPA no solo com potencial para serem utilizados

como substrato para o crescimento dos micro-organismos, pode fazer com que outros

nutrientes, que não o C, tornem-se limitantes (DEL’ ARCO, 1999).

A adição de nutrientes deve ser feita de modo que se obtenha uma relação carbono,

nitrogênio e fósforo adequada ao processo de biodegradação (HAMDI, et al. 2007). A relação

C:N:P de 100:10:1 no solo a ser biorremediado, tem sido normalmente recomendada

(JACKES et al. 2007).

Pesquisas que avaliaram os efeitos de N e P ao solo, demonstraram resultados muito

conflitantes, o que provavelmente se deve às especificidades de cada ambiente, no que se


refere a teores de nutrientes no solo, tipo de contaminante e população microbiana envolvida

(LEYS et al. 2005).

Outros nutrientes que poderiam influenciar na degradação de HPA no solo são o ferro

e o enxofre, porque desempenham funções celulares que estão intimamente relacionadas ao

metabolismo dos HPA, como a participação na estrutura das enzimas que realizam a

degradação destes compostos nas células microbianas.

Segundo Del’Arco, 1999, as fontes de nitrogênio e fósforo mais empregadas são os

sais de fosfato e o nitrato de amônio.

A adição de nutrientes deve ser feita somente após criteriosa avaliação, de forma a

evitarem-se adições desnecessárias, que resultariam em aumentos dos custos e em prejuízos

ao processo de biorremediação (JAQUES et al. 2005a).

3.5.2 Temperatura

A temperatura afeta a atividade metabólica, o consumo de substrato pelos micro-

organismos e, por consequência, a biodegradação dos HPA. Apesar de a biodegradação

ocorrer numa ampla faixa de temperatura, as maiores taxas de remoção ocorrem entre 25 e

35ºC, (OLLIVIER e MAGOT, 2005). Temperaturas acima ou abaixo desses valores, afetam

negativamente o processo de biorremediação (HAIDER, 1999).

3.5.3 Umidade e aeração

A umidade do solo é considerada por vários autores como o fator ambiental mais

crítico na biodegradação, pois uma alta atividade microbiana somente ocorrerá se houver

adequada disponibilidade de água aos micro-organismos (HAIDER, 1999).

Sabe-se que o teor de água no solo tem relação inversa com a disponibilidade de

oxigênio e, consequentemente, com as atividades dos micro-organismos aeróbios, que são os

principais responsáveis pela degradação dos HPA (PROVIDENT et al. 1993).


Um teor de umidade na faixa de 50 a 80% da capacidade de campo, é sugerido como

ideal para a obtenção de taxas ótimas de biodegradação (DEUEL e HOLLIDAY, 1997 apud

RIZZO, 2008). Outros autores restringem um pouco mais essa faixa, considerando valores

ótimos na faixa de 70 a 80% da capacidade de retenção de água (DEL’ARCO, 1999,

OLIVEIRA, 2001). Segundo Malina et al. (2002), uma faixa aceitável para os processos de

biodegradação estaria em torno de 30 a 80% da capacidade de campo.

A aeração proporciona o suprimento de oxigênio ao ambiente, favorecendo o

crescimento de micro-organismos aeróbios que utilizam este elemento como aceptor final de

elétrons, viabilizando a biodegradação do poluente (TRINDADE et al. 2005).

Muitos micro-organismos incluindo bactérias, fungos e leveduras predominantemente

aeróbios, são os maiores responsáveis pela degradação de hidrocarbonetos em solo

(MORELLI et al. 2005, THANGARAJ et al. 2007). Como esses microrganismos são

encontrados na camada superficial, também chamada de camada reativa do solo, a presença

do oxigênio é fundamental e também um fator limitante nos processos de biorremediação. O

oxigênio age como aceptor final de elétrons na mineralização de compostos recalcitrantes,

como hidrocarbonetos de petróleo, onde a matéria orgânica é oxidada até CO2 e H2O

(MODIGAN et al. 2000, STREVETT et al. 2002). O oxigênio é utilizado pelos micro-

organismos também como substrato, pois as reações biodegradativas são catalisadas pelas

enzimas oxigenases (RIZZO, 2008).

Sob condições aeróbicas, a biorremediação ocorre mais facilmente (PEREIRA Jr.;

GOMES; SORIANO, 2009). Em solo, condições de aerobiose são obtidas pelo revolvimento

periódico do mesmo, o que possibilita a rápida disponibilidade de oxigênio para o processo de

biodegradação.

3.5.4. Tipo dos contaminantes e intemperismo

A estrutura química dos contaminantes no caso específico dos hidrocarbonetos de

petróleo; influenciam diretamente na eficiência do processo de biorremediação em solos

(TRINDADE et al. 2005).

O benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX), são os hidrocarbonetos aromáticos

mais abundantes nas frações leves do petróleo, como a gasolina e o óleo diesel. Esses


compostos são solúveis em água e podem ser transportados a pontos distantes do local onde

houver um derramamento. Além disso, por causa do pequeno tamanho molecular e baixo

ponto de ebulição, esses compostos aromáticos podem ser volatilizados à temperatura

ambiente, se constituindo também numa fonte de contaminação do ar (ESPIRITO SANTO,

2002).

Dentre os hidrocarbonetos do petróleo, os HPA aromáticos são os de mais difícil

degradação e isso se deve à presença de mais de um anel benzênico em suas estruturas e, por

isso, exibem a particularidade de maior persistência no ambiente, atrelada às características

físicas e químicas dos mesmos (ALEXANDER, 1999, LIEBEG, e CUTRIGH, 1999).

Com relação à biodegradabilidade dos HPA pela população microbiana, foi

evidenciado o seu decréscimo com o aumento do peso molecular e o coeficiente de partição

octanol/água (Kow) (Tabela 3.3) (JACQUES et al. 2007).

A partir dos dados mostrados na Tabela 3.3, pode-se observar algumas características

gerais dos HPA: são sólidos à temperatura ambiente, têm altos pontos de ebulição e fusão,

baixa solubilidade em água, são solúveis em solventes orgânicos e altamente lipofílicos; suas

afinidades por fases orgânicas lipofílicas expressas pelo coeficiente de partição octanol-água,

são elevadas (entre 3,4 a 7,1). De fato, devido ao seu caráter lipofílico, os HPA e seus

derivados podem ser absorvidos pela pele, além de serem absorvidos por ingestão ou por

inalação, sendo rapidamente distribuídos pelo organismo (NETTO et al. 2000). Observa-se

que a solubilidade em água diminui com o aumento do tamanho da molécula e, com exceção

do naftaleno, que é relativamente solúvel (32mg/L). Os coeficientes de partição entre carbono

orgânico e água são também elevados e, como resultado, em sistemas aquosos os HPA

tendem a concentrar-se em sedimentos ou ficam associados à matéria orgânica em suspensão

(COSTA, 2001).


Tabela 3.3 - Constantes físico-químicas dos 16 HPA listados pela USEPA

HPA

Massa

molecular

(g)

Ponto de fusão (°C) Ponto de

ebulição (°C)

Naftaleno 128,17 81 217,9

Acenaftileno 152,20 92-93 -

Acenafteno 154,21 95 279

Fluoreno 166,22 115-116 295

Antraceno 178,23 216,4 342

Fenantreno 178,23 100,5 340

Fluoranteno 202,26 108,8 375

Pireno 202,26 150,4 393

Benzo(a)antraceno 228,29 160,7 400

Criseno 228,29 253,8 448

Benzo(b)fluoranteno 252,32 168,3 481

Benzo(k)fluoranteno 252,32 215,7 480

Benzo(a)pireno 252,32 178,1 496

Benzo(g,h,i)perileno 276,34 278,3 545

Indeno(1,2,3-c,d) pireno 276,34 163,6 536

Dibenzo(a,h) antraceno 278,35 266,6 524

HPA Pressão de

Vapor a 25° C

Coeficiente de partição

octanol/água

Solubilidade em

água a 25° C

(µg/L)

Naftaleno 10,4 3,4 3,17 . 104

Acenaftileno 8,9 . 10-1 4,07 -

Acenafteno 2,9 . 10-1 3,92 3,93 . 103

Fluoreno 8,0 . 10-2 4,18 1,98 . 103

Antraceno 8,0 . 10-4 4,5 73

Fenantreno 1,6 . 10-2 4,6 1,29 . 103

Fluoranteno 1,2 . 10-3 5,22 260

Pireno 6,0 . 10-4 5,18 135

Benzo(a)antraceno 2,8 . 10-5 5,61 14

Criseno 8,4 . 10-5 5,91 2,0

Benzo(b)fluoranteno 6,7 . 10-5 6,12 1,2 (20º C)

Benzo(k)fluoranteno 1,3 . 10-7 6,84 0,76

Benzo(a)pireno 7,3 . 10-7 6,50 3,8

Benzo(g,h,i)perileno 1,4 . 10-8 7,10 0,26

Indeno(1,2,3-c,d) pireno 1,3 . 10-8 6,58 62

Dibenzo(a,h) antraceno 1,3 .10-8 6,50 0,5 (27º C)


A pressão de vapor também diminui com o aumento do peso molecular. Como reflexo

destes fatos, no ar, HPA de dois ou três anéis tendem a concentrar-se na fase gasosa do ar,

HPA com quatro anéis distribuem-se entre as fases do ar e HPA com cinco anéis ou mais se

concentram principalmente no material particulado atmosférico (COSTA, 2001).

Trindade et al. (2005) define intemperismo como o resultado de processos biológicos,

químicos e físicos que podem afetar o tipo de hidrocarbonetos que permanecem no solo. Estes

processos incrementam a absorção de contaminantes orgânicos hidrofóbicos na matriz do

solo, diminuindo a taxa e a extensão da biodegradação. Esses autores compararam a

biodegradação de hidrocarbonetos em solo recém contaminado com óleo e um solo

contaminado há quatro anos, usando bioaumento e técnicas de bioestimulação. Ambos os

solos apresentavam 5,4% de hidrocarbonetos totais de petróleo, e uma maior eficiência de

biodegradação foi alcançado para o solo contendo óleo intemperizado, devido à adaptação da

microbiota nativa ao contaminante.

A biodegradação de hidrocarbonetos em solos com contaminação antiga também foi

estudada por Chaillan et al. (2006). Os autores verificaram que o intemperismo do óleo cru

dificultou sua biodegradação, pois os compostos mais recalcitrantes ficam remanescentes e

sorvidos à matriz do solo.

3.5.5 Quantidade do contaminante

A concentração dos HPA no solo tem grande influência na sua degradação por estar

ligada à taxa de transferência de massa para os micro-organismos. Del’ Arco e de França

(2001) verificaram a influência da concentração de hidrocarbonetos no processo de

biodegradação, em sedimento arenoso, utilizando cultura mista de microrganismos associados

a microrganismos autóctones. O contaminante usado foi o óleo Árabe leve e as concentrações

foram 14 g/kg, 21g/kg e 28 g/kg. Após 28 dias de processo, observaram degradação da fração

pesada do óleo de 33,7%, 32,8% e 28,9%, respectivamente. Para o caso de hidrocarbonetos

lineares entre C14 a C26, a biodegradação foi de, respectivamente, 100%, 61,3% e 24,9%.

Assim, concluíram o efeito negativo da concentração dos contaminantes sobre a taxa de

biodegradação, sendo esse parâmetro muito importante para a condução de processos in-situ

ou ex-situ, visto que o tempo implica, necessariamente, em aumento de custos. Cabe destacar


que, de forma geral, o perfil de concentração de bactérias e de fungos não variou em função

da concentração inicial do contaminante.

Em um estudo publicado por Li Hui et al. (2007), os autores verificaram que a

concentração de contaminantes influencia reduzindo a diversidade da comunidade microbiana

em ambientes impactados com petróleo. Os autores observaram que altas concentrações de

compostos recalcitrantes promovem uma pressão seletiva na comunidade, corroborando as

observações de Del’Arco e De França (2001). Sendo assim, os processos de recuperação de

ambientes degradados por petróleo, derivados e resíduos oleosos, requerem estudos

específicos.

3.5.6. Tipo de solo

A maioria dos solos é composta principalmente por partículas pequenas, provenientes

das rochas expostas ao intemperismo, que são os silicatos minerais. Com o tempo, o

intemperismo dos silicatos minerais leva a reações químicas, e essas reações formam

substâncias importantes na composição do solo, que são os minerais e a argila. A matéria

orgânica, por sua vez, é o agente inicial da maioria das reações do intemperismo, e é esse

material que acarreta, na maioria dos casos, a cor escura aos solos. A matéria orgânica do solo

é constituída principalmente por um material chamado húmus, que deriva principalmente das

plantas (BAIRD, 2002).

Os sedimentos são camadas de partículas minerais e orgânicas. Em países de clima

tropical, com frequência são finamente granuladas e podem, também, estar em contato com a

parte inferior dos corpos hídricos, como lagos, rios e oceanos. Os sedimentos são de grande

importância ambiental, porque são o local onde se depositam muitos poluentes, especialmente

HPA, objetos do presente estudo. A transferência de poluentes orgânicos hidrofóbicos para os

organismos pode ocorrer por meio de transferência intermediária para água intersticial, que é

a água presente nos poros microscópicos existentes dentro do material que forma o sedimento

(JAQUES et al. 2007).

A natureza físico-química do solo e o tamanho das partículas têm grande influência na

percolação, sorção e consequentemente, na degradação dos poluentes. Frações de argila e silte

são mais suscetíveis à formação de complexos com HPA, que as frações de areia. Esse


fenômeno se deve à granulometria e também à presença de filossilicatos, que são capazes de

formar complexos com substâncias cíclicas de baixa massa molecular (PEREIRA Jr.;

GOMES e SORIANO, 2009).

O teor de matéria orgânica e o grau de saturação são fatores importantes para o

processo de migração e de biodegradação de petróleo e seus derivados no solo, pois parte dos

contaminantes se particiona, ou seja, os produtos orgânicos estão em uma situação de

equilíbrio entre a sorção pelas partículas sólidas do solo e a dissolução pela água intersticial

(BAIRD, 2002, PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).

A Figura 3.6 apresenta esquematicamente os principais horizontes do perfil de um

solo.

Figura 3.6 – Perfil de um solo mostrando os principais horizontes.

Fonte: http://images.google.com.br/images

De forma bastante sucinta e simplificada, considera-se que o solo é constituído por

horizontes (camadas de partes do solo). No horizonte O predominam restos orgânicos. O

horizonte A é o horizonte de acúmulo de matéria orgânica. O horizonte E é o horizonte onde

as argilas e outras partículas finas foram lixiviadas pelas águas das chuvas. Já o horizonte B é


o horizonte de acúmulo de materiais provenientes dos horizontes superiores, e são, em geral,

ricos em argilas. O horizonte C é o constituído por material não consolidado e R é o horizonte

da rocha consolidada (IBGE, 2007). Os horizontes,variam dependendo da classificação dos

solos, (EMBRAPA, 2011).

3.5.7. Presença de biossurfactantes

Biossurfactantes são moléculas anfipáticas produzidas por micro-organismos. Eles têm

uma vasta diversidade estrutural, e podem ser: glicolipídeos, e lipoproteínas, lipoproteínas

para ácidos graxos lipídeos neutros fosfolipídeos, biossurfactantes particulados e poliméricos.

Os biossurfactantes apresentam uma melhor compatibilidade ambiental pelo fato de terem

uma grande propriedade emulsificante, alta seletividade e biodegradabilidade em comparação

aos surfactantes químicos (DAS e MUKHERJEE, 2006).

Diversas pesquisas utilizam biossurfactantes para favorecer a biodisponibilidade de

compostos hidrofóbicos. Esses estudos investigam o uso de biossurfactantes e de surfactantes

sintéticos para melhorar a remoção dos hidrocarbonetos de difícil degradação, como os HPA

(ALEXANDER, 1999, BARDI et al. 2000, NITSCHKE e PASTORE, 2002, RAHMAN et al.

2003, MILLIOLI et al.2005; LEONARDI et al. 2007). Estudos recentes mostraram a

metabolização de certos HPA pelos micro-organismos ligada a uma posterior produção de

biossurfactantes (DAS; MUKHERJEE e SEM, 2008).

Existe na natureza uma variedade de micro-organismos capazes de produzir

biossurfactantes, tais como espécies do gênero Bacillus, (DAS; MUKHERJEE e SEM, 2008,

NIKIFOROVA; POSDUYAKOVA e TURKOVSKAYA, 2009, CALVO et al. 2009, BANAT

et al., 2010, CERQUEIRA et al. 2012).

Os biossurfactantes facilitam o processo de emulsificação de hidrocarbonetos na fase

aquosa pela formação de micelas, deste modo acentuando a disponibilidade para os

microrganismos e favorecendo o processo de biodegradação (MAHANTY; PAKSHIRAJAN

e DASU, 2006, CALVO et al. 2009).

Considerando a importância do estabelecimento de condições ótimas para a

degradação de HPA, Nikiforova; Posduyakova e Turkovskaya (2009) estudaram a

possibilidade da produção de agentes emulsificantes durante a degradação de HPA de três e


quatro anéis pelo fungo Pleurotus ostreatus D1, e observaram uma dependência da atividade

emulsificante com a solubilidade do HPA.

Todos os estudos mostram que os surfactantes estão intimamente relacionados à

biodisponibilidade dos contaminantes em solos e isso tem uma importância particular, porque

contribui para o desenvolvimento de tecnologias de biorremediação de sítios contaminados

por substâncias xenobióticas.

Morita et al. (2007) estudaram a conversão microbiana do glicerol em biossurfactantes

glicolipídicos por leveduras do gênero Pseudozyma. O biossurfactante estudado foi o

Manosiletrol lipídio (MEL), que pode ser um agente facilitador da biodegradação de

hidrocarbonetos.

3.6- Uso de Cossubstratos na biorremediação de solos impactados

A adição de cossubstratos na biorremediação de solos impactados com óleo, seus

derivados e resíduos oleosos, é uma estratégia que vem sendo estudada ao longo das últimas

décadas (ARP; YEAGER e HYMAN, 2001, MORONO; UNO e HORI, 2006). Por definição,

cossubstratos são moléculas que são metabolizadas pelos microrganismos na presença de

outro substrato. Em outras palavras, os cossubstratos são fontes de carbono não essenciais ao

microrganismo, mas são utilizadas como fonte de carbono, enquanto o substrato preferencial é

consumido.

Considerando suas estruturas químicas, as moléculas de HPA não figuram como

fontes preferenciais de carbono. Associado a isso, destaca-se o fato de que esta classe de

compostos apresenta baixa solubilidade em água, favorecendo a sorção nas partículas dos

solos, com conseqüente formação de agregados (GONG et al. 2007, JACKES et al. 2008).

Assim, dada à característica e complexidade dos HPA, o processo de biodegradação ocorre

através de co-metabolismo, isto é HPA de baixa massa molecular servem de cossubstratos

para HPA de alta massa molecular (JOHNSEN; WICK e HARMS, 2005, GONG et al. 2006,

ZHANG et al. 2006), ou quando se utiliza moléculas menos complexas como, por exemplo, o

glicerol, óleos vegetais e o biodiesel (B100) (MUDGE e PEREIRA, 1999, PANNU; SINNGH

e WARD, 2004, GONG, et al. 2006).


