testes estatÍsticos na validaÇÃo de mÉtodos e ensaios...
TRANSCRIPT
TESTES ESTATÍSTICOS NA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA
INTERLABORATORIAIS EM SEMENTES DE NABO FORRAGEIRO
VERÔNICA YUMI KATAOKA
2009
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da UFLA
Kataoka, Verônica Yumi. Testes estatísticos na validação de métodos e ensaios de proficiência interlaboratoriais em sementes de nabo forrageiro / Verônica Yumi Kataoka. – Lavras : UFLA, 2009. 244 p. : il. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2009. Orientador: Marcelo Silva de Oliveira. Bibliografia.
1. Teste estatísticos. 2. Sementes. 3. Validação de métodos. 4 Ensaios de proficiência. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título. CDD – 519.56
VERÔNICA YUMI KATAOKA
TESTES ESTATÍSTICOS NA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA INTERLABORATORIAIS EM
SEMENTES DE NABO FORRAGEIRO
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Estatística e Experimentação Agropecuária, para a obtenção do título de "Doutor".
Orientador
Prof. Dr. Marcelo Silva de Oliveira
LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL
2009
VERÔNICA YUMI KATAOKA
TESTES ESTATÍSTICOS NA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA INTERLABORATORIAIS EM SEMENTES DE
NABO FORRAGEIRO
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Estatística e Experimentação Agropecuária, para a obtenção do título de "Doutor".
APROVADA em 26 de janeiro de 2009
Profa. Dra. Maria Laene Moreira de Carvalho UFLA
Prof. Dr. Eric Batista Ferreira UNIFAL
Prof. Dr. Joel Augusto Muniz UFLA
Dr. Luiz Artur Costa do Vale MAPA
Profa. Dra. Thelma Sáfadi UFLA
Prof. Dr. Marcelo Silva de Oliveira UFLA
(Orientador)
LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL
Ao meu esposo, Rubens, e aos meus filhos, Alexander e Felipe,
pelo amor e compreensão,
OFEREÇO
Aos meus pais e irmãos que, mesmo a distância, sempre me deram forças para que eu continuasse caminhando e superando todas as
dificuldades,
DEDICO.
AGRADECIMENTOS
Ao meu esposo, Rubens e aos meus filhos, Alexander e Felipe, que
souberam ter paciência para compreender as minhas frequentes ausências e por
terem sonhado comigo a conquista deste título.
Aos meus pais, Zilda e Osamu, que souberam conduzir com muita
sabedoria a minha formação como cidadã e sempre deram prioridade à
educação.
Aos meus irmãos, Patrícia, Flávio, Elisabete, Sheila e Frederico, fiéis
companheiros em todos os momentos da minha vida.
Ao Prof. Marcelo, pela paciência, amizade e atenção durante todos esses
anos, tendo um papel decisivo na condução de todos os meus trabalhos
acadêmicos, mas principalmente pela contribuição, em forma de conselhos, para
o meu crescimento intelectual, profissional e pessoal.
À Profa. Maria Laene, que sempre soube, com muita maestria, auxiliar
na execução deste trabalho, bem como em outros momentos da minha vida.
Aos meus grandes amigos do Doutorado, Adriano, Claudiney,
Eustáquio, Graziela, Josiane, Nádia e Rejane, que foram decisivos para que eu
tivesse forças para concluir mais esta etapa. Agradeço sempre a Deus, por ter
colocado no meu caminho essas pessoas. Espero que a nossa amizade, mesmo
com toda distância, seja eterna.
Aos demais amigos do Mestrado e Doutorado do DEX, bem como ex-
alunos da UFLA, atualmente morando em Lavras, Piracicaba, Belo Horizonte,
Uberlândia e São Carlos, dos quais não citarei nomes, para não correr o risco de
esquecer alguém, mas que sabem particularmente a quem estou me referindo.
Afinal, foram inúmeras horas de convivência, tanto de trabalho como de lazer e
que me proporcionaram um conforto emocional tão necessário nos momentos
decisivos.
A Luciana Souza, Marcela, Carla e Luciana Magda, que me conduziram
pelo “Universo das Sementes” e às quais serei eternamente grata, pelo
companheirismo, dedicação e ajuda.
Aos demais colegas de Mestrado e Doutorado do DEX e do DAG-
Sementes, pelas palavras de incentivo e apoio nas dificuldades.
Aos amigos que fiz nesta cidade, Francisca, Dalva e Dona Itinha, que me
deram apoio em todos os momentos e já são importantes na minha vida.
Aos professores e técnico-administrativos do DEX, pela competência,
amizade e companheirismo.
A equipe do Laboratório de Análise de Sementes da UFLA, que me
acolheu com carinho e sempre me auxiliou com presteza e disposição.
A todos os meus amigos de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA), Marco e
Ana, Rose, Betânia, Irene, Cláudia, Eurivalda e Hugo, que, mesmo de longe,
com certeza, torceram pelo meu sucesso e os quais sempre trarei perto no meu
coração.
A FAPEMIG e CNPq pelo suporte financeiro a esse trabalho, ao MAPA
pela distribuição das sementes, e aos laboratórios participantes do processo de
validação de métodos.
À Capes, pela concessão da bolsa de estudos.
Por fim, a Deus, que, na verdade, é o princípio, pois sem ele nada do que
foi dito anteriormente teria sido possível.
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................ i ABSTRACT ......................................................................................................... iii CAPÍTULO 1 ...................................................................................................... 01 1 Introdução Geral .............................................................................................. 02 4 Referências Bibliográficas ...................................... ......................................... 05 CAPÍTULO 2 : Validação de Métodos ................................................................ 06 1 Resumo ............................................................................................................. 07 2 Abstract ............................................................................................................. 08 3 Introdução ......................................................................................................... 09 4 Referencial Teórico .......................................................................................... 11 4.1 Programas de Validação de Métodos: aspectos gerais .................................. 13 4.2 Importância da cultura do nabo forrageiro ..................................................... 15 4.3 Testes de germinação ..................................................................................... 17 4.4 Seleção de lotes de acordo com a homogeneidade – Teste H ........................ 19 4.5 Caracterização dos lotes ................................................................................. 22 4.6 Identificação de valores discrepantes (outliers) ............................................. 24 4.7 Identificação de outliers nas variâncias ......................................................... 30 4.8 Avaliação da repetibilidade, reprodutibilidade e das estatísticas h e k de
Mandel ........................................................................................................... 34 4.9 Análise discriminante .................................................................................... 41 4.10 Comparação de métodos .............................................................................. 43 5 Material e Métodos ........................................................................................... 47 5.1 Seleção de lotes de acordo a homogeneidade – Teste H................................ 47 5.2 Caracterização dos lotes - Teste de germinação inicial ................................. 50 5.3 Distribuição do material para os laboratórios ................................................ 53 5.4 Das técnicas estatísticas ................................................................................. 54 5.4.1 Identificação de valores discrepantes (outliers) .......................................... 56 5.4.2 Identificação de outliers nas variâncias ...................................................... 59
5.4.3 Análise de variância .................................................................................... 62 5.4.4 Avaliação da repetibilidade, reprodutibilidade e das estatísticas h e k de
Mandel ........................................................................................................... 63 5.4.5 Comparação dos métodos ........................................................................... 69 5.4.6 Análise discriminante ................................................................................. 71 5.5 Rotinas no R .................................................................................................. 79 6 Resultados e Discussão ..................................................................................... 81 6.1 Seleção de lotes de acordo a homogeneidade – Teste H................................ 81 6.2 Caracterização dos lotes - Teste de germinação inicial ................................. 82 6.3 Teste de germinação nos laboratórios selecionados ...................................... 84 6.4 Identificação de valores discrepantes (outliers) . ........................................ 89 6.5 Identificação de outliers nas variâncias. ........................................................ 91 6.6 Análise de variância ....................................................................................... 93 6.7 Avaliação da repetibilidade, reprodutibilidade e das estatísticas h e k de
Mandel ........................................................................................................... 95 6.8 Comparação dos métodos ............................................................................ 101 6.9 Análise discriminante .................................................................................. 103 6.10 Discussão geral ......................................................................................... 106 7 Conclusões .................................................................................................. 109 8 Referências Bibliográficas .............................................................................. 110 CAPÍTULO 3: Ensaios de Proficiência ............................................................. 118 1 Resumo ........................................................................................................... 119 2 Abstract ........................................................................................................... 120 3 Introdução ....................................................................................................... 121 4 Referencial Teórico ........................................................................................ 123 4.1 Programas interlaboratoriais: aspectos gerais ............................................. 123 4.2 Ensaios de Proficiência ............................................................................ 128 4.3 Método do Z-score ....................................................................................... 131 4.4 Método Campos (1988) ............................................................................... 133 4.5 Análise de agrupamento ............................................................................... 134 4.6 Análise generalizada de Procrustes .............................................................. 138
5 Material e Métodos ......................................................................................... 141 5.1 Dos dados ..................................................................................................... 141 5.2 Das técnicas estatísticas ............................................................................... 144 5.2.1 Método do Z-score .................................................................................... 145 5.2.2 Método Campos (1988) ............................................................................ 150 5.2.3 Análise de agrupamento ............................................................................ 158 5.2.4 Análise generalizada de Procrustes ........................................................... 162 5.3 Rotinas no R ................................................................................................ 165 6 Resultados e Discussão ................................................................................... 166 6.1 Simulação 1 ................................................................................................. 166 6.2 Simulação 2 ................................................................................................. 173 6.3 Simulação 3 ................................................................................................. 177 6.4 Discussão geral ............................................................................................ 181 7 Conclusões ...................................................................................................... 185 8 Referências Bibliográficas .............................................................................. 186 Considerações Finais ......................................................................................... 190 ANEXOS ........................................................................................................... 192
i
RESUMO
Kataoka, Verônica Yumi. Testes estatísticos na validação de métodos e ensaios de proficiência interlaboratoriais em sementes de nabo forrageiro. 2009. 244 p. Tese (Doutorado em Estatística e Experimentação Agropecuária ) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.∗
Dentre as várias demandas de pesquisas na área de sementes, no que diz respeito à proposição e à investigação de técnicas estatísticas apropriadas para a avaliação de diversos processos nesta área, estão sendo consideradas neste trabalho duas delas. A primeira demanda refere-se ao processo de validação de métodos para teste de qualidade de sementes, em que uma avaliação estatística criteriosa dos resultados é essencial, uma vez que, após a validação, o método é incorporado na Regra para Análise de Sementes (RAS), passando a ser utilizado como base de comercialização e certificação de sementes. A segunda demanda está associada aos programas de ensaios de proficiência, já que as sucessivas checagens interlaboratoriais, além da implantação de sistemas de qualidade, fazem parte das exigências para o credenciamento de laboratórios de sementes junto a órgãos como a International Seed Testing Association (ISTA) e o Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Neste contexto, os problemas de pesquisa abordados neste trabalho foram: avaliar técnicas estatísticas complementares a um padrão de análise já determinado pela ISTA, num processo de validação de métodos para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro e investigar a adequação de três técnicas estatísticas, além do método do Z-score, para avaliar os resultados de um ensaio de proficiência, utilizando dados simulados, similares às condições reais. Foram desenvolvidas também rotinas específicas no software R, de código aberto e gratuito, que serviram para a otimização das análises. Como conclusão geral, verificou-se que as técnicas estatísticas propostas como complementares ao padrão da ISTA podem ser utilizadas em um programa de validação de métodos para sementes, uma vez que os resultados possibilitaram a verificação da eficiência desses procedimentos nas diversas etapas do processo. Foi possível comprovar que os métodos propostos para o teste de germinação em sementes de Raphanus sativus var. Oleiferus, com utilização de temperatura alternada 20º-30ºC, em substrato papel ou areia, apresentam exatidão, robustez e precisão (repetibilidade e reprodutibilidade), podendo ser, assim, considerados validados. As técnicas de
∗ Comitê Orientador: Marcelo Silva de Oliveira – DEX/UFLA (orientador), Maria
Laene Moreira de Carvalho – DAG/UFLA, Eric Batista Ferreira – DCE/UNIFAL (coorientadores).
ii
análise generalizada de Procrustes, método campos e análise de agrupamento, quando utilizadas conjuntamente com o método do Z-score, são promissoras para a avaliação dos resultados de ensaios de proficiência na área de sementes.
iii
ABSTRACT
KATAOKA, Verônica Yumi. Statistical tests for methods validation and interlaboratory proficiency tests in oil radish seeds. 2009. 244 p. Thesis (PhD in Statistics and Agricultural Experiments) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brazil.∗ Among the various research demands in the area of seeds, regarding the proposition and investigation of proper statistical techniques for the assessment of several processes in the area, two of them are considered in this work. The first demand refers to the process of method validation for seed quality test, in which a solid statistical evaluation is essential, as, after validation, the method is incorporated into the Rules for Seed Testing, and is therefore used as basis for seed trade and certification. The second demand is associated with proficiency essay programs, given that successive inter-laboratory verifications, in addition to implementation of quality systems, are part of the requirements for seed laboratory accreditation at agencies such as the International Seed Testing Association (ISTA) and the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA). In this context, the research problems approached in this work were to: assess complementary statistical techniques for an analysis standard already determined by ISTA, in a process for method validation for oil radish seed germination test, and investigate the appropriateness of three statistical techniques, in addition to the Z-score method, to evaluate the results of a proficiency essay, using simulated data, similar to real conditions. Specific routines have also been developed in the R software, open coded and free of charge, which served for analysis optimization. As a general conclusion, we verified that the statistical techniques proposed as complementary to the ISTA standard can be used in a program for validation of seed methods, once the results allowed for the verification of the efficiency of such procedures in the several stages of the process. It was possible to evidence that the proposed methods for germination test in seeds of Raphanus sativus var. Oleiferus, with the use of alternate temperatures of 20º-30ºC, in substrates paper or sand, present accuracy, robustness and precision (repeatability and reproducibility),and therefore can be considered as validated. The techniques of generalized Procrustes analysis, Campos method and grouping analysis, whenever jointly
∗ Guidance Committee: Marcelo Silva de Oliveira – DEX/UFLA (Adviser), Maria Laene
Moreira de Carvalho – DAG/UFLA (co-advisor), Eric Batista Ferreira – DSC/UNIFAL (Co-adviser).
iv
used with the Z-score method, are promising in the evaluation of proficiency essay results in the area of seeds.
1
CAPÍTULO 1
2
1 INTRODUÇÃO GERAL
Na pesquisa científica, a Estatística atua com as suas técnicas em todas
as etapas, sendo que geralmente as evidências empíricas são analisadas por
amostragem e estatística descritiva, testadas por meio da inferência estatística, e
que ao final permitem algum tipo de tomada de decisão.
Machado et al. (2005) salientam que o uso da metodologia estatística
não salva uma pesquisa mal planejada ou mal conduzida, e que a participação de
um especialista em Estatística deve iniciar-se, pelo menos, na fase de
planejamento.
Corroborando com essas idéias, especificamente no caso do programa
do método de validação de testes na área de sementes da International Seed
Testing Association (ISTA), esta organização preconiza que todo o processo
deve ser acompanhado por dois estatísticos: um que é responsável por todas as
orientações durante a execução e outro para revisar os resultados obtidos.
Esta recomendação se justifica pelo fato de que uma avaliação estatística
criteriosa dos resultados é uma fase essencial nesse processo, uma vez que, após
a validação, o método é incorporado nas Regras para Análise de Sementes da
ISTA (RAS - ISTA), passando a ser utilizada como base de comercialização e
certificação de sementes em todo o mundo.
Se o método não atender aos requisitos de exatidão, robustez,
reprodutibilidade e repetibilidade, a conseqüência direta será a sua aplicação de
forma inadequada em futuros testes.
Então, a discussão aqui não perpassa apenas pelo fato de que, no
momento da tomada de decisões, podem-se cometer os erros tipo I ou II, já que
esses estão sempre implícitos nos processos e podem ser controlados, mas,
3
também, pela utilização de métodos estatísticos inadequados e ou insatisfatórios
para análise dos resultados.
No Brasil, para atender a uma demanda do mercado interno, o
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), em consonância
com as regras internacionais, já está desenvolvendo um programa de validação
de métodos que, associado à implantação de sistemas de qualidade como uma
exigência para credenciamento de laboratórios de sementes, e as sucessivas
checagens interlaboratoriais (denominadas de ensaios de proficiência) que serão
realizadas, aumentarão a possibilidade de uniformização de testes e
procedimentos.
Neste contexto, verifica-se a necessidade premente de investigar, propor
e avaliar métodos estatísticos apropriados, tanto para o processo de validação de
método, como para os ensaios de proficiência na área de sementes, bem como o
desenvolvimento de rotinas específicas num programa estatístico para estes tipos
de análises.
Este foi o problema de pesquisa abordado neste trabalho, o qual foi
estruturado em dois capítulos. No capítulo 2, é apresentado o processo de
validação de método para um teste de germinação com sementes de nabo
forrageiro. No capítulo 3 são abordados os procedimentos de um ensaio de
proficiência utilizando dados simulados, exemplificando uma situação de testes
de germinação similares às condições reais. Um resumo esquemático das etapas
que foram desenvolvidas em cada um dos capítulos pode ser observado na
Figura 1.
Ressalta-se que, apesar de terem sido utilizadas sementes de nabo
forrageiro, o propósito final deste trabalho é que as técnicas avaliadas e
selecionadas sirvam como referência metodológica para programas de validação
de método e ensaios de proficiência com sementes de qualquer espécie vegetal.
4
FIGURA 1 Resumo esquemático das etapas desenvolvidas nos capítulos 2 e 3
5
4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MACHADO, A.A.; DEMÉTRIO, C.G.B.; FEREEIRA, D.F.; SILVA, J.G. C. da. Estatística experimental: uma abordagem fundamentada no planejamento e no uso de recursos computacionais. In: REUNIÃO ANUAL DA RBRAS, 50; SEAGRO,11., 2005, Londrina. Anais... Londrina: UEL, 2005. p. 290.
6
CAPÍTULO 2 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
7
1 RESUMO Para várias espécies vegetais, o teste de germinação, bem como vários outros testes, não tem seus procedimentos descritos nas Regras para Análise de Sementes (RAS) utilizadas no Brasil pela falta de padronização e validação metodológica. A International Seed Testing Association (ISTA), para assegurar a padronização de métodos para o comércio internacional de sementes, estabeleceu critérios de validação de método e, neste processo, a descrição do método deve ser clara e completa e o procedimento deve fornecer exatidão, robustez, reprodutibilidade e repetibilidade, consequentemente, vários procedimentos estatísticos devem ser utilizados para analisar os resultados. O objetivo deste estudo foi propor e avaliar o uso de outras técnicas estatísticas, além do padrão ISTA, num processo de validação de métodos específicos para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro, utilizando os substratos areia e papel e temperatura alternada 20º-30ºC. Os testes de germinação foram realizados em oito laboratórios. As técnicas estatísticas foram utilizadas para: verificar a homogeneidade dos lotes (teste H), identificar a presença de valores discrepantes (método de Hampel) e outliers nas variâncias (teste de Levene para média); avaliar os efeitos de laboratórios e lotes (análise de variância); verificar a repetibilidade, a reprodutibilidade, a exatidão e a robustez (limites críticos de repetibilidade, reprodutibilidade, estatísticas h e k de Mandel); comparar os diferentes métodos de germinação (testes F) e reavaliar o nível de qualidade dos lotes (análise discriminante). Tanto no aspecto estatístico como no fitotécnico, os métodos para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro com a utilização dos substratos areia e papel e temperatura alternada 20º-30ºC podem ser consideradas validadas, pois apresentaram exatidão, robustez, repetibilidade e reprodutibilidade adequados. As técnicas estatísticas propostas, como teste de Levene, limites críticos de repetibilidade e reprodutibilidade, testes F e análise discriminante, contribuem para a melhoria e o aperfeiçoamento das análises no processo de validação de métodos.
8
2 ABSTRACT
For several vegetal species, the germination test, as well as many other tests, has no procedures described in the Rules for Seed Testing used in Brazil due to lack of standardization and methodological validation. The International Seed Testing Association (ISTA), to ensure the standardization of methods for the international seed trade, established criteria for the validation method and, in the process, the method description should be clear and comprehensive, and the procedure should provide for accuracy, robustness, reproducibility and repeatability, consequently, several statistical procedures shall be used to analyze the results. This study aims at proposing and evaluating the use of other statistical techniques, in addition to the ISTA standard, in a process of validation of specific methods for germination tests in oil radish seeds, using sand and paper as substrates at alternate temperatures of 20º-30ºC. Germination tests were carried out in eight laboratories. The statistical techniques have been used to: verify the homogeneity of lots (H test), identify the presence of discrepant values (Hampel method) and outliers in variances (Levene’s test for average); assess the effects of laboratories and lots (analysis of variance); verify repeatability, reproducibility, accuracy and robustness (critical limits of repeatability, reproducibility, Mandel’s h and k statistics); compare different germination methods (F tests); and reevaluate the quality level of lots (discriminating analysis). Both in statistical and phytotechnical aspects, the methods for germination test in oil radish seeds with the use of substrates sand and paper and alternate temperatures of 20º-30ºC can be considered validated, as they presented proper accuracy, robustness, repeatability and reproducibility. The proposed statistical techniques, such as the Levene’s test, critical limits of repeatability and reproducibility, F tests, and discriminating analysis, contribute to improving and perfecting analyses in the process of method validation.
9
3 INTRODUÇÃO
Uma exigência do comércio de sementes é a produção das mesmas em
quantidade e qualidade suficientes para viabilizar o cultivo de uma determinada
cultura pelo produtor e, por conseguinte, possibilitar, por exemplo, a produção
de grãos em larga escala.
Para averiguar os componentes de qualidade das sementes, são
realizados testes, como o de germinação, sob condições ideais e artificiais que
permitem a manifestação do máximo potencial de germinação (Association of
official seed analysts, AOSA, 1983). Mas, para várias espécies vegetais, o teste
de germinação, bem como vários outros testes, não tem seus procedimentos
descritos nas Regras para Análise de Sementes (RAS) utilizadas no Brasil.
Segundo a literatura internacional (ISTA, 2007a; Sheppard & Cockerell,
2000; Eurachem, 1998), a designação de um teste ou método deve basear-se em
princípios de metrologia. Dessa forma, a indicação de um determinado teste
deve ser precedida de procedimentos de validação metodológica.
A International Seed Testing Association (ISTA), para assegurar a
padronização de métodos para o comércio internacional de sementes,
estabeleceu critérios de validação de métodos em um protocolo elaborado em
2002. Este programa consiste de uma avaliação crítica para assegurar que a
descrição do método seja clara e completa, e que o procedimento forneça
exatidão, robustez, reprodutibilidade e repetibilidade dos resultados em
concordância com as especificações estabelecidas pelo próprio método. Quando
apropriado, confirma a relação entre os resultados de um teste de qualidade e a
expressão prática da qualidade fisiológica da semente.
Para a avaliação do processo de validação de métodos, já existe uma
recomendação da ISTA para o desenvolvimento de uma análise padrão que
10
considera a utilização de algumas técnicas estatísticas, mas que não restringe a
proposição de novos procedimentos (ISTA, 2007a).
O problema de pesquisa para esta etapa do estudo foi definir,
primeiramente, uma cultura importante no cenário agrícola nacional de produção
e que ainda não tivesse procedimentos específicos de testes descritos na RAS
para avaliar a qualidade das suas sementes. Segundo, para a espécie em questão,
definir qual ou quais métodos deveriam ser avaliados. Por fim, verificar se
outras técnicas estatísticas, além das recomendadas pela ISTA, poderiam
contribuir para a melhoria e/ou o aperfeiçoamento das análises do programa de
validação de métodos.
11
4 REFERENCIAL TEÓRICO Nesta seção são apresentadas, em linhas gerais, as duas etapas propostas
neste estudo (Figuras 2 e 3) para o desenvolvimento de um programa de
validação de métodos na área de sementes, bem como os conceitos envolvidos
neste processo.
FIGURA 2 Esquema da 1ª etapa do programa de validação de métodos na área de sementes: procedimentos iniciais
12
FIGURA 3 Esquema da 2ª etapa do programa de validação de métodos na área
de sementes: avaliação dos resultados
13
As explicações sobre os elementos dos dois esquemas são dadas nas
seções que se seguem.
4.1 Programas de validação de métodos: aspectos gerais
De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas, ABNT
(2000), validação é a comprovação, por meio da apresentação de evidência
objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos
foram atendidos.
Esta definição pode ser interpretada para o método de validação em
sementes como sendo uma investigação crítica de um teste de qualidade para
assegurar que a descrição do método é clara e completa e que o procedimento
fornece exatidão, precisão (reprodutibilidade e repetibilidade) e robustez (ISTA,
2007a).
O método de validação de um teste de qualidade de sementes é
importante para a determinação de um resultado correto e que seja capaz de
mostrar que é “correto”, dentro de limites de variação executáveis e aceitáveis.
Importantes decisões poderão ser tomadas com base nesses resultados. Além
disso, o custo de execução de um teste deve ser considerado quando da sua
indicação.
No caso específico da área de sementes, a ISTA é a organização
internacional responsável pela oficialização de métodos de testes de qualidade e
pela promoção de seu uso seguro, conferindo, assim, confiança aos resultados e
certificações.
Até 2002, não existia um sistema consistente para a incorporação dos
métodos de teste em sementes nas regras da ISTA e cada comitê técnico tinha
seu próprio procedimento.
Em 2002, o comitê executivo deste órgão elaborou um programa de
validação de método único, tendo como objetivo fornecer um sistema que
14
permite validar novos métodos para teste em sementes, comparar métodos
equivalentes e verificar a manutenção (revisão) de métodos já existentes para
avaliação da qualidade da semente (ISTA, 2007a).
Salienta-se que, no caso deste trabalho, o programa de validação foi
utilizado no intuito de validar novos métodos para teste de qualidade de
sementes.
O programa de validação da ISTA vem sendo desenvolvido por meio de
estudos colaborativos entre laboratórios (validação multilaboratorial
colaborativa) para assegurar que o procedimento do teste em sementes forneça
resultados confiáveis e reprodutíveis, de acordo com as especificações
estabelecidas pelo método de teste. Existem alguns critérios para selecionar os
laboratórios participantes (ISTA, 2007a). São eles:
• somente laboratórios com experiência em análise de teste de qualidade
de semente ou aplicação das técnicas específicas a serem avaliadas no
teste comparativo deverão ser convidados a participar do programa;
• estes laboratórios devem ter profissionais qualificados, instalações
apropriadas e equipamentos recomendados para executar o teste em
sementes; devem entender e aceitar as suas obrigações ao participar de
um programa de validação de métodos;
• em casos nos quais exista alguma dúvida sobre a habilidade de um
laboratório em executar o teste de qualidade de sementes, um pré-teste
pode ser utilizado. Com base nos resultados, o organizador de teste
decidirá quais laboratórios podem ser envolvidos no ensaio
comparativo.
O processo completo de validação da ISTA é desenvolvido em cinco
fases: seleção e desenvolvimento do método; validação por meio de testes
comparativos; revisão dos resultados dos testes comparativos e preparação de
15
um relatório final; aprovação e aceitação final dos métodos pelos membros da
ISTA e posterior publicação nas Regras Internacionais para Análise de
Sementes.
No processo de validação de métodos proposto neste trabalho, somente
as três primeiras fases citadas foram contempladas, já que nenhuma
documentação foi enviada para a ISTA, pois não era este o foco principal do
estudo.
Como apresentado no esquema da Figura 1, a 1ª etapa para o programa
de validação proposta neste trabalho foi composta de alguns procedimentos
iniciais, tendo como 1ª subetapa a definição da espécie a ser estudada.
Neste estudo, foi escolhido o nabo forrageiro (Raphanus sativus L. var.
oleiferus Metzg.), já que não existem procedimentos específicos para teste de
germinação para esta cultura nas RAS. O que vem sendo utilizado atualmente
são métodos descritos para o teste de germinação para Raphanus sativus.
4.2 Importância da cultura do nabo forrageiro
A justificativa para o desenvolvimento de estudos mais aprofundados
com o nabo forrageiro (Raphanus sativus L. var. oleiferus Metzg.) não decorre
apenas do fato de não haver procedimentos específicos de teste descritos na
RAS, mas porque as suas sementes têm se revelado uma opção promissora como
matéria-prima para a produção do biodiesel1, por possuir alto rendimento em
óleo de baixa viscosidade, com teor médio estimado de 35%.
Vieira (2007) observa, ainda, que o óleo do nabo forrageiro é de fácil
extração, mas o principal fator que atesta a qualidade dessa matéria-prima é a
1 Segundo a Lei nº 11.097, de 13 de janeiro de 2005, biodiesel é um biocombustível para uso em motores a combustão interna com ignição por compressão ou, conforme o regulamento, para geração de outro tipo de energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem fóssil (Brasil, 2005).
16
elevada presença de triglicerídeos no óleo, os quais vão dar origem a ésteres
alquílicos de ácidos graxos e glicerina. São os ésteres que constituem o
biodiesel.
Desde 2002, pesquisas vêm sendo realizadas no intuito de otimizar o
aproveitamento das sementes de nabo forrageiro para a produção de biodiesel.
Atualmente, essas pesquisas buscam, principalmente, o melhoramento genético
dessa planta para a obtenção de uma maior produtividade, já que o rendimento
médio é de apenas 1.000 kg de grão por hectare, sendo este ainda um fator
limitante para seu uso em larga escala.
Esta cultura está incluída, principalmente, nos programas estaduais de
biodiesel dos estados do Mato Grosso do Sul e do Paraná. Em Minas Gerais,
apesar de não estar incluída como prioritária para pesquisas, foi inaugurada em
Cássia, no ano de 2005, a primeira indústria de biodiesel no Brasil (Sol e
Minas), produzido com sementes de nabo forrageiro.
A utilização de biodiesel no Brasil vem sendo incentivada por projetos
definidos pelo governo federal, por ser uma alternativa viável para a redução de
importação do óleo diesel que gera despesas anuais na ordem de US$1,2 bilhão
para o país. Existem, ainda, outros aspectos relevantes a favor da introdução do
biodiesel, como a diminuição da poluição do ar, a sustentação de um grande
programa de geração de emprego e renda com a participação da agricultura
familiar, além da possibilidade de geração de excedentes de biocombustível
exportáveis para outros países (Holanda, 2004).
Vale ressaltar que, além dos benefícios ambientais, a produção de
biodiesel pode, ainda, propiciar vantagens econômicas e políticas ao Brasil pelo
cumprimento dos acordos estabelecidos no Protocolo de Quioto e nas diretrizes
do mecanismo de desenvolvimento limpo (MDL), pela geração de cotas de
carbono e pelo fortalecimento de sua situação como um dos países de matriz
energética limpa (Holanda, 2004).
17
Segundo Foster (2004), a diretriz do programa do governo federal é
produzir biodiesel no Brasil de forma economicamente sustentável, fazendo a
inclusão do pequeno produtor do campo, promovendo a sustentação social.
Nesse sentido, o nabo forrageiro parece ser bem apropriado, já que seu custo de
produção é baixo em relação a outras culturas, como a da soja ou a do girassol, e
o seu teor de óleo é tão elevado quanto ao dessas culturas.
De acordo com Vieira (2007), a planta de nabo forrageiro se adapta bem
a diferentes condições edafoclimáticas, fornece massa foliar para adubação
verde, é indicada para a rotação de culturas, como cobertura do solo durante o
inverno e, eventualmente, para compor a alimentação animal, além de não
competir como matéria-prima na alimentação humana.
O desafio atual é a produção de sementes de nabo forrageiro em
quantidade e qualidade suficientes para possibilitar um aumento na
produtividade dessa cultura e, por conseguinte, viabilizar sua utilização como
matéria-prima competitiva e rentável para produção de biodiesel.
Para o comércio de sementes, o resultado de um teste de germinação é o
principal indicativo da qualidade fisiológica da semente, sendo considerado um
dos testes obrigatórios a serem realizados.
No caso do nabo forrageiro, o método para o teste de germinação que
vem sendo utilizado é o mesmo empregado para a espécie Raphanus sativus, não
existindo um procedimento específico para variedade Oleiferus. Então, a
proposta deste trabalho foi avaliar o processo de validação de métodos
específicos para o teste de germinação em sementes desta cultura.
4.3 Testes de germinação
A germinação é um fenômeno biológico que pode ser considerado, em
análise de sementes, como a emergência e o desenvolvimento das estruturas
essenciais do embrião, manifestando a sua capacidade para dar origem a uma
18
planta normal, sob condições ambientais favoráveis (Instituto de Pesquisas e
Estudos Florestais, IPEF, 1998).
A avaliação da germinação das sementes é efetuada pelo teste de
germinação, conduzido em laboratório sob condições controladas e por meio de
métodos padronizados que visam, principalmente, avaliar o valor dessas
sementes para a semeadura e comparar a qualidade de diferentes lotes, servindo
como base para a comercialização (Novembre, 1994; Marcos Filho et al., 2005).
O conhecimento das condições ideais para a germinação da semente de
uma determinada espécie é de fundamental importância, principalmente pelas
respostas diferenciadas que ela pode apresentar em função de diversos fatores,
como viabilidade, dormência, condições de ambiente, envolvendo água, luz,
temperatura, oxigênio e ausência de agentes patogênicos, associados ao tipo de
substrato para a sua germinação (Brasil, 1992; Bewley & Black, 1994; Carvalho
& Nakagawa, 2000).
Os substratos utilizados no teste de germinação, em geral, têm como
principal função dar sustentação às sementes, tanto do ponto de vista físico
como químico (Aguiar et al., 1993). Em função do tamanho e das exigências
ecofisiológicas das sementes quanto à umidade e à luz, cada substrato é utilizado
de maneira a oferecer maior praticidade nas contagens e na avaliação das
plântulas (Popinigs, 1985).
Nery et al. (2007) e Nery (2008) realizaram testes de germinação para
sementes de nabo forrageiro, visando definir a temperatura ótima e o substrato
ideal para avaliação da qualidade de sementes das cultivares CATI AL-1000 e
IPR 116. Estes autores verificaram que a temperatura alternada de 20º-30ºC e
uso do substrato areia seriam as condições ideais.
Apesar de essas duas pesquisas já apresentarem indicativos de um
método adequado para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro,
19
como dito, não existe ainda uma recomendação específica, descrita nas RAS,
para a variedade Oleiferus.
Foram avaliados, no programa de validação deste trabalho, dois métodos
para o teste de germinação, um utilizando como substrato a areia, e o outro o
papel, com temperatura alternada de 20º-30ºC (Figura 4).
FIGURA 4 Esquema da 1ª etapa do programa de validação de métodos, com
ênfase na subetapa definição da espécie e do método
Definidos a espécie a ser estudada e os métodos a serem validadas, a
subetapa seguinte de um programa de validação é verificar se os lotes coletados
para o processo podem ser considerados homogêneos. Para isso, são realizados
testes correspondentes ao escopo em estudo (teste de germinação, no caso deste
trabalho) e, com os resultados, aplica-se o teste de heterogeneidade (teste H).
4.4 Seleção de lotes de acordo com a homogeneidade – Teste H
A homogeneidade dos lotes e a representatividade da amostra
constituem princípios básicos da amostragem para análise de sementes
(Copeland & Liu, 2005).
20
A exigência para tal homogeneidade é a de que um lote de sementes é
caracterizado pelo conjunto de todos os seus componentes. Assim sendo, se um
lote for perfeitamente homogêneo, todos os seus componentes estarão
uniformemente distribuídos em todas as suas partes. Dessa forma, uma amostra
tomada em um ponto seria idêntica à outra tomada em qualquer outro ponto, no
que se refere às diferentes características submetidas à análise (Brasil, 1992).
Isto é, sendo um lote considerado como homogêneo, garante-se a aleatoriedade
no processo de amostragem.
Neste contexto, antes de iniciar o processo de validação, é necessário
selecionar os lotes que sejam mais homogêneos, sendo recomendado pela RAS
(Brasil, 1992) o teste de heterogeneidade (H), desenvolvido por J.G.
Tarttersfield e A. Bould, na década de 1970.
No teste H, a medida da heterogeneidade de um lote de sementes
envolve uma comparação entre a variância observada, encontrada entre as
amostras, e a variância teórica, se a distribuição for ao acaso. De fato, no
cálculo, é utilizada a variância aceitável, que é obtida pela multiplicação da
variância teórica pelo um fator “f” de variação adicional. No caso do teste de
germinação, a variância teórica é calculada utilizando-se a distribuição binomial
(Figura 5).
21
FIGURA 5 Esquema da 1ª etapa do programa de validação de métodos, com ênfase na subetapa seleção de lotes
Bould (1975) computou os valores de H críticos com base na
distribuição χ². As regras da ISTA incluem estes valores críticos de H na tomada
de decisões no controle de qualidade de um lote de sementes (ISTA, 2007b).
