tese - leon, pmm final
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
GENÔMICA APLICADA À REPRODUÇÃO EQUINA
Priscila Marques Moura de Leon
Pelotas, 2011
PRISCILA MARQUES MOURA DE LEON
Genômica Aplicada à Reprodução Equina
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do conhecimento: Biotecnologia).
Orientador: Tiago Collares Co-orientador: João Carlos Deschamps
Pelotas, 2011
Dados de catalogação na fonte:
Maria Beatriz Vaghetti Vieira – CRB 10/1032
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
L579g Leon, Priscila Marques Moura de
Genômica aplicada à reprodução equina / Priscila Marques Moura de Leon. – 93f. : fig., tab. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico, 2011. – Orientador Tiago Collares; co-orientador João Carlos Deschamps.
1.Biotecnologia. 2.Reprodução equina. 3.Expressão
gênica. 4.Polimorfismo genético. 5.DNA fetal livre. 6.Apoptose. 7.p53. 8.Sexagem molecular. I.Collares, Tiago. II.Deschamps, João Carlos. III.Título.
CDD: 636.10824
Banca examinadora: Prof. Dr. Tiago Collares, Universidade Federal de Pelotas Prof. PhD. João Carlos Deschamps, Universidade Federal de Pelotas Prof. Dra. Fabiana Kömmling Seixas, Universidade Federal de Pelotas Prof. Dra. Marta Gonçalves do Amaral, Universidade Federal de Pelotas
Aos meus pais, Vera e Ottoni, aos meus irmãos, Alexandre e Ottoni, ao meu
marido, Leonardo, e ao meu afilhado, Arthur, com amor dedico este trabalho.
“A vos, que tanto me enseñaste, el día que cantaste conmigo una canción”
(Cacho Castaña)
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Tiago Collares, pela confiança em meu trabalho, amizade,
incansável motivação e apoio dedicado à minha formação.
À Professora Fabiana Kömmling Seixas, pelos ensinamentos, amizade e pelo
apoio fundamental em meu doutorado.
Ao meu co-orientador, João Carlos Deschamps, por seus ensinamentos e por
fazer parte da minha formação profissional.
Ao colega Vinicius Campos, pelo apoio, amizade e ajuda na execução deste
trabalho.
Às colegas, Helena Thurow e Fernanda Nedel, pelo apoio durante o curso de
doutorado e desenvolvimento dos experimentos.
Aos colegas, Karine Begnini e Cristian Kaefer, pela colaboração nos
experimentos.
Aos alunos de iniciação científica, Caroline Lucas, Cristina Haas e Fernando
Pires Hartwig, pelo apoio na execução dos experimentos.
Aos colegas do Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese e do
Laboratório de Genômica Funcional.
Aos colegas e professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,
em especial ao Prof. Odir Dellagostin e ao Prof. Fabio Leivas Leite.
Aos colegas Médicos Veterinários do Stud TNT, Pablo e Pico, pela ajuda
prestada na execução deste trabalho.
A todos os demais que de alguma forma contribuíram com a execução deste
trabalho.
Muito Obrigada!
“Quem baila essa chacarera
Não pode "froxá o garrão"
Hay que firma o puchero
Batendo o legüero do coração”
Pirisca Grecco
RESUMO
LEON, Priscila Marques Moura de. Genômica aplicada à reprodução equina. 2011. 93f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Em equinos, as intersecções entre a reprodução e a genômica são numerosas, no
entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que atuam na fertilidade. Com o
genoma equino completo, existe a possibilidade de análises moleculares e estudo
de genes candidatos a biomarcadores para características reprodutivas específicas.
Com base nestas informações, a presente tese teve como objetivo desenvolver
estudos de genômica aplicada à reprodução equina. O primeiro artigo analisou a
expressão de genes relacionados a apoptose (Bax, Bcl-2, survivin e p53) no
complexo cumulus oócito equino através de qRT-PCR, comparando a expressão
gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características
morfológicas durante a maturação in vitro. Como resultados, foi observada maior
expressão do survivin (P<0.05) e menor expressão de p53 (P<0.01) em oócitos
comparado a células do cumulus do grupo considerado morfologicamente saudável.
Enquanto que a expressão de Bax foi maior (P<0.02) em células do cumulus do
grupo saudável comparado ao grupo com características morfológicas não
desejáveis. O segundo artigo analisou um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)
no gene p53, relacionando-o a parâmetros reprodutivos de éguas Puro Sangue
Inglês. Foi relatado pela primeira vez um SNP Arginina/Prolina na região do exon 4
do gene p53 equino. A prevalência foi de 73,3% para o genótipo heterozigoto, 17,1%
do genótipo Arginina/Arginina e 9,6% do Prolina/Prolina. O genótipo Arginina/Prolina
foi associado (P=0.02) a ocorrência de aborto, enquanto que o genótipo
Prolina/Prolina foi associado (P<0.05) a menor probabilidade de aborto, indicando
um papel da p53 na reprodução equina. O terceiro artigo determinou a presença de
DNA fetal livre e circulante (ccffDNA) no plasma de éguas prenhas, desenvolvendo
um teste molecular de diagnóstico pré-natal na determinação do sexo fetal através
da amplificação do gene SRY pelas técnicas de PCR, de re-amplificação por PCR
(2º-PCR) e de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Este é o primeiro relato do
DNA fetal livre e circulante em equinos. O teste de sexagem molecular resultou em
72% de sensibilidade e 85% de acurácia na técnica de PCR. Com o 2º-PCR e qPCR
a sensibilidade foi de 90,9% e 95% de acurácia. Este estudo demonstra pela
primeira vez a determinação do sexo fetal em éguas utilizando o ccffDNA. Os
resultados apresentados colaboram para o entendimento da biologia reprodutiva da
espécie equina, e indicam marcadores genéticos em potencial para parâmetros de
fertilidade. Esta tese resultou na publicação de três artigos em periódicos
internacionais da área de Reprodução e um pedido de Patente de Invenção.
Palavras-chave: Reprodução equina. Expressão Gênica. Polimorfismo Genético.
Diagnóstico Molecular. Apoptose. p53. DNA fetal livre.
ABSTRACT
LEON, Priscila Marques Moura de. Genômica aplicada à reprodução equina.
2011. 93f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
In equine, the intersections between reproduction and genomics are numerous,
however, little known about the genetic factors that acting on fertility. The conclusion
of equine genome sequencing project, brings the oportunity to evaluate candidate
genes and molecular biomarkers for specific reproductive characteristics. Based on
this information, this PhD thesis aimed to develop genomic studies applied to equine
reproduction. The first paper analyzed the expression of apoptotic-related genes
(Bax, Bcl-2, survivin and p53) in equine cumulus-oocyte complex by qRT-PCR,
comparing gene expression between morphologically distinct oocytes and cumulus
cells during in vitro maturation. Results showed that survivin mRNA levels were
higher (P<0.05) and p53 mRNA levels was lower (P<0.01) in oocytes compared to
cumulus cells in morphologically healthy. On the other hand, expression of the Bax
was significantly higher in morphologically healthy cumulus cells (P<0.02). The
second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene,
looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is
the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene.
The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared
to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of
mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with
abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion
(P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The
third article has determined the presence of circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA)
in pregnant mare’s plasma, looking to develop a molecular test for the prenatal
diagnosis of fetal sex determination using SRY gene amplification by PCR, re-
amplification by PCR (2nd-PCR) and real-time quantitative PCR (qPCR). This is the
first report of ccffDNA in equine species. The molecular sexing test resulted in
sensitivity of 72% and accuracy of 85% on the PCR. Using the 2nd-PCR and qPCR
we obtained an increasing in the sexing sensitivity results (90.9%) and an accuracy
of 95%. This study demonstrates for the first time the fetal sex determination in
mares using ccffDNA. This PhD thesis resulted in the publication of three papers in
international journals of reproduction and a patent application request. The results
presented here collaborate to understand the equine reproductive biology, and
indicate potential genetic markers to fertility parameters.
Keywords: Equine Reproduction. Gene Expression. Genetic Polymorphism.
Molecular Diagnostics. Apoptosis. p53. ccffDNA.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACTB - Actin Beta
AMELX - Amelogenin X-Linked
AMELY - Amelogenin Y-Linked
Bax - BCL2-Associated X Protein
BcL-2 - B-Cell CLL/Lymphoma 2
ccffDNA - DNA fetal livre circulante (circulating cell-free fetal DNA)
CCO - Complexo Cumulus-oócito
CRISP3 - Cysteine-Rich Secretory Protein 3
eLH - Equine Luteinizing Hormone
FIV - Fertilização In Vitro
GAPDH - Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase
G6PDH - Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase
HYPP - Paralisia Periódica Hipercalêmica (Hyperkalemic periodic paralysis)
HSP70 - Heat Shock 70kDa Protein
HSPA1A - Heat Shock 70kDa Protein 1A
ICSI - Injeção intracitoplasmática de espermatozóides
IL-1 - Interleucina 1
IL-1ß - Interleucina 1 Beta
INHBA - Inhibin Beta A
LIF - Fator Inibitório de Leucemia
Mcl-1 - Myeloid Cell Leukemia Sequence 1
MIV - Maturação In Vitro
pb - pares de base
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PIV - Produção In Vitro de Embriões
qRT-PCR - Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real
RPL32 - Ribosomal Protein L32
SCID - Imunodeficiência Combinada Grave (Severe combined immunodeficiency
disease)
SNP - Polimorfismos de Nucleotídeo Único
SPATA1 - Spermatogenesis Associated 1
SRY - Sex Determining Region Y
UBC - Ubiquitin C
ZFY - Zinc Finger Protein Y-Linked
ZFX - Zinc Finger Protein X-Linked
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 7
ABSTRACT ................................................................................................................. 9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................... 11
1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................ 14
1.1 Reprodução Equina ......................................................................................... 14 1.2 Genômica na Reprodução Equina ................................................................... 15 1.3 Expressão Gênica na Reprodução Equina ...................................................... 17 1.4 Polimorfismos Genéticos na Reprodução de Equinos ..................................... 20 1.5 Aplicação de Diagnóstico Molecular em Equinos ............................................ 22
2. ARTIGO I .............................................................................................................. 24
EXPRESSION OF APOPTOTIC GENES IN IMMATURE AND IN VITRO MATURED EQUINE OOCYTES AND CUMULUS CELLS .......................................................... 25
Summary ............................................................................................................... 26 1. Introduction ........................................................................................................ 27 2. Materials and methods....................................................................................... 29 3. Results ............................................................................................................... 32 4. Discussion ......................................................................................................... 33 5. References ........................................................................................................ 38
3. ARTIGO II ............................................................................................................. 46
ASSOCIATION BETWEEN SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN P53 AND ABORTION IN THOROUGHBRED MARES .................................................... 47
Abstract.................................................................................................................. 48 Short Communication ............................................................................................ 49 References ............................................................................................................ 52
4. ARTIGO III ............................................................................................................ 56
EQUINE FETAL SEX DETERMINATION USING CIRCULATING CELL-FREE FETAL DNA (CCFFDNA) ......................................................................................... 57
Abstract.................................................................................................................. 58 1. Introduction ........................................................................................................ 59 2. Materials and Methods....................................................................................... 61 3. Results and Discussion ...................................................................................... 65 5. References ......................................................................................................... 68
5. PATENTE DE INVENSÃO .................................................................................... 56
Anexo de Inventores .............................................................................................. 74 Resumo da Patente de Invenção ........................................................................... 75
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 73
7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 73
8. ANEXO I: Produção Científica no Doutorado ...................................................... 73
14
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Reprodução Equina
A criação de equinos tem uma elevada importância comercial, sendo o Brasil
um dos países que se destacam neste nicho econômico, principalmente devido a
crescente popularidade de esportes equestres. Segundo o Ministério da Agricultura,
no ano de 2010 o Brasil possuía o maior rebanho de equinos na América Latina,
sendo o terceiro rebanho mundial, com oito milhões de animais. O Complexo do
Agronegócio Cavalo movimenta R$ 7,3 bilhões somente com a produção de cavalos,
e ainda gera 3,2 milhões de empregos diretos e indiretos.
Diferentemente de outras espécies domésticas de interesse zootécnico, os
equinos são valorizados como indivíduo, onde animais de alto padrão genético
atingem valores elevados de comércio e reprodução. Éguas e garanhões são
selecionados para a reprodução de acordo ao seu desempenho esportivo,
morfologia e pedigree, e não de acordo a fertilidade. Portanto, fatores fisiológicos e
de capacidade reprodutiva muitas vezes são selecionados negativamente, o que
leva a menores índices reprodutivos e possíveis fracassos em levar uma gestação a
termo.