Os cossubstratos, de forma geral, favorecem processo de biodegradação pela sua

morfologia estrutural. Outro fenômeno a ser considerado é que a adição de cossubstratos

atuaria, também, na síntese de agentes emulsificantes e biossurfactantes, o que possibilita uma

maior biodisponibilidade dos HPA à célula (YUSTE et al. 2000, DAS e MUKHERJEE,

2007). A biodisponibilidade, por sua vez, é determinada pela taxa de transferência de massa

do substrato na célula microbiana relativa ao seu catabolismo intrínseco e excreção

(JOHNSEN; WICK E HARMS, 2005).

Segundo Taylor e Jones (2001), os cossubstratos podem também aumentar a superfície

de contato entre o microrganismo e composto recalcitrante, atuando sobre a viscosidade de

compostos pouco solúveis em água. Outra vantagem do uso de cossubstratos, é que a maioria

desses compostos é renovável e, portanto, ambientalmente aceitos.

A conversão de recursos renováveis em compostos utilizáveis, principalmente bio-

materiais, tem sido vista com muita atenção do ponto de vista ambiental. Esses recursos

disponíveis são óleos, amido, açúcar, celulose e lignocelulose de plantas, além de uma

variedade de rejeitos orgânicos da agricultura e indústria (MORITA et al. 2007).

Entre esses recursos renováveis destaca-se o glicerol, que tem sido obtido, em grande

quantidade, na produção de biodiesel (HUANG; CHENG e GEORGE, 2002).

ZHANG et al. (2005) estudaram a biodegradação de óleo cru Chinês, em meio líquido

por linhagem de Pseudomonas aeruginosa. Glicerol foi usado como cossubstrato ao processo

de biodegradação do óleo. Os testes foram executados em escala de bancada e demonstraram

que a presença do cossubstrato promoveu aumento da biodegradação do óleo de,

aproximadamente, 20 para 80%. Esse incremento expressivo da biodegradação foi explicado

pelos autores pela produção de raminolipídios, facilitando a transferência de massa e,

consequentemente, biodegradação. De fato, os gráficos apresentados no referido estudo

apresentam incremento da produção de tensoativos nos testes realizados na presença do

glicerol, e a literatura demonstra que linhagens de Pseudomonas aeruginosa produzem

biossurfactantes a partir de glicerol (SANT’ANNA et al. 2002, RAJINI et al. 2009).

Evidências experimentais mostram que surfactantes e glicerol diminuem a constante

dielétrica do meio, o que acentua a as interações eletrostáticas em solução e, em

consequência, estimulam a biodegradação de óleo cru (ZHANG et al. 2005, D’ERRICO;

CICCARELLI e ORTONA, 2005).


Biodiesel é outro cossubstrato que vem sendo estudado para biorremediação de

ambientes impactados por petróleo e derivados. O biodiesel é um combustível limpo com

muitas vantagens ambientais. Algumas das vantagens mais importantes são a sua

degradabilidade e a capacidade de dissolver ou emulsificar óleo cru e seus derivados

(MUDGE e PEREIRA, 1999).

Taylor e Jones (2001) realizaram experimentos de biorremediação adicionando

biodiesel a um solo contaminado com piche, em experimentos de laboratório e de campo.

Nesses experimentos, os autores observaram um aumento na degradação de óleo no solo, que

passou de 52% para 85%. O êxito do processo foi relacionado com o poder emulsificante do

biodiesel e sua ação como cossubstrato.

Pasqualino, Montané e Salvadó (2006) observaram que existiu um efeito sinérgico que

aumentou a biodegradabilidade de combustíveis fósseis na presença de biodiesel, pelo efeito

do co-metabolismo.

Fernándes-Álvarez et al. (2007) avaliaram a eficiência do biodiesel como agente de

biorremediação para tratamento on shore após derrame de óleo pesado. Verificaram que a

adição de biodiesel em 50g/kg de solo melhorou a aparência do solo, reduzindo a tonalidade

escura, e acelerou a degradação das frações alifáticas e aromáticas do óleo residual. Os

autores observaram a eficiência de remoção de HPA da ordem de 80 a 85% em um período de

60 dias.

Óleos vegetais também vêm sendo estudados como cossubstratos na biorremediação

de solos contaminados por petróleo e derivados. Pannu, Singh e Ward (2004) estudaram a

aplicação de óleo de amendoim entre 2,5 a 20% na extração de HPA em solo, obtendo

eficiências de remoção maiores que 90% na remoção de antraceno do solo.

Gong et al. (2006) estudaram a remoção de HPA em diferentes concentrações, 4.721 e

724 mg/kg em uma refinaria, utilizando óleo de girassol, a experimentos em colunas em testes

de laboratório. Após a remoção, 4 a 5% do óleo permaneceu no solo, mas o conteúdo de

carbono orgânico retornou aos níveis originais após 180 dias de incubação. Esses resultados

indicaram para os autores que o óleo de girassol tem uma grande capacidade de remover HPA

de solos contaminados, e que a solubilização com o mesmo pode ser uma alternativa para a

remediação de solos contaminados com HPA.


Baseado em comprovações de que óleos vegetais podem ser usados como um extrator

efetivo na remoção de compostos orgânicos de solos contaminados com petróleo e derivados,

esses materiais podem ser potenciais para biorremediação de solos impactados (BRAGATO e

El SEOUD, 2003, PANNU; SINGH e WARD, 2004).

Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 66

CAPÍTULO 4 - MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 – Solo

4.1.1- Amostragem

O solo utilizado no estudo foi proveniente de uma área de landfarming de indústria de

petróleo e gás, localizada no norte do país.

A Figura 4.1 mostra o perfil do landfarming onde são depositados os resíduos de

processamento de refinaria de petróleo. O landfarming foi construído obedecendo aos

procedimentos descritos na norma ABNT NBR 13894 (1997) e opera em local coberto e

impermeabilizado, com dimensões externas de 50 x 100 m, com sistema de aspersão de água

para controle do teor de umidade.

Figura 4.1: Foto ilustrando o landfarming, local de origem das amostras de solo

As amostras de solo do landfarming foram recolhidas obedecendo aos

procedimentos descritos na norma ABNT NBR 10007 (2004). Em todos os casos foram

tomadas cinco sub-amostras de cada célula de dimensões 12,5 x 16,67 m. O solo foi


submetido a revolvimento manual com auxilio de enxada e a área superficial de cada célula

foi dividida em uma rede quadriculadas imaginárias e de cada quadrícula, retirou-se amostras

de maneira que as variações do perfil fossem representadas. As amostras foram coletadas a

uma profundidade de 15-20 cm, de três células do landfarming, totalizando 75 kg de amostra

de cada célula, que foram acondicionados em sacos plásticos e depositados em caixas de

isopor, sendo em seguida encaminhados para o laboratório, para a montagem do experimento.

No momento da coleta uma parte da amostragem do solo foi separada, e encaminha para a

realização das análises físico-químicas e bacteriológicas. As amostras para as análises

bacteriológicas foram acondicionadas e mantidas a 4°C em isopor com gelo e transportadas

ao laboratório. O desenho representativo das células do landfarming está apresentado no

Quadro 4.1.

Quadro – 4.1- Representação da divisão do landfarming em células

A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

U X Y Z

4.2- Ensaios físicos e físico-químicos

4.2.1 – Umidade

Os ensaios de umidade foram realizados em duplicata. Amostras, de aproximadamente

2,0 gramas de solo, tomadas no decorrer dos experimentos, foram transferidas para placas de


Petri e levadas ao analisador de umidade por infravermelho IV-2000, GEHAKA, até massa

final constante (APHA, 1992).

4.2.2 - Capacidade de retenção de água (CRA)

Os ensaios de capacidade de retenção de água foram realizados em triplicata segundo

metodologia descrita por WATWOOD, et al. (1991), para tanto se transferiu uma quantidade

(aproximadamente 10 g) de solo para papel de filtro qualitativo tipo Watman, acoplado a um

funil de vidro de aproximadamente 5 cm de diâmetro e 5 cm de profundidade. Compactou-se

o solo sobre o papel e transferiu-se o conjunto para um becker com capacidade de 500 ml, ao

qual foi adicionada água, ao becker até um nível pouco acima do nível do papel de filtro.

Após o umedecimento da amostra, adicionou-se mais água ao becker, de forma que se

atingisse o nível próximo do topo do funil, pouco acima do nível do papel de filtro. Deixou-se

em repouso por 30 minutos. Após o período de repouso, retirou-se o funil do becker e

deixou-se escoar a água por mais meia hora. Transferiu-se o papel de filtro com solo a um

becker com 50 ml de capacidade, previamente tarado, e procedeu-se a pesagem em balança

analítica. Transferiu-se o conjunto para uma estufa a 105 ± 1ºC, por um período de vinte e

quatro horas. Em seguida, o material foi levado para um dessecador, contendo sílica gel

ativada, até alcançar a temperatura ambiente. Pesou-se o conjunto, e determinou-se o

conteúdo de umidade (capacidade de retenção de água pelo solo), pela relação da perda de

massa com a massa final da amostra, multiplicando-se por 100 para obter-se o resultado em

percentagem.

3

100)21(

m

mmCRA

Onde: CRA – Capacidade de Retenção de Água; m1 – massa inicial, em gramas; m2 –

massa final seca, em gramas e m3 – massa inicial úmida, em gramas. O ensaio foi conduzido

em triplicata e as pesagens realizadas em balança analítica (TDSFA2104N).

4.2.3 – Granulometria


A distribuição granulométrica do solo foi executada no Laboratório Prof. Jaques

Medina, Área de Geotecnia da Universidade Federal do Rio de Janeiro. O ensaio foi

executado seguindo-se a ABNT NBR 7180 (1984), que corresponde à homogeneização da

amostra, secagem ao ar, passagem por uma série de peneiras e, por fim, sedimentação em

solução de orto-polifosfato de sódio.

4.2.4 - pH

Os valores de pH dos solos foram determinados em água de acordo com as

recomendações da Embrapa (1979). Acompanhou-se o pH durante o período de 60 dias, para

cada experimento. A um becker com capacidade para 50 ml, foram transferidos 10 g de solo

pesados em balança semi-analítica (ADA, 210/L). Com auxílio de uma proveta de capacidade

para 50 ml, transferiu-se 25 ml de água destilada ao becker. A mistura foi levada à placa de

agitação para homogeneização, com o auxílio de barra magnética revestida com Teflon, por

um período 30 minutos. Após esse tempo de agitação, a mistura foi deixada em repouso, para

separação das fases. O sobrenadante foi transferido para outro becker e levado ao

potenciômetro (Digimed, Mod. DM-20), para as medições de pH. Os ensaios foram realizados

em triplicata.

4.2.5. Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (HTP)

Os ensaios foram realizados empregando-se o método USEPA 8015, que determina

compostos orgânicos não halogenados, através de cromatografia gasosa acoplada a detector

de ionização de chama. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (HP 5990) e coluna DB-5 (30 m x

0,25 mm). A pré-concentração das amostras foi realizada em atmosfera de gás inerte, N2.

Os extratos orgânicos foram obtidos seguindo o método USEPA 3540C (Soxhlet

extraction) empregando o diclorometano seco com solvente e a preparação prévia à

cromatografia seguiu o método USEPA 3630C (Silica gel cleanup).

Os valores de HTP total consideram os resultados de HTP nas faixas de gasolina,

querozene, diesel e óleo combustível, assim como a fração não resolvida no cromatograma.


Os ensaios foram realizados no laboratório Analytical Technology, na cidade de São

Paulo.

4.2.6. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA)

Foram determinados os teores dos dezesseis HPA prioritários listados pela USEPA

(Environmental Protection Agency): benzo(a)pireno (BaP); benzo(b)fluoranteno (BbF);

benzo(k)fluoranteno (BkF); criseno (CHR); acenaftileno (ACL); fluoreno (Fl), antraceno (A);

benzo(g,h,i)perileno (BghiPRL); fenantreno (FEN); dibenzo(a,h)antraceno (DahA);

indeno(1,2,3,c-d)pireno (I123cdP); pireno (PYR); acenafteno (AC); fluoranteno (FLU);

naftaleno (N) e benzo(a)antraceno (BaA). A metodologia empregada foi USEPA 8270D, que

determina compostos orgânicos semi-voláteis por cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massa. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (HP 5880), coluna DB-5 (30 m x

0,25 mm) e um espectrômetro de massa (EM 5987). Antes da injeção, os extratos foram obtidos

seguindo o método USEPA 3540C (Soxhlet extraction) empregando o diclorometano seco com

solvente. A pré-concentração das amostras foi realizada em atmosfera inerte, N2. A preparação

dos extratos (clean-up) anterior à cromatografia seguiu o método USEPA 3630C, com uso de

cartuchos descartáveis de sílica gel. Os ensaios foram realizados no laboratório Analytical

Technology, na cidade de São Paulo.

4.2.7 – Carbono Orgânico Total, Nitrogênio total e fósforo total.

Nas quantificações de Carbono Orgânico Total foi utilizado o método USEPA 9060,

fundamentado na oxidação da matéria orgânica pelo dicromato de potássio, em meio ácido.

As quantificações de Fósforo Total foram executadas por espectrofotometria, de acordo com o

método USEPA 365.3, complexação com ácido ascórbico. As quantificações de Nitrogênio

Total também foram executadas por meio de técnica espectrofotométrica, de acordo com o

método USEPA 351.2, Kjeldahl. Os ensaios foram realizados no laboratório Analytical

Technology, cidade de São Paulo.

4.2.8 – SARA – Saturados, Aromáticos, Resinas e Asfaltenos.


A determinação de SARA foi realisada com base no descrito por Shama et. al. (1998).

O analisador TLC-FID da marca Iatroscan, modelo MK7, foi utilizado para a separação e

quantificação dos picos com as seguintes condições de análise: Fluxo de gases: 160 ml/min de

Hidrogênio, 2L/min de ar sintético. Para o preparo da amostra pesou-se: cerca 0,1g de

amostra, seguido da eluição de 10mL em clorofórmio UV-HPLC, injeção de 1µL. As frações

de hidrocarbonetos saturados, aromáticos (polares, e asfaltenos) foram separadas através do

procedimento padrão ASTM (Drews,1989) utilizando cromatografia em coluna e estas frações

foram utilizadas para identificação e quantificação por toda parte. Para a percolagem

(separação dos componentes para leitura) utilizou-se n-Hexano UV-HPLC (percolagem de

100cm); tolueno UV-HPLC (percolagem de 50cm) e uma solução 95% diclorometano UV-

HPLC e 5% metanol UV-HPLC, (percolagem de 20cm).

4.3– Quantificações microbianas

As quantificações de bactérias heterotróficas totais e fungos totais nas amostras de

solo, foram conduzidas utilizando a técnica “Pour Plate”, seguindo o exposto no método de

referência (GENHARTDT et al. 1994).

Para o caso de fungos filamentosos, 10 g das amostras de solo foram homogeneizadas

em 90 mL de solução salina (NaCl 0,9%). Homogeneizou-se em shaker por 15 minutos e,

com auxílio de pipeta graduada de 1 mL, tomou-se alíquota de 1 mL que foi submetida ao

procedimento de diluição sucessiva até a décima diluição. Alíquotas de 1mL foram

transferidas para placas de Petri e acrescidas de meio Agar Sabouraud 2% de glicose (Vetec,

Rio de Janeiro, Brasil), suplementado com ampicilina 50 mg/L (CIMED, Pouso Alegre,

Brasil). As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 30 ± 1º C por 120 horas. Após

esse período, as colônias foram quantificadas e os resultados expressos em UFC por grama de

solo seco.

As bactérias heterotróficas totais foram quantificadas a partir de solos de

aproximadamente 10 g, ressuspendeu-se o solo em 90 mL de solução salina (NaCl 0,9%).

Homogeneizou-se e, com o auxílio de pipeta graduada de 1 mL, tomou-se alíquota de 1 mL,

que foi submetida ao procedimento de diluições sucessivas até a décima diluição. Alíquotas

de 1 mL foram transferidas para placas de Petri e acrescidas de meio Agar Nutriente (Merck,

Darmstadt, Alemanha) suplementado-se com nistatina, 50 mg/L (Teuto, Anápolis, Brasil). As


placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 30 ± 1º C por 48 horas. Após esse período,

as colônias foram quantificadas e os resultados expressos em UFC por grama de solo seco.

4.4 – Etapas Experimentais

4.4.1 - Influência da concentração inicial do contaminante na biorremediação

Para estudar a biorremediação dos solos contaminados foram montados testes em

escala de laboratório, usando-se reatores de polietileno nas dimensões de 20 cm de

comprimento, 20 cm de largura e 10 cm de altura, conforme indicado na Figura 4.2.

Cada reator foi preenchido com 2 kg de solo contaminado, coletado de solo de

landfarming de acordo com a norma NBR-10.007 da ABNT. Procurou-se manter as mesmas

condições de umidade em todos os reatores, na faixa de 70-80% da capacidade de retenção de

água, o que correspondeu à manutenção de valores de umidade na faixa de 20% a 35%.

O pH inicial do solo de aproximadamente 7,0 ± 0,2 não foi corrigido no decorrer dos

experimentos, apenas monitorado. Todos os reatores foram tampados, para minimizar as

contaminações por poeira e a perda de umidade.

Figura 4.2: Os reatores usados em escala de bancada


O monitoramento e estabelecimento da cinética do bioprocesso foram realizados

contemplando medidas da concentração de bactérias heterotróficas totais, fungos totais, HPA

e HTP, teor de umidade e temperatura do ambiente.

As amostras de solo apresentaram valores de concentração inicial de HTP de 15,3,

19,0 e 29,2 g/kg. Em todos os experimentos foram realizadas medições do pH do solo em

água, da temperatura ambiente e da umidade ao longo dos 60 dias do processo.

Os valores das médias da biodegradação do HTP nos solos contaminados foram

submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de comparação múltipla de médias de

Tukey, a 5% de significância. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do

programa Statistica 5.0 (Statsoft Inc).

4.4.2- Efeito do tipo e concentração inicial de cossubstratos na biorremediação

Primeiramente foram realizados testes com solos contaminados com resíduos oleosos,

cuja concentração de hidrocarbonetos inicial foi de 29,2 g/kg, quanto à presença de dois

cossubstratos: óleo de soja e o glicerol comercial.

O óleo de soja utilizado nos experimentos foi o óleo de soja comercial, da marca Liza.

O glicerol, por sua vez, da marca Vetec.

Para cada cossubstrato, foi estudada a suplementação dos solos, no tempo zero, em

concentrações de 375, 750 e 1500 mg/kg. Essas concentrações foram escolhidas baseado

inicialmente no trabalho de Zhang et al. (2005) que trabalharam em meio líquido, com

concentração de glicerol igual a 1g/L.

Foram implementadas a mesma cinética e estratégia de monitoramento apresentada no

item anterior, e mantidas as demais condições operacionais de umidade e pH iniciais do solo.

Os testes foram monitorados seguindo a mesma sistemática já apresentada.

4.4.3 - Efeito do uso de glicerol bruto na biorremediação


Em seguida, foram realizados testes com solos contaminados com resíduos oleosos,

cuja concentração de hidrocarbonetos inicial foi de 60 g/kg, quanto à presença de dois

cossubstratos: glicerol comercial e o glicerol bruto.