No programa de validação, tão importante quanto trabalhar com lotes
homogêneos é assegurar-se de que eles tenham níveis de qualidade fisiológica
diferentes, determinando, assim, a 4ª subetapa, que é a caracterização dos lotes.
22
4.5 Caracterização dos lotes
Uma das características do processo de validação de métodos para testes
de qualidade de sementes é a utilização de lotes com qualidade diferentes,
previamente determinados antes do início do estudo (ISTA, 2007a).
O objetivo é avaliar se, de fato, o método proposto será robusto sob a
condição de lotes com qualidade diferentes, isto é, se será pouco sensível a
variações causadas por flutuações nas variáveis que definem e controlam o
desenrolar do teste de qualidade de sementes.
De acordo com Waeny (1980), o método ideal deve ser robusto para
suportar condições adversas de aplicação e também ser preciso (repetibilidade e
reprodutibilidade) e exato.
Os lotes podem ser classificados, quanto à sua qualidade fisiológica, em
três níveis: inferior, intermediário e superior. A qualidade fisiológica é definida
como a capacidade das sementes para desempenharem funções vitais,
caracterizadas pela sua germinação, vigor e longevidade (Popinigis, 1985) e tem
sido avaliada rotineiramente por meio do teste de germinação (Figura 6).
23
FIGURA 6 Esquema da 1ª etapa do programa de validação de métodos, com ênfase na subetapa caracterização dos lotes
Maiores detalhes sobre o procedimento de distribuição do material para
os laboratórios selecionados (5ª subetapa), ainda desta 1ª etapa, podem ser
observados na subseção 5.3.
Na 2ª etapa do programa de validação (Figura 3), os resultados dos
laboratórios são avaliados de acordo com várias técnicas estatísticas, sendo a 1ª
24
subetapa do processo a investigação de valores discrepantes. A orientação do
programa de validação, nos casos em que for detectado algum outlier, é
promover a sua retirada do banco de dados, antes de proceder às próximas
análises (ISTA, 2007 a).
De acordo com Williams et al. (2002) e Liu et al. (2004), é importante a
identificação dos valores discrepantes antes da modelagem e análise, pois a
presença desses valores pode levar a um modelo mal especificado, à estimação
viesada de parâmetros e, por conseguinte, a resultados incorretos.
4.6 Identificação de valores discrepantes (outliers)
Podem ser considerados outliers aqueles elementos que não obedecem a
um padrão do conjunto de dados ao qual eles pertencem.
Barnett & Lewis (1994) relatam que as fontes potenciais de outliers são:
• variabilidade inerente: variação natural das observações sobre o grupo,
eventos inesperados durante o processo de gerações dos dados;
• erros de medição: instrumentos de medição inadequados, erros na
transcrição dos dados, arredondamentos nos valores obtidos;
• erro praticado: variabilidade devido à coleta imperfeita dos dados,
como, por exemplo, a escolha de uma amostra viesada.
Para identificar a presença valores discrepantes, podem ser utilizados
diversos testes estatísticos e técnicas gráficas. A ISTA (2007a) utiliza, nos seus
programas de validação de métodos para teste de qualidade de sementes, o teste
de Hampel e o Boxplot.
O método de Hampel (Hampel, 1985) é uma técnica robusta para a
detecção de outlier e que troca as estimativas da média e do desvio padrão,
sensíveis à presença de valores discrepantes, respectivamente, pela mediana e o
desvio absoluto mediano, robusto aos outliers.
25
O Boxplot (Tukey, 1977) é um tipo de gráfico que sumariza medidas
estatísticas, como: mediana, quartis inferior e superior, valores máximo e
mínimo, além de dar uma ideia da posição, da dispersão, da assimetria e da
presença de valores discrepantes, permitindo também confrontar variáveis da
mesma natureza em uma mesma escala (Bussab & Morettin, 2003).
Neste estudo, optou-se pelo uso do método de Hampel, para a retirada
dos outliers em detrimento do Boxplot.
A decisão pela utilização do método de Hampel foi baseada no conceito
de breakdown point (Hampel, 1974; Rousseeuw & Croux, 1993; Gnanadesikan,
1997; Carling, 2000; Cunha, 2002; Reiman et al., 2005; Davies & Gather, 2007;
Hellerstein, 2008).
Dada uma amostra aleatória 1,... nX X e um estimador ( )1ˆ ,... nX Xθ de
um parâmetro θ , o breakdown point é a maior fração da amostra 1,... nX X em
que os elementos iX podem assumir valores extremos sem afetar a robustez do
valor de ( )1ˆ ,... nX Xθ . Por exemplo, para a média amostral, o breakdow point,
considerando uma amostra finita, é igual a 1/n, pois, se os valores de 1 1,..., nx x −
forem fixados e nx assumir um valor tendendo ao infinito, a média amostral
também tenderá para o infinito. Ou seja, para a média amostral, basta que um
valor seja extremo para afetar a robustez da estimativa. Logo, assintoticamente,
breakdow point para a média amostral é igual a zero 1lim 0n n→∞
⎛ ⎞=⎜ ⎟⎝ ⎠
.
De acordo com Hampel (1974), Rousseeuw & Croux (1993), o desvio
absoluto mediano { }( ).mediana iMAD Y Y= − é um estimador de escala mais
26
robusto2 do que a amplitude interquatílica ( )( )0,25 0,75ˆ ˆ ˆY Yδ = − , já que os
breakdown points assintoticamente são iguais a 50% e 25%; respectivamente.
O breakdown point do desvio absoluto mediano é assintoticamente igual
a 50% porque, considerando, uma amostra finita de tamanho n, se a minoria das
observações ( )( 1) 2h n − , em que em que ( )h ⋅ representa o maior inteiro menor
que o argumento, tenderem para o infinito e o resto das observações tiver um
valor fixado, então, a mediana permanece com a maioria. Assim, o breakdown
point para uma amostra finita é [ ]( 1) 2h n n− e assintoticamente igual a 12
, pois
( 1) 1lim2 2n
nn→∞
−⎛ ⎞=⎜ ⎟⎝ ⎠
.
Os métodos diferem também na suas regras de decisão. No caso do
método de Hampel, uma observação ( )iY é considerada outlier se o desvio
absoluto em relação à mediana ( )Y for maior que 5,2MAD, em que
MAD = { }.mediana iY Y− (para o esquema dessa subetapa ver Figura 7).
2 A grosso modo, um estimador é considerado robusto, se for “insensível” a desvios de pressuposições básicas, por exemplo, mesmo na presença de outliers o seu resultado não é afetado de maneira significativa.
27
FIGURA 7 Esquema da 2ª etapa do programa de validação de métodos, com ênfase na subetapa identificação de valores discrepantes
No caso do Boxplot, o valor absoluto da observação deve ser maior que
1,5 vez a amplitude interquatílica ( )0,25 0,75ˆ ˆY Y− , isto é, ( )0,25 0,75
ˆ ˆ1,5iY Y Y> − .
Fazendo um paralelo entre essas duas técnicas, se os dados seguirem
uma distribuição normal padrão, tem-se que 5,2MAD correspondem a
aproximadamente 3,5σ (prova i), e que ( )0,25 0,751,5 Y Y− é equivalente a 2,2σ
(prova ii) (Figura 8).
28
2.02σ |---------- ----------|3.5σ |------------------- --------------------|
N~(0,1)
-1,01 1,01-1,75 1,75
FIGURA 8 Curva da Normal Padrão, com delimitação das regiões
correspondentes a 2,2σ e 3,5σ
Prova (i)
( ) 1 12 2
Y MAD MADP Y MAD P P Zμμσ σ σ
⎛ ⎞− ⎛ ⎞− ≤ = = ≤ ⇒ = ≤⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠⎝ ⎠
Para uma distribuição simétrica, a MAD é a distância entre o 1º e 2º
quartis (equivalentemente, 2º e 3º quartis). Então, o fator escala para o uso da
MAD para uma distribuição normal padrão é o 75º percentil, logo:
1 3 0,6745 1,48264
MAD MADσσ
− ⎛ ⎞= Φ = ⇒ ≅⎜ ⎟⎝ ⎠
Num paralelo com a regra de decisão do método de Hampel, tem-se:
ˆ ˆ5,2 5,2 3,51,4826i i iY Y MAD Y Y Y Yσ σ− > ⇒ − > ⇒ − >
29
Prova (ii)
Para demonstrar que ( )0,25 0,751,5 Y Y− é equivalente a, aproximadamente,
2,02σ , deve-se levar em consideração que
( )( ) ( )
( )
0,25 0,750,25 0,75
0,25 0,75
12
12
Y YYP Y Y Y P
Y YP Z
μμσ σ
σ
⎛ ⎞−−⎜ ⎟− ≤ − = = ≤ ⇒⎜ ⎟⎝ ⎠
⎛ ⎞−⎜ ⎟= ≤⎜ ⎟⎝ ⎠
( ) ( )0,25 0,75 10,25 0,75
32 2.0,6745 0,74134
Y YY Yσ
σ−
− ⎛ ⎞= Φ = ⇒ ≅ −⎜ ⎟⎝ ⎠
Num paralelo com a regra de decisão do Boxplot, tem-se:
( )0,25 0,751,5 1,5 2,020,7413i i iY Y Y Y Yσ σ> − ⇒ > ⇒ >
Reimann et al. (2005) investigaram três procedimentos para a detecção
de outliers, o Boxplot, mediana 2MAD± e a média 2σ± e concluíram, por
meio de simulações, que a função Boxplot era mais informativa se o número de
outliers estivesse abaixo de 10% do total de observações. Quando esta proporção
foi superior a 15%, somente a mediana 2MAD± teve desempenho satisfatório.
Após a investigação de valores discrepantes, a próxima subetapa do
processo de validação consiste em avaliar se a variância de algum laboratório é
discrepante em relação aos demais e, caso seja identificado como sendo um
outlier, recomenda-se a retirada do laboratório para as próximas etapas (ISTA,
2007a).
30
4.7 Identificação de outliers nas variâncias
Quanto às variâncias, um dos pressupostos fundamentais assumidos para
o bom desempenho dos testes paramétricos na avaliação de resultados
provenientes de diferentes fontes é considerar que as mesmas são homogêneas, a
ponto de não ultrapassarem determinados limites de tolerância. Tais limites são,
via de regra, com tolerância zero, isto é, variâncias homogêneas são variâncias
iguais.
De acordo com as recomendações da ISTA (2007a), o teste de Cochran
(Cochran, 1941) deve ser utilizado para verificar a hipótese nula de
homogeneidade (igualdade) entre variâncias dos laboratórios, sendo a sua
estatística expressa por:
( )2
2
1
max lp
ll
Sg
S=
=
∑, (1)
em que p é o número de laboratórios e 2lS é o estimador da variância do l-ésimo
laboratório.
Mas, observando-se os resultados do Capítulo 2, especificamente o lote
3, para os dois métodos, areia e papel, verificou-se haver certa restrição no uso
deste teste3, que será explicitado posteriormente (Tabela 1). Foi então realizado
um estudo investigativo para avaliar a adequabilidade de outros três testes:
Levene para a média, designado de teste 2 (Levene, 1960); Bartlett - teste 3
(Bartlett, 1937) e Levene para mediana - teste 4 (Brown & Forsythe, 1974).
3 Este resultado está sendo apresentado antecipadamente nesta seção, com o objetivo de auxiliar a discussão sobre a escolha do teste para a verificação de homogeneidade das variâncias.
31
TABELA 1 Variâncias dos laboratórios e valor p dos testes 1 (Cochran), 2 (Levene para média), 3 (Bartlett) e 4 (Levene para mediana) para os resultados do teste de germinação em sementes de nabo forrageiro do lote 3, para os substratos areia e papel
Substrato Lab. s² Teste (valor p) 1 2 3 4
Areia
1 4,50
p = 0,8897 p = 0,0099 -------- p = 0,8953
2 2,33 3 0,00 4 8,33 5 1,00 6 4,50 7 8,33 8 0,50
Papel
1 6,33
p = 0,0180 p = 0,0073 p = 0,2390 p = 0,0423
2 1,00 3 0,33 4 1,00 5 2,33 6 24,50 8 2,33
De acordo com os resultados, observa-se que, pelo teste de Cochran, a
1% de significância, não há evidências para rejeitar a hipótese de
homogeneidade das variâncias para os dois métodos. O mesmo resultado foi
encontrado para os testes de Bartlett e Levene modificado para a mediana.
Pelos resultados, parece haver alguma condição de restrição no uso
destes testes, uma vez que a maior variância é igual a 8,33 vezes a menor
variância, no caso do substrato areia e 74,24 vezes, no caso do substrato papel.
Vale salientar que, para o teste de Bartlett, no caso do substrato areia, a
estatística 2χ do teste (expressão 2) nem foi calculada, já que o laboratório 3
tem variância igual a zero e, consequentemente, ( )23
23
0lim lnS
S→
= +∞ :
32
( ) ( ) ( ) ( )
( )
2 212
1
ln 1 ln
1 1 113 1 1
pp l ll
p
ll
N p S n S
p n N p
χ =
=
− − −=
⎛ ⎞⎛ ⎞+ −⎜ ⎟⎜ ⎟⎜ ⎟− − −⎝ ⎠⎝ ⎠
∑
∑, (2)
em que: 1
pll
N n=
=∑ , sendo ln o número de repetições do l-ésimo laboratório;
( )2 2
1
1 1p
p l ll
S n SN p =
= −− ∑ é o estimador da variância combinada, sendo 2
lS o
estimador da variância do l-ésimo laboratório.
Vorapongsathorn et al. (2004) e Almeida et al. (2008) afirmam que os
testes de Cochran e Bartlett são sensíveis a desvios de normalidade. De acordo
com Hines & O’Hara Hines (2000), o teste de Levene modificado para a
mediana (veja sua estatística W de teste na fórmula 3) é uma alternativa robusta
com relação a desvios de normalidade, mas pode tornar-se ineficiente para
detectar desigualdade de variâncias na presença de zeros estruturais dado por:
( )( )
2. ..1
2.1 1
( )
( 1) l
pl ll
p nlk ll k
N p n Z ZW
p Z Z=
= =
− −=
− −
∑∑ ∑ , (3)
em que .lk lk lZ Y Y= − , sendo lkY a porcentagem de germinação da k-ésima
repetição no l-ésimo laboratório e .lY o estimador da mediana do l-ésimo
laboratório.
Os zeros estruturais correspondem a valores de lkZ nulos, que sempre
existem para ln ímpar, pois, nesse caso, a mediana coincide com um dos valores
de Ylk (Almeida et al., 2008).
O teste de Levene para média foi o único que rejeitou a hipótese nula
para os dois substratos. De acordo com Vorapongsathorn et al. (2004), para uma
grande variedade de distribuições, este teste é robusto.
33
A única diferença na estatística do teste de Levene para média em
relação à mediana é que, na determinação de lkZ , utiliza-se justamente o
estimador da média ( ).lY em vez da mediana ( ).lY . Segundo Almeida et al.
(2008), a estatística do teste de Levene é obtida a partir de uma análise de
variância com um único fator, já que os níveis são os grupos e cada observação é
k substituída pelo desvio absoluto da variável em relação à média do seu
respectivo grupo (Figura 9).
Por essa análise preliminar dos quatro métodos, no contexto deste
estudo, parece que o teste mais adequado foi o de Levene para média, já que
foram detectados desvios de normalidade nos resultados de alguns laboratórios
(teste de Shapiro-Wilk) e a presença de zeros estruturais (na maioria dos
laboratórios, o número de repetições era ímpar).
34
FIGURA 9 Esquema da 2ª etapa do programa de validação de métodos, com
ênfase na subetapa identificação de outliers nas variâncias
4.8 Avaliação da repetibilidade, reprodutibilidade e das estatísticas h e k de
Mandel
Numa mesma medição podem ocorrer dois tipos de erros. Pode-se ter o
erro aleatório, que é a componente do erro da medição que varia de uma forma
imprevisível (variações inerentes ao objeto, ao instrumento ou observador)
quando se efetuam várias medições da mesma grandeza (Vocabulário
Internacional de Metrologia, VIM, 2000), ou, ainda, é um erro tal que os n
resultados iy se distribuem de maneira aleatória em torno valor verdadeiro vy
(na ausência de erro sistemático) e, quando n →∞ , o valor médio vy y→ (lei
dos grande números).
35
O outro tipo de erro é o sistemático, que é o componente do erro da
medição que se mantém constante ou muda de forma previsível quando se
efetuam várias medições da mesma grandeza (VIM, 2000). Isto é, quando existe
somente o erro sistemático, os n resultados iy são iguais e a diferença para o
valor verdadeiro vy é a mesma (Vuolo, 2000).
A possibilidade de esses erros estarem presentes num estudo exige do
pesquisador a realização de aferições de erro nas medidas de suas variáveis.
Segundo Pereira (2004), essa aferição diz respeito à confiabilidade da medida e
inclui avaliações de exatidão e precisão dessas medidas.
Exatidão é o grau de concordância entre o valor médio obtido de uma
grande série de resultados de ensaio e um valor de referência aceito e a sua
medida é usualmente expressa em termos de viés. Assim, quanto menor o viés,
maior é a exatidão. Viés é um erro sistemático, em que um ou mais componentes
do erro podem contribuir para o mesmo, por exemplo, viés do laboratório, de um
método de medição (Association of Analytical Communities, AOAC, 1993).
De acordo com Mood et al. (1974), um estimador T é definido ser um
estimador não viesado ou exato do parâmetro ( )τ θ se, e somente se, a
esperança de T é igual a ( )τ θ , ou seja, [ ] ( )E Tθ
τ θ= . O termo ( ) [ ]E Tθ
τ θ − é
denominado de viés do estimador T.
Lupin & Schouenborg (2000) definem precisão como sendo o grau de
concordância entre resultados de testes independentes obtidos sobre condições
pré-estabelecidas e que dependem somente da distribuição dos erros aleatórios.
Vuolo (2000) afirma que, em medições com boa precisão, obtêm-se resultados
com muitos dígitos e bem repetitivos. Entretanto, pode existir um erro
sistemático grande e, por conseguinte, a exatidão pode não ser boa (Figura 10).
Estatisticamente, a precisão é uma medida da proximidade dos valores
oriundos de repetições de um processo em relação a uma medida de tendência
36
central desse mesmo processo. Por exemplo, uma medida possível para a
precisão seria soma de quadrados ou um quadrado médio do tipo variância:
[ ]iVar Y .
(a)
(b)
(c)
(d)
FIGURA 10 Representação da exatidão e precisão Fonte: adaptado de Pereira (2004: p.49)
37
Na Figura 10 as simbologias significam: (a) IEIP - inexatidão (não se
aproxima do alvo) e - imprecisão (as marcas são dispersas); (b) IEP – inexatidão
(está longe do alvo), mas precisão (pequena dispersão dos tiros); (c) EIP –
exatidão (aproxima-se do alvo), mas imprecisão (marcas dispersas) e (d) EP –
exatidão (acerta o alvo) e precisão (pequena dispersão).
No caso do programa de validação de método para testes de qualidade
de sementes, a precisão dos resultados é avaliada considerando-se tanto a
precisão dentro do laboratório, denominada de repetibilidade, como a precisão
geral (entre e dentro dos laboratórios), designada de reprodutibilidade.
Segundo Campos (1998), repetibilidade é a concordância entre os
resultados de uma série de medidas de uma característica, quando há constância
de um método, analista, instrumento, local e demais condições operacionais e
ambientais. No caso de variar-se premeditadamente uma ou mais das condições
que garantem a avaliação da repetibilidade, a concordância entre os resultados
de uma série de medidas de uma característica representaria a reprodutibilidade.
As condições de repetibilidade e reprodutibilidade estão sumarizadas no
Quadro 1.
QUADRO 1 Condições de repetibilidade e reprodutibilidade
Condições de repetibilidade Condições de reprodutibilidade o mesmo laboratório diferentes laboratórios o mesmo operador diferentes operadores
o mesmo equipamento diferentes equipamentos usando o mesmo método de teste
medindo materiais idênticos ocorrendo num pequeno intervalo de tempo
Fonte: Lupin & Schouenborg (2000).
38
No protocolo da ISTA (2007a), para a validação de métodos, esses
conceitos podem ser interpretados da seguinte forma: a repetibilidade irá
quantificar a variabilidade média dos resultados dentro de cada laboratório,
quando as repetições são feitas na amostra de um dado lote e a reprodutibilidade
será a repetibilidade aumentada pela variabilidade dos resultados de um
laboratório para outro laboratório de um dado lote (variância entre laboratórios),
sendo calculadas de acordo com as normas da ISO 5725-2 (1994).
Com os valores da repetibilidade e reprodutibilidade, podem ser
calculados os seus limites críticos, por meio da multiplicação por um fator
numérico D, que se refere a uma amplitude padronizada baseada na tabela de
Tukey (1977), com graus de liberdade tendendo para o infinito.
Esses limites críticos podem ser utilizados na comparação com as
amplitudes determinadas entre as repetições dentro dos laboratórios e entre
laboratórios, determinando, assim, se os índices obtidos de repetibilidade e
reprodutibilidade são aceitáveis (Olivieri, 1988; Campos, 1998; Campos et al.
1999, Lupin & Schouenborg, 2000).
Outra medida que pode auxiliar na avaliação da precisão, além da
repetibilidade e da reprodutibilidade, é a estatística k de Mandel, que indica o
desvio de um laboratório, quando comparado com o desvio padrão da
repetibilidade (ISTA, 2007a).
Já a estatística h está relacionada com a avaliação da exatidão, já que o
seu valor indica a estimativa do viés, ou seja, o valor h é a medida do desvio da
média de um laboratório, quando comparado com a média geral obtida de todos
os laboratórios (Lupin & Schouenborg, 2000).
Assim, os valores de h podem ser calculados para verificar quais
resultados dos laboratórios estão super ou subestimados, em comparação com a
média geral (ISTA, 2007a).
39
Geralmente, as estatísticas k e h de Mandel são apresentadas
graficamente. Um exemplo do gráfico k considerando oito laboratórios e quatro
lotes pode ser observado na Figura 11.
FIGURA 11 Exemplo do gráfico da estatística k de Mandel, comparado com os valores críticos (Kcrit), a 1% e 5%, para um ensaio com oito laboratórios e quatro lotes
Uma síntese dos passos desta subetapa pode ser observada na Figura 12.
40
FIGURA 12 Esquema da 2ª etapa do programa de validação de métodos, com ênfase nas subetapas avaliação de repetibilidade, reprodutibilidade e das estatísticas h e k de Mandel
41
No que tange a robustez dos métodos4, neste contexto do processo de
validação, ela passa a ser uma consequência direta da avaliação da precisão e
exatidão dos resultados para cada um dos lotes. Isto é, se um lote de qualidade
inferior não apresentar, por exemplo, reprodutibilidade, e se um lote
intermediário for considerado reprodutível, pode ser um indício de que o método
não seja suficientemente robusto.
Outro detalhe importante é que a classificação dos lotes é feita por meio
de um processo de amostragem, sendo os resultados avaliados pelo laboratório
que coordena o processo de validação. Sendo assim, é interessante averiguar se,
de fato, esses resultados vão estar em consonância com os que serão obtidos nos
demais laboratórios, ou seja, se um lote considerado previamente como sendo de
baixa qualidade continuará mantendo a mesma classificação após o processo de
validação. Para tal, a técnica estatística que pareceu ser a mais apropriada para
fazer essa reavaliação do nível de qualidade dos lotes foi a análise discriminante.
Ressalta-se que esse procedimento não faz parte do padrão da ISTA para um
programa de validação de método, sendo uma proposta desta tese.
4.9 Análise discriminante
A técnica multivariada de análise discriminante, segundo Barroso &
Artes (2003) e Ferreira (2008), tem como principais objetivos:
• discriminação: consiste em encontrar funções das variáveis observadas
(funções discriminantes) que são responsáveis ou que possam mensurar
as diferenças entre as g populações;
4 Método robusto é aquele que suporta condições diferenciadas sem apresentar resultados descontroladamente errôneos, isto é, não há comprometimento da confiabilidade dos resultados.
42
• classificação ou alocação: consiste em determinar funções das variáveis
que permitam classificar novos objetos em uma das g populações.
Esta técnica consiste em determinar uma combinação linear entre duas
ou mais variáveis independentes que discriminarão melhor os grupos definidos a
priori. A discriminação é conseguida estabelecendo-se os pesos da combinação
linear que maximizam a variância entre grupos relativos à variância dentro dos
grupos. A combinação linear para a análise discriminante é também conhecida
como função discriminante (Hair et al., 2006).
Uma fase importante no procedimento da análise discriminante é a
verificação de violação de hipóteses, como normalidade e multicolinearidade,
dentre outras. A suposição de normalidade não é condição necessária para as
análises quando aplicado o método de Fisher para a determinação da função
discriminante. Entretanto, a suposição de igualdade das matrizes de variâncias e
covariâncias é requerida, ou seja, 1 ... gΣ = = Σ = Σ (Mingoti, 2005).
Uma vez que a função discriminante linear for calculada, uma
observação pode ser alocada para uma das g populações com base em seu “score
discriminante” e, como na amostra, a população de origem de cada observação é
conhecida, será possível identificar quais deles foram classificados corretamente
ou não. Assim, pode ser calculada a taxa estimada de erro (TEE), que é a fração
das observações incorretamente classificadas, sendo uma estimativa da taxa de
erro verdadeira.
De acordo com Ferreira (2008), uma boa regra de alocação deve levar a
uma baixa TEE, mas este valor pode estar sendo subestimado, pois a mesma
amostra é usada para determinar a função de classificação. Para contornar esse
problema, pode-se usar um procedimento de validação cruzada (cross-
validation), sugerido por Lachenbruch & Mickey (1968).
43
Portanto, no contexto do processo de validação, indiretamente, o uso da
análise discriminante auxilia na avaliação da robustez do método estudado
(Figura 13).
Após a aplicação de todas essas técnicas estatísticas, se o procedimento
fornece exatidão, robustez e precisão (reprodutibilidade, repetibilidade), o
método testado pode ser considerado como validado.
4.10 Comparação de métodos
No caso deste estudo, para finalizar o processo de validação proposto,
foi necessário definir também uma técnica estatística para comparar os dois
métodos testados (substratos areia e papel). Verificou-se que a utilização de
testes F poderia ser um procedimento adequado para tal fim.
Lupin & Schouenborg (2000) afirmam que podem ser realizados testes F
para comparar tanto a precisão dentro dos laboratórios como a precisão geral de
dois métodos, utilizando-se como base os índices de repetibilidade de cada
método e os de reprodutibilidade, respectivamente (Figura 14).
Salienta-se que esta subetapa da comparação não interfere diretamente
no processo de validação de cada método, já que os testes F vão avaliar apenas
se os índices de precisão de um método são diferentes do outro.
44
FIGURA 13 Esquema da 2ª etapa do programa de validação de métodos, com
ênfase na subetapa reavaliação do nível de qualidade dos lotes.
45
FIGURA 14 Esquema da 2ª etapa do programa de validação de métodos, com ênfase na subetapa comparação de métodos.
46
Como ressaltado na seção 3, um dos problemas de pesquisa foi propor o
uso de técnicas estatísticas complementares ao procedimento padrão da ISTA, o
que fica mais bem descrito observando-se o resumo apresentado no Quadro 2. QUADRO 2 Resumo do procedimento padrão da ISTA e as técnicas estatísticas
propostas complementares para o processo de validação de métodos deste trabalho.
Padrão ISTA Propostas complementares
- Teste de Hampel, Boxplot
- Análise de variância
- Valores de repetibilidade,
reprodutibilidade, estatísticas h e k de
Mandel
- Teste de Levene para média (em
substituição ao teste de Cochran)
- Limites críticos de repetibilidade e
reprodutibilidade
- Testes F para comparação dos métodos
- Análise discriminante
47
5 MATERIAL E MÉTODOS
Foram adquiridas sementes de sete lotes de nabo forrageiro, cultivar
CATI AL 1000, de diferentes safras e procedências, sendo coletados 40 kg de
cada lote.
As etapas de seleção e caracterização dos lotes e preparação do material
para distribuição aos laboratórios selecionados para processo de validação foram
realizadas no Laboratório de Análise de Sementes, no Departamento de
Agricultura da Universidade Federal de Lavras, em Lavras, MG.
5.1 Seleção de lotes de acordo com a homogeneidade – Teste H
Após a aquisição dos materiais, foram realizados testes de germinação
para a avaliação da homogeneidade do lote por meio do teste H.
Cada lote de 40 kg foi divido em 5 recipientes e de cada um deles foi
retirada 1 subamostra de 30 g, com o auxílio de um amostrador tipo duplo para
sementes. A coleta foi feita de acordo com as prescrições da RAS (Brasil, 1992).
Para a realização do teste de germinação, as subamostras foram
classificadas de acordo com o tamanho das sementes, utilizando-se uma peneira
de 8 mm.
A semeadura foi realizada em caixas acrílicas do tipo gerbox em
substrato papel mata-borrão umedecido com água destilada 2,5 vezes a sua
massa. Foram utilizadas 100 sementes de cada subamostra, divididas em duas
caixas de 50.
Em seguida, as caixas foram transferidas para uma câmara de
germinação tipo BOD (biological oxigen demand) regulada à temperatura
alternada 20º-30°C, e procedida à contagem de plântulas normais aos três e sete
dias. Com os resultados foi realizado, para cada lote, o teste H.
48
No teste H, a variável aleatória estudada foi a porcentagem de
germinação ( )Q , considerando como hipótese nula (H0) se o lote é homogêneo
e, como hipótese alternativa (H1) se o lote é heterogêneo.
Foi computada a estatística H (valor da heterogeneidade) para o j-ésimo
lote, utilizando-se a expressão (ISTA, 2007b):
- ,jj
j
VH f
W= (4)
em que
22
1 1
( 1)
ji
N N
jii i
j
N Q QV
N N= =
⎛ ⎞− ⎜ ⎟⎝ ⎠=−
∑ ∑ é o estimador da variância observada:, sendo
jiQ a porcentagem de germinação na i-ésima subamostra e N o número de
subamostras; ( ). .100j j
j
Q QW f
n−
= é o estimador da variância aceitável:, sendo
n o número de sementes de cada subamostra, . 1iN
j i
N==∑ o estimador da
média e f o fator para variação adicional. Para o teste de germinação,
f assume o valor constante 1,1.
Ressalta-se que ( )( 1)H f Nf
+ − , sob H0, segue uma distribuição qui-
quadrada, com 1N − graus de liberdade. Com os resultados do teste H, foram
selecionados, para as próximas etapas, apenas os lotes homogêneos.
A sumarização das fases e um exemplo teórico da organização dos
dados e dos cálculos auxiliares para o teste H podem ser observados na
Figura 15 e Tabela 2, respectivamente.
49
FIGURA 15 Resumo esquemático do teste H para a variável aleatória
porcentagem de germinação ( )Q no j-ésimo lote
- jj
j
VH f
W=
valor p ?α>
2( 1)
( )( 1) ~ NH f N
fχ −
+ −
jV jW
jQ
50
TABELA 2 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a realização do teste H utilizando os resultados de um teste de germinação no j-ésimo lote com 5 subamostras ( )N de 100 sementes cada ( )n
Lote Subamostra jiQ 2jiQ jQ jV jW
J
1 Qj1
… … 5 Qj5 ∑ ∑
* Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 208) 5.2 Caracterização dos lotes – Teste de germinação inicial
Após a realização do teste H, os lotes selecionados foram
homogenizados com o auxílio de um divisor mecânico do tipo solo com oito
canaletas (Brasil, 1992). Cada lote foi dividido em oito repetições de,
aproximadamente, 5 kg cada.
Para cada repetição do lote foi retirada uma amostra de,
aproximadamente, 100g para a realização do teste de germinação. As sementes
foram classificadas de acordo com o tamanho, utilizando-se uma peneira de 8
mm.
Nessa etapa foram testadas dois métodos, um utilizando, como substrato,
o papel e o outro, areia.
A areia passou por um processo de lavagem em água corrente,
esterilizada em autoclave por 2 horas e foi umedecida em 50% da sua
capacidade de retenção, conforme Brasil (1992).
O papel foi umedecido conforme já descrito no procedimento de
germinação do teste H, bem como o processo de semeadura em caixas acrílicas
do tipo gerbox; as condições da câmara de germinação e a contagem aos três e
51
sete dias de plântulas normais. As sementes dormentes, remanescentes ao final
do teste, foram submetidas ao teste de tetrazólio (Brasil, 1992).
Durante a contagem, as plântulas normais, as plântulas anormais, e as
sementes duras, mortas e dormentes foram descritas e fotografadas, para a
padronização dos resultados do teste de germinação.
O experimento, para cada método, foi instalado segundo um
delineamento inteiramente casualizado (DIC), apenas para a variável resposta
porcentagem de germinação, com 8 repetições de 50 sementes. Os dados foram
submetidos à análise de variância e o efeito dos lotes, quando significativo, teve
suas médias comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5% de significância
(Figura 16).
Silva et al. (1999) recomendam a utilização do teste de Scott-Knott para
os procedimentos de comparações múltiplas, devido ao fato de ele possuir
poder5 elevado, taxas de erro tipo I quase sempre de acordo com os níveis
nominais e por não apresentar resultados com ambiguidade
De acordo com os resultados deste teste de germinação inicial, os lotes
foram classificados em três níveis de qualidade: inferior, intermediária e
superior.
Neste trabalho, o lote foi considerado de qualidade inferior se a taxa de
germinação fosse menor que 60%, intermediária entre 60% e 70%, e superior
acima de 70%. Essas faixas foram escolhidas com base na porcentagem de
germinação mínima para comercialização, que é de 60% para Raphanus sativus
(Brasil, 2008).
5 O poder de um teste é a capacidade deste de identificar todas as reais diferenças entre os tratamentos (Ramalho et al., 2000), ou seja, a probabilidade de rejeitar a hipótese nula Ho, quando ela é falsa (1-β). (Mood et al., 1974)
52
FIGURA 16 Resumo esquemático do teste de germinação inicial da variável
aleatória porcentagem de germinação ( )Y
Y
53
5.3 Distribuição do material para os laboratórios
Nessa etapa foram coletadas, de cada lote, amostras com cerca de 4 kg,
utilizando-se um amostrador tipo duplo, classificadas de acordo com o tamanho
por meio de uma peneira de 8 mm, ficando reduzidas a 1,2 kg. As amostras
enviadas aos oito laboratórios foram resultantes da subdivisão desse total, ou
150g por laboratório.
Deve-se ressaltar que os laboratórios selecionados eram de prestação de
serviço ou de pesquisa, credenciados ou não pelo MAPA e com diferentes níveis
de experiência com o teste de germinação para nabo forrageiro.
As sementes foram acondicionadas em sacos de papel multifoliado e
caixas de papelão e enviadas aos laboratórios, juntamente com as instruções para
a realização e a avaliação do teste de germinação, além de um questionário para
avaliar a execução prática de cada um dos métodos (Anexo A). Os laboratórios
foram informados da data de envio das amostras, sendo solicitada a rápida
execução do teste de germinação para evitar a deterioração das sementes
(Figura 17).
54
FIGURA 17 Resumo esquemático da distribuição de material para os
laboratórios selecionados.
Cada método proposto foi realizado três vezes pelos laboratórios, que
foram denominado de ensaios 1, 2 e 3.
Todos os procedimentos descritos para os dois métodos propostos neste
trabalho foram estabelecidos com base nos estudos de Nery (2008).
5.4 Das técnicas estatísticas
Nesta seção serão descritas as técnicas estatísticas que foram utilizadas
para: identificar a presença de valores discrepantes e outliers nas variâncias;
avaliar os efeitos de laboratórios e lotes; verificar a repetibilidade, a
reprodutibilidade, a exatidão e a robustez; comparar os diferentes métodos de
germinação e reavaliar o nível de qualidade dos lotes (Figura 14, p. 45).
Exemplos numéricos para apresentar a aplicabilidade de algumas dessas
técnicas podem ser observados no Anexo B.
Ressalta-se que, para proceder as análises estatísticas, foram calculadas
as médias de cada ensaio (médias de 8 repetições) e estas passaram a ser
55
denominadas de repetições, ou seja, de cada lote nas análises foram consideradas
apenas as três repetições. A variável aleatória em estudo foi a porcentagem de
germinação ( )Y .
Cada etapa foi realizada separadamente para os substratos papel e areia,
com exceção do teste F (subseção 5.4.5), que foi utilizado justamente para
comparar os resultados dos dois métodos.