O aumento do rebanho equino e a demanda de animais de alta performance
precisa ser amparado por programas de melhoramento genético, sendo assim, o uso
de biotecnologias aplicadas à reprodução assistida possibilita tal incremento. Apesar
do progresso obtido na última década no sistema de produção in vitro de embriões
(PIV) equinos, seus gametas e embriões apresentam características espécie-
específicas que precisam ser elucidadas.
15
Novos conhecimentos sobre a competência de desenvolvimento, a maturação
in vitro (MIV) e a criopreservação de oócitos e embriões é crítica para a PIV de
equinos. As técnicas de reprodução assistida, como a Injeção intracitoplasmática de
espermatozóides (ICSI), têm sido realizadas com sucesso, no entanto, a baixa
eficiência tem limitado a sua aplicação comercial para esta espécie (SQUIRES et al.,
2003; CHOI et al., 2006; HINRICHS et al., 2007). Este fato é contraditório, uma vez
que o cavalo é uma espécie em que o indivíduo é suficientemente valorizado para
justificar o uso de biotécnicas que aprimorem sua criação.
O progresso na área de biotécnicas reprodutivas foi inicialmente lento, pois a
fertilização in vitro (FIV) convencional não é reproduzível em equinos (HINRICHS,
2010). No entanto, ICSI resultou no nascimento de muitos potros (GALLI et al., 2007;
JACOBSON et al., 2010; MORTENSEN et al., 2010). Apesar disso, a qualidade dos
oócitos e as condições de cultivo in vitro são altamente variáveis, refletindo em
baixos níveis de formação de blastocisto in vitro e baixa reprodutibilidade dos
resultados entre laboratórios (DELL'AQUILA et al., 2003; SMITS et al., 2009).
Com a disponibilidade do genoma equino (WADE et al., 2009), abre a
possibilidade de análises moleculares e estudo de genes candidatos a
biomarcadores para características reprodutivas específicas. Em vista desta
abordagem, maiores conhecimentos sobre a biologia reprodutiva e eventos
moleculares, envolvidos no desenvolvimento e viabilidade de gametas e embriões,
necessitam ser elucidados. Assim como, a realização de estudos na área de
genômica e elaboração de técnicas de diagnósticos moleculares que aprimorem a
criação e a eficiência reprodutiva de equinos.
1.2 Genômica na Reprodução Equina
A reprodução é um dos principais aspectos da criação de equinos. Fatores de
fertilidade em éguas e garanhões são características de suma importância, pois
geram uma série de despesas ao criador. Estudos foram realizados buscando
correlação entre fatores ambientais, comportamentias e fisiológicos com a fertilidade
16
de equinos. No entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que atuam na
fertilidade (CHOWDHARY et al., 2008). Atualmente, os estudos relacionados à
genômica aplicada à reprodução equina têm focado na fertilidade de garanhões
(HAMANN et al., 2007; GIESECKE et al., 2010; NOVACK et al., 2010) e pouco se
sabe sobre a genômica na fertilidade de éguas.
O Projeto do Genoma Equino (The Horse Genome Project) foi iniciado em
1995, onde os cromossomos seriam identificados, e em cada um deles seriam
determinados marcadores genéticos, para que pontos de referência podessem ser
estabelecidos, assim permitindo a comparação entre os genomas equino e humano.
Neste projeto foram sequenciados 20.322 genes codificadores de proteínas, que
correspondem a apenas 2% do DNA dos cromossomos. Além disso, o projeto
mostrou que o equino serviria de modelo biológico para humanos em pelo menos 90
heredietariedades, incluindo infertilidade, doenças inflamatórias e desordens
musculares (WADE et al., 2009).
O genoma nuclear do cavalo é compactado em 32 pares de cromossomos (2n
= 64), dos quais 31 pares são autossomos e dois são cromossomos sexuais (XX nas
fêmeas e XY nos machos) (CHOWDHARY et al., 2008). Estima-se que desde a
fecundação até a maturação sexual, mais de 1.000 genes controlem o
desenvolvimento dos órgãos sexuais masculinos e femininos, e ainda 1.000 genes
adicionais controlam seu funcionamento na vida adulta. Portanto, mutações em
alguns destes genes poderiam causar anormalidades no desenvolvimento sexual e
alterações relacionadas à fertilidade (CHOWDHARY et al., 2008).
As intersecções entre a reprodução e genômica são numerosas. Ao
selecionar reprodutores, além do objetivo de produzir prole com carcterísticas
desejáveis, outros fatores genéticos podem contribuir para problemas reprodutivos
(CHOWDHARY et al. 2008). A aplicação de técnicas de reprodução assistida poderá
minimizar ou amplificar a propagação de alelos deletérios dentro de uma população,
influenciando de forma positiva ou negativa a variabilidade genética (BROSNAHAN
et al., 2010). Anormalidades cromossômicas podem afetar fertilidade (LEAR et al.,
2008), e há evidências de que um alto grau de endogamia pode ter um efeito
deletério na qualidade do sêmen (VAN ELDIK et al., 2006). Estudos moleculares
17
com os genes CRISP3, SPATA1 e INHBA têm sido realizados em associação com
problemas de fertilidade em garanhões (GIESECKE et al., 2010).
O desenvolvimento de mapas genéticos de alta resolução é uma ferramenta
valiosa para o isolamento de genes e marcadores associados com características
economicamente importantes, como a reprodução (CHOWDHARY et al., 2008). A
compreensão mais sofisticada de traços complexos e do impacto do genoma na
aptidão individual, poderá auxiliar na seleção e melhoramento genético dos animais.
Além, de permitir que pesquisadores desenvolvam testes específicos de diagnóstico
e elaborem medidas preventivas de manejo e tratamento (BROSNAHAN et al.,
2010).
1.3 Expressão Gênica na Reprodução Equina
A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) é
uma excelente ferramenta para investigações em mudanças no padrão de
expressão gênica em gametas e no desenvolvimento embrionário inicial, uma vez
que esta técnica pode ser executada com quantidade reduzidas de mRNA. O estudo
da expressão gênica aplicado à embriologia é emergente. Genes envolvidos em
processos biológicos, tais como apoptose, estresse oxidativo e criotolerância,
precisam ser estudados, a fim de comparar a expressão gênica in vivo, in vitro e sob
diferentes condições de cultivo (WRENZYCKI et al, 2005; BADR et al., 2007; RIZOS
et al, 2008). O entendimento dos padrões de expressão gênica pode ser precioso
para a identificação de causas de perda embrionária precoce, e no apoio ao
desenvolvimento de tecnologias de reprodução assistida (PARIS et al., 2011). Tais
estudos facilitam a identificação marcadores moleculares de viabilidade e
competência celular.
Em oócitos equinos existe uma carência em estudos de expressão gênica. A
atividade da proteína G6PDH foi estuda por Mohammadi-Sangcheshmeh et al.
(2011), fornecendo evidências de que a atividade da G6PDH em oócitos imaturos de
equinos possa ser um indicador da competência de desenvolvimento in vitro.
18
Anteriormente, Martoriati et al. (2002), analisaram a expressão da família de genes
IL-1 em oócitos e células do cumulus de equinos, demonstrando um efeito inibitório
da IL-1ß sobre o eLH indutor da retomada da meiose, sem reduzir a expansão das
células do cumulus, indicando que o sistema IL-1 pode ter um papel crucial na
fisiologia ovariana da égua.
Após a retomada da meiose e rompimento da vesícula germinativa, oócitos se
tornam transcricionalmente inativos, e para a síntese proteica devem contar com as
reservas de RNA acumuladas durante a fase de crescimento. Esta inatividade
transcricional e dependência do armazenamento de RNA materno persistem até
após a fertilização. Enquanto que, células do cumulus são transcricionalmente ativas
(PAYTON et al., 2010). Em estudo com complexo cumulus-oócito (CCO) bovino, foi
observado que as células do cumulus ao redor dos oócitos apresentam uma
quantidade significativamente maior de RNA total em relação aos respectivos
oócitos. Além disso, o RNA de oócitos possui maior abundância de fragmentos
pequenos de RNA (200-1500 nucleotídeos) (PAYTON et al., 2006). Estas
características foram comparadas entre seis espécies de mamíferos (bovinos,
ovinos, suínos, caninos, felinos e murinos), sendo observada similaridade quanto a
expressão destes CCOs (PAYTON et al., 2010).
No equino, o genoma embrionário se torna transcricionalmente ativo em
aproximadamente 72 h após a fertilização, ou seja, no estágio de 4-8 células (PARIS
et al., 2011). Apesar disso, os estudos envolvendo expressão gênica de embriões
equinos são escassos. Provavelmente, um obstáculo para a execução destes
estudos é o baixo número de embriões obtidos em coletas in vivo, pois os protocolos
de superovulação são muitas vezes ineficientes. Smits et al. (2009), estudaram
genes de referência para qRT-PCR em blastocistos equinos, concluindo que os
genes ACTB, UBC, RPL32 e GAPDH são recomendados como normalizadores no
estudo da expressão gênica. Mortensen et al. (2010), estudaram a expressão gênica
de HSP70 em blastocistos equinos após a exposição dos oócitos a altas
temperaturas in vitro e in vivo; obtendo que embriões produzidos in vitro
apresentaram maiores níveis de mRNA de HSPA1A, sugerindo que esta alteração
no padrão de expressão gênica seja em resposta à agressão ambiental sofrida in
vitro.
19
A apoptose é um dos principais fatores que afetam o potencial de
desenvolvimento embrionário (PARK et al, 2006; DHALI et al, 2007; ANGUITA et al,
2009). A apoptose, ou morte celular programada, que é um processo ativo e
irreversível da auto-destruição celular sob controle fisiológico (PAROLIN & REASON,
2001). Os mecanismos de apoptose podem ser ativados por estímulos externos,
através da ligação aos receptores específicos na superfície da célula, ou por
estímulos internos de stress intracelular, tais como danos ao DNA, alterações do
ciclo celular e em vias metabólicas, sendo as duas vias controladas por várias
famílias de genes (CHANG et al., 2002). O estudo da apoptose em embriões
bovinos produzidos in vitro demonstrou que os genes Bax, caspase-3 e Mcl-1 podem
ser usados como potenciais marcadores da qualidade embrionária (MELKA et al.
2010).
Estudos sobre a expressão gênica de células cumulus (MCKENZIE et al.,
2004) e apoptose (CORN et al., 2005) mostraram que o padrão de expressão das
células cumulus pode refletir o potencial de desenvolvimento de embriões humanos
durante o cultivo in vitro. A incidência de apoptose em folículos ovarianos de éguas
foi demonstrada por Dell”Aquila et al. (2003), indicando relação com a expansão das
células do cumulus e aumento da competência meiótica. No entanto, nenhuma
associação com maturação citoplasmática foi observada (DELL'AQUILA et al.,
2003). O impacto da apoptose em COC e seu impacto no potencial de
desenvolvimento oocitário permanece obscuro. Assim como, há relatos
contraditórios de várias espécies que não conseguiram esclarecer a ocorrência de
apoptose no COC (YUAN et al., 2005). Em oócitos bovinos imaturos foi relatada uma
ação benéfica da apoptose inicial no desenvolvimento embrionário após a
fertilização, considerando os genes Bax e BcL-2 bons marcadores do processo
inicial de apoptose (LI et al., 2009).
20
1.4 Polimorfismos Genéticos na Reprodução de Equinos
Modernas técnicas de Biologia Molecular vêm sendo utilizadas em estudos
envolvendo a determinação da relação entre a ocorrência de variações no DNA com
características fenotípicas, contribuindo para abordagens preventivas na medicina
humana e animal. Em animais, o interesse consiste no aprimoramento e seleção
genética criteriosos, especialmente na criação de equinos, onde cada animal é
valorizado individualmente. O uso de ferramentas de biologia molecular auxilia a
elucidação e eliminação de desordens genéticas, incrementando o padrão racial dos
animais e os lucros do criador.
Nos últimos anos têm aumentado os estudos relatando polimorfismos de
nucleotídeo único (SNP). Consequentemente, estudos de associação têm sido
realizados para estabelecer relações entre SNP e doenças (CHOWDHARY et al.,
2008). No sequenciamento do genoma equino foi encontrada uma taxa de
polimorfismo estimada em 1 a cada 1.000 pares de base (pb) (WADE et al., 2009). E
um total de 1.162.753 SNPs foram identificados entre seis raças de cavalos
(Andaluz, Árabe, Akhal Teke, Puro Sangue Inglês, Standardbred Americano e
Quarto de Milha) (WADE et al., 2009). Na raça Puro Sangue Inglês especificamente,
foi encontrado uma taxa de polimorfismo menor, 1 SNP a cada 3.000 pb, os autores
atribuem esta taxa à fechada e conservadora seleção genética (WADE et al., 2009).
