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Helena Alexandra António da Fonseca Estudo in vitro da toxicidade de corantes têxteis azo em Tetrahymena pyriformis Departamento de Zoologia/ Antropologia Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Outubro/ 2006

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Helena Alexandra António da Fonseca

Estudo in vitro da toxicidade de corantes têxteis azo

em Tetrahymena pyriformis

Departamento de Zoologia/ Antropologia

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Outubro/ 2006

Helena Alexandra António da Fonseca

Estudo in vitro da toxicidade de corantes têxteis azo

em Tetrahymena pyriformis

Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

para a obtenção do grau de Mestre em Ecologia Aplicada.

Departamento de Zoologia/ Antropologia

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Outubro/ 2006

AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer ao meu orientador, Professor Doutor Nelson Lima, da Universidade do

Minho, por me ter dado a oportunidade de realizar o trabalho de mestrado no Departamento de

Engenharia Biológica da Universidade do Minho, pela paciência e pelos conselhos científicos.

Gostaria de agradecer à orientadora Professora Doutora Maria Teresa Borges, da Faculdade de

Ciências da Universidade do Porto, pelos conselhos amigos, acompanhamento e pelo incentivo.

Queria deixar o meu obrigada à co-orientadora Doutora Ana Nicolau, da Universidade do

Minho, pela disponibilidade, apoio, compreensão, e por me ajudar a melhorar o meu

desempenho laboratorial.

Fica aqui o meu “obrigada” às colegas investigadoras da Micoteca pelo companheirismo, pela

ajuda e pela partilha de alguns momentos, que tornaram a minha estadia no laboratório ainda

mais agradável.

Queria ainda agradecer à minha amiga e colega de trabalho Magda, pela preciosa ajuda dada

na estruturação e na revisão bibliográfica; pelos conselhos “linguísticos” e pela companhia.

Finalmente, não posso deixar de agradecer aos meus pais e avó, responsáveis pelo

desencadeamento da minha inscrição no mestrado, pelo eterno apoio e compreensão… e claro

ao meu marido, Daniel, sem o qual não teria conseguido concluir o mestrado e que ao longo do

tempo sempre me ajudou a continuar e me encorajou a acabar.

A todos aqueles que, directa ou indirectamente, de alguma forma contribuíram para a

realização desta tese, o meu obrigada.

ÍNDICE GERAL

RESUMO…………………………………………………………………………………………………..v

ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………………………..vii

ÍNDICE DE TABELAS……………………………………………………………………………….…viii

I. INTRODUÇÃO GERAL…………..……………………………………………………………………1

2. TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA – BREVE ABORDAGEM……………………………....5

2.1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................6 2.1.MODOS DE ACÇÃO DOS TÓXICOS ..........................................................................................6 2.3.TESTES DE TOXICIDADE AQUÁTICA........................................................................................7 2.4. RELAÇÃO QUANTITATIVA ACTIVIDADE-ESTRUTURA (QSAR) E RELAÇÃO QUANTITATIVA ACTIVIDADE-PROPRIEDADE (QPAR) ...........................................................................................8 2.5. ORGANISMOS TESTE ..........................................................................................................9 2.6. MÉTODOS DE TESTES TRADICIONAIS....................................................................................9

2.6.1. Métodos agudos ou crónicos .....................................................................................9 2.6.2. Testes modificados, rápidos ou microbiotestes..........................................................9

3. TESTES DE TOXICIDADE COM PROTOZOÁRIOS…………………………………………….11

3.1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................12 3.2. OS CILIADOS COMO ORGANISMOS TESTE............................................................................12 3.3. TETRAHYMENA PYRIFORMIS: UMA FERRAMENTA NA TOXICOLOGIA ........................................14

3.3.1. Cultivo in vitro ..........................................................................................................14 3.3.2. Ensaios para avaliar o efeito tóxico de compostos xenobióticos. .............................15 3.3.3. Os ensaios fisiológicos toxicológicos .......................................................................15 a. Densidade celular e taxa de crescimento ...................................................................16 b. Mudanças comportamentais.......................................................................................16 c. Crescimento, mortalidade e viabilidade celulares........................................................17 3.3.4. Os ensaios bioquímicos toxicológicos......................................................................18

4. OS PROTOZOÁRIOS CILIADOS: BREVE ABORDAGEM DA SUA MORFOLOGIA, FISIOLOGIA E TAXONOMIA………………………………………………………………………….21

4.1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................22 4.2. MORFOLOGIA, FISIOLOGIA E TAXONOMIA ............................................................................22

5. CORANTES…………………………………………………………………………………………...25

5.1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................26 5.2. PRINCIPAIS FONTES DE POLUIÇÃO NO SECTOR TÊXTIL E OS SEUS REQUERIMENTOS AMBIENTAIS..............................................................................................................................................27 5.3. LEGISLAÇÃO RELATIVA AOS CORANTES AZO .......................................................................28 5.4. CORANTES AZO UTILIZADOS ..............................................................................................28 5.5. SÍNTESE DOS CORANTES AZO............................................................................................30 5.6. ESTUDOS FEITOS COM OS CORANTES AZO UTILIZADOS........................................................31

6. METODOLOGIA……………………………………………………………………………………...32

6.1. MICROORGANISMO ...........................................................................................................33 6.2. CONDIÇÕES DE CULTURA E EXPOSIÇÃO A CORANTES AZO ...................................................33 6.3. COMPOSTOS TÓXICOS E SUAS CONCENTRAÇÕES................................................................34 6.4. ENSAIOS DE DETERMINAÇÃO DE TOXICIDADE .....................................................................35

6.4.1. Ensaios Fisiológicos Toxicológicos..........................................................................35

a. Ensaios de Crescimento: ............................................................................................35 b. Ensaios de Morfometria: .............................................................................................37 c. Ensaios de Predação:.................................................................................................37 6.4.2. Ensaios Bioquímicos Toxicológicos .........................................................................38

6.5. TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS .............................................................................38

7. RESULTADOS………………………………………………………………………………………..39

7.1. CRESCIMENTO .................................................................................................................40 7.2. MORFOMETRIA .................................................................................................................44 7.3. PREDAÇÃO.......................................................................................................................51 7.4. SÍNTESE DOS RESULTADOS...............................................................................................55

7.4.1. Síntese dos resultados para cada corante azo ........................................................55 7.4.2. Síntese dos resultados para os três testes realizados: crescimento, morfometria e predação. ..........................................................................................................................58

8. DISCUSSÃO…………………………………………………………………………………………..60

9. CONCLUSÕES……………………………………………………………………………………….66

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………………...70

RESUMO

O aumento da poluição ambiental e o contínuo desenvolvimento da síntese de novos químicos

desencadeou uma crescente preocupação com os possíveis efeitos desses componentes

directa ou indirectamente na saúde humana.

Recentemente, a presença de tóxicos em ambientes aquáticos têm sido uma ocorrência

comum. Os corantes do tipo azo são bastante utilizados devido ao seu baixo custo de produção

assim como ao seu grande leque de aplicações. Porém, grandes quantidades destes corantes

são libertadas para o meio ambiente através dos efluentes industriais e a sua dispersão na

Natureza acarreta vários problemas.

O controlo da poluição aquática tem tido uma importância crescente nos últimos anos. A

libertação de corantes para o ambiente constitui apenas uma pequena porção da poluição da

água, mas os corantes são visíveis em quantidades pequenas devido à sua cor. A legislação

ambiental que existe é bastante rígida, forçando as indústrias têxteis a tratar os seus efluentes.

Este tratamento é físico-químico e muito dispendioso, além de criar um problema adicional, ou

seja, a concentração dos corantes nas lamas resultantes do tratamento dos efluentes. É

urgente combater os efeitos prejudiciais dos corantes têxteis no ambiente e a sua permanência

como resíduos recalcitrantes, inestéticos, evitando, simultaneamente, os grandes prejuízos que

as indústrias sofreriam se não pudessem produzir ou utilizar este tipo de corantes.

As alterações provocadas no meio ambiente pela introdução de substâncias tóxicas, são

susceptíveis de investigação, e, assim, a ecotoxicologia surge como um recurso para um

melhor conhecimento dos mecanismos de actuação dessas substâncias no ecossistema, mas

para isso é fundamental conhecer as alterações num indivíduo isolado. No que se relaciona

com a poluição da água os protozoários são uma excelente ferramenta de trabalho para o

estudo da toxicidade e da poluição.

No presente trabalho pretendeu-se utilizar o protozoário ciliado Tetrahymena pyriformis como

bioindicador no estudo de respostas fisiológicas e bioquímicas à presença de oito corantes azo

utilizados na indústria têxtil. Para tal, utilizou-se uma bateria de ensaios fisiológicos

toxicológicos como o crescimento, a morfometria e a predação. Estes ensaios foram realizados

numa série de testes miniaturizados usando culturas axénicas de T. pyriformis, inoculadas com

soluções dos 8 corantes em diferentes concentrações (5, 25, 50 e 100 ppm), tendo como

objectivo final a colecta de dados a fim de comparar respostas quanto à presença de diferentes

corantes têxteis azo e quanto à presença de diferentes concentrações de um mesmo corante.

Pretendeu-se com esta bateria de testes estudar se os corantes com aplicação têxtil utilizados

são tóxicos para o bioindicador utilizado e em que concentração produzem tal efeito. Espera-se

que com os resultados deste estudo se possa extrapolar a influência destes compostos no meio

aquático receptor.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Diagrama conceptual do estudo realizado, focando vários parâmetros a serem tomados em consideração para a realização dos testes de citotoxicidade com Tetrahymena pyriformis (adaptado de NICOLAU et al., 2001). .........................................................................3

Figura 2: Tetrahymena pyriformis retirada de uma cultura axénica em meio de cultura PPY (x100)........................................................................................................................................14

Figura 3: Células de Tetrahymena pyriformis viáveis e não viáveis, utilizando a calceína/AM e EthD-1. As duas células não viáveis mostram núcleos corados de vermelho (retirada de NICOLAU et al., 2001). .............................................................................................................18

Figura 4: ...................................................................................................................................23

- Diagrama A: Morfologia da Tetrahymena pyriformis: cp – citoprocto; cv – vacuolo contráctil; fv – vacúolo digestivo; mn - macronúcleo; n - núcleo; ki – corpo basal; um e m – membrana ondulatória e membranelas do aparelho oral (oa). ....................................................................23

- Diagrama B: Fotografia de contraste de fase de uma célula de Tetrahymena pyriformis fixada com vapor de 1 % de tetróxido de ósmio (x600)........................................................................23

Figura 5: Estrutura dos oito corantes azo (adaptado de MARTINS et al., 2001). ......................29

Figura 6: Esquema da síntese dos corantes azo (retirada de MARTINS et al., 2001)...............30

Figura 7 A e B: Corantes azo em pó (A) e soluções stock de 500 ppm dos corantes azo utilizados para os ensaios de toxicidade (B)..............................................................................34

Figura 8: Crescimento de Tetrahymena pyriformis exposta a quatro concentrações de corantes azo: 5 ppm (gráfico A), 25 ppm (gráfico B), 50 ppm (gráfico C) e 100 ppm (gráfico D), em ensaios de 48 horas. Para cada tempo de amostragem são representadas a médias e os desvios padrão de quatro réplicas.............................................................................................50

Figura 9: Efeito da exposição a diferentes concentrações de corantes azo no tamanho (área) de Tetrahymena pyriformis, em ensaios de 48 horas. As concentrações usadas foram de 5 ppm (gráfico A), 25 ppm (gráfico B), 50 ppm (gráfico C), e 100 ppm (gráfico D). Para cada tempo de amostragem são representadas a médias e os desvios padrão de quatro réplicas. ..................45

Figura 10: Efeito da exposição a diferentes concentrações de corantes azo na razão (W/L) do eixo menor (W) e maior (L) de Tetrahymena pyriformis, em ensaios de 48 horas. As concentrações usadas foram de 5 ppm (gráfico A), 25 ppm (gráfico B), 50 ppm (gráfico C), e 100 ppm (gráfico D). Para cada tempo de amostragem são representadas a médias e os desvios padrão de quatro réplicas.............................................................................................47

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Vantagens e desvantagens dos testes de toxicidade (adaptada de MITCHELL et al., 2002)…………………..……………………………………………………………………………………7

Tabela 2: Organismos principais dos quais foram isoladas estirpes e para as quais testes toxicológicos especiais foram desenvolvidos (adaptado de SAUVANT et al., 1999)……..……..13

Tabela 3: Setup do contador automático de células -Beckman Coulter Z Series - para um tubo capilar de abertura com 140 µm …….…………………………….…………………………………..36

Tabela 4: Resultados dos testes t de Student para a comparação das médias de n.º de células/ml de amostras sujeitas aos corantes com as médias dos controlos, para todas as concentrações e tempos de amostragem, em dois ensaios independentes (1 e 2); os valores apresentados representam o valor do p estatístico………………………………………………….43

Tabela 5: Resultados dos testes ANOVA para o crescimento de Tetrahymena pyriformis. A tabela faz a comparação entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s); carboxílico-sulfónico(C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico………….……..44

Tabela 6: Resultados dos testes t de Student, para a comparação de médias das áreas de amostras sujeitas aos corantes com as médias dos controlos, para todas as concentrações e tempos de amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico……….49

Tabela 7: Resultados dos testes t de Student para a comparação das médias das razões (W/L) de amostras sujeitas aos corantes com as médias dos controlos, para todas as concentrações e tempos de amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico……….50

Tabela 8: Resultados dos testes ANOVA para a morfometria: área e razão (W/L), de Tetrahymena pyriformis. A tabela faz a comparação entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s); carboxílico-sulfónico(C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico………………………………………………………………………………………………....51

Tabela 9: Número de microesferas ingeridas durante 20 minutos por 30 indivíduos de populações de Tetrahymena pyriformis expostos a diferentes concentrações de corantes azo: 5, 25, 50 e 100 ppm, analisadas durante o ensaio 1 com a duração de 48 horas. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico…………………………………………………………………………………………………53

Tabela 10: Resultados dos testes ANOVA para a predação de Tetrahymena pyriformis. A tabela faz a comparação entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s); carboxílico-sulfónico(C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico……………………55

I. INTRODUÇÃO GERAL

Os corantes azo são utilizados na tinturaria têxtil para corar e pintar fibras naturais e sintéticas,

couros e peles, na tipografia a cores, e ainda como aditivos de produtos derivados do petróleo.

São compostos xenobióticos, uma vez que contêm grupos ausentes em moléculas naturais e,

portanto, nem todos os microrganismos que normalmente se encarregam da reciclagem da

matéria orgânica lançada no ambiente possuem a "maquinaria enzimática" necessária ao

processamento de todos os tipos de grupos funcionais. O grupo funcional xenobiótico principal

nos corantes azo é a ligação azo, ou seja -N=N- (FERREIRA, 1998).

As indústrias de corantes e as indústrias têxteis são, respectivamente, as maiores produtoras e

utilizadoras de corantes azo. Produzem-se anualmente toneladas destes corantes, sendo cerca

de 10 a 15 % desses compostos lançados nos efluentes. Uma vez que estes corantes são

recalcitrantes à degradação microbiana, os efluentes destes processos industriais são

normalmente resistentes ao tratamento biológico, seja por microrganismos seja por plantas,

sendo muitas vezes os processos de descontaminação fisico-químicos a única alternativa de

tratamento para estas águas residuais (FERREIRA, 1998; MARTINS et al., 2001; MARTINS et

al., 2002; MARTINS et al., 2003).

Desta forma é importante determinar, com segurança, quais as concentrações de químicos que

se podem introduzir num ecossistema sem prejuízo para as comunidades do meio receptor.

Para tal é necessário proceder a uma série de testes de toxicidade. Existem dois objectivos

essenciais destes testes: a obtenção de dados sobre as propriedades toxicológicas de um

produto e o estabelecimento de limites de segurança à exposição de um novo produto.

Os mecanismos pelos quais os tóxicos podem afectar os organismos podem ser estudados de

duas formas principais: através da observação de características citológicas e fisiológicas numa

única população com o objectivo de construir uma tabela de vida (Figura 1) e/ou estudando as

consequências dos tóxicos na manutenção de várias populações dentro de uma comunidade

(NICOLAU et al., 2001).

O aumento da poluição ambiental e o contínuo desenvolvimento de novos químicos levou a

uma preocupação constante acerca dos potenciais efeitos, directos ou indirectos, destes

compostos na saúde humana (NICOLAU et al., 2004). Nos últimos anos foram realizadas

inúmeras pesquisas sobre a toxicidade de vários compostos importantes, mediante a utilização

de organismos teste em vários biotestes de toxicidade. A mais valia destes testes está

relacionada com a sua simplicidade e alto grau de reprodutibilidade. Por outro lado, os

organismos teste, utilizados para avaliar riscos e impactes ambientais, devem possuir uma

gama de características importantes, tais como: têm de ser eucarióticos; a sua biologia e

respostas gerais têm de ser bem conhecidas; o seu manuseamento laboratorial tem de ser

relativamente fácil; e têm que possuir um tempo de geração curto, importante para estudos de

efeitos tóxicos prolongados (NILSSON, 1989; NICOLAU et al., 2004). Os protozoários ciliados

preenchem todos estes requisitos. Para além disso, a comunidade de ciliados (que inclui muitas

vezes espécies sensíveis, resistentes ou de tolerância intermédia aos poluentes) são um meio

para identificar um possível impacte ecológico causado por poluentes antropogénicos

descarregados para as águas superficiais. Neste contexto, os protozoários ciliados tornaram-se

uma ferramenta valiosa para a detecção de mudanças ambientais e para avaliar o estado

trófico de um dado ecossistema aquático (MADONI, 2000; NICOLAU et al., 2004).

