Toxicidade in vitro da planta Pteridium aquilinum : avaliação em sangue bovino

Elcio Airton Fidelis1, Mary Anne Tomacheski1, Claudia Consuelo do Carmo Ota2

1 Acadêmicos do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2 Bióloga, Prof. Dnda. Universidade Tuiuti do Paraná Endereço para correspondência: Elcio Airton Fidelis, elcioairtonfidelis@hotmail.com RESUMO: O presente trabalho teve como objetivo avaliar a citotoxicidade do

extrato de Pteridium aquilinum em eritrócitos bovinos, obtidos de sangue

periférico. Foram avaliadas diferentes extratos obtidos a partir do broto, da

folha e broto/folha. Todos os extratos foram avaliados nas seguintes diluições

2:1; 1:1 e 1:2 (extrato + células). Os quais foram incubados com 2x 106 células

levados à agitação por 20 minutos. Em seguida foram feitas a contagem e a

viabilidade das células, em câmaras de Neubauer com auxílio de microscópio

de luz. Como também foi realizado o teste MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-

difenil brometo de tetrazolina), para verificar a viabilidade celular para possível

comparação das análises, através de três diluições.

Palavras-chave: Pteridium aquilinum, citotoxicidade, planta tóxica.

ABSTRACT .The present work had as objective to evaluate the cytotoxicity of

the extract of the toxic plant Pteridium aquilinum in bovine erythrocytes, gotten

of peripheral blood. Different extracts gotten from the sprout had been

evaluated, of the leaf and sprout/leaf. All the extracts had been evaluated in the

following dilutions 2:1; 1:1 and 1:2 (extract + cells). Which had been incubation

with 2x106 cells taken to the agitation for 20 minutes. After that the counting and

the viability of the cells had been made, in chambers of Neubauer with aid of

light microscope. As well as test MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl

bromide tetrazolina) was carried through to verify the cellular viability for

possible comparison of the analyses,through three dilutions.

Keywords: Pteridium aquilinum, cytotoxicity, toxic plant.

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INTRODUÇÃO

A planta Pteridium aquilinum é conhecida popularmente como

samambaia, samambaia das taperas e samambaia do campo (TOKARNIA, et

al 2000, 2002). É uma planta perene, rizomatosa, herbácea, ereta e ramificada,

medindo entre 50 a 180 cm de altura. (MARÇAL, 2002).

A P. aquilinum é muito conhecida como planta invasora, porém, no

Brasil, poucos sabem ou aceitam que ela é uma das plantas tóxicas mais

importantes. Ela é encontrada em regiões tropicais e temperadas. Distribui-se,

praticamente, por todo o Brasil, mas é encontrada principalmente na região sul

do país, como também há indícios de sua presença na América do Norte e

América Central, na Cordilheira do Andes e África (PAGE, 1976). Esta planta é

encontrada em solos ácidos, arenosos e de baixa fertilidade. Isto ocorre, devido

o excesso de hidratos de carbono armazenado em seu rizoma, ocorrendo

crescimento rápido e com propagação em matas ciliares, capoeiras, beiras de

matas e estradas (CRUZ, et.al. 2004).

Para o gado, um dos principais fatores que envolvem à ingestão da

planta é a superlotação do pasto e, principalmente, a fome. Os princípios ativos

tóxicos presentes na planta são responsáveis pelas intoxicações. Entre eles,

encontra-se o ptaquilosídeo um grupo glicosídeios norsesquiterpenos iludano

que causa intoxicação aguda. Este composto produz tumor intestinal e de

bexiga. E é principalmente encontrado nos brotos aéreos, caule subterrâneo e

folhas (MARÇAL, 2001). A toxicidade também varia em função do estágio de

crescimento da planta e da época do ano, sendo mais tóxica as plantas mais

jovens. As porções do caule que ficam enterradas e as folhas novas da

samambaia também contém o principio tóxico em concentração cinco vezes a

mais do que a encontrada nas folhas maduras (RIET-CORREA, et.al 2001).