No Broad Institute – Horse Single Nucleotide Polimorphisms são registrados em sua
base de dados 948.609 SNPs, que abrangem os cromossomos 1-31 e X.
Estudos relacionando SNP e fertilidade de garanhões foram realizados.
Hamann et al. (2007), demonstraram que um polimorfismo no gene CRISP3 (G>A)
tem um efeito significativo sobre a fertilidade de garanhões, pois garanhões
heterozigotos apresentam uma fertilidade reduzida em relação aos homozigotos. O
gene CRISP3 codifica para uma das principais proteínas do plasma seminal e se
expressa principalmente na ampola do canal deferente. A proteína associada a
espermatogênese SPATA 1 também foi estudada em relação a polimorfismos, um
SNP intrônico (BIEC2-968854) foi associado a taxa de prenhes, ou seja, garanhões
heterezigotos apresentaram uma taxa melhor de prenhes em relação aos
21
homozigotos para este SNP (GIESECKE et al., 2009). Giesecke et al. (2010)
analisaram cinco SNPs intrônicos em garanhões que possuem efeito no sítio de
ligação do fator de transcrição do gene INHBA, modificando o nível de expressão da
inibina beta A, que participa da regulação do eixo hormonal hipotálamo-hipófise.
O TP53 é um dos genes mais estudados em oncologia humana, pois em
vários tipos de tumores malignos têm sido encontradas mutações (OLIVIER et al.,
2009). O gene TP53 é fundamental no processo de supressão tumoral, por estar
envolvido na progressão do ciclo celular e apoptose, assim como na manutenção do
DNA e da integridade genômica. Dentre as mutações comumente estudadas,
encontra-se em destaque o SNP do códon 72/exon 4. Este polimorfismo resume-se
a uma variação de um G para um C, resultando na síntese dos aminoácidos Arginina
(CGC) ou Prolina (CCC). Estas duas variantes polimórficas tem demonstrado possuir
além das diferenças estruturais, propriedades bioquímicas e biológicas diferentes
(WANG et al., 1999; SZYMANOWSKA et al., 2006; LI et al., 2009). Este SNP no
códon 72 da p53 foi relacionado com problemas de fertilidade e pré-natais em
humanos (KANG et al., 2009). Alguns estudos encontraram uma relação entre os
genótipos da p53 e a ocorrência de anormalidades reprodutivas (KAY et al., 2006;
Chang, 2002) e endometriose (OMORI et al., 2004; AMMENDOLA et al., 2008).
Além disso, a TP53 é um mediador potencial da gestação, com atividades
relacionadas ao estrogênio e a progesterona (SIVARAMAN et al., 2001); e através
da regulação da transcrição do fator inibitório de leucemia (LIF), citocina crucial na
implantação embrionária (HU, 2009).
Estudos realizados em humanos são frequentemente extrapolados para
animais, baseado no conhecimento e resultados obtidos no âmbito genômico sobre
a influência dos SNP em problemas reprodutivos de mulheres, o gene da p53 torna-
se um importante alvo de pesquisa na reprodução equina.
22
1.5 Aplicação de Diagnóstico Molecular em Equinos
O uso de ferramentas de biologia molecular auxilia na elucidação e na
eliminação de desordens genéticas, incrementando o padrão racial dos animais e os
lucros do criador. Além disso, o diagnóstico rápido de doenças infecciosas de
equinos, na última década é baseado em técnicas moleculares de detecção dos
agentes infecciosos (PUSTERLA et al., 2006). A Reação em cadeia da polimerase
(PCR) é um diagnóstico molecular conhecido e implementado com sucesso
atualmente.
Com o Projeto do Genoma Equino, foram criados testes moleculares para
genes envolvidos na determinação da cor da pelagem (WADE et al., 2009). Tema
este que é de grande interesse de criadores de equinos, por determinar o valor
econômico dos animais de acordo a probabilidade de gerar prole com um
determinado padrão de pelagem. Outros testes moleculares já disponíveis detectam
doenças hereditárias, foram desenvolvidos testes para seis doenças genéticas
graves, como a Paralisia periódica hipercalêmica (HYPP) que afeta cavalos Quarto
de Milha e a imunodeficiência combinada grave (SCID) que afeta cavalos da raça
Árabe (WADE et al., 2009).
Em humanos, o DNA fetal livre e circulante (ccffDNA) no plasma materno
oferece uma fonte alternativa de material genético fetal para o diagnóstico não-
invasivo pré-natal (FINNING & CHITTY, 2008). Durante a gestação de mulheres, em
média de 10% do DNA livre no plasma materno é de origem fetal (LUN et al., 2008).
As circulações materna e fetal são separadas pela membrana placentária, no
entanto, os mecanismos possíveis do ccffDNA incluem a lise das células fetais
resultantes de danos físicos, imunológicos e apoptose, transpondo a barreira
placentária (LO et al., 1997). A determinação do sexo fetal a partir de análises
moleculares do ccffDNA em mulheres tem sido realizada em laboratórios. O ccffDNA
permite a determinação do sexo fetal a partir da amplificação e detecção de genes
específicos do cromossomo Y (FINNING & CHITTY, 2008; AKOLEKAR et al., 2010).
A predeterminação do sexo fetal em espécies domésticas tem substanciais
aplicações comercial e científica (PEIPPO et al., 1995). A sexagem fetal em equinos
23
é útil a criadores, pois permite a implementação de estratégias comerciais, em
termos de decisão de venda e valor dos animais (BUCCA, 2005). A sexagem
molecular em equinos foi descrita utilizando os genes SRY e AMELX/AMELY
(HASEGAW et al., 2000), e usando um ZFX/ZFY (PEIPPO et al., 1995) em embriões
pré-implantação.
O diagnóstico pré-natal não-invasivo em equinos a partir do sangue materno
seria uma ferramenta de diagnóstico molecular, podendo ser aplicada a testes de
doenças hereditárias e para identificação de biomarcadores, além da determinação
do sexo fetal pré-natal.
Com base nas informações apresentadas, a presente tese teve o objetivo de
desenvolver estudos de genômica aplicada à reprodução equina: I) no estudo da
expressão de genes envolvidos no processo de apoptose; II) na análise de
polimorfismos genéticos do gene p53; III) na elaboração de teste molecular de
diagnóstico utilizando o DNA fetal livre em equinos. Os dados gerados nesta tese
estão apresentados na forma de artigos científicos.
O primeiro artigo teve como objetivo analisar a expressão de genes
relacionados ao processo de apoptose no complexo cumulus oócito equino. Os
genes Bax, Bcl-2, survivin e p53 foram avaliados através de qRT-PCR durante a
maturação in vitro de complexos cumulus oócito equinos, comparando expressão
gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características
morfológicas. Este artigo foi publicado no periódico Zygote.
O segundo artigo teve como objetivo analisar um polimorfismo de nucleotídeo
único no gene p53 equino, relacionando-o a parâmetros reprodutivos de éguas Puro
Sangue Inglês. Este artigo foi submetido ao periódico The Veterinary Journal e
encontra-se em revisão após correções propostas.
O terceiro artigo buscou determinar a presença de DNA fetal livre e circulante
no plasma de éguas, desenvolvendo um teste molecular de diagnóstico pré-natal de
sexagem fetal em equinos por amplificação do gene SRY. Este artigo foi publicado
pelo periódico Theriogenology. Foi aberto um processo de pedido de Patente de
Invenção sobre o processo de diagnóstico molecular de determinação do sexo fetal
em equinos.
24
2. ARTIGO I
Expression of apoptotic genes in immature and in vitro matured
equine oocytes and cumulus cells
(artigo publicado no periódico Zygote: page 1 of 7, 2011;
doi:10.1017/S0967199411000554; Date submitted: 05.05.11. Date accepted:
08.07.11)
25
Expression of apoptotic genes in immature and in vitro matured equine
oocytes and cumulus cells
RUNNING HEADLINE: Gene expression in equine COC
P.M.M. Leon1,2, V.F. Campos1,2, C. Kaefer1,2, K.R. Begnini1,2, A.J.A. McBride3, O.A.
Dellagostin3, F.K Seixas2, J.C. Deschamps1, T. Collares1,2,*
Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese, Biotecnologia/Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS, Brazil.
1Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese, Biotecnologia/Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
2Laboratório de Genômica Funcional, Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento
Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
3Laboratório de Biologia Molecular, Núcleo de Biotecnologia, Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
* All correspondence to: Dr. Tiago Collares, Núcleo de Biotecnologia, Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Campus Universitário s/n°, Caixa Postal 354, CEP
96010-900, Pelotas, RS, Brazil, Phone: +55 53 3275 7588; Email:
26
Summary
The gene expression of Bax, Bcl-2, survivin and p53, following in vitro maturation of
equine oocytes, was compared in morphologically distinct oocytes and cumulus cells.
Cumulus-oocyte complexes (COC) were harvested and divided into two groups: G1 -
morphologically healthy cells and G2 - less viable cells or cells with some degree of
atresia. Total RNA was isolated from both immature and in vitro matured COC and
real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) was used to quantify gene
expression. Our results showed there was significantly higher expression of survivin
(P < 0.05) and lower expression of p53 (P < 0.01) in oocytes compared to cumulus
cells in G1. No significant difference in gene expression was observed following in
vitro maturation or in COC derived from G1 and G2. However, expression of the Bax
gene was significantly higher in cumulus cells from G1 (P < 0.02).
Keywords: apoptosis, gene expression, in vitro maturation, qRT-PCR.
27
Introduction
New knowledge about developmental competence, in vitro maturation (IVM)
and cryopreservation of oocytes and embryos is critical for the in vitro production of
embryos (IVP). The techniques of assisted reproduction, In vitro fertilization (IVF) and
intracytoplasmic sperm injection (ICSI) have been successfully performed with
equine gametes, however, low efficiency has limited their commercial application in
this species (Choi et al., 2006; Hinrichs et al., 2007; Squires et al., 2003). Progress in
this area was initially slow as standard IVF is not reproducible in horses (Hinrichs,
2010). However, ICSI resulted in the birth of several foals, and has been used for the
clinical production of foals (Galli et al., 2007; Jacobson et al., 2010; Mortensen et al.,
2010). Nevertheless, oocyte quality and culture conditions were found to be highly
variable, with low levels of blastocyst formation in vitro and poor reproducibility
between laboratories (Dell'aquila et al., 2003; Smits et al., 2009).
The study of gene expression is emerging in applied embryology, those
genes involved in biological processes such as apoptosis, oxidative stress and
cryotolerance need to be studied in order to compare gene expression in vivo, in vitro
and under different culture conditions (Badr et al., 2007; Rizos et al., 2008;
Wrenzycki et al., 2005). Oocyte quality can be assessed immediately following
recovery by using several non-invasive, visual assessment parameters such as the
morphology of the cumulus-oocyte complexes (COC). Oocytes with a compact
cumulus composed of several layers of cells and a homogeneous cytoplasm are
considered healthy, these oocytes can then be selected for in vitro maturation and
IVF (Li et al., 2009). However, it has been reported that equine oocytes with a
28
compact cumulus exhibited a lower meiotic competence and lower fertilization rate
after ICSI (Ambruosi et al., 2009). Analysis of the expression of genes that are
involved in early embryonic development is an important tool for the development of
assisted reproduction biotechnology.
One of the main factors affecting the potential for embryonic development is
apoptosis (Anguita et al., 2009; Dhali et al., 2007; Park et al., 2006), or programmed
cell death, which is an active and irreversible process of self-destruction of cells
under physiological control (Parolin and Reason, 2001). The mechanisms of
apoptosis may be activated by external stimuli, by binding to specific receptors on the
cell surface, or by internal stimuli to intracellular stress, such as DNA damage, cell
cycle alterations and in metabolic pathways and is controlled by several different
gene families (Chang et al., 2002). Previous studies on cumulus cell gene expression
(McKenzie et al., 2004) and apoptosis (Corn et al., 2005) showed that cumulus cells
can reflect the developmental potential of human embryos during IVF cycles.
Previously, was demonstrated the apoptosis incidence in mare ovarian follicles, its
relationship with cumulus expansion and increased meiotic competence, however, no
association with cytoplasmic maturation was observed (Dell'aquila et al., 2003). The
impact of apoptosis in the COC and its impact on oocyte development potential
remains unclear, as contradictory reports from various species have failed to clarify
the occurrence of apoptosis in the COC (Yuan et al., 2005).
Thus, the aim of the current study was to evaluate the expression of the
apoptosis related genes Bax, Bcl-2, survivin and p53 during in vitro maturation of
equine oocytes and to compare gene expression between oocytes and cumulus cells
isolated from COC with different morphological characteristics.
