UFRRJ INSTITUTO DE AGRONOMIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

CIÊNCIA DO SOLO

TESE

Inoculação de Herbaspirillum seropedicae em Duas

Variedades de Arroz Irrigado: Qualidade do

Inoculante e Necessidade da Reinoculação

Joilson Silva Ferreira

2008

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE AGRONOMIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA - CIÊNCIA DO SOLO

INOCULAÇÃO DE Herbaspirillum seropedicae EM DUAS VARIEDADES DE ARROZ IRRIGADO: QUALIDADE DO INOCULANTE E

NECESSIDADE DA REINOCULAÇÃO

JOILSON SILVA FERREIRA

Sob a Orientação da Professora Vera Lúcia Divan Baldani

e Co-orientação dos Professores José Ivo Baldani

Sonia Regina de Souza

Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências em Agronomia, Área de Concentração em Ciência do Solo

Seropédica, RJ Fevereiro de 2008

UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

633.18 F383i T

Ferreira, Joilson Silva, 1977- Inoculação de Herbaspirillum seropedicae em duas variedades de arroz irrigado: qualidade do inoculante e necessidade da reinoculação/ Joilson Silva Ferreira – 2008. 85 f. : il. Orientador: Vera Lúcia Divan Baldani. Tese (Doutorado) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto de Agronomia. Bibliografia: f. 59-67. 1. Arroz - Cultivo – Teses. 2. Arroz – Inoculação - Teses. 3. Bactérias nitrificantes – Teses. 4. Nitrogênio - Fixação – Teses. I. Baldani, Vera Lúcia Divan, 1954- . II. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Instituto de Agronomia. III. Título.

É permitida a cópia parcial ou total desta tese, desde que seja citada a fonte.

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE AGRONOMIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA – CIÊNCIA DO SOLO

JOILSON SILVA FERREIRA Tese submetida ao Curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de Concentração em Ciência do Solo, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências em Agronomia. TESE APROVADA EM 27/02/2008

Vera Lúcia Divan Baldani. Ph.D., Embrapa Agrobiologia (Orientadora)

Silvia Regina Goi. Ph. D., UFRRJ

________________________________________ Marcos Gervásio Pereira. Dr., UFRRJ

Marivaine da Silva Brasil. Dra., UFMS

Eliana Gertrudes de Macedo Lemos. Dra., UNESP

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Eremita e Manoel. Às minhas irmãs, Fátima, Elenilsa e Janilza.

Aos meus sobrinhos.

AGRADECIMENTOS A Deus pela dadiva da vida.

À CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela bolsa concedida. Ao CPGA-CS, Curso de Pós-Graduação em Agronomia – Ciência do Solo, pela oportunidade concedida. Aos amigos do Curso de Pós-Graduação em Agronomia – Ciência do Solo, da UFRRJ e da Embrapa Agrobiologia que tornarão estes anos de trabalho os melhores possíveis. Aos professores e funcionários do Departamento de Solos, em especial aos professores Marcos Gervásio Pereira, Alexandre Ravelli e Lúcia Cunha dos Anjos e aos funcionários Roberto e Luciene da Secretária do curso. À Embrapa Agrobiologia por fornecer condições para a realização deste trabalho. À Dra. Vera Baldani pela orientação e apoio em todos os momentos do desenvolvimento desta tese e no convívio do dia-dia. Ao Dr. José Ivo Baldani e a Prof. Sônia Regina de Souza pela co-orientação. Aos funcionários da Embrapa Agrobiologia que ajudaram neste trabalho. A Geraldo Baeta por está sempre a disposição para ajudar a qualquer momento. Aos laboratoristas Lúcio e Wilson, à Dra. Verônica Massena Reis e aos bolsistas e ex-bolsistas do laboratório de Gramíneas, Salomão, Daniele, Marcela, Luciana, Elisete, Marinete, Gabriela, Marivaine, Liamara, Erineudo, Guilherme, Leandro, Rafael, Wilmondes, Paulo Marcos Fernandes Boa Sorte e Willian por tornarem o laboratório um ambiente de trabalho bem descontraído. Aos meus amigos Gilmar e Salomão pela ajuda, apoio e respeito em todos os momentos durante esses 15 anos de convivência. Aos Amigos Deividson, Michael, Vandro e Geovane pelos bons momentos que passamos por todos esses anos. Ao grupo que tentou formar a mesa das quartas- feiras, Cristiane, Ricardo, Daniele, Salomão, Edílson e Liamara, mas que não deu muito certo. Ao pessoal do campo experimental da Embrapa (Terraços e Casa de Vegetação) pela ajuda e colaboração nos experimentos. Por fim, um agredecimento especial a Grande Amiga Miche le de Oliveira Macedo que partiu de forma inesperada, mas as lembranças da pessoa maravilhosa que foi, ficará para sempre em minha memória.

BIOGRAFIA Nascido em Inhambupe, município do estado da Bahia, filho de Eremita Silva Ferreira e Manoel Quirino Ferreira, concluiu o ensino fundamental no Colégio Estadual Mário Costa Filho no ano de 1991. Ingressando em 1992 no Curso de Magistério no mesmo colégio. Sendo que em 1993 desistiu do magistério e ingressou no curso de Técnico em Agropecuária, pela Escola Agrotécnica Federal de Catu - BA, concluindo o curso em 1995. Em 1996 trabalhou como funcionário temporário do IBGE, onde foi responsável pela coordenação dos censos agropecuário e populacional no município de Inhambupe. No ano de 1997 iniciou o Curso de Engenharia Florestal pela UFRRJ, em 1997 e 1998 foi bolsista de pré- iniciação científica no Departamento de Produtos Florestais do Instituto de Florestas da UFRRJ. Iniciou em 1999 trabalhos de pesquisa na Embrapa Agrobiologia como Bolsista de Iniciação Científica sob a orientação da Dra. Vera Lúcia Divan Baldani. Formou-se em Engenharia Florestal em 2002, concluindo o mestrado em Agronomia - Ciência do Solo em 2004 e no mesmo ano iniciou o curso de doutorado.

ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1: Exemplos de organismos de vida livre fixadores de nitrogênio. ............................... 4 Tabela 2: Análise química de amostras de terra utilizada no plantio das variedades de arroz

no experimento de vasos. ......................................................................................... 13 Tabela 3: Análise química das amostras de terra do horizonte A do Argisolo Vermelho

Amarelo utilizado nos experimentos com a cultura do arroz................................... 14 Tabela 4: Análise química das amostras de terra do horizonte A do Argissolo Vermelho

Amarelo utilizado nos experimentos com a cultura do arroz................................... 15 Tabela 5: Iniciadores utilizados nas reações de amplificação para análise por DGGE e

respectivas seqüências de nucleotídeos. ................................................................... 17 Tabela 6: Número de bactérias diazotróficas crescidas no meio de cultivo JNFb, presentes em

raiz e parte aérea de arroz inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae, variedade IAC4440, no estádio de desenvolvimento, vegetativo. ...... 23

Tabela 7: Acúmulo de massa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IR42 inoculadas com ou sem a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0 e 50 kg de N . ha-1). ....................................................... 24

Tabela 8: Acúmulo de massa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IAC4440 inoculadas com ou sem a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0 e 50 kg de N . ha-1). ....................................................... 24

Tabela 9: Produção de grãos das plantas de arroz da variedade IR42 inoculadas com ou sem a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0 e 50 kg de N . ha-1). ............................................................................................................... 25

Tabela 10: Produção de grãos das plantas de arroz da variedade IAC4440 inoculadas com ou sem a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante (0 e 50 kg de N . ha-1)........................................................................................................................... 25

Tabela 11: Número de bactérias diazotróficas crescidas no meio de cultivo JNFb, presentes em raiz e parte aérea de arroz, variedades IAC4440 e IR42, inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae, nos estádios de desenvolvimento vegetativo e florescimento (Primeiro ano) . ................................................................................. 26

Tabela 12: Acúmulo de massa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IR42, no estádio de desenvolvimento vegetativo (80 DAP), inoculadas com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1)........................................................................................................................... 27

Tabela 13: Acúmulo de massa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IAC4440, no estádio de desenvolvimento vegetativo (80 DAP), inoculadas com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1). ................................................................................................... 27

Tabela 14: Acúmulo de massa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IR42, no estádio de desenvolvimento florescimento, inoculadas com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1). . 28

Tabela 15: Acúmulo de massa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IAC4440, no estádio de desenvolvimento florescimento, inoculada com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1). ................................................................................................................ 28

Tabela 16: Acúmulo de nitrogênio total da parte aérea das plantas de arroz da variedade IR42, no estádio de desenvolvimento vegetativo, inoculadas com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1)........................................................................................................................... 29

Tabela 17: Acúmulo de nitrogênio total da parte aérea das plantas de arroz da variedade IAC4440, no estádio de desenvolvimento vegetativo, inoculadas com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1)........................................................................................................................... 29

Tabela 18: Acúmulo de nitrogênio total da parte aérea das plantas de arroz da variedade IR42, no estádio de desenvolvimento florescimento, inoculadas com a estirpe ZAE 94 e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1). ................ 29

Tabela 19: Acúmulo de nitrogênio total da parte aérea das plantas de arroz da variedade IAC4440, no estádio de desenvolvimento florescimento, inoculadas com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1). ................................................................................................................ 30

Tabela 20: Produção de grãos das plantas de arroz da variedade IR42 inoculada com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1). ...................................................................................... 30

Tabela 21: Produção de grãos das plantas de arroz da variedade IAC4440 inoculadas com a estirpe ZAE 94 de Herbapirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1).............................................................. 32

Tabela 22: Acúmulo de nitrogênio total dos grãos de arroz da variedade IR 42 inoculada com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1).............................................................. 34

Tabela 23: Acúmulo de nitrogênio total dos grãos de arroz da variedade IAC 4440 inoculada com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1).............................................................. 35

Tabela 24: Acúmulo de proteína total dos grãos de arroz da variedade IR 42 inoculada com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1).............................................................. 36

