Faculdade de Medicina de Lisboa

Curso de Mestrado Integrado em Medicina

- Ano Lectivo 2012/2013 - 1º Semestre

MÓDULO I.I

Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento Humano e Genética

Aulas Teórico-Práticas

2

Aula1

A MOLÉCULA DE DNA: ESTRUTURA, MANIPULAÇÃO E ANÁLISE.

CLONAGEM MOLECULAR: CONCEITOS BÁSICOS.

Consultar no livro de texto recomendado: A molécula de DNA: estrutura e função pág. 172-178 Do DNA à proteína pág. 231-235 Manipulação e análise de DNA pág. 327-331 e 333-336 A MOLÉCULA DE DNA ESTRUTURA A estrutura da molécula de DNA foi descoberta conjuntamente por James Watson e

Francis Crick em 1953, o que lhes conferiu o Prémio Nobel da Medicina e Fisiologia

em 1962. Do ponto de vista químico, o DNA é um polímero de nucleótidos. Cada um

destes nucleótidos é constituído por três componentes: um grupo fosfato, uma pentose e

uma base azotada (adenina, timina, citosina ou guanina). Cada novo nucleótido liga-se

pelo grupo fosfato ao carbono 3’ da pentose do último nucleótido da cadeia por uma

ligação fosfodiester, repetindo-se o processo na direcção 5’ → 3’. De acordo com o

modelo proposto por Watson e Crick, a molécula de DNA é constituída por duas

cadeias de nucleótidos complementares e anti-paralelas, ou seja, com sentidos de

crescimento inversos e dispostas em forma de hélice. Esta dupla hélice mantém-se unida

devido à complementaridade das bases azotadas, que se ligam através de pontes de

hidrogénio.

MANIPULAÇÃO Digestão de DNA com enzimas de restrição

As enzimas de restrição são o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem

“cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível.

As enzimas de restrição fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam

ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. As enzimas de restrição usadas em

biologia molecular têm a grande vantagem de clivarem apenas as ligações entre

nucleótidos inseridos numa sequência específica. Existem comercializadas mais de 230

3

enzimas de restrição, cada uma das quais reconhece e cliva uma determinada sequência

de nucleótidos.

As enzimas de restrição identificam-se por uma nomenclatura própria. Por exemplo,

EcoRI refere-se à primeira (I) enzima isolada do género Escherichia (E) espécie coli

(co), estirpe RY13 (R) e Hind III à terceira enzima (III) isolada de Haemophilus

influenzae, estirpe Rd.

Ligação de moléculas de DNA

A ligação entre duas moléculas de DNA é catalisada por enzimas denominadas ligases

de DNA, que estabelecem ligações fosfodiéster entre extremidades 5’-fosfato e

extremidades 3’-hidroxilo adjacentes. Esta ligação ocorre preferencialmente quando as

moléculas de DNA possuem extremidades salientes e complementares entre si. Neste

caso, ocorre emparelhamento das extremidades de ambas as moléculas, facilitando a

acção da ligase de DNA.

ANÁLISE

Electroforese de DNA em gel de agarose

A electroforese em gel de agarose é o método utilizado por rotina para separar,

identificar e purificar fragmentos de DNA. A agarose é um polímero natural extraído do

agar. Os geis preparam-se fundindo a agarose na presença de um tampão apropriado. A

solução obtida é colocada num molde e deixada arrefecer até solidificar. Ao solidificar

forma-se uma matriz cuja densidade é determinada pela concentração da agarose.

Quando se aplica um campo eléctrico através do gel, o DNA carregado negativamente

migra em direcção ao ânodo. A velocidade de migração é determinada por um conjunto

de parâmetros, entre os quais o tamanho da molécula e a concentração da agarose. A

velocidade de migração é inversamente proporcional ao log10 do tamanho do fragmento

(em pares de bases, bp) e, para um mesmo tamanho de fragmento de DNA, a velocidade

de migração é maior num gel com menor concentração de agarose. A migração das

moléculas de DNA através do gel, depende ainda da voltagem aplicada; quanto mais

alta for a voltagem, mais rápida a migração. Para visualizar o DNA nos geis de agarose

utilizam-se corantes fluorescentes como por exemplo o brometo de etídio. Esta

substância possui grupos químicos que se intercalam entre as bases do DNA. Em

consequência, o corante ligado ao DNA fluoresce com mais intensidade do que o

4

corante livre, quando irradiado com luz ultravioleta. O brometo de etídio permite

detectar cadeias simples e duplas de ácidos nucleicos, tanto de DNA como de RNA.

Por convenção, os geis de DNA são lidos da esquerda para a direita, com os poços

colocados no topo. A área do gel perpendicular ao poço designa-se “pista” ou lane.

Portanto, ao olhar para uma pista analisam-se os fragmentos de DNA colocados no poço

correspondente. Fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma

distância no gel dando origem a bandas. Por convenção, o tamanho de cada fragmento

de DNA é expresso pelo número de pares de bases que o constituem (bp).