29
Materials and methods
Cumulus-oocyte complexes (COC) source
The biological material used in this experiment was obtained from a horse
abattoir located in the city of Pelotas, RS, Brazil. The ovaries were randomly
collected on the slaughter line, without identifying age, stage of the estrous cycle,
clinical condition and nutritional status of mares. The time between slaughter and the
collection was approximately one hour, and the ovaries were transported in thermo
bottles in 0.9% NaCl sterile solution at 32 - 35°C to the Laboratory of Molecular
Embryology, UFPel. The COC were aspirated from follicles ranging from 10 to 20 mm
in diameter (follicles preceding follicle deviation). The contents were placed into a 50
mL conical tube and allowed to settle for 15 min. The sediment was evaluated using
stereomicroscope (Olympus, USA) and suitable COC were selected. Degenerated or
MII stage oocytes were discarded.
Morphological characterization of the equine COC
The COC were evaluated morphologically using an inverted optical
microscope (Olympus, USA) for the number of layers and degree of compaction of
the cumulus cells, cytoplasm homogeneity and integrity and were divided into two
groups: G1 - considered morphologically healthy (oocytes with compact cumulus and
more than three cell layers, intact cytoplasm, evenly granular and homogenous
coloration), and G2 - considered morphologically less viable or with some degree of
atresia (oocytes that presented less than three layers of cumulus cells and/or
30
expanded cumulus, with cumulus granular appearance, heterogeneous or dense
and/or shrunken cytoplasm).
In vitro maturation (IVM)
In vitro maturation of the oocytes was carried out in follicular fluid as
previously described (Caillaud et al., 2008). Briefly, equine follicular fluid was
collected from follicles smaller than 30 mm, centrifuged at 14.000 rpm for 10 min,
filtered through 22 µm filter and heat-inactivated at 56°C for 30 min. For in vitro
maturation the COC were incubated for 36 h at 38.7ºC and 5% CO2. At the end of
the incubation period the COC were denuded mechanically by repeated pipetting in a
solution of 80 IU/ml of type-I hyaluronidase (Sigma-Aldrich, USA). Groups of 60
oocytes and the corresponding cumulus cells were cryopreserved in 50 µL of TRIzol
Reagent (Invitrogen, USA) for RNA extraction and subsequent assessment of rates
of gene expression by real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR). As controls of
the IVM process, the COC were classified into G1 and G2, denuded and total RNA
was extracted immediately after collection. Nine hundred and sixty COC were divided
among the experimental groups, four replicates were performed on pools of 60 COC.
To determine the stage of nuclear maturation of the oocytes upon collection and after
IVM, 10% were assessed by staining. The maturation rate was determined by
Hoechst 33342 staining (Sigma-Aldrich, USA using a dye solution containing at 10
µg/ml and denuded oocytes were incubated for 10 min at 38.7°C. Slides were
evaluated using an epifluorescent microscope (Olympus, USA), with filter wavelength
of BP330-385 nm. Immature oocytes were those oocytes presenting a germinal
vesicle (GV) with a single condensed mass associated with the nucleolus; germinal
31
vesicle breakdown (GVBD) with an irregular envelope surrounding disperse
condensed chromatin. Metaphase I (MI) oocytes were those presenting the first
metaphase plate. In oocytes at metaphase II (MII) the metaphase plate was located
peripherally in the ooplasm and polar body in the perivitelline space. Oocytes with
abnormal chromatin configurations or no chromatin visible were considered to be
degenerating.
Total RNA isolation, reverse transcription and real-time PCR (qRT-PCR)
Total RNA was extracted from the COC stored in TRIzol as described by the
manufacturer. The extracted RNA was quantified using the Qubit Fluorometer
(Invitrogen, USA), with the Quant-iT RNA BR Assay Kit following the manufacturer’s
instructions and standardized to a concentration of 4 ng/mL (equivalent to 60
oocytes). cDNA was produced using the High Capacity cDNA Reverse Transcription
Kit (Applied Biosystems, USA) following the manufacturer’s instructions. The cDNA
was then used as template for the qRT-PCR, Stratagene Mx3005P Real-Time PCR
System (Agilent Technologies, UK), reaction using the Platinum Sybr Green Kit
(Invitrogen, USA). The primer pairs for the qRT-PCR were designed using Vector NTI
11 software (Invitrogen, USA) using the sequences for each of the target genes,
Table 1. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene (Smits et
al., 2009) was used for normalization of the target gene expression data.
Data processing and statistical analysis
Data processing and statistical analysis were performed using the software
REST 2009. The rate of gene expression was calculated relative to the expression of
32
the GAPDH gene, based on the method of Pfaffl and colleagues (Pfaffl et al., 2002).
The various groups were analysed using integrated randomization and bootstrapping
methods to compare expression ratios, P values ≤ 0.05 were considered significant.
Results
Differentiation and COC in vitro maturation (IVM)
Some 1160 COC were recovered from 528 ovaries. Immediately after
collection, 76% (76/100) of oocytes were at the germinal vesicle stage, 17% (17/100)
were at the germinal vesicle breakdown stage and 7% (7/100) were at the
degenerated stage. The COC were divided into two groups: G1 - considered
morphologically healthy and G2 - considered morphologically less viable or with
some degree of atresia, see Fig. 1. The average rate of IVM was 51%, with a rate of
54% (27/50) for the G1 group and 48% (24/50) for the G2 group.
Relative expression of the Bax, Bcl-2, survivin and p53 genes
Overall our results showed that survivin gene expression was significantly
downregulated while p53 expression was significantly upregulated in cumulus cells in
comparison to COC. Furthermore, p53 expression was higher in both immature and
in vitro matured cumulus cells.
The survivin gene showed higher expression in in vitro matured oocytes from
morphological group G1 than in cumulus cells from these oocytes (p <0.02). The p53
gene shows a lower expression in G1 in vitro matured oocytes compared to G1 in
vitro matured cumulus cells (p=0.007). However, the same relation was not observed
33
between mature oocytes and cumulus cells mature G2. Figure 2 shows the data on
survivin gene expression and the data on p53 gene expression in oocyte and
cumulus cells of G1 and G2 groups. When the expression was compared between
oocytes and cumulus cells according to morphology and maturation, differences for
genes Bcl-2 and Bax (p> 0.05) were not detected.
In this study, no difference was detected in the expression of apoptotic genes
analyzed in immature oocytes and after in vitro maturation (p>0.05). In oocytes from
different morphological groups, G1 and G2, there was no difference in Bcl-2, Bax,
survivin and p53 gene expression in immature and in vitro maturated oocytes.
Among the groups of oocytes according to morphological classification, G1 and G2,
there was no difference in Bcl-2, Bax, survivin and p53 gene expression (p>0.05).
Changes in gene expression of Bcl-2, survivin and p53 (p>0.05) were not
observed among cumulus cells. Between the morphological classification groups G1
and G2 it was observed difference in the expression of cumulus cells for the pro-
apoptotic Bax gene. The expression of Bax was higher in cells of the morphological
group G1 than G2 (p=0.02) (fig. 2).
Discussion
This study evaluated the expression of Bax, Bcl-2, survivin and p53 genes
during in vitro maturation of equine oocytes, to compare expression between different
morphological parameters of oocytes and cumulus cells from these complexes. Gene
expression studies in equine species are relatively scarce (Smits et al., 2009), this
was the first report of gene expression in equine cumulus-oocyte complex, allowing
to elucidate the pattern of expression of apoptotic genes.
34
We observed different expression of anti-apoptotic gene survivin and pro-
apoptotic gene p53 between oocytes and cumulus cells. Equine morphologically
viable oocytes expressed a higher rate of survivin and lower rate of p53 than
cumulus cells. Gene expression in cumulus cells, including genes involved in the
apoptotic process, provides evidence that embryo viability is reflected in differential
gene expression in the cumulus cells (van Montfoort et al., 2008). The bidirectional
communication between the oocyte and companion somatic cells is essential for
development of an egg competent to undergo fertilization and embryogenesis
(Matzuk et al., 2002). An increase in apoptotic cumulus cells has been related to a
decrease of mature oocytes and to a decreased ability to be fertilized in stimulated
IVF cycles (Host et al., 2000). Our results indicating the survivin and p53 proteins
synthesized, act on survival and early development of equine embryos.
Upon resumption of meiosis germinal vesicle breakdown, oocytes become
transcriptionally quiescent and must rely on pools of RNA accumulated during the
growth phase for protein synthesis (Wassarman and Letourneau, 1976). In a study of
oocytes and cumulus cells of bovine, ovine, porcine, canine, feline and murine, it was
demonstrated that oocyte RNA features were repeatable whether maturation
occurred in vitro or in vivo, and were similar between the phases of nuclear
maturation of the germinal vesicle and metaphase II oocytes (Payton et al., 2010).
The differences in features of total RNA from oocytes versus cumulus was reported,
oocytes are contained within growing antral follicles which are in large part
transcriptionally inactive while cumulus cells are transcriptionally active. Furthermore,
oocytes contain maternal pools of RNA, protein and energy stores that accumulated
35
during the growth phase, a period during which features of oocyte RNA are more like
somatic cells (Payton et al., 2010).
Survivin expression was appointed as a possible marker for good quality in
vitro developmental capacity of bovine follicular oocytes (Jeon et al., 2008). The
expression of survivin was related to the quality of COCS, their developmental
competence and the quality of in vitro produced blastocysts in bovine (Jeon et al.,
2008). The Survivin protein is known as a bifunctional protein that suppresses
apoptosis and regulates cell division. The survivin acts as inhibitor of apoptosis by
linking directly to the caspases, it has been shown to inhibit directly the caspase 3
activity, preventing the formation of apoptosome (Altieri, 2010; Kawamura et al.,
2003).
The tumor suppressor gene p53 is an important mediator in response to
cellular stress (Dhali et al., 2007). The transcriptional activity of p53 is required for
cell death in some systems, its nuclear translocation is required for transcription of
the gene Bax (Sabbatini et al., 1995). However, the p53 gene expression appear to
have no correlation with morphological quality of bovine embryos (Melka et al.,
2009). Was reported a significantly higher expression of p53 from oocyte to four-cell
stage as compared with that of the later pre-implantation stages, suggesting p53-
independent apoptosis in bovine embryos (Melka et al., 2009). Equine oocytes are
characterized by a large amount of lipid droplets in their cytoplasm, in association
with the mitochondria and smooth endoplasmic reticulum (Ambruosi et al., 2009;
Tremoleda et al., 2003), suggesting the oocytes and embryos of this species are
more sensitive to oxidative stress and apoptosis (Ambruosi et al., 2009). In vitro
maturation of oocytes is an essential step for in vitro production of embryos, however
36
the conditions under which the oocytes are subjected may result in changes in gene
expression in these cells, as a response to injuries suffered.
Expression of the Bax gene has been identified in oocytes, granulosa cells
and luteal cells of various species and levels of Bax expression appear to be
positively correlated with apoptosis in each of these lineages. Bax and p53
upregulation has been associated with apoptosis in granulosa cells (Zwain and
Amato, 2001). Among the morphological classification groups G1 and G2 it was
observed difference in the expression of cumulus cells for the gene pro-apoptotic
Bax, the expression of Bax is higher in cells of the morphological group G1, and the
Bcl-2 has not changed. However, in the study by Filali et al (2009) the Bcl-2 mRNA
expression was found to be significantly higher in cumulus cells associated with
mature oocytes than those associated with immature oocytes, whereas BAX mRNA
concentrations did not vary in cumulus cells from either source.
In this study, no difference was detected in the expression of apoptotic genes
analyzed in immature oocytes and after in vitro maturation period, and oocytes from
different morphological groups, G1 and G2. There was no difference in gene
expression Bcl-2, Bax, survivin and p53 in immature oocytes and in vitro maturated.
Similar results were published comparing the expression levels of anti-apoptotic gene
Bcl-2 in different morphological groups of bovine oocytes in vivo matured, founding
no difference in the quantification of transcripts to this gene (Pretheeban et al., 2009).
The potential development of embryos in vitro produced depends mainly on the
quality of oocytes from which they originate, with the selection of oocytes based
primarily on morphological features. While, Yang & Rajamahendran (2002) reported
higher levels of expression of the anti-apoptotic gene Bcl-2 in oocytes considered
37
morphologically healthy, Li et al. (2009) observed initial characteristics of apoptosis in
immature COC, which was confirmed by transcriptase-on quantification of Bax and
Bcl-2 showing that the dynamic change in the transcriptional profile of Bax
corresponded with the occurrence of apoptosis and early development of oocytes,
while the pattern of Bcl-2 transcription showed a contrasting pattern.