Tabela 25: Acúmulo de proteínas dos grãos de arroz da variedade IAC 4440 inoculada com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1).............................................................. 37

Tabela 26: Número de bactérias diazotróficas crescidas no meio de cultivo JNFb, presentes em raiz e parte aérea de arroz, variedades IAC4440 e IR42, inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de H. seropedicae, nos estádios de desenvolvimento, vegetativo e florescimento. ........................................................................................................... 39

Tabela 27: Acúmulo de biomassa seca e nitrogênio total da parte aérea das plantas de arroz da variedade IR42, no estádio de desenvolvimento vegetativo (80 DAP) e florescimento inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado ( 0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1) e tratamentos de reinoculação. .................................................................................... 40

Tabela 28: Acúmulo de biomassa seca da parte aérea das plantas de arroz da variedade IAC4440, no estádio de desenvolvimento vegetativo (80 DAP) e florescimento, inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado ( 0, 20, 25 e 50 kg de N. ha-1) e tratamentos de reinoculação. ............................................................................................................ 41

Tabela 29: Produção, nitrogênio total e proteína bruta total dos grãos das plantas de arroz da variedade IR42 inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum

seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) e tratamentos de reinoculação. .................................................................................... 42

Tabela 30: Produção, nitrogênio total e proteína total dos grãos das plantas de arroz da variedade IAC4440 inoculadas ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e com ou sem fertilizante nitrogenado ( 0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) e tratamentos de reinoculação. .................................................................................... 43

Tabela 31: Número do acesso e respectiva identificação das estirpes das espécies do gênero Herbaspirillum depositadas no GenBank e utilizadas no alinhamento da 16S DNAr. .................................................................................................................................. 44

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Desenho experimental dos tratamentos do primeiro ano para uma variedade em um

bloco. ........................................................................................................................ 15 Figura 2: Desenho experimental dos tratamentos do experimento de reinoculação (segundo

ano) para uma variedade em um bloco..................................................................... 16 Figura 3: Sobrevivência da estirpe ZAE 94 de H. seropedicae em inoculante turfoso

preparado utilizando turfa neutralizada com (CaCO3) à pH 6,0 e 7,0 e teor de umidade de 43 %. ..................................................................................................... 19

Figura 4: Sobrevivência da estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae em função do tempo nos diferentes teores de umidades (20 (a), 43 (b), 60 (c) e 80 % (d)) utilizados no preparo dos inoculantes. ..................................................................... 21

Figura 5: Sobrevivência da estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae em inoculante turfoso preparado com diferentes teores de umidade aos 180 dias de armazenamento em geladeira. .................................................................................. 22

Figura 6: Sobrevivência da estirpe ZAE 94 de H. seropedicae em inoculante turfoso armazenados em dois tipos de embalagem: (1) mais porosa (2) menos porosa e mantidos em geladeira por 180 dias. ........................................................................ 23

Figura 7: Análise de regressão da produção de grãos em função das doses de nitrogênio (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) na variedade IR42 inoculada ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae. .......................................................................... 31

Figura 8: Análise de regressão da variável produção de grãos em função das doses de nitrogênio (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) na variedade IAC4440 inoculada ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae. ........................................... 32

Figura 9: Análise de regressão da variável nitrogênio total dos grãos em função das doses de nitrogênio (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) na variedade IR42 inoculada ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae. ................................................... 34

Figura 10: Análise de regressão da variável nitrogênio total dos grãos em função das doses de nitrogênio (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) na variedade IAC440 inoculada ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae. ........................................... 35

Figura 11: Análise de regressão da variável proteína total dos grãos em função das doses de nitrogênio (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) na variedade IR42 inoculada ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae. ................................................... 36

Figura 12: Análise de regressão da variável proteína total dos grãos em função das doses de nitrogênio (0, 20, 50 e 100 kg de N. ha-1) na variedade IAC440 inoculada ou não com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae. ........................................... 37

Figura 13: Árvore filogenética da região 16S rRNA das diferentes espécies do gênero Herbaspirillum em comparação com a estirpe ZAE 94, agrupadas pelo método neighbour-joining. .................................................................................................... 45

Figura 14: DNA total extraído dos tecidos do colmo das plantas de arroz (primeiro experimento de campo).. .......................................................................................... 46

Figura 15: Fragmentos de 700 pb obtidos apartir da reação de PCR da região de 16s rRNA utilizando os primers específicos 799f e 1492r (material amplificado do primeiro experimento de campo). ........................................................................................... 47

Figura 16: Produto de amplificação da região de 16s rDNA utilizando os primers específicos 968f(GC) e 1401r (material amplificado do primeiro experimento de campo).. ..... 48

Figura 17: Dendograma de similaridade (UPGMA) obtido a partir da análise do gel de DGGE utilizando o programa GelComparII. Experimento de Inoculação.. ............ 49

Figura 18: Dendograma de similaridade (UPGMA) obtido a partir da análise do gel de DGGE utilizando o programa GelComparII. Experimento de Reinoculação. ......... 50

Figura 19: Dendograma de similaridade (UPGMA) e alinhamento das bandas obtido a partir da análise do gel de DGGE utilizando o programa GelComparII. Experimento de Inoculação ................................................................................................................ 52

Figura 20: Dendograma de similaridade (UPGMA) e alinhamento das bandas obtido a partir da análise do gel de DGGE utilizando o programa GelComparII. Experimento de Reinoculação ............................................................................................................ 53

Figura 21: Dendograma de similaridade (UPGMA) obtido a partir da análise do gel de DGGE utilizando o programa GelComparII. Experimento de Inoculação .............. 54

Figura 22: Dendograma de similaridade (UPGMA) obtido a partir da análise do gel de DGGE utilizando o programa GelComparII. Experimento de Reinoculação. ......... 55

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO GERAL .............................................................................................. 1

2 - REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................... 3 2.1 - A Cultura do Arroz ........................................................................................................ 3 2.2 - A Importância do Nitrogênio ........................................................................................ 3 2.3 - Organismos Fixadores de Nitrogênio ............................................................................ 4 2.4 - A Fixação Biológica de N2 em Gramíneas .................................................................... 4 2.5 - Reinoculação de Bactérias Diazotróficas ...................................................................... 6 2.6 - Produção e Preparo de Inoculantes ............................................................................... 7 2.7 - Fatores que Afetam a Sobrevivência de Microrganismos Diazotróficos ...................... 9 2.8 – Importância da Técnica de DGGE no Estudo da Diversidade de Bactérias Diazotróficas .......................................................................................................................... 9

3 - MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 12 3.1- Métodos Gerais Utilizados nos Experimentos ............................................................. 12 3.1.1- Caracterização do material murfoso utilizado e condições de multiplicação da bactéria................................................................................................................................. 12 3.1.2- Preparo da turfa com diferentes pH........................................................................... 12 3.1.3- Preparo dos inoculantes com diferentes teores de umidade ...................................... 12 3.1.4- Sobrevivência das bactérias nas turfas ...................................................................... 13 3.1.5- Caracterização das embalagens utilizadas................................................................. 13 3.2- Inoculação da Estirpe ZAE 94 de H. seropedicae em Vasos ....................................... 13 3.2.1- Sementes.................................................................................................................... 13 3.2.2- Plantio, tratamentos e delineamento experimental .................................................... 14 3.3- Inoculação e Reinoculação da Estirpe ZAE94 de H. seropedicae em Condições de Campo. ................................................................................................................................. 14 3.3.1- Plantio, tratamentos e delineamento experimental do experimento de inoculação .. 14 3.3.2- Plantio, tratamentos e delineamento estatístico do experimento de reinoculação. ... 15 3.3.3- Análise da diversidade de bactérias presentes nas plantas de arroz inoculadas e reinoculadas com a estirpe de H. seropedicae (estirpe ZAE 94) em condições de campo. 16

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 19 4.1 - Sobrevivência da Bactéria em Turfa com Diferentes pH ............................................ 19 4.2 - Sobrevivência da Bactéria em Inoculante com Diferentes Teores de Umidade e Tipo de Embalagem ..................................................................................................................... 20 4.3 - Experimento de Inoculação em Vasos ........................................................................ 23 4.4 - Experimento de Inoculação de H. seropedicae (estirpe ZAE 94) em Condições de Campo. ................................................................................................................................. 25 4.5 - Experimento de Reinoculação de H. seropedicae (estirpe ZAE 94) em Condições de Campo. ................................................................................................................................. 38 4.6 - Análise da Comunidade Microbiana Presente em Plantas de Arroz Crescidas em Condições de Campo e Inoculadas e Reinoculadas com a Estirpe de H. seropedicae (estirpe ZAE 94). ................................................................................................................. 43 4.6.1 – Sequenciamento da região 16S DNAr da estirpe ZAE 94 de H. seropedicae utilizada nos ensaios de inoculação e reinoculação. ............................................................ 43

4.6.2 - Análise da comunidade de bactérias presentes nas plantas de arroz inoculadas e reinoculadas com a estirpe ZAE94 através da técnica de DGGE........................................ 45

5– CONCLUSÕES ............................................................................................................. 57

6- CONSIDERAÇÔES FINAIS........................................................................................ 58

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 59

8- APÊNDICE .................................................................................................................... 68