Nos ruminantes, ocorrem duas síndromes principais. A ingestão das

plantas por duas a quatro semanas causa doença hemorrágica amplamente

conhecida como intoxicação por samambaia. A ingestão de quantidades bem

menores de samambaias durante muitos anos provoca hematúria enzoótica

bovina. (Hirono, et al. 1972)

Essa intoxicação pela samambaia em ruminantes manifesta-se pela

redução da atividade da medula, aumentando as fragilidades capilares,

ocorrendo hemorragia nas paredes da bexiga de forma intermitente, resultando

em perda contínua de sangue. As mortes são causadas pela anemia

decorrente dessa hemorragia (OTTO, et. al. 2002).

Inicialmente, ocorrem perdas da condição da saúde, secura e falta de

elasticidade da pele. Os sintomas clínicos manifestam-se de maneira súbita e

consistem em febre alta (40,5 – 43º C), diarréia intensa com disenteria ou

melena na maioria dos casos, sangramentos pelas narinas, olhos e vagina,

bem como salina pendente da boca (OTTO, et. al. 2002).

Deste modo este trabalho teve por objetivo verificar a toxicidade da

planta P. aquilinum em meio a eritrócitos bovinos, pelo teste de ação hemolítica

in vitro e pelo teste do 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina

(MTT).

MATERIAIS E MÉTODOS

Foram coletadas amostras da planta P. aquilinum, na Chácara

Domacoski (Rodovia dos Minérios, km 15,5, Almirante Tamandaré / PR). As

plantas, ainda na fase jovem, em desenvolvimentos (formação de brotos),

foram levadas ao Biotério do Jardim Botânico, situado na Rua Eng°. Ostoja

Roguski – bairro Jardim Botânico para sua identificação pelo biólogo Eraldo

Barbosa.

Estas amostras foram separadas para preparação de três extratos

(folha, broto e broto/folha) sendo maceradas com o auxílio de um gral. Depois

foram pesadas (para cada amostra) 5 gramas da planta para obter um extrato

de 5% com a solução de PBS (Phosphate Buffered Saline).

As amostras de sangue bovino foram coletadas em tubos específicos

com anticoagulante EDTA antes das avaliações. As amostras (n=5) foram

cedidas voluntariamente pela fazenda Veterinária da UFPR e por dois

proprietários situados na região de Almirante Tamandaré – PR.

Teste de avaliação hemolítica

A metodologia utilizada para a análise foi baseada nas análises de

PEQUENO (et. al, 2005), com algumas modificações.

As análises de toxicidade foram feitas em tubos de ensaio. Para cada

tubo de ensaio utilizado no experimento, foram feitas as seguintes diluições:

• 2:1 → Extrato + células.

• 1:1 → Extrato + células.

• 1:2 → Extrato + células.

Nas análises realizadas foram feitas em triplicatas, com cada uma

contendo os seguintes controles:

•Número de células 2x106.

•Número de células mais solução de PBS (controle negativo);

•Número de células mais solução hemolítica (controle positivo);

•Número de células mais extrato do broto P. aquilinum;

•Número de células mais extrato do broto e folha P. aquilinum; e,

•Número de células mais extrato da folha P. aquilinum.

Após as respectivas diluições, as amostras foram levadas à

incubação sob homogeneização contínua por 20 minutos em um agitador. Logo

após, foi feita a contagem das células com o auxilio da Câmara de Neubauer.

O corante utilizado para a avaliação da viabilidade celular foi o corante

Azul de Tripan à 0,4%. A viabilidade das células foi avaliada por observação

direta das preparações em Câmara de Neubauer, em microscopia óptica,

conforme a exclusão do corante. As células que se coraram em azul estavam

mortas, enquanto que as brilhantes e refringentes à luz internas quando da

contagem 99% das células linfóides estavam vivas.

Teste do MTT

A metodologia utilizada para a análise do MTT foi baseada nas análises

de PEREZ (et. al, 2008), com algumas modificações.

Após a coleta do sangue, foi feita a contagem de células na Câmara de

Neubauer com o corante Azul de Tripan à 0,4%. Cada amostra utilizada teve

uma concentração de células de 2x106.

As análises de toxicidade foram feitas em microtúbulos (ependorfs). As

amostras foram feitas em triplicatas e para cada variável utilizada foram feitas

as seguintes doses:

• Dose I → 1:2 (extrato+ células).

• Dose II → 1:1(extrato+ células).

• Dose III → 2:1(extrato+ células).