In conclusion was observed in equine morphologically viable oocytes
expressed a greater rate of survivin and lower rate of p53 than cumulus cells. No
difference was detected in the expression of apoptotic genes analyzed in oocytes
immature and after in vitro maturation period and in oocytes from morphological
groups, but in cumulus cells higher expression of the gene pro-apoptotic Bax in G1
than G2 was observed. However, other genes involved in cell survival and viability
need to be studied, as a higher number of oocytes corresponding to different stages
of meiotic maturation are targets for our subsequent studies. We believe that our
data can contribute to identification of gene regulation during maturation increases
the knowledge about the biology of the oocyte and signals the progress in
understanding the molecular events involved in communication and in vitro
maturation of cumulus-oocyte complex, indicating possible markers of viability and
competence.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CNPq and FAPERGS, Brazil. P.M.M.L,
V.F.C., C.K. and K.B. were supported by scholarships from CAPES, Brazil and J.C.D.
and O.A.D. received a research fellowship from CNPq.
38
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43
Table 1. Primers used in qRT-PCR reaction for equine oocytes.
Gene Acession Number Sequence TM Fragment
size
Efficiency
(%)
Coorelation
(R2)
Bcl-2 Eq XM_001499714.1 F 5’ GAGACCCCCAGTGCCATCAA 3’
57ºC 146 bp 99.9% 0.97 R 5’ GGGATGTCAGGTCGCTGAAT 3’
BaxEq XM_001489207.1 F 5’ TTTGCTTCAGGGTTTCATCC 3’
60ºC 162 bp 100% 0.94 R 5’ ATCCTCTGCAGCTCCATGTT 3’
p53 Eq XM_001918153.1 F 5’ AAAGGATGCCCATGCTACAGAGGA 3’
63ºC 82 bp 90.5% 0.98 R 5’ AGTAGACTGGCCCTTCTTGGTCTT 3’
SurvivinEq XM_001915400.1 F 5’ TTCATCCACTGTCCCACTGA 3’
57ºC 98 bp 70.5% 0.98 R 5’ GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3’
GAPDH NM_001163856.1 F 5’ GCC GTA ACT TCT GTG CTG TG 3’
61ºC 150 bp 84.0% 0.98 R 5’ AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG 3’
44
Figure Legends
Figure 1. A) Oocytes classified as healthy morphological group, G1; B) Oocyte
classified as morphological group with some signs of degeneration, G2.
45
Figure 2. Normalized CT values of the mRNA levels of the four apoptotic genes, Bcl-
2, Bax, Survivin and p53. A. Immature oocytes and cumulus cells from groups G1
and G2 and B. In vitro matured oocytes and cumulus cells from groups G1 and G2.
Significant differences where P < 0.05 are indicated by a *, P < 0.01 by ** and P <
0.001 by ***. iOoc: immature oocytes; iCum: immature cumulus cells; mOoc: matured
oocytes; mCum: matured cumulus cells.
46
3. ARTIGO II
Association between single nucleotide polymorphism in p53 and abortion in
Thoroughbred mares
(artigo aceito para publicação no periódico The Veterinary Journal)
47
Association between single nucleotide polymorphism in p53 and abortion in
Thoroughbred mares
Priscila Marques Moura de Leona,b, Vinicus Farias Camposa, Helena Strelow
Thurowb, Fernando Pires Hartwiga, Lisiane Priscila Selauc, Odir Antonio Dellagostind,
João Carlos Deschampsa, Fabiana Kömmling Seixasb, Tiago Collaresa,*
a Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese, Biotecnologia/Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil
b Laboratório de Genômica Funcional, Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento
Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil
c Instituto de Matemática, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
RS, Brazil
d Laboratório de Biologia Molecular, Núcleo de Biotecnologia, Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil
* Corresponding author. Tel.: +55 53 32757588.
Email address: [email protected] (T. Collares).
48
Abstract
Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the p53 gene have been studied
extensively in humans but not in horses. The aim of this study was to determine the
prevalence of the Arg/Pro SNP in p53 in horses and correlate the genotypes with the
corresponding reproductive performance in Thoroughbred mares. Blood samples
were collected from 105 horses and SNPs were detected by PCR-RFLP and
confirmed by sequencing. The heterozygous Arg/Pro was found in 73.3% of
Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected
in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arg/Pro genotype was significantly
associated with abortion (P = 0.02), while Pro/Pro mares had a lower probability of
abortion (P <0.05). p53 may play a role in equine reproduction.
Keywords: Equine; p53; Reproduction; Abortion; Genetic polymorphism
49
In mammalian reproduction, the p53 tumour suppressor protein plays an
important role in maternal reproduction through transcriptional regulation of
leukaemia inhibitory factor (LIF), a crucial cytokine for blastocyst implantation (Hu,
2009). Single-nucleotide polymorphisms (SNP) in p53 at codon72/exon4 encode
either a proline (Pro) or arginine (Arg) amino acid residue (Buchman et al., 1988).
This SNP has been reported to be associated with cancer (Li et al., 2010) and
reproduction efficiency in humans (Hu, 2009). Previous studies of p53
polymorphisms found recurrent implantation failures (Kay et al., 2006) and recurrent
pregnancy loss (Coulam et al., 2006;Pietrowski et al., 2005) in women.
Although the equine genome sequence is completed (Wade et al., 2009), exon
4 of the p53 gene has not elucidated, as there is a gap in the genome assembly at
this point; moreover there is little information on the impact of p53 gene
polymorphisms in horses. Thoroughbred breed showed population diversity through
Linkage disequilibrium study (Corbin et al., 2010). Considering the importance of the
p53 gene in reproduction, the aim of this study was to determine the prevalence of
the Arg/Pro SNP and correlate the genotypes with reproductive performance in
Thoroughbred mares.
Blood samples were collected from 105 Thoroughbred mares and the genomic
DNA was extracted using the Blood and Tissue Dneasy Kit (Qiagen). Polymorphisms
were analysed by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) as
described in Lin et al. (2008). The target region was amplified by PCR using primers:
forward 5’-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3’ and reverse 5’-
TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3’. GoTaq qPCR Master Mix (Promega) and
restriction endonuclease BstUI (New England Biolabs) were used for PCR-RFLP.
The enzyme produces 113 and 86 base pair (bp) fragments if the genotype is
Arg/Arg; 199, 113 and 86 bp fragments if it is Arg/Pro and a single fragment of 199
bp (no cleavage) with the Pro/Pro genotype (Fig. 1). For enzymatic restriction
reaction was used positive (Arg/Arg) and negative (Pro/Pro) controls.
PCR products were sequenced using the above primers with a MegaBACE
1000 DNA sequencer (GE Healthcare) using Dynamic ET-terminator technology (Fig.
50
2). Contigs were assembled and analysed using the ContigExpress module of Vector
NTI 10.0 suite (Invitrogen). The assembled sequence was analysed by BLAST
against p53 sequences available in GenBank (equine: NC_009154.2; human:
NC_000017.10).
Reproductive data from 105 mares for the reproductive seasons in 2007, 2008
and 2009 were analysed, including number of natural mating per season, a positive
diagnosis of pregnancy, birth of foals during the season, abortion, twin gestation,
placentitis, diagnosis of endometritis post-coverage, anovulatory cycles (acyclic) and
number of stillbirths. For the statistical analysis, Pearson's χ2 and Fisher’s exact test
were used to compare the differences in reproductive variables and p53 SNPs
between cases and controls. Logistic regression analysis was performed to assess
the association between the p53 genotypes, age (years) and reproductive variables.
Nagelkerke’s Pseudo-R2 was calculated for significant models.
The authors believe that is the first study demonstrating the Arg/Pro SNP in
equine p53 gene. We identified three possible genotypes of the p53 gene in the
Thoroughbred mares, identifying the existence of the Arg/Pro genotype in the equine
genome. Fig. 1A shows the results of the PCR and Fig. 1B shows the RFLP profiles.
The 199 bp nucleotide sequence corresponding to the three genotypes was
confirmed by DNA sequencing. This Arg/Pro SNP present in exon 4 of equine p53
corresponds to the SNP of codon 72/exon 4 of human p53 according to alignments
performed.
The distribution of Arg/Pro genotype in p53 in Thoroughbred mares was
77/105 (73.3%). The homozygous genotypes for Arg (18/105) and Pro (10/105) had
distributions with 17.1% and 9.6%, respectively.
The impact of the p53 SNP on the reproductive variables evaluated is
presented in Table 1. The Arg/Pro heterozygote was associated with an increased
likelihood of abortion (P = 0.022; OR = 14.455), while the homozygous Pro/Pro
appeared to protect against abortion (OR = 0.164) (Table 1). There was a correlation
between abortion and Arg, either as a homozygote or heterozygote (P = 0.018; OR =
51
7.948), in 25/26 (96.2%) of recorded abortions. The abortion is explained 14.8% by
p53 SNP in logistic regression model.
There was no significant correlation between the Arg/Pro genotype of mares
that required only one natural mating for pregnancy and mares that needed two or
more natural service matings (Table 1). However, when the Arg allele was
considered, a trend correlation was observed (P = 0.051, adjusted residual = 2.0; OR
= 2.302) in mares that had two or more natural service matings per reproductive
season. However, the inverse correlation was not observed with the Pro allele (P =
0.540; OR = 0.789), since 166/198 (78.7%) of mares that had the Pro allele had only
one mating in the reproductive season.
This is the first study demonstrating the prevalence of p53 gene polymorphism
at exon 4 in equines and its association with reproductive variables. Several studies
have shown an association with the Pro72 homozygote and recurrent pregnancy
failure in women (Firouzabadi et al., 2009; Pietrowski et al., 2005). Conversely, no
significant associations were found between codon 72/p53 SNP and recurrent
pregnancy failure in patients in a study carried out by Coulam et al. (2006).
Furthermore, Kay et al. (2006) reported a significant increase in the Arg/Arg
frequency among women with recurrent pregnancy loss. It is known that a balance in
proliferation and apoptosis is necessary to ensure normal embryonic development
during pregnancy. Apoptosis and cell proliferation is frequently observed during
normal pregnancy in blood vessel cells, cytotrophoblasts and trophoblasts of the
placenta (Pietrowski et al., 2005). The study of SNP in genes linked to reproduction
allows the prediction of prognostic markers of fertility, indicating possible precautions
in reproductive management in equines.
In summary, this study reports an association between the heterozygous
Arg/Pro genotype in the p53 gene and abortion in Thoroughbred mares
demonstrating that p53 may play a role in equine reproduction. Further studies in
larger data sets are recommended for validation this p53 genotype influence on
equine reproductive parameters.
52
Conflict of interest statement
None of the authors of this paper has a financial or personal relationship with
other people or organisations that could inappropriately influence or bias the content
of the paper.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Alan McBride for a critical review of the manuscript.
This work was supported by grants from CNPq and FAPERGS, Brazil. P.M.M.L,
V.F.C. and H.S.T. were supported by scholarships from CAPES, Brazil and J.C.D.
and O.A.D. received a research fellowship from CNPq.
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54
Table 1
Distribution of the codon 72 SNP in p53 (% genotype, n/total) and association with
reproductive variables in Thoroughbred mares.
Reproductive parameters Arg/Arg Arg/Pro Pro/Pro
All mares 17.1 (18/105) 73.3 (77/105) 9.6 (10/105)
Mating 1 16.2 (32/198) 59.1 (117/198) 24.7 (49/198)
2 or + 16.2 (11/56) 67.9 (38/56) 12.5 (7/56)
Pregnancy No 10.0 (2/20) 60.0 (12/20) 30.0 (6/20)
Yes 17.5 (41/234) 61.1 (143/234) 21.4 (50/234)
Birth of foal No 14.3 (6/42) 69.0 (29/42) 16.7 (7/42)
Yes 17.5 (37/212) 59.4 (126/212) 23.1(49/212)
Abortion No 17.5 (40/228) 58.3 (133/228) 24.1 (55/228) **
Yes 11.5 (3/26) 84.6 (22/26) * 3.8 (1/26)
Twin gestation No 16.1 (38/236) 61.9 (146/236) 22.0 (52/236)
Yes 27.8 (5/18) 50.0 (9/18) 22.2 (4/18)
Endometritis No 16.6 (37/223) 61.4 (137/223) 22.0 (49/223)
Yes 19.4 (6/31) 58.1 (18/31) 22.6 (7/31)
Stillborn No 16.5 (41/248) 60.9 (151/248) 22.6 (56/248)
Yes 33.3 (2/6) 66.7 (4/6) 0 (0/6)
Acyclic No 16.0 (39/243) 61.3 (149/243) 22.6 (55/243)
Yes 36.4 (4/11) 54.5 (6/11) 9.1 (1/11)
* P <0.02 and adjusted residual 2.6, Pearson χ2.