RESUMO FERREIRA, Joilson Silva. Inoculação de Herbaspirillum seropedicae em duas variedades de arroz irrigado: qualidade do inoculante e necessidade da reinoculação. 2008. 69f. Tese (Doutorado em Agronomia, Ciência do Solo). Instituto de Agronomia, Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008. A demanda para a utilização de bactérias diazotróficas como biofertilizante em diferentes culturas de plantas não leguminosas cresceu muito nos últimos anos, principalmente pelo fato de que ainda não existe no mercado nacional um inoculante disponível para estas plantas. Os objetivos deste trabalho foram: avaliar alguns aspectos que influenciam na qualidade de inoculantes e o efeito da inoculação e da reinoculação de Herbaspirillum seropedicae estirpe ZAE 94 (BR 11417), aplicada como inoculante na forma turfosa em duas variedades de arroz irrigado: IR 42 e IAC 4440. A qualidade do inoculante foi avaliada através da sobrevivência da estirpe em inoculantes preparados com diferentes teores de umidade, pH e embalagens durante o período de 180 dias de armazenamento em geladeira, e sua contribuição foi avaliada através dos parâmetros de produção, N-total e proteína total dos grãos. O impacto da inoculação e reinoculação, sobre a comunidade de bactérias presentes no colmo das plantas de arroz, foi realizada através da técnica de DGGE. A estirpe ZAE 94 foi multiplicada em meio de cultura por 24 h a 30° C a 100 rpm e a suspensão celular obtida foi misturada à turfa seca, moída e com a acidez corrigida para pH 7,0 e teor de umidade de 43 %. O inoculante produzido foi aplicado nas sementes de arroz, em um experimento em vasos e em dois experimentos consecutivos em campo em solo Argissolo Vermelho Amarelo, com delineamento experimental em blocos ao acaso. Os ensaios de qualidade mostraram que a umidade e tipo de embalagem utilizada foram os parâmetros que mais influenciaram a sobrevivência da estirpe. Os resultados obtidos nos experimentos de inoculação e reinoculação mostraram que o tratamento inoculado, com a estirpe ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae, foi estatisticamente igual ao tratamento que recebeu 20 kg . ha-1 de nitrogênio mineral, na forma de Sulfato de Amônia, na variedade IR42 e 50 kg . ha-1 na variedade IAC4440 para os parâmetros de produção, N-total e proteínas de grãos. O ensaio de reinoculação mostrou que a utilização do inoculante a base da estirpe ZAE 94 se faz necessária em todos os anos de plantio, já que os tratamentos inoculados e reinoculados foram estatisticamente iguais, porém estatisticamente superiores aos tratamentos não inoculados e ao que havia recebido inoculação somente no ano anterior nas duas cultivares. O uso da técnica de DGGE na análise da comunidade microbiana das plantas de arroz, em ambos experimentos de campo, mostrou uma ampla ocorrência de bandas na mesma altura da espécie Herbaspirillum seropedicae, mesmo nos tratamentos que não foram inoculados. Isto indica que esta bactéria tem grande capacidade de colonizar a planta hospedeira. Este estudo também mostrou uma grande ocorrência de bandas diferentes daquelas dos padrões utilizados, o que sugere a colonização das plantas de arroz por diferentes espécies de bactérias.

Palavras-chave: Inoculantes, Bactérias diazotróficas endofíticas, FBN, DGGE.

ABSTRACT FERREIRA, Joilson Silva., Inoculation of the Herbaspirillum seropedicae in two rice lowland varieties: Inoculant quality and need reinoculation. 2008. 69f. Thesis (Doctor Sciense in Agronomy, Soil Sciense). Instituto de Agronomia, Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2000.

The demand for the use of diazotrophic bacteria as biofertilizant in differents non leguminous crops grew a lot in the last years mainly due to the fact that there is no commercial inoculant available in Brazil. The aim of this work was to evaluate some aspects that can influence the quality of the inoculant and the contribution of the inoculation and reinoculation of the Herbaspirillum seropedicae strain ZAE 94 (BR 11417), applied as peat inoculant in two varieties of lowland rice: IR 42 and IAC 4440. The quality of the inoculant was evaluated following the survival of the strain used in the inoculant prepared with different moisture levels, pH and type of package bags storage in refrigerator during the period of 180 days and your contribuition was evaluated using the parameters yield, N-total and total of proteins accumulated in the grains. The effect of inoculation and reinoculation, on the community of the bacteria present in the stem of the rice plants was evaluated us ing the technique of DGGE. The strain ZAE 94 was grown in culture medium at 30° C and 100 rpm for 24 h and the obtained cell suspension was used in the different experiments. The inoculant was prepared using grounded dry peat, pH adjusted to 7.0 and with 43% of moisture. The produced inoculant was applied on the seeds of the rice varieties just before planting. One experiment was carried out in pots and two consecutive experiments in the field, the soil in the area classified as Udult, in a randomized block design. The data obtained showed that the moisture and package type were the aspects that had more influence on the survival strain. The results of the inoculation and reinoculation experiments showed that the inoculated ZAE 94 strain was statistically similar to the treatment of 20 kg. ha-1 of ammonium sulfate applied as the nitrogen source in the variety IR42 and equivalent to 50 kg. ha-1 in the variety IAC4440 for the parameters yield, N-total and proteins of grains. The reinoculation experiments showed the necessity to reinoculate the strain ZAE 94 in the following planting years, since that the inoculated and reinoculated treatments were statically similar but significantly superior to the non inoculated treatment and the treatment was inoculated only in the previous year for both parameters and rice varieties used. The DGGE technique applied to analyze the bacterial community present in the rice plants of both experiments showed wide occurrence of bands in the same height of the Herbaspirillum seropedicae species, even for the treatments that was not inoculated, suggesting that this bacterium has great capacity of dispersion and colonize the host plant. This study also showed occurrence of bands of different sizes from the control patterns, suggesting that rice plant varieties are colonized by different bacterial species.

Key words: Inoculants, Diazotroph Endophytic Bacteria, FBN, DGGE.

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1 – INTRODUÇÃO GERAL

O nitrogênio é um dos elementos minerais mais importantes para a produção das culturas. Embora, presente em abundância na atmosfera (78%), na forma de N2, este elemento não está prontamente disponível para as plantas, uma vez que a ligação tripla e covalente desta molécula não pode ser rompida pelas plantas. Entre os processos que podem romper esta molécula, tornando-a assimilável pelas plantas, está o da Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) que é o mais estudado em culturas de plantas leguminosas (HUNGRIA et al., 2000). A eficiência do processo da FBN em plantas de leguminosas é facilmente vis ualizada na cultura da soja no Brasil, onde atualmente não se aplica N de fertilizantes minerais, e mesmo assim o Brasil é o segundo maior produtor mundial desta leguminosa (FAO, 2004). Em plantas não leguminosas, o processo da FBN não é tão eficiente quanto na cultura da soja. Contudo, várias bactérias capazes de fixar nitrogênio atmosférico, como os gêneros Herbaspirillum, Burkholderia e Azospirillum, têm sido isoladas de plantas como arroz, trigo, milho e sorgo em vários experimentos (BALDANI, 1984, 1996; OLIVEIRA, 1992; RODRIGUES, 2003). Os resultados de inoculação destas bactérias ainda não são muito consistentes, embora, efeitos significativos na produção de grãos e N-total da planta tenham sido relatados (BALDANI, 1984, 1996).

De uma maneira geral, 60-70% dos experimentos citados por OKON & LABANDERA-GONZALEZ (1994) obtiveram sucesso, sendo que somente 5-30% deles apresentaram respostas estatisticamente significativas à inoculação de bactérias diazotróficas. Um balanço dos resultados de experimentos de inoculação com Azospirillum mostra uma grande variabilidade nos efeitos sobre culturas como o trigo, arroz, milho e sorgo, onde a média de incremento na produção de grãos está em torno de 20 a 30% (BALDANI et al., 1999; FERREIRA et al., 2003; GUIMARÃES et al., 2007).

A inconsistência destes resultados pode ser atribuída à baixa sobrevivência das bactérias diazotróficas endofíticas em solo. Por isso, torna-se importante o estudo da reinoculação destas bactérias, buscando maximizar a contribuição desta associação para a cultura do arroz.

Estudos usando a técnica de diluição isotópica com 15N mostraram, em condições gnotobióticas, efeitos positivos da inoculação das estirpes diazotróficas endofíticas selecionadas de Herbaspirillum seropedicae e Burkholderia sp. Essas estirpes contribuíram com 54 e 27%, respectivamente do N-total acumulado nas plantas de arroz da variedade Guarani (BALDANI et al, 2000). Contudo, ainda não foi desenvolvido um inoculante para o arroz, e os estudos nesse sentido devem avançar, para que seja obtido um inoculante capaz de suprir grande parte das necessidades de nitrogênio deste cereal.

De modo geral a inoculação de bactérias diazotróficas na cultura do arroz, bem como em plantas da família Poaceae (gramíneas), pode substituir a aplicação em média de 40 kg de N . ha-1, dependendo da variedade de arroz utilizada (BALDANI et al., 2000; FERREIRA et al., 2003). Essa contribuição da inoculação é facilmente quantificada numericamente. Entretanto, outros impactos ambientais, como diminuição da contaminação dos lençóis freáticos resultante da minimização do uso de N de fertilizantes minerais, são mais difíceis de serem quantificados matematicamente.

Apesar destes resultados promissores, e do Brasil ser um país referência em FBN em plantas leguminosas e não leguminosas, tendo aparatos tecnológicos e mão-de-obra qualificada, ainda não existe no mercado um inoculante comercial para gramíneas. O desuso desta tecnologia, em culturas como arroz, milho, trigo e cana-de-acúcar, coloca o Brasil em

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posição de desvantagem em relação a países como Argentina e México, onde já existem empresas especializadas na produção desta tecnologia, além de gerar perdas à economia brasileira.

Adicionalmente, ainda não existem estudos sobre o efeito da inoculação destes microrganismos sobre a diversidade de bactérias presentes nas plantas, já que o aumento da população de um determinado microrganismo pode afetar a população e a funcionalidade dos demais dentro da planta hospedeira.

Diante do exposto, os objetivos deste trabalho foram: -Avaliar a contribuição da inoculação e reinoculação da bactéria diazotrófica selecionada para as variáveis, produção, N%, N-total e teor de proteína dos grãos, nas variedades de arroz IR42 e IAC4440 em condições de campo, em dois ciclos consecutivos; -Verificar como os fatores, pH, umidade e tipo de embalagem podem afetar diretamente a sobrevivência da bactéria diazotrófica utilizada no preparo dos inoculantes. Avaliar o efeito da sua inoculação da bactéria diazotrófica utilizada sobre a comunidade de bactérias presentes no colmo das plantas de arroz, utilizando a técnica de DGGE (Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante).