5

CLONAGEM MOLECULAR

A manipulação genética permite a criação de uma nova molécula de DNA, geralmente

pela recombinação de DNA de diferentes organismos, por meios artificiais, utilizando-

se enzimas conhecidas como enzimas de restrição, e a consequente produção de muitas

cópias de DNA recombinante. Este processo designa-se clonagem.

Os passos básicos numa experiência de clonagem molecular são os seguintes:

1. Insere-se o fragmento de DNA a ser clonado numa molécula de DNA com

capacidade de auto-replicação, denominada vector, originando uma molécula

de DNA recombinante.

2. O vector funciona com um veículo que introduz o DNA numa célula hospedeira,

geralmente uma bactéria, embora se possam usar outros tipos de células.

3. Uma vez no interior da célula hospedeira o vector multiplica-se, produzindo-se

inúmeras cópias idênticas, não só do vector mas também do fragmento de DNA

que ele contém.

4. Quando a célula hospedeira se divide, as cópias das moléculas de DNA

recombinante são transmitidas à descendência e ocorre novo ciclo de replicação.

5. Após um grande número de divisões celulares, uma colónia ou clone de células

hospedeiras geneticamente idênticas é gerado. Cada célula do clone contém

muitas cópias da molécula de DNA recombinante; o fragmento de DNA

introduzido na molécula de DNA recombinante diz-se agora clonado.

6. Para além da obtenção de múltiplas cópias idênticas de um fragmento de DNA,

a clonagem de um gene num vector adequado (vector de expressão) permite a

obtenção de grandes quantidades de proteína recombinante.

Vectores de clonagem

Os vectores de clonagem são moléculas de DNA que têm como função transportar o

DNA de interesse para a célula hospedeira. A introdução de DNA em bactérias recorre

normalmente à utilização de vectores plasmídicos. Estes vectores têm como base

plasmídeos naturais que são posteriormente modificados por técnicas de engenharia

genética, por forma a obter vectores de clonagem com as características mais vantajosas

para diferentes tipos de aplicações. As características mais importantes de um vector de

clonagem são:

Origem de replicação: permite que o vector, e consequentemente a molécula de

DNA recombinante, se mantenha na célula e seja transmitida à descendência.

Marca de selecção: a maioria dos vectores plasmídicos possui um gene que

confere resistência a um antibiótico. Assim, apenas as bactérias que possuem o

DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presença desse antibiótico.

Local de policlonagem: pequena sequência de DNA (~100 pb) que contém locais

de corte únicos para várias enzimas de restrição. É neste local que é introduzido o

fragmento de DNA que se pretende clonar.

Promotor: presente apenas em vectores de expressão e adjacente ao local de

policlonagem.

Exercício 1

Qual dos seguintes nucleótidos, quando incorporados pela DNA polimerase numa cadeia de DNA nascente, provoca uma paragem da elongação :

Exercício 2

Considere o cDNA do gene X cuja sequência é apresentada na seguinte figura 1.1.

Identifique na sequência:

a) extremidades 5’ e 3’ b) codão de iniciação (start) c) codão de finalização (stop) d) 5’UTR e 3’UTR e) os primeiros 10 aa obtidos após tradução (consulte o código genético

apresentado na Fig 1.2)

Figura 1.1 - cDNA do gene X

Figura 1.2 - Código genético

Exercício 3

Qual das moléculas de DNA II pode formar uma molécula de DNA recombinante com o

DNA I? Que enzima é necessária para a formação da ligação?

1 acatttgtat tcggatccac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 61 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 121 ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg 181 agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc 241 atggcaagta ttcgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg 301 gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat gctgagaact 361 tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagtattca 421 ccccaccagt gcaggctgaa ttccagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc 481 acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggat cctttgttcc 541 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 601 taataaaaaa gctttatttt cattgc

8

1 acatttgtat tcggatccac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 61 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 121 ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg 181 agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc 241 atggcaagta ttcgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg 301 gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat gctgagaact 361 tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagtattca 421 ccccaccagt gcaggctgaa ttccagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc 481 acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggat cctttgttcc 541 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 601 taataaaaaa gctttatttt cattgc

Exercício 4

Como identificar locais de restrição na sequência de DNA indicada?

http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

Exercício 5

Dê um exemplo de um análogo de um componente do DNA usado em Medicina.

Explique o seu mecanismo de acção e indique qual a doença que trata.

Exercício 6

Durante o estágio no laboratório de Biologia Molecular, um estudante isolou DNA

cromossómico de E. coli. RY13. Em seguida colocou a mesma quantidade desse DNA

em dois tubos diferentes e fez uma digestão com enzimas de restrição. A um dos tubos

adicionou Bam HI, e ao outro, Eco RI. Que resultados espera observar? Justifique.