** P <0.02 and adjusted residual 2.4, Pearson χ2.
55
Figure legends
Figure 1. (A) Amplification of a 199 base pair (bp) fragment of p53 containing codon
72. (B) Restriction fragment length polymorphism demonstrating three possible
genotypes: Arg/Pro (A/P) (199, 113 and 86 bp fragments); Arg/Arg (A/A) (113 and 86
bp fragments); and Pro/Pro (P/P) (199 bp fragment).
Figure 2. Nucleotide sequence for identification of exon 4 equine p53 polymorphism,
the region of annealing of primer, the sequence of restriction enzyme and the point of
polymorphism.
56
4. ARTIGO III
Equine fetal sex determination using circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA)
(artigo publicado no periódico Theriogenology.
doi:10.1016/j.theriogenology.2011.09.005. Received 22 July 2011; received in
revised form 17 August 2011; accepted 6 September 2011)
57
Equine fetal sex determination using circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA)
Priscila Marques Moura de Leon1,2; Vinicius Farias Campos1,2; Odir Antônio
Dellagostin2; João Carlos Deschamps1; Fabiana Kömmiling Seixas2; Tiago Collares1*
1Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese, Biotecnologia/Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
2Laboratório de Genômica Funcional, Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento
Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
*Corresponding author: Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Campus
Universitário s/n°, Caixa Postal 354, CEP 96010-900, Pelotas, RS, Brazil, Phone:
+55 53 3275 7588; Fax: +55 53 3275 7551, Email: [email protected]
Abbreviations: ccffDNA, circulating cell-free fetal DNA; PCR, Polymerase chain
reaction; 2nd-PCR, Second round Polymerase chain reaction; qPCR, Quantitative
Real Time Polymerase chain reaction; SRY, sex determining region Y; EDTA,
ethylene diamine tetraacetic acid; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase; NTC, non-template control;
58
Abstract
In this study a PCR, re-amplification of first PCR product (2nd-PCR) and qPCR
assay was used to detect SRY gene from ccffDNA in pregnant mare’s plasma to
determine the fetal sex. For the ccffDNA collection in blood plasma we used 20
pregnant mares in the final three months of pregnancy. For control of molecular
sexing we used two non-pregnant mares and two virgin mares, in addition the non-
template control. The 182 bp nucleotide sequence corresponding to the SRY-PCR
product was confirmed by DNA sequencing. Using SRY/PCR we identified 8 from 11
male pregnancies resulting in a sensitivity of 72.7% and 17 sexing diagnosis were
correct from a total of 20 pregnancies resulting in an accuracy of 85%. Using
SRY/2nd-PCR and qPCR techniques we obtained an increasing in the sexing
sensitivity results (90.9%) and an accuracy of 95%. Fetal sex was confirmed after
birth. In conclusion, this study demonstrates for the first time the fetal sex
determination in mares using ccffDNA.
Keywords: ccffDNA; molecular sexing; SRY; equine.
59
1. Introduction
The sex predetermination of offspring in domestic species has substantial
commercial and research applications [1], and is particularly desirable in the livestock
industry [2]. Fetal gender determination in the mare can provide a useful
service to breeders [3]. It has the potential to allow commercial strategies to be
implemented, in terms of sales decisions, as the value of stock at the time of sale is
often determined by the gender of the fetus, thus enhancing the value of the
pregnant mare [3]. Moreover, some stallions have a greater proportion of quality
female versus male offspring, or just the opposite [3].
Traditionally, fetal sex determination in the mare has been conducted with
transrectal ultrasound, between Days 59 to 68, via genital tubercle identification; or
using a combination of transrectal and transabdominal ultrasound exams, between
Days 120 to 210, by identifying the external genitalia. After Day 70, the ultrasound
image in pregnant mares is complicated due to the fetal positioning in uterus [3].
These techniques require considerable expertise and many hours of sonographic
visualization of the equine fetus, and are therefore limited as it depends on the fetal
position [3].
Assays using polymerase chain reaction (PCR) for molecular sexing are often
more useful because they provide sensitive, precise, rapid, and reliable results [2].
Sexual differentiation is determined primarily by the presence or absence of the Y
chromosome, and when the sex determining region Y (SRY) gene is expressed the
male pathway prevails. In the absence of SRY, the female pathway gains control of
gonadal development [2;4]. Sex typing based PCR has been used for embryonic
sexing in equines [1;5]. The molecular sexing of horses had been described using
60
the SRY and AMELX-AMELY genes [6], and using a ZFX/ZFY in preimplantation
embryos [1].
The presence of circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) in maternal plasma
has previously been described [7]. During pregnancy, maternal and fetal circulations
are separated by the placental membrane. However, possible mechanisms include
cell lysis resulting from physical and immunological damage and developmentally
regulated apoptosis of certain fetal tissues could transpose this placental membrane
[7]. The ccffDNA in maternal plasma offers an alternative source of fetal genetic
material for prenatal diagnosis [8]. Yet, little is known about the physical and
biological characteristics of ccffDNA in maternal plasma [9]. During pregnancy, a
median of 10% of the DNA in the plasma of pregnant women is fetally derived [10],
thus allowing fetal sex determination, with the DNA amplification and detection of Y-
chromosome specific sequences in maternal plasma [8;11].
Non-invasive determination of fetal sex from the examination of ccffDNA
in mares maternal blood would be an important tool in agricultural animal husbandry,
in addition to giving the prospect of prenatal genetic diagnosis in horses. In this study
firstly a PCR assay was used to detect ccffDNA in pregnant mare’s plasma and
determine the fetal sex by SRY identification; secondly our aim was to perform a
validation study by re-amplification of the first PCR product (2nd-PCR) and qPCR
prior to making available a laboratory-developed test.
61
2. Materials and Methods
2.1. Sample collection and preparation
For the collection of free DNA in blood plasma we used 20 pregnant mares in
the final three months of gestation. The age of pregnant mares varied between five
and 13 years old, of these mares eight was Thoroughbred, six Lusitano and six
Crioulo. For control of molecular sexing we used two non-pregnant mares and two
virgins mares.
Sample preparation was performed according to the method used by Akolekar
et al. [11]. Pregnant mare’s venous blood collected in ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA) BD vacutainer tubes (Becton Dickinson UK limited,
Oxfordshire, UK) was processed within 15 min of collection and centrifuged at 664
×g for 10 min to separate plasma from packed cells and buffy coat, and
subsequently at 12470 ×g for 10 min to further separate cell debris. The pregnant
mare’s plasma obtained after double centrifugation was then divided into 0.5 mL
aliquots and stored at −80 °C until subsequent analysis. The plasma was stored for
no more than two days prior to ccffDNA extraction.
2.2. ccffDNA extraction
During validation, the QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA,
USA) was used to extract DNA from the plasma samples of pregnant mares and
controls. Briefly, 1 mL of plasma was incubated with 1 mL of buffer AL and 150 µL of
protease at 56 ºC for 15 min. After the addition of 1 mL ethanol, the mixture was
62
incubated for 5 min at room temperature. This mixture was applied to and drawn
through a QIAvac spin column as recommended by the manufacturer. The filtrate
was washed sequentially with 600 µL of Buffer AW1, 750 µL of Buffer AW2 and 750
µL of ethanol. The column was centrifuged at 14462 ×g for 3 min and subsequently
incubated at 56 °C for 3 min, allowing the membrane to air dry. DNA was eluted from
the membrane by applying nuclease-free water, incubating at room temperature for 1
min and centrifuging at 14462 ×g for 2 min.
2.3. Detection of Y-chromosome sequences and amplification
The primer pair were designed using Vector NTI 11 software (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) using the sequences for equus caballus sex determining region
Y (SRY) gene deposited at GenBank under accession number (# AC215855.2). The
target region, SRY gene was amplified by PCR techniques (PCR, 2nd-PCR and
qPCR) using the following primers: forward 5’ CGCCAGCATAGATCACAGAA 3’ and
reverse 5’ CGCAAGGTAGCTGAAAGACC 3’, with amplified product of expected 182
bp. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used as
control, GAPDH gene was amplified by the same PCR techniques describe above
using the following primers: forward 5’ GCCGTAACTTCTGTGCTGTG 3’ and reverse
5’ AATGAAGGGGTCATTGATGG 3’, with amplified product of expected 150 bp.
63
2.4. Molecular sexing reaction standardization
To standardize the molecular sexing, genomic DNA from 10 females and 10
males were used. Blood samples were collected from horses and the genomic DNA
was extracted according to the manufacturer's instructions of the Blood and Tissue
Dneasy Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Equine DNA samples of females
and males were utilized in order to standardize the reaction of molecular sexing prior
to sexing by free plasma DNA.
2.5. Polymerase chain reaction (PCR)
For the PCR reaction 5 ρmol of each primer, 10 µL of DNA template, 12 µl of
GoTaq® qPCR Master Mix (Promega Corporation, Madison, WI, USA) and H2O
DNase/RNase free for a total reaction volume of 25 µl were used. Reaction
conditions were an initial denaturation at 94 ºC for 5 min, 40 cycles of 94 ºC for 30 s,
60 ºC for 30 s and 72 ºC for 1 min. A final elongation step at 72 ºC for 10 min was
performed prior to maintaining the reaction at 4 ºC. For each sample two reactions
were performed, one with SRY and another with GAPDH. For visualization of the
amplified, 12 µl of the PCR product was electrophoresed through a 1.5% agarose gel
and stained with GelRedTM (Biotium Inc., Hayward, CA, USA). The PCR reactions
were replicated three times for all samples.
The re-amplification of PCR product using the same pair of primers was
performed in order to increase quantity of the amplified DNA fragment. In the second
round PCR (2nd-PCR), 5 µl of the first PCR product was used as template for the
64
second reaction. We used the same primer pair for SRY gene described above. The
reactions conditions were same as described above. For visualization of the
amplified product, 12 µl of the PCR product was electrophoresed through a 1.5%
agarose gel and stained with GelRed™. The re-amplification of PCR reactions were
replicated three times for all samples.
2.6. Quantitative Real Time Polymerase chain reaction (qPCR)
The ccffDNA was used as template for the qPCR reaction that was conducted
on the Stratagene® Mx3005P™ Real-Time PCR System (Agilent Technologies, Santa
Clara, CA, USA), reaction using Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix UDG
(Invitrogen). The same primer sets for SRY and GAPDH genes described above
were used. Reactions were set up in a 25 µL volume using 10 µL of ccffDNA. Cycling
conditions were the same described above for PCR, in addition was performed the
dissociation curve to indicates that the products specific. The qPCR reactions were
replicated three times for all samples.
2.7. PCR controls
A no-template control (NTC) was included in each run for all PCR techniques.
The negative control was composed of a standard female DNA. The positive control
was a mixture of female DNA containing 2% male DNA. Fetal sex was confirmed
after birth.
2.8. Sequencing
65
After amplification PCR products containing SRY were sequenced using
primers described above. Before the sequencing step, PCR products were purified
by the use of GFX PCR DNA and Gel Band purification kit according to manufacturer
instructions (GE Healthcare©, Buckinghamshire, UK). The sequencing was performed
in a MegaBACE 1000 DNA sequencer (GE Healthcare©) by the use of the Dynamic
ET-terminator technology. Chromatograms were assembled and analyzed using
ContigExpress® module of Vector NTI 10.0 suite (Invitrogen). The assembled
sequence was submitted to BLAST alignment (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) against
equine SRY sequences available in GenBank.
3. Results and Discussion
Using equine genomic DNA, designed primers for SRY and GAPDH
successfully amplified a 182 and 150 bp fragments respectively. These PCR
products were confirmed by DNA sequencing showing 100% coverage with the
equine SRY and GAPDH genes. Standardization of molecular sexing using genomic
DNA showed that SRY was exclusively amplified in male samples (Table 1).
The equine SRY/PCR had an accuracy of 85% (17/20), and a sensitivity of
72.7%; in other words it was able to identify 8 from 11 male pregnancies, while the
specificity was 100%, identifying as female nine female pregnancies. Using the
SRY/2nd-PCR technique was obtained 95% (19/20) of accuracy and 90.9% of
sensitivity, while the same results were observed in SRY/qPCR. Table 1 shows the
data of PCR, 2nd-PCR and qPCR amplification. Fig. 1 shows the ccffDNA SRY
amplification by PCR, 2nd-PCR and qPCR. We obtained amplification in all samples
66
for GAPDH/PCR, GAPDH/2nd-PCR and GAPDH/qPCR, demonstrating 100%
efficiency of ccffDNA extraction.