A estrutura padrão dos dados para esse processo de validação dos
métodos pode ser observada na Tabela 3. Exemplos de como esta estrutura foi
sendo modificada de acordo com as exigências de cálculo de cada técnica
estatística podem ser observados tantos nos exemplos teóricos que vão ser
apresentados a seguir, bem como por meio dos exemplos numéricos no Anexo
B.
56
TABELA 3 Estrutura padrão dos dados para o processo de validação de métodos
Lote ( )j Laboratório ( )l Repetição ( )k Germinação ( )jlkY
1
1 1 111Y
2 112Y
3 113Y
… … …
8 1 181Y
2 182Y
3 183Y … … … …
5
1 1 511Y
2 512Y
3 513Y
… … …
8 1 581Y
2 582Y
3 583Y
5.4.1 Identificação de valores discrepantes (outlier)
Para a detecção de valores discrepantes em todos os laboratórios do
j-ésimo lote, foram utilizadas dois tipos de técnicas, uma gráfica pelo esboço do
Boxplot (Tukey, 1977) e outra quantitativa, por meio de método de Hampel
(Hampel, 1985).
O método de Hampel para o j-ésimo lote consistiu em:
• computar a mediana ( ..jY ) e o desvio absoluto mediano
{ }..=medianaj jlk jMAD Y Y− , em que jlkY é a j-ésima porcentagem de
germinação observada na k-ésima repetição (ensaio) do l-ésimo
laboratório;
57
• utilizar a regra .. 5,2jlk j jY Y MAD− > para identificar se uma
determinada observação era um outlier.
Deve-se ressaltar que, apenas nos casos em que foi detectada a presença
de outliers por meio do método de Hampel, esses valores foram retirados das
amostras para as próximas fases do processo de validação.
O Boxplot foi utilizado tanto como uma técnica auxiliar ou
confirmatória do método de Hampel, como para permitir uma avaliação visual
do comportamento dos resultados (a descrição das medidas necessárias para sua
construção pode ser observado no Anexo C).
A sumarização das fases e um exemplo teórico da organização dos
dados e dos cálculos auxiliares para o método de Hampel podem ser observados
na Figura 18 e na Tabela 4, respectivamente.
58
FIGURA 18 Resumo esquemático do método de Hampel para a variável aleatória porcentagem de germinação ( )jY no j-ésimo lote
{ }..= medianaj jlk jMAD Y Y−
jY
.. 5, 2 ?jlk j jY Y MAD− <
59
TABELA 4 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a realização do método de Hampel utilizando os resultados de um teste de germinação no j-ésimo lote com p laboratórios e três repetições
Lote Lab. Rep. jlkY ..jlk jY Y−
J
1
1 11jY
2 12jY
3 13jY … … … …
p
1 1jpY
2 2jpY 3 3jpY
jY
jMAD 5,2 jMAD
* Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 210)
5.4.2 Identificação de outlier nas variâncias
Para avaliar a homogeneidade nas variâncias dos laboratórios, em cada
lote foi realizado o teste de Levene (utilizando à média), com as seguintes
hipóteses estabelecidas para o j-ésimo lote:
2 2 2
0 1 2
2 21
H : = =...=
H : , para pelo menos um par ( , ),jp
b m b m
σ σ σ
σ σ
⎧⎪⎨
≠⎪⎩
em que jp é o número de laboratórios no j-ésimo lote.
Foi computada a estatística jW para o j-ésimo lote, utilizando-se a
seguinte expressão (Levene, 1960):
Mediana Mediana
60
( )( )
2
. ..12
.1 1
( ),
( 1)
j
j jl
pj j jl jl jl
j p nj jlk jll k
N p n Z ZW
p Z Z=
= =
− −=
− −
∑∑ ∑ (5)
em que . ., sendo jlk jlk jl jlZ Y Y Y= − o estimador da média do l-ésimo laboratório
e jlkY a porcentagem de germinação da k-ésima repetição no l-ésimo laboratório;
jln é o número de repetições do l-ésimo laboratório e jN é o número total de
observações ( ).
1jp
j jllN n
==∑ .
A estatística jW , sob H0, segue uma distribuição F com ( )1jp − e
( )j jN p− graus de liberdade.
No caso em que era detectada a presença de outlier, o laboratório com
maior variância era retirado e o processo repetido, até que ficassem apenas os
laboratórios com variâncias homogêneas, de acordo com o teste Levene.
A sumarização das fases e um exemplo teórico da organização dos
dados e dos cálculos auxiliares para o teste de Levene podem ser observados na
Figura 19 e na Tabela 5, respectivamente.
61
FIGURA 19 Resumo esquemático do teste de Levene para a variável aleatória
porcentagem de germinação ( )jY no j-ésimo lote.
jY
( )( )
2
. ..12
.1 1
( )
( 1)
j
j lj
pj j lj lj jl
j p nj klj ljl k
N p n Z ZW
p Z Z=
= =
− −=
− −
∑∑ ∑
valor p ?α>
62
TABELA 5 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a identificação de outliers pelo teste de Levene utilizando os resultados de um teste de germinação no j-ésimo lote com p laboratórios e três repetições
Lote Lab Rep jlkY .jlk jlk jlZ Y Y= − ( )2
.jlk jlZ Z− ( )2
. ..jl jZ Z−
j
1
1 11jY
2 12jY
3 13jY
1jY 1.jZ ∑ ∑
…
1 1jpY
2 2jpY
3 3jpY
jpY .jpZ ∑ ∑
..jZ ∑ ∑ * Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 211) 5.4.3 Análise de variância
Para avaliar os efeitos dos laboratórios e lotes, foi aplicada a teoria da
análise de variância num delineamento inteiramente casualizado em esquema
fatorial com oito repetições, entretanto considerou-se a interação desprezível,
ficando seu efeito confundido nos resíduos. Foi proposto então o seguinte
modelo estatístico:
,jlk j l jlkY μ β γ ε= + + + (6)
em que: jlkY é a porcentagem de germinação da k-ésima repetição, no l-ésimo
laboratório e j-ésimo lote ( )1,.., , 1,2,..., e 1,2,...,r jk n l p j n∀ = = = ; μ é a media
geral; jβ é o efeito do j-ésimo lote; lγ é o efeito do l-ésimo laboratório ; jlkε é
o erro experimental da k-ésima repetição, no l-ésimo laboratório e j-ésimo lote
63
( )( )2~ 0,klj NIDε σ 6; nj = número de lotes; rn = número de repetições;
p = número de laboratórios.
5.4.4 Avaliação da repetibilidade, reprodutibilidade e estatísticas h e k de
Mandel
a) Repetibilidade
A variância de repetibilidade representa uma medida da variabilidade
dentro dos laboratórios. Para o j-ésimo lote, o seu estimador foi obtido por meio
da expressão (ISO 5725-2, 1994):
( )
( )
2
2 1
1
1,
1
j
j
p
jl jll
rj p
jll
n SS
n
=
=
−=
−
∑
∑ (7)
em que jln é o número de repetições do l-ésimo laboratório; jp é o número de
laboratórios e 2jlS é o estimador da variância do l-ésimo laboratório.
O limite crítico jr de repetibilidade para cada lote foi estimado por
j rj jr S D= , em que jD foi obtido da tabela de Tukey, com graus de liberdade
tendendo para o infinito (Banzatto & Konkra, 2006), podendo também ser
calculado pela expressão .j jD z n= γ , em que zγ é o quantil 100 %γ da
distribuição normal padronizada e .jn é o número médio das repetições dos
laboratórios no j-ésimo lote.
6 A sigla NID significa normal e independentemente distribuído.
64
Esse valor de jr foi comparado com a amplitude entre as repetições de
cada laboratório, em cada lote ( )jlLr ., avaliando-se, então, quais laboratórios
tiveram repetibilidade aceitável.
Um exemplo teórico da organização dos dados e dos cálculos auxiliares
para a avaliação da repetibilidade pode ser observada na Tabela 6. TABELA 6 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares
para a avaliação da repetibilidade nos resultados de um teste de germinação no j-ésimo lote com p laboratórios e três repetições
Lote Lab Rep jlkY jln 2
ljs .jlLr . 2rjs jD jr
j
1
1 11jY
1jn 21js Lrj1.
2 12jY
3 13jY
1jY … … … … … …
p
1 1jpY
jpn 2jps Lrjp. 2 2jpY
3 3jpY
jpY .jn * Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 212)
b) Reprodutibilidade
A variância de reprodutibilidade representa uma medida da variabilidade
entre e dentro dos laboratórios. Para o j-ésimo lote, o seu estimador pôde ser
obtido por meio da expressão 8 (ISO 5725-2, 1994).
2 2 2 ,Rj rj LjS S S= + (8)
65
em que 2 2
2
.
dj rjLj
j
S SS
n−
= é o estimador da variância entre laboratórios;
( )22. ..
1
1( 1)
jp
dj jl jl jlj
S n Y Yp =
= −− ∑ ; sendo ..jY o estimador da média geral de todas
as observações e .jlY o estimador da média do l-ésimo laboratório;
2
1.
1
1
1( 1)
j
j
j
p
p jll
j jl plj
jll
nn n
pn
=
=
=
⎛ ⎞⎜ ⎟⎜ ⎟= −⎜ ⎟−⎜ ⎟⎝ ⎠
∑∑
∑.
O limite crítico jR de reprodutibilidade para cada lote foi estimado por
j Rj jR S D= , sendo adotado o mesmo procedimento descrito anteriormente para a
repetibilidade, com a diferença apenas de que a amplitude foi calculada entre os
laboratórios para cada repetição jkLR , determinando, assim, quais lotes tiveram
reprodutibilidade aceitável.
A sumarização das fases para a avaliação da repetibilidade e
reprodutibilidade pode ser observada na Figura 20, e um exemplo teórico da
organização dos dados e dos cálculos auxiliares para a avaliação da
reprodutibilidade pode ser observada na Tabela 7.
66
FIGURA 20 Resumo esquemático de avaliação da repetibilidade e da reprodutibilidade para o j-ésimo lote.
. ?jl jLr r<
j rj jr S D= j Rj jR S D=
. ?j k jLR R<
67
TABELA 7 Apresentação teórica dos cálculos auxiliares para a avaliação da reprodutibilidade nos resultados de um teste de germinação no j-ésimo lote com p laboratórios e três repetições
Lote Rep. Lab. jlkY LRj.k
2djs 2
jLs 2jRs Dj Rj
j
1 1 11jY
LRj.1
… p 1jpY
2 1 12jY
LRj.2 … p 2jpY
3 1 13jY
LRj.3 … p 3jpY
* Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 213)
c) Estatística k de Mandel ( ljk ) e o valor crítico (kc)
Uma das medidas utilizadas para auxiliar na avaliação da precisão dos
resultados foi a estatística k de Mandel que, após determinada, foi comparada ao
valor crítico (kc), determinados para o j-ésimo lote por (ISO 5725-2, 1994):
,j
j ljl
r
Sk
S= (9)
1 2
1 2
( , , )
( , , )
,( 1)
lc
l
n Fk
F nα η η
α η η
=+ −
(10)
em que 1 2( , , )F α η η é o quantil ( )100 1 %α− da distribuição F com 1 ( 1)rnη = − e
2 ( 1)( 1)rp nη = − − graus de liberdade, sendo rn o número de repetições e p o
número de laboratórios.
68
d) Estatística h de Mandel ( ljh ) e do valor crítico (hc)
A medida utilizada para avaliar graficamente a estimativa do viés dos
resultados foi a estatística h de Mandel para o j-ésimo lote que foi obtida, bem
como o valor crítico (hc), por (ISO 5725-2, 1994):
( )
( )( )
. ..
2
. ..1
.
,
1
j
jl jjl p
jl jl
j j
Y Yh
Y Y
p n=
−=
−
−
∑ (11)
( )( , )
2( , )
( 1),
2c
p th
p t pα η
α η
−=
+ − (12)
em que ( , )t α η é o quantil ( )100 1 %α− da distribuição t de Student, com graus de
liberdade η = (p – 2).
Após os cálculos, foram esboçados os gráficos dos valores de h e k para
cada lote e laboratório, como no exemplo da Figura 10 (subseção 4.8), e
comparados com os valores críticos para os níveis de significância de 1% e 5%.
Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a
determinação dos valores de h e k podem ser observados na Tabela 8.
69
TABELA 8 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a determinação das estatísticas h e k de Mandel nos resultados de um teste de germinação no j-ésimo lote com p laboratórios e três repetições
Lote Lab Rep kljy jls rjs kjl ..jy hjl
j
1
1 11jY
1js
kj1
hj1 2 12jY
3 13jY
1.jy … … … … … …
p
1 jps kjp hjp 2
3 .jpy
* Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 214)
5.4.5 Comparação dos métodos
a) Comparação da precisão dos métodos dentro dos laboratórios
Foi calculada uma estatística rjF para cada lote (1,2..., )jj n= e feita a
comparação com dois limites tabelados inf sup e rj rjF F , utilizando-se as
estimativas das variâncias da repetibilidade, considerando os dois substratos,
areia e papel (Lupin & Schouenborg, 2000): 2
12
2
,rjrj
rj
SF
S= (13)
1 2 1 2inf {(1 2), , } sup { 2, , }e ,j j j jrj rjF F F Fα η η α η η−= =
em que 1 2( , , )Fα η η é o quantil ( )100 1 %α− da distribuição F com
1 1 1( 1)j j rjp nη = − e 2 2 2( 1)j j rjp nη = − graus de liberdade, sendo 1rjn o número
70
de repetições do método 1 no j-ésimo lote, 1jp o número de laboratórios do
método 1 no j-ésimo lote, a designação para o método 2 é equivalente.
Sendo as linhas de decisão como seguem:
• se inf sup rj rj rjF F F≤ ≤ , não há evidências de que os métodos tenham
precisões diferentes dentro de cada laboratório;
• Se inf <rj rjF F , há evidências de que o método 1 tenha precisão superior
ao método 2 dentro de cada laboratório;
• Se sup >rj rjF F , há evidências de que o método 1 tenha precisão inferior
ao método 2, dentro de cada laboratório;
b) Comparação da precisão geral dos métodos
Foi calculada uma estatística RjF para cada lote (j = 1,...,nj) e feita a
comparação com os valores críticos, inferior e superior, similares aos
apresentados no item a, bem como as linhas de decisão. A única diferença é que
a interpretação foi feita para a precisão geral, sendo, então, utilizadas as
estimativas das variâncias de reprodutibilidade e repetibilidade dos substratos
areia e papel (Lupin & Schouenborg, 2000):
2 2 2 21 1 2 2
1 2
1 11 1 ,Rj Rj rj Rj rjkj kj
F S S S Sn n
⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − − − −⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎝ ⎠ ⎝ ⎠
(14)
1 2 1 2inf {(1 2), , } sup { 2, , }e ,j j j jRj RjF F F Fα η η α η η−= =
em que 1 2( , , )Fα η η é o quantil ( )100 1 %α− da distribuição F, com
1 1 2 2( 1) e ( 1)j j j jp pη η= − = − graus de liberdade.
A sumarização das fases de execução para a comparação de métodos
pode ser observada na Figura 21.
71
FIGURA 21 Resumo esquemático da comparação entre métodos para o j-ésimo lote
5.4.6 Análise discriminante
Como foram selecionados lotes com níveis de qualidade diferentes,
utilizou-se a técnica de análise discriminante para averiguar, com base nos
resultados obtidos pelos laboratórios, a adequação da classificação feita a priori.
Assim, foram formados três grupos, correspondentes aos lotes de qualidade
inferior, intermediária e superior.
2 2 2 21 1 2 2
1 2
1 11 1Rj Rj rj Rj rjkj kj
F S S S Sn n
⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − − − −⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎝ ⎠ ⎝ ⎠
21
22
rjrj
rj
SF
S=
inf sup ?rj rj rjF F F≤ ≤ inf sup ?Rj Rj RjF F F≤ ≤
72
A aplicação do método de Fisher7 foi dividida em quatro etapas,
considerando:
• três grupos, denotados por τ1 (lote inferior), τ2 (lotes intermediários) e τ3
(lote superior),
• o vetor da m-ésima observação (porcentagem de germinação) no i-ésimo
grupo8 representado por imX e composto das medidas das r-variáveis
(repetições), logo [ ]1Tim im imrX X= …X (Figura 1.22);
Grupo Amostras
1 … r
1 111X … 11rX
1 121X … 12rX … … … …
FIGURA 22 Exemplo teórico da representação de um vetor de observação gerado a partir de um banco de dados (um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B, p. 214)
7 Os passos e a simbologia (em negrito, para representar uma matriz ou um vetor) utilizados estão de acordo com Barroso & Artes (2003), com algumas adaptações para o contexto deste estudo. 8 Não há correspondência direta entre a variável Y (utilizada nas etapas anteriores) e a variável X, no que tange à indicação do lote e/ou do laboratório. Ou seja, o valor, por exemplo, da observação y111, não é igual ao da observação x111, já que a primeira representa a porcentagem de germinação do lote 1, laboratório 1 e repetição 1 e a segunda representa a porcentagem de germinação do grupo 1, laboratório 1 e repetição 1. Por este motivo, elas foram indexadas com letras diferentes.
Ex: Vetor da observação 1 do grupo 1
[ ]11 111 11T
rX X= …X
73
• cada grupo foi composto de ni observações r-variadas: 111 12 1, ,..., nX X X
amostradas da população τ1, 221 22 2, ,..., nX X X da população τ2 e
331 32 3, ,..., nX X X da população τ3;
• estimadores dos vetores de médias (μi) denotadas por 1 2 3, ,X X X
• estimadores das matrizes de variâncias e covariâncias ( )iΣ do vetor X
para os três grupos, representados por 1 2 3, ,S S S .
1ª etapa: avaliação da suposição de igualdade das matrizes de covariância
Para avaliar a suposição que 1 2 3S =S =S , foi utilizado o teste de Box M9,
sendo iS calculado como segue:
( )( )1
1 ,1
inT
i im i im imin =
= − −− ∑S X X X X (15)
em que 1
1 in
i immin =
= ∑X X é o estimador do vetor de médias do i-ésimo grupo.
2ª etapa: determinação das funções discriminantes lineares de Fisher
As s funções discriminantes lineares de Fisher são determinadas por
meio de combinações lineares das variáveis em estudo e representadas por T
u uT = l X , em que u= 1, 2,...,s’,..., s, sendo ( )min , 1s r g= − , isto é, existem s
soluções não-nulas de combinações lineares igual ao mínimo entre o número de
r variáveis e o número de grupos (g) menos 1 (Ferreira, 2008).
A ideia inicial de Fisher (1938), para obter uma função discriminante T,
foi estabelecer combinações lineares que maximizassem uma razão em que o
numerador era a soma das distâncias ao quadrado entre as médias de T de cada
9 Para maiores detalhes veja Anexo D.
74
grupo e a média global de T e o denominador, a variância de T. Ou seja, a razão
entre a variabilidade entre grupos e a variabilidade comum dentro de grupos,
representada por:
( )2
1 02
ˆ,
in
TiT Ti
TT p
X X
S=
−=
∑ l B ll S l
(16)
em que: TiT iX = l X é o estimador da média de T para o i-ésimo grupo;
TTX = l X é o estimador da média geral de T, sendo
1
1X Xg
iig =
= ∑ ;
2TS = lTSp l é o estimador da variância de T; ( )
1
1
1 1g
p igi
ii
nn g =
=
⎛ ⎞⎜ ⎟⎜ ⎟= −⎜ ⎟−⎜ ⎟⎝ ⎠
∑∑
iS S é
o estimador de ∑, ou seja, a matriz de variâncias e covariâncias combinada
e 0B̂ é o estimador da soma de produtos cruzados: ( )( )01
B̂ X X X Xin
T
i ii=
= − −∑ .
Logo, o problema em questão consistia em obter o vetor l que
maximizasse a expressão (1.16), o que equivale à maximização de uma razão
entre formas quadráticas (Ferreira, 2008 e Barros & Artes, 2003). Dessa forma,
os vetores ul foram obtidos dos autovetores do sistema de equações
homogêneas:
( )0ˆ
u p uλ− =B S l 0 (17)
75
Para solucionar este sistema, adotou-se a transformação linear
não-singular do vetor ul , dada por 1/2u p u
−=l S e e pré-multiplicando-se o sistema
por 1/2S p− , obtendo-se:
( )1/2 1/20
ˆp p u uλ− − − =S B S I e 0 (18)
em que uλ e ue são os autovalores e autovetores da matriz10 1/2 1/20
ˆS B Sp p− −
Calculados os autovetores, determinou-se o vetor de combinação linear,
retomando-se a expressão 1/2u p u
−=l S e .
Assim, os coeficientes da primeira função discriminante ( )1l são os
elementos do autovetor padronizado de 10
ˆS Bp− , associado ao maior autovalor
dessa matriz.
Para determinar a segunda função discriminante, deve se buscar o vetor l
que maximiza a referida razão sujeita à restrição 1 2Cov( , ) 0=T Tl X l X , que é o
autovetor padronizado associado ao segundo maior autovalor de 10
ˆS Bp− .
Generalizando, a s’-ésima função discriminante é 'Tsl X , em que 'sl é o
correspondente s’-ésimo autovetor padronizado, sujeito à condição
', ) 0T Tb sCov =(l X l X , b < s’.
3ª etapa: regra linear de classificação
Considerou-se T o vetor de dimensões s x 1, cujos elementos foram as s
funções discriminantes e iiTX o correspondente vetor de estimadores das médias
10 As matrizes 1
0ˆS Bp
− e 1/2 1/20
ˆS B Sp p− − têm os mesmos autovalores e os autovetores de
10
ˆS Bp− são iguais a 1/2S p
− vezes os autovalores de 1/ 2 1/20
ˆS B Sp p− − (Barroso & Artes, 2003).
76
no i-ésimo grupo. A regra de classificação consistiu em alocar X no grupo kτ , se
a distância ao quadrado entre Tk e kkTX fosse menor que a mesma distância entre
Ti e iiTX , para todo i≠k, ou seja, alocar X em kτ se:
( ) ( ) ( )2 22
1 1 1,
u
s s sT T
u kT u k u iu u u
T= = =
⎡ ⎤ ⎡ ⎤− = − ≤ −⎣ ⎦ ⎣ ⎦∑ ∑ ∑X l X X l X X (19)
Para todo i≠k, em que ul é o u-ésimo autovetor padronizado de 10
ˆp−S B .
4ª etapa: avaliação da função de classificação
Para avaliar a função de classificação, foi utilizado o procedimento de
validação cruzada ou método Pseudo-Jackknife (Lachenbruch & Mickey, 1968),
para o cálculo da taxa de erro estimada (TEE).
De acordo com Ferreira (2008), a idéia deste método é omitir uma
observação por vez das 1
gii
n=∑ originais na amostra de treinamento e estimar as
regras de classificação utilizando-se as 1
1gii
n=
−∑ observações remanescentes.
A observação omitida é classificada em um dos grupos. Como se sabe qual o
grupo foi originalmente amostrado, pode-se determinar, para cada grupo,
quantas observações foram classificadas corretamente. Monta-se, então, a
denominada “matriz de confusão” (Tabela 9) e calcula-se a TEE a partir da
mesma:
TABELA 9 Exemplo de uma matriz de confusão para três grupos
grupo verdadeiro classificado Total τ1 τ2 τ3
τ1 τ2 τ3
n11 n12 n13 n1 n21 n22 n23 n2 n31 n32 n33 n3
Total 1̂n 2n̂ 3n̂ N
77
A TEE geral foi calculada, então, da seguinte forma
1 ,
g
iii
n nTEE
n=
−=
∑ (20)
em que nij = número de observações de ig classificados em jτ ; ˆin = número de
observações classificadas em iτ ; ni = número de observações em iτ e
n = número total de observações na amostra.
Essa taxa de erro geral abrange todos os tipos de erros de classificação
que podem ocorrer, mas foi possível estimar também a taxa de erro de qualquer
um dos grupos. Por exemplo, para calcular a TEE de se classificar uma
observação do grupo iτ no grupo jτ , utilizou-se a seguinte expressão:
( | ) ,ij
i
nTEE j i
n= (21)
Além disso, foi calculada a TEE de se classificar uma observação da
grupo iτ incorretamente, dada por:
( ) ,i ii
i
n nTEE in−
= (22)
A sumarização das fases de execução para a utilização da técnica de
análise discriminante pode ser observada na Figura 23.
Um exemplo numérico de todos os passos apresentados para esta técnica
pode ser observado no Anexo B.
78
FIGURA 23 Resumo esquemático da técnica de análise discriminante no contexto de um processo de validação de método
( | )= ij
i
nTEE j i
n
1
g
iii
n nTEE
n=
−=
∑
( ) −= i ii
i
n nTEE in
[ ]1 2 3Tim im im imX X X=X
1 2 3S S S= =
Tu uY = l X
( ) ( )2 2
1 1
?
s sT Tu k u i
u u= =
⎡ ⎤ ⎡ ⎤− ≤ −⎣ ⎦ ⎣ ⎦∑ ∑l X X l X X
79
5.5 Rotinas no R
Para todas as análises estatísticas foram desenvolvidas funções
específicas no software R (R Development Core Team, 2008), no intuito de
facilitar a manipulação e a interpretação dos resultados não apenas para
estatísticos, mas para pesquisadores da área de sementes.
As funções foram estruturadas de tal forma que o usuário deve entrar
apenas com um banco de dados inicial e, por exemplo, se for detectado um valor
discrepante pelo método de Hampel, o mesmo era retirado e um segundo banco
gerado automaticamente para a execução do teste de Levene. Novamente, se
algum laboratório for considerado como um outlier, um terceiro banco era
gerado para as etapas seguintes.
Para a comparação dos métodos, são necessários os valores dos desvios
padrões de reprodutibilidade e repetibilidade, bem como o número de
laboratórios e um número de repetições por lote. É gerado também,
automaticamente, um banco de dados após a execução dessa etapa
correspondente.
Os nomes e os argumentos necessários para cada função podem ser
observados na Tabela 10.
80
TABELA 10 Nome da função e argumentos necessários, de acordo com a
técnica estatística
Técnica Nome da função Argumentos
Teste H FunçãoTesteH
- nome do banco de dados. - nº de amostras simples; - nº de sementes por amostra; - fator de correção (f) - nível de significância.
Método de Hampel e Boxplot FunçãoHampelBXP - nome do banco de dados.
Teste de Levene FunçãoLevene
- nome do banco de dados (pré-estabelecido¹); - nível de significância; - número de vezes que o procedimento deve ser repetido.
Análise de variância FunçãoANAVA - nome do banco de dados (pré-estabelecido).
Repetibilidade, Reprodutibilidade Valores de h e k
FunçãoRRhk - nome do banco de dados (pré-estabelecido); - grau de confiança.
Comparação dos métodos FunçãoCompmetod - nome do banco de dados (pré-estabelecido); - nível de significância.
Análise discriminante Funçãodiscrim - nome do banco de dados; - probabilidades a priori.
¹ O banco de dados era gerado na etapa anterior, com um nome já pré-estabelecido.
Exemplos de alguns relatórios gerados, tipo de banco de dados e os
comandos para execução da FunçãoTesteH podem ser observados no Anexo E.
81
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesta seção são apresentados tanto os resultados obtidos nos
procedimentos iniciais no Laboratório de Análise de Sementes (LAS) da UFLA
(1ª etapa), como na aplicação do processo de validação nos oitos laboratórios
selecionados (2ª etapa).
6.1 Seleção de lotes de acordo com a homogeneidade - Teste H
De acordo com os resultados do teste H, cinco dos sete lotes avaliados
não apresentaram evidências estatísticas para rejeitar a hipótese de
homogeneidade do lote, a 1% de significância (Tabela 11 e Figura 24).
Estes cinco lotes foram selecionados atendendo ao critério de
homogeneidade dos lotes, que é um dos princípios básicos da amostragem para
análise de sementes (Copeland & Liu, 2005).
TABELA 11 Resultados do teste H (H calculado e valor p) para os sete lotes de
sementes de nabo forrageiro
Lote H calculado valor p 1 -0,30 0,5731 2 5,58 < 0,0001 3 -0,83 0,9125 4 0,52 0,2074 5 2,29 0,0151 6 3,21 0,0035 7 1,63 0,0417
82
FIGURA 24 Resumo esquemático dos resultados do teste H, a 1% de significância
Para etapas posteriores, somente os lotes considerados homogêneos 1, 3,
4, 5 e 7 foram utilizados e renumerados de 1 a 5, mantendo-se a mesma ordem.
6.2 Caracterização dos lotes - Teste de germinação inicial
Os resultados obtidos no teste de germinação indicam haver diferenças
estatisticamente significativas entre os efeitos dos lotes, tanto na utilização do
substrato areia como papel, sendo aplicado o teste de Scott-Knott, a 5%
significância. Esses lotes foram classificados, quanto ao nível de porcentagem de
germinação, de acordo a qualidade fisiológica, em grupos: inferior, intermediária
e superior (Tabela 12 e Figura 25).
83
TABELA 12 Resultados médios11 (%) obtidos no teste de germinação inicial com sementes de cinco lotes de nabo forrageiro para os métodos areia e papel
Lote ¹Médias Areia Papel
1 76 a 75 a 2 55 c 44 c 3 76 a 70 a 4 66 b 57 b 5 67 b 67 a
¹ Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott, a 5% de significância.
FIGURA 25 Resumo esquemático do resultado do teste de Scott-Knott, a 5% de significância
11 No cálculo das médias apresentadas neste estudo foi utilizado o critério de arredondamento estabelecido nas Regras Internacionais para Análise de Sementes (ISTA, 2007b). Deve-se ressaltar que essa aproximação, para a Estatística, é desnecessária e desaconselhável, por provocar mudanças, algumas vezes significativas num resultado de um teste.
84
Apesar de a média do lote 5, para o métodos papel, ter sido considerada
estatisticamente igual à dos lotes 1 e 3, o mesmo foi classificado como nível
intermediário, em razão do resultado obtido na areia e por apresentar valor
médio de germinação entre 60% a 70%, próximo ao valor mínimo para
comercialização de sementes da espécie Raphanus sativus, que é de 60% (Brasil,
2008).
A utilização de lotes com níveis de qualidades diferentes no processo de
validação de métodos é necessária porque o método ideal deve ser robusto para
suportar condições adversas de aplicação e também,ser preciso e exato (Waeny,
1980).
Ressalta-se que foram realizados mais dois testes de germinação com
objetivo de confirmar as classificação dos lotes encontrados nesse teste, mas
seus resultados não estão sendo apresentados nesse trabalho.
6.3 Teste de germinação nos laboratórios selecionados
Observa-se, pelo resultado geral dos oito laboratórios, que, para todos os
lotes no substrato areia, a média de germinação foi maior e o coeficiente de
variação foi menor em relação ao papel (Tabela 13). Resultados similares, sob as
mesmas condições de teste, foram encontrados por Nery et al. (2007) e Nery
(2008).
85
TABELA 13 Resultados médios (%) e coeficientes de variação (%) obtidos no teste de germinação com sementes de cinco lotes de nabo forrageiro para os métodos areia e papel
Substrato Lab. Lote1 Lote 2 Lote 3 Lote 4 Lote 5
y CV y CV y CV y CV y CV
Areia
1 89 4,90 55 8,33 87 6,54 64 0,91 80 3,31 2 94 4,87 62 6,52 95 1,61 78 5,18 87 2,90 3 98 0,59 64 6,31 96 0,00 85 1,18 92 0,00 4 94 2,81 62 7,95 94 3,07 71 16,32 85 4,25 5 92 2,51 68 5,94 95 1,05 72 9,11 86 4,08 6 92 4,52 63 11,14 91 6,25 66 18,08 79 5,80 7 91 6,34 61 8,67 93 3,11 69 8,25 85 0,68 8 93 5,69 63 16,06 91 12,38 79 14,38 85 13,94
Geral 93 4,51 62 9,60 93 5,45 73 12,90 86 6,31
Papel
1 88 4,55 53 17,02 89 2,83 59 11,29 83 5,52 2 91 4,96 56 8,80 94 1,06 61 14,13 85 3,78 3 98 0,59 68 3,06 93 0,62 83 3,69 94 2,13 4 94 4,87 61 11,16 94 1,06 65 19,66 85 9,51 5 95 2,19 66 10,61 96 1,59 81 7,44 93 4,06 6 92 3,49 61 4,34 84 9,55 68 13,26 77 8,45 7 76 8,36 40 29,63 74 14,04 45 37,47 60 20,88 8 95 1,05 64 8,27 95 1,61 77 8,52 88 0,66
Geral 91 7,78 59 17,54 90 9,19 68 21,49 83 13,95
Nos casos de espécies com nível de domesticação inferior, ou com altos
índices de infestação com microorganismos, segundo Ashton (2005),
recomenda-se a utilização do substrato areia, uma vez que este material
possibilita maior taxa e velocidade de germinação. A maior velocidade de
germinação pode ser explicada por autores, tais como Lopes et al. (2005),
Pacheco et al. (2006) e Nery (2008), como sendo consequência da maior área de
contato da semente com a areia, o que propicia maior velocidade na absorção de
água. Da mesma forma, as menores médias de germinação obtidas no substrato
papel parecem estar associadas, segundo Andrade et al. (2006), a uma menor
capacidade de retenção de água deste material ou a proximidade das plântulas no
substrato, o que pode facilitar a contaminação por microrganismos.
86
Para os dois métodos avaliados, o lote 2, de modo geral, apresentou
menores médias de germinação em relação aos demais lotes, o que corrobora
com a classificação estabelecida no teste de germinação inicial, como sendo este
de qualidade inferior.
Em relação ao coeficiente de variação, de maneira geral, observam-se
maiores valores para os lotes 2, 4 e 5, que foram considerados em estados mais
avançados de deterioração. Resultados semelhantes foram encontrados por
Illipront Junior (1997), trabalhando com sementes de soja, que concluiu existir
maior variação individual de sementes em lotes com estados progressivos de
deterioração em relação aos deteriorados ou aqueles de qualidade superior.
Este resultado era esperado também do ponto de vista estatístico, pois a
variância da proporção é função quadrática da própria proporção ( )p , como
pode ser observado pela curva apresentada na Figura 26.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
p
Var(p)
0,5
FIGURA 26 Curva da variância, em função da proporção
87
Pode-se observar que, quanto mais próximo de 0,5 (50%), maior a
variância e, consequentemente, maior o coeficiente de variação.
Essas considerações acerca dos resultados podem ser verificadas
também por meio de uma inspeção visual ao Boxplot (Figura 27). Observa-se a
menor variação de resultados para os lotes 1 e 3, de qualidade superior.
Vale salientar que as taxas de germinação encontrados nessa etapa pelos
oito laboratórios foram superiores às determinadas na etapa de caracterização
dos lotes (Tabela 12). A baixa germinação na etapa anterior foi atribuída a uma
alta incidência de microrganismos, comprovada por uma elevada porcentagem
de plantas anormais infectadas nos lotes recém-colhidos. Após um período de
armazenamento, observou-se redução dessa infestação, o que propiciou, por
conseguinte, elevação nas taxas de germinação nesta fase do processo.
88
Areia.1 Papel.1 Areia.2 Papel.2 Areia.3 Papel.3 Areia.4 Papel.4 Areia.5 Papel.5
2040
6080
100
Metodologia vs Lote
Ger
min
ação
(%)
Lote1 Lote2 Lote3 Lote4 Lote5
(a)
1.Areia 2.Areia 3.Areia 4.Areia 5.Areia 1.Papel 2.Papel 3.Papel 4.Papel 5.Papel
2040
6080
100
Lote vs Metodologia
Ger
min
ação
(%)
Areia Papel
(b)
FIGURA 27 Boxplot de acordo com o método para cada lote (a) e lote para cada método (b), com as médias representadas pelo símbolo (•)
89
6.4 Identificação de valores discrepantes (outliers)
Para o método areia, foi identificado, pelo método de Hampel,
quantidade menor de outliers em relação ao papel, três e sete, respectivamente
(Tabela 14).
TABELA 14 Identificação de valores discrepantes nos resultados do teste de germinação em sementes de nabo forrageiro, pelo método de Hampel e do Boxplot para os métodos areia e papel
Substrato Método de Hampel Boxplot Lote Lab Rep. Germ. Lote Lab. Rep. Germ.
Areia
3 1 2 81 3 1 2 81 3 6 3 85 3 8 3 78 3 8 3 78 5 6 3 74 5 8 3 71
Papel
1 7 1 69 1 7 1 69 2 7 1 26 2 7 1 26 3 6 1 76 3 6 1 76 3 7 1 62 3 7 1 62 3 7 2 80 5 7 1 47 3 7 3 80 5 7 3 61 5 7 1 47
Para o substrato areia dos três outliers identificados pelo método de
Hampel, apenas dois foram detectados também pelo Boxplot. Já para o papel dos
sete lotes detectados pelo Hampel, cinco são concordantes com o Boxplot. Esses
resultados reforçam as diferenças entre as duas técnicas apresentadas na
subseção 4.6.