O glicerol bruto utilizado foi gentilmente cedido pela Unidade Experimental de

Produção de Biodiesel da UFRJ. Este material é um resíduo da produção de biodiesel a partir

de óleo de soja.

Para este cossubstrato, foi estuda a suplementação dos solos, no tempo zero, em

concentração de 750 mg/kg, porque nesta concentração de cossustrato obtiveram-se os

maiores percentuais de remoção de HTP.

Foi implementada a mesma cinética e estratégia de monitoramento apresentadas no

item anterior e mantidas as demais condições operacionais de umidade e pH inicial do solo.

Os testes foram monitorados seguindo a mesma sistemática já apresentada nos itens

4.2 e 4.3.

4.5 - Fitotoxicidade dos solos remediados

Para a realização dos ensaios de fitotoxicidade, foram escolhidas sementes de

Abelmoschus esculentus (quiabo), Cucumis sativus (pepino) e Rudbeckia hirta (margarida

amarela). As sementes foram lavadas com água destilada por três vezes, com o objetivo de

diminuir a interferência dos conservantes. Durante a lavagem, as sementes com morfologia

irregular foram descartadas. Em seguida as sementes de bom aspecto foram colocadas sobre

papel-filtro para secagem ao ar, por uma hora, à temperatura ambiente.

Dez gramas de solo foram transferidos para um frasco cônico com capacidade para

250 mL contendo 90 mL de água destilada. Após agitação de 250 rpm por 10 minutos (Tecnal

TE920), a suspensão foi filtrada.

As placas de Petri foram forradas com papel-filtro Whatman comum disposto dentro

da placa. O papel foi recortado e colocado no interior de cada placa de Petri. Em seguida, um

volume de 5 mL do filtrado de cada solo foi transferido para as placas de Petri. Dez sementes


de cada tipo em estudo foram distribuídas sobre a superfície do papel umedecido com o

filtrado em cada placa de Petri.

O controle foi realizado com água destilada, substituindo o extrato de solo. As placas

foram incubadas em estufa da marca e modelo Nova Ética, 411D, com temperatura controlada

a 22 ±1°C, em ausência de luz, por 5 dias e, após este período, as sementes germinadas foram

contadas e o tamanho das raízes medidos com o auxílio de uma régua.

Os resultados dos níveis de toxicidade foram obtidos a partir dos cálculos do Índice de

Germinação Relativa das Sementes (GRS), da Elongação Relativa da Raiz (ERR) e do índice

de germinação (IG), conforme descrito por Vasconcelos (2011).

4.6 - Identificação de bactérias e fungos filamentosos

A identificação biomolecular dos isolados bacterianos foi realizada de acordo com o

protocolo seguido pelo Laboratório de Fisiologia Bacteriana – LFB da FIOCRUZ (estirpe

TCB-3), e de Genética Microbiana do Instituto de Microbiologia da UFRJ (estirpes TCB-1 e

TCB-4). A identificação dos isolados fúngicos foi realizada de acordo com o protocolo

descrito pelo Laboratório de Taxonomia, Bioquímica e Bioprospecção de fungos –

IOC/Fiocruz. Após a identificação, as cepas foram depositadas na coleção de culturas de

fungos filamentosos do IOC/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil.

Identificação de bactérias: para as estirpes TCB-1, TCB-2 e TCB-4: as sequências de

parte do gene que codifica o 16S rRNA foram analisadas pelo NCBI BLAST-N (primeiro hit

ou a sequência mais próxima de uma bactéria cultivada). O gene de codificação de rRNA 16S

a partir da estirpe foi amplificado por PCR utilizando iniciadores universais a 518F

(CCAGCAGCCGCGGTAATACG) x1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) e

27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) x 800R (TACCAGGGTATCTAATCC) usando

MACROGEN instalações (Coreia). A sequência de rRNA 16S obtido foi comparada ao banco

de dados GenBank utilizando a possibilidade de BLAST-N (www.ncbi.nlm.nih.gov/

explosão). As sequências de estirpes foram comparadas estreitamente com a sequência obtida

neste estudo utilizando o software CLUSTAL-X (Thompson et al. 1997). A árvore

filogenética foi construída com base nas seqüências de rRNA 16S por método de vizinhos

(NJ) de acordo com o descrito em Saitou e Nei (1987), utilizando software 5 MEGA (Tamura


et al., 2011). Para a estirpe TCB-3, a identificação foi conduzida de acordo com as

considerações citomorfológicas, bioquímicas e fisiológicas e a utilização do sistema API 50

CHB (BioMériex®). O isolado TCB nº3 foi analisado através do Multiplex-PCR.

Identificação dos fungos filamentosos: Os ensaios de isolamento das colônias foram

realizados em meio Ágar Sabouraud 2% de glicose, adicionado de 50mg/L de ampicilina

(CIMED, Pouso Alegre, Brasil), para inibir o crescimento bacteriano. Os tubos com as

colônias de fungos isolados foram enviados para o Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de

Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos, Coleção de Culturas de Fungos

Filamentosos, para a identificação taxonômica macroscópica e microscópica. A classificação

foi realizada de acordo com as técnicas clássicas micológicas, descritos na literatura

específica, para cada taxon. A identificação macroscópica das espécies fúngicas foi realizada

por análise das características macroscópicas relacionados com cada estirpe: textura da

colônia, a cor da frente e de lado reverso, a produção de pigmento, o tamanho da colônia, o

tempo de crescimento, a produção de exsudado ou não. Todas as características foram

registradas e avaliadas por serem potencialmente importantes para a classificação da linhagem

de fungos. Exame direto dos fragmentos miceliais foi observado em microscópio ótico, em

lâminas contendo o corante Lactofenol de Amann com Azul de Algodão. Após a observação

das características miceliais, cada colônia foi semeada em meios específicos. As colônias

foram incubadas à temperatura ambiente e observadas a cada 24 horas por um período de 5 a

7 dias. A identificação microscópica foi cuidadosamente examinada por preparação feita com

meios específicos, pela técnica de microcultivo segundo Rivalier e Seydel (1932). Após o

crescimento, os fungos foram identificados segundo literatura específica para cada gênero e

espécie (GOMES et al. 2010, RAPER e FENNEL, 1965, HAWKSWORTH et al. 1995).

Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 77

CAPÍTULO 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1- Caracterização do solo

Os parâmetros físicos, químicos e biológicos do solo estão apresentados na Tabela 5.1.

Tabela 5.1: Resultados da caracterização física e química do solo

Parâmetro Resultado

pH (em H2O) 6,9 ± 0,2

Argila (%) 13 ± 1

Silte (%) 25 ± 2

Areia Fina (%) 18 ± 1

Areia Média (%) 28 ± 2

Areia Grossa (%) 12 ± 1

Capacidade de Retenção de Água - CRA (%) 32 ± 1

P Total (mg P/kg de solo) 16 ± 1

N Total (mg N/kg de solo) 680 ± 50

Carbono Orgânico Total - TOC (%) 6 ± 1

O perfil da curva granulométrica, Figura 5.1, mostra uma amostra de solo, constituída

predominantemente por materiais grossos (areias e cascalho), porém apresentando também

partículas de materiais finos (argila e silte), em valores de 38%. Considerando que as argilas e

siltes apresentam elevada área superficial, os fenômenos de sorção dos contaminantes nesses

materiais são bastante favorecidos. O fato das moléculas dos contaminantes poderem estar

sorvidas na matriz do solo dificulta o processo de solubilização dessas moléculas e, por

conseguinte, a biodegradação. Por outro lado, o solo apresenta um grande percentual de

materiais arenosos, 58%, devido à porosidade que pode favorecer a transferência de massa

entre o ar atmosférico e o solo, (MARÍN et al. 2005; TRINDADE et al. 2005).

O solo apresentou pH neutro em água, considerado adequado para a atividade de

degradacão de hidrocarbonetos por bactérias e fungos (Franco et al. 2004). Em geral, solos

tropicais apresentam pH na faixa levemente ácida a neutra, devido à presença de minerais


intemperizados 1:1, por exemplo, caulinita e outros filossilicatos além dos óxidos de ferro e

de alumínio.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

Diâmetro dos Grãos (mm)

Pa

ss

a (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Reti

da (

%)

PEDREGULHOAREIAARGI LA SILTE

GROSSOMÉDIOFINO GROSSAMÉDIAFINAABNT

PENEIRAS: 200 100 60 40 2030 10 8 4 3/8 3/4 1 1 1/2

AMOSTRA 1

Figura 5.1: Curva granulométrica de uma das amostras de solo

A capacidade de retenção de água, CRA, de aproximadamente 30%, é compatível com

solos com presença de materiais finos, ou seja, argila e silte, capazes de reter água, devido à

alta superfície específica.

A salinidade do solo, ou seja, a determinação do teor de cloreto de sódio, não foi

investigada devido ao fato de ser um solo oriundo da região amazônica e não de região

marinha ou lacunar. No entanto, destaca-se que as concentrações de metais alcalinos e

alcalinos terrosos trocáveis analisados, Tabela 5.2, foram baixas, compatíveis com solos não

salinos e intemperizados e corroboram os resultados das análises granulométricas.

Minerais tipo 1:1 são comuns em solos tropicais devido ao intemperismo, e

caracterizam-se por possuir uma unidade cristalográfica contendo uma camada de tetraedros

de silício e oxigênio e uma camada de octaedros de alumínio (ou magnésio) e hidroxilas.

Como há pouca substituição do átomo central, tanto nos tetraedros quanto nos octaedros, há

pouco desbalanço de cargas, gerando poucas cargas negativas ou, tecnicamente, pequena

capacidade de troca catiônica (CTC), o que significa que os solos em que predominam os


minerais de argila do grupo das caulinitas têm pouca capacidade de reter elementos químicos,

daí a baixa fertilidade de solos tropicais muito intemperizados, como os latossolos do Cerrado

e da Amazônia Brasileira. Os óxidos de ferro e alumínio, à semelhança dos argilominerais

1:1, têm baixa CTC e contribuem pouquíssimo na retenção de nutrientes no solo, justificando,

assim, os resultados obtidos.

Tabela. 5.2: Capacidade de troca catiônica do solo de landfarming

Parâmetro Resultado

(cmolc/kg)

Ca2+

6,5

Mg2+

0,2

Na+ 11,7

K+ 0,97

Valor S 19,31

Al3+

0

H+ 6,3

Valor T 25,6

Pode-se inferir que a maior parte da matéria orgânica do solo está relacionada com a

presença de hidrocarbonetos de petróleo, uma vez que a etapa de clean up em sílica gel foi

executada previamente à determinação do TPH, que será apresentado na seção seguinte.

5.2- Caracterização do contaminante

Trata-se de resíduos oleosos do refino de petróleo, de consistência semi-sólida e

coloração negra, impregnado ao solo, conferindo cor e brilho.

Analisando o perfil cromatogratográfico do extrato de HTP de uma das amostras dos

solos estudados, Figura 5.2, observa-se que foram detectados compostos orgânicos como uma

mistura complexa não resolvida (MCNR) e nenhum hidrocarboneto linear, pristano e fitano

foram detectados. A MCNR apresentou-se com compostos orgânicos na faixa da gasolina

(TPH GRO) 5%, do diesel (TPH DRO) 5%, e do lubrificante (TPH ORO) 90%. A ausência de

pristano e de fitano, a concentração do TPH GRO e do TPH DRO e a elevação da linha de


base indicam o processo de intemperização dos resíduos oleosos, incrementando a

recalcitrância e, consequentemente, a dificuldade para o biotratamento.

O intemperismo se refere ao resultado de processos químicos, biológicos e físicos

sobre o resíduo, que podem afetar o tipo dos compostos que permanecem em solo. Somada

aos fatores descritos, destaca-se a elevada concentração de HTP, que dificulta ainda mais a

biorremediação (Del’Arco e De França, 2001).

A composição dos óleos e resíduos oleosos é um dos fatores que determinam a

eficácia de um processo de biotratamento. Óleos crus e resíduos oleosos podem ter suas

composições descritas de acordo com vários critérios e considerando vários métodos

analíticos. Dentre estes critérios, o mais usado é a polaridade.


Figure 5.2: Cromatograma do extrato orgânico do solo contaminado antes da biorremediação

em laboratório, HTP = 29,2 g/kg

Análise de SARA, saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos, divide os componentes

do óleo cru e resíduos oleosos de acordo com a sua polaridade, usando técnicas analíticas,

como, por exemplo, com base na força da gravidade: cromatográfia em coluna e

cromatografia em camada fina (TLC); e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

2.5

5

.0

7.5

1

0.0

12

.5

15.0

17

.5

Min

ute

s

TP

H-G

RO

TP

H-K

RO

-

TP

H-D

RO

-

TP

H-O

RO

0

20

00

60

00

40

00

mV

olts

Tem

po

(m

in)

Corrente (mV)


Os resultados das análises de SARA estão apresentados na Tabela 5.3. Juntamente

com a Figura 5.3, fica demonstrado que se trata de um solo contaminado com resíduo oleoso

pesado, com significante presença de compostos recalcitrantes, como as resinas e os

asfaltenos.

Tabela. 5.3: Caracterização por polaridade do resíduo oleoso contido no solo

Fração (%)

S - Saturados 6 1

A - Aromáticos 22 3

R - Resinas 52 3

A - Asfaltenos 20 2

A análise dos resultados de SARA, sobretudo aqueles realizados via cromatografia em

camada delgada acoplada à detector de ionização de chama (TLC-FID), considera resultados

em porcentagens, pois os compostos saturados e aromáticos podem ser subestimados, por se

tratar de uma fração com materiais voláteis, sobretudo quando comparados às resinas e

asfaltenos, que podem ser perdidas na análise TLC. Destaca-se que, nos nossos testes, o

tempo de eluição foi minimizado ao máximo, objetivando evitar a volatilização de frações

leves da amostra. Considerando, ainda, se tratar de um solo de landfarming, exposto ao

processo de aeração continuada, infere-se que os resultados refletem a integridade da amostra,

demonstram a dificuldade de biodegradação, além de corroborar o perfil cromatográfico, onde

se verifica o intemperismo.


0,1 0,2 0,3 0,4

Tempo (min)

0,6

0,5

0,4

0,3

Co

rren

te (

mV

)

Figura 5.3: Perfil cromatográfico do resíduo oleoso que contaminou os solos, em coluna

delgada, usando TLC-FID para análise SARA

É importante destacar que, a fração de compostos saturados consiste de material não

polar, incluindo hidrocarbonetos lineares, ramificados, e hidrocarbonetos cíclicos saturados. A

fração aromática inclui compostos aromáticos, constituídos de um ou mais anéis aromáticos e,

portanto, mais polar que a fração saturada. As duas frações restantes, resinas e asfaltenos, têm

substituintes polares, se distinguindo a miscibilidade em solventes orgânicos, os asfaltenos

são insolúveis em um excesso de heptano ou pentano, ao passo que as resinas são miscíveis

nestes hidrocarbonetos. Assim, comparando a Tabela 5.3 e Figura 5.2, pode-se verificar que a

maior parte dos hidrocarbonetos saturados restantes está na faixa do óleo lubrificante,

reiterando os desafios da biorremediação proposta.

Com alto teor de hidrocarbonetos, o solo apresenta, ainda, elevada quantidade

de carbono orgânico, cerca de 6%, o que indica a presença de outras classes de compostos

orgânicos no solo, que pode ser material húmico, material fúlvico, ou compostos oriundos da

biodegradação dos hidrocarbonetos (OLIVEIRA e de FRANÇA, 2005). O teor de HPA no

solo é muito menor que o de TPH, corroborando com as informações do local de origem, e

análises de SARA.

5.3 - Efeito da concentração inicial do resíduo na Biorremediação

A operação de landfarming e outras tecnologias de biotratamento de solos impactados

com resíduos oleosos, deve considerar a concentração inicial do contaminante, que é

S A

R

A


reconhecida como um dos fatores limitantes para bioprocessos (LIU et al. 2011,

BOOPATHY, 2000). Assim, para se estudar a influência da concentração inicial de

hidrocarbonetos na biorremediação do solo, foram realizados testes com amostras de solos

com valores iniciais de hidrocarbonetos totais de petróleo de 15,3, 19,0 e 29,2 g/kg de solo. É

importante enfatizar que, unidades de biotratamento de resíduos oleosos, almejam tratar as

maiores concentrações de resíduos, no menor tempo, para melhoria dos custos globais do

processo, justificando esta etapa da Tese.

Independente da concentração inicial do contaminante, em todos os ensaios de

biorremediação o pH inicial do solo foi de aproximadamente 6,9 ± 0,1, decaindo ligeiramente

ao longo dos 60 dias e atingindo valores de 6,0. O metabolismo de frações leves e pesadas de

petróleo produzem diversos tipos de ácidos orgânicos que podem reduzir o pH do solo, fato

que dá evidências de uma microbiota metabolicamente ativa (WATSON et al. 2002). A

manutenção do pH pode estar relacionada à neutralização dos intermediários ácidos pelas

espécies alcalinas do solo, detectadas nas análises químicas.

Destaca-se ainda que a umidade dos solos foi monitorada e corrigida para 70 a 80% da

capacidade de retenção de água; faixa considerada ideal para os processos de biodegradação,

de acordo com RAMÍREZ et al. (2009), objetivando a melhoria da dispersão de oxigênio,

oriundo do ar atmosférico, no solo. Esses valores foram monitorados e corrigidos durante

todo o processo.

A evolução da biodegradação dos HTP do solo diminuiu com o aumento dos

níveis de contaminante, conforme visualização da Figura 5.4 a e b. Em 30 dias de processo, a

degradação em todos os biorreatores contendo 15,3 ou 19,0 g/kg de solo, alcançou o mesmo

nível, aproximadamente 55%, indicando que já existiam no solo, micro-organismos

degradadores de hidrocarbonetos. Neste mesmo período, a biodegradação dos contaminantes

foi 10% menor, quando se operou com o nível de contaminação de 29 g/kg de solo, que

alcançou 55% de remoção somente foi alcançada em 60 dias de processo. Esta menor

atividade microbiana está provavelmente relacionada com a suscetibilidade de algumas

espécies ao contaminante.


40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

30 60

Tempo (dias)

Bio

de

gra

daçã

o (

%)

(%)

HTP inicial 15,3 g/kg



0

5000

10000

15000

20000

30 60

Tempo (dias)

HT

P (

mg

/kg

)

(mg

/kg

)

LI

(a)

(b)


Figura 5.4: Porcentagem de biodegradação de HTP (a) e Concentração de HTP (b), em 30 e

60 dias de processo, nos ensaios de biorremediação com HTP inicial 15,3, 19,0 e 29,2 g/kg de

solo.

LI = Limite de intervenção para áreas industriais, segundo a Lista Holandesa.

Na Tabela 5.4, encontram-se os resultados das comparações múltiplas das médias de

biodegradação do HTP em 30 e em 60 dias de processo.

Tabela. 5.4: Comparações múltiplas das médias de biodegradação do HTP em 30 e

em 60 dias de processo

HTP inicial (g/kg de solo)

MSB*

30 dias 60 dias

15,3 54,93 a** 83,83 c**

19,0 55,03 a** 71,97 d**

29,2 45,07 b** 55,28 e**

*MSB – Média significativa da biodegradação (p < 0,05)

** Letras minúsculas distintas, em cada coluna, indicam médias significativamente

diferentes, pelo Teste de Tukey.