In women, a study using the SRY sequence reported that correct prediction of
male fetuses varied from 31 to 97%, and specificity varied from 93 to 100% [12].
Comparing the performance of the SRY and DYS14 sequences, the DYS14 assay is
the best approach for early fetal gender assessment because it is more sensitive,
accurate, and efficient (80 vs. 97.9% respectively) [13]. Nested-PCR specific for the
amelogenin gene revealed false-Y-negative results in 50% of the cases [14]. While,
in other paper the amelogenin X and amelogenin Y genes resulted in 100%
sensitivity and 93.8% reliability in a Nested-PCR [15]. Absence of Y-chromosome
sequences in maternal plasma implies that the fetus is female but this may also be
the consequence of undetectable levels of cffDNA in the presence of male fetuses
[16]. The use of larger volumes of plasma and most sensitive molecular techniques
can avoid these test failures as demonstrated in the present study.
To perform as a routine laboratory test a strategy for increasing the sensitivity of
sexing test in horses becomes necessary. The use of qPCR with a larger final
volume (50 µL), the identification of DYS14 and AMELY genes, together with SRY
amplification, can improve the effectiveness of fetal gender determination. The qPCR
eliminates contamination risk because it is a closed detection system. A further
advantage of qPCR is its sensitivity, enabling detection of very low copy numbers of
DNA; this can be extremely useful in early stages of gestation [8]. In humans, it was
demonstrated that the non-invasive prediction of fetal sex from examination of
ccffDNA in maternal blood can be achieved with a high accuracy in the first three
months of pregnancy [11].
67
To our knowledge, this is the first study demonstrating the presence of ccffDNA
in pregnant mare’s plasma. This discovery opens an approach for non-invasive
assessment of pregnancy including the prenatal fetal gender identification. With the
horse genome sequence completed [17], genetic diseases can be detected with a
simple diagnostic test using the ccffDNA. Our future efforts are to improve the sexing
test sensitivity and to determine the least period of pregnancy in which it is possible
to detect the ccffDNA at satisfactory concentrations and Nested-qPCR for molecular
detection in equines.
In conclusion, this study demonstrates that it is possible to achieve fetal sex
determination using ccffDNA in mares.
4. Acknowledgements
The authors thank Dr. Kevin Smith for a critical review of the manuscript. This
work was supported by CNPq and FAPERGS, Brazil. P.M. M. de Leon and V. F.
Campos are students of the Graduate Program in Biotechnology at Federal
University of Pelotas and are supported by grants from CAPES.
68
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71
Figure captions
Figure 1. Molecular sexing test using equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA)
for SRY amplification: A) Polymerase chain reaction (PCR); B) Second round
Polymerase chain reaction (2nd-PCR); C) Quantitative Real Time Polymerase chain
reaction (qPCR). M: ccffDNA of male pregnant mare; F: ccffDNA of female pregnant
mare; +TC: positive control; -TC: negative control; NTC: non-template control;
72
Table 1. Sensitivity of molecular sexing by SRY and GAPDH genes amplification in equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDDNA).
*2nd-PCR: Second round Polymerase chain reaction
Samples SRY
PCR %
(n/total)
GAPDH
PCR %
(n/total)
SRY
2nd-PCR* %
(n/total)
GAPDH
2nd-PCR %
(n/total)
SRY
qPCR %
(n/total)
GAPDH
qPCR %
(n/total)
ccffDNA
Male pregnancy 72.7
(8/11)
100
(11/11)
90.9
(10/11)
100
(11/11)
90.9
(10/11)
100
(11/11)
Female pregmancy 0
(0/9)
100
(9/9)
0
(0/9)
100
(9/9)
0
(0/9)
100
(9/9)
Control Genomic DNA
Male 100
(10/10)
100
(10/10)
100
(10/10)
100
(10/10)
100
(10/10)
100
(10/10)
Female 0
(0/10)
100
(10/10)
0
(0/10)
100
(10/10)
0
(0/10)
100
(10/10)
Control mares
ccffDNA non-pregnant 0
(0/2)
100
(2/2)
0
(0/2)
100
(2/2)
0
(0/2)
100
(2/2)
ccffDNA virgin 0
(0/2)
100
(2/2)
0
(0/2)
100
(2/2)
0
(0/2)
100
(2/2)
73
5. PEDIDO DE PATENTE
Determinação do gênero fetal através de análise do DNA fetal livre
circulante em equinos
(Protocolo 016110005809)
74
ANEXO DE INVENTORES
Título: DETERMINAÇÃO DO GÊNERO FETAL ATRAVÉS DE ANÁLISE DO
DNA FETAL LIVRE CIRCULANTE EM EQUINOS
TIAGO VEIRAS COLLARES
PRISCILA MARQUES MOURA DE LEON
VINICIUS FARIAS CAMPOS
ODIR ANTÔNIO DELLAGOSTIN
JOÃO CARLOS DESCHAMPS
FABIANA KÖMMLING SEIXAS
75
Resumo da Patente de Invenção para: “DETERMINAÇÃO DO GÊNERO FETAL
ATRAVÉS DE ANÁLISE DO DNA FETAL LIVRE CIRCULANTE EM EQUINOS”
A presente invenção refere-se à determinação do gênero fetal durante a
gestação de equinos através de análise molecular a partir do DNA fetal livre
circulante no plasma de éguas. Em particular, a presente invenção refere-se a
extração de DNA fetal livre circulante em amostras de plasma sanguíneo de éguas
prenhes, seguida da identificação do gênero fetal através da identificação de genes
específico do gênero masculino (SRY) e da espécie equina (GAPDH), através da
técnica molecular de reação em cadeia da polimerase (PCR) e suas variações (PCR,
2º-PCR, Nested-PCR e PCR quantitativo em tempo real).
A presente invenção refere-se ainda a protocolos que foram elaborados para
utilização como procedimento de diagnóstico em estabelecimentos, como criatório
de equinos e laboratório veterinário especializado, permitindo assim diagnosticar o
sexo fetal durante o período gestacional de éguas. A sexagem fetal em equinos
influencia estratégias comerciais, como a decisão de venda e o valor agregado a
reprodutora. Em adição, a presente invenção indica substancial aplicação
diagnóstica do DNA fetal livre equino, servindo de substrato para o diagnóstico de
síndromes causadas por herança mendeliana e seleção a partir de marcadores
genéticos para melhoramento racial.
76
6. CONCLUSÕES
Os resultados apresentados nesta tese colaboram para o entendimento da
biologia reprodutiva de equinos, e indicam marcadores genéticos em potencial para
parâmetros de fertilidade.
I) No estudo da expressão de genes envolvidos no processo de apoptose no
complexo cumulus-oócito equino foi observado que os genes survivin e p53 são
marcadores em potencial de viabilidade. Oócitos equinos morfologicamente
saudáveis apresentam maior expressão de survivin e menor expressão de p53,
comparado a células do cumulus. Não foi detectada diferença na expressão de
genes apoptóticos analisados entre oócitos imaturos e maturados in vitro, e nem
entre oócitos de diferentes grupos morfológicos. O gene pró-apoptótico Bax foi
mais expresso em células do cumulus do grupo morfologicamente saudável. No
entanto, outros genes envolvidos na sobrevivência da célula e viabilidade
precisam ser estudados. Nossos dados sinalizam o progresso na compreensão
dos eventos moleculares envolvidos na comunicação e maturação in vitro de
oócitos, indicando possíveis marcadores de viabilidade e competência.
II) Na análise de polimorfismos genéticos, demonstramos a existência de SNP
Arginina/Prolina no exon 4 da p53 equina. Nossos resultados mostraram uma
associação do genótipo heterozigoto Arginina/Prolina da p53 com a ocorrência de
aborto em éguas Puro Sangue Inglês. Desta forma, evidenciando que o gene p53
desempenha um importante papel na reprodução equina. O estudo de SNP em
genes ligados à reprodução permite a previsão de marcadores de prognóstico da
fertilidade, indicando possíveis precauções no manejo reprodutivo em equinos.
77
III) Este foi o primeiro estudo que demonstra a presença de DNA fetal livre e
circulante em equinos. Esta descoberta abre uma abordagem para o diagnóstico
fetal não-invasivo durante a gestação de éguas. Nossos resultados mostram que
é possível determinar o sexo fetal através do ccffDNA e amplificação do gene
SRY em equinos.
78
7. REFERÊNCIAS
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84
ANEXO 1: Produção Científica no Doutorado
O período de doutoramento no Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia da UFPel, ao qual foram executados experimentos no Laboratório de
Embriologia Molecular e Transgenese e Laboratório de Genômica Funcional do
Centro de Desenvolvimento Tecnológico – Biotecnologia, gerou a produção de
produtos científicos e tecnológicos conforme especificado abaixo.
Artigos.......................................................................................................8
Patentes....................................................................................................3
Livros.........................................................................................................2
Capítulos de Livros....................................................................................2
Trabalhos Completos publicados em Anais de Eventos...........................5
Resumos Expandidos publicados em Anais de Congressos..................22
Resumos publicados em Anais de Congressos........................................6
I. Artigos Publicados em periódicos
CAMPOS, V. F.; KOMNINOU, E. R.; URTIAGA, G.; LEON, P. M. M.; SEIXAS, F. K.;
DELLAGOSTIN, O. A.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. NanoSMGT:
transfection of exogenous DNA on sex-sorted bovine sperm using nanopolymer.
Theriogenology, v. 75, p. 1476-1481, 2011.
COLLARES, T.; CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.; CAVALCANTI, P. V.; AMARAL,
M. G.; DELLAGOSTIN, O.; DESCHAMPS, J. C.; SEIXAS, F. K. Transgene
transmission in chickens by sperm-mediated gene transfer after seminal plasma
removal and exogenous DNA treated with dimethylsulfoxide or N,N-
dimethylacetamide. Journal of Biosciences, v. 36, p. 613-620, 2011.
CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.; KOMNINOU, E. R.; DELLAGOSTIN, O. A.;
DESCHAMPS, J. C.; SEIXAS, F. K.; COLLARES, T. NanoSMGT: transgene
85
transmission into bovine embryos using halloysite clay nanotubes or nanopolymer to
improve transfection efficiency. Theriogenology, v. 76, p. 1552-1560, 2011.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Cysteamine
increased the equine oocytes nuclear maturation rate. Theriogenology Insigh, v. 1, p.
25-32, 2011.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; CORCINI, C. D.; SANTOS, E. C. S.; RAMBO, G.;
LUCIA, T.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Cryopreservation of immature
equine oocytes, comparing a solid surface vitrification process with open pulled
straws and the use of a synthetic ice blocker. Theriogenology, 2011.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; KAEFER, C.; BEGNINI, K. R.; MCBRIDE, A. J. A.;
DELLAGOSTIN, O. A.; SEIXAS, F. K.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T.
Expression of apoptotic genes in immature and in vitro matured equine oocytes and
cumulus cells. Zygote (Cambridge. Print), 2011.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; DELLAGOSTIN, O.; DESCHAMPS, J. C.; SEIXAS,
F. K.; COLLARES, T. . Equine fetal sex determination using circulating cell-free fetal
DNA (ccffDNA). Theriogenology , 2011.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; THUROW, H. S.; HARTWIG, F. P., SELAU, L. P.;
DELLAGOSTIN, O. A., DESCHAMPS, J. C., SEIXAS, F. K., COLLARES, T.
Association between single nucleotide polymorphism in p53 and abortion in
Thoroughbred mares. The Veterinary Journal. 2011.
II. Patente de Invenção
COLLARES, T.; LEON, P. M. M.; SEIXAS, F. K.; CAMPOS, V. F.; DELLAGOSTIN,
O. A.; DESCHAMPS, J. C. Determinação do gênero fetal através da análise do DNA
fetal livre circulante em equinos. (Processo 016110005809). 2011.
86
COLLARES, T.; SEIXAS, F. K.; CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.; DELLAGOSTIN,
O. A.; DESCHAMPS, J. C. Transfecção de DNA exógeno para espermatozóides
usando nanotubo de haloisita (Processo 016110005807). 2011.
COLLARES, T.; LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; SEIXAS, F. K.; DESCHAMPS, J.
C. Técnica de vitrificação de oócitos em suporte metálico (Processo 016110005806).
2011.
III. Livros/Capítulos
SEIXAS, F. K.; DELLAGOSTIN, O.; LEON, P. M. M.; COLLARES, T.; GALLI, V.
Biossegurança em OGMs na fronteira da manipulação genética. 1ª. ed. Pelotas/RS:
Editora e Gráfica UFPel, 2009. v. 1. 284 p.
SEIXAS, F. K.; COLLARES, T.; LEON, P. M. M.; DELLAGOSTIN, O. A.; CAMPOS,
V. F. Risco Químico: boas práticas em biotecnologia. 1. ed. Pelotas/RS: Editora e
Gráfica UFPel, 2011. v. 1. 204 p.