Figura 1: Diagrama conceptual do estudo realizado, focando vários parâmetros a serem tomados em

consideração para a realização dos testes de citotoxicidade com Tetrahymena pyriformis (adaptado de

NICOLAU et al., 2001).

Recentemente, o uso de protozoários ciliados em testes toxicológicos tem sido investigado e o

seu potencial em bioensaios padrão tem sido demonstrado em diversos ambientes. O

protozoário Tetrahymena pyriformis foi, por mais de quatro décadas, o organismo de eleição em

análises, na avaliação da qualidade proteica e na determinação de efeitos de várias

substâncias tóxicas (SAUVANT et al., 1999; STEFANIDOU et al., 1999; NICOLAU et al., 2001).

Tóxicos Objecto-teste Função-teste Níveis de Organização Biológica

Resposta

Etc.

Corantes têxteis azo

Protozoários

Dados

biológicos Reprodução Viabilidade

Energia e alimento

Anabolismo Catabolismo

Crescimento Predação

Manutenção

Locomoção

Factores Ecológicos

Características Citológicas e Fisiológicas

Existem vários trabalhos que relatam estudos realizados com T. pyriformis relativamente a

parâmetros como o crescimento, mortalidade, predação e ensaios bioquímicos, nomeadamente

adenosina-5-trifosfato (ATP), actividade da fosfatase ácida (ACP) e redução do 3-[4,5-dimetil-

tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazóleo brometo (MTT), na presença de tóxicos. Estes ensaios são

avaliados usando culturas axénicas de T. pyriformis (DIAS et al., 1999; NICOLAU et al., 2001).

Martins et al.. (2001, 2002 e 2003) realizaram ensaios sobre a biodegradação dos corantes azo

de aplicação têxtil por fungos, nomeadamente o fungo filamentoso Phanerochaete

chrysosporium, de modo a estudar até que ponto aqueles são recalcitrantes. O trabalho que se

propõe neste projecto apresenta uma nova abordagem no estudo destes corantes,

nomeadamente da sua toxicidade em organismos modelo, como a T. pyriformis, um trabalho

inovador na medida em que não foi ainda determinada a toxicidade destes corantes em

qualquer outro organismo teste.

O objectivo deste trabalho é estudar a toxicidade de diferentes compostos químicos usados na

indústria têxtil – corantes azo – no protozoário T. pyriformis, através da realização de ensaios

toxicológicos fisiológicos, nomeadamente, crescimento, predação e morfometria. Pretende-se

avaliar se os compostos são tóxicos e, se o forem, em que concentrações surgem os efeitos

tóxicos e quais são esses efeitos, ou seja, que alterações provocam no organismo bioindicador.

2. TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA – BREVE ABORDAGEM

2.1. Introdução

A noção de toxicidade existe desde o século XVI. O médico suíço Paracelsus escreveu em

1567 que “Todas as substâncias são venenosas. Não há nada que não o seja. A dose certa

diferencia um veneno de um remédio”. Dada esta longa história, podíamos esperar que

actualmente houvesse dados disponíveis para quase todos os químicos que se utilizam. No

entanto, isto é de longe verdadeiro. Existem actualmente cerca de 2500 químicos que são

importados para ou manufacturados na União Europeia em grandes quantidades (mais de 1000

toneladas/ano). No entanto, só estão disponíveis 14 % dos dados de toxicidade ambiental e

saúde humana, não existindo dados para 21 % dos químicos e apenas 3 % têm um conjunto de

dados completos (MITCHELL et al., 2002).

À escala global, o Instituto Worldwatch estima que não existe informação disponível sobre os

efeitos tóxicos de 79 % dos mais de 70000 químicos sintéticos. Se nos debruçarmos sobre o

caso da qualidade ambiental da água, a situação é bem pior (MITCHELL et al., 2002).

2.1. Modos de acção dos tóxicos

Quando se tenta prever a toxicidade, é vital diferenciar os tipos de efeito tóxico, existindo vários

modelos para descrever a toxicidade. A diferenciação fundamental é entre toxicidade reactiva

(ou específica) – associada a um mecanismo, como por exemplo uma reacção química ou a

inibição de um caminho metabólico - e não reactiva (não específica ou narcótica) – associada à

quantidade de tóxico que actua nas células.

Muitos investigadores propuseram uma classificação de tóxicos com base no seu modo de

acção, no entanto destaca-se a classificação de Verhaar et al.. (2000 in MITCHELL et al.,

2002). Estes investigadores usam uma combinação do modo de acção e a relação quantitativa

estrutura-actividade (QSAR) para definir quatro classes:

1. químicos inertes (de toxicidade básica);

2. químicos menos inertes (químicos com acidez na ligação do hidrogénio);

3. químicos reactivos (os que reagem não selectivamente com certas estruturas químicas

encontradas comummente nas células);

4. químicos activos específicos (os que exibem toxicidade devido a interacções com certos

receptores).

Em termos gerais, as concentrações com efeitos tóxicos para o segundo grupo são 5 a 10

vezes mais baixas do que para o primeiro grupo. No entanto, as concentrações para o terceiro

e quarto grupo são ainda mais baixas, ou seja, 10 e 104 vezes. Verhaar et al.. (2000 in

MITCHELL et al., 2002) validou este sistema de classificação através 176 compostos diferentes

e 964 dados independentes do Centro Europeu de Ecotoxicidade e Toxicologia de Químicos

(ECETOC).

2.3.Testes de toxicidade aquática

Uma análise sistemática da toxicidade de produtos químicos em diferentes águas naturais pode

permitir precisar a relação entre a toxicidade e parâmetros químicos. O estudo da toxicidade

realizado com diferentes organismos, permitirá definir uma cartografia da biodisponibilidade e

da toxicidade de compostos tóxicos (LE DÚ, 1993).

Assim, têm sido utilizados uma miríade de organismos modelo e tipos de testes de toxicidade. A

popularidade destes testes varia, ao longo do tempo, de acordo com a preferência dos

investigadores, das organizações, dos países, etc., estando continuamente a ser revistos,

melhorados ou até dando azo a novas criações (Tabela 1). No Reino Unido, o Direct Toxicity

Assessment (DTA) Demonstration Programme Steering Group recomendou que as formas de

vida mais simples devem ser utilizadas para os testes de ecotoxicidade, ou seja, bactérias,

plantas e invertebrados devem ser utilizados em vez dos vertebrados que, quando

seleccionados, o devem ser em números mínimos de indivíduos (MITCHELL et al., 2002).

Tabela 1: Vantagens e desvantagens dos testes de toxicidade (adaptada de MITCHELL et al., 2002).

Vantagens Desvantagens

- Holísticos

- Simples

- Baixo custo

- Baseados nos efeitos

- Envolvem condições controladas

- Não diagnósticos quando usados

sozinhos

- Não necessariamente representativos do

ambiente natural

- Não podem testar tudo

- Não podem considerar as condições

alteradas do meio

Os dados resultantes dos testes de toxicidade aquática apresentam uma grande variedade de

aplicações:

� decisões industriais para o desenvolvimento, manufactura e comercialização de um

produto;

� registo de produtos de forma a satisfazer os regulamentos de segurança;

� permissão de descargas de efluentes industriais ou municipais;

� avaliação do risco de impacte ecológico ou ambiental;

� prossecução ou defesa de actividades relacionadas com compostos químicos;

� análise da qualidade da água e protecção dos organismos aquáticos.

2.4. Relação quantitativa estrutura-actividade (QSAR) e relação

quantitativa actividade-propriedade (QPAR)

Uma QSAR é um modelo matemático que relaciona a actividade biológica (toxicidade) das

moléculas com as suas estruturas químicas. Modelos que descrevem uma relação entre a

actividade biológica de moléculas e as suas propriedades químicas ou físico-químicas são

QPAR. Quando se constrói uma relação QSAR/QPAR, o primeiro passo é usar dados de

toxicidade para estabelecer uma relação matemática entre a toxicidade química de substâncias

não testadas.

As aplicações dos QSAR/QPAR são, entre outras, estimar:

� as propriedades físico-químicas com relevância biológica como o coeficiente de partição

água-octanol, solubilidade em água e biodegradação;

� e prever pontos de ecotoxicidade;

� o potencial de bioacumulação de químicos em organismos aquáticos.

Muitos autores usaram os modelos QPAR para a previsão de toxicidade, nomeadamente, o

coeficiente água – octanol, hidrofobicidade, solublidade aquática, etc. (MITCHELL et al., 2002).

As QSAR têm sido utilizadas em ecotoxicologia como ferramentas úteis para a previsão de

toxicidade. Sabendo que os compostos químicos exibem toxicidade segundo vários

mecanismos de acção tóxica (por exemplo, narcose), o desenvolvimento e a aplicação de

QSAR evoluiu de uma abordagem meramente química para uma relacionada com os

mecanismos de acção dos compostos. A vantagem das QSAR baseadas em mecanismos é a

sua elevada predição de toxicidade. No entanto, para utilizar esta ferramenta, os mecanismos

de actuação dos compostos têm que estar bem identificados, se bem que a correcta

determinação destes mecanismos de acção não é sempre fácil, pois a toxicidade é um efeito

complicado e muitos passos envolvidos neste são pouco conhecidos e caracterizados (REN,

2003).

2.5. Organismos teste

Uma variedade de tipos de organismos teste, de vários níveis tróficos e muitos géneros

diferentes, são utilizados nos testes de toxicidade aquática. Os mais utilizados incluem plantas

(algas), animais invertebrados (crustáceos) e espécies de peixes de forma a determinar os

efeitos tóxicos nos vários níveis tróficos. Os testes realizados com microrganismos também se

têm tornado mais comuns, talvez com o objectivo de estudar as culturas das lamas activadas

das estações de tratamento de águas residuais. No geral, existem alguns critérios utilizados

para escolher o organismo: deve ser sensível ao tóxico, deve representar as populações

indígenas que são principalmente ecologicamente importantes, deve ser de fácil aquisição e de

manutenção laboratorial prática (LARSEN et al., 1997).

2.6. Métodos de testes tradicionais

2.6.1. Métodos agudos ou crónicos Os testes agudos são normalmente realizados antes dos testes crónicos, sobretudo quando se

quer avaliar a mortalidade ou a sobrevivência. A LC50 (concentração letal 50, ou seja, a

concentração que causa 50 % de mortalidade) é a mais frequentemente utilizada. A toxicidade

aguda é importante para medir a letalidade do tóxico, estimando assim a sua concentração e

potência.

Os testes crónicos de toxicidade são desenhados para avaliar os efeitos da longa exposição

aos contaminantes. O crescimento (peso e comprimento), número normal de embriões,

anormalidades morfológicas e número de descendentes são efeitos sub-letais típicos utilizados

nos testes crónicos. O benefício destes testes é que possibilitam uma acção de remediação

antes da mortalidade (MITCHELL et al., 2002).

Os testes de toxicidade sub-letais que não têm como finalidade a mortalidade, são muito

importantes para determinar a toxicidade de uma ou várias substâncias. Podem ser divididos

em três categorias:

� testes bioquímicos e fisiológicos (inibição respiratória ou enzimática);

� testes comportamentais (locomoção, territorialismo, agressão);

� testes histológicos (alterações em tecidos dos organismos estudados);

2.6.2. Testes modificados, rápidos ou microbiotestes. O tempo e o custo que envolviam os testes tradicionais de toxicidade levaram ao

desenvolvimento de testes alternativos. Como já foi mencionado anteriormente, a preocupação

com o bem-estar dos organismos teste foi também considerada nesta pesquisa. Não obstante,

os testes crónicos e agudos são relativamente dispendiosos e requerem uma contínua

manutenção dos organismos testes (MITCHELL et al., 2002). Este facto levou ao

desenvolvimento de uma gama de rápidos microbiotestes de ecotoxicidade dos quais se

destacam:

� Microtox: teste que mede as mudanças na produção de luz por bactérias luminescentes

(Vibrio fischeri) expostas a um efluente ou tóxico, sendo o tempo requerido para este

teste menos de 1 hora;

� Algaltoxkit: teste de inibição de crescimento de 72 horas, baseado na alga verde

Selenastrum capricornutum;

� Daphtoxkit: bioensaio de 24 horas de LC50 realizado em microplaca, que utiliza larvas

de crustáceos de água doce Daphnia magna e Daphnia pulex, cujo tempo de incubação

é de 24 horas.

3. TESTES DE TOXICIDADE COM PROTOZOÁRIOS

3.1. Introdução

Ultimamente, a presença de tóxicos nos ambientes aquáticos tornou-se uma ocorrência comum.

Estes são provenientes principalmente de esgotos de indústrias, que reduzem a eficiência do

tratamento biológico das águas residuais devido a fenómenos de intoxicação (NICOLAU et al.,

2001).

Diferentes organismos podem apresentar sensibilidades variáveis de acordo com os químicos;

e a sensibilidade de uma certa espécie pode variar de acordo com o tipo de composto tóxico.

Isto significa que um modelo de acção de um conjunto de químicos encontrados para uma dada

espécie pode não ser aplicado a outra espécie diferente. No entanto, a toxicidade de um

químico ou de um conjunto de químicos, no que se refere à deplecção de ambos os organismos

e espécies, pode ser demonstrado testando a comunidade da microfauna que habita as lamas

activadas (NICOLAU et al., 2001).

Os protozoários ciliados muitas vezes podem atingir densidades de 107 células/ L no tanque de

arejamento. Apresentam um papel importante no processo de purificação das águas ao

remover, através da predação, a maioria das bactérias dispersas, que causariam grande

turbidez no efluente final. São muito sensíveis às variações ambientais e foi já descoberto que

mudanças na comunidade de protozoários podem afectar toda a cadeia alimentar destes

ecossistemas artificiais, afectando também a performance biológica do tratamento de águas

residuais (NICOLAU et al., 2001).

Estes protozoários, pelo que foi anteriormente relatado e porque: 1) representam um

componente básico das comunidades microplânctónicas e microbênticas de ambientes

aquáticos, 2) apresentam ampla distribuição, 3) e são de importância ecológica significativa, ou

seja, desempenham funções chave nas cadeias tróficas aquáticas, onde medeiam o fluxo de

substâncias biológicas e de energia de um nível trófico para o seguinte; são importantes

organismos indicadores assinalando a deterioração dos ecossistemas aquáticos (LARSEN et

al., 1997; MADONI, 2000; NICOLAU et al., 2004).

3.2. Os ciliados como organismos teste Durante muito tempo, os protozoários foram extensivamente estudados, descritos e

classificados por protozoólogos. Os protozoários são células eucarióticas presentes em quase

todos os ambientes aquáticos e terrestres. O seu comportamento normal no meio ambiente

pode estar relacionado com a presença de poluentes e com a qualidade do ar, solo e água.

Este facto levou muitos toxicologistas e ecotoxicologistas a usar os protozoários como modelos

animais para o estudo de compostos xenobióticos e para a avaliação dos seus riscos para a

saúde pública (LARSEN et al., 1997; NICOLAU et al., 1999; SAUVANT et al., 1999; DIAS et al.,

2003).

Entre as várias espécies de protozoários seleccionadas para estudos ecotoxicológicos, os

ciliados são os mais usados. A tabela que se segue refere-se aos principais ciliados utilizados

em estudos de toxicidade:

Tabela 2: Organismos principais dos quais foram isoladas estirpes e para as quais testes toxicológicos

especiais foram desenvolvidos (adaptado de SAUVANT et al., 1999).

Espécies de protozoários Testes toxicológicos

Colpidium campylum Protozoários utilizados no estudo dos efeitos e interacções entre poluentes aquáticos orgânicos e não orgânicos

Euplotes vannus Euplotes harpae Paramecium putrinum Oxytricha Spirostomum ambigum Entosiphon sulcatum Stentor sp. Paramecium sp. Tetrahymena vorax Tetrahymena thermophila Tetrahymena pigmentosa

Organismos testes para a avaliação da toxicidade de iões de metais pesados em substâncias orgânicas

Tetrahymena pyriformis O mais comum modelo protista usado em estudos toxicológicos

A Tetrahymena pyriformis tem sido usada nas últimas décadas por vários estudos toxicológicos

e ecotoxicológicos, que a validam como um organismo teste ideal e como um complemento ou

alternativa a modelos animais mais complexos na investigação toxicológica (NILSSON, 1981;

NICOLAU et al., 1999; SAUVANT et al., 1999; NICOLAU et al., 2001; DIAS & LIMA, 2002;

NICOLAU et al., 2004). Além disso, foi o primeiro protozoário a ser cultivado axenicamente, ou

seja, num meio definido, livre de bactérias e outros organismos, sendo mantido em culturas

celulares apropriadas à adição de um composto que constitui, em princípio, a única alteração

nas condições de cultura. (SAUVANT et al., 1999; STEFANIDOU et al., 1999 ; NICOLAU et al.,

2001; NICOLAU et al., 2004).

Para além do uso de outros protozoários como organismos teste, a Tetrahymena pyriformis é

um dos protozoários ciliados mais utilizados para avaliar os efeitos citotóxicos de compostos

xenobióticos (SAUVANT et al., 1999). Este ciliado foi o organismo teste seleccionado para a

avaliação da qualidade das proteínas, bem como para a determinação do efeito de várias

substâncias (carcinógenos, insecticidas, fungicidas, micotoxinas, químicos orgânicos, metais

pesados, drogas farmacêuticas, etc.). A biologia desta célula eucariótica é bem conhecida,

sendo caracterizada por um curto tempo de geração que fez dela um modelo a utilizar nos

ensaios in vitro (SAUVANT et al., 1995; BONNET et al., 2005).