Em 30 dias, a análise de variância indicou uma diferença mínima significativa para a

biodegradação foi de 5,34%, com um desvio padrão de 2,13. O Teste de Tukey comprovou,

com base nas comparações múltiplas das médias, para p<0,05, que a biodegradação é

diferente somente entre os dois níveis mais altos de concentração de HTP estudados.

A análise de variância, realizada com os dados de biodegradação em 60 dias, levou a

um valor de diferença mínima significativa para a biodegradação de 7,16%, com um desvio

padrão de 2,86%. Complementarmente, com o conjunto de dados obtidos com o Teste de

Tukey, foi possível verificar que, neste período de tempo, os percentuais de biodegradação

obtidos são estatisticamente diferentes, a um nível de significância de 5%. Desta maneira

confirma-se, que a concentração inicial do contaminante influenciou a biodegradação dos

hidrocarbonetos, tanto em 30 quanto em 60 dias de processo.


Cabe destacar que, em 60 dias, somente os ensaios com solo contendo 15,3 e 19,0

g/kg, alcançaram HTP residual abaixo do limite de intervenção estipulado pela Legislação

Holandesa para solos em áreas industriais, que é de 5 g/kg de solo (HOLANDA, 1994). É

importante informar que os Estados da Região Norte do Brasil não possuem legislação

específica para valores orientadores de qualidade do solo e, em casos como estes, onde a

legislação local ambiental é omissa ou não existente, os estudos ambientais para remediação

de áreas contaminadas por petróleo, derivados e resíduos oleosos, costumam usar como base a

Legislação Nacional ou Legislações Internacionais de valores orientadores da qualidade do

solo. Neste contexto, a Legislação Holandesa, por sua vanguarda, é tomada como referência

em muitos Países e também em alguns Estados do Brasil, como é o caso do Estado de São

Paulo.

Detendo-nos aos aspectos de Legislação Nacional, o CONAMA, por meio da sua

Resolução Nº 420/09, que “dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo

quanto à presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento

ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de atividades

antrópicas”, não apresenta valores de HTP como referência de qualidade de solo, justificando,

assim, o uso do valor de HTP indicado na Legislação Holandesa como alvo da

biorremediação nesta Tese.

Os maiores valores de HTP residual, em 60 dias de processo, podem estar

relacionados com o aumento da concentração inicial de hidrocarbonetos nos solos,

corroborando alguns estudos encontrados na Literatura. ABIOYE et al. (2012) realizaram

experimentos de biorremediação de solo contaminado com óleo lubrificante automotivo

usado, e verificaram que a biodegradação dos hidrocarbonetos de petróleo é inversamente

proporcional à quantidade inicial de contaminantes no solo. Embora não tenham reportado

valores de HTP, estes autores relatam o uso de solos com 5 e 15% de contaminação com o

óleo lubrificante, e destacam que a biodegradação decresce em até duas ordens de grandeza

com o aumento da quantidade inicial do contaminante. Para esta conclusão, usaram um

modelo de decaimento exponencial (Eq 5.1):

y = - a.eC(t)

, Equação 5.1


onde y é a degradação, a uma constante, t é o tempo e C a concentração do

contaminante.

Del’ Arco e de França (2001) trabalharam na biorremediação de solo arenoso, recém-

contaminado com óleo árabe leve, em concentrações de HTP não superiores a 14 g/kg, devido

aos efeitos inibidores do contaminante. Estudando a biodegração nos testes com concentração

inicial de TPH de 29 g/kg, observou-se que ela não foi inibitória, mostrando a importância da

realização de estudos específicos para cada sistema e o potencial da microbiota autóctone dos

solos. Considerando que nesta pesquisa foi utilizado solo de uma área de landfarming de uma

refinaria de petróleo, considera-se que a microbiota já estava adaptada ao contaminante,

contribuindo para a remoção dos hidrocarbonatos.

Destacamos ainda que outro fator que pode ter contribuído para permanência de

hidrocarbonetos no solo foi o intemperismo. Trindade et al. (2005) estudaram a bidegradação

de petróleo cru e petróleo cru intemperizado em solo tropical, e verificaram que a facilidade

com que os hidrocarbonetos podem ser removidos dos solos varia inversamente com o

intemperismo do contaminante.

Para estudar a degradação dos HPA, usamos como alvo do tratamento, o atendimento

à Legislação Nacional, ou seja, a Resolução Nº 420/09 do CONAMA cujos valores de

concentração de HPA no solo são reportados individualmente, conforme Tabela 5.5.

Tabela 5.5: Lista CONAMA de valores orientadores para solos (Brasil, 2009)

HPA

Solo (mg/kg de solo)

Prevenção

Investigação

Agrícola Residencial Industrial

Antraceno 0,039 - - -

Benzo(a)antraceno 0,025 9 20 65

Benzo(k)fluoranteno 0,38 - - -

Benzo(g,h,i)perileno 0,57 - - -

Benzo(a)pireno 0,052 0,4 1,5 3,5

Criseno 8,1 - - -

Dibenzo(a,h)antraceno 0,08 0,15 0,6 1,3


Fenantreno 3,3 15 40 95

Indeno(1,2,3-c,d)pireno 0,031 2 25 130

Naftaleno 0,12 30 60 90

(-) não estabelecido

Os resultados obtidos das amostras com HTP de 29,2 g/kg, revelam concentrações de

Benzo(a)Pireno e Criseno, de 8,1 e 21,4 mg/kg, respectivamente, sendo os demais oito HPA

detectados, porém em concentrações abaixo do limite de quantificação, de 0,6 mg/kg, para

cada composto. Cabe destacar que, dos dois HPA quantificados, somente o Benzo(a)Pireno

possui valor de concentração para intervenção, que é 3,5 mg/kg de solo.

A biodegradação do criseno e benzo[a]pireno está apresentada na Tabela 5.6. A

análise da tabela permite verificar que o aumento da concentração inicial de hidrocarbonetos

no solo influenciou negativamente a biodegradação do criseno, não sendo observado o efeito

na degradação de benzo[a]pireno. Os HPA são compostos tóxicos e compõem moléculas de

interesse ambiental em solos impactados (JAQUES et al. 2007).

Tabela 5.6: Biodegradação de criseno e de benzo[a]pireno em função da concentração inicial

de HPA no solo

HTP inicial (g/kg do solo) Biodegradacão (%)

Criseno Benzo(a)Pireno

15,3 66 ± 5 37 ± 4

19,0 53 ± 4 29 ± 2

29,2 19 ± 2 35 ± 3

A biodegradação de HPA depende de muitos fatores, como biodisponibilidade e

intemperismo do contaminante (TRINDADE et al. 2005). O criseno possui quatro anéis

aromáticos enquanto o Benzo(a)Pireno possui cinco anéis condensados, e, portanto, maior

massa molecular. Vários estudos comprovam que os HPA de alta massa molar são menos

biodegradáveis quando comparados com os de menor massa molar (VASCONCELOS et al.

2011, ATAGANA et al. 2006), o que está relacionado com a biodisponibilidade destes

compostos.


Outro fato a considerar é que o intemperismo do solo aumenta a adsorção dos

contaminantes orgânicos hidrofóbicos, como os HPA na matriz do solo, diminuindo a

velocidade e a extensão da biodegradação. Como consequência, depois de um período inicial

de tratamento, a concentração de alguns HPA pode tender a se estabilizar em um valor

residual, como observado para o caso do benzo(a)pireno. Uma das hipóteses mais aceitáveis

propõe que os fenômenos de transferência de contaminantes constitui a etapa limitante do

bioprocesso (NOCENTINI et al. 2000, RIZZO et al. 2008). Ou ainda que a taxa de

transferência de massa de hidrocarbonetos para a fase aquosa é considerada como sendo um

dos principais fatores que regem a taxa de biodegradação (HADBARATA e TACHIBANA,

2009). Em tais situações, a concentração residual do contaminante depende principalmente

das partículas finas do solo e do intemperismo do contaminante.

A análise da Tabela 5.5 permite, ainda, verificar que permanece a necessidade de

intervenção no solo com HTP inicial de 29,2 g/kg, pois o valor residual de Benzo(a)Pireno é

em torno de 5 mg/kg, superior ao indicado na Resolução CONAMA N° 420/09, justificando

estudos de melhoria da biorremediação do solo nesta condição, os quais serão apresentados na

seção seguinte.

O comportamento dos micro-organismos revela informações a respeito da presença ou

ausência das variáveis da biodegradação e auxilia na interpretação dos resultados (Pala et al.

2006). Os resultados do monitoramento das concentrações de Bactérias Heterotróficas Totais

e Fungos Totais estão apresentados na Figura 5.5 a-b.


Figura 5.5: Evolução do crescimento microbiano durante a biorremediacão em função do teor

inicial do contaminante, (a) Bactérias Heterotróficas Totais -BHT; (b) Fungos Totais- FT

A concentração inicial de Bactérias Heterotróficas Totais e de Fungos Totais foi

similar em todos os ensaios (Fig. 5.5 a-b). Na maioria dos ensaios alcançou valores máximos

em sete dias de processo, diminuindo ao longo do tempo e alcançando menores concentrações

microbianas em 30 dias de processo, mas em valores compatíveis aos reportados na literatura

(a)

(b)


consultada para solos impactados com petróleo e seus derivados (OLIVEIRA e De FRANÇA

2005).

A análise das Figuras 5.5 a e b, conjuntamente com a Figura 5.4, permitiu concluir que

os teores dos macronutrientes (N e P) presentes no solo impactado, não foram inibitórias para

o processo, e que esses elementos foram importantes para a produção de biomassa e, portanto,

para a biodegradação. Em condições aeróbicas provocadas pelo revolvimento do solo nos

ensaios, verificou-se que a presença de maiores concentrações dos contaminantes provocou a

redução da concentração de FT e BHT ao longo do processo, entretanto o perfil das curvas se

manteve. Aqui se pode verificar o poder inibidor dos contaminantes.

Nos ensaios, com a concentração inicial de HTP de 29,2 g kg-1, foram obtidas as

mesmas concentrações de fungos totais a partir de 30 dias de processo, sem comprometer a

biodegradação dos contaminantes. Isto corrobora o relatado na literatura por Pérez-

Armendáriz et al. (2010) e por Tortella et al. (2005), que destaca os fungos filamentosos como

micro-organismos com elevado potencial hidrocarbonoclástico, principalmente na degradação

de frações mais pesadas de petróleo, como aquelas predominantes nos resíduos oleosos. A

redução das concentrações dos grupos microbianos monitorados pode também ser atribuída ao

esgotamento dos nutrientes, requeridos para a assimilação de carbono (BALLAMINUT e

MATHEUS, 2007).

O conjunto dos resultados apresentados é suficiente para concluir que existe efeito

antagônico do aumento da concentração do resíduo na biodegradação dos hidrocarbonetos de

petróleo no solo estudado. Cabe novamente destacar que, ao final de 60 dias de bioprocesso,

os solos com as duas menores concentrações de HTP inicial testadas foram considerados

tratados, conforme a Legislação Holandesa (TPH < 5 g/kg) e a Resolução CONAMA 420/09,

justificando, desta forma, os estudos complementares com solos contendo TPH inicial de 29,2

g/kg, que foram executados e cujos resultados estão apresentados e discutidos na seção

subsequente.

Esta parte da Tese foi publicada na Revista Internacional de Contaminación

Ambiental, v. 29, n.1, p.21-28, Fevereiro de 2013. Cópia do artigo no Anexo C desta pesquisa.


5.5- Emprego de cossubstratos renováveis como alternativa para aumentar a

biodegradação dos hidrocarbonetos

As características dos cossubstrados usados para aumentar a biodegradação dos

hidrocarbonetos, estão listadas na Tabela 5.7, e foram obtidas do fornecedor.

Tabela 5.7 – Características físico-químicas dos cossubstratos

Parâmetro Óleo de Soja Glicerol Comercial

Densidade (20°C) 0,916 1,262

pH 4,7 6,0

Tensão superficial (20°C) 34,4mN/m 63,4 mN/m

Umidade < 0,1% 1 %

Ca, Mg, Na, K, Fe <0,1 < 0,2 mg Elemento/g

Semelhante aos testes anteriores, a temperatura dos solos não foi controlada para

reduzir custos de processo. Nos 60 dias de experimento, a temperatura dos solos esteve em 30

2ºC. Reitera-se que a Literatura reporta que, em temperaturas entre 25 a 30ºC, desenvolve-

se uma grande variedade de espécies de micro-organismos capazes de oxidar hidrocarbonetos

(OLLIVIER e MAGOT, 2005). Muitos experimentos de laboratório têm demonstrado que a

degradação de hidrocarbonetos por micro-organismos tem sido melhor conduzida em

temperaturas na faixa de 20 a 35ºC.

O perfil de comportamento do pH dos solos, nos reatores suplementados com cada um

dos cossubstratos testados, está exibido na Figura 5.6. Nota-se que em todos os experimentos,

o comportamento do pH foi semelhante e houve um leve decaimento ao longo do processo,

tendendo a valores de pH levemente ácido, e, portanto, não inibindo o desenvolvimento dos

micro-organismos (OLLIVIER e MAGOT, 2005). Nossos resultados corroboram com aqueles

apresentados por Kim et al. (2005), quando reportaram que, os valores de pH levemente

ácidos encontrados em solos contaminados, estão relacionados à captação de HPA da matriz

sólida pelos micro-organismos e consequente a degradação destes compostos com formação

de intermediários ácidos. Em estudo mais recente, Janbadhu e Fulekar (2011) também

relacionaram a mudança do pH do meio para valores levemente ácidos, com a biodegradação

de HPA. As alegações destes autores foram embasadas em testes conduzidos em escala de

laboratório, usando como reatores frascos tipo Erlenmeyer, com capacidade para 250 mL, em


meio mineral. Os achados de Janbadhu e Fulekar (2011) foram justificados pelo aumento da

produção de intermediários ácidos, que estão diretamente relacionados à atividade metabólica

e ao progresso da biodegradação de hidrocarbonetos por consórcio misto composto por

linhagens bacterianas, de fungos filamentosos e actinomicetos, todos isolados de solo

impactado com hidrocarbonetos.

Figura 5.6: Valores de pH dos reatores contendo glicerol e óleo de soja como cossubstratos

Durante os ensaios, a umidade dos solos foi monitorada e corrigida para 70 a 80% da

capacidade de retenção de água; faixa considerada ideal para os processos de biodegradação

de acordo com Ramírez et al. (2009). Estes valores de capacidade de retenção de água

representavam umidades de, aproximadamente, 20-25%, conforme Tabela 5.8.

Tabela 5.8: Monitoramento da umidade dos solos

Tempo (dias) Óleo de Soja Glicerol Comercial

0 22 3 24 2

15 25 3 27 2

30 20 2 22 3

45 16 3 17 3

60 22 2 21 1


Alguns autores relatam uma faixa ideal de umidade de solos para a biodegradação de

hidrocarbonetos, que situa-se entre 15 e 20% (KOTER; WHITE e KELSEY, 2001). Outros

autores, como ATANAGA et al. (2006), relatam um teor de umidade na faixa de 23 a 26%.

Assim consideramos que nos testes realizados, a umidade foi mantida dentro da faixa ótima.

As perdas abióticas de HTP foram menores que 10% e, nas condições estabelecidas

nesta investigação, possivelmente resultaram da volatilização e foto-oxidação, como descreve

a literatura (Imfeld et al. 2009). Verificou-se que, independente do tipo de cossubstrato usado,

ocorreu aumento da biodegradação nos solos, em 60 dias de processo (Figura 5.7).

Figure 5.7: Percentual de degradação com suplementação dos cossubstratos glicerol e óleo de

soja e HTP de 29,2 g/kg de solo, após 60 dias

Pode-se observar que o glicerol foi o cossubstrato que promoveu uma maior redução

na concentração de HTP residual no solo. Nesse período, as amostras suplementadas com

glicerol promoveram respostas satisfatórias nas concentrações de 375 e 750 mg/kg, quando o

parâmetro HTP esteve abaixo do limite de intervenção estipulado pela Legislação Holandesa

para solos em áreas industriais, que é de 5000 mg/kg de solo (BRASIL, 2009). Quando se

50

60

70

80

90

Controle 375 750 1500

Concentração do cossubstrato (mg/kg)

Glicerol Comercial

Óleo de Soja

Bio

de

gra

daçã

o (

%)


suplementou o solo com um teor mais alto de cossubstrato testado, 1500 mg/kg, a

biodegradação foi um pouco menor que a encontrada na condição anterior, provavelmente

devido ao fato de que, nessa concentração, o cossubstrato foi preferencialmente degradado

aos contaminantes (SILVA et al. 2010).

A análise do perfil cromatográfico (Figura 4.8) dos extratos dos solos suplementados

com os cossubstratos permite verificar que, nas três condições estudadas, os compostos na

faixa de TPH GRO foram totalmente biodegradados, observado pelo perfil próximo a linha de

base, e que a degradação do TPH ORO também ocorreu, embora em menor proporção,

indicando a adaptação da microbiota nativa.


Figure 5.8. Perfil cromatográfico do extrato orgânico do solo de landfarming com teor de

HTP igual a 29,2g/kg de solo, suplementado os cossubstratos glicerol e de óleo de soja

após 60 dias

A potencialidade dos cossubstratos na biorremediação também foi analisada com

relação à biodegradação do Criseno e do Benzo(a)pireno (Tabela 5.9), ambos considerados

HPA de alta massa molecular (VASCONCELOS et al. 2011), e, portanto, de mais difícil

biodegradação, em comparação aos HPA de menor massa molecular.

Tabela 5.9: Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno

Tipo Cossubstrato Biodegradação (%)

Concentração (mg/kg de solo) Criseno Benzo(a)Pireno

Gli

cero

l

Com

erci

al 375 38 ± 2 30 ± 1

750 55 ± 2 53 ± 2

1500 19 ± 1 35 ± 2

Óle

o d

e S

oja

375 38 ± 2 31 ± 2

750 41 ± 2 36 ± 3

1500 22 ± 2 17 ± 2

Bra

nco

0 (zero) 18 ± 3 22 ± 2

A análise da tabela permite verificar que tanto o óleo de soja quanto o glicerol

comercial incrementam a biodegradação dos HPA monitorados, corroborando os resultados

de redução de TPH. A melhor condição encontrada foi 750 mg/kg relação 40:1 TPH: glicerol

(concentração de 750 mg/kg)

Comparando a Tabela 5.9 e 5.6, verifica-se que, para o solo com HTP inicial de 29,2

mg/kg, o uso do glicerol comercial permitiu o aumento da biodegradação do Criseno de 19

para 55%, quando se empregou a relação 40:1 HTP: glicerol (concentração de 750 mg/kg).

Ainda analisando estas tabelas, pode-se verificar que a biodegradação do Benzo(a)pireno

aumentou de 35 para 53%, também com o uso do glicerol na concentração de 750 mg/kg.

Embora, com efeito menos pronunciado que o observado nos testes que

empregaram glicerol, o uso do óleo de soja, na concentração de 750 mg/kg (40:1 HTP: óleo


de soja), também aumentou a biodegradação dos dois HPA monitorados. Em suma, os

resultados encontrados, mostram que o uso de um dos dois cossubstratos estudados aumenta a

remoção do Criseno e do Benzo(a)pireno, na concentração de cossubstrato de 750 mg/kg.