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2 - REVISÃO DE LITERATURA 2.1 - A Cultura do Arroz

O arroz (Oryza sativa L.) é uma cultura anual, monocotiledônea pertencente à família Poaceae (MOREIRA & KLUGE, 1999), com distribuição entre as latitudes de 45° Norte a 40° Sul e desde o nível do mar até 3000 metros de altitude (PINZAN, 1986). O Brasil ocupa atualmente o 9° lugar, com 3% da produção mundial, e produção média anual de 3,4 ton/ha (IBGE, 2007). O estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor nacional. O sistema de cultivo predominante no Rio Grande do Sul é o de irrigação por inundação com uma área plantada de 990 mil hectares (IBGE, 2007). Nos estados de Mato Grosso e Maranhão, o sistema de cultivo é o de sequeiro com área plantada de 494 mil e 372 mil hectares, respectivamente (IBGE, 2007). Este sistema é influenciado pela disponibilidade de água, através da chuva, o cultivo é feito no período de verão, entre os meses de outubro e abril (GUIMARÃES & SANT’ANA, 1999).

Nos últimos 25 anos, a lavoura de arroz tornou-se altamente dependente dos fertilizantes químicos, aumentando assim os custos de produção. A seleção de variedades de arroz mais eficiente na FBN, adaptadas à condição de inundação e de sequeiro, é uma estratégia interessante e deve ser considerada para a sustentabilidade desta cultura (OLIVEIRA, 1994). 2.2 - A Importância do Nitrogênio

O nitrogênio é um dos elementos mais abundante nas plantas como constituinte essencial de aminoácidos, proteínas, bases nitrogenadas, ácidos nucléicos, hormônios e clorofila, entre outras moléculas. No solo o nitrogênio disponível para as plantas pode estar na forma de nitrato, amônia, aminoácidos, peptídios e purinas, sendo encontrados transportadores de membranas para todas estas formas (WILLIANS & MILLER, 2001).

Embora presente na atmosfera em aproximadamente 78% da constituição gasosa, é encontrado na forma molecular (N2), que não é absorvível pelas plantas, já que a maioria das plantas obtém o nitrogênio do solo sob a forma de íon nitrato (NO3-) e amônio (NH4+) (FERNADES & SOUZA, 2006).

A forma mais comumente absorvida é a de nitrato, já que o nitrogênio amoniacal liberado pela decomposição da matéria orgânica do solo é rapidamente convertido a nitrato por bactérias quimiossintetizantes. Sendo que sob condições de pH muito ácido, altas concentrações de fenóis ou anoxia, a amônia não é oxidada e pode ficar acumulado no solo e algumas plantas a absorverem nesta forma.

Os átomos de nitrogênio presentes na molécula de N2 encontram-se unidos de uma maneira muito estável. Por esse motivo, para que o N2 possa ser convertido a uma forma assimilável é necessário o fornecimento de temperatura e pressão muito elevadas (fixação industrial), processo esse que consome muita energia e encarece o preço do adubo nitrogenado. Assim, a presença de um sistema enzimático apropriado (fixação biológica) realiza a conversão de uma forma mais econômica.

A fixação industrial do N2, chamada de processo de Haber-Bosch, utiliza temperaturas em torno de 200 oC e pressões em torno de 200 atm, sendo dispendiosa do ponto de vista energético (TAIZ & ZEIGER, 2004).

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No processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN), organismos procariotos são capazes de assimilar o N2 atmosférico e convertê-lo a forma assimilável (NH3). A FBN ocorre graças à enzima nitrogenase, o que do ponto de vista energético é dispendioso para o organismo que a realiza, sendo que à reação pode ocorrer à temperatura ambiente e pressão atmosférica adequada. (REIS et al., 2006).

N2 + 16 ATP + 8 e- + 8H+ ---> 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi.

(onde e- simboliza elétron e Pi simboliza o fosfato inorgânico).

O processo industrial converte cerca de 80 X 1012 g.ano-1 de nitrogênio molecular em amônia, enquanto, que a fixação por processos naturais converte cerca de 190 X 1012 g.ano-1. Deste total fixado por processos naturais, os relâmpagos são responsáveis por cerca de 8%, as reações fotoquímicas, entre óxido nítrico gasoso (NO) e o ozônio (O3), produzindo o ácido nítrico (HNO3), por cerca de 2% e a fixação biológica de nitrogênio (FBN) por bactérias ou algas azuis responsáveis por aproximadamente 90%, daí a importância em se estudar a FBN em plantas fixadoras e não fixadoras.

2.3 - Organismos Fixadores de Nitrogênio

Organismos procariontes, que possuem a enzima nitrogenase, são capazes de fixar o N2 através de um processo denominado fixação biológica de nitrogênio (FBN). Esses organismos podem ser de vida livre (Tabela 1) ou viver em associações. Dentre as bactérias autotróficas e heterotróficas, destacam-se as cianobactérias (Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema, Anabaena, Nostoc), que realizam a fotossíntese de maneira semelhante aos vegetais superiores, havendo a liberação de O2, e a Klebsiella pneumoniae, na qual foram identificados e estudados os primeiros genes nif. Tabela 1: Exemplos de organismos de vida livre fixadores de nitrogênio.

Bactérias Autotróficas - Thiobacillus ferrooxidans - Rhodospirillum rubrum

- Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema, Anabaena, Nostoc Bactérias Heterotróficas

- Clostridium pasteurianum - Klebsiella pneumoniae - Azotobacter vinelandii

Fonte: adaptado de SMITH & GALLON (1993). Já para as bactérias que formam associações com leguminosas, como os gêneros Bradyrhizobium e Rhizobium, a estimativa da FBN está em torno de 100 % do N requerido pela planta. Para as bactérias associadas às gramíneas, como os gêneros Herbaspirillum e Burkholderia, a resposta a FBN está em torno de 30 % do N requerido pela cultura dependendo das variedades utilizadas (FERREIRA et al., 2003). 2.4 - A Fixação Biológica de N2 em Gramíneas O crescente interesse no estudo da FBN na agricultura, visa minimizar o uso de fertilizantes minerais nitrogenados na produção agrícola. A utilização de adubos nitrogenados está ligada a grandes desvantagens, sendo as principais delas o alto custo dos adubos, uma vez

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que para se produzir industrialmente um quilograma de fertilizante nitrogenado, se gasta seis vezes mais energia que aquela necessária para produzir um quilograma de fósforo ou de potássio (DA SILVA et al., 1978), e problemas ambientais, como a contaminação do lençol freático por excesso na aplicação de N na forma de nitrato, principalmente para países em desenvolvimento, onde a agricultura econômica requer minimização dos investimentos para permanecer economicamente viável.

Diversas gramíneas de interesse econômico, como milho, arroz e trigo, podem estar associadas com bactérias do gênero Azospirillum, Burhholderia e Herbaspirillum. Outro exemplo importante seria a associação de bactérias do gênero Gluconacetobacter com cana-de-açúcar. Nesta associação não ocorre a formação de uma estrutura especializada para a fixação do nitrogênio (nódulos) e as bactérias podem invadir ou não o tecido da planta através de ferimentos na epiderme, pontos de emissão de raízes secundárias e estômatos, sendo distribuída para o restante da planta via vasos condutores (REIS et al., 2006). Os produtos da fotossíntese são liberados pela planta, e absorvidos pelas bactérias que estão na rizosfera ou no interior da planta. As bactérias fixam o nitrogênio e transferem o NH4+ para a planta.

Esta associação não é tão eficiente quanto a simbiose leguminosas-rizóbio e o mecanismo de liberação NH4+ da bactéria para a planta, ainda não está elucidado, já que não se sabe se a bactéria libera o N2 fixado ou se este é liberado após a morte e lise da célula bacteriana. Além do que, devido à ausência de estruturas especializadas e a ampla distribuição em diferentes partes da planta, é difícil precisar o nicho da fixação. Devido à sensibilidade da enzima nitrogenase ao oxigênio, o possível nicho deve apresentar uma baixa concentração de O2. Estas bactérias diazotróficas e endofíticas apresentam grande potencial para utilização na agricultura dado a habilidade de colonizar o interior das plantas e de se localizar em nichos protegidos do oxigênio, e assim, o potencial da enzima nitrogenase, para fixar nitrogênio pode ser mantido no nível máximo (BALDANI & DÖBEREINER, 1995). Muitas espécies de bactérias fixadoras de nitrogênio são conhecidas e têm sido isoladas de plantas cultivadas, como por exemplo arroz, milho, cana-de-açúcar e sorgo ( REIS et al. 1994; OLIVARES et al. 1996; REIS JR. et al. 2000).

No caso de arroz, diversas bactérias foram isoladas em associação com a planta, como por exemplo os gêneros Burkholderia, Herbaspirillum, Azospirillum e Pseudomonas e recentemente o gênero Sphingomonas (BALDANI, 1984 e 1996, SAMPAIO, 2004). Dentre as espécies representativas destes gêneros podemos citar a B. brasilensis, isolada de cana-de-açúcar, batata doce, mandioca e principalmente arroz (BALDANI, 1996), H. seropedicae isolada de arroz, milho, trigo e sorgo (BALDANI et al., 1986) e a espécie A. brasilense isolada de milho, trigo, arroz e sorgo (BALDANI, 1984, BALDANI et al., 1997).

Efeitos positivos da inoculação destas bactérias diazotróficas têm sido observados por diversos autores. Em experimentos de inoculação com Herbaspirillum seropedicae em solo não estéril, conduzido em condições de casa de vegetação, observou-se que este endófito pode ser introduzido no interior da planta de arroz e sorgo, pela aplicação do inoculante nas sementes antes da germinação (OLIVARES et al., 1993). Estudos de microscopia ótica e eletrônica têm mostrado que os endófitos, H. seropedicae e “B. brasilensis” são capazes de infectar e colonizar o tecido de plantas de arroz (BALDANI, 1996).