LEON, P. M. M.; NEDEL, F.; COLLARES, T. Banco de Tumores. In: Fabiana K.
Seixas; Tiago Collares. (Org.). Oncologia Celular e Molecular: inovações
biotecnológicas. Pelotas/RS: Editora e Gráfica UFPel, 2011, v. 1, p. 82-107.
CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.; COLLARES, T. Animais Transgêncos e Câncer.
In: Fabiana K. Seixas; Tiago Collares. (Org.). Oncologia Celular e Molecular:
inovações biotecnológicas. Pelotas/RS: Editora e Gráfica UFPel, 2011, v. 1, p. 269-
286.
IV. Trabalhos Completos publicados em Anais de Eventos
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; HAAS, C. S.; SEIXAS, F. K.; DESCHAMPS, J. C.;
COLLARES, T. Effect of in vitro maturation on the expression of apoptosis-
87
associated genes in equine oocytes. In: II Jornada internacionales del Instituto de
Investigación y Tecnología en Reproducción Animal, 2010, Buenos Aires, Argentina.
LEON, P. M. M.; THUROW, H. S.; CAMPOS, V. F.; HAAS, C. S.; HARTWIG, F. P.;
SEIXAS, F. K.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Association among TP53 SNP
and reproductive parameters in mares. In: II Jornada internacionales del Instituto de
Investigación y Tecnología en Reproducción Animal., 2010, Buenos Aires, Argentina.
BEGNINI, K.; LEON, P. M. M.; KAEFER, C.; AGUIAR, I.; FORTES, E. K.; CAMPOS,
V. F.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Expressão de genes apoptóticos na
vitrificação de oócitos equinos.. In: 6ª Jornadas Técnicas de la Facultad de
Veterinaria, 2009, Montevideo, Uruguai.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; KAEFER, C.; BEGNINI, K.; AGUIAR, I.; FORTES,
E. K.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Avanços no estudo da expressão de
genes apoptóticos em oócitos equinos. In: 6ª Jornadas Técnicas de la Facultad de
Veterinaria, 2009, Montevideo, Uruguai.
KAEFER, C.; LEON, P. M. M.; BEGNINI, K.; AGUIAR, I.; FORTES, E. K.; CAMPOS,
V. F.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Avaliação da expressão de genes
apoptóticos e de estresse oxidativo em oócitos e tecidos do trato reprodutivo eqüino.
In: 6ª Jornadas Técnicas de la Facultad de Veterinaria, 2009, Montevideo, Uruguai.
V. Resumos Expandidos publicados em Anais de Congressos
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; LUCAS, C. G.; HAAS, C. S.; SEIXAS, F. K.;
COLLARES, T. Sexagem fetal em equinos utilizando o DNA livre fetal circulante
(ccffDNA). In: XIII ENPOS da UFPel, 2011, Pelotas, RS.
LUCAS, C.; HAAS, C. S.; LEON, P. M. M.; SEIXAS, F. K. Sexagem molecular de
embriões bovinos. In: XX Congresso de Iniciação Científica da UFPel, 2011, Pelotas,
RS.
88
BASGALUPP, S. P.; LUCAS, C.; HAAS, C.; LEON; P. M. M.; COLLARES, T.;
SEIXAS, F. K. Formação de biobancos de DNA para estudos de genômica funcional
na espécie equina. In: XX Congresso de Iniciação Científica da UFPel, 2011,
Pelotas, RS.
HAAS, C.; LUCAS, C. G.; LEON, P. M. M.; SEIXAS, F. K.; COLLARES, T.;
DESCHAMPS, J. C. Associação entre o polimorfismo da p53 e a ocorrência de
sarcóide em equinos. In: XX Congresso de Iniciação Científica da UFPel, 2011,
Pelotas, RS.
HARTWIG, F. P.; THUROW, H. S.; LEON, P. M. M.; HAACK, R.; HORTA, B. L.;
SEIXAS, F. K.; COLLARES, T. Estudo Associativo do SNP ARG72PRO do Gene
P53 e a Característica de Cor da Pele na Coorte de 1982.. In: XIX Congresso de
Iniciação Científica da UFPel, 2010, Pelotas, RS.
BJORKNESJO, S. C.; OLIVEIRA, R. S.; HAAS, C. S.; LEON, P. M. M.; SEIXAS, F.
K.; COLLARES, T. Genotipagem e análise em tempo real da expressão do gene da
p53 em tumores de células da granulosa (TCG) de equinos. In: XIX Congresso de
Iniciação Científica da UFPel, 2010, Pelotas, RS.
OLIVEIRA, R. S.; BJORKNESJO, S. C.; LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.;
DESCHAMPS, J. C.; Seixas, F. K.; COLLARES, T. Análise da expressão do gene
inibidor apoptótico Survivin durante a maturação in vitro de oócitos equinos.. In: XIX
Congresso de Iniciação Científica, XII ENPOS e II Mostra Científica da UFPel, 2010,
Pelotas, RS.
CAMPOS, V. F.; URTIAGA, G.; KOMNINOU, E. R.; LEON, P. M. M.; SEIXAS, F. K.;
DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. NanoSMGT: transfecção de DNA exógeno em
sêmen bovino sexado usando nanopolímeros. In: XIX Congresso de Iniciação
Científica, XII ENPOS e II Mostra Científica da UFPel, 2010, Pelotas, RS.
89
LEON, P. M. M.; THUROW, H. S.; HARTWIG, F. P.; NEDEL, F.; CAMPOS, V. F.;
SEIXAS, F. K.; COLLARES, T. Polimorfismo no códon 72 da p53 em coorte PSI
equina. In: XIX Congresso de Iniciação Científica, XII ENPOS e II Mostra Científica
da UFPel, 2010, Pelotas, RS.
HARTWIG, F. P.; CAMPOS, V. F.; LEON, P.M.M.; Seixas, F. K.; COLLARES, T.
Polimorfismos no Gene TLR2 Equino através de Análises In silico. In: I SIMPÓSIO
DOS PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFCSPA e I MOSTRA CIENTÍFICA
DE TRABALHOS DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE, 2010,
Porto Alegre, RS.
THUROW, H. S.; HARTWIG, F. P.; LEON, P. M. M.; HAACK, R.; HORTA, B. L.;
SEIXAS, F. K.; COLLARES, T. Associação do histórico familiar de câncer e o SNP
Arg72Pro da p53. In: VI Congresso Franco-Brasileiro de Oncologia, 2010, Rio de
Janeiro.
BEGNINI, K.; LEON, P. M. M.; KAEFER, C.; CAMPOS, V. F.; OLIVEIRA, R. S.;
COLLARES, T.; DESCHAMPS, J. C. Expression of Bcl-2 gene related to apoptosis in
equine oocytes. In: XV Meeting of the Brazilian Society for Cell Biology, 2010, São
Paulo, SP.
LEON, P. M. M.; BJORKNESJO, S. C.; THUROW, H. S.; CAMPOS, V. F.; SEIXAS,
F. K.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Expressão gênica de TP53 e survivin em
tumor de células da granulosa. In: VI Congresso Franco-Brasileiro de Oncologia,
2010, Rio de Janeiro.
URTIAGA, G.; COLLARES, T. F.; CAMPOS, V. F.; Seixas, F. K.; LEON, P. M. M.;
DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Viability of sperm cells from rabbits submitted to
gene doping with erythropoietin gene. In: XV Meeting of the Brazilian Society for Cell
Biology, 2010, São Paulo, SP.
KAEFER, C.; BEGNINI, K.; LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; COLLARES, T. F.;
AMARAL, M. G.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Avaliação in vitro de genes
90
apoptóticos e de estresse oxidativo em oócitos e tecidos reprodutivos eqüinos. In:
XVIII Congresso de Iniciação Científica e IX ENPOS, 2009, Pelotas, RS.
BERNEIRA, E.; AGUIAR, I.; AMARAL, M. G.; COLLARES, T. F.; CAMPOS, V. F.;
LEON, P. M. M.; COLLARES, T.; DESCHAMPS, J. C. Estudo da DNase do plasma
seminal de jundiá (Rhamdia quelen). In: XVIII CIC - Congresso de Iniciação
Científica - XI ENPOS - Encontro de Pós-Graduação - I Mostra Científica
Universidade Federal de Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
AGUIAR, I.; FORTES, E. K.; LEON, P. M. M.; KAEFER, C.; BEGNINI, K.; CAMPOS,
V. F.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Expressão das caspases 3 e 9 em
gametas e tecidos reprodutivos eqüinos. In: XVIII CIC - Congresso de Iniciação
Científica - XI ENPOS - Encontro de Pós-Graduação - I Mostra Científica
Universidade Federal de Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
BEGNINI, K.; KAEFER, C.; AGUIAR, I.; LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.;
COLLARES, T. F.; AMARAL, M. G.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Expressão
dos genes Bax, Bcl-2 e p53, relacionados aos processos de apoptose, durante a
vitrificação de oócitos eqüinos. In: XVIII CIC - Congresso de Iniciação Científica - XI
ENPOS - Encontro de Pós-Graduação - I Mostra Científica Universidade Federal de
Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
LEON, P. M. M.; CAMPOS, V. F.; KAEFER, C.; BEGNINI, K.; COLLARES, T. F.;
AMARAL, M. G.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Delineamento in silico e
avaliação in vitro de genes apoptóticos em oócitos eqüinos. In: XVIII CIC -
Congresso de Iniciação Científica - XI ENPOS - Encontro de Pós-Graduação - I
Mostra Científica Universidade Federal de Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
COLLARES, T. F.; BERNEIRA, E.; AGUIAR, I.; CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.;
AMARAL, M. G.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Clonagem do gene da
eritropoetina de coelho. In: XI ENPOS - Encontro de Pós-Graduação - I Mostra
Científica Universidade Federal de Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
91
CAMPOS, V. F.; COLLARES, T. F.; KAEFER, C.; LEON, P. M. M.; LANES, C. F.;
SANDRINI, J. C.; MARINS, L. F.; OKAMOTO, M.; SAMPAIO, L. A.; DESCHAMPS, J.
C.; COLLARES, T.; ROBALDO, R. B. Avaliação da expressão gênica do
neuropeptídeo Y durante 24 horas no linguado Paralichthys orbignyanus. In: XVIII
CIC - Congresso de Iniciação Científica - XI ENPOS - Encontro de Pós-Graduação -
I Mostra Científica Universidade Federal de Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
KAEFER, C.; COLLARES, T. F.; BERNEIRA, E.; CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.;
AMARAL, M. G.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Análise da motilidade
espermática em coelhos utilizados para avaliar a administração de eritropoetina na
espermatogênese. In: XVIII CIC - Congresso de Iniciação Científica - XI ENPOS -
Encontro de Pós-Graduação - I Mostra Científica Universidade Federal de Pelotas,
2009.
VI. Resumos publicados em Anais de Congressos
THUROW, H. S.; HARTWIG, F. P.; LEON, P. M. M.; HAACK, R.; HORTA, B. L.;
COLLARES, T. ; SEIXAS, F. K. Análise do SNP Arg72Pro do gene da p53 e a
herança familiar de câncer na coorte de 1982 de Pelotas. In: XII Encontro de Pós-
Graduação da UFPel, 2010, Pelotas, RS. XII Encontro de Pós-Graduação da UFPel,
2010.
GONCALVES, B.; NUNES, F. D.; LEON, P. M. M.; COLLARES, T. F.; AMARAL, M.
G.; CAMPOS, V. F.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Avaliação da motilidade de
espermatozóides de galos após a retirada do plasma seminal por sucessivas
lavagens. In: XVIII Congresso de Iniciação Científica e IX ENPOS, 2009, Pelotas,
RS.
BERNEIRA, E.; COLLARES, T. F.; AGUIAR, I.; CAMPOS, V. F.; LEON, P. M. M.;
AMARAL, M. G.; COLLARES, T.; DESCHAMPS, J. C. Perfil eletroforético em SDS-
PAGE das proteínas do plasma seminal de coelho (Orytologus cuniculus). In: XI
92
ENPOS - Encontro de Pós-Graduação - I Mostra Científica Universidade Federal de
Pelotas, 2009, Pelotas, RS.
NUNES, F. D.; GONCALVES, B.; LEON, P. M. M.; COLLARES, T. F.; AMARAL, M.
G.; CAMPOS, V. F.; DESCHAMPS, J. C.; COLLARES, T. Avaliação da concentração
de células espermáticas de galos doadores de sêmen usados na geração de aves
transgênicas. In: XVIII CIC - Congresso de Iniciação Científica - XI ENPOS -
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