O efeito sinérgico do uso do cossubstrato no solo sobre a biodegradação dos dois HPA

estudados, pode estar relacionado com fenômenos de transporte. O glicerol é uma fonte de

carbono solúvel em água, mais acessível como nutriente para diferentes tipos de micro-

organismos e pelo fato deste composto poder estimular a produção de biossurfacctantes, o que

pode ter favorecido o processo de biorremediação (CALVO et al. 2003, SILVA et al. 2010).

O óleo vegetal também pode ter sido usado na produção de biotensoativos, justificando o

aumento da remoção dos hidrocarbonetos (LIMA et al. 2009). Outra hipótese considerada

para explicar a melhoria da biodegradação é que os cossubstratos podam ter auxiliado na

transferência de massa dos HPA, através de processos físico-químicos de interface,

viabilizando a dessorção dos contaminantes da fase sólida e a assimilação microbiana (YAP et

al. 2010). Assim fica claro o efeito positivo do uso dos cossubstratos testados no

biotratamento dos solos contaminados com resíduos oleosos.

Os resultados obtidos no monitoramento microbiano nos reatores que operaram na

biorremediação do solo suplementado com 750 mg/HTP estão apresentados na Figura 5.9.

Nota-se que a concentração inicial de BHT e FT totais foi semelhante em todos os testes, (Fig.

5.9.a e 5.9.b), dado que o perfil das curvas foi semelhante, independente da quantidade do

cossubstrato usado. Tanto as concentrações de BHT quanto as de FT alcançaram valores

máximos em sete dias de processo, decrescendo ao longo do tempo e alcançando as menores

concentrações microbianas em 60 dias de processo, porém em valores compatíveis aos

reportados na literatura para solos impactados com petróleo e derivados (OLIVEIRA e De

FRANÇA, 2005).

A análise das Figuras (5.9.a e 5.9.b) permite ainda concluir que: 1) o solo impactado

possuía concentração não inibitória de macronutrientes (N e P), que são elementos

importantes para produção de biomassa; 2) a suplementação com os cossubstratos favoreceu o

crescimento de bactérias e não influenciou a concentração de fungos, que apresentaram um

perfil semelhante para os testes com e sem suplementação com glicerol ou com o óleo

vegetal.


O tempo para o re-estabelecimento, em média, da população dos fungos, determinado

no reator controle, foi metade do tempo pelas BHT, provavelmente devido ao esgotamento

dos nutrientes ou aumento não significativo da concentração de metabólitos tóxicos.

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

1,0E+10

BH

T (

UF

C/g

de s

olo

)

Controle Biótico

Glicerol Comercial

Óleo de Soja

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

0 7 15 30 60

Tempo (dias)

FT

(U

FC

/g d

e s

olo

)

Figura 5.9: Monitoramento microbiano de solos suplementados com glicerol e óleo de soja a

750 mg/kg e HTP de 29,2g/kg, (HTP/Cossubstrato, igual a 40:1)

Os resultados de alta concentração de fungos apresentados neste trabalho, confirmam

as alegações encontradas de Atagana et al. (2006), Tortella et al. (2005) e de Pérez-

Armendáriz et al. (2010), que reportaram fungos filamentosos como micro-organismos com

(a)

(b)


elevado potencial hidrocarbonoclástico, principalmente na degradação de frações mais

pesadas do petróleo, como aquelas predominantes nos resíduos oleosos.

O conjunto dos resultados demonstra que o uso de glicerol, numa concentração de 750

mg/kg, que leva a uma relação HTP: Glicerol de 40:1, foi eficiente para biotratamento do

solo, considerando os maiores valores de remoção de Benzo(a)pireno e Criseno.

Considerando que se deseja otimizar a quantidade de resíduo que ingressa em qualquer planta

de tratamento de resíduos, fica justificado um estudo para a verificação da eficácia da relação

de HTP: glicerol de 40:1, no biotratamento de solo com maior quantidade de hidrocarbonetos.

Esta parte da pesquisa foi publicada, na Revista: Brazilian Journal of Petroleum and

Gas, v.6, n.2, p.43-51, 2012. Cópia do artigo no Anexo C desta pesquisa.

5.6- Biorremediação de solo contaminado em laboratório com TPH 60 g/kg, empregando

glicerol bruto como cossubstrato

Em tratamentos em escala industrial, busca-se aumentar a eficiência econômica das

unidades pelo aumento da capacidade de processamento das cargas, num dado intervalo de

tempo. Em alguns casos essa estratégia pode funcionar, porém, em processos biotecnológicos

de tratamento, esta prática pode não ter êxito, pois a concentração inicial dos contaminantes

pode exercer efeito inibitório à microbiota (ALEXANDER, 1999, Del’ARCO e De

FRANCA, 1999).

Assim, buscando a melhoria da economicidade do tratamento, e com a finalidade de

verificar a eficácia de emprego de cossubstratos em solo contendo alta concentração de HTP

inicial, 60 g/kg, na relação 40:1 (HTP inicial e glicerol), testou-se o glicerol comercial e o

glicerol bruto, excedente da produção de biodiesel. Os resultados de pH e umidade ao longo

do tempo estão apresentados na Figura 5.10.


Figura 5.10: Valores de pH e umidade em solos suplementados com glicerol comercial e

glicerol bruto e HTP inicial de 60 g/kg de solo na relação (HTP: Cossubstrato, igual a 40:1)

Pode-se verificar pelo perfil das curvas de pH, que houve um leve decaimento nos

valores, o que é indicativo de atividade metabólica. Esse decaimento inicial foi mais

acentuado nos reatores com glicerol comercial. Já pelo uso de glicerol bruto foi observado

decaimento menos acentuado inicialmente, talvez devido à presença de contaminantes como

metanol e sabão, fósforo, potássio, cálcio, silício, sódio e zinco (ABAD e TURON, 2012).

Esses contaminantes podem causar alguma inibição na atividade de certas enzimas. A faixa de

pH do solo entre 6,0 e 7,0 é considerada ótima para a degradação de hidrocarbonetos (Vidal,

2001, apud Coulon et al. 2010, JAQUES et al. 2007).

Das nossas observações em laboratório destacamos que a alta concentração de óleo

(HTP) dificultou a incorporação da água no solo, requerendo maior revolvimento para a

incorporação da água. Assim, obtiveram-se valores de umidade na faixa de 18 a 22%, dentro

da faixa de 50 a 80% da capacidade de retenção de água do solo, que são considerados

favoráveis a degradação pelos micro-organismos (RAMÍREZ et al. 2009).


Os resultados dos percentuais de biodegradação do HTP estão apresentados na Figura

5.11.

20

30

40

50

60

70

80

90

100

30 60

Tempo (dias)

Bio

degra

dação (

%)

Glicerol Comercial

Glicerol Bruto

Controle Biótico

Figura 5.11: Percentual de degradação de solos com HTP de 60 g/kg, suplementados com

cossubstratos, glicerol comercial e glicerol bruto na relação (HTP: Cossubstrato, de 40:1)

A análise dos resultados permite verificar que ambos os cossubstratos empregados

influenciaram positivamente a biodegradação de HTP, aumentando de 50 para

aproximadamente 80% a biodegradação em 60 dias de processo. Assim, fica claro que a

adição dos cossubstratos testados no solo com alto teor inicial de hidrocarbonetos, pode ser

eficaz na biodisponibilidade desses contaminantes para os micro-organismos.

Observando a degradação do Benzo(a)pireno na Tabela 5.10 abaixo, verifica-se que o

percentual de degradação desse contaminante; na presença de glicerol comercial foi de 35 ±

7% e de 56 ± 10%, e na presença de glicerol bruto, ao final de 60 dias de processo. O uso do

glicerol bruto, resultou em leve aumento no percentual de biodegradação deste HPA. Os

resultados de biodegradação de Criseno foram semelhantes entre si, ou seja, aproximadamente

75% de remoção, independente do cossubstrato usado. Estes resultados indicam que os

contaminantes do glicerol bruto não influenciaram negativamente na biodegradação dos HPA

analisados e, assim, a potencialidade do uso deste subproduto na remediação de solos

impactados com hidrocarbonetos.


Tabela 5.10. Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno

Cossubstrato Biodegradação (%)

Criseno Benzo(a)pireno

Glicerol Comercial 72 ± 12 35 ± 7

Glicerol Bruto 78 ± 15 56 ± 10

A literatura reporta trabalhos da degradação de criseno e Benzo(a)pireno em diferentes

ambientes, conforme Tabela 5.11.

Tabela 5.11. Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno reportados da literatura

Autor(es)

Criseno

Conci. Biod. Amb.

Hadibarata e Tachibana (2009) - 90% solo

Doth et al., 2010 50 mg/L 80% Meio Mineral

Hyayat et al., 2012 1mM 48% Meio Mineral

Willison J.C (2004) 0,5 g/L 97,5% Meio Bifásico

Valentin et al., 2007 50 mg/Kg 34,6% solo

Mohan et al., 2009 84 mg/Kg 40,95% solo

Sayara et al., 2011 1000 mg/kg 29,5% solo

Lors et al., 2012 809 mg/Kg 76% solo

Autor(es)

Benzo(a)pireno

Conci. Biod. Amb.

Rentz et al. (2008) 1630µ/ml 100 % Meio mineral

Lily et al. (2009) 50µ/ml 84,7 % Meio mineral

Kot-Wasik et al. (2004) 1 mg/L 80% Água de rio

Romero et al. (2010) 40 mg/L 75 % Meio mineral

Nabatilan (2006) 30µg/g 63 % Sedimento

Wang et al. (2008) 100 mg/kg 29 a 37 % Solo

Heitkamp e Cerniglia (1989) - 36% Sedimento

Kot-Wasik et al. (2004) 1 mg/L 20% Água de mar

Nota: Conci. = concentração; Biod. = biodegradação e Amb. = ambiente


Comparado as Tabelas 5.10 e 5.11, podemos verificar que os resultados de

biodegradação encontrados no nosso Estudo são promissores. Considerando os micro-

organismos encontrados em uma área de landfarming, supomos que estão adaptados aos HPA

de maior número de anéis, sendo o solo da região Amazônica de características

predominantemente argilosas. Outro fator que pode ser destacado é que a adição de fontes

adicionais de carbono, mais facilmente assimiláveis, pode estar agindo como um estimulante

à degradação de compostos recalcitrantes ou facilitando a biodisponibilidade dos

hidrocarbonetos.

Ressaltamos que, após a remediação, os valores de concentração residual de Criseno e

Benzo(a)pireno foram, respectivamente, de 113 mg/kg e de 12 mg/kg. Logo, o

Benzo(a)pireno está presente no solo em concentração acima do limite de intervenção

estabelecido pela Resolução CONAMA 420/09 para áreas industriais, que é de 3,5 mg/kg,

sendo a redução da concentração deste HPA no solo, um novo desafio a ser vencido em

experimentos futuros.

A atividade microbiana com cada cossubstrato foi monitorada pela medida da

concentração de bactérias heterotróficas totais e fungos totais, no período de 60 dias (Figura

5.12).


Figura 5.12- Monitoramento microbiano em solos suplementados com glicerol comercial e

glicerol bruto na relação (HTP/Cossubstrato, igual a 40:1) e HTP inicial de 60g/kg


Observa-se que a concentração inicial de cada grupo microbiano investigado, foi

semelhante, independente do emprego do cossubstrato. Na Figura 5.12a observa-se que no

decorrer do processo houve um leve decaimento na população de bactérias, chegando a

valores na ordem de 106 UFC/g, em 60 dias de processo. Isso se deu, provavelmente, devido

ao nível elevado de contaminação e pela recalcitrância do contaminante.

Na presença de glicerol bruto, Figura 5.12b, a população de fungos decaiu nos

primeiros 10 dias e tendeu a estabilidade até o final do processo. Já nos testes com o uso do

glicerol comercial observou-se um aumento da concentração de fungos até 30 dias de

processo, decaindo ao longo dos trinta dias seguintes.

O perfil da população de fungos pode ser indicativo de adaptação ao contaminante ou

o uso do cossubstrato como fontes de carbono de fácil biodegradação. O comportamento

diferenciado da concentração de fungos nos solos não influenciou o resultados da

biodegradação do HTP e dos HPA monitorados, comprovando as alegações de Trindade et al.

(2005) e de Del’Arco (1999) que reportam que a diversidade de tipos de micro-organismos

(não necessariamente a concentração) é fator importante na biodegradação.

5.7- Fitotoxicidade do solo

O mecanismo de ação dos HPA nas plantas foi descrito como a redução da habilidade

da raiz em absorver água e nutrientes (DEBIANE et al. 2008). O teste de fitotoxicidade é uma

das mais simples formas de diagnóstico da fertilidade de solos biorremediados (DAZY;

FÉRARD e MASFARAUD, 2009 apud Vasconcelos 2011). A inibição da germinação e a

diminuição do crescimento vegetal, bem como a morte das plantas, são indicadores da

toxicidade dos hidrocarbonetos (RIVERA-CRUZ e TRUJILLO-NARCÍA, 2004).

Assim, para verificar a eficiência de processos de biorremediação de solos

contaminados por hidrocarbonetos do petróleo e minimizar riscos associados à disposição

desse resíduo no solo, verificou-se a fitotoxicidade do solo contaminado com 60g/kg de solo

no inicio e após 60 dias de bioprocesso.

Nas amostras de solo impactado por hidrocarbonetos de petróleo e no solo tratado com

os cossubstratos na concentração de 750 mg/kg de solo, o efeito fitotóxico foi investigado

utilizando-se sementes dos vegetais Abelmoschus esculentus ( quiabo), Cucumis sativus


(pepino) e Rudbeckia hirta (margarida amarela). As três sementes são dicotiledôneas, sendo

duas de vegetais e uma de flor. A escolha destas sementes também foi embasada no diâmetro.

Cucumis sativus tem o maior diâmetro de semente de 0,9 cm, seguido pela Rudbeckia hirta

0,8 cm e o Abelmoschus esculentus, 0,5 cm.

Os resultados dos ensaios de Fitotoxicidade para as três sementes estudadas estão

listados na Tabela 5.12.

Tabela 5.12. Fitotoxidade do solo antes e depois do biotratamento

Vegetal 0 dias 60 dias

Abelmoschus esculentus ALTO NÃO FITOTÓXICO

Cucumis sativus MODERADO NÃO FITOTÓXICO

Rudbeckia hirta ALTO ALTO

Os resultados demonstram que a toxicidade dos contaminantes estudados não teve

relação com o diâmetro das sementes, pois apenas a semente de tamanho intermediário sofreu

efeitos tóxicos, após o tratamento. As sementes de Cucumis sativus e de Abelmoschus esculentus

(de maior e menor diâmetro), se mostraram mais tolerantes aos efeitos tóxicos do contaminante. A

literatura reporta que sementes maiores são menos influenciadas pelo efeito tóxico dos

contaminantes do que sementes de menor tamanho (SMITH et al. 2006, HAMDI et al. 2007,

REYNOSSO-CUERVAS et al. 2008). A escolha de sementes de cor clara garantiu que

nenhuma delas apresentasse fotoblastismo positivo que, de acordo com (CORDAZZO e

ARACAMA 1998, apud VASCONCELOS, 2011), teriam sua germinação inibida pela

ausência de luz, o que poderia induzir a erros de interpretação nas respostas dos testes. É

provável que a forma da semente também tenha influência na germinação, pois as sementes

de Albelmoschus esculentus são redondas e, embora apresentem um diâmetro menor, a sua

área superficial é grande.

Os resultados demonstram que o tratamento foi eficiente para reduzir os efeitos

fitotóxicos do solo sobre o Abelmoschus esculentus ( quiabo) e o Cucumis sativus (pepino).

Já para Rudbeckia hirta ( margarida amarela), o efeito fitotóxico alto persistiu após os 60 dias

de bioprocesso. Tem-se, assim, a fitotoxicidade à Rudbeckia hirta como sendo uma


importante variável de resposta para experimentos futuros de biorremediação deste solo

(ANASTASI et al. 2009).

5.8- Micro-organismos isolados durante os 60 dias de processo em laboratório

A capacidade de degradar hidrocarbonetos do petróleo é apresentada por diversos

organismos, principalmente as bactérias, os fungos filamentosos e as leveduras. Esses micro-

organismos são geralmente isolados de sítios contaminados por petróleo e derivados,

considerando a adaptação ao contaminante (BRITO et al. 2010, ZHONG et al. 2011,

JANBANDHU e FUKLER, 2011). Desde a década de 1950 do século passado, vem sendo

isoladas e identificadas bactérias e fungos degradadores de hidrocarbonetos. Dentre os

isolados, destacam-se os gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Norcadia,

Sphingomonas, Mycobacterium e Gordonia, dentre outras, e de fungos do gênero

Cunninghamella, Fusarium, Candida, Penicillium e Aspergillus (CERNIGLIA et al. 1997,

JAQUES et al. 2005 apud JAQUES et al. 2007).

No presente estudo, os cultivos em placa demonstrou uma diversidade de micro-

organismos cultiváveis, conforme apresentado na Figura 5.13. Podem ser observadas colônias

de fungos e bactérias, com distintos aspectos e, considerando os elevados teores de HTP no

solo, temos inferência da presença de organismos hidrocarbonoclásticos.

Fungos e bactérias predominantes nos cultivos em placa foram isolados com a

finalidade de identificar os micro-organismos relacionados com a degradação dos

hidrocarbonetos de petróleo, nas três concentrações de HTP testadas.


Figura 5.13: Colônias de fungos e bactérias com distintos aspectos

Foi possível isolar oito estirpes microbianas, sendo quatro fungos filamentosos e

quatro bactérias. As bactérias isoladas foram codificadas como: TCB-1; TCB-2; TCB-3 e

TCB- 4. As estirpes de fungos, por sua vez, foram codificadas como TCF-I; TCF-II; TCF-III

e TCF-IV. A identificação dos isolados bacterianos está apresentada na Tabela 5.12, e dos

isolados fúngicos, na Tabela 5.13. Estes resultados corroboram aqueles apresentados por

Araújo et al. (2002) e Chailan et al. (2004). Estes autores isolaram e identificaram estirpes de

fungos e bactérias capazes de degradar hidrocarbonetos de petróleo em solos contaminado

com petróleo.

Tabela. 5.13: Isolados bacterianos em solo contaminado com resíduos oleosos

Código Linhagem Identidade (%) TSO* Nº de Acesso

TCB-1 Rhodococcus gordoniae 89% 1039 pb EU741104.1#

TCB-2 Micrococcus luteus 99% 1439bp FJ189776.1#

TCB-3 Bacillus cereus ** 100% 1000bp LBF##

TCB-4 Serratia marcescens 100% 1149 pb AB680122.1#

Nota: * TSO – Tamanho da Sequencia Obtida, ** Sensu stricto

# GenBank ## FIOCRUZ1641


Tabela 5.14: Fungos Filamentosos isolados de solo contaminado com resíduos oleosos

Código Linhagem Banco Fiocruz*

TCF-I Aspergillus flavus IOC- 4615

TCF-II Aspergillus niger. var. niger IOC- 4616

TCF-III Aspergillus clavatus IOC- 4617

TCF-IV Cunninghamella echinulata IOC- 4618

Nota: * Após catalogação

A identificação das linhagens de Rhodococcus gordoniae, Micrococcus luteus e

Serratia marcescens, corrobora os trabalhos de Jones et al. (2004), Wongsa et al. (2004) e de

Ramirez et al. (2010), que também isolaram espécies destas bactérias de solos contaminados

com hidrocarbonetos de petróleo.