Observa-se, ainda com base nos resultados, a eliminação de todas as
repetições do laboratório 7 no lote 3 para o substrato papel. De forma geral, este
laboratório, principalmente para o substrato papel, obteve resultados bem
diferenciados dos demais (Figura 28), tendo sido, inclusive, identificadas
90
algumas plântulas com danos de umidade, provocados, possivelmente, por
condições inadequadas na realização do teste de germinação.
1.1 3.1 5.1 2.2 4.2 1.3 3.3 5.3 2.4 4.4 1.5 3.5 5.5 2.6 4.6 1.7 3.7 5.7 2.8 4.8
2040
6080
100
Lote vs Laboratório - Areia
Ger
min
ação
(%)
Lab1 Lab2 Lab3 Lab4 Lab5 Lab6 Lab7 Lab8
(a)
1.1 3.1 5.1 2.2 4.2 1.3 3.3 5.3 2.4 4.4 1.5 3.5 5.5 2.6 4.6 1.7 3.7 5.7 2.8 4.8
2040
6080
100
Lote vs Laboratório - Papel
Ger
min
ação
(%)
Lab1 Lab2 Lab3 Lab4 Lab5 Lab6 Lab7 Lab8
(b)
FIGURA 28 Boxplot de acordo com o laboratório para os substratos areia (a) e papel (b), com as médias representadas pelo símbolo (•)
91
6.5 Identificação de outlier nas variâncias
Para o método areia, foram identificados, pelo teste de Levene, outliers
nos lotes 3, 4 e 5 e, para o papel, apenas no lote 3 (Tabela 15).
TABELA 15 Resultados do teste de Levene, a 1% de significância, para cada combinação de lote e substrato
Substrato Lote valor p Condição Indicação
Areia
1 0,0915 Variâncias homogêneas Continuar a análise 2 0,2698 Variâncias homogêneas Continuar a análise 3 0,0099 Variâncias heterogêneas Repetir o teste 4 0,0067 Variâncias heterogêneas Repetir o teste 5 0,0009 Variâncias heterogêneas Repetir o teste
Papel
1 0,1419 Variâncias homogêneas Continuar a análise 2 0,1602 Variâncias homogêneas Continuar a análise 3 0,0073 Variâncias heterogêneas Repetir o teste 4 0,1268 Variâncias homogêneas Continuar a análise 5 0,0399 Variâncias homogêneas Continuar a análise
A princípio, esses resultados parecem ser contraditórios ou incoerentes
com toda a discussão feita anteriormente, de que houve uma menor variação nos
resultados para o substrato areia, já que foram identificados três lotes com
variâncias heterogêneas para este método e apenas um lote para o papel. De fato,
o que acontece é que comparações dessa natureza (entre medidas descritivas e
um teste estatístico) não procedem, uma vez que medidas como coeficiente de
variação e desvio padrão são meramente descritivas e mostram apenas
tendências de comportamento. Além disso, seus valores são calculados
assumindo a hipótese de não haver diferenças entre laboratórios.
Já o teste de Levene é um processo inferencial, em que estão associados
grau de confiança e erros tipo I e II, e o que está sendo testado é justamente se os
92
laboratórios podem ser considerados, quanto à sua variação, homogêneos ou
não.
No caso dos lotes 4 e 5, por serem considerados intermediários, espera-
se que, na maioria das vezes, este tipo de lote apresente sementes em diferentes
estágios de deterioração, propiciando assim uma maior variação no resultados
entre repetições e laboratórios (Illipronti Junior, 1997).
Para cada lote em que foram identificados outliers, retirou-se o
laboratório com maior variância e repetiu-se o teste de Levene e, com exceção
do lote 4 – areia, para os demais lotes não foi rejeitada a hipótese nula de
variâncias heterogêneas nos laboratórios restantes (Tabela 16).
TABELA 16 Resultados da reaplicação do teste de Levene, l% de significância,
para as combinações de lote e substrato
Substrato Lote valor p Condição Laboratório retirado
Areia 3 0,0198 Variâncias homogêneas 4 e 7 4 0,0080 Variâncias heterogêneas 6 5 0,0845 Variâncias homogêneas 8
Papel 3 0,3372 Variâncias homogêneas 6 No caso do lote 3 - areia, foram retirados, simultaneamente, os
laboratórios 4 e 7, por apresentarem variâncias iguais. Para o lote 4 – areia,
mesmo com a retirada do laboratório 6, foi necessário reaplicar o teste de
Levene pela segunda vez, sendo excluído também o laboratório 4 (Figura 29).
Finalmente, as variâncias dos laboratórios restantes para este lote foram
consideradas homogêneas (valor p = 0,0145), salientando que são retirados
apenas os resultados dessas combinações lote-laboratório e não laboratório como
um todo.
93
FIGURA 29 Resumo esquemático dos resultados do teste de Levene para os substratos areia e papel, a 1% de significância
6.6 Análise de variância
Com as retiradas de outliers, o delineamento experimental passou a ser
não balanceado. Logo, para a obtenção dos quadrados médios, foram utilizadas
as somas de quadrados tipo III (Tabela 17).
94
TABELA 17 Resumo da análise de variância e teste de Shapiro-Wilk para a variável porcentagem de germinação em substrato areia e papel, de acordo com oito laboratórios, em ensaios com sementes de cinco lotes de nabo forrageiro
Sub. Fonte de variação G.L. Quadrado médio F Valor p
Areia
Laboratório 7 122,8865 5,27 <0,0001 Lote 4 3.912,8757 167,94 <0,0001 Resíduo 90 23,2987 C.V (%) 5,94 Shapiro – Wilk (valor p) 0,4583
Papel
Laboratório 7 717,1304 19,05 <0,0001 Lote 4 4.588,0339 121,87 <0,0001 Resíduo 99 C.V (%) 7,78 Shapiro – Wilk (valor p) 0,0001
Pelos resultados da análise de variância, para os dois substratos, foram
identificadas diferenças estatisticamente significativas entre os efeitos de
laboratórios.
Algumas hipóteses podem ser levantadas para explicar tais diferenças
nos resultados, como, por exemplo, a alta variação no estádio de maturação das
sementes no momento da colheita, grande número de sementes imaturas, mal
formadas e chochas (Bittencourt et al., 1991). Uma possível dificuldade na
análise e interpretação do teste pelos laboratórios é o fato de ser uma planta
pouco avaliada e conhecida pelos mesmos ou, ainda, o excesso de
microrganismos, pois já foi constatada alta associação entre patógenos e nabo
forrageiro (Nery, 2008). Ou, ainda, o fato de que nem todos os laboratórios
selecionados são credenciados pelo MAPA ou tem um programa ativo de
controle de qualidade.
Ao contrário dos laboratórios, era previsível a presença de diferenças
estatisticamente significativas para o efeito dos lotes, já que, por princípio,
95
inicia-se o processo de validação com lotes de qualidades diferentes (ISTA,
2007a).
Pelo teste de Shapiro-Wilk, a 1% de significância, foi rejeitada a
hipótese de normalidade nos resíduos para o substrato papel, o que pode ser
confirmado pela inspeção visual do gráfico dos resíduos padronizados pelos
quantis teóricos (Figura 30). Observa-se que os maiores desvios de normalidade
encontram-se nas caudas inferiores.
-2 -1 0 1 2
-4-3
-2-1
01
2
Quantis Teóricos (b)
Res
íduo
s P
adro
niza
dos
FIGURA 30 Gráficos para a verificação das suposições de normalidade dos
resíduos para o substrato papel
6.7 Avaliação da repetibilidade, reprodutibilidade e dos valores de h e k
1) Repetibilidade
No caso do substrato areia, comparando-se a amplitude de cada
laboratório ( )jLr com os limites críticos de repetibilidade por lote, grau de
confiança de 99%, pôde-se verificar que, com exceção dos laboratórios 4 e 7, em
96
relação ao lote 3 e laboratório 8 para o lote 5, todos os demais apresentaram
repetibilidade aceitável (Tabela 18).
De fato, esses laboratórios que não apresentaram repetibilidade não
tinham sido incluídos no cálculo do limite crítico, já que foram retirados da
análise em etapas anteriores, sendo reapresentado apenas para confirmar a
situação de não adequabilidade dos seus resultados, para os lotes mencionados,
no processo de validação.
TABELA 18 Amplitude ( )jlLr , limite crítico, desvio padrão de repetibilidade e
resultados da determinação da condição de repetibilidade (Re) ou não (Nr) para os laboratórios em cada lote no substrato areia
Laboratório Lote 1 2 3 4 5
1 Lrj1 8 9 3 1 5 Condição Re Re Re Re Re
2 Lrj2 9 7 3 8 5 Condição Re Re Re Re Re
3 Lrj3 1 8 0 2 0 Condição Re Re Re Re Re
4 Lr41 5 9 5 21 7 Condição Re Re Nr Re Re
5 Lrj5 5 8 2 13 7 Condição Re Re Re Re Re
6 Lrj6 8 14 3 22 9 Condição Re Re Re Re Re
7 Lrj7 10 10 5 11 1 Condição Re Re Nr Re Re
8 Lrj8 10 18 1 21 21 Condição Re Re Re Re Nr
Limite crítico 16,32 23,58 4,93 24,51 11,79 sr 4,05 5,85 1,34 6,08 2,93
Apesar de os laboratórios 4 e 6, com relação ao lote 4, estarem na
mesma situação dos outros três citados anteriormente, ainda conseguiram
97
apresentar condições de repetibilidade. A explicação parece estar associada à
alta variabilidade apresentada por este lote (Figura 28(a)).
Já para o substrato papel, as exceções foram os laboratórios 6 e 7, para o
lote 3, que também tinham sido retirados da análise nas outras etapas
(Tabela 19).
TABELA 19 Amplitude ( )jlLr , limite crítico, desvio padrão de repetibilidade e
resultados da determinação da condição de repetibilidade (Re) ou não (Nr) para os laboratórios em cada lote no substrato papel
Laboratório Lote 1 2 3 4 5
1 Lrj1 8 18 5 13 9 Condição Re Re Re Re Re
2 Lrj2 9 9 2 17 6 Condição Re Re Re Re Re
3 Lrj3 1 4 1 6 4 Condição Re Re Re Re Re
4 Lr41 9 13 2 25 14 Condição Re Re Re Re Re
5 Lrj5 4 13 3 12 7 Condição Re Re Re Re Re
6 Lrj6 6 5 16 18 13 Condição Re Re Nr Re Re
7 Lrj7 0 1 18 31 11 Condição Re Re Nr Re Re
8 Lrj8 2 10 3 13 1 Condição Re Re Re Re Re
Limite crítico 12,33 22,34 6,00 38,64 19,74 sr 3,13 5,66 1,49 9,59 5,00
2) Reprodutibilidade
Quanto às condições de reprodutibilidade, no caso do substrato areia,
comparando-se a amplitude de cada repetição ( )jLR com os limites críticos por
98
lote, grau de confiança de 99%, pôde-se verificar que todos os lotes
apresentaram reprodutibilidade aceitável (Tabela 20). No caso do substrato
papel, a exceção foi novamente o lote 4.
TABELA 20 Amplitude ( )jkLr , limite crítico, desvio padrão
de reprodutibilidade e resultados da determinação da condição de reprodutibilidade (Rr) ou não (NR) para os lotes em cada repetição nos substratos areia e papel
Substrato Lote Repetição Limite crítico sR 1 2 3
Areia
1 LR1k 14 7 13
16,94 4,20 Condição Rr Rr Rr
2 LR2k 14 16 21
23,99 5,96 Condição Rr Rr Rr
3 LR3k 6 4 7
8,49 2,31 Condição Rr Rr Rr
4 LR4k 23 23 20 34,92 8,66 Condição Rr Rr Rr
5 LR5k 12 9 18 18,20 4,52 Condição Rr Rr Rr
Papel
1 LR1k 8 18 18 22,12 5,61 Condição Rr Rr Rr
2 LR2k 25 24 24 31,76 8,05 Condição Rr Rr Rr
3 LR3k 6 6 9 10,64 2,64 Condição Rr Rr Rr
4 LR4k 61 34 33 60,46 15,00 Condição NR Rr Rr
5 LR5k 21 23 35 36,13 9,16 Condição Rr Rr Rr
3) Valores de h e k
Pela observação dos gráficos dos valores de h e k para o substrato areia
(Figura 31), verifica-se que os h e k críticos a 1% não foram ultrapassados,
evidenciando a consistência dos resultados de cada lote por laboratório.
99
Ocorreram apenas uma tendência à subestimação pelo laboratório 1 e
superestimação pelo laboratório 3, comparados com a média geral, de acordo
com os valores de h e maior variabilidade entre os lotes para o laboratório 8, de
acordo com os valores de k.
1 2 3 4 5 6 7 8
12345
Laboratórios
Val
ores
de
h-4
-20
24
h crítico (5%) h crítico (1%)
1 2 3 4 5 6 7 8
12345
Laboratórios
Val
ores
de
k0
12
3
k crítico (5%) k crítico (1%)
FIGURA 31 Gráficos dos valores de h e k, para o substrato areia
100
1 2 3 4 5 6 7 8
12345
Laboratórios
Val
ores
de
h-4
-20
24
h crítico (5%) h crítico (1%)
1 2 3 4 5 6 7 8
12345
Laboratórios
Val
ores
de
k0
12
3
k crítico (5%) k crítico (1%)
FIGURA 32 Gráficos dos valores de h e k, para o substrato papel
Para o substrato papel verifica-se também que os h e k críticos a 1% não
foram ultrapassados (Figura 32), com tendência à subestimação dos resultados
pelos laboratórios 1 e 7, superestimação pelos laboratórios 3 e 5, comparados
101
com a média geral, baseado nos valores de h e maior variabilidade entre os lotes
dos laboratórios 1 e 7, de acordo com os valores de k.
6.8 Comparação dos métodos
De acordo com o teste F, não existiram evidências estatísticas para
considerar diferenças na precisão nem dentro dos laboratórios e nem no geral,
para os dois métodos em cada lote (Tabela 21).
TABELA 21 Resultados da comparação dos dois métodos pelo teste F, a 1% de significância
Comparação Lote Substrato F calculado F inferior F superior
Dentro dos laboratórios
1 Areia 0,59 0,32 3,22 Papel
2 Areia 0,94 0,32 3,22 Papel
3 Areia 1,23 0,25 4,07 Papel
4 Areia 2,49 0,29 3,86 Papel
5 Areia 2,92 0,30 3,47 Papel
Geral
1 Areia 6,93 0,11 8,88 Papel
2 Areia 6,68 0,11 8,88 Papel
3 Areia 1,34 0,07 14,94 Papel
4 Areia 3,39 0,10 14,20 Papel
5 Areia 4,81 0,11 10,79 Papel
Além dos resultados estatísticos, cada laboratório preencheu uma ficha
de avaliação (Anexo A) na qual foram comparados os dois métodos, sempre
102
indicando qual dos dois seria mais fácil na execução de alguns procedimentos.
Para todas as respostas, o método papel foi eleito, pela maioria dos laboratórios,
como o mais fácil (Tabela 22).
TABELA 22 Respostas para a ficha de avaliação sobre facilidade dos dois métodos, de acordo com a etapa de execução
Etapa nº de laboratórios Areia Papel Ambos
Pré-montagem 0 7 0 Montagem 1 5 1
Manipulação 1 6 0 Avaliação 2 4 1
* Apenas um laboratório não enviou a ficha de avaliação.
As principais dificuldades apontadas por alguns laboratórios foram: na
pré-montagem, o método areia foi de difícil manipulação e esterilização; já na
avaliação, o papel possibilitou maior incidência de fungos nas sementes.
Os comentários gerais enviados pelos os laboratórios foram:
• “Embora o método papel tenha sido de mais fácil montagem à
manipulação, observou-se que as plântulas estavam mais definidas
no método da areia”;
• “Como as sementes estavam sem tratamento, durante a avaliação do
teste de germinação em papel, verificou-se uma maior contaminação
de fungos”;
• “Para a nossa rotina, preferimos o papel, por questão de facilidade”;
• “Para manipulação, a montagem em papel é mais fácil. Já para
avaliação, é mais fácil em areia.”
103
6.9 Análise discriminante
Os cinco lotes foram divididos em três grupos, cada grupo
correspondendo aos níveis de qualidade: grupo τ1 – inferior (lote 2); grupo τ2 –
intermediário (lotes 4 e 5) e grupo τ3 – superior (lotes 1 e 3).
Para a utilização da técnica de análise discriminante, foram retirados, de
cada lote, os laboratórios que tinham sido considerados outliers pelo teste de
Levene.
Pelos resultado do teste de Box M, a 1% de significância, para o método
areia (valor p= 0,1258) pareceu não haver evidências para rejeitar a hipótese de
igualdade das matrizes de variâncias e covariâncias, sugerindo a utilização da
regra linear para a classificação. Já no caso do papel (valor p = 0,0004), esta
hipótese foi rejeitada e a primeira indicação seria utilizar a função quadrática
(Barroso & Artes, 2003).
Apesar dos resultados do teste de Box M, foram determinadas, para os
dois métodos, as funções discriminantes lineares de Fisher. A justificativa da
utilização da regra linear, no caso do papel, será apresentada posteriormente.
Para avaliar a função de classificação, foi utilizado o processo de
validação cruzada, obtendo-se as matrizes de confusão para os dois métodos
(Tabelas 23 e 24).
TABELA 23 Matriz de confusão com validação cruzada – regra linear de Fisher, para os resultados do teste de germinação em sementes de nabo forrageiro, para o método areia
Grupo
verdadeiro Grupo classificado total τ1 τ2 τ3
τ1 8 0 0 8 τ2 2 8 3 13 τ3 0 0 14 14
Total 10 8 17 35
104
TABELA 24 Matriz de confusão com validação cruzada – regra linear de Fisher, para os resultados do teste de germinação em sementes de nabo forrageiro, para o método papel
Grupo
verdadeiro Grupo classificado total τ1 τ2 τ3
τ1 6 2 0 8 τ2 3 6 7 16 τ3 0 2 13 15
Total 9 10 20 39 Com os resultados das matrizes de confusão obtiveram-se, para os dois
métodos, as três taxas de erro de se classificar: no geral uma observação
incorretamente - TEE; uma observação do grupo iτ no grupo jτ - TEE (j|i) e
uma observação do grupo iτ incorretamente - TEE (i) (Tabela 25).
TABELA 25 Taxas de erro (%) para classificações pelo processo de validação cruzada – regra linear, para os métodos areia e papel
Taxas de erro Areia Papel TEE 14,29 35,90
TEE (1|2) 15,38 18,75 TEE (1|3) 0,00 0,00 TEE (2|1) 0,00 25,00 TEE (2|3) 0,00 13,33 TEE (3|1) 0,00 0,00 TEE (3|2) 23,08 43,75 TEE (1) 0,00 18,75 TEE (2) 38,46 62,50 TEE (3) 0,00 15,38
105
Para o método areia, somente o grupo 2 apresentou taxa de erro de
classificação, o que era em parte esperado por serem lotes de qualidade
intermediária (Illipronti, 1997).
Pelos resultados apresentados na matriz de confusão para o substrato
areia (Tabela 23), verifica-se uma tendência do grupo 2, tanto à sub como à
superestimação, uma vez que foram duas observações classificadas no grupo 1 e
três no grupo 3. E, desses cinco valores confundidos, quatro deles são
observações do lote 4, reforçando também o que já foi dito sobre este lote, no
que se refere à sua alta variabilidade em relação aos demais lotes.
Para o método papel, a primeira consideração a ser feita é que a escolha
pela utilização da regra linear em detrimento da regra quadrática vem do fato de
que a taxa de erro geral obtida foi menor, já que, no caso quadrático, a TEE seria
igual a 46,15%.
Esses melhores resultados da regra linear, mesmo que as matrizes de
variâncias e covariâncias sejam diferentes, podem estar associados a desvios de
normalidade. De acordo com Johnson & Wichern (1998), a regra quadrática é
mais afetada pela falta de normalidade multivariada do que a regra linear. Já o
método de validação cruzada, segundo Giri (2004), não é muito sensível à
violação de normalidade.
Essa suposição de rejeição à hipótese de normalidade multivariada foi
verificada no caso do grupo 3 do método papel (valor p = 0,00001), pelo teste de
Shapiro Wilk multivariado de Royston (Royston, 1983), a 1% significância.
Comparando-se os dois métodos, verifica-se que os três tipos de taxa de
erro para o substrato papel foram bem superiores ao da areia, evidenciando um
fato já constatado de uma variação maior dos resultados obtidos no papel.
Segundo Ferreira (2008), o desempenho de uma regra de classificação depende
das distâncias dos grupos e essa distância depende da variabilidade. Quanto
106
menor for a dispersão do grupo, menores serão os erros de classificação
incorreta.
Pode-se observar que, independente do método, o grupo 2 apresentou as
maiores taxas de erro de classificação, o que parece estar associado a uma maior
dispersão nos resultados obtidos num lote de qualidade intermediária. Como
afirma Ferreira (2008), “por melhores que sejam os métodos matemáticos uma
boa regra de decisão dependerá de outros fatores exógenos ao controle.”
No geral, foi possível sustentar a confirmação da classificação feita a
priori, dessa forma os métodos puderam ser considerados de fato robusto, por
discriminar os lotes com diferentes níveis de qualidade.
6.10 Discussão geral
Para os dois métodos, os resultados indicaram que os procedimentos
forneceram exatidão, robustez, reprodutibilidade e repetibilidade. Assim, numa
avaliação global, em termos estatísticos e considerando o nível de significância
de 1% para todos os testes e análises, verifica-se que métodos com a utilização
dos substratos areia e papel, temperatura alternada 20º-30ºC, podem ser
validadas para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro
(Figura 33).
107
FIGURA 33 Resumo esquemático dos resultados para avaliação da exatidão, precisão e robustez no processo de validação dos métodos que utilizam substratos areia e papel, temperatura alternada 20º-30ºC, para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro
Em termos fitotécnicos, observou-se que a eficiência do método depende
do nível de deterioração do lote. Aqueles de qualidade intermediária apresentam
maior variação de resultados entre e dentro dos laboratórios. Mas, apesar de não
ter apresentando, como dito, diferenças estatísticas entre os dois métodos, parece
haver uma preferência dos laboratórios pelo uso do substrato papel.
108
Outra consideração a ser feita é quanto à utilização do nível de
significância de 1% em detrimento, por exemplo, de um valor mais tradicional,
como 5%. A justificativa está associada ao fato que, no processo de validação, o
controle do erro tipo I é importante e necessário, mesmo ocasionando um
aumento no erro tipo II. Além disso, para a maioria dos testes estatísticos, existe
uma dificuldade metodológica de definir o erro tipo II.
Nesse contexto de validação, deve-se diminuir o risco de considerar que
um laboratório ou método estejam fora do padrão quando de fato não estejam,
isto é, rejeitar hipóteses nulas, como os laboratórios têm repetibilidade, os
métodos têm mesma precisão, quando elas são verdadeiras. Por isso, a opção de
tornar os testes mais conservativos12 .
Para o teste Scott-Knott, apresentado na seção 6.2, optou-se por
considerar o nível de significância de 5%, tornando o teste mais liberal13.
Naquele contexto, um maior controle do erro tipo II era importante, já que
caracterizar o lote com um determinado nível de qualidade, sem que de fato seja
a classificação verdadeira, pode até mesmo inviabilizar o processo de validação.
Como dito, ter lotes com características diferentes é um pré-requisito para este
tipo de processo.
12 Um teste é conservativo quando o erro tipo I é controlado de forma excessiva, aumentando-se a taxa de erro tipo II e diminuindo-se o poder do teste (Carmer & Swanson, 1973). Em um teste conservativo, a probabilidade de se encontrar um resultado significativo falso (erro tipo I) é inferior ao valor α estabelecido (Snedecor & Cochran, 1980). 13 Um teste é liberal quando se aumenta a taxa de erro tipo I, diminuindo a taxa de erro tipo II e aumentando o poder do teste (Machado et al., 2005).
109
7 CONCLUSÕES
As técnicas estatísticas propostas contribuem para a melhoria e o
aperfeiçoamento das análises no processo de validação, no sentido de que:
• o teste de Levene para média permite identificar alguns laboratórios
discrepantes que não são considerados no uso do teste de Cochran;
• a determinação dos limites críticos de repetibilidade e reprodutibilidade
permite afirmar mais pontualmente que laboratórios e lotes têm essas
condições satisfeitas;
• quanto aos seus índices de precisão, os métodos de germinação podem
ser comparadas, com base em resultados de um teste estatístico;
• a técnica da Análise Discriminante auxilia o processo de validação de
método, sendo instrumentação de confirmação dos resultados obtidos
nos laboratórios relativos a classificação de um lote quanto ao seu
potencial de germinação. Pode-se então considerar este resultado como
um indicativo que o método a ser validado seja de fato robusto, por
discriminar lotes com diferentes níveis de qualidade.
O controle da taxa de erro tipo I, em todos os testes estatísticos, é
determinante para a viabilidade do processo de validação de método.
Por fim, tanto no aspecto fitotécnico como no estatístico, os métodos
para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro com a utilização dos
substratos areia e papel temperatura alternada 20º-30ºC podem ser consideradas
validadas, pois a análise dos resultados obtidos em oito diferentes laboratórios
confirmaram que os mesmos apresentarem exatidão, precisão (repetibilidade e
reprodutibilidade) e robustez.
110
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, I.B.; PIÑA-RODRIGUES, F.C.M.; FIGLIOLIA, M.B. Sementes florestais tropicais. Brasília: ABRATES, 1993. 350 p. ALMEIDA, A. de; ELIAM, S; NOBRE, J. Modificações alternativas aos testes de Levene e de Brown e Forysthe para igualdade de variâncias e médias. Revista Colombiana de Estadística, Bogotá, v. 31, n. 2, p. 241-260, 2008. ANDRADE, A.C.S.; PEREIRA, T.S.; FERNANDES, M.J.; CRUZ, A.P.M.; CARVALHO, A.S.R. Substrato, temperatura de germinação e desenvolvimento pós-seminal de sementes de Dalbergia nigra. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41, n. 3, p. 517-523, mar. 2006. ASHTON, P.M. Seed germinatio testing. In: SEED technologists training manual. Ithaca: The Society of Commercial Seed Technologists, 2005. 450 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Sistema de gestão da qualidade – Fundamentos e Vocabulário, 2000 (NBR ISO 9000). ASSOCIATION OF ANALYTICAL COMMUNITIES. International Harmonized Protocol for Proficiency Testing of (Chemical) Analytical Laboratories. Journal of AOAC International, v. 76, n. 4, p. 1-27, 1993. Disponível em: <http://www.inmetro.gov.br/kits/ctle05_protocolo.pdf>. Acesso em: 10 dez. 2007. ASSOCIATION OF OFFICIAL SEED ANALYSTS. Seed vigour testing handbook. Washington, 1983. 88 p. (AOSA. Handbook on Seed Testing Contribution, 32) BANZATTO, D.A.; KONKRA, S.N. Experimentação agrícola. 4.ed. Jaboticabal: FUNEP. 2006. 237 p. BARNETT, V.; LEWIS, T. Outliers in statistical data. 3.ed. Chichester: J. Wiley, 1994. 604 p. BARROSO, L. P.; ARTES, R. Análise multivariada. In: REUNIÃO ANUAL DA RBRAS, 48.; SEAGRO,10., 2003, Londrina. Anais… Lavras: UFLA, 2003. p. 151.
111
BARTLETT, M. S. Properties of sufficiency and statistical tests. Proceedings of the Royal Statistical Society Series A, London, n. 160, p. 268–282, 1937. BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: physiology of development and germination. 2.ed. New York/London: Plenum, 1994. 445 p. BITTENCOURT, J.F.N.; SADER, R.; UNAGRO, M.R.G.; TOLEDO, N.M. P. Maturação fisiológica de sementes de girassol cv. Contisol. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v. 13, n. 2, p. 81-85, 1991. BOULD, A. The distribution of the heterogeneity value H. Seed Science. & Technology, Switzerland, v. 3, p. 439-449, 1975. BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para análise de sementes. Brasília: SNDA/DNDV/CLAV, 1992. 365 p. BRASIL. Ministério da Ciência e Tecnologia. Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel. 2005. Disponível em: <http://www.biodiesel.gov.br/>. Acesso em: 21 de jan. 2008. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº 30. 2008. Disponível em: <http://www.puntofocal.gov.ar/notific_otros_miembros/bra288_t.pdf>. Acesso em: 2 jan. 2009. BROWN, M. B.; FORSYTHE, A. B. Robust tests for equality of variances. Journal of the American Statistical Association, Alexandria, n. 69, p. 364-367,1974. BUSSAB, W. O.; MORETTIN, P. A. Estatística básica. 5. ed. São Paulo: Saraiva, 2003. 526 p. CAMPOS, P. M. Comparação de métodos para a avaliação do controle de qualidade de laboratório de análises de solo. 1998. 99 p. Dissertação (Mestrado em Estatística e Experimentação Agropecuária) - Universidade Federal de Lavras, Lavras. CAMPOS, P. M.; MUNIZ, J.A.; OLIVEIRA, M.S. de; FERREIRA, D.F. Estimativa da repetibilidade e reprodutividade de laboratórios e via de aplicação no controle de qualidade de solo. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 23, n. 2, p. 404-409, 1999.
112
CARLING, K. Resistant outlier rules and the non-gaussian case. Computational Statistics & Data Analysis, Netherlands, n. 33, p. 249-258, 2000. CARVALHO, N.M.; NAKAGAWA, J. Sementes: ciência, tecnologia e produção. Jaboticabal: FUNEP, 2000. 588 p. CARMER, S.G.; SWANSON, M.R. An evaluation of ten pairwise multiple comparison procedure by Monte Carlo methods. Journal American Statistical Association, Washington, v. 68, n. 341, p. 66-74, Mar. 1973. COCHRAN, W.G. The distribution of the largest of a set of estimated variance as a fraction of their total. Annals of Eugenics, London, n. 11, p. 47-52, 1941. COPELAND, L.; LIU, H. Seed sampling and sub sampling. In: THE SOCIETY OF COMMERCIAL SEED TECHNOLOGISTS. Seed technologists training manual, Switzerland, 2005. 450p. CUNHA, U. S. da; MACHADO, S. do A.; FIGUEIREDO FILHO, A. Uso de análise exploratória de dados e de regressão robusta na avaliação do crescimento de espécies comerciais de terra firme da Amazônia. Revista Árvore, Viçosa, v. 26, n. 4, p. 391-402, ago. 2002. DAVIES, P. L.; GATHER, U. The breakdown point- examples and counterexamples. REVSTAT – Statistical Journal, v. 5, n. 1, p. 1-17, mar. 2007. EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics. Middlesex, 1998. Disponível em: http://www.eurachem.org/guides/valid.pdf. Acesso em : dez. 2008. FERREIRA, D. F. Estatística multivariada. Lavras: UFLA/DEX, 2008. 661 p. FISHER, R.A. The statistical utilization of multiple measurements. Annals of Eugenics, London, v. 8, p. 376-386, 1938. FOSTER, M. das G. S. Estados brasileiros se articulam para produzir biodiesel. 2004. Disponível em: <//www.secti.ba.gov.br/secti.page? module=noticias&action=verNoticia&id=221>. Acesso em: 13 de jan. 2008.
113
GNANADESIKAN, R. Methods for statistical data analysis of multivariate observations. New Jersey: J. Wiley, 1997. 353 p. GIRI, N.C. Multivariate statistical analysis. 2.ed. New York: M. Dekker, 2004. 558 p. HAIR, J. F. Jr.; ANDERSON, R.E.; TATHAN, R.L.; BLACK, W.C. Multivariate data analysis. 5.ed. Upper Saddle River: Prentice Hall, 2006. 593p. HAMPEL, F.R. The influence curve and its role in robust estimation. Journal of the American Statistical Association, Washington, n. 69, p. 383-393, 1974. HAMPEL, F.R. The breakdown points of the mean combined with som rejection rules. Technometrics, Alexandria, n. 27, p. 95 – 107, 1985. HELLERSTEIN, J.M. Quantitative data cleaning for large databases. 2008. p. 1- 42. Disponível em: < http://db.cs.berkeley.edu/jmh>. Acesso em: 20 dez. 2008. HINES, W. G. S.; O’HARA HINES, R. J. ‘Increased power with modified forms of the levene (Med) test for heterogeneity of variance’. Biometrics, Arlington , n. 56, p. 451–454, 2000. HOLANDA, A. Biodiesel e inclusão social. Brasília: Câmara dos Deputados, Coordenação de Publicações, 2004. 200 p. ILLIPRONTI JUNIOR, R.A. Variation in quality of individual seeds within a seed lot of soyeban (Glycine Max (L.) Merrill). 1997. 157 p. Thesis (Doctoral in Agronomy) Wageningen Agricultural University, Wageningen.
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO 5725/2. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 2: Basi c method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. Genève, 1994.
INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. Method validation for seed testing. Switzerland, 2007a. INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. International rules for seed testing. Switzerland, 2007b.
114
INSTITUTO DE PESQUISAS E ESTUDOS FLORESTAIS. Informativo Sementes IPEF, abr. 1998. 2 p. Disponível em: <http://www.ipef.br/ especies/germinacaoambiental.html>. Acesso em: 10 nov. 2008. JOHNSON, R.A.; WICHERN, D.W. Applied multivariate statistical analysis. 4.d. New Jersey: Prentice Hall, 1998. 816 p. LACHENBRUCH, P.A.; MICKEY, M.R. Estimation of error rates in discriminant analysis. Technometrics, Washington, v. 10, n. 1, p. 1-11, 1968. LEVENE, H. Contributions to probability and statistics: Essays in Honor of Harold Hotelling. In: OLKIN, I.; GHURYE, S. G.; HOEFFDING. W.; MADOW, W.G.; MANN, H.B. (Ed.). Stanford: Stanford University, 1960. p. 278-292. LIU, H.; SHAH, S.; JIANG, W. On-line outlier detection and data cleaning. Computers and Chemical Engineering, United Kingdom, n. 28, p. 1635–1647, 2004. LOPES, J.C.; CAPUCHO, M.T.; MARTINS FILHO, S.; REPOSSI, P.A. Influência da temperatura, substrato e luz na germinação de sementes de bertalha. Revista Brasileira de Sementes, Pelotas, v. 27, n. 2, p. 18-24, dez. 2005. LUPING, T.; SCHOUENBORG, B. Methodology of Inter-comparison tests and statistical analysis of the results. SP Swedish National Testing and Research Institute. SP REPORT. 2000. p. 35. Disponível em: <http://www.nordicinnovation.net/nordtestfiler/tec482.pdf>. Acesso em 10 jan. 2008. MACHADO, A.A.; DEMÉTRIO, C.G.B.; FEREEIRA, D.F.; SILVA, J.G. C. da. Estatística experimental: uma abordagem fundamentada no planejamento e no uso de recursos computacionais. In: REUNIÃO ANUAL DA RBRAS, 50; SEAGRO,11., 2005, Londrina. Anais... Londrina: UEL, 2005. p. 290. MARCOS FILHO, J. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba: FEALQ, 2005. 495 p. MINGOTI, S. A. Análise de dados através de métodos de estatística multivariada: uma abordagem aplicada. Belo Horizonte: UFMG, 2005. 295 p.
115
MOOD, A. M.; GRAYBILL, F.A.; BOES, D.C. Introduction to the theory of statistics. 3 ed. New York: J. Wiley, 1974. 564 p. NERY, M.C. Colheita, beneficiamento e controle de qualidade de sementes de nabo forrageiro 2008. 180 p. Tese (Doutorado em Fitotecnia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras. NERY, M.C.; CARVALHO, M.L.M. de; GRIS, C.F.; NERY, F.C.; LEAL FILHO, W.R.; FRAGA, A.C. Germinação de sementes de nabo forrageiro cultivar IPR 116. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PLANTAS OLEAGINOSAS, ÓLEOS, GORDURAS E BIODIESEL. 4., 2007, Varginha. Resumos... Varginha: UFLA e Prefeitura Municipal de Varginha, 2007. 1CD-ROM. NOVEMBRE, A.D.L. C. Estudo da metodologia para a condução do teste de germinação em sementes de algodão (Gossypium hirsutum L.) deslintadas mecanicamente. 1994. 133 p. Tese (Doutorado em Agronomia) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba, SP. OLIVIERI, J.C. Método gráfico para interpretação de resultados em programa interlaboratorial: elipse de confiança, técnicas e métodos. São Paulo: IPT. 1988. 20 p. PACHECO, M.V.; MATOS,V.P.; FERREIRA, R.L.; FELICIANO, A.L.P.; PINTO, K.M.S. Efeito de temperatura e sibstratos na germinação de sementes de Myracrodruon urundeuva Fr. All, (Anarcadiace). Revista Árvore, Viçosa, MG, v. 30, n. 3, p. 359-367, maio/jun. 2006. PEREIRA, J.C.R. Análise de dados qualitativos: estratégias metodológicas para as ciências da saúde, humanas e sociais. São Paulo: EDUSP, 2004. 156 p. POPINIGIS, F. Fisiologia da semente. Brasília: AGIPLAN, 1985. 289 p. RAMALHO, M.A. P.; FERREIRA, D.F. ; OLIVEIRA, A.C. Experimentação em genética e melhoramento de plantas. Lavras, UFLA, 2000. 303 p. R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: a language and environment for statistical computing. R Vienna, Áustria: Foundation for Statistical Computing. 2008. Disponível em: <http://www.R-project.org>. Acesso em: 10 jan. 2008.