Após realizadas as dosagens, aguardaram-se 30 minutos. Logo adiante,

as amostras foram levadas à centrifugação a 1.200 rpm por 8 minutos, o

sobrenadante foi descartado. Foram pipetados 10 µl de MTT e 90 µl de meio

enriquecido a 5 % de solução de soro fetal bovino em meio RPMI. As amostras

foram encubadas por 3 horas a 37 º C em uma estufa.

Logo após a incubação, as amostras foram levadas à centrifuga nas

mesmas condições anteriormente citadas. O sobrenadante foi desprezado. E

as amostras foram ressuspensas com 100 µl da solução DMSO. As amostras

foram colocadas em placa ELISA, agitadas e analisadas em espectrofotômetro

(ELISA) em comprimento de onda de 550 nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os métodos de obtenção e técnicas empregadas permitiram verificar a

viabilidade das células e sua citotoxicidade nos extrato da planta Pteridium

aquilinum. A viabilidade das células pode ser verificada nos gráficos abaixo:

folha broto broto e folha0

20

40

60

80

100inicial2:11:11:2

animal

% d

e cé

lula

s vi

ávei

s

Gráfico 01: teste de avaliação hemolítica

Os resultados da análise de ação hemolítica no sangue bovino exposto

ao extrato da planta Pteridium aquilinum, encontram-se sumarizados no gráfico

01, no qual apresenta o número de células ainda viáveis nas seguintes

diluições: 2:1, 1:1, 1:2, para os extratos da folha, broto e broto/folha.

Foram evidenciados no gráfico, alterações nos resultados sobre a

toxicidade da planta nas seguintes proporções:

• Para o extrato folha/broto, foi verificado que na diluição 2:1,

apresentaram um resultado próximo a 20% de células viáveis, seguido

de 30% das folhas e 50% do broto, em comparação com o controle sem

a adição de extrato.

• Para o extrato da folha/broto, foi verificado que na diluição 1:1,

apresentaram um resultado próximo a 20 % de células viáveis, seguidos

de 30% das folhas e 70% do broto,em comparação com o controle sem

a adição de extrato.

• Para o extrato do broto, foi verificado que na diluição 1:2 apresentou um

resultado próximo à 40 % de células viáveis, seguidos de 45% das

folhas e 45% do folha/broto, em comparação com o controle sem a

adição de extrato.

Todos os resultados foram analisados conforme o padrão utilizado de

100% de células viáveis.

Gráfico 02. Teste avaliação MTT nas doses, controles positivo e negativo

(amarelo), dose 1:2 (preto), dose 1:1 (azul) e dose 2:1 (vermelho).

Os resultados da análise do MTT em sangue bovino contaminado com o

extrato da planta Pteridium aquilinum, encontram-se sumarizados no gráfico

02, no qual apresenta o número de células ainda viáveis nas seguintes

diluições:1:2 , 1:1 e 2:1 para os extratos da folha, broto e broto/folha.

Foram evidenciados no gráfico, alterações nos resultados sobre a

toxicidade da planta nas seguintes proporções:

• Para o extrato do broto, foi verificado que em todas as diluições ele foi o

mais tóxico dentre as variáveis.

• Para o extrato da folha, foi verificado que a maior toxicidade ocorreu na

diluição 1:1, seguido da diluição 1:2 e 2:1.

• Para o extrato da folha/broto, foi verificado que na diluição 1:2

apresentou a maior toxicidade, seguido da diluição 2:1 e 1:1.

Com relação as análises realizadas podemos verificar que há uma

grande toxicidade no sangue bovino com o extrato da planta P. aquilinum, por

não existir um tratamento eficaz dessa intoxicação aos bovinos o único

tratamento existente é profilático, que envolve apenas a remoção das

samambaias nas pastagens como também o abate do animal.

Por questões financeiras, o produtor leva o animal doente para

abatedouros, repassando essa toxicidade para consumidor final. Sendo este

tema um caso de saúde publica.

CONCLUSÃO:

Pode-se concluir através de ensaios preliminares que o extrato aquoso

do broto/folha da planta P. aquilinum , para o teste de hemólise, nas diluições

1:1 e 2:1 são os mais tóxicos, seguido do extrato da folha. E em comparação

com o teste do MTT, os extratos do broto foram os mais tóxicos, seguidos do

extrato broto/folha, conclusão obtida devido a presença de saponinas no

extrato aquoso do broto, pois esta interfere na parede celular hemolisando a

célula.

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