O gênero Rhodococcus tem capacidade para degradar muitos compostos orgânicos, o

que pode ser devido à sua capacidade de produzir surfactantes, Ruggeri et al. (2009). A sua

presença e disseminação no ambiente torna-os candidatos ideais para promover a remediação

de sítios contaminados (van LEEUWENHOEK, 1998). Além disso, Rhodococcus mostra uma

grande diversidade metabólica, contribuindo para degradação de xenobióticos (Dabbs, 1998,

Goodfellow et al. 2004, Jones et al. 2004), e também são reportados na literatura como

degradadoras de HPA (KIM e LEE, 2007, JANBANDHU e FULEKAR, 2011). Rodococcus

gordoniae pertencentes à família Nocardeaceae, são aeróbicas, Gram-positivas e catalase

positiva, que formam filamentos ramificados que se fragmentam em elementos coco-bacilos.

Formam colônias de forma côncava, brilhantes, de coloração variando entre rosa pálido a

coral, e apresentam bordas filamentosas (JONES et al. 2004). Rodococcus sp. isoladas de

sedimentos contaminados, se mostraram capazes de metabolizar fenantreno via orto e meta

clivagem (DEAN-ROSS; MOODY e CERNIGLIA, 2002).

Serratia, por sua vez, pertence à família das Enterobactereaceae e pode ser descrita

como uma bactéria que apresenta forma de bastonetes curtos (0,5 a 0,8 μm de diâmetro e 0,9 a

2,0 micrometro de comprimento) com bordas arredondadas. Em geral, apresenta mobilidade

pela presença de flagelos peritríquios. É facultativa, podendo crescer em ampla faixa de pH, 5

a 9, fortemente catalase positiva. Apresenta crescimento em ampla faixa de temperatura (10 a

36 ºC), e salinidade (0 a 4% NaCl). As colônias da linhagem Serratia marcences isoladas

nesta pesquisa apresentam pigmentação vermelha, formato côncavo, de aspecto brilhante e

liso. Sendo um micro-organismo quimioheterotrófico, cresce em distintas fontes de carbono e


pode ser cultivada em meio mínimo com uma única fonte de carbono e sulfato de amônio,

como fonte de nitrogênio (GRIMONT e GRIMONT, 1984). A literatura relata vários

experimentos de degradação de petróleo e derivados utilizando-se espécies de Serratia

marcences (WONGSA et al. 2004, RAMIREZ et al. 2010, ANYANWU; OBI e OKOLO,

2011). A produção de biossurfactante por Serratia marcences também foi comprovada nos

trabalhos de Ferraz et al. (2002).

Micrococcus luteus se caracteriza pela eficiência na biodegradação de hidrocarbonetos

de petróleo, por sua capacidade de emulsificar os hidrocarbonetos pela produção de

biossurfactantes, que aumentam a adesão das células ao substrato (TULEVA et al. 2009).

A espécie Bacillus cereus, sensu lato, que compreende o grupo de micro-organismos

denominado de Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis e Bacillus cereus (sensu stricto), já

foi bastante estudada, por suas características patogênicas (JENSEN et al. 2003).

Segundo as considerações citomorfológicas, bioquímicas e fisiológicas, e a utilização

do sistema API 50 CHB (BioMériex®), a amostra do isolado TCB-3 foi identificada como

Bacillus cereus sensu stricto. Trata-se de bastonetes com esporos preponderantemente

elípticos subterminais não deformantes

Consórcios de bactérias contendo Bacillus cereus, isolado de resíduos petroquímicos,

demonstraram eficácia na degradação de borras oleosas (CERQUEIRA et al. 2011). De

maneira geral, a capacidade hidrocarbonoclástica desses micro-organismos, segundo alguns

autores, se deve a produção de biossurfactantes, que é uma estratégia utilizada para acentuar a

biodisponibilidade de compostos hidrofóbicos (BANAT et al. 2010, CALVO et al. 2009,

NILKIFOROVA et al. 2009, CERQUEIRA et al. 2012).

O gênero Aspergillus é freqüentemente encontrado no ar e no solo. Apresenta-se sob a

forma de um micélio septado escuro ou hialino. Parte da massa micelial se diferencia em

conidióforo, terminalmente com vesícula, que pode ser globosa, hemisférica, elíptica ou

clavada, e de coloração hialina ou pigmentada. Na vesícula são formados os esterigmas ou

fiálides, diretamente ou sobre metulas (BARNETT e HUNTER, 1986, SAMSON;

HOEKSTRA e FRISVAD, 1995 apud IEDA ROTTAVA, 2005). As colônias de Aspergillus

niger são compostas de micélio aéreo, com conidióforos eretos, distribuídos densamente

sobre a superfície do meio, além de grande produção de conídios. As espécies pertencentes ao

grupo produzem o aspergilo ou cabeça aspergilar. Tal estrutura consiste em uma haste não


septada e estípede, terminando em uma vesícula, sobre a qual nascem às células

conidiogênicas, denominadas por fiálides. Estas, por sua, vez são responsáveis por sintetizar

os conídios, bem como as métulas (SAMSON et al. 1995, SANTOS, 2007 apud SIMAS

2011).

Como regra geral, são células multinucleadas. O micélio jovem produz conidióforo

solitário abundante decorrente somática hifas. Conidióforos hialinos ou pigmentados são

longos, lisos, cada um terminando em uma cabeça bulbosa chamada de vesícula. As vesículas

têm dimensões de 20-100 µm de diâmetro. Um grande número de células conidiogénicas

ocorre na superfície da vesícula multinucleadas, por isso são observados como cabeças

conidiais irradiadas. Células Conidiogênicas, primárias ou secundárias, são fiálides típicas.

Quando os fiálides atingem a maturidade, eles começam a produzir conídios um após o outro,

em cadeias. Conídios são globosos, com paredes ásperas medindo entre 3,5 e 5,0 mm de

diâmetro. Os conídios são formadas na extremidade tubular das fiálides. Como conidióforos e

conídios são produzidos em abundância, sua cor é predominante na pigmentação da colônia,

aparecendo na coloração preta ou marrom (USECHE; VALENCIA e PÉREZ, 2004).

A espécie Aspergillus flavus apresenta hifas hialinas, esporos rugosos, vesícula

globulosa ou piriforme e esporos globulosos de cor verde oliva. Pode ser uniseriado,

apresentando métulas de onde originam-se os esporos, ou podem ser biseriados, possuindo

metulas e fialides. Os conidióforos originam se de uma estrutura chamada célula pé.

Macroscopicamente possui textura pulverulenta, micélio branco, com esporulação cuja

tonalidade varia de verde oliva a amarelado. Dependendo do meio de cultura, pode ou não

haver coloração no reverso da placa, sendo radiado em qualquer condição de cultivo em meio

solido.

As colônias são constituídas por micélio fino, mas de textura densa. Cobrem-se de

conídios de cor geralmente entre o amarelo e o verde. O reverso é branco ou róseo. As

cabeças conidiais são radiadas; os conidióforos incolores e de paredes espessas; as vesículas

alongadas, quando jovens, e mais tarde globosas com 10 e 65m de diâmetro; os esterigmata

unisseriados ou bisseriados; os conídios globosos e geralmente com 3,5 a 4,5m de diâmetro.

Muitas estirpes produzem esclerócios, particularmente quando isoladas recentemente, que por

vezes dominam a morfologia da colônia. A sua forma, cor e dimensões são variadas;

raramente excedem 1mm de diâmetro e podem tomar cor castanho-avermelhada escura. A


presença de esclerócios é acompanhada, muitas vezes, do aparecimento à superfície da

colônia de gotas de um exsudado castanho-averemelhado (PAULINO, 1998).

Aspergillus clavatus são fungos saprófitos (BEZERRA Jr. et al. 2009). Os esporos de

A. clavatus apresentam conídeos de dimensões 3-4,5 x 2.5-4,5 µm (ALLERGY et al. 1984).

O gênereo Cunninghamella caracteriza-se pela ausência de hifas septadas, o que indica

que ele é um Zygomyceto. Exibe a presença de esporângios globosos. O tamanho de uma

esporangiola é de cerca de 6-7 µm de diâmetro (MURAD et al. 2011).

Foram realizadas as observações das características macroscópicas após crescimento

em meio Agar Sabouraud e verificou-se a presença de colônias de coloração verde azulado

(Cunninghamella echinulata), verde musgo (Aspergillus flavus); marrom escuro (Aspergillus

clavatus); e preta (Aspergillus niger. var. níger), todas com aspecto aveludado.

Os fungos filamentosos isolados e identificados dos solos em estudo, têm sua

característica hidrocarbonoclástica já citada em trabalhos anteriores com Aspergillus níger

(RAMIREZ et al. 2010, EJA et al. 2005 ).

Lotfinasabasi et al. (2012) reportaram o isolamento e crescimento de estirpes de

Aspergillus em solos contaminados com óleo cru e verificaram o potencial de um isolado de

Aspergillus níger na biodegração de hidrocarbonetos em altas concentrações (5 a 20% m/m).

PÉREZ-ARMENDÁRIZ et al. (2010) também reportam o êxito de isolado de Aspergillus

niger na degradação de hidrocarbonetos intemperizados isolados de solo mexicano, com

remoção de aproximadamente, 60% do HTP.

Cutright (1995), estudou a cinética envolvida de biodegradação de HPA por

Cuninghamella echinulata var. elegans e sugeriu que, para uma cinética de primeira ordem, a

taxa de degradação na concentração do contaminante é proporcional à concentração do

contaminante no solo e ao tipo de contaminante (HARITASH e KAUSHIK, 2009).

O fungo filamentoso Cunninghamelalla utiliza o sistema citocromo P450, (via de

degradação de HPA ilustrada na Figura 3.5), no metabolismo de uma variedade de poluentes,

entre eles os hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e hidrocarbonetos aromáticos

policíclicos. É um gênero catabolicamente versátil (YADAV et al. 2000).

Nascimento, T.C.F. Conclusões 114

CAPÍTULO 6 – CONCLUSÕES

6.1 – Conclusões

Em 60 dias de processo, o aumento da concentração de TPH inicial no solo de 15,3 e

19,0 g/kg, não impediu que o TPH residual alcançasse valores abaixo do limite de

intervenção estipulado pela Legislação Holandesa para solos em áreas industriais, que

é de 5 g/kg de solo. No entanto, o aumento da concentração de TPH inicial para 29,2

g/kg, promoveu uma diminuição do percentual de biodegradação dos hidrocarbonetos

e o solo apresentou valor de TPH residual próximo de 12 g/kg, justificando, assim,

estudos de alternativas de tratamento.

O aumento da concentração inicial do TPH do solo, de 15,3 para 29,2 g/kg,

influenciou negativamente a biodegradação do criseno, que passou de 66 para 19%. Já

para o caso do benzo(a)pireno, não foi verificado qualquer efeito do TPH inicial na

biodegradação.

O emprego do glicerol comercial ou do óleo de soja influenciou positivamente na

biodegradação do TPH, do criseno e do benzo(a)pireno, quando testado com TPH

inicial de 29,2 g/kg.

Pôde-se verificar que as relações mássicas entre a quantidade do cossubstrato e o TPH

inicial do solo influenciaram a biodegradação dos hidrocarbonetos. Os melhores

resultados de remoção dos contaminantes foram obtidos na relação 40:1 (TPH:

Cossubstrato). Nesta condição, observaram-se também maiores percentuais de

biodegradação de criseno e benzo(a)pireno, a saber, 55 e 53% com o uso do glicerol e

41 e 36% com o emprego do óleo de soja.

Em valores de TPH inicial de 60 g/kg, não foi verificada diferença significativa na

biodegradação dos hidrocarbonetos totais de petróleo pela suplementação com glicerol

comercial ou com glicerol bruto (um resíduo), revelando o potencial de

Nascimento, T.C.F. Conclusões 115

reaproveitamento deste resíduo do setor de energia. Este mesmo comportamento foi

observado para o criseno e benzo(a)pireno.

Com os experimentos desta pesquisa, foi possível obter oito isolados microbianos

capazes de se manter ativos em solos contendo altos teores de hidrocarbonetos,

indicando o potencial da microbiota nativa da Amazônia na biodegradação de

compostos recalcitrantes produzidos pelo setor de petróleo e gás.

6.2 – Sugestões

Verificar o efeito da suplementação de glicerol bruto em solos com altas contrações de

HTP por períodos de tempo maiores, por exemplo, 90 e 120 e 240 dias, na relação

(HTP: Cossubstrato) de 40:1.

Promover o bioaumento em laboratório, na biorremediação de solos contendo altas

concentrações de HTP, utilizando os micro-organismos isolados nesta pesquisa;

bactérias e fungos filamentosos, uma vez que os mesmos se mostraram bons

degradadores de hidrocarbonetos recalcitrantes.

Realizar os testes de Fitotoxicidade ao final de cada experimento, utilizando sementes

da espécie que se mostrou mais sensível aos efeitos fitotóxicos, testados nesta

pesquisa; semente da espécie Rudbeckia hirta (margarida amarela).

Testar a biorremediação com a suplementação de glicerol bruto, excedente da

produção de biodiesel, utilizando outras fontes de matérias-primas renováveis.

Investigar a biodegradação dos HPA, de 4, 5 e 6 anéis aromáticos, dos 16 listados pela

USEPA em outras relações (HTP:Cossubstrato), partindo de um planejamento

experimental, testando solos contaminados com altas concentrações de HTP, (30g/kg,

60g/kg e 100g/kg de solo) e glicerol bruto como cossubstrato.

Nascimento, T.C.F. Referências Bibliográficas 116

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Mycobacterium sp. and Sphingomonas sp. Bioresources Technology, v. 102, p. 2965–

2972, 2011.

Nascimento, T.C.F.

ANEXOS

ANEXO B – Produção bibliográfica

Trabalho publicado em periódico de circulação internacional

NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Potential of glycerol and

soybean oil for bioremediation of weathered oily-sludge contaminated soil. Brazilian

Journal of Petroleum and Gas, v.6, n.2, p. 043-051, 2012.

Trabalho aceito para publicação em periódico de circulação internacional

NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Biorremediación de um

suelo tropical contaminado con residuos aceitosos intemperizados. Revista Internacional

de Contaminación Ambiental, v.29, n.1, p. 21-28, 2013.

Trabalhos completos em eventos cientícos

NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Efeito do Glicerol e

Biodiesel na Biorremediação de solo contaminado com resíduos de refinaria. In: XVIII

CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA QUÍMICA - COBEQ, 19-22/09,

2010, Foz do Iguaçu. Anais... São Carlos: Cubo Multimidia, 442 p., 2010.

NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Efeito da adição de

cossubstratos na Biorremediação de Solos de Landfarming de Refinaria de Petróleo. In:

XVIII SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS - SINAFERM, 24-27/07, 2011.

Apresentação oral. Caxias do Sul, 2011.

NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Identificação de micro-

organismos hidrocarbonoclásticos isolados de solo de landfarming suplementado com

fontes adicionais de carbono. In: XIX CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA

QUÍMICA, 09-12/09, 2012, Búzios-RJ. Anais...: Cubo Multimidia, 439 p., 2012.

Nascimento, T.C.F.

ANEXOS

BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS INTEMPERIZADOS

Teresa Cristina FERREIRA DO NASCIMENTO1, Fernando Jorge SANTOS OLIVEIRA2 y Francisca PESSOA DE FRANÇA3*

1 Departamento de Engenharia Bioquímica. Alumna de Doctorado en la Universidade Federal do Rio de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil

2 Petróleo Brasileiro S.A - PETROBRAS, Brasil3 Departamento de Engenharia Bioquímica da Escola de Química, DSc, Tecnología de Procesos Químicos y

Bio-químicos, Universidad Federal do Rio de Janeiro*Autor responsable: [email protected]

(Recibido agosto 2011, aceptado noviembre 2012)

Palabras clave: biorremediación, biodegradación, residuos aceitosos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, suelo intemperizado

RESUMEN

En este trabajo se evaluó la biorremediación de un suelo de clima tropical, contamina-do con residuos aceitosos intemperizados. Fueron ensayadas tres concentraciones de hidrocarburos totales de petróleo (HTP) iniciales: 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo. Los ensayos fueron llevados a cabo en 60 días, monitoreando los siguientes parámetros: humedad, pH, concentración de bacterias heterotróficas totales (BHT), hongos totales (HT), hidrocarburos totales de petróleo (HTP) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP): benzo(a)pireno (BaP) y criseno (CHR). La concentración inicial de los HTP influenció inversamente la biodegradación: 84, 72 y 55 %, respectivamente, en 60 días. El aumento de la concentración inicial de HTP también influenció negativamente la degradación del CRH, no siendo observado efecto alguno en la degradación del BaP.

Key words: bioremediation, biodegradation, oily residues, polycyclic aromatic hydrocarbons, intemperized soil

ABSTRACT

This study evaluates the bioremediation of a tropical soil from tropical climate, contaminated with weathered oily residues. Three initial concentrations of total petroleum hydrocarbons (TPH) were tested: 15.3, 19.0 and 29.2 g/kg of soil. The experiments were conducted over 60 days, by monitoring the following param-eters: moisture, pH, concentration of total heterotrophic bacteria, total fungi, total petroleum hydrocarbons and polycyclic aromatic hydrocarbon: benzo(a) pyrene (BaP) and chrysene (CHR). The initial concentration of TPH inversely influenced biodegradation: 84, 72 and 55 % respectively, during 60 days. By increasing the initial concentration of TPH, the degradation of CHR was also influenced; however, no effect on the degradation of BaP was observed.

Rev. Int. Contam. Ambie. 29 (1) 21-28, 2013

T.C. Ferreira do Nascimento et al.22

INTRODUCCIÓN

El sector del petróleo y del gas natural genera varios residuos peligrosos y, entre estos, los residuos empetrolados que pueden presentar compuestos tóxicos como los hidrocarburos aromáticos policí-clicos y ser inflamables. Los residuos empetrolados son generados en las operaciones normales de las unidades, en las paradas para mantenimiento y en los casos de emergencia ambiental, incrementando su cantidad. La gestión ambiental de los residuos con miras a minimizar los efectos adversos de los eventos de contaminación ambiental por residuos aceitosos, el desarrollo sostenible y los costos relacionados con las operaciones de almacenamiento, transporte y tratamiento de los residuos son preocupaciones actuales, tanto del sector industrial, como del sector académico.

La incorporación de residuos aceitosos en un suelo constituye una ruta para el tratamiento de estos materiales; sin embargo, cuando es mal conducida genera pasivos ambientales. Los derrames de petróleo crudo y sus derivados y el almacenamiento inade-cuado de residuos también aumentan el valor de lo que corresponde a pasivos ambientales del sector del petróleo y del gas natural, impulsando investigacio-nes para el desarrollo de alternativas efectivas, tanto desde el punto de vista técnico como desde el punto de vista económico.