O potencial de utilização dessas bactérias é grande, já que experimentos de inoculação, conduzidos em casa de vegetação, com estirpes de Herbaspirillum seropedicae mostraram que 17 a 19% do N acumulado foi derivado da FBN enquanto que este aumento foi de 11 a 20% com “Burkholderia brasilensis” (BALDANI, et al., 2000). No campo, dependendo da variedade de arroz utilizada, o incremento na produção de grãos pode chegar a 62%, quando inoculada com uma estirpe selecionada (GUIMARÃES et al., 1998).

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A inoculação da variedade de arroz IR42, crescidas no campo, com as estirpes de Herbaspirillum seropedicae (ZAE 94) e Burkholderia brasilensis (BR11430) promoveu aumentos na produção de grãos de 38% e 16%, respectivamente em relação ao controle não inoculado (FERREIRA et al., 2003). Estas mesmas estirpes também proporcionaram aumentos de até 18% na produção de grãos da variedade IAC4440 em relação ao controle não inoculado. Estudos de inoculação em trigo com a estirpe JA04 de A. brasilense acrescido da adubação com 15 kg N.ha-1 demonstraram um aumento no N-total e produção de grãos, resultados estes, similares ao tratamento que recebeu 60 kg N.ha-1 (DIDONET et al., 1996).

A inoculação com as estirpes Sp 245 (A. brasilense) e Sp 59b (A. lipoferum) promoveu aumento no crescimento da parte aérea, raiz e ramificações radiculares de plantas de arroz (linhagens promissoras de terras altas) em condições de laboratório. As maiores respostas, tanto no comprimento da parte aérea, quanto da raiz, foram obtidas quando se utilizou Azospirillum brasilense Sp245 como inoculante (DIDONET et al., 2003).

Experimentos conduzidos em casa de vegetação com trigo, cevada e aveia, inoculados com Azospirillum sp. estirpe RAM-7, mostraram que a inoculação aumentou a produtividade, porém, estas respostas variam entre as culturas avaliadas. Para o trigo, os aumentos significativos foram obtidos quando a inoculação foi associada a 100% do nitrogênio recomendado, já no tratamento que recebeu somente inoculação este aumento foi de 7,4%, embora não significativo. Na cevada, a presença do inoculante foi capaz de suprir 20% da adubação recomendada de nitrogênio. Para a aveia, a inoculação com Azospirillum sp. RAM-7 não proporcionou aumento significativo na produtividade. Em relação ao teor de nitrogênio total dos grãos, para as três culturas, não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos avaliados (DALLA SANTA et al., 2004a). Em ensaios de inoculação de sementes de café (Coffea arábica), cv. Catuaí vermelho IAC 144, observou-se que as mudas inoculadas com A.brasilense, estirpe Cd, apresentavam valores significativamente maiores de altura, peso de matéria seca de folhas, de caule + ramos e de raízes, quando comparadas às mudas não inoculadas (RICCI et al., 2003).

Já na cultura do milho, experimentos com o inoculante “Graminante” a base de Azospirillum spp., os tratamentos com inoculação e aplicação de adubação nitrogenada obtiveram produção de 6404 kg ha-1, no tratamento sem inoculação, a produção foi de 5500 kg.ha-1 (CAVALLET et al., 2000). Estes autores concluíram que dependendo da disponibilidade de nitrogênio a inoculação das sementes aumentou a produção em 30%.

Resultados semelhantess foram encontrados por DALLA SANTA et al. (2004b) em experimentos de inoculação em milho em condições de campo, por dois anos consecutivos, com Azospirillum sp estirpes RAM-7 e RAM-5. Esses autores observaram que com o uso dessas estirpes foi capaz de reduzir em 40% a quantidade de fertilização nitrogenada recomendada em cada experimento.

Apesar destes efe itos positivos relatados e do Brasil ser um país referência em FBN em plantas leguminosas e não leguminosas, além de ter aparatos tecnológicos e mão-de-obra qualificada, ainda não existe no mercado um inoculante comercial para gramíneas.

2.5 - Reinoculação de Bactérias Diazotróficas

No Brasil são poucos os resultados sobre o efeito da reinoculação de diversas culturas. Por exemplo, mesmo no caso da soja, os efeitos da reinoculação ainda são bastante controversos.

No caso da soja, sobre condições de uma população nativa muito eficiente, foram observadas respostas a reinoculação em solos do cerrado (VARGAS et al.,1992). No estado do

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Paraná foram verificados incrementos de 10 % na produtividade, além de que a manutenção dos teores de N no solo beneficiaram a nutrição da cultura seguinte (NISHI et al., 1996).

Incrementos significativos na produção de grãos foram observados na cultura de feijão, em solos do cerrado, no segundo ano de cultivo, utilizando sementes reinoculadas (HUNGRIA et al., 2000). Entretanto, Campos (1999), trabalhando com soja em plantio direto, observou que não houve efeito da reinoculação nos experimentos conduzidos cinco anos após a primeira inoculação. Segundo o autor, a falta de reposta à reinoculação deve-se ao estabelecimento da população de rizóbio no solo. Resultados semelhantes foram encontrados por CAMPOS & GNATTA (2006) trabalhando com a reinoculação de diferentes formulações de inoculantes comerciais em soja cultivada por plantio direto de 8 a 12 anos. Estes autores também não observaram respostas a reinoculação em três safras consecutivas nos parâmetros estudados

Resultados obtidos nos Estados Unidos demonstraram que populações de rizóbio com 20 a 50 células/g de solo eliminam a resposta à inoculação, desde que essas bactérias sejam eficientes (THIES et al., 1991), nessas condições, mesmo quando inoculantes eficientes são utilizados, muitas vezes é difícil detectar resposta à inoculação.

Deste modo, é importante a avaliação do efeito da reinoculação de bactérias diazotróficas que se mostraram eficientes em promover a FBN em culturas como o arroz, além de que a RELARE (Rede de Laboratórios para a Recomendação de Estirpes) determina no de recomendação de estirpes a serem utilizadas em inoculantes comerciais, que as mesmas sejam testadas em ciclos consecutivos da cultura. 2.6 - Produção e Preparo de Inoculantes

O inoculante é o conjunto formado por um veículo de inoculação contendo um ou mais microrganismos. Este veículo deve ser capaz de manter um maior número de células viáveis por um determinado tempo de armazenamento (lei n.º 86955 de 18 de fevereiro de 1982), além de facilitar a colonização das plantas após a inoculação das sementes. Além disto, devem desempenhar as funções previstas como por exemplo, fixar nitrogênio atmosférico ou atuar como bactérias promotoras de crescimento.

Os inoculantes mais comuns no mercado são: inoculante líquido que utiliza como veículo de inoculação os meios líquidos que contenham um grande número de células, que possam sobreviver por um longo período, regule a pressão osmótica e proteja a integridade da membrana celular (RONCHI & BALATTI, 1996); e o inoculante turfoso: que utiliza como veículo de inoculação a turfa em pó ou granulada, sendo mais comum a turfa em pó, que apresenta um alto teor de matéria orgânica, podendo preservar um elevado número de células por um longo período.

A Argentina lançou um produto denominado GraminanteTM, produzido pela Empresa Laboratórios Alquimia S.A., a base de pó de carbonato de cálcio, contendo uma mistura de estirpes de Azospirillum spp., para ser utilizado principalmente na cultura do milho. Os fabricantes asseguram que este produto pode aumentar a produção de grãos em cerca de 20%. Entretanto, nenhum desses inoculantes introduzidos no mercado mundial apresentaram comprovada eficiência quando testados no Brasil. (CAMPOS et al., 1999 e 2000)

Outros inoculantes comerciais contendo A. brasilense também foram lançados no mercado mundial. No Estados Unidos foi desenvolvido um produto com o nome de Azo-GreenTM. Na Itália, Alemanha e Bélgica foi desenvolvido um produto contendo uma mistura de A. brasilense (estirpe Cd) e A. lipoferum (estirpe Br17), o nome comercial do produto é Zea-NitTM. Na França foi lançado outro produto a base de Azospirillum contendo a estirpe CRT1; este produto utilizado em experimento com milho, no nordeste de Togo, na África, promoveu o aumento de 100% na produção de grãos (FAGES & MULARD, 1988). No México foi desenvolvido um fertilizante para milho denominado “Fertilizante para Milho”,

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que tem sido usado com sucesso visto a sua aplicação em 5.000 ha no ano de 1993 (OKON & LABANDERA-GONZALEZ, 1994).

A qualidade do inoculante está condicionada ao tipo de veículo, umidade, aeração e pelas condições ambientais a que este é submetido até a sua utilização (ARAÚJO, 1993). As condições ambientais influenciam diretamente a sobrevivência do microrganismo usado, o que pode ser explicado pelas variações observadas no número de bactérias. A precipitação pluviométrica é um desses fatores que interferem na população, pois em épocas de baixa precipitação o número de bactérias encontradas foi menor que em condição de alta precipitação (REIS JR et al., 2000).

A qualidade do inoculante também pode ser avaliada através da determinação do número de células viáveis e pelo teor de elementos tóxicos como por exemplo cloro e sódio, presentes nos veículos turfosos utilizados.

No Brasil, por lei regulamentada, n.º 86955 de 18 de fevereiro de 1982, foi oficializado o controle de qualidade dos inoculantes comerciais, indicando especificações, garantias e tolerâncias para os inoculantes produzidos. Para os inoculantes que contenham microrganismos fixadores de nitrogênio, estes deverão apresentar concentração mínima de 107/108 células viáveis por grama do produto no momento do uso, entretanto, a RELARE (2004), alterou este número para 109 células por grama do produto. Além disso, o veículo utilizado para produção do inoculante pode também afetar a sobrevivência das bactérias diazotróficas após a inoculação das sementes (KREMER & PETERSON, 1982).