3.3. Tetrahymena pyriformis: uma ferramenta na toxicologia

3.3.1. Cultivo in vitro

No seu ambiente natural, Tetrahymena pyriformis alimenta-se de bactérias, mas pode ser

mantida num meio artifical, axénico e quimicamente definido (Figura 2).

Figura 2: Tetrahymena pyriformis retirada de uma cultura axénica em meio de cultura PPY (x100).

Foram já propostos meios de cultura muito similares para este organismo, mas as diferenças

entre eles podem influenciar os resultados obtidos. A temperatura das culturas pode variar entre

25 ºC a 30 ºC. A maioria dos ensaios foi realizada a uma temperatura óptima de 28 °C, com

culturas axénicas e sem agitação. Na maioria dos ensaios, as culturas de Tetrahymena

pyriformis encontravam-se em fase de crescimento exponencial, com densidades de células

entre 4 e 5x104 células/mL. De entre os muitos meios de cultura propostos, a maioria dos

investigadores utiliza meio com proteose–peptona e extracto de levedura, suplementado com

sais inorgânicos, conhecido por meio PPYS. As proporções de proteose-peptona e extracto de

levedura podem variar de 0 a 2 %.

A constituição do meio de crescimento é muito importante, uma vez que vários trabalhos

demonstram que o estado fisiológico da Tetrahymena pyriformis e o efeito tóxico de compostos

xenobióticos estão relacionados com a composição do meio de cultura, o pH e, especialmente,

com a quantidade de matéria orgânica presente (SAUVANT et al., 1999).

Para além disso, a simplicidade do seu manuseamento laboratorial é essencial para torná-las

uma alternativa viável à utilização de outros animais aquáticos, na avaliação da toxicidade de

poluentes (LARSEN et al., 1997; NICOLAU et al., 1999; SAUVANT et al., 1999; DIAS et al.,

2003).

3.3.2. Ensaios para avaliar o efeito tóxico de compostos xenobióticos

Hoje em dia, os testes biológicos são bastante desenvolvidos, porque a prática laboratorial

requer ensaios rápidos, simples e sensíveis para avaliar a toxicidade dos poluentes ambientais

(SAUVANT et al., 1995). Em toxicologia, os bioensaios agudos normalmente medem a

mortalidade relativa de concentrações crescentes de xenobióticos e condições de exposição

específicas. Até à data, a evolução da metodologia dos bioensaios é baseada em respostas

sub-letais do modelo celular.

Em Tetrahymena pyriformis, a avaliação dos efeitos citotóxicos de compostos xenobióticos

pode ser realizada utilizando vários parâmetros e ensaios metabólicos, fisiológicos ou

bioquímicos toxicológicos.

3.3.3. Os ensaios fisiológicos toxicológicos

A taxa de crescimento e as alterações morfológicas têm sido utilizadas há algumas décadas. A

diminuição do crescimento populacional é um método frequentemente usado para avaliar a

toxicidade sub-letal de compostos orgânicos e inorgânicos, que não requer especial experiência

técnica. Outros parâmetros como a mobilidade celular, padrões natatórios, taxa de fagocitose e

a análise do citoesqueleto podem ser estudados e foram propostos para a determinação do

estado fisiológico e energético de Tetrahymena pyriformis, quando em contacto com diversos

poluentes.

a. Densidade celular e taxa de crescimento

Em condições óptimas, o crescimento de Tetrahymena pyriformis é caracterizado por uma fase

de crescimento logarítmica – fase log -, uma fase de crescimento pré-estacionária, e uma fase

estacionária. Na fase logarítmica, que pode durar desde algumas horas a dois dias,

dependendo do inóculo, a densidade celular aumenta logaritmicamente e o tempo de geração

ocorre entre as 3 e as 7 horas. Na fase pré-estacionária o crescimento diminui por algumas

gerações antes de entrar na última fase, a estacionária.

Durante estas fases, o pH aumenta de 6,7 para 8 em meio PPYS. Este comportamento pode

ser explorado para testes de toxicidade. Após a exposição a compostos xenobióticos, a

densidade celular e a taxa de crescimento são frequentemente propostas para especificar o

impacto tóxico das substâncias testadas; as contagens celulares são feitas automaticamente

por um contador electrónico de partículas, microscopicamente por um hemocitómetro ou por

medições de densidade óptica com espectrofotómetro. Estas contagens permitem a realização

de curvas de crescimento, que servem para calcular o tempo de geração das populações, que

depois do contacto com xenobióticos aumenta.

A densidade celular é também usada para a comparação do potencial tóxico de substâncias.

Os resultados são fornecidos em valores de IC50 (a concentração efectiva que reduz a

densidade celular a 50 % face à verificada nos controlos). É ainda de salientar que a medição

indirecta da densidade óptica é equivalente à contagem directa electrónica de partículas

quando se determina a densidade celular de culturas de Tetrahymena pyriformis, excepto nos

testes de químicos coloridos ou insolúveis (SAUVANT et al., 1999).

b. Mudanças comportamentais

Em condições normais, Tetrahymena pyriformis é caracterizada por grande mobilidade e

actividade. Na presença de compostos xenobióticos o organismo ajusta o seu comportamento

aos factores tóxicos stressantes. Assim, a sua locomoção e a sua mobilidade foram descritas

como dependentes do estado de saúde das células.

A fagocitose é um fenómeno normal na Tetrahymena pyriformis. A sua taxa é influenciada pela

temperatura, pelo pH e pela presença de partículas sólidas. Vários compostos podem interferir

inibindo ou estimulando a predação. Além disso, alguns xenobióticos podem acumular-se,

aumentando a sua toxicidade (SAUVANT et al., 1999).

O protozoário Tetrahymena pyriformis tem sido muito usado como um modelo experimental

para estudos toxicológicos. Foi já confirmado que a endocitose (fagocitose e pinocitose) ocorre

através da formação de vacúolos. A fagocitose nos protozoários é uma função celular clássica,

reflectindo o nível de energia do protozoário e representa o principal meio de defesa em

organismos que não possuem a capacidades de fabricar anticorpos. A predação foi já utilizada

em vários estudos, nomeadamente com substâncias psicotrópicas (drogas) (STEFANIDOU et

al., 1999).

c. Crescimento, mortalidade e viabilidade celulares

Os ensaios de crescimento são os mais frequentemente usados para determinar a toxicidade

sub-letal. Um ensaio de mortalidade/crescimento, através da utilização de observação

microscópica das alterações a baixa ampliação, é uma técnica de fácil reprodução e não requer

experiência técnica ou despesas operacionais (NICOLAU et al., 1999).

No entanto, estes ensaios apresentam algumas limitações, que os tornam inadequados para

alguns compostos tóxicos. O reconhecimento de células mortas torna-se muitas vezes

ambíguo, uma vez que células não móveis bem como as que possuem formas alteradas podem

ser contadas como células mortas. As observações ao microscópio de luz podem subestimar o

verdadeiro número de células viáveis, ou seja, uma contagem falsa e negativa, uma vez que

muitas células anormais não se encontram de facto mortas. Estas podem recuperar a sua forma

normal após a remoção do tóxico, crescendo normalmente nos ensaios de recuperação

(NICOLAU et al., 2001; DIAS & LIMA, 2002).

A citotoxicidade e morte celular têm sido investigadas através da utilização de marcadores

retidos pelas células vivas ou libertados de células lisadas. Os derivados fluorogénicos são

substratos para esterases, coram células vivas, e são amplamente utilizados como marcadores

citoplasmáticos e como sondas de viabilidade.

A calceína AM é um éster lipofílico não fluorescente que se difunde passivamente nas células e

é transformado em calceína fluorescente, por esterases intracelulares. Uma vez hidrolizada, a

calceína livre insolúvel nos lípidos e com alta carga negativa, é aprisionada dentro de células

com membranas intactas e torna-se verde fluorescente a um comprimento de onda de 530 nm.

Um segundo corante é então adicionado para corar as células mortas. EthD-1 (homodímero de

etídio) é um fluorocromo impermeável que passa através de membranas não funcionais e

estabelece uma ligação forte com os ácidos nucleicos de cadeia dupla, emitindo uma

fluorescência vermelha a um comprimento de onda de 617 nm. As células viáveis verdes e

células não viáveis vermelhas podem ser detectadas por microscopia de fluorescência (Figura

3). A sua quantificação e análise de dados podem ser feitas através de várias técnicas como:

microfluorometria, citometria de fluxo, microscopia laser e confocal (NICOLAU et al., 2001; DIAS

et al., 2002).

Figura 3: Células de Tetrahymena pyriformis viáveis e não viáveis, utilizando a calceína/AM e EthD-1. As

duas células não viáveis mostram núcleos corados de vermelho (retirada de NICOLAU et al., 2001).

Este novo método para avaliar a citotoxicidade foi utilizado como alternativa à contagem directa

de protozoários viáveis ao microscópio de luz. Os resultados obtidos com este método e com o

da contagem directa são semelhantes, especialmente no que diz respeito ao aumento do tempo

de exposição (NICOLAU et al., 2001).

3.3.4. Os ensaios bioquímicos toxicológicos

Ao longo de décadas, a mobilidade celular e o aspecto das células observadas ao microscópio

de luz visível têm sido utilizados como indicadores de viabilidade. No entanto, nos últimos anos,

vários testes têm sido desenvolvidos ou adaptados a estas células, nomeadamente: conteúdo

em adenosina-5-trifosfato (ATP), a actividade da fosfatase ácida (ACP), e a redução do 3-[4,5-

dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazóleo brometo (MTT), e mais recentemente, o teste bioquímico

denominado MWFP (Multiwell filter plates) para avaliar a viabilidade das células (DAYEH et al.,

2005).

Gikas et al. (1993 in NICOLAU et al., 2001; NICOLAU et al., 2004) utilizaram ensaios que

detectaram a quantidade de ATP para caracterizar a viabilidade da biomassa; Dowhanick et al.

(1994 in NICOLAU et al., 2001; NICOLAU et al., 2004); Gamborg et al. (1994 in NICOLAU et al.,

2001) utilizaram o teste da ATP para detectar microrganismos na indústria da cerveja e da

alimentação e Nicolau et al. (2004) utilizaram o teste da ATP para determinar o estado

energético de culturas de protozoários submetidos a diferentes tóxicos. Estes investigadores,

entre outros, assumiram a possibilidade de utilizar a concentração de ATP para detectar as

células viáveis de uma certa espécie.

Muitos trabalhos foram realizados utilizando a actividade da ACP de outras hidrolases para

detectar a actividade digestiva dos protozoários, uma vez que há uma íntima relação entre a

função lisossómica normal e a digestão intracelular em Tetrahymena e outros ciliados. No

entanto, apenas alguns autores sugeriram o teste da actividade da ACP para a avaliação da

toxicidade. Entre eles destaca-se a utilização da actividade da ACP por Nicolau et al. (2004),

como um indicador do estado metabólico das culturas, principalmente da função digestiva

intracelular.

Os ensaios toxicológicos convencionais são muitas vezes lentos e trabalhosos, e tornam-se

impraticáveis quando muitos compostos ou concentrações estão a ser testadas. Isto levou a um

grande interesse por ensaios colorimétricos ou fluorimétricos que podem ser miniaturizados em

microplacas de 96 poços e avaliados com espectofotómetro de microplacas ELISA. Neste

aspecto, o ensaio MTT e a utilização dos protozoários é uma excelente opção: permite

simultaneamente testes de diferentes tóxicos a várias concentrações, é rápido e não requer

experiência técnica nem despensas operacionais como outros bioensaios estandardizados

(DIAS et al., 1999). O ensaio colorimétrico MTT, baseado na redução do corante tetrazólio tem

sido extensivamente utilizado na avaliação in vitro da proliferação celular e citotoxicidade, bem

como no estudo de aditivos, micotoxinas e fármacos contra o cancro (DIAS et al., 1999;

NICOLAU et al., 2001; ZILBERG & SINAI 2006). Trata-se de um método quantitativo que

consiste na redução metabólica do corante tetrazólio, um grupo de compostos quaternários de

amónia solúveis em água, por dehidrogenases de células viáveis imobilizadas ou suspensas

num meio. O resultado deste ensaio é a produção de cristais insolúveis de formazano em água.

Os cristais formados podem ser observados ao microscópio no citoplasma celular ou extraídos

e dissolvidos com solventes orgânicos, como o dimetil sulfóxido (DMSO), sendo assim possível

a sua quantificação com um espectrofotómetro (DIAS et al., 1999; NICOLAU et al., 2001;

ZILBERG & SINAI, 2006).

Os ensaios bioquímicos colorimétricos MTT, ATP e ACP que utilizam os protozoários parecem

ser excelentes opções porque proporcionam testes simultâneos com diferentes tóxicos a várias

concentrações e são fáceis e rápidos de realizar (NICOLAU et al., 2001).

4. OS PROTOZOÁRIOS CILIADOS: BREVE ABORDAGEM DA SUA MORFOLOGIA, FISIOLOGIA E TAXONOMIA.

4.1. Introdução

A Tetrahymena pyriformis é caracterizada por possuir um ciclo de vida muito curto, o que

permite a sua fácil cultura em condições laboratoriais apropriadas. Os efeitos tóxicos de

substâncias também podem ser testados em várias gerações. Todas estas propriedades podem

explicar a utilização deste modelo biológico em numerosos estudos fisiológicos e bioquímicos

bem como em pesquisas farmacológicas e toxicológicas.

4.2. Morfologia, fisiologia e taxonomia Tetrahymena pyriformis (Ehremberg, 1830) é um ciliado de água doce pertencente ao Filo

Ciliophora, à classe Oligohymenophorea, subclasse Hymenostomia, ordem Hymenostomatida,

subordem Tetrahymenina.

O seu corpo tem um comprimento de aproximadamente 50-60 µm e uma largura de 30 µm e

tem forma de pêra, característica que lhe deu o nome do restritivo específico (Figura 4). São

possíveis várias modificações da sua forma, nomeadamente em culturas antigas ou sob stress.

A superfície da Tetrahymena pyriformis é coberta por 400 a 600 cílios ancorados par a par em

cada corpo basal que, por sua vez, está ancorado a um citoesqueleto cortical (DIAS, 1998).

Debaixo da membrana plasmática que cobre todo o organismo incluindo os cílios, há um

sistema de alvéolos achatados que se encontram agrupados em pares na base de cada cílio.

Uma densa camada de citoplasma chamada epiplasma encontra-se debaixo destes alvéolos,

que são localizados na zona de transição do corpo basal para os cílios.

O aparelho oral, localizado perto da extremidade anterior da célula, consiste em quatro

estruturas ciliares: membrana ondulatória (um) nas margens direita e posterior da cavidade

bucal, e as três membranelas da zona adoral que ficam fora da cavidade (Figura 4).

A parede da cavidade bucal em forma de funil é suportada por uma série de fitas peliculares e

por um intrincado sistema de microtúbulos originados a partir dos corpos basais. Estas fitas,

unindo as membranelas, contribuem para a formação de uma fibra citofaríngea pós-oral que se

entende ao longo da citofaringe. O citóstoma fica na base da cavidade bucal e a estrutura de

forma cónica da citofaringe abre-se no vacúolo digestivo abaixo do citóstoma.

Na zona da citofaringe, a transição da estrutura da película constituída por três camadas para a

membrana celular que envolve o vacúolo digestivo é evidente. Quando o vacúolo digestivo está

cheio, deixa a região oral e um novo vacúolo é formado. A eficiência e a taxa de formação de

vacúolos digestivos depende do ciclo celular, estado fisiológico da célula e factores ambientais

tais como pH, temperatura, etc. Foi já mostrado que muitas substâncias orgânicas e inorgânicas

podem interferir com a formação de vacúolos digestivos, daí que a capacidade de formação de

novos vacúolos é um bom indicador de condições tóxicas.

Figura 4:

- Diagrama A: Morfologia da Tetrahymena pyriformis: cp – citoprocto; cv – vacuolo contráctil; fv – vacúolo

digestivo; mn - macronúcleo; n - núcleo; ki – corpo basal; um e m – membrana ondulatória e

membranelas do aparelho oral (oa).

- Diagrama B: Fotografia de contraste de fase de uma célula de Tetrahymena pyriformis fixada com

vapor de 1 % de tetróxido de ósmio (x600).

As fases da digestão são similares a outros ciliados. A última fase é a egestão de material não

digerido, que ocorre no citopígeo. Esta é uma estrutura permanente da célula que se encontra

entre os alvéolos na superfície ventral posterior da célula. Durante a egestão, a película que se

encontra nas margens do citopígeo e a membrana do vacúolo fundem-se com a membrana

celular. Quando a defecação termina, o citopígeo fecha e o vacúolo vazio colapsa em pequenas

vesículas, cujas membranas podem ser recicladas para se tornarem membranas de outro

vacúolo digestivo.

Uma importante característica é que o vacúolo contráctil mantém constante o volume celular

eliminando fluído a uma taxa igual à entrada passiva de água numa célula hiperosmótica.

A B

Alguns iões (como o sódio) são transportados activamente através da membrana e expelidos, e

as mitocôndrias são de facto associadas a esta estrutura.

A Tetrahymena pyriformis é uma importante espécie amicronucleada, ou seja, tem apenas um

macronúcleo esférico e polipóide, com cerca de 10 µm de diâmetro. Contêm densos grânulos

de cromatina e muitos nucléolos em forma de copo. Os grânulos de cromatina, compostos por

DNA e proteínas, são visíveis em fases celulares. Na interfase, a cromatina é finamente

granulada e distribuída ao longo do macronúcleo; nesta fase, é muito activa na síntese, e

aparece escura durante a observação microscópica de contraste de fase. Durante o ciclo

celular, ocorrem mudanças regulares relacionadas com a duplicação celular e morfogénese, na

estrutura dos agregados de cromatina. A configuração da cromatina muda para a forma

condensada na fase estacionária e durante o esfomeamento; é simultânea com as mudanças

na organização nucleolar.