La biorremediación de suelos contaminados es una técnica de tratamiento que tiene como objetivo utilizar el potencial de la micro biota autóctona o exógena, para degradar los compuestos orgánicos constituyentes de los residuos, con la consecuente disminución de la toxicidad. Esta tecnología está influenciada por factores internos y externos. Entre los factores internos se destaca el genotipo de los microorganismos y entre los externos, la temperatura, la aireación, el tipo y la concentración de los con-taminantes, su grado de intemperismo, así como las fuentes y las concentraciones de los macronutrientes (Huang et al. 2004, Zahed et al. 2010). Esta tecnolo-gía es, en general, eficiente y económica cuando se compara con las alternativas físicas y fisicoquímicas convencionales de tratamiento de suelos (Oliveira y de França 2005).

Se ha realizado estudios buscando la biorremedia-ción de suelos impactados por hidrocarburos como una función de factores externos, como el tipo y la concentración de fuentes de N y de P, el pH y la pre-sencia de surfactantes (Venosa y Zhu 2003, Das et al. 2008). Por otra parte, se encuentran pocos estudios sobre el efecto del intemperismo de los residuos

empetrolados en los suelos, en especial suelos de clima tropical, y de la concentración de estos residuos intemperizados sobre la biorremediación (Trindade et al. 2005). Esto aún a sabiendas que este es un problema contemporáneo para los países en desarro-llo, considerando el número de áreas contaminadas abandonadas y los aspectos de sostenibilidad, salud y ambiente.

Las consideraciones ambientales y económicas dieron impulso a la elaboración de esta investi-gación, la cual buscó verificar la eficacia de la biorremediación de un suelo tropical contaminado con distintas concentraciones de residuos aceitosos intemperizados.

MATERIAL Y MÉTODOS

El suelo utilizado en este estudio es proveniente de un área de landfarming usada para el tratamiento de residuos aceitosos de la industria de petróleo y gas, y recibió residuos petrolizados hace un poco más de cinco anos. Este sitio está cerca de la línea del ecuador. Se registran, en el área, temperatura media de 27 ºC, humedad relativa entre 75 y 86 % y precipitación entre 1750 y 2500 mm. De acuerdo con estos datos, el área es típica de un clima tropical.

Para ejecutar el muestreo de suelo el área del landfarming fue dividida en tres lotes justificando las tres diferentes concentraciones de HTP ob-servadas. El suelo, fue colectado de siguiendo la normativa brasileña vigente, ABNT NBR (10004). Las muestras de suelo utilizadas para los ensayos de biorremediación fueron acondicionadas en cajas de cloruro de polivinilo (PVC), con capacidad para 20 litros y refrigeradas a 4 ± 1 ºC, con el fin de realizar los ensayos de biotratamiento.

Granulometría, humedad, pH y capacidad de retención de agua (CRA)

La distribución granulométrica del suelo fue eje-cutada de acuerdo con la Norma Brasileña (ABNT NBR 7180 1984), que corresponde a la homogenei-zación de la muestra, secado al aire, paso por una serie de tamices y finalmente, sedimentación de los granos en solución de orto-polifosfato de sodio. La humedad fue determinada mediante el uso de crisoles de porcelana y un analizador de humedad por infra-rrojo, Gehaka, mod. IV-2000, hasta peso constante. Los valores de pH de los suelos fueron determinados mediante suspensiones en agua destilada. Se utilizó el procedimiento descrito por Embrapa (1979), con potenciómetro Digimed, mod. DM-20. La CRA de

BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS 23

las muestras de suelos fue determinada siguiendo la metodología descrita por Watwood et al. (1991). Las determinaciones fueron llevadas a cabo por triplicado.

Hidrocarburos totales de petróleo (HTP) y HAPPara la determinación de HTP y sus fracciones

fue utilizada la metodología USEPA 8015, que determina compuestos orgánicos no halogenados a través de cromatografía gaseosa, acoplada a un detector de ionización de llama. Los extractos orgá-nicos fueron obtenidos siguiendo el método USEPA 3540C (Soxhlet extraction) y la preparación previa a la cromatografía siguió el método USEPA 3630C (Silica gel cleanup). Los valores de HTP consideran los resultados de HTP en las fracciones de gasolina, querosén, diesel y aceite combustible, así como la fracción no resuelta en el cromatograma.

Fueron determinados los tenores de criseno (CHR) y de benzo(a)pireno (BaP) por cromatogra-fía gaseosa acoplada a espectrometría de masas, de acuerdo con el método USEPA 8270 C.

Los extractos orgánicos fueron obtenidos si-guiendo el método USEPA 3540C y la preparación previa a la cromatografía siguió el método USEPA 3630C. Todas las determinaciones fueron realizadas por triplicado.

Cuantificaciones microbianasLas cuantificaciones de los grupos microbianos,

bacterias heterotróficas totales y hongos totales en las muestras de suelo fueron llevadas a cabo utilizando la Técnica Pour Plate. Se agregaron 10 g de suelo a 90 mL de solución salina (NaCl al 0.9 %) y se promovió la agitación en batidora (Tecnal - TE-420) por 15 minutos a 150 rpm. Alícuotas de 1 mL fueron sometidas al procedimiento de diluciones decimales sucesivas, cultivadas en medio de cultivo específico para cada grupo microbiano. Para la cuantificación de hongos se utilizó el medio agar Sabóraud (Vetec, Río de Janeiro, Brasil), con 2 % de glucosa y suplemen-tado con ampicilina 50 mg/L (Cimed, Pouso Alegre Brasil). Para la cuantificación de bacterias se utilizó el medio agar nutriente (Merck, Darmstadt, Alema-nia), suplementado con nistatina, 50 mg/L (Teuto, Anápolis, Brasil). Las placas fueron incubadas en estufa bacteriológica a 30 ± 1 ºC, por 48 horas para el crecimiento y conteo de bacterias y por 120 horas para el crecimiento y conteo de hongos. Después de ese periodo los resultados fueron expresados en unidades formadoras de colonia por gramo de suelo (UFC/g de suelo). Todas las determinaciones y ex-perimentos fueron realizados por triplicado.

BiorremediaciónLos ensayos de biodegradación fueron realizados

en reactores de polietileno con dimensiones de 20 cm × 20 cm × 10 cm (largo, ancho, alto). Cada reactor fue alimentado con 2 kg de suelo contaminado y se procuró mantener las mismas condiciones de hume-dad en todos los reactores, fracción de 70-80 % de la capacidad de retención de agua, correspondiendo a valores de humedad entre 20 a 25 %. Cada uno de los tres ensayos de biorremediación fue realizado por triplicado, totalizando nueve tratamientos.

Para el monitoreo del bioproceso fueron vigilados los siguientes parámetros: humedad, pH, concentra-ción de bacterias heterotróficas totales (BHT), hongos totales (HT), hidrocarburos totales de petróleo (HTP) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP): benzo(a)pireno (BaP) y criseno (CHR). Todos los resultados analíticos son presentados como la media de tres ensayos.

Los resultados de las medias de biodegradación de HTP (en un delineamiento completamente ca-sualizado) fueron sometidos al análisis de varianza (ANOVA) y a la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey, a 5 % de significancia. En todos los casos, los análisis estadísticos fueron realizados con el auxilio del programa computacional Statistica, versión 5.5 (Statsoft Inc).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de algunos parámetros de la carac-terización física y química del suelo se presentan en el cuadro I. Se trata de un suelo con 28 % de ma-teriales finos. Considerando que las arcillas y limos presentan elevada área superficial, los fenómenos de adsorción de los contaminantes en esos materiales son bastante favorecidos, lo cual dificulta el proceso de solubilidad de esas moléculas y, por consiguiente,

CUADRO I. CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y QUÍMICA DEL SUELO

Parámetro Resultado

pH (en H2O) 6.9 ± 0.2Arcilla (%) 13 ± 1Limo (%) 25 ± 2Arena Fina (%) 18 ± 1Arena Media (%) 28 ± 2Arena Gruesa (%) 12 ± 1CRA (%) 32 ± 1P total (mg P/kg de suelo) 16 ± 1N total (mg N/kg de suelo) 680 ± 50HTP (mg/kg de suelo) 29179 ± 450


la biodegradación. Por otro lado, el suelo presentó un porcentaje importante de materiales arenosos, 58 %, que puede favorecer la biodegradación por una mejor transferencia de masa del oxígeno del aire atmosférico y el suelo, debido a la porosidad (Marin et al. 2005, Trindade et al. 2005). El pH próximo a la neutralidad se considera adecuado para la actividad de degrada-ción de hidrocarburos por bacterias y hongos (Franco et al. 2004). La CRA, aproximadamente del 30 %, es compatible con suelos limosos, así como también el pH levemente ácido que es coincidente con la presencia de minerales de arcillas, concordando con los resultados granulométricos.

En los cromatogramas fueron detectados com-puestos orgánicos en la fracción de gasolina (HTP GRO) 5 %, de diesel (HTP DRO) 5 %, y de lubri-cantes (HTP ORO) 90 %. La poca concentración de compuestos de cadenas menores indica, con-juntamente con la ausencia de compuestos lineares resueltos y a la elevación de la línea de base, el proceso de intemperismo de los residuos, incre-mentando la resistencia del residuo y la dificultad para el biotratamiento. El intemperismo se refiere al resultado de procesos químicos, biológicos y físicos sobre el residuo, que pueden afectar el tipo de compuestos que permanecen en el suelo. Las muestras presentaron HTP inicial de 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo y estas elevadas concentraciones del contaminante dificultan aún mas la biorreme-diación, conforme lo reportado por Del´Arco y de França (2001).

En todos los ensayos de biorremediación el pH inicial del suelo fue de aproximadamente 6.9 ± 0.1 decayendo a 6.2 ± 0.1 a lo largo de los 60 días del proceso. El metabolismo de las fracciones leves y pesadas de petróleo produce diversos tipos de ácidos orgánicos que pueden reducir el pH del suelo y este hecho da evidencias de una microbiota metabólica-mente activa (Watson et al. 2002).

Durante los ensayos, la humedad de los suelos fue mantenida entre 70 y 80 % de la capacidad de retención de agua; intervalo considerado ideal para los procesos de biodegradación de acuerdo con Ra-mírez et al. (2009). Estos valores de humedad fue-ron mantenidos ya que se encuentran en la fracción óptima que favorece el proceso de biodegradación aeróbica de hidrocarburos en suelos ya que la hu-medad en exceso puede dificultar la dispersión del oxígeno (Marin et al. 2005). Las temperaturas de los suelos no fueron controladas para reducir costos de proceso y se mantuvieron en 30 ± 2 ºC. De acuerdo con Oliver y Magot (2005), en temperaturas entre 25 ºC y 30 ºC se desarrolla una gran variedad de

especies de microorganismos capaces de oxidar hidrocarburos. Muchos ensayos de laboratorio han demostrado que la biodegradación de hidrocarburos por microorganismos ha sido llevada a cabo de ma-nera más conforme con temperaturas en el intervalo de 20 a 35 ºC (Stempwort y Biggar 2008).

Las pérdidas abióticas fueron estimadas como menores al 10 % y, en las condiciones establecidas en esta investigación, posiblemente son el resultado de la volatilización y fotooxidación, como describe la literatura consultada (Imfeld et al. 2009).

La evolución de la biodegradación de los HTP del suelo disminuyó con el aumento de los niveles de contaminación (fig. 1). En 30 días de proceso, la de-gradación en todos los bioreactores conteniendo 15.3 o 19 g/ kg alcanzó el mismo nivel, aproximadamente 55 %, indicando que había una tolerancia de los mi-croorganismos autóctonos a estos niveles de conta-minación. En este mismo período, la biodegradación de los contaminantes fue 10 % menor en cuanto se operó con el nivel de contaminación de 29 g/kg que alcanzó 45 % de remoción solamente a los 60 días de proceso. Esta menor actividad microbiana está probablemente relacionada con la susceptibilidad de algunas cepas al contaminante. En 60 días, solamente en los ensayos con suelo conteniendo 15.3 y 19.0 g/kg fueron alcanzados HTP residuales por debajo del límite de intervención estipulado por la Legislación Brasileña para suelos en áreas industriales, que es de 5 g/kg de suelo (Brasil 2009).

El análisis del perfil cromatográfico de los estratos de los suelos permite verificar que, en las tres condi-ciones estudiadas, los compuestos en la fracción de HTP GRO fueron totalmente biodegradados y que la degradación del HTP ORO fue superior a 50 %, a pesar de ser considerado resistente, indicando la adaptación de la microbiota nativa.

40

50

60

70

80

90

100

30 60Tiempo (días)

Bio

degr

adac

ión

(%)

HTP inicial 15.5 g/kg

HTP inicial 19.0 g/kgHTP inicial 29.2 g/kg

Fig. 1. Porcentaje de biodegradación de HTP, en 30 y 60 días de proceso, en los ensayos de biorremediación con HTP inicial 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo


Trindade et al. (2005) estudiaron la biodegradación de petróleo crudo y petróleo crudo intemperizado en suelo tropical y verificaron que la facilidad con que los hidrocarburos pueden ser removidos de los suelos varía inversamente con el intemperismo del contami-nante. Del´Arco y de França (2001) trabajaron en la biorremediación con suelo arenoso contaminado con petróleo árabe liviano, en concentraciones de HTP no superiores a 14 g/kg de suelo, debido a los efectos inhibidores del contaminante. En el presente trabajo, la concentración de hidrocarburos de aproximadamente 29 g/kg de suelo tropical estudiado no fue inhibidora, revelando la importancia de la realización de estu-dios específicos para cada sistema y el potencial de la microbiota autóctona de los suelos. Dado que fue utilizado suelo de un área de landfarming para trata-miento de residuos aceitosos, la microbiota del suelo ya estaba adaptada, contribuyendo a la remoción de los hidrocarburos intemperizados.

El comportamiento de los micro-organismos revela informaciones respecto de la presencia o ausencia de las variables de la biodegradación y, además, la interpretación de los resultados es de un valor con-siderablemente importante para el entendimiento del

proceso (Pala et al. 2006). La concentración inicial de BHT y HT totales fue similar en todos los ensa-yos (Fig. 2a y 2b). En la mayoría de los ensayos las concentraciones de BHT y de HT alcanzaron valores máximos en siete días de proceso, disminuyendo a lo largo del tiempo y alcanzando las menores concen-traciones microbianas en 30 días de proceso, pero en valores comparables a los reportados en la literatura consultada para suelos impactados con petróleo y sus derivados (Oliveira y de França 2005). El análisis de las figuras 2a y 2b, conjuntamente con la figura 1, permite además concluir que el suelo impactado no tenía concentración inhibidora de macronutrientes (N y P), que son elementos importantes para la producción de biomasa y, por lo tanto, biodegradación en condi-ciones aeróbicas, provocada por la agitación del suelo en los ensayos. Se verifica además que la presencia de mayores concentraciones del contaminante provocó la reducción de la concentración de HT y de BHT a lo largo del proceso; sin embargo, el perfil de las curvas se mantuvo. En los ensayos llevados a cabo con HTP inicial de 29.2 g/kg fueron obtenidas las menores concentraciones de HT, a partir de 30 días de proceso, sin comprometer la biodegradación de los

Fig. 2. Evolución del crecimiento microbiano durante la biorremediación (a) BHT; (b) HT

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

1.00E+07

1.00E+08

1.00E+09

BH

T (U

FC/k

g de

sue

lo)

HTP Inicial 15.3 g/kg



1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (dias)

HT

(UFC

/kg

de s

uelo

)


contaminantes. Esto corrobora lo expresado por Pérez-Armendáriz et al. (2010) y por Tortella et al. (2005) que reportan hongos filamentosos como microorga-nismos con elevado potencial hidrocarbonoclástico, principalmente en la degradación de las fracciones más pesadas del petróleo, como aquellas predominantes en los residuos aceitosos. La reducción de las concentra-ciones de los grupos microbianos monitoreados puede también ser atribuida a la reducción o agotamiento de los nutrientes requeridos para la asimilación del carbono (Ballaminut y Matheus 2007).

En el cuadro II se encuentran los resultados de las comparaciones múltiples de las medias de biode-gradación de HTP en 30 y en 60 días de proceso. En 30 días, el ANOVA indicó que la diferencia mínima significativa para la biodegradación fue 5.34 % con un desvío estándar de 2.13. La prueba Tukey comprobó, con base en las comparaciones múltiples de las medias, para p < 0.05, que la biodegradación es diferente sólo entre los dos niveles más altos de concentración de HTP estudiados. Sin embargo, en dicho periodo de tiempo le suelo no pudo ser clasificado como tratado, con base en la legislación brasileña.

El ANOVA, realizado con los datos de biodegrada-ción en 60 días, llevó a un valor de diferencia mínima significativa para la biodegradación de 7.16 %, con un desvío estándar de 2.86 %. Complementariamente, con el conjunto de datos obtenidos con la prueba de Tukey, es posible verificar que en este periodo de tiempo las biodegradaciones porcentuales obtenidas son estadísticamente diferentes, a un nivel de signifi-cancia de 5 %. De esta manera, está confirmando que la concentración inicial del contaminante influenció a la biodegradación de los hidrocarburos, tanto a los 30 como a los 60 días de proceso. Nuestros resultados corroboran aquellos reportados por Del’Arco y de França (2001) e indican la importancia del control de la concentración inicial de HTP para el éxito del

tratamiento. Se verifica además, que la biodegrada-ción es inversamente proporcional a la concentra-ción inicial del contaminante, probablemente por la inhibición del metabolismo celular y formación de intermediarios tóxicos (Alexander 1999, Del’Arco y de França 2001).

La biorremediación también fue analizada con relación a la biodegradación de los HAP CHR y BaP (Cuadro III). El análisis del cuadro permite veri-ficar que el aumento de la concentración inicial de hidrocarburos en el suelo influyó negativamente en la biodegradación del CHR, no siendo observado efecto en la degradación del BaP. Los HAP son compuestos tóxicos y moléculas de interés ambiental en suelos impactados (Jaques et al. 2007). Su biodegradación depende de muchos factores como biodisponibilidad, muy influenciada por la matriz del suelo y el intempe-rismo del contaminante. El CHR posee cuatro anillos aromáticos en cuanto que el BaP posee cinco anillos condensados y, por lo tanto, mayor peso molecular. Varios estudios comprueban que los HAP de alto peso molecular son menos biodegradables cuando son comparados con los de menor masa molecular (Alexander 1999, Vasconcelos et al. 2011). Otro hecho que se debe considerar es el intemperismo del suelo que aumenta la adsorción de contaminantes orgánicos hidrofóbicos, como los HAP en la matriz sólida, diminuyendo la velocidad y la extensión de la biodegradación. Como consecuencia, después de un período inicial de tratamiento, la concentración de algunos HAP puede tender a estabilizarse en un valor residual, como lo observado para el caso del BaP. Una de las hipótesis mas aceptadas propone que los fenómenos de transferencia de contaminantes cons-tituyen la etapa limitante del bioproceso (Nocentini et al. 2000). En tales situaciones, la concentración residual del contaminante depende mayormente de las partículas finas de los suelos y del intemperismo del contaminante.