Estudos de sobrevivência de estirpes ZAE 94 de Herbaspirillum seropedicae e M130 de Burkholderia brasilensis inoculadas em turfa nacional e armazenadas em geladeira apresentaram uma população em torno de 108 células . g-1 de inoculante em até 110 dias de armazenamento (FERREIRA et al., 2003).

No Brasil, o uso desses biofertilizantes teve início na década de 50 e somente no ano de 1956 se instalou no país a primeira indústria brasileira de inoculantes. A produção brasileira de biofertilizantes é de cerca de 20 milhões de doses/ano, entre os inoculantes do tipo líquido e turfoso. Apesar desta produção é necessária a importação de mais 13 milhões de doses para atender a demanda interna, o que torna o Brasil um mercado interessante para as multinacionais do ramo. Do total de doses de inoculantes produzidos para atender a demanda brasileira cerca de 98,83 % são consumidas na cultura da soja e 1,12% no feijão (http://www.agrolink.com.br/noticias/Noticialista.aspx).

Embora o país seja referência mundial em fixação biológica de nitrogênio (FBN) em plantas não leguminosas como por exemplo o arroz, trigo, milho e cana-de-açúcar e ser o responsável pela identificação de diversas bactérias diazotróficas dos gêneros Herbaspirillum, Azospirillum, Glucanacetobacter, Burkholderia, ainda não existe no mercado nacional um biofertilizante comercial destinado a estas culturas em contraste aos países como Argentina, México e EUA que já comercializam produtos com essas bactérias.

Uma das razões pela inexistência de produto no mercado brasileiro deve-se a baixa reproducibilidade na resposta das plantas à inoculação em contraste ao observado para a cultura da soja. Entretanto, destaca-se lembrar que diversos autores observaram uma economia de até 50 kg de N. ha-1, em algumas plantas não leguminosas (BALDANI et al., 2000; FERREIRA et al., 2003; FERREIRA, 2004; GUIMARÃES et al., 2007). Se considerarmos a área plantada com as quatro culturas citadas acima (arroz, trigo, milho e cana-de-açúcar), pode-se projetar que a diminuição com a aplicação de N no Brasil seria em torno de bilhões de reais ao ano. Além de benefícios indiretos como a geração de empregos na indústria de inoculantes e na agricultura, ainda ter-se-ia os benefícios diretos ao meio ambiente. Portanto, o uso de bactérias diazotróficas como biofertilizantes é uma estratégia viável e deve ser adotada tanto em culturas de plantas leguminosas como em não leguminosas.

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2.7 - Fatores que Afetam a Sobrevivência de Microrganismos Diazotróficos

Diversos fatores podem afetar a sobrevivência e o efeito dessas bactérias sobre as plantas após a inoculação das sementes e plantio. Dentre esses fatores pode-se citar o veículo de inoculação, que está diretamente relacionado à manutenção da umidade e o pH (RELARE, 2004).

A produção em larga escala de inoculantes geralmente se baseia em duas etapas: o crescimento de microrganismo em cultura líquida e o seu uso para impregnação da turfa. A cultura é multiplicada em grande quantidade de meio líquido que contenha um alto número de células/ml. O sucesso deste método depende da adição de um número suficiente de microrganismos para estabelecer uma grande população inicial e uso de turfas e condições de armazenamento que permita a multiplicação, e mantenha a viabilidade. Outro fator constitutivo de sucesso do método depende da esterilização e da exclusão subseqüente de contaminantes.

Dentre os principais fatores que afetam a sobrevivência da bactéria na turfa, estão a temperatura de armazenamento, entre 4º e 26º C, que afeta a taxa de crescimento mas não a sobrevivência do microrganismo, principalmente do rizóbio, desde que a umidade não seja limitante (ROUGHLEY, 1968).

Teores de umidade entre 30% e 40% restringiram o número de células das estirpes de rizóbio SU47 e CB756, e valores de 30% de umidade restringiram o número de células da estirpe de rizóbio TA1 após uma semana. Teores de umidade de até 60% favoreceram a sobrevivência das estirpes SU47, CB756 e TA1 até 12 semanas (ROUGHLEY, 1968).

Pode ocorrer perda de água no inoculante, devido à permeabilidade dos sacos de polietileno usados como embalagem. FENG et al., 2002 observaram que o teor de umidade da turfa decresceu de 52%, na fase inicial, para 49% após 85 dias a 30º C, o que foi atribuída às trocas gasosas dos sacos de polietileno usados como embalagem. Os sacos de polietileno usados devem ser capazes de permitir a troca de gases e reter umidade satisfatória para a sobrevivência dos microrganismos. FENG et al., 2002 em trabalho com rizóbio verificaram que a limitação de nutrientes e a baixa concentração de O2 na turfa, são alguns dos fatores responsáveis na indução de mudança na morfologia destas bactérias.

Elementos como Na+ e Cl- podem afetar a sobrevivência de rizóbios na turfa, dependendo da concentração e da fonte do elemento. Estudos feitos com a interação desses elementos com culturas de Rhizobium trifolli estirpe TA1, e Rhizobium meliloti estirpe SU47 mostraram que, quando o sódio foi adicionado na forma de Na2 HPO4, a taxa de crescimento do rizóbio foi afetada em cultura rica. Entretanto, esse crescimento, na turfa, com a mesma fonte, não foi afetado. Já a adição de CaCl2.H2O foi mais tóxica que a de NaCl na turfa e em meio de cultura rico (STEIBORN et al., 1975).

2.8 – Importância da Técnica de DGGE no Estudo da Diversidade de Bactérias Diazotróficas

Bactérias diazotróficas têm a habilidade de colonizar o espaço inter celular das plantas de arroz, acessando o seu interior através de fissuras provocadas pela emissão de raízes laterais, injúrias mecânicas e por estômatos (SILVA, 2001). A contribuição destas bactérias não está limitada a FBN, já que trabalhos na literatura demonstram a capacidade de produção de hormônios vegetais, como auxinas, citocininas e giberelinas (MELO, 1998), além de contribuir para a defesa física da planta contra agentes patogênicos, ocupando espaços dentro da planta que poderiam vir a ser nichos para estes patógenos vegetais.

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Embora diversas bactérias diazotróficas tenham sido isoladas de arroz, milho, cana de açúcar e sorgo (como os gêneros Azospirillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Gluconacetobacter e Sphingomonas), as técnicas de cultivo em meio de cultura, tradicionalmente utilizadas, no isolamento destas bactérias não são eficientes, já que apenas 10 % da população total destas bactérias pode ser cultivada (COWAN, 2000). Isto significa, que um grande número de bactérias, com grande potencial de utilização na agricultura, pode ainda não ter sido isolada. Além disso, algumas estirpes poderiam se encontrar em estado não cultivável no ambiente sendo então excluídas das análises (ROSADO, 2000). O uso de técnicas de biologia molecular, baseadas no uso da região 16S RNA, para o isolamento e a caracterização da diversidade de bactérias diazotróficas tem permitido um grande avanço nesta aérea. KUKLINSKY-SOBRAL et al. (2005) trabalhando com a diversidade de bactérias, através da técnica de DGGE e cultivo em meio de cultura, presentes no interior de tecidos de plantas de soja, cultivadas com e sem a aplicação de glifosato, verificaram diferenças nos gêneros isolados pelas duas técnicas. O que pode ser explicado em função das fontes de nutrientes utilizados pelo meio de cultura, e pelo fato de que na técnica de DGGE pode-se utilizar o DNA total extraído diretamente das plantas, não beneficiando grupos específicos de microrganismos. Através do uso da técnica de DGGE é possível analisar a diversidade de grupos funcionais, ou seja, de organismos que estão envolvidos em determinados processos, como por exemplo, microrganismos fixadores de nitrogênio. Para isso é necessário o uso de iniciadores baseados em genes responsáveis pelo processo de FBN.

O DGGE é uma técnica de eletroforese que utiliza géis de poliacrilamida com gradiente desnaturante. O uso de gradientes desnaturantes permite a separação de fragmentos de DNA de mesmo tamanho, mas com seqüências de bases nucleotídicas diferentes. Entretanto, na utilização desta técnica é necessário o uso de iniciadores que possuam uma seqüência de nucleotídeos rica em G+C (grampo G-C), cujo objetivo é impedir a desnaturação total da dupla fita do DNA na eletroforese (MUYZER et al., 1993). Os fragmentos amplificados separam-se de acordo com a sua composição nucleotídica durante a eletroforese, portanto, as duplas fitas de DNA que contenham mais GC exigem uma concentração de desnaturante maior para que ocorra a sua desnaturação. Após a desnaturação total a velocidade de migração do DNA no gel é extremamente reduzida e ocorre a separação dos outros fragmentos que apresentam composição nucleotídica diferente (MUYZER & SMALLA 1998).

A vantagem da técnica de DGGE está no fato de normalmente serem utilizados os genes ribossomais (16S em bactérias e 18S para fungos) como DNA alvo, para os quais existem amplos bancos de dados disponíveis, o que possibilita a análise de homologia dos fragmentos isolados (MUYZER & SMALLA 1998). Além do uso destes inicadores, pode-se utilizar iniciadores específicos, com o gene nif H, capazes de caracterizar um determinado gênero ou grupo microbiano. O uso desses iniciadores permite que microrganismos com populações reduzidas possam ser avaliados com maior sensibilidade em relação à população microbiana total. As principais desvantagens são a demandada para a otimização das condições do gradiente no gel, o uso de fragmentos de apenas 500 pb que limita as informações da seqüência, além da necessidade de utilização do grampo de GC (RANJARD et al., 2000).

Esta técnica tem sido utilizada em diferentes estudos de diversidade microbiana como, por exemplo, efeito dos herbicidas sobre a biomassa microbiana do solo (ZILLI, 2004), impacto de metais pesados sobre a diversidade de rizobactérias (DELL’AMICO et al., 2005), efeito de práticas agrícolas sobre a comunidade microbiana do solo (WAKELIN et al., 2007), efeito de pesticidas (EL FANTROUSSI et al., 1999), resíduos de petróleo (DUARTE et al., 2001), e o cultivo de plantas geneticamente modificadas (HEUER et al., 2002).

