Transcrição e Processamento de RNA

Bibliografia:

Genes VII - Benjamin Lewin

Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha

Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.)

Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva

Instituto de Química- USP

Replicação

Transcrição

Tradução

Proteína

- Processo para síntese de todos os RNAs da célula

- Reflete o estado fisiológico da célula

- O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável

- Processo catalisado pelas RNAs polimerases

- Processo para síntese de todos os RNAs da célula

- Reflete o estado fisiológico da célula

- O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável

- Processo catalisado pelas RNAs polimerases

Transcrição Reversa

Replicação de RNA

Principais Tipos de RNA

RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas

RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo

RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos

tRNA

-Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo

-Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição

Bases modificadas nos tRNAs

Processamento do precursor do tRNA

tRNA maduro

Modificação das bases Processamen

to

Ribossomo bacteriano

70S (2,7 x 106)

Ribossomo Eucariótico

80S (4,6 x 106)

rRNAs:

Processamento do precursor do rRNA

Metilação das bases

Clivagem

RNAs maduros

RNA precursor 30S

Exemplos de rRNAs:

- Estrutura secundária com grampos e alças

- Bases metiladas

E.coli:

DNA fita codificadora

DNA fita molde

RNA transcrito

Transcrição

Síntese de RNA: formação da ligação fosfodiester envolve o ataque nucleofílico do 3’ OH da cadeia crescente no fosfato do carbono 5´do ribonucleosídeo trifosfatado que será incorporado

A RNA polimerase não requer um iniciador (primer) para iniciar a síntese do RNA

Bolha de transcrição

Fita molde

RNA polimerase

Direção da transcrição

Direção da transcrição

RNA polimerase de E.coli

RNA polimerase de E.coli

Ligação ao promotor

Centro catalítico

Reconhecimento específico do promotor

As RNA polimerases não tem mecanismo de correção de erro(taxa de erro 10-

5)

Promotores de genes bacterianos

Região -10

Região -35

Posição +1

Início da Transcrição

Reconhecimento e Ligação ao promotor

Deslocamento da subunidade sigma

Marcação do DNA com 32P

Tratamento com DNAse

Separar os fragmentos em uma eletroforese em gel de poliacrilamida. Visualizar fragmentos após exposição a filme de Raio-X

Regiões ligadas a RNA polimerase

Footprinting de DNA

Substituição do fator sigma controla a iniciação: Os distintos fatores sigma reconhecem promotores diferentes

Bolha de transcrição

Fita molde

RNA polimerase

Direção da transcrição

5´ 3´

Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação

Terminação da transcrição dependente da proteína Rho

Rho (46kDa, ativa como hexâmero) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase

Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação, Rho alcança a enzima

Rho desenrola o híbrido RNA-DNA

Sequência de Terminação dependente de Rho: rica em C

A RNA polimerase bacteriana é inibida por rifamicina (liga a subunidade beta)

A subunidade beta da RNA pol contem 5 sítios de ligação para rifamicina

O antibiótico previne o início da síntese da cadeia de RNA, imediatamente após a formação da primeira ligação fosfodiester

Agentes intercalantes inibem tanto a transcrição com a replicação, em procariotos e eucariotos

Actnomicina D

Acridina

0 gene geralmente é maior do que a sequência codificadora para a proteína

5´UTR5´UTR 3´UTR3´UTR

Proteína

UTR: Região não traduzida (Untranslated region)

0 mRNA bacteriano pode ser policistrônico (poligênico)

Distância intergênica (-1 a

40 bases)

Gene A Gene B

3´UTR3´UTR5´UTR5´UTR

fimfiminícioiníciofimfiminícioinício

Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos

Transcrição

Processamento

Transporte

Tradução

Citoplasma

Núcleo

RNA polimerases de eucariotos

RNA pol I Nucleólo rRNA Várias subunidades

RNA pol II Nucleoplasma

hnRNA (transcrito primário)snRNA

Várias subunidades

RNA pol III Nucleoplasma

rRNA 5StRNAs

Várias subunidades

RNA pol Mitocondrial

Mitocondria 01 subunidade

RNA pol de Cloroplastos

Cloroplasto Similar as bacterianas

Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição

A RNA polimerase II é inibida especificamente por -amanitina

Isolado do cogumelo Amanita phalloides

Altamente tóxico

Bloqueia a etapa de elongação

Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II

PromotorEnhancer Gene

Estrutura de Promotores da RNA Pol II

Promotores de genes transcritos pela RNApol II

Tata Binding Protein

Complexo TFIID

Promotores de genes transcritos pela RNApol III e I:

A TBP também é componente dos complexos de iniciação de transcrição destes promotores

Domínios dos Fatores de Transcrição

Domínio de Ativação

Domínio conector

Domínio de ligação ao DNA

Proteínas necessárias para transcrição a partir de promotores reconhecidos pela RNA Pol II

Pro

cari

ot

os

Eu

cari

oto

s

Splicing

Ad

ição d

o 5

´CA

P

(mod

ificação d

a e

xtr

em

idad

e 5

´do h

nR

NA

)

Etapas para geração do transcrito maduro

(hnRNA)

Transcrição e adição do 5´cap

Clivagem, poliadenilação e

splicing

Poliadenilação:

Adição da cauda poli (A) na extremidade 3´do hnRNA (transcrito primário): ~200 Adeninas

Sequencia sinal para poliadenilação

(hnRNA)

Gen

es e

ucari

óti

cos s

ão e

m g

era

l in

terr

om

pid

os p

or

intr

on

s

Splicing: remoção dos introns

Mamíferos tem maior número de exons/gene número de

Tamanho de introns em vertebrados é variado

Exons que codificam para proteínas são usualmente

pequenos

Remoção de introns pelo “spliceossomo”:

associação de ribonucleoproteínas pequenas (snRNPs)

formando um complexo de 3x103 kDa

AGGUAAGU-----Pyr---A--NCAGG

Auto-splicing:introns do grupo I

Auto-splicing: introns do grupo I

Auto-splicing: introns do grupo II