Na Tetrahymena, os usuais organelos citoplasmáticos são mitocôndrias, retículo

endoplasmático, complexo de Golgi, ribossomas, peroxissomas e lisossomas. As suas

estruturas espelham o estado fisiológico da célula. Durante o período de esfomeamento, na

fase estacionária, ou em reposta a certos tratamentos, ocorrem mudanças estruturais nas

células: as mitocôndrias e os peroxissomas tornam-se densos, aparecem gotas lipídicas,

vacúolos autofágicos, partículas de glicogénio e muitos corpos de inclusão, reflectindo

mudanças de metabolismo.

Perante este breve descrição, fica claro que muitas das características estruturais dos

organelos são marcadores importantes do estado físiológico da Tetrahymena e podem ser

usados para criar modelos simples do estudo da toxicidade de muitas substâncias (SAUVANT

et al., 1999).

5. CORANTES

5.1. Introdução

Os corantes têxteis azo são caracterizados pela presença de um ou mais grupos azo (-N=N-).

São o maior e mais versátil grupo de corantes, e mais de metade dos corantes anualmente

produzidos (estimados globalmente em 1994 em cerca de 1 milhão de toneladas) são corantes

azo. Presumivelmente, mais de 2000 corantes azo diferentes são utilizados para tingir vários

materiais tais como têxteis, couro, plásticos, cosméticos e alimentos (STOLZ, 2001; NOVOTNÝ

et al., 2006). Amplamente usados na indústria têxtil, a sua aplicação ascende até aos 70 % de

todos os corantes utilizados. Durante o processo de coloração dos têxteis, 2 a 50 % dos

corantes aplicados podem ser perdidos nas águas residuais industriais que posteriormente são

libertadas no meio ambiente (NOVOTNÝ et al., 2006). Existe apenas o registo de um único

grupo azo num produto natural (4,4′-dihidroxiazobenzeno); todos os outros produzidos

industrialmente são considerados compostos xenobióticos, resistindo à biodegradação (STOLZ,

2001).

A aguda toxicidade de corantes azo medida pelos critérios da União Europeia para a

classificação de substância perigosas é baixa, sendo os valores de LD50 de 250-2000 mg/Kg.

Alguns corantes azobásicos, ácidos e directos foram classificados como sendo muito tóxicos ou

apenas tóxicos para peixes, crustáceos, algas e bactérias, enquanto que os corantes azo

reactivos têm concentrações efectivas muito elevadas (níveis de CE>100 mg/L) e assim não

são considerados tóxicos para organismos aquáticos. Os corantes azo não iónicos são

geralmente classificados como tóxicos ou potencialmente tóxicos. As algas são sensíveis aos

corantes, mas o efeito inibitório está muitas vezes relacionado com a inibição da luz quando as

concentrações destes corantes são muito elevadas, em vez de um efeito directo dos corantes

(NOVOTNÝ et al., 2006).

A síntese de corantes azo está bem estabelecida e anualmente são desenvolvidos novos

corantes. Os efluentes coloridos de indústrias de coloração de tecidos e de indústrias têxteis

causam poluição visual no ambiente e são perigosos para a vida, uma vez que são resistentes

a tratamento biológico.

São considerados compostos xenobióticos recalcitrantes devido à presença de uma ligação

N=N e outros possíveis grupos que não são facilmente biodegradáveis, por exemplo o grupo

sulfónico (SO3H). Os corantes azo são tóxicos e podem tornar-se perigosos para o ambiente

através da formação de aminas aromáticas (anilinas), que são carcinogénicas ou mutagénicas.

As anilinas são formadas pela clivagem da ligação azo que, usualmente, ocorre em condições

de anaerobiose por muitas estirpes de bactérias (MARTINS et al., 2001).

Os organismos vivos normalmente não sintetizam ligações azo e grupos sulfónicos aromáticos,

sendo o conhecimento limitado sobre a biodegradação destes grupos.

Para proteger o ambiente, são necessárias estratégias de aumentem a gama de compostos

xenobióticos degradados nos tratamentos de águas residuais ou as capacidades de

degradação destes compostos por microrganismos. Tendo isto em mente, os corantes azo que

foram utilizados neste estudo incluem grupos ácidos reactivos que providenciam ligações

covalentes com as fibras têxteis, evitando a perda de grandes quantidades de corantes após o

processo de tinturaria e grupos bioacessíveis ao sistema enzimático de fungos – grupos

guaiacol e siringol (MARTINS et al., 2002).

5.2. Principais fontes de poluição no sector têxtil e os seus

requerimentos ambientais

Na década de 1970, foram relatados casos de trabalhadores responsáveis pelo controle de

qualidade de artigos têxteis, com problemas de lacrimação, tosse e reacções alérgicas da pele.

Pessoas que utilizavam roupas que não necessitavam de passagem a ferro, apareciam com

infecções na pele. No entanto, naquela altura, estes incidentes eram ignorados. Na década de

1980, principalmente no final, com o avanço da ciência e da tecnologia e com o aumento da

preocupação ambiental dos cidadãos, os relatórios acerca do potencial efeito nefasto de certos

produtos têxteis receberam grande atenção. Na indústria têxtil moderna, os processos de

coloração de têxteis e a sua rectificação são processos tipicamente químicos e a poluição

decorrente destes é uma realidade.

Generalizando, as substâncias nocivas presentes nos têxteis e produtos de vestuário incluem

as seguintes categorias:

� formaldeído, branqueador fluorescente e amaciador;

� resíduos de pesticidas; antisépticos, inibidores de bolor nas fibras de lã e algodão

(como, por exemplo, o pentaclorofenol);

� resíduos de metais pesados;

� resíduos de monómeros de corantes azo e formaldeído nas fibras químicas;

� resíduos de pesticidas e fertilizantes utilizados nas culturas de algodão.

Desde a década de 1990, muitos países adoptaram medidas e requisitos ambientais, para

restringir a utilização de químicos nefastos na produção de têxteis e vestuário. Alguns destes

requisitos são impostos através de leis e de regulamentações (Policy Research Center for

Environment and Economy, 1999).

5.3. Legislação relativa aos corantes azo

Como foi referido anteriormente, muitos países adoptaram legislação ambiental e requerimentos

restringindo o uso de químicos perigosos na produção de têxteis e vestuário. Uma das leis mais

conhecidas é a Segunda Emenda ao Acto de Protecção do Consumidor elaborada pelo governo

alemão em 1994, proibindo a utilização de corantes azo. A Quinta Emenda a este acto foi

aprovada em Abril de 1997 e, desde então, muitos outros países europeus seguiram os passos

da Alemanha. Outros países europeus, tais como a Suécia, a França e a Dinamarca formularam

legislação respeitante aos corantes azo (Policy Research Center for Environment and Economy,

1999).

Tendo em consideração que os corantes azo são muito utilizados nos processos de coloração

de têxteis e couro, é de salientar a sua capacidade de libertar algumas arilaminas que podem

causar cancro. A União Europeia, restringiu estas arilaminas nos produtos comercializados na

Europa. Assim, adoptou uma legislação relativa a corantes azo em Setembro de 2002, que se

aplicou a todos os Estados Membros a partir de 11 de Setembro de 2003. A Directiva

2002/61/EC, cobre 22 aminas e é relevante para artigos têxteis e artigos de couro que estejam

em contacto directo com a pele. Esta directiva reformulada pela 2004/21/ EC foi implementada

em Portugal pelo Decreto Lei n.º 208/2003.

A legislação portuguesa é uma transposição directa da legislação europeia, o que significa que

se rege pelos mesmos requisitos. Esta legislação proíbe a utilização de corantes azo no fabrico

de artigos têxteis ou de pele, que entrem em contacto prolongado com a pele ou com a boca. A

Directiva estabelece ainda que os produtos referidos não podem conter as 22 aminas listadas

na legislação, numa concentração acima dos 30 ppm. Se os artigos forem feitos de fibras

recicladas não podem conter mais do que 70 ppm.

5.4. Corantes azo utilizados

Os corantes têxteis azo caracterizam-se pela presença de pelo menos um grupo cromóforo azo,

mas podem conter dois, três ou, mais raramente, quatro grupos azo (-N=N-). Os grupos de

azoto têm hibridização sp2 e estão ligados normalmente a anéis aromáticos. Os corantes azo,

cujos grupos substituintes são anéis benzénicos, denominam-se homocíclicos. Se contêm um

ou mais anéis heterocíclicos, os corantes azo designam-se heterocíclicos.

Podem ainda ter adicionalmente grupos sulfónicos (S03H, na maioria dos corantes azo), não

sendo facilmente degradados por microrganismos. Quimicamente são derivados do azo

benzeno.

Figura 5: Estrutura dos oito corantes azo (adaptado de MARTINS et al., 2001).

Ácido 3-aminobenzenosulfónico→guaiacol Ácido 4-aminobenzenosulfónico→guaiacol

Ácido 3-aminobenzenosulfónico→siringol Ácido 4-aminobenzenosulfónico→siringol

Ácido 3-aminobenzóico→guaiacol Ácido 4-aminobenzóico→guaiacol

Ácido 3-aminobenzóico→siringol Ácido 4-aminobenzóico→siringol

A nomenclatura apresentada para os corantes neste trabalho, expressando a componente

diazo e a componente de ligação dos grupos sulfónicos é comum na química têxtil para

evidenciar o processo de síntese. As siglas referem-se ao tipo de ácido (carboxílico – C ou

sulfónico – S), à sua posição no anel (meta – m ou para – p) e ao componente de ligação

(guaiacol – g ou siringol – s). Utilizaram-se assim os oito corantes (Figura 5): ácido meta-

aminobenzenosulfónico-guaiacol (Sm-g), ácido para-aminobenzenosulfónico-guaiacol (Sp-g),

ácido meta-aminobenzenosulfónico-siringol (Sm-s), ácido para-aminobenzenosulfónico-siringol

(Sp-s), ácido meta-aminobenzóico-guaiacol (Cm-g), ácido para-aminobenzóico-guaiacol (Cp-g),

ácido para-aminobenzóico-siringol (Cm-s), ácido para-aminobenzóico-siringol (Cp-s).

5.5. Síntese dos corantes azo

Oito corantes azo foram sintetizados por Ferreira (1998) por diazotação de ácidos meta ou para

aminobenzoicos ou aminosulfónicos (componentes diazo) e a sua junção com guaiacol ou

siringol (componentes de acoplamento) (Figura 6).

Figura 6: Esquema da síntese dos corantes azo (retirada de MARTINS et al., 2001).

A uma solução de componentes diazo (25 mmol) em NaOH 5 % (16 mL) e água (4 mL) foi

adicionada uma solução de NaNO2 (20 mmol) em água (4 mL). A solução resultante foi

adicionada lentamente e com agitação constante a uma mistura de HCl concentrado (4 mL) e

gelo (50 g) mantendo a temperatura entre 0 e 5 ºC, tendo-se formado um precipitado. Depois o

ácido diazotado foi adicionado à solução gelada de acoplamento (20 mmol) em NaOH a 5 %

(40 mL), com agitação. Finalmente, NaCl (40 g) foi adicionado e a mistura foi agitada

continuamente durante 30 minutos à temperatura ambiente. O corante azo precipitado foi

filtrado e lavado com etanol e éter. Os corantes sintetizados (Figura 5) foram caracterizados

utilizando espectroscopia de UV-visível, IV e H-NMR e espectroscopia de massa. A

nomenclatura apresentada, expressa o componente diazo → componente de acoplamento, é

usada na química têxtil ara sugerir o processo de síntese (MARTINS et al., 2001).

5.6. Estudos feitos com os corantes azo utilizados

Estes corantes foram sintetizados com ácido aminobenzóico e aminosulfónico como

componentes diazo e com grupos bioacessíveis como 2-metoxifenol (guaiacol) e 2,6-

dimetoxifenol (siringol) como componentes de acoplamento. Estes grupos bioacessíveis estão

presentes na estrutura da lenhina e parecem ser pontos de acesso para as enzimas linholíticas

produzidas por fungos como o Phanerochaete chrysosporium (MARTINS et al., 2001).

Foram realizados também estudos comparativos de degradação fúngica destes corantes azo

reactivos simples ou misturados (MARTINS et al., 2003); e estudos sobre a biodegradação de

corantes azo têxteis por Phanerochaete chrysosporium (MARTINS et al., 2001).

6. METODOLOGIA

6.1. Microorganismo

O organismo unicelular que serve de bioindicador para esta investigação é o protozoário

Tetrahymena pyriformis da estirpe CCAP 1630/1W, obtido da Colecção de Culturas de Estirpes

de Algas e Protozoários do Reino Unido. As células do banco de colecção foram mantidas em

cultura na estufa, a uma temperatura constante de 25 ºC em meio PPY - Proteose Peptone

Yeast Extract Médium (CCAP,1995), sendo periodicamente - cada 2 meses - sujeitas a

rejuvenescimento.

6.2. Condições de cultura e exposição a corantes azo

Todos os ensaios toxicológicos utilizaram culturas axénicas, de 18 a 24 horas, de Tetrahymena

pyriformis. As células cresceram até à fase exponencial na estufa a 25 ºC, em meio de PPY (2

% de proteose peptona e 0,25 % de extracto de levedura) a pH entre 7,0 e 7,5. Antes da

esterilização por autoclavagem, o meio foi filtrado utilizando filtros com porosidade de 0,45 µm,

de modo a eliminar partículas que pudessem interferir com a observação microscópica e

contagem electrónica de células.

Todos os ensaios foram efectuados com uma densidade inicial de cultura entre as 8000 e as

11000 células/mL. Estas densidades foram conseguidas através da concentração por

centrifugação das culturas celulares em tubos de 50 mL, numa centrífuga Sigma 4K15, a uma

velocidade de 4500 rpm, durante 2 minutos, após a qual foi retirada cerca de metade do

sobrenadante. Da cultura concentrada de células foi retirada uma amostra de 500 µL, diluída

em 1 mL posteriormente em água destilada, perfazendo um volume final de 1,5 mL num tubo

Eppendorf de 2 mL. Foram retiradas três amostras de 30 µL, às quais se adicionaram 30 µL de

formalina a 4 %; as amostras foram observadas num microscópio óptico Leica DMR a uma

ampliação de 100x e determinou-se o número total de células em cada amostra, fazendo-se

depois a média das três amostras. Para se obter densidades entre as 8000 e as 11000

células/mL, em cada amostra de 30 µL, deveríamos ter entre 250 a 400 células.

Os corantes azo estudados foram adicionados às culturas celulares nas seguintes

concentrações: 5, 25, 50 e 100 ppm, tendo sido as células não expostas ao corante usadas

como controlo. As células de T. pyriformis tratadas e não tratadas foram incubadas em tubos

Eppendorf de 2 mL, num volume total de 1,5 mL (DIAS et al., 2003). O pequeno volume destes

tubos não provoca a baixa oxigenação da cultura, uma vez que Dias et al. (2002) levaram a

cabo dois ensaios nos quais comparam as condições de crescimento de culturas celulares em

tubos Eppendorf de 2 mL e em tubos de plástico de 12 mL, encontrando uma elevada

correlação de taxa de crescimento em ambos os ensaios (r2=0,989).

Os ensaios foram realizados nas mesmas condições, sem stress adicional por esfomeamento,

competição por alimento ou mudança das condições ambientais (NICOLAU et al., 2001).

6.3. Compostos tóxicos e suas concentrações

Os oito corantes (Figuras 5 e 7), previamente descritos, foram sintetizados por investigadores

da Universidade do Minho (FERREIRA, 1998), e são os seguintes:

� ácido meta-aminobenzenosulfónico-guaiacol (Sm-g)

� ácido para-aminobenzenosulfónico-guaiacol (Sp-g)

� ácido meta-aminobenzenosulfónico-siringol (Sm-s)

� ácido para-aminobenzenosulfónico-siringol (Sp-s)

� ácido meta-aminobenzóico-guaiacol (Cm-g)

� ácido para-aminobenzóico-guaiacol (Cp-g)

� ácido meta-aminobenzóico-siringol (Cm-s)

� ácido para-aminobenzóico-siringol (Cp-s)

A

B

Figura 7 A e B: Corantes azo em pó (A) e soluções stock de 500 ppm dos corantes azo utilizados para

os ensaios de toxicidade (B).

Os corantes foram administrados às culturas celulares através de oito soluções para as quatro

concentrações de corantes estipuladas: 5, 25, 50 e 100 ppm. Para tal foram previamente

preparadas duas soluções stock de todos os corantes utilizados: solução stock A de 1000 ppm

e solução stock B de 500 ppm (Figura 7). Antes da esterilização por autoclavagem, as soluções

foram filtradas utilizando filtros com porosidade de 0,45 µm, e mantiveram-se ao abrigo da luz,

uma vez que os corantes são fotossensíveis.