116
REIMANN, C.; FILZMOSER, P.; GARRETT, R.G. Background and threshold: critical comparison of methods of determination. Science of the Total Environment, Netherlands, n. 346, p. 1-16, 2005. ROUSSEEUW, P.J.; CROUX, C. Alternatives to the median absolute deviation. Journal of the American Statistical Association, Washington, v. 88, n. 424, p. 1273-1283. 1993 ROYSTON, J.P. Some techniques for assessing multivariate normality based on the Shapiro –Wilk W. Applied Statistics Journal of the Royal Statistical Society – Series C, London, v. 32, n. 2, p. 121-1333, 1983. SHEPPARD, J. W.; COCKERELL, V. International Seed Testing Association handbook of method validation for the detection of seedborne pathogens. Switzerland, International Seed Testing Association 2000. SILVA, E.C.; FERREIRA, D.F.; BEAZORTI, E. Avaliação do poder e taxas de erro tipo I do teste de Scott-Knott por meio do método de Monte Carlo. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 23, n. 2, p. 687-696, 1999.
SNEDECOR, G.W.; COCHRAN, W.G. Statistical methods. Iowa: University of Ames, 1980. 507 p. TUKEY, J.W. Exploratory data analysis. Reading, Mass: Addison-Wesley, 1977.
VIEIRA, A. M. Química pesquisa uso de nabo forrageiro na produção de biodiesel. Boletim Informativo da UFMG, v. 33, n. 1574, 2007. Disponível em: <http://www.ufmg.br/boletim/bol1574/sexta.shtml>. Acesso em 10 jan. de 2007. VOCABULÁRIO Internacional de Metrologia. Erro aleatório e erro sistemático. 2.ed. Brasília: INMETRO/SENAI, 2000. VORAPONGSATHORN, T.; TAEJAROENKUL, S.; VIWATWONGKASEM, C. A comparison of type I error and power of Bartlett’s test, Levene’s test and Cochran’s test under violations of assumptions. Journal Science Technology, Lusaka, v. 26 n. 4, p. 537-547, 2004.
117
VUOLO, J. H. Fundamentos da teoria de erros. 2.ed. São Paulo: E. Blucher, 2000. 249 p. WAENY, J.C.C. Repetitividade e reprodutividade II. São Paulo: IPT. 1980. 14 p.
WILLIAMS, G. J.; BAXTER, R. A.; He H. X.; HAWKINS S.; GU, L. A comparative study of RNN for outlier detection in data mining. In: IEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON DATA-MINING, 2002, Maebashi City. Proceedings... Maebashi City, Japan: CSIRO, 2002. (Technical Report CMIS-02/102).
118
CAPÍTULO 3 ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA
119
1 RESUMO
O ensaio de proficiência é um dos tipos de programas interlaboratoriais que permitem determinar o desempenho de um laboratório por meio de uma comparação que utiliza medidas em materiais homogêneos, ou similares, em pelo menos dois laboratórios, sob condições predeterminadas. Na área de sementes, para o processo de manutenção do credenciamento ou acreditação, a International Seed Testing Association (ISTA) exige a participação dos laboratórios de sementes credenciados em ensaios de proficiência. A técnica estatística utilizada pela ISTA na avaliação dos resultados de um ensaio de proficiência é o método do Z-score. O problema de pesquisa abordado neste capítulo foi investigar e avaliar técnicas estatísticas, além do método do Z-score, que pudessem ser adequadas para analisar os resultados de ensaios de proficiência na área de sementes. Foram avaliados então três procedimentos: método Campos, análise de agrupamento e análise generalizada de Procrustes. Para gerar o banco de dados foram realizadas três simulações, cada uma representando os resultados de um teste de germinação com doze laboratórios participantes. Esses doze laboratórios formaram uma composição de dois grupos discrepantes em relação a algum(ns) parâmetro(s) estatístico(s), como a média e a matriz de variâncias e covariâncias. No caso do método do Z-score, foram calculados, para cada laboratório e simulação, a precisão e a exatidão, e atribuído uma classificação e uma nota. No método Campos também foram calculados para cada laboratório e simulação a precisão e a exatidão e atribuído um selo. Na análise de agrupamento foram construídos dendrogramas e calculadas as correlações cofenéticas para cada simulação. Na análise generalizada de Procrustes, para cada simulação foram construídos elipses de confiança de 95%. As três técnicas propostas, no geral, conseguiram distinguir os dois grupos, mostrando-se como potenciais procedimentos para a uttilização em ensaios de proficiência na área de sementes. O método do Z-score não conseguiu separar adequadamente os grupos, sendo necessários maiores estudos para avaliar o desempenho deste procedimento nas situações simuladas.
120
2 ABSTRACT
Proficiency test is a type of inter-laboratory program that allows determining the performance of a laboratory by comparing to at least other two laboratories through measurements in homogeneous or similar materials under predetermined conditions. In the area of seeds, for the process of maintaining accreditation, the International Seed Testing Association (ISTA) requires the participation of accredited seed laboratories in proficiency tests. The statistical technique used by ISTA for the assessment of proficiency test results is the Z-score method. The research problem approached in this chapter was to investigate and assess statistical techniques, besides the Z-score method, that would prove adequate to analyze the results of proficiency tests in the area of seeds. Therefore, three procedures have been evaluated: Campos method, Cluster Analysis, and Generalized Procrustes Analysis. In order to generate the database three simulations have been carried out, each representing the results of germination test with twelve participating laboratories. The twelve laboratories were arranged in two discrepant groups regarding some statistical parameter(s) such as variance and covariance average and matrix. In the case of Z-score method, precision and accuracy were calculated for each laboratory and simulation, and rating and grade were attributed. In the Campos method, precision and accuracy were also calculated for each laboratory and simulation, and a label was attributed. In the grouping analysis, dendrograms were built and cophenetic correlations were calculated for each simulation. In the Generalized Procrustes Analysis, confidence ellipses of 95% were built for each simulation. The three proposed techniques, in general, managed to distinguish the two groups, presenting themselves as potential procedures to be used for proficiency tests in the area of seeds. The Z-score method did not manage to adequately separate the groups, and further studies become necessary to assess the performance of that procedure in the simulated situations.
121
3 INTRODUÇÃO
A participação dos laboratórios em programas interlaboratoriais é um
dos mecanismos de controle de qualidade dos seus resultados previstos na NBR
ISO/IEC 17025 (Association of Analytical Communities, AOAC, 1993). Estes
tipos de ensaios comparativos podem auxiliar os laboratórios na detecção e, por
conseguinte, na correção de possíveis fontes de erros. Esses erros podem ser
aleatórios ou sistemáticos, provenientes de deficiências nos procedimentos de
análise, nos equipamentos e nos analistas, dentre outras fontes.
De acordo com a indicação dessa mesma norma, para garantir a
qualidade dos resultados de um laboratório, os mesmos devem ser provenientes
de um método validado, seguido da estimativa da incerteza de medição, ou seja,
de uma avaliação da exatidão e precisão.
O ensaio de proficiência é um dos tipos de programas interlaboratoriais
que permitem determinar o desempenho de um laboratório por meio de uma
comparação que utiliza medidas em materiais homogêneos, ou similares, em
pelo menos dois laboratórios, sob condições predeterminadas.
Para o processo de manutenção do credenciamento ou acreditação, a
International Seed Testing Association (ISTA) exige a participação dos
laboratórios de sementes credenciados em ensaios de proficiência.
O objetivo dos ensaios de proficiência da ISTA não é identificar os
melhores laboratórios de análises de sementes no mundo, mas sim destacar
aqueles que não satisfazem ao desempenho mínimo, que é razoável esperar de
um laboratório credenciado e determinar se estão, de fato, tomando ações
corretivas para que seu desempenho atinja, pelo menos, o nível mínimo (ISTA,
2007).
122
A técnica estatística utilizada pela ISTA na avaliação dos resultados de
um ensaio de proficiência é o método do Z-score. Em outras áreas (química,
meio ambiente, solos, etc.) são utilizados, além desse método, procedimentos
estatísticos, como, por exemplo, os métodos da elipse de confiança de Youden
(Olivieri, 1988) e do Profert (Oliveira et al., 1995).
Atualmente, no Brasil, a Rede Metrológica RS e a Lanagro/RS vêm
desenvolvendo um programa de ensaio de proficiência em sementes de soja,
com os seguintes itens de ensaios: análise de pureza e determinação de outras
sementes por número (determinação do número total por categoria e
determinação do número por espécie). O desempenho de cada laboratório será
avaliado também pelo método do Z-score (Rede Metrológica, 2008).
O problema de pesquisa abordado neste capítulo foi investigar e avaliar
técnicas estatísticas, além da método do Z-score, que pudessem ser adequadas
para analisar os resultados de ensaios de proficiência na área de sementes.
123
4 REFERENCIAL TEÓRICO
4.1 Programas interlaboratoriais: aspectos gerais
De acordo com a norma Associação Brasileira de Normas Técnicas,
ABNT NBR ISO 9000 (ABNT, 2000), qualidade pode ser definida como sendo
a totalidade das propriedades e das características de um produto ou serviço que
lhe conferem aptidão para satisfazer às necessidades implícitas ou explícitas dos
clientes.
No caso do laboratório de sementes, o serviço prestado é a avaliação da
qualidade de sementes, por meio de procedimentos de análise, até a emissão do
respectivo boletim de análise.
De acordo com a legislação pertinente, para proceder às análises, os
laboratórios baseiam-se nas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992), que
se fundamentam na uniformidade dos procedimentos e especificam os diferentes
métodos de análises que devem ser empregados, os tamanhos máximos para os
lotes de sementes, o peso mínimo da amostra média ou submetida e da amostra
de trabalho e a utilização de tabelas de tolerância para os diferentes tipos de
testes em sementes (Zorato, 2005).
No que tange às tabelas de tolerância14, calculadas por Miles, em 1963,
os laboratórios fundamentam-se nas mesmas como um método estatístico para
controle interno de qualidade em testes de rotina, bem como para comparar
resultados de diferentes laboratórios, uma vez que é possível garantir que os
resultados estejam dentro dos padrões exigidos pela RAS.
14 As tabelas de tolerância determinam a amplitude tolerável para as diferenças entre repetições de um teste com (1-α) de confiança, ou seja, no caso do teste de germinação, são equivalentes as amplitudes de intervalos de confiança unilateral ou bilateral para a proporção.
124
Contudo, no cálculo dessas tabelas, levou-se em consideração apenas a
variação aleatória das amostras obtidas em diferentes laboratórios e, de acordo
com os estudos de Jorgensen et aI. (1992), a variação entre testes de germinação
conduzidos no mesmo laboratório não pode ser explicada exclusivamente pela
variação ao acaso da amostragem.
Miles (1963), citado por Oliveira & Cicero (1996), afirma que as
diferenças significativas dos resultados no teste ou entre testes de germinação
podem ter como causas: o acaso, deficiência de equipamentos, incluindo
variação de ambiente dentro do germinador, deficiência de método, deficiência
técnica, erros ou inconsistência na distinção entre plântulas normais e anormais,
fungos e bactérias, produtos químicos nas sementes, contagens ou registros
imprecisos, amostragem não casualizada das sementes para o teste e mudança na
porcentagem de germinação entre os testes.
Em consonância com essas afirmações, Rennie & Tomlin (1984)
observaram que variações ocorridas em testes de germinação podem ser devido
às diferenças normais de amostragem, ou dos procedimentos e condições para o
teste, ou, ainda, às variações nas avaliações entre analistas. Esses mesmos
autores verificaram também, em seus estudos, que a variação de resultados entre
laboratórios foi maior que a variação entre repetições ou entre testes, em um
mesmo laboratório.
Nesse sentido, a participação dos laboratórios em trabalhos de
comparação pode auxiliar na busca de fontes de erros, para eliminá-los ou
minimizar seus efeitos, podendo, assim, auxiliar o controle interno de qualidade
laboratorial (Chuí et. al., 2004).
Segundo Olivieri & D’elia (1996), citados por Campos (1998), os
programas interlaboratoriais devem permitir aos laboratórios participantes a
comparação dos seus resultados, para verificar se a exatidão e a precisão obtidas
125
em seus processos metrológicos são coerentes com os resultados de outros
laboratórios que atuam em um mesmo setor tecnológico.
As comparações interlaboratoriais são utilizadas para determinar
características de métodos, materiais ou laboratórios. Se o interesse for conhecer
características de métodos, é necessário utilizar materiais adequados e
laboratórios competentes para realizar as medições propostas. Se o problema é
atribuir valores para certificar materiais de referência, o estudo deverá ser
apoiado por laboratórios confiáveis de mais alta qualidade metrológica. Por
outro lado, não é certo avaliar o desempenho de laboratórios, a menos que
estejam disponíveis amostras homogêneas a serem distribuídas para laboratórios,
utilizando-se de métodos validados (Chuí et al., 2002).
Pelo relatado, o termo “Programa Interlaboratorial” é muito abrangente.
O planejamento, a organização, a operacionalização e a interpretação dos
resultados dependem da finalidade a que se destinam, resultando, por
conseguinte, na utilização de diversas técnicas estatísticas para avaliação dos
resultados (Quadro 3).
126
QUADRO 3 Tipos de programas interlaboratoriais (PI), descrição e técnicas estatísticas associadas
Tipos de PI Objeto de estudo Descrição Técnicas
estatísticas
Ensaios de proficiência Laboratório
Avaliação do desempenho de laboratórios, reconhecimento formal da sua competência técnica para um determinado ensaio
Método do Z-score
Compatibilização de resultados Laboratório Comparação dos resultados
entre laboratórios
Método da Elipse de Confiança de
Youden Estudo de precisão de métodos – estudo colaborativo
Método Avaliação do desempenho de um método
ANOVA/ISO 5725
Certificação de materiais de referência
Material Estimativa do “valor real” de uma ou mais amostras em um material
ANOVA/ABNT/ ISO 35
Calibração Equipamento
Calibração de equipamentos, utilizando padrões ou materiais de referência
Método do erro normalizado
Aferição interlaboratorial Laboratório
Visa o aprimoramento das técnicas operacionais, orientando os laboratórios participantes a atentarem ao método, à calibração ou aferição do instrumental, bem como treinamento do operador
Método da Elipse de Confiança de
Youden
Método Profert
Fonte: Quadro adaptado de Chuí (2006).
As técnicas estatísticas identificadas no Quadro 3, para cada tipo de
programa interlaboratorial, são os padrões utilizados na maioria das análises,
mas não são únicas, podendo acontecer algumas alterações e ou adaptações, de
acordo com a conveniência do estudo. Outro ponto importante a ser ressaltado é
127
que, em quaisquer das situações mencionadas, o mais complexo numa análise é
determinar quais valores devem ser designados para as avaliações estatísticas
dos resultados oferecidos pelos laboratórios participantes de um programa de
comparação interlaboratorial. Como valor designado entende-se aquele que
melhor estima o valor verdadeiro (AOAC, 1993).
Geralmente, em ensaios de proficiência, estes valores são estabelecidos
como os "verdadeiros", pelo órgão competente que o patrocina. Os laboratórios
que se submetem não questionam os valores designados utilizados na avaliação
estatística, por entenderem que a entidade que oferece o programa esteja
imbuída de sua autoridade. Já no caso da compatibilização de resultados, estes
valores podem ser estabelecidos por consenso.
Nos programas para certificação de materiais de referência, geralmente,
são escolhidos os laboratórios de maior hierarquia na escala metrológica, ou
seja, laboratórios de metrologia, de instituições públicas reconhecidas, ou
especialistas que podem demonstrar sua capacidade metrológica.
A princípio, não existem os valores verdadeiros e, não havendo critério
suficiente para defini-los, utilizam-se, por consenso, a média e o desvio padrão
do conjunto de resultados apresentados pelos laboratórios, correndo-se o risco de
aceitação de quase todos eles (tanto faz usar, por exemplo, o método do Z-score
como a Elipse de Confiança de Youden). De acordo com Wong (2005), muitas
variáveis influenciam estes valores, como, por exemplo, número de
participantes, homogeneidade dos itens de ensaios distribuídos, precisão dos
métodos e repetibilidade dos resultados dos laboratórios.
Enfim, pode-se dizer que todos os programas citados têm o propósito de
avaliar o desempenho de laboratórios. O que distingue uma situação da outra são
os objetivos para os quais a avaliação se propõe. Nesse trabalho, o programa
interlaboratorial proposto seguiu as características de um ensaio de proficiência
para área de sementes.
128
4.2 Ensaios de proficiência
Apesar de existirem vários tipos de programas de ensaios de
proficiência, como descrito no ABNT ISO/IEC guia 43-1 (ABNT, 1999), todos
possuem uma característica em comum: os resultados de um laboratório de
ensaio são comparados com aqueles obtidos por um ou mais participantes do
programa (AOAC, 1993).
Os benefícios advindos da inserção neste tipo de programa
interlaboratorial incluem que o laboratório participante dispõe de uma avaliação
externa regular e independente da qualidade de seus resultados, podendo
comparar o seu desempenho com o de outros laboratórios semelhantes e os
dados obtidos podem servir de subsídio para a implementação de ações
preventivas para a melhoria dos procedimentos do laboratório (Instituto
Nacional de Metrologia, INMETRO, 2005)
No ensaio de proficiência, os materiais enviados aos laboratórios devem
ser estáveis e homogêneos, para que qualquer variabilidade significativa
observada não seja atribuída aos mesmos.
No caso da área de sementes, a ISTA promove ensaios de proficiência
que são realizados por escopo15. Os laboratórios credenciados da área são
obrigados a participar, sendo permitida também a adesão voluntária de
laboratórios credenciados em outros escopos que queiram aferir-se, bem como
os não credenciados (ISTA, 2007).
Outra característica dos ensaios de proficiência da ISTA é que são
realizadas pelo menos duas avaliações anuais, sendo cada uma delas chamada de
15 Escopo - Define as atividades de um laboratório para o qual demonstrou a sua competência e que são abrangidas por um sistema que proporciona confiança na capacidade do laboratório para cumprir os critérios estabelecidos. O escopo do credenciamento é um resumo do trabalho do laboratório, mas detalhado o suficiente para tornar a distinção entre os seus diferentes elementos. É baseada em métodos e espécies individuais ou grupos de espécies, conforme o caso (ISTA, 2007).
129
rodada. Para o teste de germinação, geralmente, realizam-se três rodadas por ano
e a avaliação final é feita no período de três anos, ou seja, a cada rodada, o
laboratório vai acompanhando o seu desempenho, recebendo classificações
parciais e, ao final, ainda recebe uma classificação geral.
Nos ensaios de proficiência da ISTA, o procedimento estatístico
utilizado é o método do Z-score. Assim, a proposta deste trabalho foi verificar se
outras técnicas estatísticas poderiam auxiliar e/ou aperfeiçoar a análise dos
resultados de um ensaio de proficiência na área de sementes. Para tal, foram
avaliados mais três procedimentos: método Campos, análise de agrupamento e
análise generalizada de Procrustes. O primeiro foi proposto, inicialmente, para a
avaliação de um programa interlaboratorial na área de solos e os outros dois são
técnicas multivariadas usados em diversos contextos (Figura 34).
Vale ressaltar que é possível utilizar o contexto multivariado no ensaio
de proficiência, no sentido de que, para cada laboratório, sempre são distribuídas
duas ou mais amostras e essas podem ser tratadas como as variáveis
explicativas.
130
FIGURA 34 Resumo esquemático das técnicas estatísticas utilizadas na avaliação de um ensaio de proficiência na área de sementes
131
4.3 Método do Z-score
A técnica de Z-score é adotada quando se deseja avaliar o desempenho
técnico de laboratórios, principalmente em ensaios de proficiência, fornecendo
boa indicação da competência analítica do laboratório. O princípio deste método
é calcular Z-scores baseados na determinação do valor de referência aceito,
representado pela estimativa da média, após a retirada dos valores discrepantes
(ISTA, 2007).
Com os valores do Z-scores são calculados os índices de viés, precisão e
exatidão para cada laboratório (Figura 35).
A avaliação de desempenho do laboratório, por exemplo, para o teste de
germinação, segue o seguinte critério: 2Z ≤ indica desempenho satisfatório; se
2 3Z< < , o desempenho é questionável e, quando 3Z ≥ , o desempenho é
considerado não satisfatório.
No programa do ensaio de proficiência da ISTA, estes critérios são
adaptados, pois, a cada rodada, são enviadas três amostras para cada laboratório,
senso assim somados os Z-scores calculados para cada uma delas e atribuída a
seguinte classificação:
A - soma absoluta do Z-scores ≤ 3,5;
B- 3,5 < soma absoluta do Z-scores ≤ 5,3;
C - 5,3 < soma absoluta do Z-scores ≤ 7,0 e
BMP (below minimum performance) - soma absoluta do Z-scores > 7,0.
Estas classificações são convertidas em “notas”, em cada rodada e a
classificação, ao final de seis rodadas, fica definida como descrito na Tabela 26.
132
FIGURA 35 Esquema de um ensaio de proficiência na área de sementes, com ênfase no Método do Z-score
TABELA 26 Classificação geral de todos os testes, baseados nas notas após 6 rodadas
Classificação por rodada Nota atribuída Intervalo Classificação geral
A 5 28-30 A B 4 21-27 B C 3 16-20 C
BMP 0 Abaixo de 16 BMP Fonte: The ISTA Proficiency Test Program (ISTA, 2007).
133
4.4 Método Campos
O método denominado Campos, neste estudo, se refere à proposta
metodológica estatística apresentada por Campos (1998). De fato este autor, já
tinha realizado algumas alterações no método originalmente denominado de
PROFERT, proposto por Oliveira et. al. (1995).
Segundo Campos et. al. (1999), o método do PROFERT pode ser
utilizado para avaliar resultados de um programa de controle de qualidade das
análises de laboratórios de solos, por meio de técnicas da estatística básica.
Nos estudos de Campos (1998), foram comparados os métodos de
Waeny e PROFERT, associados ao método gráfico da elipse de confiança de
Youden em dois conjuntos de dados: um ensaio real e outro simulado no
contexto de um programa interlaboratorial na área de solos, sendo verificada
uma maior adequação nas situações propostas do método PROFERT em
detrimento das outras duas técnicas.
O método PROFERT baseia-se em propriedades da distribuição normal
de probabilidade, para a construção de faixas de confiança para mediana
(considerada como valor de referência), obtendo-se a estimativa da exatidão de
um laboratório. A precisão pode ser determinada por meio de um índice de
imprecisão, de acordo com um intervalo de confiança para a razão de variâncias.
No PROFERT, a exatidão e a precisão são quantificadas, sendo
considerados exatos todos os laboratórios que possuam, pelo menos, 67% de
exatidão e precisos se apresentam também, no mínimo, 67% de índice de
precisão. Ao final, recebem uma atribuição de selos com os seguintes critérios:
nenhum selo, se forem inexatos; selo prata, se forem exatos, porém, imprecisos e
selo ouro, classificados como exatos e precisos (Figura 36).
134
FIGURA 36 Esquema de um ensaio de proficiência na área de sementes, com ênfase no método Campos
4.5 Análise de agrupamento
Segundo Mingoti (2005), o objetivo da análise de agrupamento é dividir
os elementos de uma amostra ou população em grupos, de forma que os
elementos pertencentes a um mesmo grupo sejam similares entre si com relação
às variáveis avaliadas e as observações em grupos diferentes sejam heterogêneas
para estas mesmas características.
Nenhuma suposição é feita a respeito do número de grupos ou de sua
estrutura. Assim, o princípio dessa técnica é agrupar elementos de acordo com
suas similaridades.
135
Para esse procedimento, é necessário definir, primeiro, as medidas de
similaridade ou de dissimilaridade que serão utilizadas. Se as medidas forem de
dissimilaridade, quanto menores os seus valores, mais similares são os
elementos que estão sendo comparados. A segunda etapa se refere à
determinação do método de agrupamento.
Existem diversos tipos de medidas de dissimilaridade, e a escolha por
uma delas depende de alguns fatores, dentre eles, o tipo de variável em estudo.
No caso das variáveis quantitativas, podem ser utilizadas, por exemplo, distância
de Minkowsky, distância generalizada ou ponderada, distância euclidiana e
distância Manhattan ou quarteirão (city block), sendo essas duas últimas casos
particulares da distância de Minkowsky.
De acordo com Ferreira (2008), a distância euclidiana é apropriada para
os casos em que os grupos de variáveis possuem escalas similares, pois, caso
contrário, variáveis com maior variabilidade irão dominar a classificação das
distâncias. No contexto de um ensaio de proficiência, as medidas das variáveis
(amostras) sempre têm a mesma escala.
Quanto aos métodos de agrupamento, existem também diversos tipos e o
pesquisador deve decidir qual o mais adequado ao seu propósito, uma vez que
diferentes técnicas podem levar a diferentes soluções (Souza et al., 1997).
Segundo Bussab et al. (1990), todos os métodos baseiam-se um duas ideias
básicas: coesão interna dos elementos e isolamento externo entre os grupos.
Os métodos de agrupamentos são divididos em hierárquicos e não
hierárquicos. Segundo Rencher (2002), nos métodos não hierárquicos, o número
de grupos deve ser definido previamente e os elementos são alocados de forma
otimizada; já os hierárquicos são aqueles em que os elementos são classificados
em grupos em etapas diferentes, ou seja, de modo hierárquico, produzindo,
como resultado final, um gráfico denominado dendrograma (Figura 37). Os
136
dendrogramas apresentam os elementos e os respectivos pontos de junção ou de
divisão dos grupos formados em estágio (Ferreira, 2008).
Um método hierárquico é dito aglomerativo quando o processo de
agrupamento inicia-se com g grupos, cada um contendo um dos elementos e
termina com um único grupo formado por todos os elementos.
05
1015
20
Grupos
Med
ida
das
dist
ânci
as
lab5
lab2
lab3
lab1
lab4
FIGURA 37 Exemplo de um dendrograma para o método de agrupamento
hierárquico aglomerativo com cinco laboratórios, a partir dos dados de um teste de germinação
As técnicas aglomerativas mais utilizadas são: métodos do vizinho mais
próximo, do vizinho mais distante, da ligação média, do centroide, da mediana e
de Ward. Não existe uma recomendação específica sobre qual método é o mais
adequado para um conjunto de dados, mas, de acordo com Totti et al. (2001), o
método da ligação média é bastante utilizado.
137
Uma das formas de escolher o método de agrupamento pode ser por
meio de comparação dos valores da correlação cofenética, isto é, o método
selecionado será aquele que apresentar a maior correlação cofenética. Essa
correlação é uma medida da qualidade do ajuste, pois mede o grau de
preservação das distâncias emparelhadas pelo dendrograma resultante do
agrupamento em relação às distâncias originais (Ferreira, 2008).
A determinação do número final de grupos também é uma etapa
importante no procedimento de agrupamento, ou seja, apesar de o método
aglomerativo terminar sempre com a formação de um único grupo, essa pode
não ser a junção ideal ou natural. Mingoti (2005) afirma que, em termos de
variabilidade, no estágio inicial tem-se a partição com menor dispersão possível,
já que todos os grupos têm um único elemento. Logo, a variância de cada um
deles é igual a zero e, no estágio final, tem-se a maior dispersão interna possível.
Desse fato decorre a necessidade de buscar uma partição natural dos
elementos, estabelecendo um ponto de corte. Um critério que vem sendo
utilizado é o proposto por Mojena (1977), que leva em consideração a média e o
desvio padrão das distâncias para a determinação de uma regra de decisão
(Figura 38).
Em síntese, a utilização da técnica de análise de agrupamento para
análise dos resultados no contexto de ensaio de proficiência parece ser
apropriada, uma vez que os laboratórios que apresentem desempenhos similares
devem se agrupar naturalmente e, por conseguinte, devem formar grupo(s)
isolado(s) os de piores desempenhos. Quanto ao tipo de agrupamento, pelo
exposto, o hierárquico aglomerativo pode ser indicado, porque, de fato, os
laboratórios não estariam reunidos em grupos pré-estabelecidos e tê-los
inicialmente em grupos separados, verificando passo a passo as junções, pode
ser mais adequado.
138
FIGURA 38 Esquema de um ensaio de proficiência na área de sementes com
ênfase na análise de agrupamento
4.6 Análise generalizada de Procrustes
Desenvolvida em meados de 1970, a análise generalizada de Procrustes
(cuja sigla em inglês é GPA) surgiu para resolver um problema puramente
matemático e acabou tendo enorme impulso pela sua aplicação prática,
particularmente no campo da análise sensorial (Ferreira & Oliveira, 2007).
No contexto da GPA (Gower, 1975) há sempre três elementos presentes:
os indivíduos, os objetos e as variáveis. Por exemplo, para a análise sensorial,
geralmente, os indivíduos são os provadores, os objetos são os alimentos e as
139
variáveis são os atributos desses alimentos (sabor, aroma, etc.). Fazendo um
paralelo para um ensaio de proficiência na área de sementes, os indivíduos
podem ser considerados como sendo as repetições de um determinado teste, os
objetos, os laboratórios e as variáveis, as amostras. Portanto, assim como a
análise sensorial busca, por meio da sensiometria, caracterizar um grupo de
alimentos ao longo dos provadores, a GPA, neste contexto, busca caracterizar os
laboratórios ao longo das repetições.
A GPA, em linhas gerais, procura ajustar os dados vindos de vários
indivíduos para obter uma configuração de consenso, minimizando as diferenças
geométricas. Para tal, todos os m conjuntos de dados são simultaneamente
transladados, rotacionados e multiplicados por um fator de escala, enquanto um
critério de qualidade de ajuste é otimizado (Ferreira et al., 2008).
Um dos resultados da GPA é um plano-resposta que é formado por dois
eixos principais representando combinações lineares das variáveis em que os
objetos foram originalmente avaliados. Esse plano mostra cada objeto como um
ponto (Ferreira & Oliveira, 2007).
Ferreira et al. (2007) verificaram, em seus estudos, a importância de
determinar uma distância mínima significativa entre objetos no plano-resposta,
sendo, então, proposta por esses autores a estimação de uma região de confiança
ao redor de cada ponto (objeto) via técnica de reamostragem Bootstrap. Nos
casos em que ocorria a interseção entre elipses, um teste de hipóteses Bootstrap
era então estabelecido para decidir a significância sobre a distância euclidiana
entre tais pontos (Ferreira & Oliveira, 2007).
Logo, parece promissora a proposição do uso dessa técnica para análise
dos resultados de um ensaio de proficiência, uma vez que é razoável supor que
laboratórios (objetos) que tenham desempenhos similares serão identificados
pelas interseções entre as suas elipses e, por conseguinte, os mais discordantes
140
ficarão geometricamente distantes dos demais, com um determinado grau de
confiança pré-estabelecido (Figura 39).
FIGURA 39 Esquema de um ensaio de proficiência na área de sementes com
ênfase na GPA
141
5 MATERIAL E MÉTODOS
Nesta seção são apresentados os procedimentos utilizados para a geração
do banco de dados, bem como a descrição metodológica das técnicas estatísticas
adotadas nesse estudo.
5.1 Dos dados
Como não houve tempo hábil para a coleta de dados reais, foi feita a
opção pela utilização de um exemplo ilustrativo com dados simulados. Deve-se
ressaltar que o procedimento de simulação utilizado aqui não se presta a
comparação entre métodos, quando então simulação implica em reamostragem.
Nesta tese, simulação é um procedimento que gera uma massa de dados apenas
para efeito ilustrativo. Ainda deve se salientar que esta geração de dados
ilustrativos utilizou valores de parâmetros condizentes com a realidade, como
será explicitado a seguir. Assim, para gerar o banco de dados, foram realizadas
três simulações, cada uma representando os resultados de um teste de
germinação com doze laboratórios participantes.
Esses doze laboratórios formaram uma composição de dois grupos
discrepantes em relação a algum(ns) parâmetro(s) estatístico(s), como a média e
a matriz de variâncias e covariâncias. Para a definição dos parâmetros da
simulação, foram utilizados os resultados de germinação de alguns lotes e
laboratórios selecionados do capítulo 2 (Figura 40).
O grupo 1 foi composto por dez laboratórios e o grupo 2, por apenas
dois laboratórios. A determinação do número de laboratórios por grupo foi
estabelecida por uma decisão empírica, já que, num ensaio de proficiência,
espera-se que os resultados de laboratórios credenciados não sejam muito
discordantes. Assim, foram inseridos apenas dois laboratórios com alguma
142
medida de discrepância para avaliar se as técnicas seriam adequadas para
detectar tais diferenças.
FIGURA 40 Resumo esquemático da seleção do laboratórios e lotes do capítulo 2, para a determinação dos parâmetros das simulações
143
O critério para a escolha dos lotes foi baseado no princípio, já
comentado anteriormente, de que o grupo 1 ficasse discrepante do grupo 2.
Logo, para o primeiro grupo, optou-se pelos lotes que foram caracterizados, no
capítulo 2, como de qualidade superior (lotes 1 e 3) e, para o outro grupo, foi
selecionado o lote considerado inferior (lote 2). Quanto aos laboratórios, foram
selecionados os quatros primeiros que finalizaram as suas análises.
Escolhidos os lotes e os laboratórios do capítulo 2, foram calculadas as
médias e as matrizes de variâncias e covariâncias para a definição dos
parâmetros das simulações, considerando as três repetições, denominadas, neste
contexto, de amostras (Tabelas 27 e 28).
TABELA 27 Proporções médias de germinação das três amostras, para os grupos 1 e 2, de acordo com os dados do capítulo 2
Grupo Amostra 1 2 3
1 0,94375 0,93712 0,94137 2 0,63875 0,63750 0,62250
¹ Os dados não foram simulados na forma percentual.
TABELA 28 Variâncias e covariâncias das três amostras, para os grupos 1 e 2,
de acordo com os dados do Capítulo 2
Grupos Amostra Amostra 1 2 3
1 1 0,00136 0,00064 0,00077 2 0,00162 0,00108 3 0,00136
2 1 0,00792 -0,00001 0,00149 2 0,00890 -0,00010 3 0,00767
*Para cada grupo, os valores da diagonal correspondem às variâncias e os demais valores as covariâncias, por exemplo, ( )1 2, 0,00001Cov a a = − .
144
Com os parâmetros iniciais definidos, foram geradas as três simulações,
sob as seguintes condições:
• simulação 1: médias iguais entre os dois grupos e matriz de
variâncias e covariâncias diferentes;
• simulação 2: médias diferentes e matrizes de variâncias e
covariâncias iguais entre os grupos;
• simulação 3: médias e matrizes de variâncias e covariâncias
diferentes.
As simulações foram realizadas considerando, para o i-ésimo grupo
( )1,2i = , a variável aleatória porcentagem de germinação como normais
multivariadas ( )~ ,i i iN ∑Y μ , em que iY é a matriz de proporção de germinação
com dimensões vxq, sendo rv n p= ( rn é o número de repetições e p é o número
de laboratórios) e q o número de amostras; iμ é o vetor de médias das q
amostras e i∑ é a matriz de variâncias e covariâncias das q amostras.
Apesar da recomendação da ISTA (2007) para a realização de seis
rodadas nos ensaios de proficiência, neste estudo foi considerada apenas uma
rodada, pois não teria sentido prático utilizar, nas simulações, os mesmos
parâmetros estatísticos para a geração dos resultados das demais rodadas.
5.2 Das técnicas estatísticas
Foram estabelecidos quatro procedimentos estatísticos para avaliar o
desempenho dos laboratórios nesse ensaio de proficiência simulado: o método
do Z-score, o método Campos, a análise de agrupamento e a análise generalizada
de Procrustes. A porcentagem de germinação ( )Y foi a variável aleatória em
estudo.
145
Os procedimentos, com exceção da análise generalizada de Procrustes,
foram descritos em forma de etapas apenas para fins didáticos.