CUADRO III. BIODEGRADACIÓN DEL CRISENO Y DEL BENZO(A)PIRENO EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE HTP EN EL SUELO

HTP inicial(g/kg de suelo)

Biodegradación (%)

CHR BaP

15.3 66 ± 5 (6.9) 37 ± 4 (3.5)19.0 53 ± 4 (7.3) 29 ± 2 (4.5)29.2 19 ± 2 (7.8) 35 ± 3 (8.1)

Nota: Los números presentados entre paréntesis son de la concentración inicial media del HAP, en mg/kg

CUADRO II. PRUEBA DE TUKEY, DIFERENCIAS SIGNI-FICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS REALIZADOS

HTP inicial(g/kg de suelo)

MSB*

30 días 60 días

15.3 54.93 a** 83.83 c**19.0 55.03 a** 71.97 d**29.2 45.07 b** 55.28 e**

Nota: *MSB – media significativa de la biodegradación (p < 0.05)** Letras minúsculas distintas, en cada columna, indican medias significativamente diferentes


CONCLUSIÓN

Los resultados de biodegradación de HTP en-contrados son alentadores y revelan el éxito del biotratamiento propuesto para tratamiento de los suelos impactados con altas concentraciones de residuos aceitosos intemperizados. El aumento de la concentración inicial de hidrocarburos tota-les influyó negativamente. Al final de 60 días de bioproceso, los suelos con las dos concentraciones menores ensayadas de HTP inicial fueron consi-derados tratados, de acuerdo con la Legislación Brasileña (HTP < 5 g/kg). La concentración inicial de HTP también influyó negativamente en la bio-degradación del CHR, no siendo observado efecto en la degradación del BaP, probablemente debido a la biodegradación preferencial de los HAP de menor peso molecular, sumado al intemperismo del suelo estudiado, contribuyendo la adsorción de este compuesto en las partículas finas del suelo, dificultando la biodegradación.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y a PETROBRAS por el apoyo financiero.

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POTENTIAL OF GLYCEROL AND SOYBEAN OIL FOR BIOREMEDIATION OF WEATHERED OILY-SLUDGE CONTAMINATED SOIL

a Nascimento, T. C. F.;

b Oliveira, F. J. S.;

a França, F. P.1

a Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, Brazil

b Petróleo Brasileiro S.A., Rio de Janeiro, Brazil

ABSTRACT The bioremediation of petroleum-contaminated soil was investigated on laboratory scale. This work evaluated the effect of co-substrate addition in tropical climate soil highly contaminated with oily residue. Glycerol and soybean oil were used as auxiliary co-substrates for contaminant degradation. Three different concentrations of co-substrate were tested, and the experiments were carried out over 60 days. The following parameters were monitored: humidity, pH, total heterotrophic bacteria, total fungi, total petroleum hydrocarbons (TPH), and the concentrations of benzo[a]pyrene and chrysene. The soil supplementation with renewable co-substrates improved the efficiency of the biodegradation TPH, with removals of 85% and 83% for glycerol and soybean oil, respectively, compared to a 55% removal yielded by the biodegradation process without supplementation. The use of glycerol increased Chrysene and Benzo[a]pyrene biodegradation by 50%, while soybean oil supplementation increased their removal by 36%.

KEYWORDS bioremediation; biodegradation; oily waste; glycerol; soybean oil

1 To whom all correspondence should be addressed.

Address: Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Athos da Silveira Ramos, 149, Bloco E, Sl E-201 - Ilha do Fundão Rio de Janeiro- Brazil - CEP 21941-909 Telephone / Fax: +55 21 2562-7621 / +55 21 2562-7567 | E-mail: [email protected] doi:10.5419/bjpg2012-0004

mailto:[email protected]


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1. INTRODUCTION

One of the greatest unsolved issues in the oil and natural gas industry is the adequate disposal of oil residues, such as tank slops and sludge, generated in refinery thermal units. The costs related to sustainable and efficient treatment and disposal procedures for these residues are of great concern to both industrial and academic sectors. Society is concerned about these issues because all people are ultimately affected by hazardous events like oil spills that can happen on or offshore.

The biodegradation of oily waste into a contaminated soil is a recently developed treatment route. The objective of this treatment is to use the potential of natural soil microbiota to degrade the organic compounds in oily waste, decreasing its toxicity whenever adequate physical and chemical conditions for biodegradation are present (Huang et al., 2004). Biotechnological treatments not only are energy highly efficient but also cost less than conventional treatments. These treatments offer a large range of applications in terms of types and concentrations of contaminants (Oliveira and de França, 2005). While bioremediation is known for its low cost and its efficiency, it can be influenced by several factors, such as microbiota, climate, the weathering of contaminants, and the concentrations of organic compounds (Das et al., 2008; Marin et al., 2005). Soil structure is another important factor that influences bioremediation, as the solid matrix affects the availability of contaminants for the microbiota. For instance, the bioremediation of weathered soil with high concentrations of clay and silt can be difficult due to the decreased availabilities of the pollutants (Chaîneau et al., 2003; Gong et al., 2008). Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are toxic compounds that have become an environmental issue due to their high concentration in oily residues, being carcinogenic, and accumulating biologically (Haritash and Kauship, 2009). Additionally, the chemical structure of the 16 priority PAH listed by the United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA) pollutant list may favor the sorption in soil particles, decreasing removal of the pollutants (Trindade et al., 2005).

A method to enhance biodegradation of hydrocarbons in natural soils may be the utilization of co-substrates, which can either play the role of

alternate carbon source or act as mass transfer agent between the liquid phase of the soil and the solid matrix (Huang et al., 2004; Mellendorf et al., 2010). Commercial glycerol (GLY) and soybean oil (SBO) are renewable and low cost co-substrates, used to enhance process efficiency without increasing significantly bioremediation costs. This work investigates the potentials of GLY and SBO as auxiliary co-substrates in the bioremediation of a tropical soil with highly concentrated with weathered oily waste contamination.

2. MATERIAL AND METHODS

Soil originated from a landfarming area was collected from the Brazilian oil and gas industry located in the north of the country. All the samples were taken at a depth of 15cm from the surface.

2.1 Physical analysis

Soil size distribution analysis was performed using conventional screen procedures for the separation of stones and sand. Screening was followed by sedimentation of fine materials in sodium ortho-phosphate solution. Soil water content was determined using porcelain crucibles and an infrared humidity analyzer. Soil pH values were measured in 1:1 (w/w) distilled water suspensions. The water holding capacity (WHC) of the soil samples were determined by weight analysis (Watwood et al., 1991).

2.2 Chemical analysis

To determine Total Petroleum Hydrocarbon (TPH), the soil samples were supplemented with deuterated tricontane. Samples were submitted to 16 EPA priority determinations, and deuterated PAH compounds were used as standards. The samples were subjected to Soxhlet extractions with ultra pure methylene chloride for 16h according to EPA Method 3540C (EPA, 1996). The extracted phase was submitted to a cleanup procedure in a silica gel chromatographic column according to EPA Method 3630 (EPA, 1996). The sample volume was reduced to 1mL under N2. TPH was measured following EPA Method 8015 (EPA, 1996) using a Thermo Finnigan Focus gas chromatograph equipped with a DB-5 capillary column and a flame ionization detector. PAH, on the other hand, were quantified using EPA Method 8270 (EPA, 1996)


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with a Thermo Finnigan Focus gas chromatograph equipped with DB-5-MS column and a DSQ 2 Thermo Finnigan mass spectrometer operating at selective ion mode (less than 3 cycles/s).

Total nitrogen and total phosphorus were measured by conventional methods using a UV-Vis spectrophotometer according to methods described previously (Embrapa, 1997).

2.3 Microbiological count

Quantification of the microbiological groups present in the soil samples, both Total Heterotrophic Bacteria (THB) and Total Fungi (TF), was conducted using the pour plate Technique. A 0.9% (m/v) NaCl solution (90mL) was transferred to Erlenmeyer flasks containing 10g of soil samples, which were shaken for 15 min at 150 RPM. Samples (1mL) were submitted to a successive dilution procedure and cultivated in a culture medium specific to each microbial group. Agar Sabouraud with glucose 2% (m/v) was used for TF while the Agar Nutrient Medium was used for THB. The plates were placed in a bacterial incubator at 30±1oC for 48h for bacterial cell growth and counting and for 120h for fungi cell growth and counting. The results were expressed as colony-forming units per gram of dry soil (CFU/g dry soil). All microbiological counts and experiments were carried out in triplicate.

2.4 Bioremediation tests

Biodegradation experiments were conducted in polyethylene reactors 20cm long, 20cm wide and 10cm high. Contaminated soil (2kg) was added to each reactor, and the soil humidity was adjusted to

20-25%, which corresponds to 70-80% of the soil water holding capacity (Watwood et al., 1991).

THB, TF, TPH, PAH, pH, and moisture were monitored throughout the process. The potential of two co-substrates - GLY and SBO - in the biodegradation of TPH was tested. Commercial soybean oil was used. Each co-substrate soil was supplemented with 375, 750, and 1500mg of co-substrate per kg of soil. To guarantee oxygen supply, the soil was aerated manually every 72h using a glass stirring rod. Soil sampling for experimental analysis was carried out by collecting 10g of the soil from three equidistant locations. This was performed to mix and to homogenize the soil samples to get a unique final sample. To determine abiotic losses, control tests were carried out using a silver nitrate solution 10% (m/v) biocide instead of water in moisture control. All tests were conducted in triplicate, and the results were presented as the mean of the three independent experiments. Blank tests were executed without co-substrate supplementation using same procedure for water addition and aeration.

3. RESULTS AND DISCUSSION

Some parameters related to the physical and chemical characterization of the soil are presented in Table 1. The contaminated soil contained 38% fine materials (clay and silt). Although clay and silt have high surface areas, the sorption phenomenon of contaminants on these materials was favored, making it harder for contaminants less bioavaliable. Hydrocarbon degradation by bacteria and fungi were favored at pH values close to

Table 1. Physical and chemical characterization of soil.

Parameters Results

pH (in distilled water) 6.9 ± 0.2 Clay (%) 13 ± 1 Silt (%) 25 ± 2 Fine Sand (%) 18 ± 1 Medium Sand (%) 28 ± 2 Coarse Sand (%) 12 ± 1 Water Holding Capacity (WHC) (%) 32 ± 1 Total P (mg P/kg) 16 ± 1 Total N (mg N/kg) 680 ± 50 TPH (mg/kg) 29,179 ± 450


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neutral (Franco et al., 2004). A WHC of approximately 30% was consistent with weathered soils. A slightly acidic pH is characteristic of clay minerals, which was in agreement with the granulometric distribution observed.

The chromatogram of the soil organic extract (Figure 1) presented an Unsolved Complex Mixture (UCM) or organics, and neither pristane nor phytane were detected. The following organic compounds were present in the UCM: gasoline (TPH GRO), 4%; kerosene (TPH-KRO), 1%; diesel (TPH DRO), 5%; and lubricants (TPH ORO), 90% (w/w). The absence of pristane and phytane, the concentrations of TPH GRO and TPH DRO, and the elevated base line suggested that the weathering process was taking place in the petroleum waste, increasing the difficulty of biotreatment. In fact, the hazardousness of the residue is a result of chemical, physical, and biological processes occurring within the residue that may affect the types of compounds that remain in the soil. In addition, a high concentration of TPH was observed, which also makes bioremediation difficult (Del’Arco and de França, 2001). Among the 16 U.S. EPA priority PAHs, the soil contained chrysene (CHR) and benzo[a]pyrene (BaP) as predominant compounds, with concentrations of 21,640 and 41,048 µg/kg, respectively. Other PAHs were detected at concentrations very close to the sample quantification limit 1,083 µg/kg for each PAH.

All of the bioremediation assays began with a pH 6.9±0.1, decreasing slightly through the test period (60 days), reaching values of 6.5 for the tests without co-substrates and 6.0 for the tests with co-substrates. The decrease in pH may be explained by the fact that when the microbiota present in the soil are active, the metabolic breakdown of the light and heavy fractions of petroleum produces several types of organic acids which, in turn, reduce pH (Watson et al., 2002). It is also important to report that soil phyllosilicates, iron, and aluminium oxyhridroxides may provide some buffering capacity, contributing to the slight pH decrease.

During the tests, the soil moisture was kept between 70 to 80% of the WHC, which is considered ideal for biodegradation processes (Ramírez et al., 2009). Another reason to maintain the soil moisture in that range is that a greater percentage of water would decrease oxygen dispersion in the soil, demanding greater effort to accomplish the aerobic biodegradation of hydrocarbons (Marin et al., 2005). The aqueous phase in soil enhances the microbial solid/liquid interface, facilitates contaminant transport to the microbial cells, and permits the diffusion of microbial excreta. In addition, water competes for the same binding sites as PAH in the solid phase of soil, resulting in an increase in the degree of desorption of these organics.

Figure 1. TPH chromatogram of contaminated soil before bioremediation.


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To reduce process costs, soil temperatures were not controlled. During the 60-day experiment, soil temperatures remained at 30±2oC. Temperatures between 25 and 30°C are suitable for the growth of a great variety of species of microorganisms capable of oxidizing hydrocarbons (Olivier and Magot, 2005). Also, laboratory experiments indicate that hydrocarbons degradation by microorganisms is best conducted at temperatures between 20 and 35°C.

Abiotic losses were less than 10%. Abiotic losses are attributed to volatilization and photo-oxidation (Imfeld et al., 2009). Regardless of the co-substrate used, there was a decrease in soil TPH concentration during the 60-day process (Figure 2). Both GLY and SBO supplements, at concentrations

of 375 and 750mg of co-substrate per kg of soil, produced good results, provided that TPH were lower than 5 g/kg of soil, which is the limit for intervention for fine soils in industrial areas according to an international quality standard (Netherlands Government Gazette, 1994). When the soil was supplemented with 1500 mg of co-substrate per kg of soil, biodegradation was slightly reduced, most likely because soil microorganisms biodegraded the co-substrate to the exclusion of the contaminants (Silva et al., 2010). U.S. EPA Method 8015 reports the concentrations of extractable hydrocarbons, sometimes referred to as gasoline, kerosene, diesel, and oil range organics; or TPH GRO, TPH KRO, TPH DRO and TPH ORO, respectively, because the boiling point ranges of the hydrocarbons in each roughly correspond to

Figure 2. Bioremediation tests with glycerol and vegetable oil supplementation at 60 days.

50

60

70

80

90

Blank 375 750 1500

Bio

deg

rad

atio

n (%

)

Co-substrate concentration (mg/kg)

Glycerol

Soybean oil

Table 2. Biodegradation of Chrysene and Benzo[a]pyrene.

Co-substrate Biodegradation (%)

Type Concentration (mg of co-substrate/kg of soil)

CHR BaP

GLY

375 38 ± 2 30 ± 1

750 55 ± 2 53 ± 2

1500 19 ± 1 35 ± 2

SBO

375 38 ± 2 31 ± 2

750 41 ± 2 36 ± 3

1500 22 ± 2 17 ± 2


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those of gasoline (C6 to C10-12), kerosene (C11 to C14), diesel fuel (C8-12 to C24-26), and oil (C20 to C28-C30), respectively. The chromatographic profiles (Figure 3) from the soil organic extracts from soils that had been supplemented with co-substrates confirm that TPH GRO and TPH KRO were strongly biodegraded. TPH ORO was degraded to a great extent despite its recalcitrant nature, clearly indicating native microbiota adaptation.

In contrast to results reported by Del’Arco and de França (2001), who worked with sandy soil contaminated with Light Arab oil, with TPH concentrations not greater than 14g/kg of soil, due to inhibitory effects, the initial hydrocarbon concentration of approximately 29g/kg of tropical soil did not exhibit bioprocess inhibition, illustrating the need to investigate each system and the potential of its soil microbiota individually. This work used landfarming soil for the treatment of oily wastes; therefore, the native microbiota was already adapted, contributing to the removal of hydrocarbons.

Regarding CHR and BaP biodegradation, both SBO and GLY enhanced PAH biodegradation (Table 2). PAHs are very toxic compounds, being of great interest in contaminated sites. CHR has four aromatic rings while BaP has five condensed rings. These compounds are classified as PAHs of high molecular weight (Daugulis and McCracken, 2003), having low vapor pressures and tending to remain adsorbed on the soil fine material, inhibiting biodegradation. High molecular weight PAHs are less biodegradable than those having low molecular weights (Alexander, 1999; Atagana et al., 2006; Vasconcelos et al., 2011), which is related to the bioavailability of the compounds.

The use of co-substrates increased CHR and BAP removal, with a co-substrate concentration of 750 mg/kg resulting in the greatest removal of the two PAHs for both types of co-substrates. Another issue to be taken into account is the soil intemperism (with a soil fine particle content of 38% clay and silt), which increases the sorption of hydrophobic organic contaminants such as PAH in the solid matrix, decreasing the rate and extension of biodegradation. In intemperised soils, the transfer of pollutants is the step that limits the bioprocess (Nocentini et al., 2000). Glycerol is a water soluble carbon source that is more available as a nutrient to different types of microorganisms. Because GLY is able to enhance biosurfactant production, it can have a favored bioremediation process (Calvo et al., 2009; Silva et al., 2010). Soybean oil may have helped in the mass transfer of contaminants from the solid matrix to the microbiota present in the soil (Yapa et al., 2010). Hence, the effects of both co-substrates on soil biotreatment are clear.

The behavior of microorganisms is related profoundly to the biodegradation parameters, and the test results reveal a great deal about the process. The tests supplemented with 750mg of co-substrate per kg of soil are presented in Figures 4a and 4b. The initial concentrations of THB and TF were the same in all the tests, and the curve profiles were similar. THB and TF concentrations reached their maximum values after 7 days and then started to decrease, with THB concentrations reaching their minimum values after 60 days and TF concentrations reaching minimum values after 45 days for both co-substrates. These values are compatible with values reported in the literature for soils contaminated with petroleum and other refinery products (Oliveira and de França, 2005).

Figure 3. TPH chromatogram during bioremediation tests with glycerol and vegetable oil supplementation at 60 days.


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Figures 4a and 4b reveal that: 1) microbial concentrations increased during 7 days of the process, so the contaminated soil initially had non-inhibitory concentrations of macronutrients (N and P), which are important elements for biomass production; 2) co-substrate supplementation favored bacteria growth but only influenced fungal metabolism slightly, which exhibited similar profiles with or without supplementation with either co-substrate. This result is corroborated with findings reported in the literature (Atagana et al., 2006; Pérez-Armendáriz et al., 2010, Tortella et al., 2005), in which filamentous fungi were identified as microorganisms with great capabilities of degrading hydrocarbons, especially the heavy fractions of petroleum such as those found in oily sludge.

4. CONCLUSIONS

GLY and SBO were used as co-substrates in the biodegradation of oily waste in contaminated soil. At a concentration of 750mg of co-substrate per kg of soil, each co-substrate attained optimal TPH and PAH removals in terms of CHR and BaP removal from an intemperized soil. Sorption of organic hydrophobic contaminants to the solid matrix is favored in this type of soil, decreasing the rate and extension of biodegradation. The supplementation of co-substrates is of great importance because it can favor contaminant mass transfer from the solid matrix to microorganisms. The use of the co-substrates also increased THB and TF, enhancing soil biotreatment. As GLY is an abundant by-product of biodiesel production, its utilization as a

Figure 4. Microbial growth during bioremediation - (a) Total Heterotrophic Bacteria (THB) and (b) Total Fungi (TF).


50

co-substrate in contaminated soil bioremediation constitutes an important product destination. Finally, the potentials of GLY and SBO for biotreatment of soil were verified experimentally.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors wish to thank CNPq and CAPES for their financial support.

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