As culturas celulares expostas aos corantes azo nas quatro concentrações estipuladas: 5, 25,

50 e 100 ppm, foram realizadas da seguinte forma:

� 100 ppm - 150 µL de solução stock A dos corantes + 350 µL de água destilada + 500

µL de PPY concentrado 2x + 500 µL de cultura de T. pyriformis;

� 50 ppm - 75 µL de solução stock A dos corantes + 425 µL de água destilada + 500 µL

de PPY concentrado 2x + 500 µL de cultura de T. pyriformis;

� 25 ppm - 75 µL de solução stock B dos corantes + 425 µL de água destilada + 500 µL

de PPY concentrado 2x + 500 µL de cultura de T. pyriformis;

� 5 ppm - 15 µL de solução stock B dos corantes + 485 µL de água destilada + 500 µL de

PPY concentrado 2x + 500 µL de cultura de T. pyriformis;

6.4. Ensaios de Determinação de Toxicidade

6.4.1. Ensaios Fisiológicos Toxicológicos

As culturas celulares de T. pyriformis foram expostas a corantes azo em ensaios com a duração

de 48 horas. Foram realizados dois ensaios independentes para cada concentração dos oito

corantes azo, com duas a quatro réplicas. Os corantes foram adicionados às células nas

seguintes concentrações: 5, 25, 50 e 100 ppm, as células não expostas ao corante foram

usadas como controlo. As células de T. pyriformis tratadas e não tratadas foram incubadas em

tubos Eppendorf de 2 mL, num volume total de 1,5 mL (DIAS et al., 2003), para cada tempo de

amostragem (1, 24 e 48 horas).

a. Ensaios de Crescimento:

Contagem de células no contador automático de células

Para a contagem automática das células, estas têm que estar suspensas num electrólito. A

suspensão de células é retirada, através de vácuo, por uma abertura com um diâmetro

conhecido, inserida num tubo com eléctrodos, que criam uma corrente eléctrica que atravessa a

abertura. Cada célula que passa na abertura desloca um volume igual de electrólito, causando

uma resistência na corrente eléctrica. Esta modulação é detectada pelo aparelho através de um

sinal. Estes sinais são amplificados electronicamente e contados automaticamente. O aparelho

tem que ser calibrado para as células e volumes pretendidos e é estabelecido um tamanho

superior e um inferior para eliminar as contagens acima ou abaixo destes tamanhos,

respectivamente (TEUNISSON, 1971).

Dimensões celulares e ajuste do contador automático de células

Os ajustes do aparelho - Beckman Coulter Z Series (E.U.A.) - para um tubo capilar de abertura

de 140 µm, foi realizado previamente para um volume de contagem de 1 mL. As células são

contadas de acordo com o seu volume e não com a sua forma. Antes de cada ensaio procedeu-

se à confirmação dos valores pré-definidos no setup, que se evidenciam na Tabela 3. Foram

escolhidos os valores relativos aos tamanhos mais predominantes, ou seja entre 10 e 30 µm.

As contagens foram realizadas para células com tamanhos menores do que 10 µm, tamanhos

entre 10 e 30 µm e tamanhos acima do 30 µm. Foram retiradas amostras de 1,5 mL, das

culturas controlo e das expostas aos corantes, às 1, 24 e 48 horas, as quais foram diluídas

1:10; 1:20 e 1:30, respectivamente, numa solução salina isotónica – ISOTON II (Beckman

Coulter, E.U.A.). Para cada amostra diluída fez-se a contagem das células vivas em quatro sub-

amostras de 1 mL, a partir das quais se calculou o valor médio das quatro contagens. Para

minimizar erros de contagem as diluições foram realizadas para garantir uma concentração

baixa de solução, sendo a ideal abaixo dos 5 %.

Tabela 3: Setup do contador automático de células -Beckman Coulter Z Series - para um tubo capilar de

abertura de 140 µm.

Abertura Limite de tamanho inferior Limite de tamanho superior

140 µm 10 µm 30 µm

O aparelho foi verificado periodicamente, tendo sido limpo com solução salina ISOTON II, após

longos períodos sem utilização (mais do que 15 dias). Quando as contagens davam erros de

leitura que poderiam estar associados a detritos acumulados no aparelho, procedeu-se à sua

limpeza através do esvaziamento e enchimento da abertura com ISOTON II, ou mesmo através

do esvaziamento e enchimento de todo o sistema.

b. Ensaios de Morfometria:

Com este método pretendeu-se saber qual a alteração da morfologia celular por exposição aos

vários corantes. Assim, amostras tratadas e não tratadas foram fixadas durante 1 hora em

solução NBF (Formalina Neutra Tamponizada), lavadas e coradas com azul toluidina a 0,01 %

(Sigma). Sub-amostras de 50 µL de cultura suspensa foram colocadas em lâminas e analisadas

com um microscópio óptico invertido (Nikon Diaphot 300) a uma ampliação de 100x. Procedeu-

se seguidamente à análise da imagem com uma câmara de vídeo monocromática CCD (Sony

AVCD5CE), binarizada e os dados foram analisados pelo software MATLAB 5.1 (The

Mathworks Inc., Natick) de modo a determinar a área e a razão (W/L) dos eixos mais curto (W)

e mais longo (L) das células. Os parâmetros morfológicos foram determinados através da

imagem binária final. Foi realizada uma calibração prévia, através de uma lâmina com uma rede

graduada, ajustada para um milímetro. A uma ampliação de 100x, 0,5 mm correspondiam a um

valor médio de 459 pixels no ecrã do computador. Seguindo as mesmas condições para a

captura de imagem, o equivalente entre pixels e micrómetros foi calculado segundo a equação:

1 pixel = 1, 089 µm. Em cada sub-amostra, foram analisadas aleatoriamente 100 células nos

seguintes tempos de amostragem: 1 e 48 horas (DIAS et al.. 2003).

c. Ensaios de Predação:

Estes ensaios foram realizados em tubos Eppendorf de 2 mL, por adição de microesferas

amarelo-esverdeadas fluorescentes de látex (FluoSpheres , Molecular Probes, E.U.A.) com

0,5 µm de diâmetro, às células tratadas e às células controlo. Foi utilizada uma concentração

final de aproximadamente 1,05x106 microesferas/mL em meio PPY de acordo com Dias et al..

(2003). Ensaios realizados anteriormente determinaram qual o tamanho e a concentração de

microesferas que possibilitava a melhor observação microscópica e a contagens subsequente

de microesferas predadas. Sherr et al. (1987 in NICOLAU et al., 1999) realizou experiências

com ciliados fagotróficos estuarinos e mostrou que estes ingeriam as bactérias fluorescentes a

uma taxa superior do que ingeriam as microesferas de tamanho idêntico, o que indica que este

ensaio pode subestimar a predação. No entanto, este ensaio apenas pretende avaliar a

toxicidade dos corantes azo em Tetrahymena pyriformis.

Para cada concentração e cada corante, após 20 minutos de incubação no escuro, as amostras

são mortas e fixadas pela adição de solução de NBF (10 % (v/v) de formalina em tampão

fosfato salino (PBS) de pH 7,0, a uma concentração final de 2-5 % (v/v)) durante 1 hora.

Procedeu-se depois à lavagem e ressuspensão de células em azida de sódio a 0,1 % (p/v), em

PBS, e armazenadas no escuro até à análise subsequente com um microscópio epifluorescente

(ZEISS Axioskop). Cada sub-amostra, retirada às 1, 24 e 48 horas, foi observada a uma

ampliação de 100x; quando uma célula era localizada, a luz incidente foi mudada para luz UV

(com filtro de excitação EX 450-490 nm, espelho FT 510 e filtro de barreira BA 520) e foi

contado o número de microesferas ingeridas, com uma ampliação de 1000x. Em cada sub-

amostra, retirada de cada ensaio, as 30 células foram analisadas e o número total de

microesferas ingeridas foi determinado para os dois ensaios independentes. (NICOLAU et al.,

1999; DIAS et al.. 2003).

6.4.2. Ensaios Bioquímicos Toxicológicos

6.5. Tratamento estatístico dos dados

Depois da realização dos ensaios procedeu-se à análise estatística dos dados. Em primeiro

lugar realizaram-se testes F para comparar as variâncias de duas amostras de dados

(comparou-se sempre os controlos com cada um dos corantes, para cada concentração e

tempo de amostragem). De acordo com os resultados obtidos realizaram-se posteriormente

testes t de Student para variâncias iguais e testes t de Student para variâncias desiguais, para

verificar se as médias de duas amostras eram significativamente diferentes (comparou-se

sempre os controlos com cada um dos corantes, para cada concentração e tempo de

amostragem). Utilizaram-se os testes F e os testes t de Student para a análise estatística de

todos os ensaios: crescimento, predação e morfometria. Realizaram-se também análises de

variância com factor único (ANOVA) (quando as variâncias das amostras eram iguais) e testes t

de Student para variâncias desiguais para verificar se as médias dos seguintes grupos: siringol-

guaiacol (s-g); carboxílico-sulfónico (C-S) e meta-para (m-p), eram significativamente diferentes.

Foram aceites os valores de p<0,05 como nível de significância estatística entre grupos (DIAS

et al.. 2003) e o p<0,01 foi utilizado para enfatizar o maior nível de significância estatística

obtida. Todo o tratamento estatístico foi realizado no software Microsoft Excel 2003.

7. RESULTADOS

Os resultados são apresentados por ordem alfabética: crescimento, morfometria e predação. Os

resultados dos ensaios de crescimento e morfometria apresentam-se em gráficos e tabelas de

significância onde se registam os valores de p estatístico. Os resultados dos ensaios de

predação apresentam-se em tabelas de médias, desvios-padrão com os valores de p.

Foram apenas considerados para a análise de resultados os valores estatisticamente

significativos para p<0,05 e p<0,01, caso estes se registassem em ambos os ensaios realizados

para cada parâmetro (estes encontram-se assinalados a cinza nas respectivas tabelas). Nas

tabelas encontram-se a itálico os valores de p>0,05.

Para cada parâmetro analisaram-se os resultados e, por último, fez-se uma síntese, dando

especial ênfase aos efeitos globais causados por cada corante azo estudado.

7.1. Crescimento

Embora se tenham realizados dois ensaios independentes, apenas se apresenta um deles

(SEWARD et al., 2001). Os resultados obtidos num de dois ensaios independentes de

crescimento são apresentados na Figura 8. Apresenta-se apenas um dos gráficos, uma vez que

as diferenças entre eles não aparentam ser muito relevantes. Em cada gráfico estão patentes

as médias de quatro réplicas retiradas em cada tempo de amostragem e o respectivo desvio-

padrão.

Conforme se observa na Figura 8 e de acordo com a Tabela 4, à medida que as concentrações

dos corantes foram aumentando, aumentaram globalmente as diferenças significativas entre os

controlos e os corantes. De uma forma geral encontram-se mais diferenças significativas nos

corantes sulfónicos do que nos corantes carboxílicos. Seguidamente será feita a análise dos

resultados relativos a cada corante, para todas as concentrações:

Cm-g: este corante não possui toxicidade para as concentrações de 5, 25 e de 100 ppm. Para

uma concentração de 50 ppm registou-se uma diferença significativa (p<0,01) entre este

corante e o controlo depois de 1 hora de exposição.

Cp-g: este corante não possui toxicidade para a concentração de 5 ppm. Já para as

concentrações de 25 e 100 ppm o corante inibiu o crescimento de Tetrahymena pyriformis às 24

e 48 horas significativamente (p<0,05). Para uma concentração de 50 ppm o corante apenas

inibiu o crescimento após 1 hora de exposição, tendo a seguir recuperado, embora se note um

crescimento menor que o controlo, no entanto não significativo estatisticamente. Em todas as

concentrações e de um modo geral este corante inibiu o crescimento de Tetrahymena

pyriformis.

A B

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

1 24 48

Tempo de exposição (horas)

n.º

cél

ula

s/ m

l

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

C D

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

1 24 48

Tempo de exposição (horas)

n.º

cél

ula

s/ m

l

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

1 24 48

Tempo de exposição (horas)

n.º

cél

ula

s/ m

l

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

Figura 8: Crescimento de Tetrahymena pyriformis exposta a quatro concentrações de corantes azo: 5

ppm (gráfico A), 25 ppm (gráfico B), 50 ppm (gráfico C) e 100 ppm (gráfico D), em ensaios de 48 horas.

Para cada tempo de amostragem são representadas a médias e os desvios padrão de quatro réplicas.

Sm-g: este corante revelou-se mais tóxico apenas nos ensaios para a concentração de 5 ppm,

uma vez que às 24 horas este provocou uma acentuada quebra no crescimento relativamente

ao controlo e aos outros corantes. Este decréscimo foi registado igualmente às 48 horas. Para

as concentrações de 25 e 50 ppm apenas se registou diferenças significativas (p<0,01 e

p<0,05, respectivamente) em relação ao controlo após 1 hora de exposição, tendo a população

de Tetrahymena recuperado o crescimento. Para a concentração de 100 ppm houve diferenças

significativas em relação ao controlo para níveis de significância de 0,01 às 24 horas de

exposição, tendo a população recuperado seguidamente.

Sp-g: este corante revelou valores de crescimento irregulares quando comparado com o

controlo. Para a concentração de 5 ppm apenas registou um crescimento menor e

significativamente diferente para p<0,05 às 48 horas de exposição; para a concentração de 50

0 20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

1 24 48 Tempo de exposição (horas)

n.º

cél

ula

s/ m

l

Controlo

Cm-g Cp-g Sm-g Sp-g Sm-s Sp-s Cm-s Cp-s

ppm registou um crescimento menor e significativamente diferente para p<0,01 à 1 e para

p<0,05 às 48 horas de exposição; para a concentração de 100 ppm registou um crescimento

maior e significativamente diferente para p<0,01 às 24 horas de exposição.

Sm-s: este corante revelou um comportamento irregular similar ao corante Sp-g, uma vez que

para a concentração de 5 ppm apenas registou um crescimento menor e significativamente

diferente para p<0,01 às 48 horas de exposição; para a concentração de 50 ppm registou um

crescimento menor e significativamente diferente para diferente para p<0,01 à 1 e para p<0,05

às 24 horas de exposição; para a concentração de 100 ppm registou um crescimento maior e

significativamente diferente para p<0,01 às 24 horas de exposição.

Sp-s: este corante registou para a concentração de 5 ppm um crescimento menor e

significativamente diferente para p<0,01 após 48 horas de exposição; para a concentração de

25 ppm este corante revelou um crescimento menor que o controlo significativamente diferente

(p<0,05) após 1 hora de exposição; para a concentração de 50 ppm registou um crescimento

menor e significativamente diferente para diferente para p<0,05 após 24 horas de exposição;

para a concentração de 100 ppm registou um crescimento maior e significativamente diferente

para p<0,05 após 1 hora de exposição e p<0,01 após 24 horas.

Cm-s: este corante condicionou globalmente para todas as concentrações um crescimento

inferior relativamente ao controlo, no entanto apenas na concentração de 100 ppm consegue

obter valores de crescimento menores e significativamente diferentes do controlo. Desta forma

às 24 horas os valores mostram-se estatisticamente diferentes para p<0,01 e às 48 horas para

um p<0,05. A seguir ao corante Cm-g é o que apresenta menos diferenças significativas

relativamente aos valores de crescimento do controlo.

Cp-s: este corante influenciou um crescimento irregular para todas as concentrações: às 48

horas de exposição para as concentrações de 5 e 25 ppm o crescimento foi antagónico, ou

seja, inibiu o crescimento significativamente (p<0,01) e aumentou o crescimento

significativamente (p<0,05), respectivamente. Para a concentração de 100 ppm o corante

mostrou-se significativamente diferente do controlo para um valor de p<0,05.

Tabela 4: Resultados dos testes t de Student para a comparação das médias de n.º de células/mL de

amostras sujeitas aos corantes com as médias dos controlos, para todas as concentrações e tempos de

amostragem, em dois ensaios independentes (1 e 2); os valores apresentados representam o valor do p

estatístico.

Corantes Crescimento

Ensaio 1 2 1 2 1 2

Tipo Conc. (ppm) 1 hora 24 horas 48 horas

Cm-g 5 5,6E-06 0,46810 0,12497 0,00519 1,3E-07 1,9E-04 25 0,06373 0,00164 0,54622 0,46639 0,47031 0,00618 50 0,00361 0,00799 0,11803 1,8E-04 0,10197 0,06852

100 8,2E-10 0,08300 0,00164 0,08452 0,00211 0,05886

Cp-g 5 4,2E-04 0,86842 0,12005 0,84706 0,06368 0,49514

25 0,06234 9,0E-05 0,01492 1,8E-04 0,04411 0,01444 50 0,03693 0,02518 0,25408 4,1E-07 0,06427 0,03331 100 0,04313 0,07175 0,01131 9,2E-07 1,4E-07 2,7E-07

Sm-g 5 1,1E-06 0,73173 4,0E-05 0,02532 1,7E-05 0,01143 25 1,7E-08 1,4E-04 0,68120 0,15469 0,67698 0,03406 50 0,04548 0,01379 0,41133 5,8E-05 0,16815 0,00867 100 0,13093 0,03034 0,00642 8,1E-04 1,2E-05 0,91752

Sp-g 5 9,5E-08 0,91291 0,00384 0,41824 0,04787 0,00349

25 2,9E-06 0,11207 0,25748 3,2E-04 0,37688 0,00252 50 2,7E-04 0,00726 0,23136 4,1E-07 0,02443 0,01477 100 2,9E-04 0,0660 6,9E-04 6,4E-08 0,10652 0,02144

Sm-s 5 9,0E-07 0,51559 0,06406 0,00829 7,3E-05 0,00549 25 0,05994 0,13466 0,84698 9,4E-04 0,48342 0,10603

50 1,5E-04 0,00873 0,01071 6,2E-05 0,20912 0,12333

100 0,00197 0,26603 1,7E-04 1,5E-05 0,44236 6,1E-05

Sp-s 5 1,1E-04 0,42211 0,97987 8,7E-04 1,6E-04 1,0E-05 25 0,00606 0,01864 0,40828 0,06240 0,11838 0,26732

50 0,39469 0,17120 0,02367 1,3E-06 0,63466 0,00429 100 0,00177 0,01794 0,00782 7,5E-09 0,07605 0,34454

Cm-s 5 9,4E-07 0,52397 0,05147 0,15192 1,8E-04 0,42810

25 0,09850 0,14300 0,14356 0,99253 0,51208 0,03220

50 0,15639 0,00281 0,57400 3,6E-05 0,00430 0,08284

100 0,84812 0,01996 0,00240 7,1E-07 3,9E-07 0,04492

Cp-s 5 9,4E-07 0,86723 0,23141 0,21083 1,9E-08 1,2E-04 25 1,0E-04 0,65902 0,18112 0,00468 0,02313 0,01977 50 0,00114 0,84447 0,07787 1,1E-04 0,13046 0,16884

100 0,47539 0,02127 0,04125 8,5E-04 0,85383 0,00274

Relativamente aos resultados do teste ANOVA (registados na Tabela 5), quanto à comparação

entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s);

carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem,

apenas se registou uma diferença significativa. Os resultados mostram que no ensaio 1

realizado para o crescimento há uma diferença significativa entre os grupos de corantes com

guaiacol e com siringol.