5.2.1 Método do Z-score
Para calcular os índices de viés, exatidão, precisão de cada laboratório
utilizando o método do Z-score, foi seguida a metodologia adotada nos ensaios
de proficiência da ISTA (2002):
1 ª etapa: identificação de valores discrepantes (outliers)
Nesta etapa, o laboratório foi considerado como outlier, se a estimativa
da sua média, numa determinada amostra (a-ésima amostra), não estivesse
contida num intervalo de confiança para a mediana dado por: * *
( ) ( 2; ) ( 2; ); ,a a a a a a aIC Y S t Y S tγ α η α η⎡ ⎤= − +⎣ ⎦ (23)
em que aY é o estimador da mediana para a variável aleatória porcentagem de
germinação (Y); *aS é o estimador do desvio padrão dos valores acima da
mediana; ( 2; )at α η é o quantil ( )100 1 2 %α− da distribuição t de Student com
graus de liberdade ( )– 1Mnη = , sendo Mn o número de laboratórios que têm
valores acima da mediana, γ é o grau de confiança e ( )1α γ= − .
Um exemplo teórico da organização dos dados e dos cálculos auxiliares
para esta etapa do método do Z-score pode ser observado na Tabela 29
146
TABELA 29 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a identificação de valores discrepantes pelo método do Z-score nos resultados de um teste de germinação em q amostras com p laboratórios
Amostra 1 … Amostra q Lab Média Média
1 11Y 1qY
… … … … p 1pY qpY
Mediana - aY 1Y qY
Desvio padrão (acima da mediana) - *aS *
1S *qS
* Um exemplo numérico pode ser observado no ANEXO B (p. 220)
2 ª etapa: determinação do Z- score
Considerando apenas os laboratórios aceitáveis, ou seja,
desconsiderando os outliers, em cada amostra foram calculados os valores de aY
(estimador da porcentagem média de germinação da a-ésima amostra) e aS (estimador do desvio padrão da a-ésima amostra).
Em seguida, foi calculado o Z- score para cada laboratório numa
determinada amostra ( alZ ), inclusive para os valores discrepantes, de acordo
com a expressão (24).
( ),al a
ala
Y YZ
S−
= (24)
em que alY é o estimador da porcentagem média de germinação do l-ésimo
laboratório na a-ésima amostra.
147
3 ª etapa: classificação numa rodada
A classificação dos laboratórios com as designações A, B, C ou BMP foi
feita de acordo com as regras da ISTA (Tabela 26, seção 4.3), somando-se o Z
score absoluto de todas as amostras:
1| | ,
q
l ala
Z Z=
=∑ (25)
em que q é o número de amostras.
Com o valor de lZ , foi atribuída à nota T ln : 5, 4, 3 ou 0, para cada
laboratório, também de acordo com as regras da ISTA para apenas uma rodada.
4 ª etapa: cálculo do viés
Para o cálculo do viés de cada laboratório foi determinada a média do
Z- score utilizando a expressão (2.4).
1
q
ala
l
ZV
q==∑
(26)
Para valores de V superiores a 1,5 recomenda-se que o laboratório revise
todos os seus procedimentos (ISTA, 2002).
5 ª etapa: cálculo da precisão
A medida da precisão para o l-ésimo laboratório foi determinada em
função do viés e do Z-score, de acordo com a expressão (27).
( )( )2
1 ,
q
al lI a
l
Z VP
q=
−=∑
(27)
148
6 ª etapa: cálculo da exatidão
A medida da exatidão do l-ésimo laboratório foi obtida, em função do
viés e da precisão, pela expressão (28).
( ) ( ) ( )( )22I Il l lE V P= + (28)
Para ( )0,000 1,499IlE< < , o laboratório teve exatidão considerada como
aceitável,; para ( )1,500 1,999IlE< < , crítica e para ( ) 2,000I
lE ≥ , inaceitável
(ISTA, 2002).
Um exemplo teórico da organização dos dados e dos cálculos auxiliares,
bem como a sumarização das fases para a aplicação do método do Z-score, pode
ser observado na Tabela 30 e na Figura 41, respectivamente.
TABELA 30 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para determinação do Z-score ( )| |lZ , viés ( )lV , precisão ( )( )I
lP e
exatidão ( )( )IlE , pelo método do Z-score, nos resultados de um
teste de germinação em q amostras com p laboratórios
Amostra 1 … Amostra q
1
q
ala
Z=∑ | |lZ lV ( )I
lP ( )IlE
Lab Z-score Z-score 1 11Z 1qZ 1Z 1| |Z 1V ( )
1IP ( )
1IE
… … … … … … … … … p 1pZ qpZ pZ | |pZ pV ( )I
pP ( )IpE
Média - aY 1Y qY Desvio padrão - aS 1S qS * Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 221-222)
149
FIGURA 41 Resumo esquemático do método do Z-score no contexto de um ensaio de proficiência
Y
Y
150
5.2.2 Método Campos (1998)
Para calcular a precisão e a exatidão de cada laboratório, utilizando o
método Campos, foi seguida a metodologia adotada por Campos (1998), com
algumas adaptações para o contexto deste estudo.
1 ª etapa: identificar valores discrepantes (outliers)
Para identificar e eliminar os outliers, foram utilizadas estatísticas
robustas, especificamente os quartis e o intervalo interquartílico para k-ésima
repetição e a-ésima amostra
( ) ( ) ( ) ( )0,75 0,25ˆ ˆˆ ˆ; ,
2 2ak ak ak akB BY Yδ δ⎛ ⎞− +⎜ ⎟
⎝ ⎠ (29)
em que ( )0,25ˆ
akY é o estimador do quantil para porcentagem de germinação com
frequência de 25% acima (3º quartil), ( )0,75ˆ
akY é o estimador do quantil com
frequência de 75% acima (1º quartil), ( ) ( ) ( )0,25 0,75ˆ ˆ ˆ
ak ak akY Yδ = − é o estimador do
intervalo interquartil; B é definido como sendo 1 1, para 0d B B= − > .
Fazendo 1d variar de 0 a 9, e consequentemente B variando de 1 a 10, foi
considerada como outlier toda a determinação que tivesse discrepância16 1 2d > ,
ou seja, que estivesse fora do intervalo ( ) ( ) ( ) ( )0,75 0,253 3ˆ ˆˆ ˆ;2 2ak ak ak akY Yδ δ⎛ ⎞− +⎜ ⎟
⎝ ⎠,
devendo ser retirado para o procedimento da 2ª etapa.
16 A medida de discrepância para uma determinação Y indica que Y não é aceito como sendo um valor próximo do verdadeiro valor que, neste caso, é a mediana, isto é, Y não é um valor aceitável para a característica em questão (Campos, 1998).
151
Neste caso, entendeu-se como determinação de Y como sendo alkY , que
é porcentagem de germinação da k-ésima repetição do l-ésimo laboratório na
a-ésima amostra.
Um exemplo teórico da organização dos dados e dos cálculos auxiliares
para esta etapa do método de Campos pode ser observado na Tabela 31.
TABELA 31 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a determinação dos limites inferiores e superiores e valores de d1, pelo método Campos, nos resultados de um teste de germinação em q amostras com p laboratórios e nr repetições
Amostra 1 … Amostra q
B Repetição
d1
B Repetição
d1 1 2 … nr 1 2 … nr
1 Li
0 … 1 Li
0 Ls Ls
… Li
… … Li
1 Ls Ls
10 Li
9 … 10 Li
9 Ls Ls
( )1 0,75ˆ
kY … ( )0,75ˆ
pkY
( )1 0,25ˆ
kY … ( )0,25ˆ
pkY
( )1ˆ
rδ … ( )ˆ
pkδ
* Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 223-224)
2 ª etapa: cálculo da medida de discrepância 2d
a) Foram estabelecidos intervalos de confiança para a mediana da k-ésima
repetição e a a-ésima amostra:
152
( ) ( )
( ) ( )( ) ( ) ( )( )1 1 2 2 , ,
( 1) ; ; ( 1) ,
i s i s
ak ak ak akmd ak md ak md ak md ak
L L L L
Y B S Y BS Y BS Y B S
∪
− + − ∪ + + + (30)
em que akY é o estimador da mediana; ( )
2
'.2
akmd ak
ak
SSn
π= é o estimador do desvio
padrão da mediana, sendo 2akS o estimador da variância, '
an o novo tamanho da
amostra após a retirada dos outliers na 1ª fase ( 'ak akn n≤ ), com akn sendo o
número de observações iniciais.
b) Foi determinado o valor de outra medida de discrepância para a determinação
de Y , denominada 2
0, se 01, se 0
Bd
B B=⎧
= ⎨ − >⎩. Assim, fazendo 2d variar de 0 a 9,
cada determinação de Y recebeu uma classificação, de acordo com o intervalo
em que estivesse contido.
Um exemplo teórico da organização dos dados e dos cálculos auxiliares
para esta etapa do método de Campos pode ser observado na Tabela 32.
153
TABELA 32 Exemplo teórico da organização dos dados e de cálculos auxiliares para a determinação dos limites inferiores e superiores e valores de 2d , pelo método Campos, nos resultados de um teste de germinação em q amostras com p laboratórios e rn repetições
Amostra 1 … Amostra q
B Repetição
d2
B Repetição
d2 1 2 … nr 1 2 … nr
0 Li1
0
0 Li1
0 Ls1= Li2 Ls1= Li2 Ls2 Ls2
…
…
… …
9 Li1
10
9 Li1
10 Ls1= Li2 Ls1= Li2 Ls2 Ls2
1kY … qkY 2
1kS … 2qkS
'1kn … '
qkn
( )1md kS … ( )md qkS * Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 225)
3 ª etapa: cálculo da exatidão
Após o cálculo de d1 e d2, foi proposto o cálculo da exatidão do l-ésimo
laboratório como segue:
( )( ) 100% ,
18II l
ll
TEn
= − (31)
em que lT é a soma das discrepâncias d1 e d2 de todas as repetições ( )lrn e
amostras ( )q numa única rodada; ln é o número de resultados total ( )ln q .
154
4 ª etapa: cálculo da precisão
Para determinar a precisão do l-ésimo laboratório, foi necessária a
utilização de três medidas auxiliares: variância mínima inerente, variância
observada e imprecisão, como descrito a seguir.
a) Variância mínima inerente – variância das determinações em que a soma das
discrepâncias 1d com 2d era igual a zero
Foi calculado primeiro o efeito para cada amostra ( )2min( )aS e, depois, o
efeito geral ( )2minS .
"
''
2
12"
12min( ) " ,
1
a
a
n
aini
aii a
aa
YY
nSn
=
=
⎛ ⎞⎜ ⎟⎜ ⎟⎝ ⎠−
=−
∑∑
(32)
" 2min( )
2 1min
"
1
,
q
a aa
q
aa
n SS
n
=
=
=∑
∑ (33)
em que "an (1< "
an < na) será o numero de determinações em que a soma das
discrepâncias 1d e 2d é zero para a-ésima amostra.
b) Variância observada – variância para cada laboratório com os dados de todas
as amostras, independente das discrepâncias 1d e 2d
2
1 12
1 12( ) ,
1
lr
lr
nq
alknqa k
alka k l
obs ll
YY
nSn
= =
= =
⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠−
=−
∑∑∑∑
(34)
155
c) Cálculo do índice de imprecisão
( )1 2
2( )
2min ,
1. ,obs ll
SI h
S Fα η η
⎛ ⎞⎜ ⎟=⎜ ⎟⎝ ⎠
(35)
em que ( )h ⋅ representa o maior inteiro menor que o argumento; ( )1 2,Fα η η é o
quantil ( )100 1 %α− da distribuição F com 1 ( 1)lnη = − e
"2
11
q
aa
nη=
⎛ ⎞= −⎜ ⎟⎝ ⎠∑ graus de liberdade.
d)Precisão:
( ) .1001009
II ll
IP ⎛ ⎞= − ⎜ ⎟⎝ ⎠
(36)
5 ª etapa: classificação dos laboratórios
O laboratório foi considerado exato e preciso se os valores de ( )IIlE e
( )IIlP , respectivamente, tivessem sido superiores a 67%17, recebendo a seguinte
classificação por selos:
nenhum selo – inexatos e imprecisos;
selo bronze18 – inexatos e precisos;
selo prata – exatos e imprecisos;
selo ouro – exatos e precisos.
17 O valor determinado como limite para a exatidão e precisão (67%) foi resultado de discussões e de um consenso entre profissionais das áreas de estatística e de fertilidade dos solos (Campos, 1998). 18 Esta classificação com atribuição do selo bronze não existia na proposta original de Campos (1998).
156
Um exemplo teórico da organização dos dados e dos cálculos auxiliares
para as etapas de 3 a 5 do método de Campos, bem como a sumarização dos
procedimentos, pode ser observado na Tabela 33 e na Figura 42,
respectivamente.
TABELA 33 Exemplo teórico da organização dos dados e cálculos auxiliares para a determinação da exatidão ( )( )II
lE , da precisão ( )( )IIlP e da
classificação dos laboratórios pelo método Campos nos resultados de um teste de germinação em q amostras com p laboratórios e nr repetições
Lab. lT nl
( )IIlE "
1n "2n 2
min(1)S 2min(2)S 2
minS 2( )obs lS lI ( )II
lP Clãs. 1
… p
* Um exemplo numérico pode ser observado no Anexo B (p. 226)
157
FIGURA 42 Resumo esquemático do método de Campos no contexto de um ensaio de proficiência
Y
2d
( )1 2d >
158
5.2.3 Análise de agrupamento
Para o uso desta técnica foram consideradas apenas as médias de cada
laboratório por amostra. A metodologia utilizada está de acordo com Ferreira
(2008) e Mingotti (2005), com algumas adaptações para o contexto deste estudo.
1ª etapa: escolha do critério de parecença
Neste estudo adotou-se a distância euclidiana como medida de
dissimilaridade entre dois objetos k e j, e que determina a distância física entre
dois objetos, considerando o espaço euclidiano.
2ª etapa: escolha do algoritmo de agrupamento
Foi selecionado o método da ligação média19 ou média das distâncias, no
qual a distância entre grupos é calculada pela média das distâncias entre todos os
pares de elementos dos dois grupos que estão sendo comparados.
As fases para o desenvolvimento do algoritmo estão descritas a seguir.
1ª fase
Inicialmente, o número de grupos estabelecidos foi igual ao número de
laboratórios, ou seja, 12 grupos com um laboratório cada, sendo calculada a
distância euclidiana entre dois grupos quaisquer ( )e i j , de um laboratório cada
(expressão 37).
( )2
. .1
,q
ij ai aja
d Y Y=
= −∑ (37)
19 A escolha por este método foi baseada em estudo comparativo, no qual o valor da correlação cofenética para este método foi superior aos dos métodos do vizinho mais próximo, do vizinho mais distante, centroide, mediana e Ward. Esses resultados não serão apresentados neste trabalho.
159
em que q é igual ao número de amostras; .iaY é o estimador da porcentagem
média de germinação do i-ésimo grupo (laboratório) na a-ésima amostra; .jaY é
o estimador da porcentagem média de germinação do j-ésimo grupo na a-ésima
amostra.
Em seguida, foi montada uma matriz de distâncias e observada a
combinação com o menor valor de ijd , estabelecendo-se, assim, os dois
laboratórios que passaram a constituir um novo grupo.
2ª fase
Com o primeiro grupo formado, atualizou-se a matriz de distâncias
calculando-se a distância entre o grupo recém-criado e os grupos remanescentes,
utilizando-se o critério de tomar a média das distâncias entre todos os pares de
elementos que podem ser formados com os elementos dos dois grupos que estão
sendo comparados. Assim, se o grupo iG tem in elementos e o grupo jG tem
jn elementos, a distância entre eles pode ser definida por:
( ), .i j
mqi j
m G q G i j
dd G G
n n∈ ∈
= ∑ ∑ (38)
Este processo foi então repetido, até se formar apenas um único
grupo ( )1g = e, com os valores de distâncias obtidos em cada passo do processo
iterativo, foi construído o dendrograma, indicando-se os grupos que foram
formados e as distâncias correspondentes.
3 ª etapa: determinação do número de grupos
Para a determinação do número de grupos g, foi utilizado o critério
proposto por Mojena (1977), que aperfeiçoa a qualidade do ajuste do
160
agrupamento aos dados. Isto é, foi escolhido o número de grupos dado pelo
primeiro estágio no dendrograma, no qual
m aSα α φ> + (39)
em que 1,2,...,m p= , sendo p o número máximo de grupos (neste contexto o
número de laboratórios); mα é o valor da distância para o estágio da junção
correspondente a 1p m− + grupos, α e aS são estimadores da média e o desvio
padrão dos 'sα distâncias; φ é uma constante.
Millingan & Cooper (1985) sugerem utilizar 1,25φ = , baseados em
resultados de simulação.
4 ª etapa: validação do agrupamento
Para validar o agrupamento foram comparadas as distâncias
efetivamente observadas entre os objetos (distâncias euclidianas) e as distâncias
previstas a partir do processo de agrupamento, utilizando-se a correlação de
Pearson, mas que, neste contexto, é denominada de correlação cofenética.
Quanto mais próximo de 1 melhor a qualidade de ajuste do agrupamento.
A sumarização das fases para a utilização da técnica de análise de
agrupamento pode ser observada na Figura 43.
Um exemplo numérico de todos os passos apresentados para esta técnica
pode ser observado no Anexo B.
161
FIGURA 43 Resumo esquemático da técnica de análise de agrupamento, no contexto de um ensaio de proficiência
Y
Y
162
5.2.4 Análise generalizada de Procrustes (GPA)
A seguir são apresentadas, de forma sucinta, as fases de organização e
análise de dados na GPA. A metodologia utilizada está de acordo com Ferreira
et al. (2007), com algumas adaptações para o contexto deste estudo.
Organização dos dados
Os dados foram organizados em rn matrizes de dimensões pxq , em que
rn é o número de repetições; p é o número de laboratórios e q é o número de
amostras.
Cada matriz foi denotada por kX ( )'1,..., ,..., rk r n= , tendo na linha a
porcentagem de germinação correspondente ao l-ésimo laboratório ( )1,...,l p=
e, na coluna, a a-ésima amostra ( )1,...,a q= .
'
11 1
1
q
r
p pq
x x
x x
⎡ ⎤⎢ ⎥= ⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦
X
em que ijx é a porcentagem de germinação do l-ésimo laboratório e da a-ésmia
amostra.
Análise dos dados
Como comentado na seção 4.6, geometricamente, a ideia básica da
técnica de Procrustes é procurar uma configuração de consenso que se ajuste
simultaneamente a todos os rn conjuntos de dados.
Para tal, as matrizes kX devem ser transformadas aplicando-se
sequencialmente operações matemáticas de translação, rotação e escala, de
forma que fiquem as mais parecidas possíveis.
Essa transformação pode ser expressa por:
163
( )'tk k k k ks→ −X X 1u Q (40)
em que tkX é a matriz kX transformada; ks é um fator de escala; uk é um vetor
coluna de translação (dimensão 1xp ) é que contém as médias das colunas de
kX ; 1 é um vetor linha de uns e Qk é uma matriz ortogonal que promove a
rotação.
A maneira de verificar a similaridade entre as matrizes kX é adotar um
critério de ajuste a ser otimizado, como a minimização da soma de quadrados
dos resíduos, representada por:
1
rntk
k=
= −∑S X G (41)
em que ( )'
1 1
1 1r rn nt
k k k k kk kr r
sn n= =
= − =∑ ∑G X 1u Q X , representando a média das
matrizes transformadas (com a mesma dimensão de kX ).
Assim, para resolver o problema da minimização de S, é necessário
estimar sk, uk, Qk, e determinar a matriz G, sendo utilizado, para tal, um
algoritmo iterativo.
A reamostragem Bootstrap é utilizada para permitir a inferência
estatística (intervalos de confiança e teste de hipóteses), como descrito por
Ferreira et al. (2007). Cada unidade reamostral, neste contexto, é uma das
matrizes kX que geram as estimativas de Bootstrap de localização dos objetos
(laboratórios, neste contexto).
Neste estudo, foram compostas 100 amostras de Bootstrap, resultando,
consequentemente, em 100 matrizes G, e que, para fins de visualização gráfica,
utilizaram-se apenas as duas primeiras colunas de sua projeção no espaço gerado
pelos eixos principais.
164
Vale salientar que, além dos 100 conjuntos de pontos gerados por
reamostragem Bootstrap, o conjunto de pontos proveniente da amostra original
também foi utilizado para a tomada de decisões.
Determinados os 100 pontos, foram esboçadas p elipses, com 95% de
confiança, cada uma representando geometricamente a configuração de um
laboratório. A sumarização das fases para a utilização da técnica de GPA pode
ser observada na Figura 44.
FIGURA 44 Resumo esquemático da análise generalizada de Procrustes, no
contexto de um ensaio de proficiência
( )'tk k k k ks→ −X X 1u Q
1
rntk
k== −∑S X G
sk, uk, Qk
165
5.3 Rotinas no R
Para as análises estatísticas, foram desenvolvidas funções específicas no
software R (R Development Core Team, 2008), com exceção da análise de
agrupamento, em que foram usadas as funções já implementadas. Os nomes e os
argumentos necessários para cada função podem ser observados na Tabela 34.
Vale salientar que Campos (1998) desenvolveu, numa planilha de
cálculo, as rotinas para a execução do método PROFERT e verificou que o
tempo gasto era de 32 minutos, em média, para realizar uma análise completa.
Com as rotinas desenvolvidas no software R, não foram gastos nem 2 segundos
para proceder à mesma análise, incluindo a geração automática de um relatório
completo. TABELA 34 Nome da função e argumentos necessários, de acordo com a
técnica estatística
Técnica Nome da função Argumentos
Método do Z score FunçãoZscore - nome do banco de dados. - grau de confiança
Método Campos FunçãoCampos - nome do banco de dados
Análise generalizada de Procrustes
bootGPA (desenvolvida por Ferreira, 2007)
- array de dados - nome das dimensões - lógico, diz se a transformação deve ser ortogonal (rotação) - número de reamostragens bootstrap - grau de confiança das elipses
Exemplos de alguns relatórios gerados e tipo de banco de dados podem
ser observados no Anexo E.
166
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesta seção são apresentados os resultados obtidos nas três simulações,
bem como a aplicação, para cada caso, das quatro técnicas estatísticas propostas
neste estudo.
Cada simulação correspondeu a um ensaio de proficiência, tendo como
escopo o teste de germinação realizado em doze laboratórios com três amostras e
oito repetições.
6.1 Simulação 1
Na simulação 1, os dados foram gerados utilizando-se as matrizes de
variâncias e covariâncias diferentes e médias iguais para os dois grupos, um com
10 (grupo 1) e outro com 2 ( grupo 2) laboratórios.
Dados simulados
Os resultados simulados das proporções médias de germinação e das
variâncias e covariâncias para os dois grupos podem ser observados nas Tabelas
35 e 36, respectivamente.
TABELA 35 Proporções médias de germinação das três amostras para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1.
Simulação Grupo Amostra 1 2 3
1 1 0,94132 0,93708 0,93872 2 0,95737 0,92561 0,94317
167
TABELA 36 Variâncias e covariâncias da proporção de germinação das três amostras para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1.
Simulação Grupo Amostra Amostra 1 2 3
1
1 1 0,00131 0,00052 0,00061 2 0,00154 0,00091 3 0,00107
2 1 0,00307 0,00177 0,00009 2 0,00418 -0,00124 3 0,00487
Método do Z-score
Pelos valores do Z-score dos doze laboratórios para as três amostras,
observa-se que o laboratório 3 teve dois valores na faixa de desempenho
considerada como insatisfatória ( 3Z ≥ |), assim como os laboratórios 6, 7, 10,
11 e 12, com apenas um valor cada. Os melhores desempenhos foram os dos
laboratórios 1, 4, 5 e 9 - 2Z < | (Figura 45).
168
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
123
Laboratórios
Z-sc
ore
-6-4
-20
24
6
FIGURA 45 Valores de Z-score para um ensaio de proficiência em doze laboratórios, com três amostras, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1
Levando em consideração tanto as notas como a classificação da
exatidão, verifica-se que não foi possível distinguir satisfatoriamente os dois
grupos para a simulação 1 (Tabela 37).
169
TABELA 37 Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1
Grupo Lab. Classificação Nota Viés Precisão Exatidão Classificação exatidão
1
1 A 5 0,6 1,2 1,4 Aceitável 2 A 5 1,1 1,4 1,7 Crítico 3 BMP 0 2,8 5,7 6,4 Não aceitável 4 A 5 0,5 0,1 0,5 Aceitável 5 A 5 0,6 1,2 1,3 Aceitável 6 C 3 2,1 4,1 4,6 Não aceitável 7 C 3 1,8 1,7 2,4 Não aceitável 8 B 4 1,4 0,5 1,5 Aceitável 9 A 5 0,9 0,7 1,1 Aceitável
10 C 3 2,1 4,4 4,8 Não aceitável
2 11 C 3 1,8 1,8 2,6 Não aceitável 12 BMP 0 2,6 5,5 6,1 Não aceitável
Neste contexto, o que se pode questionar é o risco que se ocorre de
classificar um laboratório como BMP, por exemplo, o laboratório 3, quando ele
deveria ter desempenho similar aos demais laboratórios do seu grupo inicial.
Esta estranheza existe pelo menos em tese, já que se está trabalhando com dados
simulados e espera-se, consequentemente, que em condições relativamente
controladas.
Assim, parece que esta técnica talvez não seja a mais adequada para a
situação em que as matrizes de variâncias e covariâncias sejam diferentes.
Mas, sem levar em consideração a discussão sobre a distinção dos
grupos, esses resultados indicam que, no contexto de um ensaio de proficiência,
os laboratórios que receberam classificação C e BMP devem ser alertados para
fazer uma revisão geral em todos os seus procedimentos e equipamentos, antes
de uma próxima rodada (ISTA, 2007), bem como aqueles que apresentaram
índice de viés acima de 1,5 (ISTA, 2002).
170
Método Campos (1998)
Pelos resultados do método de Campos foi possível classificar os
laboratórios do grupo 1 com um selo diferente do grupo 2, evidenciando as
diferenças entre os valores de precisão e exatidão para os dois grupos
(Tabela 38).
TABELA 38 Resultados do método Campos para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1
Grupo Lab. Precisão (%) Exatidão (%) Selo
1
1 93,29 88,89 Ouro 2 96,30 100,00 Ouro 3 88,89 88,89 Ouro 4 91,90 77,78 Ouro 5 97,92 100,00 Ouro 6 91,90 88,89 Ouro 7 93,29 88,89 Ouro 8 95,60 88,89 Ouro 9 93,06 100,00 Ouro
10 94,68 88,89 Ouro
2 11 81,25 66,67 Prata 12 86,57 55,56 Prata
Análise de Agrupamento
Inicialmente, utilizando-se o critério proposto por Mojena (1977), só
seria formado um único grupo, pois o ponto de corte foi igual a 4,63
( )2,51; 1,70asα = = e o valor da distância do estágio da junção correspondente a
um grupo foi 6,49, de acordo com o dendrograma (Figura 46)
171
02
46
8
Grupos
Med
ida
das
dist
ânci
as
lab1
1
lab3
lab1
2
lab6
lab1
0
lab7
lab1
lab5
lab4
lab8
lab2
lab9
Ponto de Corte
FIGURA 46 Dendrograma para o agrupamento de doze laboratórios utilizando o método da ligação média, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1
Contundo, este valor de distância foi considerado outlier pelo método de
Hampel. Logo, neste estudo, está sendo proposta uma modificação no
procedimento original do critério de Mojena, isto é, primeiro deve-se verificar
uma possível presença de um valor discrepante na medida das distâncias, para
depois calcular a média, o desvio padrão e, consequentemente, o ponto de corte.
Neste caso, o novo ponto de corte foi igual a 3,52 ( )2,10; 1,13asα = = e
a medida da distância correspondente à junção da formação de dois grupos foi
de 4,39. Assim, o laboratório 11 ficou separado dos demais laboratórios, mas
não foi possível, com o uso da técnica de análise de agrupamento, separar
também o laboratório 12.
O agrupamento pôde ser considerado de boa qualidade, pois o valor da
correlação cofenética foi igual a 86,52%.
172
Análise Generalizada de Procrustes (GPA)
De acordo com a inspeção visual do gráfico gerado pela utilização da
técnica de GPA, verifica-se que os laboratórios do grupo 2 estão relativamente
afastados do grupo 1. Este afastamento nota-se, principalmente, no laboratório
12, já que a elipse do laboratório 11 ainda intercepta numa pequena região da
elipse do laboratório 7, porém, estatisticamente (valor p = 0,2920) o suficiente
para não se poder afirmar que há discordância entre seus resultados. Contudo,
parece ser ainda uma técnica apropriada para a distinção dos laboratórios na
situação da simulação 1 (Figura 47).
FIGURA 47 Elipses de confiança de 95%, geradas pela técnica de GPA para os doze laboratórios, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 1
173
6.2 Simulação 2
Na simulação 2 os dados foram gerados utilizando-se médias diferentes
e matrizes de variâncias e covariâncias iguais para os dois grupos.
Dados simulados
Os resultados simulados das médias e das matrizes de variâncias e
covariâncias para os dois grupos podem ser observados nas Tabelas 39 e 40,
respectivamente.
TABELA 39 Proporções médias de germinação das três amostras para o
conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2
Simulação Grupo Amostra 1 2 3
2 1 0,94563 0,93079 0,93327 2 0,63152 0,62662 0,61657
TABELA 40 Variâncias e covariâncias da proporção de germinação das três
amostras para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2
Simulação Grupo Amostra Amostra 1 2 3
2
1 1 0,00128 0,00047 0,00062 2 0,00145 0,00113 3 0,00143
2 1 0,00183 0,00049 0,00110 2 0,00138 0,00086 3 0,00103
Técnicas estatísticas
No caso da simulação 2, apesar de o método Z-score não ter conseguido
distinguir satisfatoriamente os dois grupos (Tabela 41), deve-se observar que os
174
scores para as três amostras dos laboratórios 11 e 12 são bastante elevados
negativamente (Figura 48). Tal comportamento não foi observado os resultados
desses dois laboratórios para as condições da simulação 1 (Figura 45). Assim,
essas considerações parecem ser um indicativo que poderia ser proposta uma
classificação intermediária entre C e BMP.
Todas as demais técnicas diferenciaram, de forma satisfatória, os dois
grupos, como pode ser observado pelos resultados da Tabela 42, no caso do
Método Campos, o dendrograma para Análise de Agrupamento (Figura 49) e o
gráfico gerado pela GPA (Figura 50).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
123
Laboratórios
Z-sc
ore
-6-4
-20
24
6
FIGURA 48 Valores de Z-score20 para um ensaio de proficiência em doze
laboratórios com três amostras, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2
20 Para os laboratórios 11 e 12, os valores de Z-score eram muito elevados, não tendo sido adotada a escala do eixo y em função dos mesmos, para não provocar uma distorção visual dos demais valores, bem como torná-los comparáveis com as outras simulações.
175
TABELA 41 Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2
Grupo Lab. Classificação Nota Viés Precisão Exatidão Classificação
exatidão
1
1 A 5 0,8 0,5 0,9 Aceitável 2 B 4 1,7 0,5 1,8 Crítico 3 B 4 1,4 0,3 1,4 Aceitável 4 A 5 0,6 0,9 1,1 Aceitável 5 B 4 1,7 2,5 3,1 Não aceitável 6 A 5 0,9 0,7 1,2 Aceitável 7 B 4 1,3 1,3 1,8 Crítico 8 C 3 2,1 4,3 4,8 Não aceitável 9 B 4 1,2 1,3 1,8 Crítico
10 B 4 1,5 3,2 3,5 Não aceitável
2 11 BMP 0 41,2 82,5 92,2 Não aceitável 12 BMP 0 39,4 79,1 88,3 Não aceitável
TABELA 42 Resultados do método Campos para o conjunto de dados dos
grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2
Grupo Lab. Precisão (%) Exatidão (%) Selo
1
1 93,98 88,89 Ouro 2 93,29 88,89 Ouro 3 94,91 88,89 Ouro 4 96,06 88,89 Ouro 5 96,30 100,00 Ouro 6 97,69 100,00 Ouro 7 90,74 88,89 Ouro 8 92,82 88,89 Ouro 9 93,89 88,89 Ouro
10 93,89 88,89 Ouro
2 11 7,18 100,00 Bronze 12 9,26 88,89 Bronze
176
010
2030
4050
60
Grupos
Med
ida
das
dist
ânci
as
lab1
1
lab1
2
lab8
lab1
0
lab2
lab3
lab7
lab9
lab5
lab4
lab1
lab6
Ponto de Corte
FIGURA 49 Dendrograma para o agrupamento de doze laboratórios, utilizando o método da ligação média, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2
No caso da técnica de agrupamento, o ponto de corte estabelecido, após
a retirada da distância 54,01 (outlier pelo método de Hampel), foi igual a 3,19
( )1,94; 1,00asα = = e a medida da distância correspondente à junção da
formação de dois grupos, de 3,74. Assim, os laboratórios 11 e 12 ficaram num
grupo diferente dos demais. O agrupamento foi considerado como de boa
qualidade, pois o valor da correlação cofenética foi igual a 99,86%.
177
FIGURA 50 Elipses de confiança de 95%, geradas pela técnica de GPA para os
doze laboratórios, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 2.
6.3 Simulação 3
Na simulação 3, os dados foram gerados utilizando-se médias e matrizes
de variâncias e covariâncias diferentes para os dois grupos.
Dados simulados
Os resultados simulados das médias e das variâncias e covariâncias para
os dois grupos podem ser observados nas Tabelas 43 e 44, respectivamente.
178
TABELA 43 Proporções médias de germinação das três amostras para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
Simulação Grupo Amostra 1 2 3
2 1 0,93958 0,93590 0,93529 2 0,65235 0,63809 0,61254
TABELA 44 Variâncias e covariâncias da proporção de germinação das TRÊS amostras para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
Simulação Grupo Amostra Amostra 1 2 3
2
1 1 0,00726 0,00031 0,00481 2 0,00533 -0,00168 3 0,00954
2 1 0,00144 0,00079 0,00086 2 0,00200 0,00135 3 0,00144
Técnicas estatísticas
No caso da simulação 3, também com exceção do método do Z-score
(Figura 51 e Tabela 45), todas as demais técnicas diferenciaram de forma
satisfatória os dois grupos, no caso do Método Campos com os resultados
apresentados na Tabela 46, o dendrograma para Análise de Agrupamento
(Figura 52) e o gráfico gerado pela GPA (Figura 53).
179
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
123
Laboratórios
Z-sc
ore
-6-4
-20
24
6
FIGURA 51 Valores de Z-score21 para um ensaios de proficiência em doze
laboratórios, com três amostras, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
TABELA 45 Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados dos
grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
Grupo Lab. Classificação Nota Viés Precisão Exatidão Classificação exatidão
1
1 A 5 0,8 1,8 2,0 Crítico 2 BMP 0 3,2 0,4 3,2 Não aceitável 3 A 5 0,5 0,9 1,0 Aceitável 4 A 5 0,5 1,1 1,2 Aceitável 5 A 5 1,1 0,4 1,2 Aceitável 6 A 5 0,7 0,4 0,8 Aceitável 7 B 4 ,3 0,5 1,4 Aceitável 8 A 5 0,7 1,5 1,6 Crítico 9 A 5 0,4 0,6 0,7 Aceitável
10 A 5 1,0 2,0 2,3 Não aceitável
2 11 BMP 0 23,4 47,1 52,6 Não aceitável 12 BMP 0 26,4 52,9 59,1 Não aceitável
21 Para os laboratórios 11 e 12, os valores de Z-score eram muito elevados, não tendo sido adotada a escala do eixo y em função dos mesmos para não provocar uma distorção visual dos demais valores, bem como torná-los comparáveis com as outras simulações.
180
TABELA 46 Resultados do método Campos para o conjunto de dados dos grupos 1 e 2, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
Grupo Lab. Precisão (%) Exatidão (%) Selo
1
1 97,45 100,00 Ouro 2 91,20 100,00 Ouro 3 95,60 88,89 Ouro 4 93,52 88,89 Ouro 5 97,45 88,89 Ouro 6 97,45 88,89 Ouro 7 95,14 88,89 Ouro 8 90,74 88,89 Ouro 9 97,45 100,00 Ouro
10 96,76 88,89 Ouro
2 11 19,91 55,56 Nenhum selo 12 15,97 22,22 Nenhum selo
010
2030
4050
60
Grupos
Med
ida
das
dist
ânci
as
lab2
lab7
lab5
lab6
lab1
lab1
0
lab9
lab8
lab3
lab4
lab1
1
lab1
2
Ponto de Corte
FIGURA 52 Dendrograma para o agrupamento de doze laboratórios,
utilizando o método da ligação média, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
181
Para a técnica de agrupamento, o ponto de corte estabelecido, após a
retirada da distância 52,56 (outlier pelo método de Hampel), foi igual a 6,18
( )2,99; 2,54asα = = e a medida da distância correspondente à junção da
formação de dois grupos de 8,09. Assim, os laboratórios 11 e 12 ficam num
grupo diferente dos demais. O agrupamento pode ser considerado de boa
qualidade, pois o valor da correlação cofenética foi igual a 99,39%.