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A demanda para a utilização de bactérias diazotróficas, em diferentes culturas não leguminosas, cresceu muito nos últimos anos, e desse modo, o conhecimento de bactérias diazotróficas eficientes e capazes de colonizar culturas de importância econômica, como o arroz, que é altamente dependente de nitrogênio de fertilizantes minerais, é um grande desafio para a sustentabilidade dessas culturas.

O uso de técnicas de biologia molecular no estudo da diversidade de bactérias diazotróficas é importante para caracterizar e identificar gêneros, espécies ou até mesmo estirpes que tenham potencial de utilização na agricultura, para o suprimento de nitrogênio, produção de hormônios e supressão de patógenos, além de dar uma contribuição importante do efeito da inoculação sobre a comunidade de bactérias presentes nas plantas.

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3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1- Métodos Gerais Utilizados nos Experimentos 3.1.1- Caracterização do material murfoso utilizado e condições de multiplicação da bactéria.

A análise química do veículo turfoso utilizado mostrou que o substrato apresenta as seguintes características: pH em H2O de 3,4, teor de Al 8,5 (cmolc/dm3), Ca 7,1 (cmolc/dm3), Mg 6,9 (cmolc/dm3), P 22 (mg/dm3), K 47 (mg/dm3) e Matéria Orgânica (MO) de 72 (g . kg-1).

A estirpe de Herbaspirillum seropedicae ZAE 94 (depositada na coleção de culturas de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia com o código BR 11417) previamente selecionada por BALDANI (1996), foi multiplicada em tubos de ensaio contendo meio Dygs, por 24 horas a 30º C sob agitação a 100 rpm, em seguida riscada em placas com meio semi-específico, NFb 3x (DOBEREINER et al., 1995), para verificar a pureza da cultura crescida. Após a verificação da pureza, a estirpe foi multiplicada em meio Dygs e o número de células viáveis foi determinado pelo método do Número Mais Provável (NMP) no meio JNFb (DOBEREINER et al., 1995), e utilizada no preparo dos inoculantes. O número foi de 1,4 x 109 células viáveis/mL

3.1.2- Preparo da turfa com diferentes pH Para avaliar a sobrevivência das bactérias em diferentes pH, a turfa foi neutralizada até atingir os pH 6,0 e 7,0. Para a neutralização foram adicionados doses crescentes de CaCO3 nas amostras das turfas, e colocada para incubar por até 15 dias segundo metodologia utilizada por FERREIRA (2004). A determinação do pH em água foi feita durante todo o período para verificar se houve variação do mesmo. Após a etapa de neutralização e esterilização (autoclave), os sacos contendo as turfas foram utilizados no preparo dos inoculantes. Para avaliação da sobrevivência nos dois pH, foi utilizada a umidade inicial de 42 % em base seca, que é o mesmo utilizado nos inoculantes rizobianos preparados com o veículo turfoso empregado nos ensaios desta tese. 3.1.3- Preparo dos inoculantes com diferentes teores de umidade

Os inoculantes foram preparados até atingir as umidades de 20, 42, 60 e 80%. Para isso, adiciounou-se a mesma quantidade de cultura utilizada no teor de umidade de 42% em todos os demais tratamentos. Para os tratamentos com teores de umidade de 60 e 80%, o volume de cultura foi completado com água destilada estéril, para atingir a umidade desejada. Para a umidade de 20%, o volume de cultura foi centrifugado a 6000 x g e o pelete ressuspendido no volume desejado.

Os teores de umidade utilizados (U) foram determinados por diferença entre a massa

da amostra úmida (MAU) e a massa da amostra seca (MAS):

U (%)= (MAU-MAS)*100/MAS.

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A suspensão bacteriana contendo 1,4 x 109 células/mL foi inoculada com auxílio de uma seringa esterilizada, em sacos de polipropileno contendo turfa (previamente seca, moída, esterilizada e pH ajustado), até atingir a umidade inicial desejada. Após a inoculação, a turfa contendo as bactérias foi mantida por 24 horas a 30°C e em seguida armazenada em geladeira a 4 °C.

3.1.4- Sobrevivência das bactérias nas turfas

Avaliação da sobrevivência das bactérias foi feita pelo método do NMP, utilizando o meio semi-seletivo, JNFb para a estirpe ZAE 94. Inicialmente as contagens foram feitas aos 1, 15 e 30 dias, e subseqüentemente a cada 30 dias. Os inoculantes foram armazenados em geladeira por até 180 dias. Foram utilizados três repetições dos inoculantes preparados para cada tratamento. Após a determinação do NMP de bactérias presentes as amostras foram descartadas. 3.1.5- Caracterização das embalagens utilizadas As embalagens polipropileno utilizadas nos ensaios de sobrevivência apresentavam as seguintes especificações:

- Embalagem 1: Mais porosa e com as dimensões (200mm de comprimento, 120mm de largura e 0,05mm de espessura);

- Embalagem 2: Menos porosa e com as dimensões (200mm de comprimento, 120mm de largura e 0,08mm).

3.2- Inoculação da Estirpe ZAE 94 de H. seropedicae em Vasos

Foram utilizados os primeiros 20 cm do horizonte A de um Planossolo Série Ecologia, oriundo do Campo Experimental da Embrapa Agrobiologia. Não foi ajustado o pH, pois este solo já havia sido submetida à calagem anterior à coleta. A partir da análise química do solo (Tabela 2), foram feitas adubações, com 20 kg de P2O5 e 50 kg de K2O de acordo com o Manual de Adubação e Calagem para o Rio de Janeiro para a cultura de arroz (ALMEIDA et al., 1988). Como fonte de micronutrientes foi aplicado FTE na quantidade de 0,3 g . kg-1 de solo.

Tabela 2: Análise química de amostras de terra utilizada no plantio das variedades de arroz

no experimento de vasos. pH em

água Al Ca Mg P K

(cmolc/dm3) (mg/dm3)

Solo 5,8 0,0 1,3 0,7 6 27 3.2.1- Sementes Foram utilizadas sementes das variedades de arroz contrastantes quanto ao potencial de fixação. IR42 (Alta contribuição para FBN) (OLIVEIRA et al. 1994; KUNDU & LADHA, 1995; WU et al., 1995) e IAC4440 (baixa contribuição para FBN) (OLIVEIRA, 1994) cedidas pela Embrapa Arroz e Feijão e multiplicadas no Campo Experimental da Embrapa Agrobiologia em Seropédica, RJ, na safra de 2004/2005.

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3.2.2- Plantio, tratamentos e delineamento experimental

O plantio foi feito com as sementes das variedades IR42 e IAC4440, peletizadas com o inoculante turfoso (concentração de 250g de inoculante . 20kg-1 de semente (FERREIRA, 2004) preparado com teor de umidade de 42% e pH 7,0, em vasos com capacidade para 6 kg, contendo 4 kg de solo não estéril. O plantio foi feito com 6 sementes por vaso, sendo feito desbaste, entre 20 e 30 dias após plantio (DAP), deixando 4 plantas/vaso. Os vasos foram inundados, quando as plântulas atingiram em média 15 cm de altura, e a lâmina d’água de 2 cm foi mantida sempre na mesma altura durante a realização do experimento. O experimento foi conduzido ao ar livre com delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições, em arranjo fatorial 2 x 2, com e sem inoculação da estirpe ZAE 94, e com e sem aplicação da dose de 50kg de N . ha-1, totalizando 4 tratamentos. A separação das médias foi feita utilizando o teste estatístico LSD a 5% de probabilidade no programa Sisvar (FERREIRA, 2000). As coletas foram feitas durante o período vegetativo (60 DAP), onde foi analisado o acúmulo de massa seca da parte aérea e o NMP da população de bactérias presentes na parte aérea e raiz das plantas de arroz e ao final do ciclo da cultura foi avaliado a produção de grãos. 3.3- Inoculação e Reinoculação da Estirpe ZAE94 de H. seropedicae em Condições de Campo. As variedades de arroz IR42 e IAC4440 foram plantadas no campo experimental da Embrapa Agrobiologia, em um Argissolo Vermelho Amarelo. Após a análise química do solo (Tabela 3), foi feita a adubação e calagem, segundo recomendações do Manual de Adubação e Calagem para o Rio de Janeiro para a cultura de arroz (ALMEIDA et al., 1988). Como fonte de micronutrientes foi aplicado FTE na quantidade de 14 kg/ ha-1. Tabela 3: Análise química das amostras de terra do horizonte A do Argisolo Vermelho

Amarelo utilizado nos experimentos com a cultura do arroz. pH em

água Al Ca Mg P K

(cmolc/dm3) (mg/dm3)

Planossolo 5,0 0,3 2,3 1,5 14 84 3.3.1- Plantio, tratamentos e delineamento experimental do experimento de inoculação (Período de 2005-2006).

O plantio foi feito com sementes inoculadas, em parcelas com seis linhas, espaçadas 30 cm, e na densidade média de 100 sementes por metro linear. As parcelas foram distribuídas em 6 blocos ao acaso. Os tratamentos utilizados foram: a inoculação ou não da estirpe ZAE 94, as variedades de arroz IAC4440 e IR42 e 3 doses de N mineral na forma de sulfato de amônio ( 20, 50 e 100 Kg de N.ha-1) (Figura 1). As doses de nitrogênio (50 e 100 kg de N . ha-1) foram parceladas com aplicações aos 40 dias após o plantio, no início do florescimento e no enchimento dos grãos.

A separação das médias foi feita utilizando o teste estatístico LSD a 5% de probabilidade além do uso da análise de regressão para descrever a resposta das plantas aos diferentes níveis de adubação e inoculação. Para realização do teste estatístico foi utilizado o programa Sisvar.

Foram realizadas três coletas, no período vegetativo, florescimento e maturação de grãos de arroz. Os parâmetros agronômicos analisados foram à matéria seca da parte aérea,

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%N (TEDESCO, 1983), nitrogênio total da parte aérea e dos grãos, produção de grãos, proteína bruta dos grãos e a contagem do número de bactérias diazotróficas presentes nas diferentes partes da planta. O conteúdo de proteína bruta dos grãos foi calculado pelo N-Kjeldahl multiplicado pelo fator de correção de 5,95. Este fator é baseado no conteúdo de nitrogênio (16,8 %) da proteína do arroz, a glutelina (JULIANO, 1985).

No florescimento também foi feita a análise da diversidade das bactérias diazotróficas através da técnica de DGGE conforme descrita no item 3.3.3. As parcelas foram mantidas sob irrigação constante durante todo o ciclo da cultura.

BLOCO I

S 20 C C (20)

50 100 C (50) C (100)

Figura 1: Desenho experimental dos tratamentos do primeiro ano para uma variedade em um bloco. Legenda: S- Sem inoculação, C- com inoculação e 20, 50 e 100 refere-se às doses de Nitrogênio em kg . ha-1.

3.3.2- Plantio, tratamentos e delineamento estatístico do experimento de reinoculação (Período 2006-2007). No segundo ano, a parte aérea das plantas de arroz remanescentes, do ano anterior, foi retirada e o restante das plantas foi incorporado ao solo. Após a análise química das amostras de terra do horizonte A de um Argissolo Vermelho Amarelo (Tabela 4), foi feita a correção de acordo com a necessidade da cultura. Tabela 4: Análise química das amostras de terra do horizonte A do Argissolo Vermelho

Amarelo utilizado nos experimentos com a cultura do arroz. pH em

água Al Ca Mg P K

(cmolc/dm3) (mg/dm3)

Argissolo 5,0 0,2 2,1 1,1 4,7 70,4

O experimento foi conduzido em blocos ao acaso com seis repetições. Os tratamentos consistiram nos mesmos utilizados no ano anterior, mais a reinoculação ou não das parcelas, acrescentado-se dois tratamentos aos do ano anterior, totalizando 10 tratamentos para cada variedade. Alguns tratamentos receberam inoculação no primeiro ano e não no segundo, e o vice-verso (

Figura 2). As variáveis avaliadas foram semelhantes ao experimento anterior. A separação das médias foi feita utilizando o teste estatístico Scott-Knott a 10 % de probabilidade. O uso deste teste neste experimento se justifica devido à facilidade em separar ensaios com números de tratamentos maiores. Para realização do teste foi utilizado o programa Sisvar (FERREIRA, 2000).

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BLOCO I

SC 20 100 CC CC (50)

SS 50 CS CC (20) CC (100)

Figura 2: Desenho experimental dos tratamentos do experimento de reinoculação (segundo

ano) para uma variedade em um bloco. Legenda: S- Sem inoculação, C- com inoculação, 0, 20, 50 e 100 refere-se doses de N. A primeira e segunda letra, referem-se ao primeiro e segundo ano respectivamente. Exemplo: SC- Primeiro ano sem inoculação (S) e o segundo inoculado (C).

3.3.3- Análise da diversidade de bactérias presentes nas plantas de arroz inoculadas e reinoculadas com a estirpe de H. seropedicae (estirpe ZAE 94) em condições de campo.

Anteriormente ao estudo da diversidade de bactérias presentes no colmo de plantas de arroz inoculadas, foi feito o sequenciamento e alinhamento da estirpe ZAE 94, com outras bactérias do gênero H. seropedicae. O objetivo desta etapa foi caracterizar e identificar corretamente a bactéria alvo, além de verificar a possibilidade de se obter um iniciador estirpe específico utilizando a região universal do 16S rRNA, de modo a facilitar o monitoramento desta estirpe nas plantas inoculadas em campo. A comparação das seqüências geradas foi feita através do programa BLASTn (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn, ALTSCHUL, et al., 1997). O alinhamento das seqüências de DNA foi feita utilizando o programa Clustal_W (THOMPSON et al., 1994), seguida da construção da árvore filogenética, utilizando o algoritmo neighbour-joining no programa MEGA (www.megasoftware.net, KUMAR et al., 2004).

Na análise da diversidade de bactérias das plantas foi utilizado o colmo das plantas de arroz, já que de acordo com BARRAQUIO et al. (1997) este seria o local onde está presente o maior número de bactérias diazotróficas. Para estudar a diversidade de bactérias diazotróficas, presentes nos colmos das plantas de arroz, foi utilizada a técnica de DDGE (Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante) ( MYERS et al, 1987). No estudo da diversidade de bactérias através da técnica de DGGE é necessário utilizar um padrão de bandas de bactérias diazotróficas conhecidas. Este padrão foi inicalmente definido por BOA SORTE et al. (2006). As etapas utilizadas no estudo da diversidade das plantas de arroz inoculadas são descritas a seguir.

a) Extração do DNA total das plantas arroz Neste procedimento foram utilizadas seis plantas por tratamento. As plantas foram primeiramente lavadas em água corrente e depois em água destilada por duas vezes. Após a lavagem, foram retirados discos de 1 cm de comprimento na base do colmo das plantas. Em seguida este material foi macerado com nitrogênio líquido e foram retiradas três amostras de aproximadamente 200 mg cada. As amostras obtidas foram utilizadas na extração do DNA total segundo a metodologia descrita por DOYLE & DOYLE (1987).

Ao final da extração, as três amostras foram misturadas, obtendo-se então 1 amostra composta por tratamento. O produto obtido da extração de DNA total foi separado por eletroforese em gel de agarose 1,0 % em TAE 1X, a 100V por 1h, e após corado por 20 segundos em brometo de etídeo, descorado por 30 minutos, visualizado sob luz ultravioleta e fotografado.

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b) Amplificação da região 16S rRNA utilizando iniciadores específicos

Cerca de 80 ng do DNA total extraído das plantas de arroz, foi utilizado na amplificação da região de 16S rRNA. Foi utilizado uma desnaturação a 95°C por 3 min, 30 ciclos de 94°C por 20 seg., 53°C por 40 seg. e 72°C por 40 seg. e um a extensão final a 72°C por 7 min. Foram utilizados os iniciadores específicos 799f (CHELIUS & TRIPLETT, 2001) e 1492r (OSBORNE et al., 2005) para avaliar a comunidade microbiana total. A reação continha 5 µl de tampão(10x), 2,5 µl de MgCl(25mM), 1 µl de dNTP(2,5mM), 1 µl de BSA(3mg/mL), 0,5 µl de Taq-polimerase(500U), 0,7 µl do iniciador 799f e 1 µl do iniciador 1492r (25mM), para um volume de 50 µl por reação. O uso destes iniciadores teve como objetivo eliminar a amplificação dos plastídeos, mitocôndrias e cloroplastos, obtidos durante o processo de extração do DNA total e que concorrem com o DNA bacteriano na reação de PCR (reação em cadeia da polimerase).

c) Amplificação com iniciadores específicos para DGGE (Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante) (MUYZER et al., 1996).

O procedimento seguido foi o descrito por MUYZER et al. (1996). Após a primeira reação de PCR do item anterior (b), aproximadamente 5 µl do produto obtido foi submetido à nova reação de PCR, contendo 5 µl de tampão(10x), 3 µl de MgCl(25mM), 4 µl de dNTP(2,5mM), 1 µl de BSA(3mg/mL), 0,6 µl de Taq-polimerase(500U) e 0,5 µl de cada iniciador (25mM), para um volume de 50 µl por reação e os iniciadores 968f e GC-1401r (HEUER & SMALLA, 1997) (Tabela 5). Ao final da reação, o material amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose (1%) a 100 V por 1h, para visaulização da qualidade do material amplificado. Em seguida o material obtido foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante (DGGE).

Tabela 5: Iniciadores utilizados nas reações de amplificação para análise por DGGE e respectivas seqüências de nucleotídeos.

Primer Sequência:

1401r CGG TGT GTA CAA

GGC CCG GGA ACG

968f CGC CCG GGG CGC

GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG TGGG GAA CGC GAA CCT TAC

d) Montagem do gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante Foi utilizado o sistema de eletroforese vertical (BioRad DCode System -Universal

Mutation Detection System) com placa de 20 X 20 cm, espaçador 1,5 mm. O material utilizado foi previamente lavado, para retirar resíduos de poliacrilamida.

Foram utilizados gradientes de desnaturação variando de 55 a 65 % (BOA SORTE et al. 2006), como desnaturante foi utilizado uréia-formamida (MYERS et al, 1987). As faixas de desnaturação utilizadas, foram obtidas a partir da mistura de duas soluções (menor (45 %) e maior concentração (75 %) de uréia- formamida) com 6% de poliacrilamida para volume

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final de 20 ml do gel de corrida. Esta mistura é obtida com o auxílio de uma bomba peristáltica com fluxo aproximado de 0,22 mL/min.

e) Aplicação das amostras

Foi aplicado uma alíquota de 30 µL do produto da amplificação com os iniciadores

GC1401r e 968f, misturado com 5 µL de corante de corrida (0,5% azul de bromofenol, 40% sacarose, 0,1 mol/L de EDTA, 5% de SDS) nos poços do gel.

f) Eletroforese em gel de gradiente de desnaturação – DGGE

O produto da amplificação da reação de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de poliacrilamida com Gradiente de Desnaturação (DGGE) por 16 horas a 120 volts, utilizando uma cuba vertical contendo tampão TAE 0,5X aquecido a 60° C. O objetivo é separar moléculas de tamanho similar, mas com seqüências diferentes, utilizando um gradiente com força crescente de desnaturação (formamida e uréia).

g) Coloração e descoloração do gel de poliacrilamida

A coloração do gel de poliacrilamida foi feita com AgNO3 segundo CRESTE et al. (2001). Em seguida, o gel foi colocado para secar por aproximadamente 24h, e após este perí