Tabela 5: Resultados dos testes ANOVA para o crescimento de Tetrahymena pyriformis. A tabela faz a

comparação entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s);

carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem. Os valores

apresentados representam o valor do p estatístico.

7.2. Morfometria

Embora se tenham realizado dois ensaios independentes, apenas se apresenta um deles

(SEWARD et al., 2001). Os resultados obtidos num de dois ensaios independentes de

morfometria são apresentados nas Figuras 9 e 10. Apresenta-se apenas um dos gráficos, uma

vez que as diferenças entre eles não aparentam ser muito relevantes.

Estão representados nas Figuras 9 e 10, respectivamente, os efeitos da exposição a diferentes

concentrações de corantes azo na área e na razão W/L de Tetrahymena pyriformis, em ensaios

de 48 horas, para concentrações de 5, 25, 50 e 100 ppm. Em cada gráfico estão patentes as

médias de quatro réplicas retiradas em cada tempo de amostragem e o respectivo desvio-

padrão.

Grupos de Ensaio Crescimento

corantes 1 hora 24 horas 48 horas

g-s 1 0,97894 0,86530 0,03806 2 0,72822 0,68213 0,06867

C-S 1 0,42627 0,61737 0,33407

2 0,69345 0,14303 0,10550

m-p 1 0,38404 0,82828 0,98973

2 0,38410 0,93030 0,09308

A B

0

200

400

600

800

1000

1200

1 48

Tempo de exposição (horas)

Áre

a ( µµ µµ

m)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

0

200

400

600

800

1000

1200

1 48

Tempo de exposição (horas)

Áre

a ( µµ µµ

m)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

C D

0

200

400

600

800

1000

1200

1 48

Tempo de exposição (horas)

Áre

a ( µµ µµ

m)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

0

200

400

600

800

1000

1200

1 48

Tempo de exposição (horas)Á

rea

( µµ µµm

)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

Figura 9: Efeito da exposição a diferentes concentrações de corantes azo no tamanho (área) de

Tetrahymena pyriformis, em ensaios de 48 horas. As concentrações usadas foram de 5 ppm (gráfico A),

25 ppm (gráfico B), 50 ppm (gráfico C), e 100 ppm (gráfico D). Para cada tempo de amostragem são

representadas a médias e os desvios padrão de quatro réplicas.

De acordo com a Figura 9 e com a Tabela 6, nota-se de forma geral que as diferenças entre as

áreas dos controlos e as áreas dos corantes para ambos os tempos de amostragem são

escassas. À medida que aumentam as concentrações dos corantes, foram-se verificando mais

diferenças significativas globais quando comparamos as médias dos corantes com as dos

controlos, sendo essas diferenças acentuadas com o aumento da concentração e para as

amostragens realizadas após 48 horas de exposição. Apresenta-se, de seguida, a análise dos

resultados relativos a cada corante, para todas as concentrações:

Cm-g: este corante apresentou, apenas, uma diferença relativa ao controlo às 48 horas, para

uma concentração de 100 ppm. Verificou-se que houve um aumento significativo da área

(p<0,05) das células de Tetrahymena pyriformis relativamente ao controlo.

Sm-g: este corante registou, apenas, uma diferença significativa após 1 hora de exposição,

para uma concentração de 50 ppm. Verificou-se que houve um aumento significativo da área

(p<0,05) das células tratadas relativamente ao controlo.

Sp-g: este corante registou já mais diferenças, tendo sido verificadas sempre às 48 horas de

exposição e para as concentrações de 25, 50 e 100 ppm. A área das células expostas a este

corante aumentaram significativamente relativamente às células do controlo, para um valor de

p<0,05 e para um valor de p<0,05 relativamente à maior concentração testada (100 ppm).

Sm-s: este corante registou diferenças significativas relativamente ao controlo, apenas para

tempos de exposição de 48 horas, nas concentrações de 25 ppm e 100 ppm. A área das

células expostas a este corante aumentaram significativamente na concentração de 25 ppm

(p<0,05) e na concentração de 100 ppm (p<0,01), mostrando que a área das células aumentou

relativamente à área das células do controlo.

Sp-s: este corante registou, apenas, uma diferença significativa após 48 horas de exposição,

para uma concentração de 5 ppm. Verificou-se que houve um aumento significativo da área

(p<0,01) das células tratadas relativamente às células do controlo.

Cp-s: este corante apresentou duas diferenças relativas ao controlo às 48 horas, para as

concentrações de 50 e 100 ppm. Verificou-se que houve um aumento significativo da área

(p<0,01) das células de Tetrahymena pyriformis relativamente ao controlo.

Cp-g e Cm-s: estes corantes não registaram diferenças significativas para qualquer

concentração utilizada e para cada tempo de amostragem.

Da análise acima referida, podemos verificar que em todos os casos de diferenças significativas

relativamente às áreas celulares, quando comparados com as células do controlo, os corantes

provocaram um aumento das áreas celulares.

De acordo com a Figura 10 e com a Tabela 7, pode-se referir que as diferenças entre a razão

eixo menor/eixo maior (W/L) nas células tratadas e nas células não tratadas são ainda menos

do que as verificadas para as áreas das células. Neste caso verificam-se mais diferenças na

concentração de 50 ppm do que nas restantes. Apresenta-se, de seguida, relativamente ao

parâmetro razão (W/L), a análise dos resultados relativos a cada corante, para todas as

concentrações:

A B

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

1 48

Tempo de exposição (horas)

Raz

ão

(W

/L)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,50,6

0,7

0,8

0,9

1

1 48

Tempo de exposição (horas)

Raz

ão (

W/L

)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

C D

0

0,10,2

0,30,4

0,5

0,60,7

0,80,9

1

1 48

Tempo de exposição (horas)

Raz

ão (

W/L

)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1 48

Tempo de exposição (horas)

Raz

ão (

W/L

)

Controlo

Cm-g

Cp-g

Sm-g

Sp-g

Sm-s

Sp-s

Cm-s

Cp-s

Figura 10: Efeito da exposição a diferentes concentrações de corantes azo na razão (W/L) do eixo menor

(W) e maior (L) de Tetrahymena pyriformis, em ensaios de 48 horas. As concentrações usadas foram de

5 ppm (gráfico A), 25 ppm (gráfico B), 50 ppm (gráfico C), e 100 ppm (gráfico D). Para cada tempo de

amostragem são representadas a médias e os desvios padrão de quatro réplicas.

Cp-g: este corante registou, apenas, uma diferença significativa após 1 hora de exposição, para

uma concentração de 50 ppm. Verificou-se que houve uma diminuição significativa (p<0,01) na

razão (W/L) relativamente ao controlo, indicando uma forma celular mais alongada do que a

apresentada pelas células controlo.

Sm-g: este corante marcou, uma diferença significativa após 48 horas de exposição, para uma

concentração de 50 ppm. Verificou-se que houve uma diminuição significativa (p<0,01) na razão

(W/L) relativamente ao controlo, indicando uma forma celular mais alongada do que a

considerada normal (controlo).

Sp-g: este corante apresentou de forma semelhante ao corante Cp-g apenas uma diferença

significativa após 1 hora de exposição, para uma concentração de 50 ppm. Verificou-se

igualmente que houve uma diminuição, embora menos significativa (p<0,05) na razão (W/L)

relativamente ao controlo, indicando uma forma celular mais alongada do que a apresentada

pelas células do controlo.

Sp-s: este corante registou o inverso do que tem sido analisado, ou seja, verificou-se que na

concentração mais elevada testada (100 ppm) e no maior tempo de exposição (48 horas) este

corante provocou um arredondamento celular significativamente superior (p<0,05) ao registado

para o controlo. A toxicidade neste caso teve um efeito diferente na forma das células

relativamente ao que foi registado para os restantes corantes analisados.

Cm-s: este corante provocou na concentração de 25 ppm, às 48 horas, um significativo

alongamento das células (p<0,05) comparativamente ao controlo. Este efeito já foi registado

anteriormente noutros corantes para a concentração de 50 ppm.

Cm-g, Sm-s e Cp-s: estes corantes não registam diferenças significativas relativamente à

razão (W/L) para qualquer concentração utilizada e para cada tempo de amostragem.

Quando se analisa a Tabela 8, relativa aos resultados do teste ANOVA, quanto à comparação

entre médias de áreas e razões W/L de grupos de corantes de todas as concentrações,

guaiacol-siringol (g-s); carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos

de amostragem, verifica-se que existem várias diferenças significativas dentro destes grupos

em ambos os ensaios realizados (ensaios 1 e 2). Relativamente ao parâmetro área das células

de Tetrahymena pyriformis verifica-se diferenças significativas, à 1 hora em dois grupos

distintos e em ambos os ensaios: guaiacol-siringol (g-s) para um valor de p<0,01 e meta e para

(m-p), assumindo valor de p<0,05. Esta diferença mantém-se no apenas no ensaio 1, em

ambos os grupos, após 48 horas de exposição. Quanto ao parâmetro morfométrico - razão W/L

– nota-se que existem diferenças significativas entre os seguintes grupos de corantes:

� grupo guaiacol-siringol (g-s) às 48 horas, em ambos os ensaios, para valores de p<0,05;

� grupo carboxílico-sulfónico (C-S) à 1 hora, em ambos os ensaios para valores de

p<0,05;

� grupo meta-para (m-p) em ambos os tempos de amostragem para valores de p<0,01.

Analisando os dois parâmetros (área e razão W/L) simultaneamente pode-se constatar que:

� os efeitos tóxicos entre os grupos de corantes guaiacol-siringol (g-s) são

significativamente diferentes consoante o parâmetro morfométrico analisado, uma vez

que se manifestaram efeitos tóxicos relativamente às áreas após uma hora de exposição

e relativamente à razão W/L após 48 horas de exposição;

Tabela 6: Resultados dos testes t de Student, para a comparação de médias das áreas de amostras

sujeitas aos corantes com as médias dos controlos, para todas as concentrações e tempos de

amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico.

Corantes Morfometria (áreas)

Ensaio 1 2 1 2

Tipo Conc. (ppm) 1 hora 48 horas

Cm-g 5 0,28886 0,51031 0,74846 0,00134 25 0,10094 3,48E-05 2,21E-05 0,19843

50 0,23728 0,34881 2,24E-09 0,00021 100 2,85E-06 0,20680 1,2E-05 0,01215

Cp-g 5 0,68665 0,54153 0,02412 0,22624

25 0,17857 3,24E-06 9,52E-06 0,75207

50 0,16146 0,00112 1,15E-04 0,21841

100 0,30942 0,40945 3,07E-04 0,11054

Sm-g 5 0,40184 0,71977 0,37552 0,68360

25 0,06750 3,89E-11 8,66E-09 0,96133

50 0,03296 0,00312 0,00434 0,05165

100 2,33E-05 0,63412 0,08838 0,97663

Sp-g 5 0,26047 0,25131 0,77413 0,10075

25 0,47751 5,1E-08 0,04927 0,01584 50 0,42635 7,09E-05 0,01337 0,00634 100 4,08E-07 0,46771 3,27E-14 2,35E-04

Sm-s 5 0,77607 0,84544 0,31957 0,01287 25 0,46570 1,04E-05 0,00254 0,03119 50 0,21733 0,33529 4,74E-07 0,08863

100 0,25708 0,44162 7,69E-06 0,00241

Sp-s 5 0,55630 0,71570 0,00794 0,00133 25 0,31324 5,01E-09 0,18832 0,66165

50 0,00435 0,19519 7,56E-05 0,89713

100 0,11012 1,59E-07 2,28E-05 0,05781

Cm-s 5 0,38537 0,70568 0,54583 0,14174

25 0,89844 1,46E-11 0,72850 0,23987

50 0,35935 0,16046 9,43E-08 0,87239

100 0,23636 0,23390 1,21E-04 0,54992

Cp-s 5 0,60599 0,25483 0,26225 0,13232

25 0,56325 2,8E-07 5,36E-06 0,44375

50 0,60605 0,58697 9,2E-07 3,06E-05 100 0,00227 0,21646 2,33E-05 1,99E-07

Tabela 7: Resultados dos testes t de Student para a comparação das médias das razões (W/L) de

amostras sujeitas aos corantes com as médias dos controlos, para todas as concentrações e tempos de

amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico.

Corantes Morfometria (razões W/L)

Ensaio 1 2 1 2

Tipo Conc. (ppm) 1 hora 48 horas

Cm-g 5 0,24458 0,11882 0,28730 0,00205

25 0,19959 0,00035 0,71012 0,24045

50 4,11E-16 0,66816 4,49E-14 0,31062

100 0,29990 0,88772 0,62682 0,00960

Cp-g 5 0,34405 0,08526 9,61E-05 0,25837

25 0,25465 9,21E-05 0,22754 0,26474

50 4,97E-16 1,9E-04 1,76E-30 0,05881

100 0,48773 0,03614 0,13260 0,06472

Sm-g 5 0,39019 0,49394 0,32690 0,21387

25 0,89062 0,00035 0,71939 0,78671

50 8,04E-24 0,34352 1,76E-26 5,17E-04

100 0,01188 0,03614 0,52408 0,3015

Sp-g 5 0,05897 0,23569 0,06387 0,53330

25 0,73316 0,00351 0,01021 0,37961

50 0,02304 0,03602 5,75E-14 0,14326

100 0,00333 0,21755 0,06663 0,00131

Sm-s 5 0,42999 0,00628 0,80016 0,25515

25 0,52053 9,04E-05 0,52464 0,02429

50 0,00294 0,21182 5,63E-18 0,05968

100 0,27859 0,09511 0,69467 0,74046

Sp-s 5 0,23663 0,24567 3,02E-05 0,59953

25 0,19131 0,06357 0,00061 0,59448

50 3,63E-05 0,75412 8,24E-26 0,18879

100 0,23185 5,85E-07 0,03751 8,28E-10

Cm-s 5 0,05909 0,01899 0,49730 0,13825

25 0,87785 0,00076 0,01929 0,03335

50 1,51E-07 0,15417 3,74E-14 0,71050

100 0,05611 0,04421 0,13507 0,65896

Cp-s 5 0,37666 0,01195 0,31039 0,17670

25 0,35705 0,00110 0,25601 0,26000

50 0,86316 0,77352 1,98E-13 0,05640

100 0,00214 0,77373 0,75515 2,41E-04

� os efeitos tóxicos entre os grupos de corantes com grupos carboxílicos e com grupos

sulfónicos (C-S) são significativamente mais evidentes após uma exposição inicial a

estes corantes;

� os efeitos tóxicos entre grupos de corantes com orientação meta ou para (m-p) são

significativamente diferentes durante todo o tempo de exposição, com mais realce após

1 hora de exposição das Tetrahymena pyriformis aos corantes.

Tabela 8: Resultados dos testes ANOVA para a morfometria: área e razão (W/L), de Tetrahymena

pyriformis. A tabela faz a comparação entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações:

guaiacol-siringol (g-s); carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de

amostragem. Os valores apresentados representam o valor do p estatístico.

Grupos de Ensaio Morfometria (áreas)

Grupos

de Ensaio Morfometria (razões W/L)

corantes 1 hora 48 horas corantes 1 hora 48 horas

g-s 1 5,62E-10 5,99E-29 g-s 1 0,05896 0,04285 2 3,99E-05 0,05741 2 0,46016 4,3E-06

C-S 1 0,98416 0,10891 C-S 1 0,01341 0,08348

2 0,46010 0,00141 2 4,89E-10 0,09542

m-p 1 0,04135 0,04199 m-p 1 1,27E-06 4,67E-06

2 0,04413 0,33845 2 6,44E-14 0,00168

7.3. Predação

Os efeitos das diferentes concentrações dos tóxicos na predação de Tetrahymena pyriformis

estão representados na Tabela 9. Apresentam-se os resultados em forma de tabela, onde estão

patentes as médias das microesferas ingeridas em cada ensaio, os desvios padrão e os níveis

de significância para p<0,05 e p<0,01 para os testes t de Student realizados para comparar as

médias dos vários corantes com as dos controlos.

Embora se tenham realizados dois ensaios independentes, apenas se apresenta um deles

(SEWARD et al., 2001) em forma de tabela, na qual se optou por colocar juntamente com os

dados das médias das microesferas ingeridas e dos desvios padrão, os níveis de significância

adoptados.

Ao comparar os resultados em ambos os ensaios e os valores de p obtidos aquando do

tratamento estatístico t de Student a fim de apurar diferenças entre os corantes e os controlos

para cada concentração e para cada tempo de amostragem, pode-se concluir que os ensaios

são diferentes. Devido a este facto serão apenas consideradas para análise dos resultados as

diferenças significativas encontradas em ambos os ensaios e será apresentado apenas o

ensaio 1, visto ser o que apresenta mais consistência nos resultados. De forma geral, nota-se

que em todas as concentrações existe uma tendência para a diminuição na ingestão de

microesferas ao longo das 48 horas. Os valores dos desvios-padrão indicam também que em

cada célula observada variou muito o número total de microesferas ingeridas. De uma forma

global e salvaguardando algumas pontuais excepções, repara-se que o número de

microesferas ingeridas nos três tempos de amostragem aumentou à medida que se aumentou a

concentração dos corantes estudados. Apresenta-se de seguida a análise dos resultados

relativos a cada corante, para todas as concentrações:

Cm-g: este corante apresentou um aumento global da predação nos três tempos de

amostragem de acordo com o aumento da concentração do corante. Por exemplo, à 1 hora as

médias de microesferas ingeridas nas concentrações de 5, 25, 50 e 100 ppm foram 7,90; 7,60;

11,63 e 10,67; respectivamente. Notou-se em ambos os ensaios uma ingestão de microesferas

à 1 hora na concentração de 100 ppm significativamente menor (p<0,05) do que a do controlo.

Cp-g: este corante revelou um decréscimo global da predação principalmente com o aumento

das concentrações até aos 50 ppm. Nesta concentração a ingestão de microesferas à 1 hora foi

significativamente menor (p<0,01) do que a do controlo. Para uma concentração de 100 ppm

houve uma estimulação aparente da ingestão de microesferas, dado que passou de um valor

de 7,23 para 11,60 microesferas ingeridas a uma concentração de 50 e de 100 ppm,

respectivamente.

Sm-g e Sm-s: estes corantes, de uma forma global, registaram um aumento da ingestão de

microesferas com o aumento da concentração, no entanto não se registaram diferenças

significativas relativamente ao controlo.

Sp-g: este corante apresentou um aumento da ingestão de microesferas com o aumento da

concentração até 100 ppm, sendo estas diferenças significativamente menores do que o

controlo para o tempo de amostragem de 48 horas, para as concentrações de 25 e 100 ppm, o

que pode significar um efeito mais tóxico naquela concentração.

Tabela 9: Número de microesferas ingeridas durante 20 minutos por 30 indivíduos de populações de

Tetrahymena pyriformis expostos a diferentes concentrações de corantes azo: 5, 25, 50 e 100 ppm,

analisadas durante o ensaio 1 com a duração de 48 horas. Os valores apresentados representam o valor

do p estatístico.

Corantes Predação (n.º médio de microesferas/ célula)

Tipo Conc. (ppm) 1 hora 24 horas 48 horas p p p

Cm-g 5 7,90 ± 7,59 0,92197 5,40 ± 4,48 0,27060 3 ± 4,07 0,79531

25 7,60 ± 5,23 0,25973 4,60 ± 4,65 0,19406 5,66 ± 4,07 0,93984

50 11,63 ± 8,33 0,56600 7,87 ± 6,21 0,92068 3,30 ± 3,40 0,87588

100 10,67 ± 6,67 0,01657 8,87 ± 4,29 0,35887 7,63 ± 7,61 0,45706

Cp-g 5 10,13 ± 7,67 0,23115 6,63 ± 5,68 0,87398 3,50 ± 3,79 0,81261

25 9,97 ± 6,35 0,72316 5,63 ± 3,85 0,52040 4,90 ± 5,03 0,56248

50 7,23 ± 4,55 8,72E-04 5,50 ± 5,63 0,11791 2,33 ± 2,97 0,29930

100 11,60 ± 7,35 1,62E-06 8,23 ± 5,22 0,63480 7,27 ± 6,34 0,54811

Sm-g 5 8,77 ± 4,52 0,58575 5,40 ± 4,95 0,29022 3,40 ± 4,41 0,75952

25 8,47 ± 6,64 0,60325 5,47 ± 4,24 0,45843 7,40 ± 5,61 0,27153

50 11,93 ± 7,62 0,65437 5,41 ± 6,11 0,11394 7,07 ± 6,56 0,00549

100 14,40 ± 7,64 0,68315 8,70 ± 6,83 0,49511 7,10 ± 8,60 0,67340

Sp-g 5 8,70 ± 7,64 0,71121 6,57 ± 5,47 0,83548 3,33 ± 3,68 0,69688

25 7,40 ± 5,56 0,22097 5,27 ± 5,39 0,41750 2,67 ± 3,58 0,02033

50 10,23 ± 8,27 0,20730 6,70 ± 6,16 0,42512 3,67 ± 5,26 0,65810

100 12,57 ± 7,80 0,21058 5,90 ± 5,14 0,33097 3,00 ± 3,63 0,02013

Sm-s 5 8,87 ± 7,42 0,63366 5,17 ± 4,46 0,20168 3,87 ± 3,95 0,93022

25 11,37 ± 7,43 0,27833 5,80 ± 3,98 0,60335 3,87 ± 5,69 0,22178

50 12,17 ± 5,98 0,14138 10,43 ± 5,33 0,98304 6,43 ± 4,32 0,39880

100 7,10 ± 6,06 0,82E-05 10,37 ± 7,70 0,13440 4,57 ± 3,21 0,20532

Sp-s 5 9,67 ± 7,93 0,36363 6,43 ± 5,57 0,76622 4,93 ± 4,61 0,34184

25 10,10 ± 8,63 0,71448 5,55 ± 4,99 0,50670 4,10 ± 4,44 0,23627

50 9,73 ± 10,19 0,78301 8,57 ± 8,14 0,21724 4,37 ± 6,38 0,01591

100 7,33 ± 4,41 5,86E-05 7,87 ± 6,97 0,82619 5,53 ± 5,26 0,63225

Cm-s 5 10,47 ± 9,70 0,24124 5,47 ± 4,95 0,31254 4,13 ± 4,70 0,76657

25 6,80 ± 6,41 0,13510 5,83 ± 4,46 0,63118 3,83 ± 4,32 0,16572

50 9,73 ± 6,25 0,08569 8,57 ± 7,61 0,77418 4,37 ± 4,16 0,21443

100 11,20 ± 7,70 0,06008 7,60 ± 5,76 0,93651 6,10 ± 4,37 0,90750

Cp-s 5 9,33 ± 6,69 0,42070 6,87 ± 6,70 1,00000 4,70 ± 4,53 0,44254

25 6,40 ± 4,54 0,05002 7,90 ± 6,81 0,43225 4,47 ± 5,56 0,40019

50 12,77 ± 8,59 0,98713 16,20 ± 10,37 6,7E-04 6,13 ± 4,03 0,00249

100 8,97 ± 6,91 0,00291 7,50 ± 6,32 0,98472 6,07 ± 6,17 0,90302

Controlo 5 8,07 ± 5,34 6,87 ± 5,67 3,77 ± 4,82

25 9,37 ± 6,70 6,53 ± 6,57 5,73 ± 6,01

50 12,80 ± 7,29 8,03 ± 6,69 3,17 ± 3,18

100 15,27 ± 8,69 7,47 ± 7,08 6,27 ± 6,49

Sp-s: este corante registou uma ingestão de microesferas não consistente com o aumento da

concentração, nota-se que a ingestão relativamente à concentração não foi regular. No entanto,

para a concentração mais elevada (100 ppm) após 1 hora de exposição, a diferença na

ingestão de microesferas por Tetrahymena tinha sido significativamente diferente da ingestão

realizada pelas células do controlo no mesmo tempo de amostragem.

Cm-s: este corante, à semelhança do anterior, não apresentou uma ingestão de microesferas

consistente com o aumento da concentração, nota-se que a ingestão relativamente à

concentração não foi regular. De qualquer forma, para as concentrações e tempos de

amostragem efectuados não se registaram diferenças significativas entre os valores de ingestão

para as células tratadas quando comparadas com as células do controlo.

Cp-s: este corante, não apresentou igualmente uma predação concordante que aumentasse ou

diminuísse progressivamente com o aumento da sua concentração. Nota-se que a ingestão

relativamente à concentração não foi regular. No entanto, para a concentração mais elevada

(100 ppm) após 1 hora de exposição, a diferença na ingestão de microesferas pelas células

(8,97) tinha sido significativamente diferente da realizada pelas células do controlo (15,27) no

mesmo tempo de amostragem.

De uma forma geral, neste ensaio de predação consegue-se apurar que existem mais valores

significativamente mais baixos de ingestão de microesferas após 1 hora de exposição, nas

concentrações mais altas de corantes (100 ppm – 4 casos e 50 ppm – 1 caso), o que nos indica

um efeito inibitório da predação logo a pós a exposição ao corante. No entanto, como este

efeito não é significativamente diferente nos tempos de amostragem seguintes, 24 e 48 horas,

deduz-se que as células adaptaram-se ao corante e recuperaram a sua capacidade predatória

normal.

Quando se analisa a Tabela 10, relativa aos resultados do teste ANOVA, quanto à comparação

do parâmetro predação entre grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol

(g-s); carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem,

verifica-se que existem várias diferenças significativas dentro destes grupos, mas nunca em

simultâneo em dois ensaios realizados (ensaios 1 e 2). Verificam-se diferenças significativas

entre os seguintes grupos de corantes:

� grupo guaiacol-siringol (g-s) às 24 horas, no ensaio 1 e às 48 horas no ensaio 2, para

valores de p<0,01;

� grupo carboxílico-sulfónico (C-S) às 24 horas e às 48 horas no ensaio 2, para valores de

p<0,05.

Estes resultados da ANOVA não são significativos para concluir acerca da toxicidade entre

grupos de corantes.

Tabela 10: Resultados dos testes ANOVA para a predação de Tetrahymena pyriformis. A tabela faz a

comparação entre médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s);

carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem. Os valores

apresentados representam o valor do p estatístico.

Grupos de Ensaio Predação

corantes 1 hora 24 horas 48 horas

g-s 1 0,37430 0,00026 0,78654

2 0,06157 0,42672 0,00267

C-S 1 0,36020 0,13578 0,58373

2 0,15224 0,03309 4,57E-05

m-p 1 0,73364 0,09951 0,20538

2 0,38224 0,34185 0,56802

7.4. Síntese dos Resultados

7.4.1. Síntese dos resultados para cada corante azo

� O corante Cm-g não possui toxicidade significativa relativamente aos parâmetros

avaliados. No ensaio de crescimento apenas se registaram duas diferenças

significativas (p<0,01) entre este corante e o controlo depois de 1 hora de exposição,

para uma concentração de 50 ppm e entre este corante e o controlo às 48 horas, para

uma concentração de 100 ppm (Figura 8 e Tabela 4). Na morfometria verificou-se um

aumento significativo da área (p<0,05) das células de Tetrahymena pyriformis

relativamente ao controlo (Figuras 9 e 10; e Tabela 6). Apresentou um aumento global

da predação nos três tempos de amostragem de acordo com o aumento da

concentração do corante. Notou-se em ambos os ensaios uma diminuição significativa

da ingestão de microesferas à 1 hora na concentração de 100 ppm relativamente ao

controlo (Tabela 9).

� O corante Cp-g inibiu significativamente o crescimento de Tetrahymena pyriformis às 24

e 48 horas, para as concentrações de 25 e 100 ppm. Para uma concentração de 50 ppm

o corante inicialmente inibiu o crescimento, mas depois a Tetrahymena pyriformis

conseguiu recuperar (Figura 8 e Tabela 4). Relativamente à morfometria, apresentou

apenas uma diferença significativa na área celular após 1 hora de exposição, para uma

concentração de 50 ppm. Verificou-se que houve uma diminuição significativa na razão

W/L relativamente ao controlo, indicando uma forma celular mais alongada (Figuras 9 e

10; e Tabela 6). Revelou um decréscimo global da predação principalmente com o

aumento das concentrações até aos 50 ppm. Nesta concentração a ingestão de

microesferas à 1 hora foi significativamente menor do que a do controlo. Para uma

concentração de 100 ppm houve uma estimulação aparente da ingestão de microesferas

(Tabela 9).

� O corante Sm-g revelou ser mais tóxico na concentração mais baixa (5 ppm), para os

ensaios de crescimento. Para as concentrações de 25 e 50 ppm apenas se registou

diferenças significativas em relação ao controlo após 1 hora de exposição, tendo a

população de Tetrahymena recuperado o crescimento. Para a concentração de 100 ppm

houve diferenças significativas em relação ao controlo, às 24 horas de exposição, tendo

a população posteriormente recuperado (Figura 8 e Tabela 4). Quanto à morfometria,

para uma concentração de 50 ppm, registou-se um aumento significativo na área celular,

após 1 hora de exposição, bem como uma diminuição significativa na razão W/L

relativamente ao controlo, indicando uma forma celular mais alongada do que a

considerada normal (Figuras 9 e 10; e Tabela 6).

� O corante Sp-g revelou valores de crescimento irregulares tanto superiores como

inferiores quando comparado com o controlo, em todas as concentrações (Figura 8 e

Tabela 4). Relativamente à morfometria e especificamente relativamente à área celular,

este corante registou já mais diferenças, tendo sido verificadas sempre às 48 horas de

exposição e para as concentrações de 25, 50 e 100 ppm. Quanto à razão W/L este

corante apresentou apenas uma diferença significativa após 1 hora de exposição, para

uma concentração de 50 ppm, indicando uma forma celular mais alongada do que a

apresentada pelas células do controlo (Figuras 9 e 10; e Tabela 6). Registou ainda um

aumento, embora não significativo da ingestão de microesferas com o aumento da

concentração (Tabela 9).

� O corante Sm-s revelou valores de crescimento irregulares tanto superiores como

inferiores quando comparado com o controlo, em todas as concentrações (Figura 8 e

Tabela 4). Relativamente ao parâmetro área celular este corante registou diferenças

significativas relativamente ao controlo, apenas para tempos de exposição de 48 horas,

nas concentrações de 25 e 100 ppm, mostrando que a área das células aumentou

relativamente à área das células do controlo (Figuras 9 e 10; e Tabela 6). Quanto à

predação verificou-se um aumento da ingestão de microesferas com o aumento da

concentração até 50 ppm, sem que se evidenciassem diferenças significativas

relativamente ao controlo. Quando na concentração de 100 ppm obteve uma ingestão

inferior à registada para 50 ppm, o que pode significar um efeito mais tóxico naquela

concentração máxima (Tabela 9).

� O corante Sp-s revelou valores de crescimento irregulares tanto superiores como

inferiores quando comparado com o controlo, em todas as concentrações (Figura 8 e

Tabela 4). Relativamente à área celular, parâmetro morfométrico, o corante registou

apenas um aumento significativo da área das células tratadas relativamente às células

do controlo, após 48 horas de exposição, para uma concentração de 5 ppm.

Relativamente à razão W/L verificou-se que na concentração mais elevada de 100 ppm,

às 48 horas, este corante provocou um arredondamento celular significativamente maior

ao registado para o controlo, o que indica toxicidade. Neste caso a toxicidade teve um

efeito diferente na forma das células, relativamente ao que foi registado para os

restantes corantes analisados (Figuras 9 e 10; e Tabela 6). Quanto à predação este

corante registou uma ingestão de microesferas variável e irregular, de acordo com o

aumento da concentração (Tabela 9).

� O corante Cm-s obteve sempre um crescimento inferior relativamente ao controlo; no

que respeita apenas à concentração de 100 ppm, conseguiu obter valores de

crescimento menores e significativamente diferentes do controlo (Figura 8 e Tabela 4).

Quanto à área celular este corante provocou na concentração de 25 ppm, às 48 horas,

um significativo alongamento das células comparativamente ao controlo (Figuras 9 e 10;

e Tabela 6). Relativamente à predação, não apresentou uma ingestão de microesferas

consistente e significativa com o aumento da concentração, nota-se que a ingestão

relativamente à concentração foi irregular (Tabela 9).

� O corante Cp-s provocou nos parâmetros crescimento e predação valores variáveis e

muito irregulares para todas as concentrações testadas e tempos de amostragem

(Figura 8 e Tabelas 4 e 9). Relativamente ao parâmetro área celular verificou-se um

aumento significativo da área de Tetrahymena pyriformis relativamente ao controlo, às

48 horas, para as concentrações de 50 e 100 ppm (Figuras 9 e 10; e Tabela 6).

7.4.2. Síntese dos resultados para os três testes realizados: crescimento, morfometria e predação.

No que diz respeito aos testes ANOVA realizados para todos os parâmetros, nos quais se

compararam médias de grupos de corantes de todas as concentrações: guaiacol-siringol (g-s);

carboxílico-sulfónico (C-S); meta-para (m-p), para os respectivos tempos de amostragem

registou-se o seguinte:

1. No parâmetro crescimento (Tabela 5) os resultados mostram que apenas no ensaio 1

realizado se verificou uma diferença significativa entre os grupos de corantes com

guaiacol e siringol.

2. No parâmetro morfometria (área e razão W/L) verifica-se que existem várias diferenças

significativas dentro destes grupos em ambos os ensaios realizados (ensaios 1 e 2)

(Tabelas 6, 7 e 8):

� quanto à área de Tetrahymena pyriformis verificam-se diferenças significativas à 1

hora nos grupos guaiacol-siringol (g-s) e meta e para (m-p);

� quanto à razão W/L nota-se que existem diferenças significativas entre os seguintes

grupos de corantes: guaiacol-siringol (g-s) às 48 horas; carboxílico-sulfónico (C-S) à

1 hora; e meta e para (m-p) em ambos os tempos de amostragem;

� analisando os dois parâmetros (área e razão W/L) simultaneamente nota-se que os

efeitos tóxicos dentro do grupo carboxílico-sulfónico (C-S) são significativamente

mais evidentes após uma exposição inicial a estes corantes e que os efeitos tóxicos

dentro do grupo meta e para (m-p) são significativamente diferentes durante todo o

tempo de exposição, particularmente após 1 hora de exposição das células aos

corantes (Tabelas 6, 7 e 8).

3. No parâmetro predação verificou-se que a ingestão de microesferas foi mais baixa após

1 hora exposição, nas concentrações de 50 e 100 ppm, indicando um efeito inibitório da

predação logo após a exposição ao corante. Às 24 e 48 horas, registou-se a ausência

de inibição o que indica uma possível adaptação celular ao corante. Quanto à

comparação da predação entre grupos de corantes de todas as concentrações:

guaiacol-siringol (g-s); carboxílico-sulfónico (C-S); meta e para (m-p) para os respectivos

tempos de amostragem, verifica-se que existem várias diferenças significativas dentro

destes grupos, mas nunca em simultâneo em dois ensaios realizados (ensaios 1 e 2).

Desta forma, e como foi dito anteriormente, os resultados do teste ANOVA não são

significativos para concluir acerca da toxicidade entre estes grupos de corantes.

8. DISCUSSÃO

O estudo da toxicidade de corantes azo é importante uma vez que estes correspondem a mais

de metade dos corantes anualmente produzidos (STOLZ, 2001; NOVOTNÝ et al., 2006);

representam o maior e mais versátil grupo cuja aplicação da indústria têxtil ascende até aos 70

%; e são compostos recalcitrantes e resistentes à biodegradação, que podem ser libertados

para o meio ambiente através dos efluentes industriais, provocando vários problemas

ambientais no meio aquático receptor (FERREIRA, 1998; NOVOTNÝ et al., 2006).

Moawad et al (2003) referiu que estudos para avaliar a toxicidade dos corantes têxteis

realizados por Sharma & Sobti (2000), Rajaguru et al (2001), Wang et al (2002), concluíram que

os efeitos tóxicos dependiam muito da concentração e que todos os corantes são tóxicos em

concentrações mais elevadas.

Salienta-se o facto de terem sido empregues quatro concentrações 5, 25, 50 e 100 ppm de

corantes azo e nenhuma delas ter tido notórios efeitos citotóxicos. Estas concentrações foram

empregues tendo em vista duas razões:

� o facto de os corantes azo presentes em produtos téxteis não poderem libertar aminas

numa concentração acima dos 30 ppm ou dos 70 ppm, caso os artigos sejam feitos de

fibras recicladas, de acordo com a Directiva Europeia 2004/21/ EC implementada em

Portugal pelo Decreto Lei n.º 208/2003 (única legislação existente que indica valores de

concentração permitidos, relativos a corantes azo). As concentrações de 30 e 70 ppm

estão abrangidas pelas utilizadas neste estudo e por este facto pode-se inferir quanto à

toxicidade destes corantes para esta gama de concentrações;

� a necessidade de conhecer os efeitos tóxicos sub-letais de corantes azo, em células

eucarióticas, em concentrações mais baixas particularmente inferiores a 30 ppm.

Os resultados relativos à toxicidade em todos os parâmetros analisados são globalmente

irregulares e heterogéneos, o que pode ser explicado por várias razões:

� as concentrações utilizadas, por serem concentrações sem efeitos tóxicos muito

notórios, tiveram implicações durante a fase de tratamento estatístico dos resultados,

uma vez que se registaram diferenças entre os dois ensaios realizados para cada

parâmetros testado. Assim sendo, decidiu-se a análise dos resultados estatísticos

semelhantes para ambos os ensaios, o que se revelou inconclusivo relativamente à

toxicidade dos corantes quando comparados com o controlo;

� as condições das culturas celulares utilizadas para os testes de toxicidade variarem ao

longo do tempo, tendo favorecido o crescimento em alguns ensaios em detrimento de

outros;

� o facto de se ter trabalhado com concentrações baixas que podem corresponder a

limiares de toxicidade e, assim sendo, os resultados são muito heterogéneos. E nestes

casos as diferentes respostas dependem sobretudo do estado fisiológico individual dos

organismos teste, podendo haver indivíduos mais resistentes do que outros; o aumento

das concentrações dos tóxicos causaram uma inibição ou estimulação das respostas

fisiológicas de T. pyriformis;

� a variação da densidade inicial da cultura, embora ténue, pode ter afectado a taxa de

crescimento devido a limitação de espaço e/ou alimento e ter influenciado na resposta

fisiológica aos tóxicos.

Nos estudos toxicológicos apenas um bioensaio não é o suficiente para dar uma imagem global

dos efeitos num organismo teste. Desta forma, esta abordagem utilizando uma bateria de três

testes toxicológicos fisiológicos, permitiu uma recolha de informação mais abrangente acerca da

toxicidade de corantes têxteis azo, em Tetrahymena pyriformis. Os ensaios bioquímicos são

importantes como complemento aos ensaios fisiológicos, desta forma o conteúdo em ATP, a

actividade da ACP e a redução do MTT podiam ter representado boas alternativas aos

tradicionais testes toxicológicos (NICOLAU et al.. 2001). No entanto, não foram utilizados neste

estudo, uma vez que as soluções que contém os corantes são coloridas, interferindo assim com

os resultados destes testes colorimétricos.

O parâmetro no qual, quando comparadas todas as concentrações, se notou um aumento

global da toxicidade de todos os corantes, foi o crescimento. Inicialmente, optou-se por realizar

a contagem de células ao microscópio; no entanto verificou-se que esta era muito demorada e

sujeita a erros (especialmente quando se trabalha com concentrações celulares elevadas)

(TEUNISSON, 1971), e os resultados obtidos foram inconclusivos e muito díspares entre

ensaios para a mesma concentração. Assim, optou-se por realizar as contagens celulares

relativas aos ensaios de crescimento através do contador automático de células, o que

melhorou os resultados obtidos, uma vez que para uma dada concentração, corante e tempo de

amostragem não havia discrepância nas médias das sub-amostras realizadas. Algumas

discrepâncias na contagem deveram-se possivelmente à sedimentação das células em

suspensões mais densas durante as contagens.

A morfometria foi, dos métodos utilizados, o mais sensível na determinação da toxicidade entre

grupos de corantes, uma vez que os resultados foram semelhantes em ambos os ensaios

realizados e se registaram bastantes diferenças dentro dos grupos de corantes siringol-

guaiacol, carboxílico-sulfónico e meta-para, para os dois tempos de amostragem (1 e 48 horas).

O menos sensível foi o parâmetro crescimento uma vez que apenas se registou uma diferença

e apenas num dos ensaios realizados para este parâmetro.

Os resultados apresentados por este trabalho extrapolam que os protozoários desempenham

um papel muito importante na predação e no controle da densidade populacional de bactérias

(COX et al., 1999; HAHN et al., 2001). Estes corantes não apresentam uma toxicidade evidente,

portanto, podem não colocar em perigo a sobrevivência dos protozoários e a eficácia de todo o

processo de tratamento de águas residuais industriais.

Ao contrário do que refere Nicolau et al. (2001), os ensaios de predação foram os mais

trabalhosos e demorados. No início da avaliação deste parâmetro considerou-se a hipótese de

realizar a predação através do método automático (com análise de imagem) de acordo com

Dias et al. (2003); no entanto verificou-se que este método seria ainda mais moroso e

complicado, para o estudo de uma grande gama de corantes e de concentrações. Em

contrapartida, como foram contadas as microesferas a olho nú, pode ter ocorrido subestimação

no número de microesferas devido principalmente à sua intensa fluorescência e ao cansaço

ocular após muito tempo seguido de contagens ao microscópio (DIAS et al., 2003). A fagocitose

nos protozoários é uma função celular clássica, reflectindo o nível de energia do protozoário. A

diminuição da fagocitose pela Tetrahymena pode ser explicada devido ao decréscimo de

energia nestes protozoários, que está relacionada com a energia da própria célula

(STEFANIDOU et al., 1999). Assim, os casos em que houve uma significativa diminuição da

predação, devido à influência de um tóxico, mostram que as células diminuíram a sua energia e

o investimento desta na capacidade fagocítica foi muito menor.

Em todos os ensaios realizados não podemos isolar um efeito tóxico característico de

determinado corante ou grupo de corantes. Relativamente ao crescimento, os corantes que

registaram mais diferenças significativas relativamente aos controlos foram o Cp-g, o Sm-g e

Sp-s. Alguns corantes estimularam a predação quando em concentrações mais elevadas (Sp-s,

Cp-s, Cp-g, Cm-g, Sm-s) e de uma forma global aumentaram a área celular - parâmetro

morfométrico - de acordo com o aumento da concentração dos corantes (Sp-g, Sm-s, Cp-s, Cm-

g). Nestes ensaios apurou-se a toxicidade de um corante individualmente e o ideal seria a

avaliação da toxicidade da mistura de corantes, o que realmente acontece em ambientes

aquáticos sujeitos a descargas de efluentes industriais têxteis.

A hormesis é fenómeno de relação dose-resposta caracterizado pela estimulação em doses

baixas e pela inibição a doses elevadas. Foi já observada em vários estudos e é conhecida por

ser independente do agente químico, do modelo biológico e/ou do parâmetro toxicológico

usado. É ainda um conceito ainda pouco apreciado e reconhecido, que pode mudar a forma

como a toxicologia é estudada/ abordada. Esta teoria explora o facto da natureza fundamental

da dose resposta não ser linear mas em forma de U. O princípio por trás destas respostas

implica que baixas concentrações de algumas substâncias tóxicas podem produzir um efeito

benéfico quando em doses baixas (CALABRESE, 2002; CALABRESE & BALDWIN, 2003).

A estimulação é observada (nem sempre) seguindo uma resposta inicial inibitória. Dependendo

do parâmetro utilizado, a resposta hormética é muitas vezes caracterizada por ser um U

invertido (no caso do crescimento ou sobrevivência), um J (no caso de doença). Estas

respostas toxicológicas em forma de U são baseadas em estudos reais e podem ser

generalizadas. Foram já descritos 5000 exemplos de respostas horméticas independentes de

classes de substâncias químicas, modelo biológico ou testes toxicológicos utilizado

(CALABRESE, 2002; CALABRESE & BALDWIN, 2003).

Tendo por base esta teoria podemos verificar que em todos os ensaios realizados existem, para

cada corante, respostas toxicológicas que graficamente adoptam com a forma de U normal, de

U invertido ou de J. Estas respostas são mais evidentes nos ensaios de morfometria e de

predação. Relativamente à morfometria os resultados obtidos, ou seja, o alongamento celular

como resposta à toxicidade dos corantes pode ser entendido como uma resposta benéfica e

portanto hormética. No que diz respeito à predação podemos verificar que a resposta das

células ao aumento da concentração de cada corante é muito diferente. Podemos verificar que

por exemplo, relativamente ao corante Cp-g e Cm-s houve uma estimulação da predação na

concentração de 5 ppm, uma diminuição deste parâmetro nas concentrações intermédias (25 e

50 ppm) e novamente a estimulação da predação na concentração mais elevada – 100 ppm.

Estas respostas podem ser consideradas horméticas, na medida que correspondem a um

gráfico em forma de U, tendo em conta o aumento a concentração do corante. Da mesma forma

o corante Sm-s apresenta uma resposta hormética, mas neste caso em forma de U invertido,

para a mesma gradação de concentrações.

Apesar da utilização de protistas, em especial de ciliados, ter ganho um interesse crescente por

muitos investigadores, não foram encontradas muitas referências da sua utilização na avaliação

da toxicidade de corantes azo, utilizando uma bateria de testes toxicológicos. Assim, este

estudo colmata um pouco essa falta de dados.

Não é possível afirmar que a Tetrahymena pyriformis é especialmente sensível a um

determinado grupo de substâncias. Tal como os outros modelos biológicos, os efeitos

toxicológicos induzidos por substâncias orgânicas e inorgânicas variam imenso, nomeadamente

valores de IC50 dependendo também das suas características físico-químicas e dos seus

mecanismos de acção (SAUVANT, 1999). Desta forma, este ciliado poderá ter-se revelado mais

resistente do que outro organismo modelo para o tipo de corantes utilizados, não se notando

evidentes efeitos tóxicos.

9. CONCLUSÕES

A Tetrahymena pyriformis é uma célula eucariótica, de fácil e rápido crescimento em condições

axénicas e revelou-se ser um modelo ideal para este estudo ecotoxicológico. A maioria dos

estudos realizados apontam para a validação deste protozoário como um modelo, e concluem

que a Tetrahymena pyriformis pode ser considerada como um complemento ou alternativa a

outros modelos animais na investigação toxicológica. (SAUVANT et al., 1999). Este trabalho

reforça a importância dos ciliados como organismos bioindicadores e estimula a utilização do

protozoário Tetrahymena pyriformis como uma ferramenta na avaliação da toxicidade de

substâncias novas ou já existentes, em meio aquático.

Embora não se possa afirmar seguramente que a Tetrahymena pyriformis é especialmente

sensível a um determinado grupo de substâncias, através deste estudo pode-se concluir que

este ciliado é mais resistente aos efeitos tóxicos dos corantes azo utilizados, pelo que seria

importante a realização de um futuro estudo similar utilizando outros organismos testes, de

forma a comprovar a similaridade das respostas tóxicas.

Nos estudos toxicológicos apenas um bioensaio não é o suficiente para dar uma imagem global

dos efeitos num organismo teste. Desta forma, esta abordagem utilizando uma bateria de três

testes toxicológicos fisiológicos, permitiu uma recolha de informação mais abrangente acerca da

toxicidade de corantes azo, em Tetrahymena pyriformis. Espera-se que esta combinação de

ensaios possa representar uma forma sensível de testar tipos similares de agentes, bem como

o seu possível efeito em sistemas alvo de uma grande variedade de organismos. No entanto,

seria importante, no futuro, realizar trabalhos nos quais se pudesse ampliar a bateria de testes

de modo a comprovar os resultados obtidos nestes estudos de toxicidade.

Os ensaios de crescimento mais frequentemente usados para determinar a toxicidade sub-letal

realizados através da utilização de um contador automático de células revelaram-se ser muito

mais fiáveis do que os mesmos realizados através da contagem ao microscópio. De facto, o

ensaio de crescimento foi o menos demorado, uma vez que foi utilizado um contador de células.

O crescimento é um ensaio de fácil reprodução, não requerendo experiência técnica ou

despesas operacionais (NICOLAU et al., 1999). Foi utilizado o equipamento Beckman Coulter Z

Series, para as contagens celulares relativas ao crescimento. Embora este aparelho seja

utilizado para determinar em laboratório a concentração de eritrócitos, leucócitos e plaquetas de

humanos ou de animais, pode ser calibrado para protozoários, como a Tetrahymena pyriformis,

revelando ser uma ferramenta essencial nos ensaios de crescimento.

Pode-se concluir igualmente que os ensaios de predação com Tetrahymena pyriformis, ao

contrário do referido por Nicolau et al. (1999; 2001), foram os mais trabalhosos e demorados.

Seriam ainda mais morosos se tivessem sido realizados através do método automático - com

análise de imagem. Esta conclusão retirou-se do facto do presente estudo utilizar uma grande

gama de corantes (oito no total) e de concentrações (quatro no total).

Todos estes aspectos levam a concluir que a miniaturização dos testes de toxicidade e a

utilização dos protozoários ciliados constituem uma boa alternativa a outros testes de toxicidade

mais laboriosos e dispendiosos.

Com este trabalho podemos concluir que quando se utilizam concentrações baixas de tóxicos,

podemos ter respostas fisiológicas dos organismos modelo que podem ser entendidas, na

toxicologia tradicional, como irregulares e não conclusivas. No entanto, tendo em conta a teoria

da hormesis, podemos concluir que muitas das respostas deste estudo, nomeadamente no que

diz respeito ao parâmetro predação, são caracterizadas por adoptar a forma de U normal, de U

invertido ou de J. Estas respostas podem ser consideradas horméticas tendo em conta o

aumento a concentração do corante, as respostas obtidas e as concentrações baixas utilizadas.

As águas residuais de indústrias têxteis constituem uma ameaça para o ambiente em várias

partes do mundo (NILSSON et al., 2006). Os corantes têxteis são resistentes à degradação e

causam poluição visual. São perigosos porque podem manter no meio por períodos de tempo

prolongados podendo ter uma acção tóxica, mutagénica e cancerígena nos seres vivos

aquáticos. Os corantes azo são considerados recalcitrantes à degradação microbiológica mas

pouco se sabe acerca da sua toxicidade. A avaliação da ecotoxicidade dos corantes é

importante para ajudar a reduzir o efeito perigoso destes químicos (MOAWAD et al., 2003).

Desta forma, o trabalho realizado foi importante e inovador, uma vez é o primeiro e único estudo

sobre a toxicidade deste tipo de corantes têxteis azo utilizados em organismos teste. Até à data

apenas foram realizados estudos sobre a biodegradação destes corantes azo por fungos

linholíticos.

Seria ainda importante realizar futuras investigações com os mesmos corantes têxteis, no

entanto, noutras vertentes das quais se enumeram as seguintes: 1) a utilização de uma gama

mas alargada de concentrações superiores; 2) a realização da combinação de vários corantes

de forma a estudar os efeitos tóxicos das misturas; 3) a aplicação/ adequação, como já foi

referido, de mais testes toxicológicos diversificados (não apenas com carácter fisiológico); e 4) a

propensão destes corantes para a formação de aminas e a avaliação do efeito cancerígeno e

mutagénico destas sobre as células de um organismo bioindicador, como a Tetrahymena

pyriformis.

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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