FIGURA 53 Elipses de confiança de 95%, geradas pela técnica de GPA para os
doze laboratórios, de acordo com os critérios estabelecidos para a simulação 3
6.4 Discussão geral
Como síntese dos resultados, verificou-se que, no caso da simulação 1,
para a maioria das técnicas, a distinção dos dois grupos não foi considerada
totalmente satisfatória, apresentando, por exemplo, no caso da análise de
182
agrupamento, menor valor de correlação cofenética em relação às demais
simulações. Já no caso da GPA, como comentado, ocorreu até mesmo a
intercepção entre dois laboratórios de grupos distintos (Figura 54).
FIGURA 54 Resumo esquemático dos resultados das quatro técnicas estatísticas utilizadas na avaliação dos três ensaios de proficiência simulado para um teste de germinação, sendo os laboratórios de 1 a 10 considerados como grupo 1 e os laboratórios 11 e 12, como grupo 2
183
No caso do método do Z-score, para as três simulações, foi reavaliado o
uso desta técnica considerando apenas o grupo 1, isto é, as notas e as
classificações atribuídas foram recalculadas retirando-se os dados do grupo 2.
Nesta nova avaliação ocorreram poucas mudanças tanto na classificação como
nas medidas de viés, precisão e exatidão (resultados no Anexo F). Em alguns
casos, aconteceu até mesmo redução da nota, parecendo indicar que esta técnica
tem certa restrição de uso em algumas situações e que novos estudos devem ser
feitos para avaliar o desempenho desse procedimento.
Numa discussão mais geral acerca do emprego do método do Z-score
para análise dos resultados de um ensaio de proficiência, deve-se ressaltar que a
utilização exclusiva desta técnica deve ser feita com cautela, pois pode colocar
em risco algum laboratório quanto à sua real condição de qualidade. Por outro
lado, o seu uso conjunto com outros procedimentos pode provocar dúvidas
também quanto à validade dos resultados, como é o caso neste estudo.
A baixa distinção dos grupos, no caso do método do Z-score, pode estar
associada ao tamanho da amostra, pois os intervalos de confiança para mediana
são construídos utilizando-se um valor de t de Student alto (graus de liberdade
igual a 4), provocando, consequentemente, um aumento da taxa de erro para um
grau de confiança pré-fixado.
Vale salientar que, mesmo com os grupos já pré-estabelecidos na
simulação, não foram utilizadas nem a técnica de análise discriminante nem a
própria técnica de análise de agrupamento pelo método, por exemplo, das k-
médias (agrupamento não hierárquico) para a confirmação dos grupos, pois o
objetivo era justamente verificar quanto uma determinada técnica poderia
detectar essas diferenças naturalmente, ou seja, tentando reproduzir uma
situação com dados reais em que número de grupos não é pré-estabelecido, nem
tampouco os seus elementos.
184
Se fosse feito um paralelo dos resultados obtidos com testes de
germinação real para essas três situações de simulação, poderia se considerar
que:
• caso da simulação 1 é, talvez, o menos esperado de acontecer, isto é,
laboratórios apresentarem, para uma mesma espécie testada, médias
iguais e variabilidade tão diferentes, a não ser que existam realmente
diferenças quanto à qualidade dos laboratórios;
• para a simulação 2, em que as médias são diferentes, esta situação pode
ocorrer na prática se os laboratórios também forem bem diferentes ou se
houver algum problema no procedimento do teste ou no material
enviado;
• a situação da simulação 3 não seria incomum em testes de germinação
com espécies silvestres, pois, geralmente, ocorre maior variabilidade
entre repetições e laboratórios, como verificado nos resultados do
capítulo 2.
185
7 CONCLUSÕES
Para os três casos de simulação, existem limitações na utilização do
método do Z-score, uma vez que não foi possível a distinção dos grupos de
forma satisfatória. Já o método de Campos sempre atribuiu selos diferentes para
os dois grupos.
A modificação proposta para o teste de Mojena mostrou ser apropriada
para a definição do número de grupos, na presença de distâncias discrepantes.
As técnicas de análise de agrupamento e da análise generalizada de
Procrustes, de forma geral, distinguiram bem os grupos. Deve-se ressaltar que,
com a utilização destes dois procedimentos, foi possível fazer considerações
acerca do desempenho dos laboratórios, com base apenas na representação
gráfica dos resultados (dendrograma e biplot, respectivamente). Não foi
necessária, então, nestes casos, a obtenção de índices de precisão e exatidão para
avaliar os laboratórios no contexto de um ensaio de proficiência.
De forma geral, os laboratórios que apresentaram distorção nos
resultados foram identificados por pelo menos uma das técnicas. Logo, esses
resultados podem servir para nortear, por exemplo, as diretrizes do programa de
Controle de Qualidade de um laboratório e o processo de credenciamento de
laboratórios de sementes junto aos órgãos certificadores.
186
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Ensaios de Proficiência por comparações interlaboratoriais. Rio de Janeiro, 1999 (NBR ISO/IEC Guia 43-1). ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Sistema de gestão da qualidade: fundamentos e vocabulário. Rio de Janeiro, 2000 (NBR ISO 9000). ASSOCIATION OF ANALYTICAL COMMUNITIES. International harmonized protocol for proficiency testing of (Chemical) analytical laboratories. Journal of AOAC International, v. 76, n. 4, 1993. Disponível em: <http://www.inmetro.gov.br/kits/ctle05_protocolo.pdf>. Acesso em: 10 dez. 2007. BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para análise de sementes. Brasília: SNDA/DNDV/CLAV, 1992. 365 p. BUSSAB, W.O.; MIAZAKI, É.S.; ANDRADE, D.F. Introdução à análise de agrupamentos. São Paulo: ABE, 1990. 105 p. CAMPOS, P.M. Comparação de métodos para a avaliação do controle de qualidade de laboratório de análises de solo. 1998. 99 p. Dissertação (Mestrado em Estatística e Experimentação Agropecuária) - Universidade Federal de Lavras, Lavras. CAMPOS, P.M.; MUNIZ, J.A.; OLIVEIRA, M.S. de; FERREIRA, D.F. Estimativa da repetibilidade e reprodutividade de laboratórios e via de aplicação no controle de qualidade de solo. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 23, n. 2, p.404-409, 1999. CHUÍ, Q.S. Programas interlaboratoriais. Associação Brasileira de Polímeros (ABPol). 2006. Disponível em: < http://www.abpol.com.br/pdf/PIABPo.pdf>. Acesso em: 10 jan. 2008. CHUI, Q.S.H.; ANTONOFF, H.B.; OLIVIERI, J.C. Utilização de índices r e R obtidos de Programas Interlaboratoriais para o controle de precisão de método
187
analítico: determinação de água por Karl Fische. Química Nova, v. 25, n. 4, p. 657-659, 2002. CHUÍ, Q.S.; BISPO, J.M. de A.; IAMASHITA, C.O. O papel dos programas interlaboratoriais para a qualidade dos resultados analíticos. Química Nova, São Paulo, v. 27, n. 6, p. 9993-1003, 2004 FERREIRA, D.F. Estatística multivariada. Lavras: UFLA/DEX, 2008. 661p. FERREIRA, E.B. Some topics in Procrustes analysis applied to sensometrics. 2007. 131 p. Tese (Doutorado em Estatística e Experimentação Agropecuária) - Universidade Federal de Lavras, Lavras. FERREIRA, E.B.; MAGALHÃES, F.A.R.; OLIVEIRA, M.S. de; FERREIRA, D.F. Sensory profile of the gorgonzola type cheese through bootstrap confidence regions in generalized procrustes analysis. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, Juiz de Fora, v. 62, p. 535-540, 2007. FERREIRA, E.B.; OLIVEIRA, M.S. de. Sensiometria: uma abordagem com ênfase em Procrustes. Santa Maria: UFSM, 2007. 71 p. FERREIRA, E.B.; OLIVEIRA, M.S. de; FERREIRA, D.F; MAGALHÃES, F.A.R. Sensory profile of gorgonzola via generalized procrustes analysis using R. Boletim CEPPA, Curitiba, v. 26, n. 1, p. 151-159, jan./jul. 2008. GOWER, J.C. Generalized Procrustes analysis. Psychometrika, Berkeley, v. 40, p. 33-51, 1975. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA. Informações sobre ensaios de proficiência: In: ENQUALB - Encontro para qualidade. São Paulo: 2005. Disponível em: <http://www.inmetro.gov.br/laboratorios/ensaioProf.asp>. Acesso em: 10 jan. 2008. INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. ISTA Referee Test Programme: ISTA statistics seminar. Corvallis, Oregon, 2002. INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. The ISTA Proficiency Test Programme. Switzerland, 2007. JORGENSEN, J.; KRISTENSEN, K.; DEPRINS, H.; STEINER, A.M. Studies on variation between results of repeated germination tests made in the same laboratory. Seed Science & Technology, Zürich, v. 20, n. 2, p. 281-287, 1992.
188
MILES, S.R. Handbook of tolerances and of measures of precision for seed testing. Proceedings of the International Seed Testing Association, Zürich, v. 28, n. 3, p. 525-686, 1963. MILLIGAN, G.W.; COOPER, M.C. An examination of procedures for determining the number of clusters in a data set. Psychometrika, Williamsburg, v. 50, p. 159-179, 1985. MINGOTI, S. A. Análise de dados através de métodos de estatística multivariada: uma abordagem aplicada. Belo Horizonte: UFMG, 2005. 295 p. MOJENA, R. Hierarchical grouping methods and stopping rules: an evaluation. Computer Journal, London, v. 20, p. 359-363, 1977. OLIVEIRA, M.S. de; CORRÊA, J.B.; CAMPOS, P.M. Programa interlaboratorial de controle de qualidade de análise de solo do estado de Minas Gerais (PROFERT-MG). Boletim Informativo da SBCS, Campinas, v. 20, n. 1, p. 18-23, 1995. OLIVEIRA, P.R.P.; CICERO, S.M. Causas de variação dos resultados das análises de sementes de capim colonião (Panicum maximum Jacq.). Revista Brasileira de Sementes, v. 18, n. 1, p. 122-128, 1996. OLIVIERI, J.C. Método gráfico para interpretação de resultados em programa interlaboratorial: elipse de confiança, técnicas e métodos. São Paulo: IPT. 1988. 20p. R Development Core Team (2008). R: a language and environment for statistical computing. Vienna, Áustria: R Foundation for Statistical Computing. Disponível em: <http://www.R-project.org>. Acesso em: 10 jan. 2008. REDE METROLÓGICA. Programa piloto de comparação interlaboratorial em sementes. Porto Alegre, 2008. Disponível em: <http://www.redemetrologica.com.br/arquivo/laboratorial/ARQ_136.pdf >. Acesso em: 10 jan. 2009. RENCHER, A.C. Methods of multivariate analysis. 2thed. New York: J. Wiley, 2002. 708 p.
189
RENNIE, W.J.; TOMLIN, M.N. Repeatability, reproducibility and interrelationship of results of tests on wheat seed samples infected with Septoria nodorum. Seed Science & Technology, Zürich, v. 12, n. 3, p. 863-880, 1984. SOUZA, A.L.; FERREIRA, R.L.C.; XAVIER, A. Análise de agrupamento aplicada à ciência florestal. Viçosa, MG: SIF, 1997. 109 p. TOTTI, R.; VENCOVSKY,R.; BATISTA, L.A.R. Utilização do método de agrupamentos hierárquicos em acessos de Paspalum (Gramínea(Poaceae)). Semina: Ciências Exatas Tecnológicas, Londrina, v.22, p. 25-35, dez. 2001. WONG, S.K. Evaluation of the use of consensus values in proficiency testing programmes. Accreditation and Quality Assurance, Heidelberg, v.10, p.409-414, 2005. ZORATO, F. Evolução do laboratório de análise de sementes. Revista Seed News, v. 9, n. 6, 2005. Disponível em: < http://www.seednews.inf.br/portugues/seed96/artigocapa96.shtml>. Acesso em: 10 nov. 2007.
190
CONSIDERAÇÕES FINAIS Neste estudo, de forma geral, deve-se considerar que:
• O desenvolvimento de rotinas específicas no software R serve para
otimização das análises, sendo todos os relatórios gerados
automaticamente e de forma rápida, além de possibilitar o uso de um
software único, de código aberto, grátis e livre.
• As técnicas estatísticas propostas no capítulo 2, como, por exemplo, a
análise discriminante para avaliar a classificação dos lotes e os testes F
para comparação de dois métodos, podem ser utilizados em um
programa de validação de métodos para sementes, uma vez que as
análises possibilitam mostrar a eficiência desses procedimentos nas
diversas etapas do processo.
• Para o teste de germinação em sementes de Raphanus sativus var
oleiferus, os métodos utilizando temperatura alternada 20°-30°C e
substratos areia ou papel estão validados por terem apresentado
exatidão, precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) e robustez.
• A análise generalizada de Procrustes, o método Campos e a análise de
agrupamento, apresentadas no capítulo 3, são técnicas promissoras para
a avaliação dos resultados de ensaios de proficiência na área de
sementes.
• No caso dos ensaios de proficiência na área de sementes, a utilização
simultânea das quatro técnicas estatísticas (as três citadas no item
anterior, acrescidas do método do Z-score) é inédita, sendo
recomendável para potencializar a avaliação do desempenho dos
laboratórios.
191
• Apesar dos indicativos positivos da adequabilidade das técnicas
estatísticas propostas neste trabalho, tanto para programas de validação
de métodos como para ensaios de proficiência, verifica-se a necessidade
do desenvolvimento de mais alguns estudos teóricos, como, por
exemplo, a avaliação do tamanho da amostra, do efeito de lote, da
espécie, bem como outras técnicas para a detecção de valores e
variâncias discrepantes.
192
ANEXOS
ANEXO A Página
FIGURA 1A Categorias de sementes encontradas no teste de
germinação em lotes de sementes de nabo forrageiro.
A - Plântula Normal; B – Anormal deformada; C –
Anormal infeccionada; D – dormente e E – morta........ 205
FIGURA 2A Categorias de sementes encontradas no teste de
tetrazólio em lotes de sementes de nabo forrageiro.
Viáveis: A - embrião com coloração rosa ou menos de
50% do embrião descolorido sem atingir o eixo
embrionário e tecido com aspecto normal e firme.
Inviáveis: B – mais de 50% dos cotilédones
descoloridos; C - região do eixo embrionário
descolorida; D – embrião com coloração vermelho
carmim e E - embrião completamente descolorido....... 206
FIGURA 3A Métodos adotadas para o teste de germinação em lotes
de sementes de nabo forrageiro. A – método
utilizando como substrato o papel germitest; B –
nivelamento da areia fina; C – método utilizando
como substrato areia fina............................................... 206
193
ANEXO B Página
TABELA 1B Determinação pelo teste Hj da condição de homogeneidade de um lote utilizando os resultados de um teste de germinação de 5 subamostras (N) com 100 sementes cada (n).............................................................................. 208
TABELA 2B Identificação de outliers pelo método de Hampel para os resultados de um teste de germinação em dois laboratórios com dois lotes e três repetições cada .......................................................................... 210
TABELA 3B Identificação de outliers nas variâncias pelo teste de Levene utilizando os resultados do teste de germinação apresentados na Tabela 2B............................................................................. 211
TABELA 4B Determinação da amplitude dentro do laboratório, da variância e dos limites críticos de repetibilidade utilizando os resultados do teste de germinação apresentados na Tabela 2B....................................... 212
TABELA 5B Determinação da amplitude entre laboratórios, da variância e dos limites críticos de reprodutibilidade utilizando os resultados do teste de germinação apresentados na Tabela 2B....................................... 213
TABELA 6B Determinação dos valores de h e k........................... 214
TABELA 7B Resultados de um teste de germinação em oito laboratórios para dois lotes (grupo) e duas repetições cada.......................................................... 215
TABELA 8B Valores da função discriminante para os dois grupos........................................................................ 218
TABELA 9B Matriz de confusão simples – regra linear................ 219
TABELA 10B Identificação de outlier pelo método do Z-score nos resultados médios de um teste de germinação com nove laboratórios em duas amostras................. 220
194
ANEXO B Página
TABELA 11B Determinação do Z-score para os resultados médios de um teste de germinação com nove laboratórios em duas amostras...................................................... 221
TABELA 12B Determinação do viés, precisão, exatidão pelo método do Z-scroe dos nove laboratórios em duas amostras.................................................................... 222
TABELA 13B Resultados de um teste de germinação em três laboratórios com duas amostras e quatro repetições cada........................................................................... 222
TABELA 14B Determinação dos limites inferiores e superiores e valores de d1 para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada............................ 223
TABELA 15B Determinação de d1 (com base nos limites da Tabela 14B) para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada ............................ 224
TABELA 16B Determinação dos limites inferiores e superiores e valores de d2 para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada............................ 225
TABELA 17B Determinação de d2 (com base nos limites da Tabela 16B) para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada............................ 225
TABELA 18B Determinação de medidas auxiliares, exatidão, precisão e classificação pelo método de Campos para os três laboratórios em duas amostras............... 226
TABELA 19B Resultados médios de um teste de germinação com cinco laboratórios em duas amostras........................ 226
TABELA 20B Resultados das distâncias euclidianas para combinações duas a duas de quatro laboratórios em duas amostras............................................................ 226
FIGURA 1B Dendrograma para o agrupamento de 5 laboratórios a partir dos dados de germinação utilizando o método da ligação média.......................................... 230
195
ANEXO B Página
TABELA 21B Determinação do ponto de corte para determinação do número de grupos, procedimento de Mojena (1977)........................................................................ 230
TABELA 22B Medidas das distâncias euclidianas e previstas para o cálculo da correlação cofenética........................... 231
196
ANEXO C Página FIGURA 1C Descrição e interpretação das medidas utilizadas na
construção de um boxplot......................................... 232
197
ANEXO E Página
TABELA 1E Exemplo da montagem de um banco de dados para a realização do teste H................................................... 236
TABELA 2E Exemplo da montagem de um banco de dados para a realização do método de Hampel................................ 237
TABELA 3E Exemplo da montagem de um banco de dados para a Análise Discriminante.................................................. 237
TABELA 4E Exemplo da montagem de um banco de dados para o método do Z-score e método de Campos (1998)......... 238
TABELA 5E Exemplo da montagem de um banco de dados para a Análise de Agrupamento............................................. 239
FIGURA 1E Exemplo de alguns relatórios gerados no software R para o Capítulo 2.......................................................... 240
FIGURA 2E Exemplo de alguns relatórios gerados no software R para o Capítulo 3.......................................................... 241
FIGURA 3E Programa para execução da FunçaoTesteH no software R.................................................................... 242
198
ANEXO F Página
TABELA 1F Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados do grupo 1, de acordo com a simulação 1......... 243
TABELA 2F Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados do grupo 1, de acordo com a simulação 2 ........ 243
TABELA 3F Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados do grupo 1, de acordo com a simulação 3......... 244
199
ANEXO A
Neste anexo são apresentadas as instruções para a realização e avaliação
do teste de germinação, e um questionário para verificar a execução prática de
cada um dos métodos.
Etapas para realização do teste de germinação em sementes de nabo
forrageiro (Raphanus sativus L. var. oleiferus Metzg).
Organizadores do teste: UFLA/MAPA
e-mail:[email protected]
Endereço:Campus da UFLA/DAG/Setor de Sementes-CP3037-CEP37200-000 Lavras MG
Telefone: 35 3829 1055 ou 35 3829 1084
1) Orientações gerais
a) O teste deverá ser iniciado imediatamente após o recebimento das amostras
dos cinco lotes de sementes de nabo forrageiro. Caso não seja possível, as
amostras devem ser armazenadas em local fresco e seco.
b) O teste de germinação deverá ser realizado em dois tipos de substrato: areia
fina e papel mata-borrão; e com 8 repetições de 50 sementes por lote;
b) As caixas acrílicas tipo gerbox deverão ser acondicionadas em câmara de
germinação regulada à temperatura alternada 20ºC-30°C, com fotoperíodo de
8/16 horas;
200
c) Após 3 dias deverão ser retiradas as plântulas normais, e os resultados dessa
primeira contagem (expressos em porcentagem) registrados na ficha de
avaliação (Anexo A1);
d) Após 7 dias as sementes deverão ser avaliadas, em porcentagem, de acordo
com as seguintes categorias: plântulas normais (N), anormais defeituosas (AD),
anormais infeccionadas (AI), mortas (M) e dormentes (D); e os resultados
preenchidos na ficha de avaliação (Anexo A1).
e) Para padronização dos resultados do teste observe a Figura 1A (Anexo A3),
correspondente as categorias N, AD, AI, M e D.
f) Para uma categorização adequada das sementes remanescentes, em mortas ou
dormentes, deverá ser utilizado o teste de Tetrazólio com solução de 0,5% por 3
horas a 40 ºC, sendo as viáveis classificadas como dormentes e inviáveis como
mortas. (Figura 2A – Anexo A3) e registrados na ficha de avaliação (Anexo A2)
2) Procedimento inicial
Determinação e uniformização do grau de umidade das sementes
a) O grau de umidade deverá ser determinado pelo método de estufa a 105+3oC
por 24 horas (BRASIL, 1992), com 2 repetições de 10 gramas de sementes por
lote.
3) Substrato papel mata-borrão
a) O papel deverá ser umedecido com água destilada numa quantidade
correspondente a 2,5 vezes da sua massa;
b) As sementes em numero de 50 por repetição ou gerbox, deverão ser dispostas
de forma alternada sobre o papel (Figura 3A – Anexo A3);
201
c) Após a montagem as caixas deverão ser transferidas para o germinador,
seguindo as orientações gerais já descritas no item 1.
4) Substrato areia
a) 500 gramas de areia fina deverão ser peneiradas, lavadas e secas ao livre por
um 24h.
b) Esterilizar a areia em estufa a 200ºC/2h, devendo ser utilizada no máximo em
até 15 dias.
c) Antes da montagem do teste a areia deverá ser umedecida em 50% da sua
capacidade de campo;
d) Para cada caixa acrílica tipo “gerbox” deverá ser utilizado 215 gramas de
areia;
e) A areia deverá ser nivelada, utilizando um pedaço de papel germitest dobrado.
O papel deverá ser passado no sentido vertical, numa quantidade de vezes
suficiente para o seu nivelamento completo (Figura 3A– Anexo A3).
f) Após o nivelamento, as sementes deverão ser dispostas alternadamente sobre a
areia (Figura 3A– Anexo A3).
g) As caixas deverão ser transferidas para o germinador, seguindo as orientações
gerais já descritas no item 1.
5) Comunicação dos resultados
a) Deverão ser enviadas via correio (endereço acima) uma cópia das fichas de
avaliação, bem como o questionário (Anexo A4) devidamente preenchidos. Os
originais deverão ser mantidos no laboratório até o final do processo.
202
b) Os resultados deverão também ser enviados via mail, pelo preenchimento dos
anexos e encaminhamento ao organizador do teste.Endereço:[email protected]
c) Cada laboratório receberá um código identificador para pode verificar os seus
resultados no boletim parcial. Qualquer inconsistência nos resultados o
laboratório deverá ser comunicada imediatamente ao organizador do teste.
6) Orientações finais
a) Caso seja necessário um re-teste o organizador deverá ser informado. Esse
procedimento deverá ser adotado nas seguintes circunstâncias: problemas no
equipamento durante a condução do teste; resultados aparentemente
inconsistentes, sendo que neste caso as possíveis causas devem ser investigadas
imediatamente e caso haja dúvidas o organizador do teste deverá ser consultado.
b) O material sobressalente só deverá ser descartado após o término do processo
de validação, data que será informada via e-mail.
c) Qualquer dúvida e/ou possíveis problemas no material enviado poderão ser
encaminhadas via e-mail para o organizador do teste.
203
ANEXO A1
FICHA DE AVALIAÇÃO
Teste para validação de método
Espécie: Raphanus sativus L. var. oleiferus Metzg
Escopo: Germinação
Código do laboratório:_______________________________________
Método – Substrato: ( ) Areia ( ) Papel
Lote: ( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( )5
Rep PN
Contagem ao 3º dia
PN Contagem ao 7º dia
PN total PAD PAl SM SD
1 2 3 4 5 6 7 8
total *PN = Plântulas normais; PAD = Plântulas anormais deformadas; PAI = Plântulas anormais infeccionadas, SM = Sementes mortas; SD = Sementes duras.
Observações:
204
ANEXO A2
FICHA DE AVALIAÇÃO
Teste para validação de método
Espécie: Raphanus sativus L. var. oleiferus Metzg
Escopo: Tetrazólio
Código do laboratório:
Método – Substrato: ( ) Areia ( ) Papel
Lote: ( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( )5
Repetição Viáveis Inviáveis 1
2
3
4
5
6
7
8
Observações:
205
ANEXO A3
FIGURA 1A Categorias de sementes encontradas no teste de germinação em
lotes de sementes de nabo forrageiro. A - Plântula Normal; B – Anormal deformada; C – Anormal infeccionada; D – dormente e E – morta ao final de 7 dias
A AA
B B B
C C D
EEEE
206
FIGURA 2A Categorias de sementes encontradas no teste de tetrazólio em lotes de sementes de nabo forrageiro. Viáveis: A - embrião com coloração rosa ou menos de 50% do embrião descolorido sem atingir o eixo embrionário e tecido com aspecto normal e firme. Inviáveis: B – mais de 50% dos cotilédones descoloridos; C - região do eixo embrionário descolorida; D – embrião com coloração vermelho carmim e E - embrião completamente descolorido
FIGURA 3A Métodos adotados para o teste de germinação em lotes de sementes
de nabo forrageiro. A – método utilizando como substrato o papel germitest; B – nivelamento da areia fina; C – método utilizando como substrato areia fina
A B B
C C DE
A
A B C
207
ANEXO A4
QUESTONÁRIO DE AVALIAÇÃO
Teste para validação de método
Espécie: Raphanus sativus L. var. oleiferus Metzg
Escopo: Germinação
Código do laboratório: 1) Os métodos estão descritos de forma clara e sem ambigüidades?
( ) Sim ( ) Não 2) Qual dos dois métodos você considerou mais “fácil” no momento da: a) Pré-montagem (Preparação do material) ( ) Areia ( ) Papel ( ) Ambas ( ) Nenhuma delas Se for o caso, indique as principais dificuldades:
_______________________________________________________________________
b) Montagem ( ) Areia ( ) Papel ( ) Ambas ( ) Nenhuma delas
Se for o caso, indique as principais dificuldades:
_______________________________________________________________________
c) Manipulação ( ) Areia ( ) Papel ( ) Ambas ( ) Nenhuma delas
Se for o caso, indique as principais dificuldades:
_______________________________________________________________________
d) Avaliação (Contagem – visualização) ( ) Areia ( ) Papel ( ) Ambas ( ) Nenhuma delas
Se for o caso, indique as principais dificuldades:
_______________________________________________________________________
3) Comentários gerais:
_______________________________________________________________________
208
ANEXO B
Neste anexo são apresentadas passo a passo algumas técnicas estatísticas
utilizadas neste estudo por meio de exemplos numéricos. Ressalta-se que os
dados utilizados são apenas para fins didáticos, não havendo, portanto uma
preocupação excessiva quanto ao tamanho da amostra, número de laboratórios
selecionados, dentre outras medidas.
Teste H
Para verificar se um lote pode ser considerado homogêneo pelo teste H é
necessário calcular as variâncias: observada (Vj) e teórica (Wj) de um teste de
germinação (Tabela 1B). Determinar a estatística Hj e comparar com um nível
de significância estabelecido.
No caso do teste de germinação, o valor do fator para variação adicional
é sempre igual a 1,1. Sendo a variável aleatória em questão a porcentagem de
germinação (Q)
TABELA 1B Determinação pelo teste Hj da condição de homogeneidade de um lote utilizando os resultados de um teste de germinação de 5 subamostras (N) com 100 sementes cada (n)
Subamostra qi q²i y v w 1 98 9.604
93,40 14,80 6,78 2 96 9.216 3 89 7.921 4 94 8.836 5 90 8.100 ∑ =467 ∑ = 43.667
209
Cálculo de v e w
( )
22
21 1 5(98² ... 90²) 98 ... 90
14,80( 1) 5(5 1)
i
N N
ii i
N q qv
N N= =
⎛ ⎞− ⎜ ⎟ + + − + +⎝ ⎠= = =− −
∑ ∑
( ) ( )100 93,40 100 93,40. .1,1 6,78
100q q
w fn− −
= = =
Determinação da estatística H
14,80 - 1,1 1,08 valor p 0,09426,78
vH fw
= = − = ⇒ =
O lote avaliado pode ser considerado homogêneo pelo teste H, ao nível
de significância de 1%.
Método de Hampel
Para a detecção de um outlier pelo método de Hampel é necessário
calcular: mediana de um conjunto de dados para um determinado nível do
estudo, neste exemplo, o nível é o lote; a diferença entre cada observação e a
mediana (desvios); a mediana desses desvios (MAD) e a regra de decisão -
outlier > 5,2MAD (Tabela 2B).
210
TABELA 2B Identificação de outliers pelo método de Hampel para os resultados de um teste de germinação em dois laboratórios com dois lotes e três repetições cada
Lote 1 Lote 2
Lab. Rep. 1lky 1 1..lky y− Condição Lab. Rep. 2lky 2 2..lky y− Condição
1 1 88 2 não
1 1 92 1,5 não
2 91 1 não 2 89 1,5 não 3 93 3 não 3 93 2,5 não
2 1 93 3 não
2 1 65 25,5 outlier
2 89 1 não 2 85 5,5 não 3 86 4 não 3 92 1,5 não
1..y 90,0 2..y 90,5 MAD1 2,5 MAD2 2,0
5,2 MAD1 13,0 5,2 MAD2 10,4
Somente a observação 221y foi considerada um outlier, uma vez que
221 2. 225,5 5,2 10,4y y MAD− = > =
Teste de Levene
Para o uso desta técnica é necessário calcular vários tipos de desvios em
relação: a média de um subnível (laboratório), a média geral dos desvios de um
subnível, a média geral dos desvios de um nível - lote (Tabela 3B). Determinar à
estatística W e comparar com um determinado nível de significância.
Cálculo da estatística: ( )( )
2
. ..12
.1 1
( )
( 1)
j
j jl
pj j jl jl jl
j p nj jlk jll k
N p n Z ZW
p Z Z=
= =
− −=
− −
∑∑ ∑
a) [ ]
( )1
(6 2). 3.(0,11) 3.(0,11) 2,68 0,2686(2 1). 3,19 6,74 9,93
W− +
= = =− +
valor p= 0,6316 (distribuição F com 1 e 4 graus de liberdade)
Mediana Mediana
211
b) [ ]
( )2
(5 2). 3.(0,60) 2.(1,36) 13,61 9,6710(2 1). 1,41 0,00 1,41
W− +
= = =− +
valor p= 0,0529 (distribuição F com 1 e 3 graus de liberdade)
TABELA 3B Identificação de outliers nas variâncias pelo teste de Levene utilizando os resultados do teste de germinação apresentados na Tabela 2B
Lote Lab Rep jlky .jlk jlk jlz y y= − ( )2
.jlk jlz z− ( )2
. ..jl jz z−
1
1
1 88 |88-90,67|=2,67 (2,67-1,78)²=0,79 2 91 0,33 2,09 3 93 2,33 0,31 11.y 90,67 11. 1,78z = ∑ = 3,19 0,11
2
1 93 3,67 1,49 2 89 0,33 4,46 3 86 3,33 0,79 21.y 89,33 21. 2, 44z = ∑= 6,74 0,11
1.. 2,11z =
2
1
1 92 0,67 0,79 2 89 2,33 0,60 3 93 1,67 0,01 12.y 91,33 12. 1,56z = ∑ = 1,41 0,60
2
1 2 85 3,50 0,00 3 92 3,50 0,00 22.y 88,50 22. 3,50z = ∑ = 0,00 1,36
2.. 1,87z =
Nenhum laboratório, ao nível de significância de 1%, é considerado um
outlier.
212
Condições de repetibilidade
Para avaliar as condições de repetibilidade de um determinado
laboratório e lote, é necessário calcular: a variância dos dados, a variância de
repetibilidade, o limite crítico e a amplitude dentro dos laboratórios (Tabela 4B).
Exemplo para o cálculo da variância do lab1 e lote 1:
( )( )
( ) ( ) ( )( )
2 2 2 2.2 1
11
88 90,67 91 90,67 93 90,676,33
3 11
jlnjlk jlk
jl
y ys
n=
− − + − + −= = =
−−∑
TABELA 4B Determinação da amplitude dentro do laboratório, da variância e
dos limites críticos de repetibilidade utilizando os resultados do teste de germinação apresentados na Tabela 2B
Lote Lab Rep jlky jln 2
jls Lrj1. 2rjs Dj rj
1
1
1 88 3 6,33 5
9,33 4,03 12,31
2 91 3 93 11.y 90,67
2
1 93 3 12,33 7 2 89
3 86 21.y 89,33 1. 3n =
2
1
1 92 3 4,33 4
11,06 3,68 12,24
2 89 3 93 12.y 91,33
2
1 2 24,50 7 2 85
3 92 22.y 88,50 2. 2,5n =
213
Os laboratórios apresentam repetibilidade aceitável, com grau de
confiança de 99%, pois as amplitudes (Lrj1) são menores que os limites críticos
(rj).
Condições de reprodutibilidade
Para verificar as condições de reprodutibilidade de uma determinada
“repetição” e lote, é necessário calcular: a variância entre laboratórios, a
variância de reprodutibilidade, o limite crítico e a amplitude entre os laboratórios
(Tabela 5B).
TABELA 5B Determinação da amplitude entre laboratórios, da variância e dos limites críticos de reprodutibilidade utilizando os resultados do teste de germinação apresentados na Tabela 2B
Lote Rep. Lab. jlky LRj.k
2djs 2
jLs 2jRs Dj Rj
1
1 1 88 5
2,66 -2,22 7,11 4,03 10,75
2 93
2 1 91 2 2 89
3 1 93 7 2 86
2
1 1 92 0
10,03 -0,42 10,63 3,68 11,99
2
2 1 89 4 2 85
3 1 93 1 2 92
Exemplo do cálculo 2djS e jn para o lote 1, considerando as informações da
Tabela 5B.
214
( ) ( ) ( )2
2 2 21 1 1..
2 11
1
3 90,67 90 3 89,93 902,66
( 1) (2 1)
l ll
d
n y ys
p=
− ⎡ ⎤− + −⎣ ⎦= = =− −
∑
221 2 22
11 1 2
111
1
1 1 3 3(3 3) 3( 1) (2 1) 3 3
ll
ll
ll
nn n
p n
=
=
=
⎛ ⎞⎜ ⎟ ⎡ ⎤+⎜ ⎟= − = + − =⎢ ⎥− − +⎜ ⎟ ⎣ ⎦⎜ ⎟⎝ ⎠
∑∑
∑
As repetições apresentam reprodutibilidade aceitável, com garu de
confiança de 99%, pois as amplitudes são menores que os limites críticos (Rj).
Valores de h e k
O valor de k para cada laboratório e lote é determinado pela divisão da
variância entre laboratórios pela variância de reptibilidade. Para obter o valor de
h são calculados dois tipos de desvios em relação: a média do laboratório, a
média geral do lote (Tabela 6B)
TABELA 6B Determinação dos valores de h e k
Lote Lab Rep jlky ljs rjs kjl ..jy hjl
1
1
1 88 2,52
3,05
0,8239
90,00
1,2247 2 91 3 93 11.y 90,67
2
1 93 3,51 1,1496 -1,2247 2 89
3 86 12.y 89,33
2
1
1 92 2,08
3,33
0,6257
89,92
1,0954 2 89 3 93 21.y 91,33
2
1 4,95 1,4883 -1,0954 2 85
3 92 22.y 88,50
215
Exemplo para o valor de h do lab1 e lote 1: ( )
( ) ( )
( )( ) ( ) ( )1
11. 1..11 2 2
21 1.. 1 1
1
90,67 90,001,2247
90,67 90,00 89,33 90,00 2 1 .31p
ll
Y Yh
Y Y p n=
− −= = =
− + − −− −∑
Análise Discriminante
Como descrito na seção 5.3.6 do capítulo 2, esta técnica pode ser
desenvolvida em 4 etapass.
1ª etapa) Avaliação da suposição de igualdade das matrizes de covariância
São calculados os vetores de médias, as matrizes de variâncias e
covariâncias (Tabela 7B) e aplicado o teste de Box’s M (que não será
apresentado).
TABELA 7B Resultados de um teste de germinação em oito laboratórios para dois lotes (grupo) e duas repetições cada
Lab Grupo Amostra 1 (a1)
Amostra 2(a2)
1 1 94 922 1 90 943 1 88 924 1 90 985 1 92 966 1 90 987 1 94 968 1 96 961 2 72 742 2 98 883 2 86 844 2 64 785 2 78 886 2 76 847 2 64 848 2 66 74
Ex: Vetor da observação 1 do grupo 1
[ ]111 112
11 94 92T
x x
=
x
Vetor das médias para cada grupo
1 2
91,75 75,5095,25 81,75⎡ ⎤ ⎡ ⎤
= =⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦
x x
Matrizes de covariâncias e variâncias para
cada grupo
1 2
7,36 0,36 141, 43 42,710,36 5,64 42,71 32,50⎡ ⎤ ⎡ ⎤
= =⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦
s s
216
Exemplo do cálculo da determinação de 1x
1
1 111
1
94 90 88 90 92 90 94 961 192 94 92 98 96 98 96 968
734 91,751762 95,258
n
mmn =
⎛ ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤= = + + + + + + +⎜ ⎟⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠⎡ ⎤ ⎡ ⎤
= =⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦
∑x x
x
Exemplo do cálculo da determinação de 1s
[ ]
1
1
94 91,75 94 91,75 96 91,75 96 91,75192 95, 25 92 95,25 96 95, 25 96 95,257
2, 25 4, 251 2,25 3,25 4,3,25 0,757
T T⎧ ⎫⎛ ⎞⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎛ ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤⎪ ⎪= − − + + − −⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟⎨ ⎬⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎝ ⎠⎪ ⎪⎩ ⎭
⎡ ⎤ ⎡ ⎤= − + +⎢ ⎥ ⎢ ⎥−⎣ ⎦ ⎣ ⎦
…
…
s
s [ ]
1
1
25 0,75
5,06 7,31 18,06 3,1917,31 10,56 3,19 0,567
51,50 2,50 7,36 0,3612,50 39,50 0,36 5,647
⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠⎛ − ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤
= + +⎜ ⎟⎢ ⎥ ⎢ ⎥−⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠⎡ ⎤ ⎡ ⎤
= =⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦
…s
s
2ª etapa) Determinação das funções discriminantes lineares de Fisher
Supondo a igualdade das matrizes das variâncias e covariâncias,
determinam-se as funções discriminantes lineares de Fisher, por meio de
algumas medidas auxiliares: X , 0B̂ e Sp.
Cálculo de X , 0B̂ e Sp com os dados apresentados na Tabela 7B
2
1
91,75 75,50 167,25 167, 25 83,621 1 195, 25 81,75 177,00 177,00 88,502 2 2i
i=
⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤= = + = = =⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠ ⎝ ⎠∑X X
217
( )( )2
01
0
0
ˆ
91,75 83,62 91,75 83,62 75,50 83,62 75,50 83,62ˆ95,25 88,50 95,25 88,50 81,75 88,50 81,75 88,50
66,015 54,845ˆ54,
B X X X X
B
B
T
i ii
T T
=
= − −
⎛ ⎞⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎛ ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤= − − + − −⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎝ ⎠
=
∑
66,015 54,845 132,03 109,69845 45,560 54,845 45,560 109,76 91,12
⎛ ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤+ =⎜ ⎟⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠
( ) ( )1 1 2 2
1 1 2
1
( 1) ( 1)1 12
7,36 0,36 141, 43 42,71(8 1) (8 1)
0,36 5,64 42,71 32,50(8 8 2)
74,39 21,5321,53 19,07
g
p i igi
ii
p
p
n nnn nn g =
=
⎛ ⎞⎜ ⎟ − + −⎜ ⎟= − =⎜ ⎟ + −
−⎜ ⎟⎝ ⎠
⎡ ⎤ ⎡ ⎤− + −⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎣ ⎦ ⎣ ⎦=+ −
⎡ ⎤= ⎢ ⎥⎣ ⎦
∑∑
S SS S
S
S
No caso em que g = 2, o vetor l pode ser obtido diretamente por
( ) 11 2l= X X S
Tp−− , logo para este exemplo:
[ ] 1 20,019 0,686 0,019 0,686l= y a a⇒ = +
3ª etapa) Regra de classificação
Para o caso em que g =2, calcula-se o ponto médio m entre duas médias
univariadas amostrais dado por ( ) ( ) ( )11 2 1 2 1 2
1 1ˆ2 2
x x s x xTpm y y −= + = − + e
estabelecesse a regra de classificação para x como sendo: alocar x em 1τ se
ˆl xT m≥ e alocar em 2τ caso contrário (Tabela 8B).
218
TABELA 8B Valores da função discriminante para os dois grupos
Lab Grupo função 1 1 64,89 2 1 66,19 3 1 64,78 4 1 68,94 5 1 67,60 6 1 68,94 7 1 67,64 8 1 67,68 1 2 52,13 2 2 62,23 3 2 59,26 4 2 54,72 5 2 61,85 6 2 59,07 7 2 58,84 8 2 52,02
Assim, tomando com exemplo vetor da observação 1 do grupo 1
11
9492
x⎡ ⎤
= ⎢ ⎥⎣ ⎦
a classificação pode ser obtida da seguinte forma:
191,75 75,50 74,39 21,53 91,75 75,501ˆ 62,33
95, 25 81,75 21,53 19,07 95, 25 81,752
T
m−⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤
= − + =⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎝ ⎠ ⎝ ⎠
[ ]0,01994 92 64,89 62,33
0,686l xT ⎡ ⎤
= = >⎢ ⎥⎣ ⎦
Pela regra de classificação adotada esta observação é considerada sendo
do grupo 1.
219
4ª etapa) Avaliação da função de classificação Com as observações classificadas é construída a matriz de confusão
(Tabela 9B) e determinada a taxa de erro geral. Neste exemplo, não está sendo
apresentado o método de validação cruzada utilizado no capítulo 2.
TABELA 9B Matriz de confusão simples – regra linear
grupo
verdadeiro
grupo classificado total
τ1 τ2
τ1 8 0 8
τ2 0 8 8
Total 8 8 16
Como todas as observações foram classificadas corretamente não há
taxas de erro a serem determinadas.
Método do Z score
Como apresentado na seção 5.2.1 do capítulo 3, esta técnica pode ser
desenvolvida em 6 etapas.
1ª etapa) Identificação de valores discrepantes (outliers)
São estabelecidos, para cada nível de estudo (neste caso a amostra),
intervalos de confiança para mediana, e considera-se um outlier se o resultado
médio de um teste de germinação não estiver contido neste intervalo (Tabela
10B).
220
TABELA 10B Identificação de outlier pelo método do Z-score nos resultados médios de um teste de germinação com nove laboratórios em duas amostras
Amostra 1 Amostra 2 Lab. Média Lab. Média
6 98 6 97 5 95 5 95 1 92 1 91 3 92 4 89
Mediana 4 90 9 89 7 86 8 86 9 86 3 81 8 85 7 80 (Outlier) 2 60 2 54 Média 87,11 84,67 Mediana - ay 90,00 89 Desvio padrão (acima da mediana) - *
as 2,87 3,65 Graus de liberdade 3 3
(0,005;3)at 5,84 5,84 Limite Inferior - *
(0,005;3)a a ay s t− 73,24 67,67 Limite Superior - *
(0,005;3)a a ay s t+ 106,76 110,32 ¹ Nível de confiança de 99%.
2ª etapa) Determinação do Z- score
Calcula-se a média e o desvio padrão para cada amostra,
desconsiderando os outliers identificados na etapa anterior, e determina-se o
valor do Z-score para cada laboratório (Tabela 11B).
221
TABELA 11B Determinação do Z-score para os resultados médios de um teste de germinação com nove laboratórios em duas amostras
Amostra 1 Amostra 2
Lab. Média 1lZ Lab. Média 2lZ 6 98 1,61 6 97 1,41 5 95 0,97 5 95 1,07 1 92 0,32 1 91 0,41 3 92 0,32 4 89 0,08
4 90 -0,11 9 89 0,08 7 86 -0,97 8 86 -0,41 9 86 -0,97 3 81 -1,24 8 85 -1,18 7 80 -1,41 2 60 -6,55 2 54 -5,70 Média - ay 87,11 84,67 Desvio padrão - as 2,87 3,65
3 ª etapa) Classificação numa rodada
Não estão sendo apresentadas nem a classificação, nem a nota que seria
atribuída a cada laboratório, uma vez que, neste exemplo, não há três amostras.
4ª a 6 ª etapas) Cálculo do viés, precisão e exatidão
Pelos resultados obtidos, o laboratório 6 tem exatidão considerada como
crítica ( )( )61,500 1,999IE< < e o laboratório 2 como inaceitável. ( )( )2 2,000IE ≥
Todos os laboratórios apresentam boa precisão. (Tabela 12B)
222
TABELA 12B Determinação do viés, precisão, exatidão pelo método do Z-scroe dos nove laboratórios em duas amostras
Amostra 1 Amostra 2 4ª a 6ª etapas
Lab. Média 1lZ
Lab. Média 2lZ 2
1al
a
Z=∑ lV ( )I
lP ( )IlE
6 98 1,61 6 97 1,41 3,02 1,51 0,07 1,51 5 95 0,97 5 95 1,07 2,04 1,02 0,04 1,02 1 92 0,32 1 91 0,41 0,74 0,37 0,03 0,37 3 92 0,32 4 89 0,08 0,40 0,20 0,08 0,22 4 90 -0,11 9 89 0,08 -0,02 -0,01 0,07 0,07 7 86 -0,97 8 86 -0,41 -1,38 -0,69 0,20 0,72 9 86 -0,97 3 81 -1,24 -2,21 -1,10 0,10 1,11 8 85 -1,18 7 80 -1,41 -2,59 -1,29 0,08 1,30 2 60 -6,55 2 54 -5,70 -12,25 -6,13 0,30 6,13
Exemplo para o cálculo da precisão do lab 1:
( ) ( ) ( )2 2
1
1,61 1,51 1,41 1,510,07
2IP
− + −= =
Método Campos (1998)
O banco de dados utilizado como exemplo para aplicação do método
Campos encontra-se na Tabela 13B.
TABELA 13B Resultados de um teste de germinação em três laboratórios com duas amostras e quatro repetições cada
Amostra 1 Amostra 2
Lab. Repetição Lab.
Repetição 1 2 3 4 1 2 3 4
1 88 91 93 97 1 92 89 93 96 2 97 96 99 99 2 100 99 98 100 3 73 59 66 68 3 65 65 52 65
223
Como descrito na seção 5.2.2 do capítulo 3, esta técnica pode ser
desenvolvida em 5 etapas.
1 ª etapa) Identificação de valores discrepantes (outliers)
São construídos intervalos interquartílicos (Tabela 14B) e verifica-se em
qual deles a observação está contida, sendo atribuído um índice de discrepância
d1 com valor correspondente ao número do intervalo menos uma unidade
(Tabela 15B).
TABELA 14B Determinação dos limites inferiores e superiores e valores de d1
para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada
Amostra 1 Amostra 2
B Repetição
d1
B Repetição
d1 1 2 3 4 1 2 3 4
1 Li 74,5 65,8 71,3 74,8
0 1 Li 69,8 68,5 61,0 71,8
0 Ls 98,5 100 100 100 Ls 100 100 100 100
2 Li 68,5 56,5 63,0 67,0
1 2 Li 61,0 60,0 49,5 63,0
1 Ls 100 100 100 100 Ls 100 100 100 100
3 Li 62,5 47,3 54,8 59,3
2 3 Li 52,3 51,5 38,0 54,3
2 Ls 100 100 100 100 Ls 100 100 100 100
… … … … … …
( )1 0,75ˆ ky 80,5 75,0 79,5 82,5 ( )2 0,75ˆ ky 78,5 77,0 72,5 80,5
( )1 0,25ˆ ky 92,5 93,5 96,0 98,0 ( )2 0,25ˆ ky 96,0 94,0 95,5 98,0
( )1ˆ
kδ 12,0 18,5 16,5 15,5 ( )2
ˆkδ 17,5 17,0 23,0 17,5
¹ Quando o limite superior ultrapassava a 100 foi feita a substituição por 100. Exemplo para o cálculo dos limites da repetição 3, amostra 2 e B = 3:
( ) ( ) ( ) ( )23 0,75 23 23 0,25 233 3ˆ ˆˆ ˆ; 72,5 .(15,5);95,5 .(15,5) (38,0;132,5)
2 2 2 2B By yδ δ⎛ ⎞ ⎛ ⎞− + = − + =⎜ ⎟ ⎜ ⎟
⎝ ⎠ ⎝ ⎠
224
TABELA 15B Determinação de d1 (com base nos limites da Tabela 14C) para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada
Amostra 1 Amostra 2
Lab. Repetição
Lab. Repetição
1 2 3 4 1 2 3 4
11ky 88 91 93 97 21ky 92 89 93 96 d1 0 0 0 0 d1 0 0 0 0
12ky 97 96 99 99 22ky 100 99 98 100 d1 0 0 0 0 d1 0 0 0 0
13ky 73 59 66 68 23ky 65 65 52 65 d1 1 1 1 1 d1 1 1 1 1
Neste caso não é identificado nenhum outlier, pois todos os valores de d1
são menores que 3, permanecendo todos os valores para o 2º passo.
2 ª etapa) Cálculo da medida de discrepância 2d
São construídos intervalos de confiança para mediana (Tabela 16B) e
verifica-se em qual deles a observação está contida, sendo atribuído um índice
de discrepância d2 com valor correspondente ao número do intervalo menos uma
unidade, com exceção de d2 =0, que é determinado pelos dois primeiros
intervalos (Tabela 17B).
225
TABELA 16B Determinação dos limites inferiores e superiores e valores de d2 para os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada
Amostra 1 Amostra 2
B Repetição
d1
B Repetição
d1 1 2 3 4 1 2 3 4
0 Li1 79,2 76,5 80,3 84,4
0 0 Li1 78,7 76,3 74,7 82,1
0 Ls1= Li2 88,0 91,0 93,0 97,0 Ls1= Li2 92,0 89,0 93,0 96,0 Ls2 96,7 100 100 100 Ls2 100 100 100 100
1 Li1 70,5 61,9 67,6 71,9
0 1 Li1 65,5 63,7 56,5 68,3
0 Ls1= Li2 79,2 76,5 80,3 84,4 Ls1= Li2 78,7 76,3 74,7 82,1 Ls2 100 100 100 100 Ls2 100 100 100 100
2 Li1 61,7 47,4 54,8 59,3
1 2 Li1 52,2 51,0 38,2 54,4
1 Ls1= Li2 70,4 61,9 67,6 71,9 Ls1= Li2 65,5 63,7 56,5 68,3 Ls2 100 100 100 100 Ls2 100 100 100 100
… … … … … …
1ky 88,0 91,0 93,0 97,0 2ky 92,0 89,0 93,0 96,0
21ks 147 403 309 301 2
2ks 336 305 637 367 '1kn 3 3 3 3 '
2kn 3 3 3 3
( )1md ks 8,8 14,5 12,7 12,6 ( )2md ks 13,3 12,6 18,3 13,9 TABELA 17B Determinação de d2 (com base nos limites da Tabela 16B) para
os três laboratórios em duas amostras e quatro repetições cada
Amostra 1 Amostra 2
Lab. Repetição
Lab. Repetição
1 2 3 4 1 2 3 4
11ky 88 91 93 97 21ky 92 89 93 96 d1 0 0 0 0 d1 0 0 0 0 d2 0 0 0 0 d2 0 0 0 0
12ky 97 96 99 99 22ky 100 99 98 100 d1 0 0 0 0 d1 0 0 0 0 d2 0 0 0 0 d2 0 0 0 0
13ky 73 59 66 68 23ky 65 65 52 65 d1 1 1 1 1 d1 1 1 1 1 d2 0 1 1 1 d2 1 1 1 1
226
3ª a 5ª etapas) Classificação, cálculo da exatidão e precisão (Tabela 18B)
TABELA 18B Determinação de medidas auxiliares, exatidão, precisão e
classificação pelo método de Campos para os três laboratórios em duas amostras
Lab. lT nl
( )IIlE "
1n "2n 2
min(1)s 2min(2)s 2
mins 2( )obs ls lI ( )II
lP Clas. 1 0 8 100
8 8 15,7 17,0 16,3 9,7 0 100 Ouro
2 0 8 100 2,0 0 100 Ouro 3 13 8 90,3 39,0 0 100 Ouro
Para os cálculos de 2min(1)s e 2
min(2)s são excluídas todas as determinações do laboratório 3, uma vez que a soma de d1 com d2 é diferente de zero. Análise de agrupamento
Para a aplicação da técnica de análise de agrupamento, estão sendo
utilizados resultados de um teste de germinação, com cinco laboratórios e duas
amostras (Tabela 19B).
TABELA 19B Resultados médios de um teste de germinação com cinco laboratórios em duas amostras
Lab. Amostra 1 Amostra 2 1 86 85 2 82 80 3 82 81 4 82 85 5 72 74
227
A primeira etapa consiste no cálculo da distância euclidiana entre cada
par de laboratórios – grupos (Tabela 20B). Determina-se um novo grupo para a
combinação que apresentar a menor distância.
TABELA 20B Resultados das distâncias euclidianas para combinações duas a duas de quatro laboratórios em duas amostras
Combinações ijd Novo grupo
Lab1 – Lab2 6,43
Lab2 e Lab3, representado por Lab23
Lab1 – Lab3 5,66 Lab1 – Lab4 4,00 Lab1 – Lab5 17,80 Lab2 - Lab3 1,00 Lab2 – Lab4 5,00 Lab2 - Lab5 11,66 Lab3 - Lab4 4,00 Lab3 – Lab5 12,21 Lab4 – Lab5 14,87
Exemplo do cálculo da distância entre os laboratórios 1 e 2
( ) ( ) ( )2 2 212 1 . 2 .
186 82 85 80 6,43
p
k kk
d y y=
= − = − + − =∑
1ª matriz de distâncias:
1 2 3 4 51 0,00 6,43 5,66 4,00 17,802 6,43 0,00 1,00 5,00 11,663 5,66 1,00 0,00 4,00 12,214 4,00 5,00 4,00 0,00 14,875 17,80 11,66 12,21 14,87 0,00
Lab Lab Lab Lab LabLabLabLabLabLab
⎡ ⎤⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦
228
Processo 1: Recalcular a matriz de distâncias pelo método de ligação média,
considerando o novo grupo Lab23 com os demais grupos.
Exemplo do cálculo da distância do Lab1 (grupo 1G ) com o novo grupo Lab23
(grupo 2G ) utilizando os resultados da 1ª matriz:
( ) ( ) ( )12 131 2
6,43 5,66, 1, 23 6,05(1.2) 2
d dd G G d Lab Lab
+ += = = =
Calculam-se também as distâncias entre Lab4 e Lab23; e entre Lab5
com Lab23, atualizando-se assim a matriz de distâncias com esses novos valores
e mantendo as demais distâncias apresentadas na 1ª matriz de distâncias.
2ª matriz de distâncias:
1 23 4 51 0,00 6,05 4,00 17,8023 6,05 0,00 4,50 11,944 4,00 4,50 0,00 14,875 17,80 11,94 14,87 0,00
Lab Lab Lab LabLab
LabLabLab
⎡ ⎤⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦
Processo 2: Recalcular a matriz de distância, considerando o novo grupo Lab14
(menor distância apresentada na 2ª matriz) com os grupos remanescentes Lab23
e Lab5, utilizando ainda alguns resultados da 1ª matriz de distâncias:
( ) ( )12 13 42 43 6,43 5,66 5,00 4,0014, 23 5,27(2.2) 4
d d d dd Lab Lab
+ + + + + += = =
229
3ª matriz de distâncias: 14 23 5
14 0,00 5,27 16,4323 5,27 0,00 11,945 16,43 11,94 0,00
Lab Lab LabLabLabLab
⎡ ⎤⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦
Processo 3: Recalcular a matriz de distância, considerando o novo grupo
Lab2314 (menor distância apresentada na 3ª matriz) com o grupo remanescente
Lab5.
( ) ( )25 35 15 45 12,21 14,87 17,80 11,662314, 5 14,14(4.1) 4
d d d dd Lab Lab
+ + + + + += = =
4ª matriz de distâncias:
2314 52314 0,00 14,14
5 14,14 0,00
Lab LabLab
Lab⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦
O processo é finalizado com a formação de um único grupo Lab23145,
sendo construído o dendrograma considerando as menores distâncias em cada
processo, neste exemplo, 1,00; 4,00; 5,27; 14,14 (Figura 1B).
230
05
1015
20
Grupos
Med
ida
das
dist
ânci
as
lab5
lab2
lab3
lab1
lab4
FIGURA 1B Dendrograma para o agrupamento de 5 laboratórios a partir dos
dados de germinação utilizando o método da ligação média
Para verificar quanto grupos de fato devem ser considerados no final do
processo, pode se utilizar o procedimento de Mojena (1977) (Tabela 21B).
TABELA 21B Determinação do ponto de corte para determinação do número de grupos, procedimento de Mojena (1977)
Estágio (m) Grupos mα
1 Lab1,Lab2,Lab3, Lab4, Lab5 2 Lab1, Lab23, Lab4, Lab5 1,00 3 Lab14, Lab23, Lab5 4,00 4 Lab2314, Lab5 5,27 5 Lab23145 14,14
Média (α ) 6,10 Desvio padrão ( )as 5,65
asα φ+ - Ponto de corte 13,16
231
Neste exemplo, por este critério, seria considerado apenas um único
grupo com todos os laboratórios.
Para validar o agrupamento são comparadas as distâncias efetivamente
observadas entre os objetos (distâncias euclidianas) e as distâncias previstas a
partir do processo de agrupamento, utilizando-se a correlação cofenética (Tabela
22B).
TABELA 22B Medidas das distâncias euclidianas e previstas para o cálculo da correlação cofenética
Combinações Distância euclidiana Distância prevista Lab1 – Lab2 6,43 5,27 Lab1 – Lab3 5,66 5,27 Lab1 – Lab4 4,00 4,00 Lab1 – Lab5 17,80 14,14 Lab2 - Lab3 1,00 1,000 Lab2 – Lab4 5,00 5,27 Lab2 - Lab5 11,66 14,14 Lab3 - Lab4 4,00 5,24 Lab3 – Lab5 12,21 14,14 Lab4 – Lab5 14,87 14,14
Correlação cofenética 0,95
O agrupamento pode ser considerado de boa qualidade, pois o valor da
correlação cofenética é próximo de 1.
232
ANEXO C
Para esboçar um boxplot devem ser calculadas várias medidas
descritivas (Figura 1C).
*
Valores extremos: valores maiores que 3 comprimentos da caixa, a partir do percentil 75%
25% dos dados estão acima da caixa °
Outliers: valores maiores que 1,5 comprimentos da
caixa, a partir do percentil 75%
Maior valor que não é outlier
Percentil 75% 50% dos dados estão
Mediana
dentro da caixa
Percentil 25%
Menor valor que não é outlier
25% dos dados estão abaixo da caixa
°
Outliers: valores menores que 1,5 comprimentos da
caixa, a partir do percentil 25%
* Valores extremos: valores menores que 3 comprimentos da caixa, a partir do percentil 25%
Fonte: Cazorla (2001)22
FIGURA 1C Descrição das medidas utilizadas na construção de um boxplot 22 CAZORLA, I. C. Educação estatística: análise exploratória. Ilhéus, BA, 2001. Cap. III, 41 p. Disponível em: <http://www.socio-estatistica.com.br/Edestatistica/apostila.htm>. Acesso em: 10 abr. 2009.
233
Calculadas as medidas descritivas como: mediana, o pecentil 25%, o percentil 75% e a amplitude interquartílica é possível esboçar o boxplot, sendo que o comprimento da caixa é determinado pela amplitude interquartilica = Q3 - Q1
234
ANEXO D Teste de Box’s M (Ferreira, 200823)
Um dos testes para verificar a homogeneidade de matrizes de
covariâncias de 2I ≥ populações normais multivariadas é conhecido como teste
de Box’s M.
Esse teste foi proposto por Box (1949) como uma modificação ao teste
de Bartlett (1947).
O interesse é testar a hipótese de homogeneidade sobre as covariâncias
( )pxp das I populações dada por:
0 1 2: ... IH ∑ = ∑ = = ∑
Considerando amostras aleatórias de I populações normais p-variadas
( ),p i iN μ ∑ de tamanho in , cada uma (1,2,..., )i I= . A amostra da i-ésima
população é dada por 1 2, ,...,ii i inY Y Y em que p
ijY ∈ corresponde a j-ésima da
unidade da i-ésima população. Considerando ainda que .1
Iii
n n=
=∑ , a estatística
do teste de Box’s M é dada por: 2
2
1 1
1 1 2 3 1 ln ( ) ln6( 1)( 1)
I I
i i ci ii
p p x S n I Sn I p I
χ νν= =
⎡ ⎤⎛ ⎞⎛ ⎞+ − ⎡ ⎤= − − − −⎢ ⎥⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎢ ⎥− + − ⎣ ⎦⎢ ⎥⎝ ⎠⎝ ⎠⎣ ⎦
∑ ∑ ,
possui distribuição assintótica qui-quadrado com ( 1) ( 2) / 2f I p p= − + graus
de liberdade, sendo que os estimadores ( )e i cS S não-viesados das matrizes de
covariâncias populacionais são definidos por:
23 FERREIRA, D.F. Estatística multivariada. Lavras: UFLA/DEX, 2008. 661 p.
235
( )( ) ( ). .1
1 1ˆ ˆ e 11 1
in T
i ij i ij i c i iji
S Y Y Y Y S n Sn n=
= − − = −− −∑
236
ANEXO E
Neste anexo são apresentados os tipos de bancos de dados que foram
montados para análise no R e variaram conforme a técnica estatística
empregada; um exemplo com alguns relatórios gerados e os comandos para a
execução da FunçãotesteH.
A justificativa para apresentação de tais exemplos decorre de dois fatos.
Primeiro, as rotinas desenvolvidas no R estão na forma de linguagem de
programação e, conseqüentemente, apresentam uma lógica para a montagem do
banco de dados.
Segundo, exemplificar para pesquisadores a montagem de alguns tipos
de banco de dados para viabilizar a utilização dos mesmos no software R.
Teste H
TABELA 1E Exemplo da montagem de um banco de dados para a realização do
teste H
Lote¹ Subamostra Germinação LT1 S1 98 LT1 S2 92 LT1 S3 96 LT1 S4 95 LT1 S5 94 LT2 S1 85 … … …
LT5 S5 74 ¹ Não utilizar, por exemplo, a simbologia L T 1, ou seja, não devem ser dados espaço entre letras, senão o software R fará a leitura considerando como sendo 3 colunas separadas
237
Método de Hampel
Foi montado um banco de dados inicial somente para a detecção de
outliers (seção 5.4.1 do capítulo 2).
TABELA 2E Exemplo da montagem de um banco de dados para a realização do método de Hampel
Laboratório Lote Repetição Germinação LB1 LT 1 R1 98 LB1 LT 1 R2 92 LB1 LT 1 R3 96 LB2 LT 1 R1 95 LB2 LT 1 R2 94 LB2 LT 1 R3 85 … … … …
LB8 LT 5 R3 75
Análise Discriminante
TABELA 3E Exemplo da montagem de um banco de dados para a Análise
Discriminante
Grupo R1 R2 R3 G1 90 95 98 G1 89 94 92 G1 92 91 96 G1 94 93 95 G1 91 96 94 G1 89 97 85 … … … … G3 75 70 72
238
Método do Z-score e Método Campos (1998)
TABELA 4E Exemplo da montagem de um banco de dados para o método do Z-score e método de Campos (1998)
Laboratório Lote Repetição Germinação Rodada¹
LB1 LT1 R1 98 1 LB1 LT1 R2 92 1 LB1 LT1 R3 96 1 LB2 LT1 R1 95 1 LB2 LT1 R2 94 1 LB2 LT1 R3 85 1 … … … … …
LB12 LT5 R3 79 6 ¹ No caso desse estudo foi realizada apenas uma rodada.
Análise de Agrupamento
TABELA 5E Exemplo da montagem de um banco de dados para a Análise de
Agrupamento
¹ Amostra1 Amostra2 Amostra3 LB1 90 95 98 LB2 89 94 92 LB3 92 91 96 LB4 94 93 95 LB5 91 96 94 LB6 89 97 85 … … … …
LB12 75 70 72 ¹ Na utilização das funções já implementadas no R para esta técnica, não se nomeia a coluna do fator ² São utilizadas as médias de cada laboratório de acordo com a amostra.
239
Análise Generalizada de Procrustes (GPA)
Para a Análise Generalizada de Procrustes o banco de dados inicial é
formado por um vetor único. No próprio R são estruturadas oito (repetições)
matrizes (arrays) tendo nas linhas os laboratórios e nas colunas as amostras, de
acordo com os seguintes comandos:
gvar=read.table("gvar.txt",h=T)
attach(gvar)
testvar<-array(gv,
dim=c(12,3,8),
dimnames=list(Lab=c("1","2","3","4","5","6","7","8","9","10","11","12"),
Amostra=c("1","2","3"),
Repetição=c("1","2","3","4","5","6","7","8")))
240
Outliers detectados pelo Método de Hampel - Areia ____________________________________________________________ Lab. Lote Rep. Germ. 1 3 2 81 6 3 3 85 8 3 3 78 ____________________________________________________________ Outliers detectados pelo Box plot - Areia _____________________________________________________________ Lab. Lote Rep. Germ. 1 3 2 81 8 3 3 78 6 5 3 74 8 5 3 71 _____________________________________________________________
Detecção de outliers nas variâncias para cada lote pelo Teste de Levene - Areia __________________________________________________________________ Lote valorp Condição¹ 1 0.0915 Var. Homogêneas - continuar a análise 2 0.2698 Var. Homogêneas - continuar a análise 3 0.0099 Var. Heterogêneas - repetir o teste 4 0.0067 Var. Heterogêneas - repetir o teste 5 0.0009 Var. Heterogêneas - repetir o teste __________________________________________________________________ ¹Nível de significância = 0.01 __________________________________________________________________ Comparação com Limite crítico de Reprodutibilidade - Areia _______________________________________________________________ Lote Amostra.1 Amostra.2 Amostra.3 limite_crítico sR 1 14 7 13 16.93892 4.203881 2 14 16 21 23.99690 5.955523 3 6 4 7 8.49251 2.308827 4 23 23 20 34.91761 8.665812 5 12 9 18 18.20006 4.516870 _______________________________________________________________
FIGURA 1E Exemplo de alguns relatórios gerados no software R para o Capítulo 2
241
Resultado do Z score¹ - Exatidão __________________________________________________________________ Lab. Viés.rod Precisão.rod Exat.rod Clas.Exat.rod² 1 0.6 1.2 1.4 Aceitável 2 1.1 1.4 1.7 Crítico 3 2.8 5.7 6.4 Não aceitável 4 0.5 0.1 0.5 Aceitável 5 0.6 1.2 1.3 Aceitável 6 2.1 4.1 4.6 Não aceitável 7 1.8 1.7 2.4 Não aceitável 8 1.4 0.5 1.5 Aceitável 9 0.9 0.7 1.1 Aceitável 10 2.1 4.4 4.8 Não aceitável 11 1.8 1.8 2.6 Não aceitável 12 2.6 5.5 6.1 Não aceitável __________________________________________________________________ ¹Nível de confiança = 0.95 __________________________________________________________________ ² Aceitável - Exatidão menor que 1,5 Crítico - Exatidão maior ou igual a 1,5 e menor que 2,0 Não aceitável - Exatidão maior do que 2,0 __________________________________________________________________ Resultado do Método do Profert __________________________________________________________________ Lab. Exatidão Precisão Selo¹ 1 93.29 88.89 Ouro 2 96.3 100 Ouro 3 88.89 88.89 Ouro 4 91.9 77.78 Ouro 5 97.92 100 Ouro 6 91.9 88.89 Ouro 7 93.29 88.89 Ouro 8 95.6 88.89 Ouro 9 93.06 100 Ouro 10 94.68 88.89 Ouro 11 81.25 66.67 Prata 12 86.57 55.56 Prata __________________________________________________________________ ¹ Selo Ouro - Exatidão e Precisão maiores que 67% Selo Prata - Exatidão maior que 67% e Precisão menor ou igual a 67% Selo Bronze - Exatidão menor que 67% e Precisão maior que 67% Nenhum selo - Exatidão e Precisão menores ou iguais a 67% __________________________________________________________________
FIGURA 2E Exemplo de alguns relatórios gerados no software R para o
Capítulo 3
242
#==============================================================# Nome : FunçãoTesteH # Autora : Verônica Yumi Kataoka # Data : 18/08/2008 # Versão : v1 # Objetivo : Realizar o teste H de acordo com as normas ISTA., 2006 #============================================================== FunçãoTesteH =function (a,N,n,fc,prob) { mg=tapply(a[,3],a[,1],mean) s2=a[,3]^2 stot=tapply(s2,a[,1],sum) stotq=(tapply(a[,3],a[,1],sum))^2 varobs=(N*stot-stotq)/(N*(N-1)) varaceit=(mg*(100-mg)*fc)/n H=round(((varobs/varaceit)-fc),2) qui=qchisq((1-prob),N-1) Htabela=(fc*qui)/(N-1) Htabelaf=round((Htabela -fc),2) lt=as.factor(a[,1]) nL=nlevels(lt) j=matrix(0,nL,1) for(i in 1:nL) { j[i]<- ifelse(H[i] < Htabelaf, "Homogêneo", "Heterogêneo") } d<-data.frame(Lote=levels(a[,1]),Hcalculado=H,Htabelado¹=Htabelaf,Condição = j) cat("____________________________________________","\n") cat(" Teste H ","\n") cat("____________________________________________","\n") print(d,row.names=FALSE) cat("____________________________________________","\n") cat("¹Nível de significância =",(prob),"\n") cat("_____________________________________________________","\n") Sys.time( ) cat("_____________________________________________________","\n") cat("#####################################################","\n") } FIGURA 3E Programa para execução da FunçaoTesteH no software R
243
ANEXO F
Neste anexo são apresentados resultados complementares do Capítulo 3.
TABELA 1F Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados do grupo 1, de acordo com a simulação 1
Grupo Lab. Classificação Nota Viés Precisão Exatidão Classif. Exatidão
1
1 A 5 0,8 1,5 1,8 Crítico 2 A 5 0,9 1,2 1,5 Crítico 3 BMP 0 2,9 5,9 6,6 Não aceitável 4 A 5 0,7 0,1 0,7 Aceitável 5 A 5 0,5 1,1 1,3 Aceitável 6 B 4 1,7 3,3 3,7 Não aceitável 7 C 3 1,8 1,4 2,3 Não aceitável 8 B 4 1,6 0,4 1,6 Crítico 9 B 4 1,2 1,3 1,7 Crítico
10 B 4 1,4 3,0 3,3 Não aceitável
TABELA 2F Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados do grupo 1, de acordo com a simulação 2
Grupo Lab. Classificação Nota Viés Precisão Exatidão Classif. Exatidão
1
1 A 5 0,3 0,5 0,5 Aceitável 2 B 4 1,4 1,2 1,8 Crítico 3 A 5 0,8 0,1 0,8 Aceitável 4 B 4 1,3 2,6 2,9 Não aceitável 5 C 3 2,1 3,6 4,1 Não aceitável 6 A 5 0,7 0,7 1,0 Aceitável 7 C 3 2,2 4,2 4,7 Não aceitável 8 BMP 0 5,0 10,6 11,7 Não aceitável 9 C 3 2,3 4,3 4,9 Não aceitável
10 BMP 0 4,1 9,1 10,0 Não aceitável
244
TABELA 3F Resultados do método do Z-score para o conjunto de dados do grupo 1, de acordo com a simulação 3
Grupo Lab. Classificação Nota Viés Precisão Exatidão Classif. Exatidão
1
1 A 5 0,9 1,9 2,1 Não aceitável 2 BMP 0 2,9 0,7 2,9 Não aceitável 3 A 5 0,5 1,0 1,1 Aceitável 4 A 5 0,5 1,1 1,2 Aceitável 5 A 5 1,0 0,4 1,1 Aceitável 6 A 5 0,6 0,5 0,8 Aceitável 7 A 5 1,1 0,3 1,2 Aceitável 8 A 5 0,7 1,5 1,6 Crítico 9 A 5 0,4 0,6 0,8 Aceitável
10 A 5 1,0 1,9 2,2 Não aceitável
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo