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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
GIULIANO MARCELO DRAGONE MELNIKOV
Fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo
contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte
Lorena – SP
2007
GIULIANO MARCELO DRAGONE MELNIKOV
Fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo
contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte
Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial.
Área de Concentração: Conversão de biomassa Orientador: Dr. João Batista de Almeida e Silva
Lorena – SP
2007
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
Dragone Melnikov, Giuliano Marcelo
Fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte / Giuliano Marcelo Dragone Melnikov ; orientador João Batista de Almeida e Silva. -- 2007
140 f. : fig.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de Biomassa) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, 2007
1. Fermentação contínua 2. Cerveja 3. Leveduras imobilizadas 4. Bagaço de malte 5. Processo de altas densidades 6. Reator de coluna de bolhas. I. Título.
663.4 - CDU
Giuliano Marcelo Dragone Melnikov
Fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte
Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de Biomassa
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr.
Instituição: Assinatura:
Prof. Dr.
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Prof. Dr.
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Prof. Dr.
Instituição: Assinatura:
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A mi esposa Solange, por acompañarme todos los días en este camino, brindándome todo su
amor, dulzura e compañerismo.
A mis padres, Franco y Susana, responsables por todas mis conquistas.
Al nono y a la nona, que dejaron este mundo pero permanecerán por siempre en mi memoria.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. João Batista de Almeida e Silva, pelo apoio, amizade, confiança e orientação,
constantemente dados durante a execução deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de
doutorado concedida.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelos apoios financeiros.
A todas as pessoas (colegas, funcionários e professores) da EEL/USP que contribuíram para a
realização deste trabalho, especialmente ao Padrinho (Paulinho) e ao Mateus.
Às empresas: Malteria do Vale, Corn Products Brasil, Wallerstein Industrial e Comercial,
JohnsonDiversey e Atias Química pela doação das matérias-primas.
Ao Sr. Júlio Landmann (Malteria do Vale) pelo interesse e patrocínio para participação em
eventos.
À empresa FEMSA Cerveja Brasil pelas análises de cromatografia gasosa.
Ao Dr. Durval Rodrigues Junior (DEMAR) pelas análises de microscopia eletrônica de
varredura.
RESUMO
DRAGONE, G. Fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte. 2007. 140 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007. O objetivo deste trabalho foi estudar a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo, utilizando o bagaço de malte (principal subproduto da indústria cervejeira) como suporte para a imobilização das leveduras. Os ensaios foram realizados em um reator de coluna de bolhas (5,2 l de volume de trabalho) com uma levedura cervejeira comercial Saccharomyces cerevisiae tipo lager. Durante as fermentações foram avaliados os efeitos das variáveis do processo: temperatura, concentração de extrato original e composição do mosto, nos parâmetros fermentativos e na produção de compostos voláteis relacionados com o sabor das cervejas produzidas. De acordo com os resultados, todas as variáveis estudadas influenciaram no desempenho da fermentação. O aumento da temperatura de 7 para 15ºC proporcionou um aumento no consumo de nitrogênio amino livre (FAN), nos graus aparente e real de fermentação, na velocidade de consumo de extrato e na produtividade volumétrica em etanol, a partir de mostos puro malte. O aumento na concentração de extrato original do mosto (elaborado com 100% malte ou com 74% de malte e 26% de adjunto de alto teor de maltose) na faixa de 13,4ºP a 19,6ºP favoreceu a produtividade volumétrica em etanol. No entanto, a partir dos mostos puro malte com concentração de extrato original acima de 15ºP, houve uma elevada produção de ésteres, causando um desequilíbrio na concentração dos compostos voláteis. A fermentação contínua dos mostos elaborados apenas com malte (100% malte) apresentou um melhor desempenho (maior velocidade de consumo de extrato e maior produção de etanol) do que a fermentação contínua dos mostos elaborados com malte e adjunto. Por outro lado, as cervejas elaboradas a partir de mostos com adjunto apresentaram os compostos voláteis em níveis mais próximos aos encontrados nas cervejas de mercado (produzidas pelo processo tradicional de fermentação descontínua com células livres). De uma forma geral concluiu-se que a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte, pode ser realizada com um bom desempenho à 15ºC, empregando mostos elaborados com malte e adjunto (relação adjunto:malte de 1:2,8). Além disso, a cerveja obtida nessas condições apresenta características similares às das cervejas de mercado, e o uso de adjunto em substituição parcial ao malte pode contribuir reduzindo o custo global do processo. Palavras-chave: Fermentação contínua. Cerveja. Leveduras imobilizadas. Bagaço de malte. Processo de altas densidades.
ABSTRACT
DRAGONE, G. Primary fermentation of high gravity brewing by continuous process using yeasts immobilised on spent grains. 2007. 140 f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007. The objective of this work was to study the primary fermentation of high gravity brewing by continuous process using spent grains (the main brewery by-product) as yeasts immobilisation carrier. The assays were performed in a bubble column reactor (5.2 l working volume) with a commercial brewing yeast Saccharomyces cerevisiae lager type. During the fermentations, the effects of the process variables: temperature, original extract and wort composition, were evaluated on the fermentative parameters and production of volatile compounds related with the flavour of the produced beers. According to the results, the fermentation performance was influenced by all the studied variables. The temperature increase from 7 to 15ºC proportioned an increase in the free amino nitrogen (FAN) consumption, apparent and real degrees of fermentation, extract consumption rates and ethanol volumetric productivity, from all malt worts. The ethanol volumetric productivity was favoured by the increase in the original extract of wort (produced with 100% malt or with 74% malt and 26% high maltose adjunct) in the range between 13,4ºP and 19,6ºP. Nevertheless, from all malt worts with original extract higher than 15ºP, there was an elevated esters production that caused an imbalance in the volatile compounds concentration. The continuous fermentation of worts produced with all malt (100% malt) presented a better performance (higher extract consumption rate and ethanol production) than the continuous fermentation of worts produced with malt and adjunct. On the other hand, beers elaborated from worts with malt and adjunct presented volatile compounds at more similar levels to those found in commercial beers (produced by the traditional discontinuous fermentation process with free cells). In a general form, it was concluded that primary fermentation of high gravity brewing by continuous process using immobilised yeasts on spent grains, can be carried out with a good performance at 15ºC, using worts produced with malt and adjunct (adjunct:malt ratio of 1:2.8). In addition, the beer produced under these conditions presents similar characteristics to those found in commercial beers, and the use of adjunct in a partial replacement of the malt may contribute decreasing the overall cost of the process. Keywords: Continuous fermentation. Beer. Immobilised yeasts. Spent grains. High gravity process.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Produção de álcoois superiores por leveduras (STEWART; RUSSELL, 1998). ..... 26
Figura 2. Formação de diacetilo a partir de carboidratos por leveduras (modificado de
LEWIS; YOUNG, 1995). ........................................................................................ 29
Figura 3. Métodos básicos para a imobilização de células (PILKINGTON et al., 1998). ....... 32
Figura 4. Bagaço de malte (A); Fotomicrografia de partícula. Ampliação: 45 vezes (B)........ 37
Figura 5. Caldeira de mostura utilizada durante etapa de mosturação. .................................... 55
Figura 6. Teste do iodo. (A) presença de amido, (B) ausência de amido................................. 56
Figura 7. Tina de filtração utilizada durante a etapa de filtração do mosto. ............................ 57
Figura 8. Caldeira de fervura utilizada durante a etapa de cozimento do mosto...................... 58
Figura 9. Reator “airlift” utilizado nos experimentos............................................................... 60
Figura 10. Reator de coluna de bolhas utilizado nos experimentos. ........................................ 62
Figura 11. Concentração de células livres (Xlivres) e imobilizadas (Ximob) durante a
fermentação de meio sintético em frascos Erlenmeyer. .......................................... 73
Figura 12. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas
durante a fermentação de meio sintético em frascos Erlenmeyer. Ampliação:
2000 vezes. .............................................................................................................. 74
Figura 13. Consumo de extrato e produção de etanol durante a fermentação de meio
sintético em frascos Erlenmeyer.............................................................................. 75
Figura 14. Concentração de células livres (Xlivres) e imobilizadas (Ximob) durante a
fermentação contínua em reator “airlift” empregando diferentes taxas de
diluição (D).............................................................................................................. 76
Figura 15. Concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a fermentação contínua
em reator “airlift” empregando diferentes taxas de diluição (D)............................. 78
Figura 16. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas
durante a fermentação em reator “airlift”. Ampliação: 1000 vezes. ....................... 79
Figura 17. Efeito da temperatura na concentração de extrato aparente, etanol e pH durante
a fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de
bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de
diluição: 0,05 h-1)..................................................................................................... 81
Figura 18. Efeito da temperatura na concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas
(Ximob) e totais (Xtotais) durante a fermentação contínua de mosto (100% malte)
de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e
10 ml/min de ar; taxa de diluição, D: 0,05 h-1)........................................................ 82
Figura 19. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas
durante a fermentação contínua para avaliação do efeito da temperatura em
reator de coluna de bolhas. Ampliação: 1500 vezes................................................ 84
Figura 20. Efeito da temperatura na viabilidade e concentração de células livres (Xlivres),
determinadas por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco
(g/l), durante a fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator
de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar;
taxa de diluição: 0,05 h-1). ....................................................................................... 85
Figura 21. Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na
concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a fermentação primária
para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator
de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar;
taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC). ........................................................ 94
Figura 22. Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na
concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas (Ximob) e totais (Xtotais),
durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades
por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases:
200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição, D: 0,04 h-1;
temperatura: 15ºC)................................................................................................... 96
Figura 23. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas
durante a fermentação contínua para avaliação do efeito da concentração de
extrato original de mostos puro malte em reator de coluna de bolhas.
Ampliação: 1770 vezes............................................................................................ 97
Figura 24. Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na viabilidade
e concentração de células livres (Xlivres), determinadas por contagem em
câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l), durante a fermentação
primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo
no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min
de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC). .............................................. 98
Figura 25. Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto, na
concentração de extrato aparente, etanol e pH, durante a fermentação primária
para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator
de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar;
taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC). ...................................................... 102
Figura 26. Efeito da concentração do extrato original de mostos com malte e adjunto, na
concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas (Ximob) e totais (Xtotais),
durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades
por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases:
200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição, D: 0,04 h-1;
temperatura: 15ºC)................................................................................................. 103
Figura 27. Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto, na
viabilidade e concentração de células livres (Xlivres) determinadas por contagem
em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l), durante a fermentação
primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo
no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min
de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC). ............................................ 105
Figura 28. Efeito da composição do mosto na concentração de etanol, grau aparente
(GAF) e real (GRF) de fermentação para diferentes concentrações de extrato
original. (Adj: mostos elaborados com 74% de malte e 26% de adjunto. Malte:
mostos elaborados com 100% de malte). .............................................................. 107
Figura 29. Efeito da composição do mosto nas velocidades de consumo de extrato (RS) e
de produção de etanol (RP) e nas velocidades específicas de consumo de
extrato (μS) e de produção de etanol (μP) para diferentes concentrações de
extrato original. (Adj: mostos elaborados com 74% de malte e 26% de adjunto.
Malte: mostos elaborados com 100% de malte).................................................... 108
Figura 30. Efeito da composição do mosto (□: mosto com malte e adjunto; ■: mosto puro
malte) de 15ºP na produção de compostos voláteis durante a fermentação
primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo
no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min
de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC). ............................................ 111
Figura 31. Concentração de compostos voláteis nas cervejas encontradas no mercado (▬)
e nas cervejas obtidas por processo contínuo empregando mostos com malte e
adjunto com diferentes concentrações originais de extrato (■: 14,3ºP; ○:
15,2ºP; ×: 19,6ºP). Valores estimados para uma concentração final de etanol de
4,7% v/v e apresentados como porcentagem dos valores máximos para cervejas
do mercado. ........................................................................................................... 112
Figura 32. Efeito da aeração na concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a
fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por
processo contínuo no reator de coluna de bolhas com leveduras imobilizadas
em bagaço de malte (Temperatura: 15ºC). ............................................................ 115
Figura 33. Efeito da aeração na concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas
(Ximob) e totais (Xtotais) durante a fermentação primária para produção de
cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de
bolhas (Temperatura: 15ºC)................................................................................... 117
Figura 34. Efeito da aeração na viabilidade e concentração de células livres (Xlivres)
determinadas por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco
(g/l), durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas
densidades pelo processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Temperatura:
15ºC). ..................................................................................................................... 118
Figura 35. Modelo da ficha de avaliação utilizada no teste triangular para avaliar a
diferença de sabor entre a cerveja produzida por processo contínuo no reator de
coluna de bolhas e uma cerveja nacional de mercado elaborada pelo processo
descontínuo............................................................................................................ 133
Figura 36. Características e dimensões (em mm) do reator “airlift” utilizado nos
experimentos.......................................................................................................... 134
Figura 37. Dimensões (em mm) do reator de coluna de bolhas utilizado nos experimentos. 135
Figura 38. Vista frontal (A) e lateral (B) do reator de coluna de bolhas utilizado nos
experimentos.......................................................................................................... 136
Figura 39. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte utilizado como suporte.
Ampliação: 1000 vezes.......................................................................................... 138
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Características dos principais álcoois superiores encontrados em cerveja........... 25
Tabela 2.2 - Características dos principais ésteres encontrados em cerveja. ........................... 27
Tabela 2.3 - Capacidade de imobilização da levedura S. cerevisiae em vários suportes. ........ 35
Tabela 2.4 - Capacidade máxima de retenção celular (carga celular) de acordo com o
tamanho da partícula do bagaço de malte................................................................ 38
Tabela 2.5 - Vantagens e desvantagens de reatores utilizados com sistemas de células
imobilizadas............................................................................................................. 39
Tabela 3.1 - Composição do meio utilizado para crescimento do inóculo nos ensaios em
frascos Erlenmeyer. ................................................................................................. 51
Tabela 3.2 - Composição do meio utilizado para crescimento do inóculo nos ensaios em
reator “airlift”. ......................................................................................................... 52
Tabela 4.1 - Composição química (% peso seco) do bagaço de malte na forma original
(não tratado) e após os tratamentos de deslignificação alcalina descrito por
diferentes autores..................................................................................................... 72
Tabela 4.2 - Efeito da temperatura nos parâmetros da fermentação contínua de mosto
(100% malte) de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases:
240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,05 h-1).......................... 86
Tabela 4.3 - Efeito da temperatura nos parâmetros da fermentação descontínua de mosto
(100% malte) de 15ºP, no reator de coluna de bolhas. ............................................ 87
Tabela 4.4 - Efeito da temperatura na produção de compostos voláteis durante a
fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de
bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de
diluição: 0,05 h-1)..................................................................................................... 91
Tabela 4.5 - Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte nos
parâmetros da fermentação primária para produção de cervejas de altas
densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de
gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1;
temperatura: 15ºC)................................................................................................... 95
Tabela 4.6 - Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na produção
de compostos voláteis durante a fermentação primária para produção de
cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de
bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de
diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC). .................................................................... 99
Tabela 4.7 - Concentração de compostos voláteis nas cervejas encontradas no mercado e
nas cervejas obtidas por processo contínuo empregando mostos puro malte com
diferentes concentrações originais de extrato (valores estimados para uma
concentração final de etanol de 4,7% v/v)............................................................. 101
Tabela 4.8 - Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto nos
parâmetros da fermentação primária para produção de cervejas de altas
densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de
gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1;
temperatura: 15ºC)................................................................................................. 106
Tabela 4.9 – Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto na
produção de compostos voláteis durante a fermentação primária de cervejas de
altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de
gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1;
temperatura: 15ºC)................................................................................................. 109
Tabela 4.10 - Respostas obtidas no teste triangular para avaliar a diferença de sabor entre
a cerveja produzida por processo contínuo no reator de coluna de bolhas e uma
cerveja nacional de mercado elaborada pelo processo descontínuo...................... 120
Tabela A.1 - Especificações físico-químicas do adjunto com alto teor de maltose MOR-
REX® 1557 ............................................................................................................ 137
Tabela A.2 - Composição aproximada em açúcares do adjunto com alto teor de maltose
MOR-REX® 1557.................................................................................................. 137
LISTA DE SIGLAS
ASBC American Society of Brewing Chemists
BU Bitterness Units
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DEAE Dietilaminoetil
EBC European Brewery Convention
FAN Free Amino Nitrogen
NAD+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (forma oxidada)
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (forma reduzida)
QBSD Quadrant Back Scattering Detector
UV Ultravioleta
VPSE Variable Pressure Secondary Electron
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC graus Celsius
ºP graus Plato
α alfa
κ kappa
ºBe graus Baumé
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 20
2 REVISÃO DA LITERATURA 22
2.1 PRODUÇÃO TRADICIONAL DE CERVEJA PELO PROCESSO DESCONTÍNUO 22
2.1.1 FORMAÇÃO DE COMPOSTOS RELACIONADOS COM O SABOR DA CERVEJA 24
2.1.1.1 Álcoois superiores 24
2.1.1.2 Ésteres 26
2.1.1.3 Dicetonas vicinais 28
2.2 FERMENTAÇÃO PRIMÁRIA CONTÍNUA COM LEVEDURAS IMOBILIZADAS 29
2.2.1 MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO E TIPOS DE SUPORTES 31
2.2.1.1 Bagaço de malte como suporte para a imobilização celular 36
2.2.2 REATORES UTILIZADOS NOS PROCESSOS COM CÉLULAS IMOBILIZADAS 38
2.3 PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CERVEJAS DE ALTAS DENSIDADES 41
2.3.1 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA COM LEVEDURAS IMOBILIZADAS PARA PRODUÇÃO DE CERVEJAS
DE ALTAS DENSIDADES 43
3 MATERIAIS E MÉTODOS 46
3.1 METODOLOGIAS AVALIADAS PARA O PREPARO DO BAGAÇO DE MALTE 46
3.2 CARACTERIZAÇÃO DOS MATERIAIS AVALIADOS COMO SUPORTE DE
IMOBILIZAÇÃO 48
3.2.1 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UNIDADE 48
3.2.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CELULOSE, HEMICELULOSE E LIGNINA 48
3.2.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS 50
3.3 MICRORGANISMO 50
3.4 PREPARO DO INÓCULO 50
3.4.1 ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER 51
3.4.2 ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT” 52
3.4.3 ENSAIOS EM REATOR DE COLUNA DE BOLHAS 53
3.5 PREPARO DOS MEIOS DE FERMENTAÇÃO 53
3.5.1 MEIO SINTÉTICO PARA ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER 53
3.5.2 MEIO SINTÉTICO PARA ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT” 54
3.5.3 ELABORAÇÃO DOS MOSTOS 100% MALTE E MALTE COM ADJUNTO 54
3.5.3.1 Mosturação 55
3.5.3.2 Filtração 56
3.5.3.3 Fervura 57
3.5.3.4 Autoclavagem 58
3.5.3.5 Armazenamento durante a fermentação contínua 58
3.6 CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO 59
3.6.1 ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER 59
3.6.2 ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT” 59
3.6.2.1 Características do reator 59
3.6.2.2 Operação inicial e processo fermentativo 60
3.6.3 ENSAIOS EM REATOR DE COLUNA DE BOLHAS 61
3.6.3.1 Características do reator 61
3.6.3.2 Operação inicial e processo fermentativo 62
3.7 ACOMPANHAMENTO ANALÍTICO DOS EXPERIMENTOS 64
3.7.1 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS IMOBILIZADAS 64
3.7.2 CONCENTRAÇÃO E VIABILIDADE DE CÉLULAS LIVRES 65
3.7.3 CONCENTRAÇÕES DE EXTRATO ORIGINAL, APARENTE E REAL, ETANOL E GRAU APARENTE E
REAL DE FERMENTAÇÃO 65
3.7.4 CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO AMINO LIVRE (FAN) 65
3.7.5 CONCENTRAÇÃO DE DIACETILO, ÉSTERES E ÁLCOOIS SUPERIORES 66
3.7.6 PH 66
3.7.7 CONTAMINAÇÃO BACTERIANA 66
3.7.8 FOTOMICROGRAFIAS 67
3.8 METODOLOGIA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS 67
3.8.1 PARÂMETROS FERMENTATIVOS DE PROCESSOS DESCONTÍNUOS 68
3.8.2 PARÂMETROS FERMENTATIVOS DE PROCESSOS CONTÍNUOS 68
3.9 ANÁLISE SENSORIAL – TESTE TRIANGULAR 69
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 71
4.1 PREPARO DO BAGAÇO DE MALTE PARA USO COMO SUPORTE DE
IMOBILIZAÇÃO 71
4.2 TESTES PRELIMINARES PARA AVALIAÇÃO DO BAGAÇO DE MALTE COMO
SUPORTE DE IMOBILIZAÇÃO DE LEVEDURAS 73
4.2.1 ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER 73
4.2.2 ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT” COM CIRCULAÇÃO INTERNA 76
4.3 FERMENTAÇÃO PRIMÁRIA DE CERVEJAS DE ALTAS DENSIDADES POR
PROCESSO CONTÍNUO EM REATOR DE COLUNA DE BOLHAS 80
4.3.1 EFEITO DA TEMPERATURA 80
4.3.1.1 Avaliação dos parâmetros fermentativos 80
4.3.1.2 Comparação com parâmetros fermentativos de fermentações descontínuas 86
4.3.1.3 Produção de compostos relacionados com o sabor e aroma da cerveja 90
4.3.2 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE EXTRATO ORIGINAL DE MOSTOS PURO MALTE 93
4.3.2.1 Avaliação dos parâmetros fermentativos 93
4.3.2.2 Produção de compostos relacionados com o sabor e aroma 98
4.3.3 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE EXTRATO ORIGINAL DE MOSTOS COM ADJUNTO 101
4.3.3.1 Avaliação dos parâmetros fermentativos 101
4.3.3.2 Produção de compostos relacionados com o sabor 108
4.3.4 EFEITO DA AERAÇÃO 113
4.3.5 ANÁLISE SENSORIAL DA CERVEJA DE ALTA DENSIDADE – TESTE TRIANGULAR 119
4.3.6 ASSEPSIA DO SISTEMA PARA OS DIFERENTES ENSAIOS 120
5 CONCLUSÕES 121
REFERÊNCIAS 124
APÊNDICES 132
APÊNDICE A – Equações utilizadas para determinação da porcentagem de celulose,
hemicelulose, lignina e cinzas. 132
APÊNDICE B – Modelo de ficha de avaliação para teste triangular. 133
APÊNDICE C – Esquema do reator “airlift” utilizado nos experimentos. 134
APÊNDICE D – Dimensões do reator de coluna de bolhas utilizado nas fermentações para
produção de cervejas de altas densidades. 135
APÊNDICE E – Características do reator de coluna de bolhas utilizado nas fermentações
para produção de cervejas de altas densidades. 136
ANEXOS 137
ANEXO A – Especificações do adjunto MOR-REX® 1557 137
ANEXO B – Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte utilizado como suporte de
imobilização das leveduras durante a fermentação contínua para produção de cervejas de
altas densidades. 138
ANEXO C – Trabalhos premiados. 139
ANEXO D – Recomendações para futuros trabalhos. 140
20
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, as indústrias precisam ser cada vez mais eficientes para sobreviver em um
mundo competitivo e globalizado. Isto tem gerado um grande interesse na busca de processos
inovadores que possam ser realizados com um menor custo sem afetar a qualidade do produto.
A fermentação contínua de cervejas utilizando leveduras imobilizadas representa uma das
inovações tecnológicas mais promissoras para a indústria cervejeira, pois além de reduzir o
tempo e o custo de produção, requer baixos investimentos quando comparada com a
fermentação descontínua tradicional. No entanto, para que essa tecnologia possa ser
implementada em escala industrial, algumas limitações tais como: problemas relacionados
com o sabor da cerveja, contaminação durante a fermentação, limitações difusionais de
transferência de massa e alterações na fisiologia e metabolismo das células imobilizadas
necessitam ainda ser superadas. O custo do suporte de imobilização é também um fator de
grande importância a ser considerado. Nesse sentido, a utilização de suportes de baixo custo
baseados em subprodutos industriais constitui sem dúvida uma alternativa promissora que
deve ser avaliada.
Outra importante inovação tecnológica praticada cada vez mais pelas indústrias cervejeiras, é
a produção de cervejas de altas densidades. A fermentação do mosto cervejeiro com
concentrações de extrato mais elevadas do que as tradicionalmente utilizadas permite
aumentar a capacidade de produção através de um uso mais eficiente das instalações,
reduzindo os custos de energia, mão de obra, limpeza e efluentes.
Este trabalho teve como principal objetivo estudar a fermentação primária de cervejas de altas
densidades pelo processo contínuo, utilizando o bagaço de malte (principal subproduto da
indústria cervejeira) como suporte para a imobilização das leveduras. Durante as
fermentações, foram avaliados os efeitos das variáveis: temperatura, concentração de extrato
21
original e composição do mosto, em diversos parâmetros fermentativos e na produção dos
compostos voláteis responsáveis pelo sabor das cervejas. Também foi verificado o efeito de
baixas taxas de aeração na estabilidade do sistema. A análise sensorial através do teste
triangular permitiu comparar o sabor de uma cerveja de alta densidade produzida pelo
processo contínuo com o sabor de uma cerveja do mercado brasileiro elaborada pelo processo
descontínuo.
Este estudo dá seqüência a uma das linhas de pesquisa do Grupo de Microbiologia Aplicada e
Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena, a qual
tem como objetivo o estudo de novas tecnologias para a produção de cervejas. Iniciadas em
1997, as pesquisas nesta área contam com os apoios das agências FAPESP, CAPES, CNPq e
das empresas Malteria do Vale, Corn Products Brasil, Wallerstein Industrial e Comercial e
JohnsonDiversey.
22
2 REVISÃO DA LITERATURA
O processo de produção de cerveja constitui um exemplo típico de biotecnologia tradicional
ou antiga, devido à sua longa história. No entanto, grandes avanços neste processo já foram
realizados e atualmente a indústria cervejeira utiliza uma série de inovações técnicas,
bioquímicas, microbiológicas e genéticas. O desenvolvimento de novos cultivares de cevada,
por exemplo, tem propiciado a obtenção de maltes que geram altos rendimentos de extrato e
apresentam atividades adequadas de enzimas amilolíticas e proteolíticas. A adição de
bactérias lácticas durante a fase de maltagem minimizou o desenvolvimento de
microrganismos prejudiciais como Fusarium sp. A fermentação primária de mostos de altas
densidades (processo “high gravity”) promoveu um significativo aumento da capacidade de
produção de cerveja. Recentemente, algumas leveduras geneticamente modificadas têm sido
desenvolvidas para manter a concentração de diacetilo em valores inferiores ao limiar de
detecção sensorial, facilitar a filtração da cerveja e produzir cervejas com baixos teores de
carboidratos. Outro exemplo de inovação tecnológica para o processo cervejeiro é a utilização
de bioreatores operados de forma contínua com leveduras imobilizadas para a etapa de
maturação da cerveja. Através desta técnica, um tempo de residência no reator de apenas 2 h é
suficiente para completar o processo de maturação, enquanto que empregando o sistema
descontínuo tradicional, este tempo é de normalmente algumas semanas (LINKO et al.,1998).
Estudos recentes mostram que existem diversos grupos de pesquisa ao redor do mundo
trabalhando no sentido de implementar, em escala industrial, a fermentação primária para
produção de cervejas pelo processo contínuo utilizando leveduras imobilizadas.
2.1 PRODUÇÃO TRADICIONAL DE CERVEJA PELO PROCESSO DESCONTÍNUO
23
O processo tradicional de produção de cervejas tipo lager, predominante em todo o mundo
nos dias atuais, pode ser resumido em poucas etapas, conforme descrito por Virkajärvi (2001).
Na primeira delas, denominada mosturação, o malte é moído e misturado com água. As
enzimas presentes no próprio malte são então ativadas de acordo com um perfil de
temperatura controlado, o qual permite hidrolisar o amido em mono, di, trissacarídeos e
dextrinas, e as proteínas em peptídeos e aminoácidos. Essa fase do processo necessita de um
tempo de aproximadamente 2 h para ser completada. Após esse tempo, a fração insolúvel do
malte (bagaço de malte) é removida por filtração, obtendo-se uma solução denominada mosto.
A próxima etapa consiste na adição de lúpulo e cozimento do mosto durante 1 a 2 h para
ssegurar a assepsia necessária do meio, promover a precipitação de compostos (complexos
formados com proteínas e polifenóis), solubilizar e isomerizar componentes do lúpulo,
remover compostos responsáveis por sabores desagradáveis no produto final, inativar as
enzimas presentes e permitir a obtenção da concentração desejada de extrato. Ao final do
cozimento, o precipitado formado é removido e o mosto é resfriado até a temperatura de
fermentação, aerado e inoculado na linha de transferência para o fermentador.
A etapa inicial de fermentação do mosto, denominada fermentação primária ou principal, é a
fase de maior atividade metabólica da levedura, durante a qual quase todo o extrato
fermentescível é convertido em álcool e gás carbônico. Durante este período ocorrem também
algumas reações que resultam na formação de subprodutos (ésteres, álcoois superiores e
outros) que exercem um importante efeito no sabor da cerveja. Em função das baixas
temperaturas utilizadas (6 a 15ºC) durante essa fase, a fermentação primária pode durar até 10
dias. A etapa seguinte corresponde ao período de maturação da cerveja, onde a temperatura é
reduzida normalmente a 0ºC sendo mantida durante 2 a 4 semanas. Caso haja presença de
extrato fermentescível residual na cerveja, este continua a ser fermentado nessas condições,
porém de forma mais lenta, sendo esse processo denominado fermentação secundária. Os
24
principais objetivos da maturação são a redução da concentração dos compostos de sabor
indesejável na cerveja, a saturação do produto final com CO2 e a remoção dos componentes
responsáveis pela turbidez (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001). De acordo com esses
autores, após o processo fermentativo (fermentação/maturação) a cerveja ainda não está
pronta para o consumo e requer vários tratamentos antes de ser engarrafada. Logo, em uma
última etapa, a cerveja maturada poderá passar por até seis tratamentos: a) carbonatação; b)
modificação de sabor; c) padronização da cor; d) estabilização contra turvação; e)
clarificação; f) estabilização biológica.
2.1.1 FORMAÇÃO DE COMPOSTOS RELACIONADOS COM O SABOR DA CERVEJA
Diversos compostos voláteis contribuem com o sabor, e em particular, com o odor das
cervejas. A importância de cada um deles é determinada pela sua concentração, sua interação
com outros constituintes (voláteis e não voláteis) e seu limiar de percepção (ANGELINO,
1991), ou seja, a menor concentração do composto capaz de ser percebida pelo consumidor
(BAMFORTH, 2005). Cerca de 600 compostos voláteis já foram identificados em cervejas, os
mais importantes incluem os álcoois superiores, os ésteres e as dicetonas vicinais
(WILLAERT; NEDOVIC, 2006).
2.1.1.1 Álcoois superiores
Durante a fermentação primária para produção de cerveja, os álcoois superiores (também
chamados de “álcoois fúsel”) são formados pelas células de leveduras como subprodutos do
processo e representam a principal fração dos compostos voláteis produzidos. De uma forma
geral, os álcoois superiores podem ser classificados em alifáticos (n-propanol, 2-metil-
25
propanol ou isobutanol, 2-metil-1-butanol ou álcool amílico e 3-metil-1-butanol ou álcool
isoamílico) e aromáticos (2-fenil-etanol, tirosol e triptofol). Dentre eles, os álcoois superiores
alifáticos são responsáveis pelo sabor “alcoólico” ou de “solvente” da cerveja e produzem
uma sensação de aquecimento na boca (WILLAERT; NEDOVIC, 2006). A Tabela 2.1 mostra
os principais álcoois superiores encontrados em cerveja e seus descritores de sabor.
Tabela 2.1 - Características dos principais álcoois superiores encontrados em cerveja.
Composto Fórmula Limiar de percepção do sabor (mg/l)
Descritores do sabor
n-propanol
700 Alcoólico
Isobutanol
100-200 Alcoólico
Álcool Amílico
65 Alcoólico, vinoso, banana, iodofórmio
Álcool Isoamílico
70 Alcoólico, vinoso, banana, doce
2-fenil-etanol
125 Rosas, perfumado
(BAXTER; HUGHES, 2001; ANGELINO, 1991).
A formação desses compostos por leveduras é complexa, dado que eles podem ser produzidos
como subprodutos da degradação ou da biosíntese de aminoácidos através de rotas catabólica
e anabólica, respectivamente (Figura 1). A rota catabólica (processo bioquímico no qual os
compostos orgânicos são degradados, geralmente com liberação de energia) envolve a via
onde o ceto-ácido produzido a partir da transaminação de um aminoácido, é descarboxilado a
seu correspondente aldeído e então reduzido a álcool através de uma enzima desidrogenase.
Desta forma, por exemplo, o 2 metil-propanol pode ser formado a partir do aminoácido
valina, o 3-metil-1-butanol a partir da leucina e o 2-metil-1-butanol a partir da isoleucina. A
CH3
OH
CH3
OH
CH3
CH3
OHCH3
CH3
OHCH3
OH
26
rota anabólica (processo bioquímico no qual os compostos orgânicos são formados,
geralmente emprega energia) utiliza as vias envolvidas na biosíntese de aminoácidos a partir
de carboidratos. Assim como na rota catabólica, o ceto-ácido intermediário é descarboxilado e
o aldeído resultante reduzido a álcool (STEWART; RUSSELL, 1998). O n-propanol, por
exemplo, é produzido a partir do ácido α-cetobutanóico apenas pela rota anabólica, devido à
ausência do aminoácido correspondente (ANGELINO, 1991).
Figura 1. Produção de álcoois superiores por leveduras (STEWART; RUSSELL, 1998).
2.1.1.2 Ésteres
Assim como os álcoois superiores, os ésteres também são formados como subprodutos
durante a fermentação primária para produção de cerveja. Dentre esses compostos, os mais
comumente encontrados incluem: acetato de etila, acetato de isoamila (2 e 3-metil-butil-
acetato), caproato de etila (decanoato de etila), caprilato de etila (octanoato de etila) e 2-fenil-
etil-acetato. Os ésteres constituem um importante grupo de compostos voláteis na cerveja pois
Carboidratos
Aminoácidos
Metabolismo decarboidratos
Proteínas
Transaminação
Conjunto de oxoácidos
Aminoácidos
Aldeídos
Etanol e álcoois superiores
Oxoácidos
CO2
NADH NAD+
27
apresentam limiares de percepção relativamente baixos, podendo proporcionar um sabor frutal
ou floral (ANGELINO, 1991). No entanto, a presença destes compostos na cerveja é
desejável desde que em quantidades e proporções adequadas (WILLAERT; NEDOVIC,
2006). Na Tabela 2.2 estão apresentados alguns dos ésteres mais importantes encontrados em
cerveja e seus descritores de sabor.
Tabela 2.2 - Características dos principais ésteres encontrados em cerveja.
Composto Fórmula Limiar de percepção do sabor (mg/l)
Descritores do sabor
Acetato de etila
30 Solvente, doce
Acetato de Isoamila
1 Banana, solvente
Hexanoato de etila
0,2 Maçã, frutado, doce
Caprilato de etila
0,5 Maçã, frutas tropicais, doce
2-fenil-etil-acetato
3 Rosas, mel, maçã, doce
(BAXTER; HUGHES, 2001).
Os ésteres são formados por leveduras através de uma reação de condensação intracelular
entre um acetil-CoA e um álcool, catalisada pela enzima álcool acetil-transferase (éster
sintase) (VERSTREPEN et al., 2003). Desta forma, o acetato de etila é o éster produzido em
maiores quantidades durante a fermentação para produção de cerveja, pois o seu precursor
(etanol) é o álcool mais comum presente no meio (STEWART; RUSSELL, 1998). A reação
para a formação de acetato de etila a partir de etanol é a seguinte:
O
O
CH3 CH3
O
O
CH3 CH3
CH3
O
O
CH3CH3
O
O
CH3CH3
O
O
CH3
28
CH3CH2OH + CH3COSCoA CH3CH2COOCH3 + CoASH
Etanol Acetil-CoA Acetato de etila Coenzima A
2.1.1.3 Dicetonas vicinais
As dicetonas vicinais encontradas em cerveja compreendem o diacetilo (2,3-butanodiona) e a
2,3-pentanodiona, os quais são compostos carbonila obtidos a partir de subprodutos das vias
que levam à formação de valina e isoleucina durante a fermentação. Ambos compostos
conferem um sabor “amanteigado” e “adocicado” à cerveja, quando presentes em elevadas
concentrações. Porém, sensorialmente o diacetilo é o mais importante pois seu limiar de
percepção de sabor em cervejas tipo lager é baixo, correspondendo a cerca de 0,10 -
0,15 mg/l. Esse valor é aproximadamente 10 vezes menor que o limiar de percepção de sabor
da 2,3-pentanodiona (WILLAERT; NEDOVIC, 2006). Apesar de serem obtidos a partir de
subprodutos do metabolismo de carboidratos pelas leveduras, a formação de ambos, diacetilo
e 2,3-pentanodiona, ocorre fora das células através de uma reação química não enzimática
(Figura 2). No caso do diacetilo, o aceto-hidroxi ácido intermediário na síntese de valina (α-
acetolactato) é excretado da célula e então convertido por uma descarboxilação oxidativa. O
diacetilo então formado é re-assimilado pela levedura e reduzido a acetoína e 2,3-butanodiol
em reações que envolvem a oxidação do cofator NADH. Conseqüentemente, o NAD+
produzido permite manter o balaço redox na célula para as etapas posteriores de fermentação
(HORNSEY, 1999). Os limiares de percepção de sabor da acetoína e do 2,3-butanodiol são
relativamente elevados (acima de 17 e 4500 mg/l, respectivamente) e, portanto, as etapas
finais de redução do diacetilo são de grande importância para se obter uma cerveja com
propriedades organolépticas adequadas (STEWART; RUSSELL, 1998).
éster sintase
29
Figura 2. Formação de diacetilo a partir de carboidratos por leveduras (modificado de LEWIS; YOUNG, 1995).
2.2 FERMENTAÇÃO PRIMÁRIA CONTÍNUA COM LEVEDURAS IMOBILIZADAS
Uma das formas de se aumentar a produtividade de um processo descontínuo é convertê-lo
em um processo contínuo. Este fato fez com que muitas cervejarias se dedicassem à
implementação de sistemas contínuos em escala industrial nas décadas de 50 e 60. No
entanto, na década de 70, esta linha de pesquisa foi abandonada em função de diversas
dificuldades encontradas para sua implantação. Porém, na década de 80, a tecnologia de
imobilização celular começou a ser empregada em processos contínuos de fermentação,
solucionando os problemas até então encontrados (STEWART; RUSSELL, 1998).
De acordo com Virkajärvi et al. (2002), a implementação de um sistema contínuo de
O
OH
CH3CH3
OH
O
O
OH
CH3CH3
OH
O
O
O
CH3CH3
O
O
CH3CH3
O
CH3CH3
OH
O
CH3CH3
OH
CH3CH3
OH
OH
CH3CH3
OH
OH
Carboidrato
Metabolismo de carboidratos
α-acetolactato
α-acetolactato
Valina
diacetilo
acetoína
2,3-butanodiol
NAD+
NADH
NAD+
NADH
CO2
30
fermentação primária para produção de cerveja, oferece uma série de vantagens frente à
tradicional fermentação descontínua, tais como: redução no tamanho dos equipamentos e da
planta, obtenção de um produto com qualidade uniforme e, principalmente, uma significativa
redução no tempo necessário para produção da cerveja. O uso de um sistema contínuo
empregando células imobilizadas é capaz de reduzir ainda mais o tempo da fermentação
primária, a qual pode ocorrer em apenas um dia (MENSOUR et al., 1996). Smogrovicová et
al. (1997) produziram cerveja tipo lager com um tempo de fermentação primária de apenas
12,75 h, utilizando um reator “gas-lift” de 521 ml com células imobilizadas em esferas de
pectato de cálcio. De acordo com esses autores, a cerveja produzida apresentou uma
composição e propriedades organolépticas similares às das cervejas produzidas por
fermentação descontínua. Onaka et al. (1985) desenvolveram um sistema de fermentação
primária contínua com leveduras Saccharomyces cerevisiae tipo lager imobilizadas em
esferas de gel de alginato de cálcio, que permitiu a elaboração de cervejas com baixas
concentrações de diacetilo, em um tempo de 20,8 h.
De acordo com Bardi et al. (1996), a fermentação primária contínua para produção de cerveja
com leveduras imobilizadas num material celulósico deslignificado (serragem de madeira)
proporcionou produtividades em etanol, três a quatro vezes maiores do que os valores obtidos
durante as fermentações descontínuas repetidas realizadas em temperaturas inferiores à 10ºC.
Esses autores sugeriram a possibilidade de utilização do processo contínuo com baixas
temperaturas em escala industrial, devido ao aumento da produtividade e aos resultados
satisfatórios das análises de sabor e da composição da cerveja produzida. Em um trabalho
posterior, Bardi, Koutinas e Kanellaki (1997) observaram ainda que o sistema contínuo de
fermentação para produção de cerveja utilizando leveduras imobilizadas em glúten apresentou
estabilidade operacional durante 3 meses, sem contaminação microbiana e com uma
produtividade em etanol relativamente alta. A cerveja obtida por este processo também
31
apresentou qualidade satisfatória, com uma baixa concentração de diacetilo e polifenóis.
Ensaios realizados em escala piloto em um reator com volume de leito de 1000 l,
demonstraram a possibilidade de produzir cervejas utilizando um sistema contínuo de
fermentação primária com leveduras imobilizadas em cavacos de madeira. O sistema foi
mantido em operação durante várias semanas com um bom desempenho das leveduras.
Dependendo das condições de fermentação e da cepa de levedura empregada, o tempo da
fermentação principal variou entre 20 e 30 h (PAJUNEN; LOMMI, VILJAVA, 2000).
Devido a estas vantagens, grandes cervejarias em todo o mundo têm tentado implementar o
processo contínuo de fermentação primária com células imobilizadas. Alguns exemplos são as
cervejarias: Kirin Brewery Company Ltd. (Japão), Labbat Breweries (Canadá), Meura Delta
(Bélgica), Sapporo Breweries Ltd. (Japão) e Hartwall Plc (Finlândia) (VIRKAJÄRVI, 2001).
Desta forma, a fermentação principal de cerveja em sistema contínuo com células
imobilizadas, pode se tornar em breve uma realidade nas cervejarias modernas
(PILKINGTON et al., 1998).
2.2.1 MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO E TIPOS DE SUPORTES
A técnica de imobilização celular baseia-se em manter as células em uma região limitada do
espaço, preservando suas atividades catalíticas e possibilitando seu uso de forma repetida ou
contínua (KAREL; LIBICKI, ROBERTSON, 1985; KATCHALSKI-KATZIR; KRAEMER,
2000). Existem quatro métodos básicos para a imobilização de células: auto-agregação,
contenção por membranas, aprisionamento em matrizes porosas e ligação às superfícies
(GERBSCH; BUCHHOLZ, 1995; PILKINGTON et al., 1998), os quais estão esquematizados
na Figura 3.
32
Auto-agregação (floculação) Contenção em membranas
Aprisionamento em matrizes Ligação às superfícies
Figura 3. Métodos básicos para a imobilização de células (PILKINGTON et al., 1998).
A imobilização por auto-agregação consiste em promover a agregação ou a floculação das
células de maneira natural ou induzida artificialmente. Desta forma, as células são ligadas
entre si sem a necessidade de usar um suporte de imobilização. Entretanto, dado que os
agregados celulares naturais são geralmente instáveis e sensíveis às tensões de cisalhamento, a
maioria das vezes é necessária a adição de agentes químicos (como glutaraldeído) que
formam ligações cruzadas entre as células durante a imobilização (GROBOILLOT et al.,
1994). Masschelein, Ryder e Simon (1994) relataram que a produção de cerveja por processo
contínuo utilizando a auto-agregação das leveduras foi praticamente abandonada no começo
dos anos 70.
A imobilização por contenção em membranas envolve o uso de membranas pré-formadas ou a
formação in situ da membrana em torno das células a serem imobilizadas (KAREL; LIBICKI,
ROBERTSON, 1985). Este método, também conhecido como encapsulamento, tem sido
utilizado como uma tecnologia alternativa ao aprisionamento em matrizes porosas uma vez
33
que oferece vantagens como, alta capacidade de contenção de células e prevenção da perda de
células para o meio de fermentação. Devido à ausência de núcleo gelificado, as limitações à
transferência de massa também são reduzidas (PARK; CHANG, 2000). De acordo com
Gerbsch e Buchholz (1995), uma aplicação promissora deste princípio de imobilização é a
contenção de biocatalisadores em micro esferas do tipo “hollow fiber”, formadas através de
interações iônicas entre sulfato de celulose e cloreto de poli-dimetil-dialil-amônio. O método
de imobilização por contenção das leveduras em membranas, tem sido pouco utilizado na
produção contínua de cerveja (PILKINGTON et al., 1998). De acordo com Verbelen et al.
(2006), esse método de imobilização é atrativo em termos de produtividade, mas em
fermentações de baixo valor agregado como na produção de cerveja, torna-se inviável devido
ao elevado valor das membranas que aumenta a relação custo/benefício.
A imobilização por aprisionamento em matrizes porosas normalmente envolve a síntese in
situ da matriz em torno das células a serem imobilizadas. Este método de imobilização tem
sido extensivamente estudado devido à possibilidade de uso de polímeros hidrofílicos
compatíveis como suportes de imobilização (NORTON; D’AMORE, 1994). Além disso, as
células imobilizadas em uma matriz hidrofílica podem estar protegidas de condições adversas
de pH, temperatura, solventes orgânicos e compostos inibidores presentes no meio de
fermentação. No entanto, este método apresenta também algumas desvantagens como,
pequeno volume disponível para a contenção das células imobilizadas, perda de células para o
meio de fermentação e instabilidade dos suportes normalmente utilizados, o que limita a
utilização dos agregados por longos períodos (PARK; CHANG, 2000). Dentre os suportes
mais utilizados para este tipo de imobilização destaca-se o gel de alginato de cálcio (TATA et
al., 1999; PILKINGTON et al., 1998).
Algumas fermentações em escala piloto têm sido realizadas pela indústria cervejeira
empregando leveduras imobilizadas em esferas de alginato de cálcio. Porém, vários
34
problemas têm sido observados, os quais incluem a perda de integridade mecânica do suporte
(pela abrasão ou compressão das partículas), limitações à transferência de massa e
dificuldades de ampliação de escala. Além disso, em fermentações com a levedura
S. cerevisiae aprisionada neste suporte foi observado ainda que as limitações de transferência
de massa proporcionam uma redução na velocidade específica de fermentação, na formação
de álcoois superiores e ésteres e no consumo de aminoácidos. Todos esses problemas têm
levado à busca por outros tipos de suporte em substituição ao alginato de cálcio. Uma
alternativa à técnica de imobilização por aprisionamento é a ligação de células por adsorção
(DEBOURG, 1993).
A imobilização por meio de ligação (ou adsorção) às superfícies pode ocorrer através de
forças de Van der Waals (hidrofóbicas), interações eletrostáticas entre superfícies de cargas
opostas, interações iônicas (ácido/base de Lewis) ou por ligações covalentes (pontes de
hidrogênio) entre grupos reativos do suporte e da parede celular das leveduras (WILLAERT,
2000; NEDOVIC et al., 2001; VERBELEN et al., 2006). Esse método de imobilização é
simples e barato, porém, apresenta como principal desvantagem, a facilidade de perda das
células imobilizadas para o meio de fermentação. Para aumentar a biomassa imobilizada,
geralmente são utilizados suportes porosos que permitem a ligação das células à estrutura
superficial interna do material (GROBOILLOT et al., 1994). Além disso, a ligação das células
no suporte pode ser induzida utilizando agentes de ligação (óxidos metálicos, glutaraldeído,
ou aminosilanas). Entretanto, na produção de bebidas, a adesão natural é geralmente preferida
frente ao uso de indutores potencialmente nocivos ou instáveis. A imobilização natural através
de ligação a superfícies é muito simples, mas as concentrações de células imobilizadas são
geralmente menores do que as obtidas em sistemas com células imobilizadas através do
aprisionamento em matrizes porosas (VERBELEN et al., 2006). Na imobilização natural
podem ser formadas películas de células de até 1 mm de espessura. Valores superiores são
35
difíceis de ser obtidos pois devido à ausência de barreiras entre as células e o meio, é
estabelecido um equilíbrio entre as células adsorvidas e as livres em suspensão pela constante
desorção e re-localização dos microrganismos no suporte (KOURKOUTAS et al., 2004).
Segundo Pradella (2001), materiais inorgânicos (alumina, sílica, zircônia, vidro, diatomita),
polímeros sintéticos (poliacrilamida, cloreto de polivinila, poliestireno, poliuretano,
polietileno glicol) e polímeros naturais (ágar, pectina, celulose, dextrana, colágeno) são
comumente utilizados como suporte para imobilização por ligação a superfícies.
Shindo et al. (2001), compararam a capacidade de imobilização da levedura S. cerevisiae em
vários tipos de suporte (Tabela 2.3). Segundo esses autores, os três suportes utilizados para o
aprisionamento das leveduras: os géis de alginato de cálcio, de κ-carragenana e de polivinil
álcool permitiram obter altas densidades celulares. Porém, a preparação das partículas de gel
para a imobilização das células foi relativamente difícil com esses suportes. No método de
adsorção, os suportes de esferas de vidro e de cerâmica e a DEAE-celulose foram facilmente
preparados para a imobilização das leveduras. Por outro lado, devido ao desgaste, essas
esferas foram quebradas com uma maior facilidade no reator de leito fluidizado provocando
uma diminuição do número de células imobilizadas quando comparadas com o método de
aprisionamento. Por esses motivos, a adesão das células em superfícies modificadas é um dos
métodos mais utilizados para a imobilização das leveduras cervejeiras (DEBOURG, 1993).
Tabela 2.3 - Capacidade de imobilização da levedura S. cerevisiae em vários suportes.
Suporte Capacidade de imobilização
Método de imobilização
Gel de alginato de cálcio Alta Aprisionamento Gel de κ-carragenana Alta Aprisionamento Gel de polivinil álcool Alta Aprisionamento Esferas de cerâmica Média Adsorção Esferas de vidro Média Adsorção DEAE-celulose Baixa Adsorção Esferas de quitosana Média Adsorção Esferas de zeolita Média Adsorção
(SHINDO et al., 2001)
36
2.2.1.1 Bagaço de malte como suporte para a imobilização celular
Os suportes de imobilização descritos anteriormente possuem a mesma finalidade: reter uma
alta concentração celular no reator, visando aumentar a produtividade volumétrica do sistema
e diminuir os custos de fermentação (PILKINGTON et al., 1998). No entanto, a escolha do
suporte deve ser feita considerando alguns fatores importantes, tais como sua disponibilidade,
ausência de toxicidade, resistência mecânica, capacidade de retenção da biomassa e custo.
Segundo Linko et al. (1998), o preço do suporte de imobilização é o fator de maior limitação
econômica na implantação do processo contínuo em escala industrial. Para evitar esse
problema, uma alternativa interessante que merece ser avaliada é a utilização de suportes de
baixos custos baseados em subprodutos industriais.
O bagaço de malte (Figura 4) é um subproduto da indústria cervejeira de baixo custo e grau
alimentício, produzido após etapa de mosturação (KOPSAHELIS et al., 2007). Segundo
Reinold (1997), esse material representa cerca de 85% do total de subprodutos gerados pelas
cervejerias, sendo obtidos aproximadamente 20 kg úmido para cada 100 l de cerveja
produzida. Considerando essa relação, e sabendo que a produção de cervejas no Brasil no ano
de 2006 foi de 9,5 bilhões de litros (COMÉRCIO, 2007), é possível estimar que somente no
ano passado, a produção de bagaço de malte no Brasil foi de cerca de 1,9 milhões de
toneladas. Esse subproduto é um material lignocelulósico com a seguinte composição
química: 35% de hemicelulose, 20% de celulose, 10% de lignina e 10% de gorduras
(REINOLD, 1997). Segundo Hernández et al. (1999), o bagaço de malte contém 20 a 30% de
proteínas e 70 a 80% de fibras. Essa composição pode apresentar variações dependendo do
tipo de cevada utilizada, das condições de maltagem e mosturação, e da quantidade e do tipo
de adjunto adicionado (SANTOS et al., 2003).
37
Figura 4. Bagaço de malte (A); Fotomicrografia de partícula. Ampliação: 45 vezes (B).
De acordo com Brányik et al. (2001), o bagaço de malte constitui uma alternativa promissora
como suporte de imobilização durante a fermentação contínua para produção de cerveja, pois
além de ter um baixo custo, apresenta uma elevada capacidade de retenção de leveduras é
estável e permite ser preparado, esterilizado e regenerado de maneira simples. Além disso, as
leveduras na superfície do bagaço de malte encontram-se em contato direto com o meio de
fermentação, o que diminui os problemas de transferência de massa (BRÁNYIK et al., 2002).
A colonização das leveduras cervejeiras nas partículas do bagaço de malte ocorre através de
dois mecanismos: a) adesão espontânea das células nos sítios ativos da superfície do material,
e b) retenção das células pela aspereza da superfície do suporte. A partir da adesão e/ou
adsorção inicial das células, as leveduras gradualmente vão cobrindo toda a superfície do
suporte, formando uma “biopelícula” de leveduras de espessura variável de acordo com as
diferenças nas propriedades da superfície do bagaço de malte (BRÁNYIK et al., 2004c). A
etapa inicial de ligação das leveduras assim como a velocidade e extensão da imobilização,
são também influenciadas pelo tamanho da partícula do suporte. Quanto menor o tamanho das
partículas, maior a velocidade de formação da “biopelícula” e a capacidade máxima de
retenção celular, provavelmente devido ao aumento da relação entre área superficial/peso do
suporte e também devido ao aumento do número de sítios ativos disponíveis para a ligação
A B
38
inicial das células (BRÁNYIK et al., 2001). A Tabela 2.4 mostra a relação entre a capacidade
máxima de retenção celular (carga celular) e o tamanho médio das partículas do bagaço de
malte.
Tabela 2.4 - Capacidade máxima de retenção celular (carga celular) de acordo com o tamanho da partícula do bagaço de malte.
Tamanho médio do suporte (mm2)
Carga celular máxima (g cél/g sup)
0,105 0,430 0,247 0,364 0,590 0,268
(BRÁNYIK et al., 2001)
2.2.2 REATORES UTILIZADOS NOS PROCESSOS COM CÉLULAS IMOBILIZADAS
Além do suporte e do método de imobilização, o tipo ou configuração do reator é também um
fator de grande importância na implementação, em escala industrial, do processo contínuo de
fermentação utilizando células imobilizadas (TATA et al., 1999). De acordo com Karel,
Libicki e Robertson (1985), a escolha do reator deve ser feita considerando principalmente a
resistência à transferência de massa entre a fase líquida (na qual se encontram os substratos) e
a fase sólida (na qual se encontram as células imobilizadas). Fatores como tipo, tamanho e
condições de operação do reator influenciam a transferência de massa, afetando o coeficiente
de transferência de massa do filme líquido (KL) que envolve os agregados imobilizados. A
otimização das condições de mistura entre a fase líquida e a fase sólida maximiza o contato
superficial entre estas fases, minimizando a espessura do filme líquido adjacente que envolve
o suporte de imobilização, maximizando o valor de KL e, conseqüentemente, minimizando as
limitações impostas à transferência de massa (PILKINGTON; MARGARITIS, MENSOUR,
1998).
Em geral, são 5 os tipos de reatores que têm sido utilizados em sistemas contínuos de
39
fermentação com leveduras imobilizadas. Estes incluem os reatores de leito fixo (ou
empacotado), de leito fluidizado (ou expandido), de membrana com reciclo de células, os
“gas-lift” ou “airlift” e os de coluna de bolhas (VERBELEN et al., 2006). Alguns reatores
podem ainda ser modificados para melhorar as características de transferência de massa e a
capacidade de controle das condições de cultivo, ou para minimizar o estresse imposto ao
suporte de imobilização (FUKUDA, 1994; BARON; WILLAERT, BACKER, 1996). A
Tabela 2.5 resume as principais vantagens e desvantagens dos reatores comumente utilizados
nos sistemas com células imobilizadas.
Tabela 2.5 - Vantagens e desvantagens de reatores utilizados com sistemas de células imobilizadas.
Tipo de reator Vantagens Desvantagens
Leito fixo (ou empacotado) Desenho simples Baixos requerimentos de energia
Mistura pouco eficiente de líquido Acúmulo de gases Dificuldades na ampliação de escala Oclusão com sólidos Compactação do leito limita a altura do reator
Leito fluidizado (ou expandido)
Baixo cisalhamento Sistemas em escala industrial disponíveis atualmente Boa mistura de líquido
Problemas com espuma Ampliação de escala mais complexa do que a de leito fixo
“Gas-lift” Menor cisalhamento do que no de leito fluidizado Elevada transferência de massa e calor Custo reduzido de bombeamento quando comparado com o de leito fluidizado
Problemas com espuma Ampliação de escala mais complexa do que a de leito fixo
Coluna de bolhas Equipamento simples e de baixo custo Elevada transferência de gases e de calor Apropriado para meios com altas concentrações de sólidos
Problemas com espuma Elevados requerimentos de gases
(PILKINGTON et al., 1998; WILLAERT, 2000)
40
Nos reatores de leito fixo, os agregados imobilizados são empacotados em uma coluna através
da qual passa o meio de fermentação. Apesar da simplicidade do modelo e baixo custo, este
tipo de reator apresenta problemas no controle dos principais parâmetros de processo (pH,
oxigênio dissolvido e temperatura) (PRADELLA, 2001). Além disso, algumas variáveis no
comportamento ideal do fluxo do meio de fermentação são constantemente observadas devido
ao acúmulo de gases (como CO2), compactação do leito ou acúmulo de biomassa suspensa
(levando à formação de caminhos preferenciais), o que prejudica as taxas de produção
limitando a transferência de massa (FUKUDA, 1994).
Os reatores de leito fluidizado permitem que as células imobilizadas permaneçam em
suspensão, através da passagem de um fluxo ascendente de meio líquido, o que possibilita
também uma maior mistura entre as fases líquida (meio) e sólida (suporte), facilita a remoção
de gases e minimiza a pressão sobre as células imobilizadas (GROBOILLOT et al., 1994).
Porém, no estado de fluidização, as colisões entre as partículas podem causar o desgaste e a
perda do suporte. Além disso, o uso de suportes de vidro ou de cerâmica requer elevadas taxas
de fluxo do meio, o que proporciona uma maior perda de células e aumenta os custos de
bombeamento (NEDOVIC et al., 2001). Para se obter uma boa fluidização, a diferença de
densidade entre o suporte com as células imobilizadas e o meio de fermentação deve ser a
maior possível. É importante destacar também, que diversos padrões de mistura entre as fases
líquida e sólida podem ser obtidos em função do tamanho e da densidade do suporte, bem
como das taxas de fluxo do líquido e da geometria do leito (PILKINGTON; MARGARITIS,
MENSOUR, 1998).
Os reatores do tipo “airlift” ou “gas-lift” utilizam uma circulação forçada de ar ou de gás,
respectivamente, o que facilita a transferência de massa e calor e promove uma elevada
remoção de CO2, evitando canalizações e oclusões (BRÁNYIK et al., 2002). Nestes reatores,
o meio de fermentação tem uma movimentação cíclica bem definida através de dispositivos e
41
arranjos internos construídos para esse propósito (SCHMIDELL; FACCIOTTI, 2001). Os
dispositivos internos (tubos concêntricos) podem ser alterados com o objetivo de melhorar as
condições do processo. Vicente, Dluhý e Teixeira (1999), relataram que a introdução de seis
misturadores estáticos no tubo de corrente de um reator “gas-lift” proporcionou um aumento
de 30% na produtividade em etanol durante a fermentação de glicose com a levedura
S. cerevisiae.
O reator de coluna de bolhas é basicamente um recipiente cilíndrico com um dispersor de
gases na região inferior. Devido à configuração simples, a manutenção requerida para esse
tipo de reator é mínima e os custos operacionais envolvidos são baixos dada a ausência de
elementos móveis. Além dessas vantagens, este reator também se destaca por ser capaz de
proporcionar elevadas transferências de massa e calor. Por todos esses motivos, os reatores de
coluna de bolhas têm recebido grande atenção durante os últimos 20 anos sendo utilizados
industrialmente em diversas áreas (KANTARCI; BORAK, ULGEN, 2005). As indústrias
química, petroquímica, metalúrgica e de bioprocessos são alguns exemplos que utilizam esses
reatores (DEGALEESAN; DUDUKOVIC, PAN, 2001). Em escala de laboratório, alguns
estudos recentes têm avaliado o emprego desse tipo de reator na fermentação para produção
de vinagre (RUBIO-FERNÁNDEZ; SALVADOR, FREGAPANE, 2004), xilitol (BRANCO
et al., 2006) e cerveja pelo processo contínuo (BRÁNYIK, et al., 2004b; BRÁNYIK, et al.,
2004c).
2.3 PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CERVEJAS DE ALTAS DENSIDADES
No processo tradicional de produção de cerveja, mostos com concentrações de extrato de 11
ou 12ºP, são fermentados para produzir cervejas com 4 a 5% (v/v) de etanol (CASEY;
MAGNUS, INGLEDEW, 1984). O grau Plato (ºP) pode ser definido como as gramas de
42
extrato equivalentes ao peso da sacarose, em 100 gramas de mosto à 20ºC (ODOMERU et al.,
1992).
Na produção de cervejas de altas densidades (“High gravity brewing”) são fermentados
mostos com concentrações de extrato maiores do que as tradicionalmente utilizadas, sendo
necessário portanto, uma diluição com água carbonatada em uma etapa posterior. Uma grande
vantagem deste processo é que, com a redução da quantidade de água empregada no preparo
do mosto, é possível aumentar a produção de cerveja sem a necessidade de expandir a
capacidade dos equipamentos para a elaboração do mosto, fermentação e armazenamento do
produto (STEWART et al., 1997). De acordo com Hackstaff (1978), mostos de até 18ºP têm
sido fermentados com resultados satisfatórios.
A fabricação de cerveja de altas densidades tem sido progressivamente introduzida nas
cervejarias do mundo inteiro nos últimos 30 anos. Em 1997, nos Estados Unidos, a maior
parte das cervejas já era produzida por esse método e não pelos métodos convencionais
(STEWART, 2000). Segundo Schmedding, Evans e Groesbeek (1997), o processo de altas
densidades constitui uma inovação tecnológica resultante da crescente competitividade do
mercado, que permite una redução dos custos e a introdução de novos produtos. De acordo
com Stewart (1999), várias cervejarias estão empregando o processo de altas densidades
devido a vantagens tais como: (1) crescente capacidade de produção de cerveja através de um
uso mais eficiente das instalações existentes da planta, (2) redução nos custos de energia, mão
de obra, limpeza e efluentes, (3) incremento da estabilidade física. Além disso, em termos de
economia, foi estimado que o aumento na concentração do mosto de 12 para 15ºP, resulta em
uma diminuição de 14% no consumo de energia, com um aumento de 25 até 35% na
produtividade do processo (HACKSTAFF, 1978; McCAIG et al., 1992).
Por outro lado, algumas cervejarias não têm implementado este processo devido às seguintes
desvantagens: (1) menor eficiência de extração dos componentes do malte durante a
43
mosturação e redução da utilização de lúpulo devido à alta concentração da suspensão
(aumento da relação de carboidratos para água), (2) diminuição da estabilidade da espuma, (3)
os mostos com elevadas concentrações de extrato podem influenciar no desempenho da
levedura, com efeitos sobre as características de fermentação e floculação (RUSSELL;
STEWART, 1995). Efeitos de estresse tais como alta pressão osmótica e níveis de etanol
elevados são ainda mais significativos quando a concentração de extrato do mosto é
aumentada, diminuindo a viabilidade da levedura e tornando as fermentações mais lentas
(PRATT; BRYCE, STEWART, 2003; D’AMORE; CELOTTO, STEWART, 1991). Algumas
estratégias propostas para contornar estes problemas incluem: o aumento da temperatura de
fermentação e da concentração de inóculo e a suplementação nutricional do meio com fontes
de nitrogênio assimilável, esteróis e ácidos graxos insaturados (CASEY; MAGNUS,
INGLEDEW, 1984).
2.3.1 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA COM LEVEDURAS IMOBILIZADAS PARA PRODUÇÃO DE
CERVEJAS DE ALTAS DENSIDADES
Estudos recentes têm demonstrado a possibilidade de realizar a fermentação principal
contínua de mostos com elevadas concentrações de extrato, empregando leveduras
imobilizadas. Virkajärvi et al. (2002) avaliaram diferentes parâmetros da fermentação
contínua de mostos com concentrações de extrato entre 15 e 24ºP, à 10ºC, em escala de
laboratório (reator tubular de 1,6 l de volume total). O microrganismo empregado neste
processo foi uma levedura cervejeira S. pastorianus tipo lager imobilizada em esferas de
vidro poroso. Os resultados obtidos revelaram que os graus aparente de fermentação dos
mostos de 15 e 18ºP foram satisfatórios (81% e 77%, respectivamente). Entretanto, para os
mostos com maiores concentrações de extrato, os graus aparente de fermentação foram
44
menores: 60% para o mosto de 21ºP e 45% para o mosto de 24ºP. O consumo de nitrogênio
amino livre (FAN) foi o mesmo, independente da concentração de açúcares no mosto. A
produtividade da fermentação (definida como as gramas de açúcar consumido por volume de
suporte por unidade de tempo) foi máxima para o mosto de 18ºP. Os mostos de 15 e 21ºP
apresentaram produtividades similares, enquanto que o mosto de 24ºP teve a menor
produtividade. Esses autores concluíram que cervejas de altas densidades podem ser
produzidas por fermentação contínua utilizando leveduras imobilizadas. Além disso,
sugeriram a continuação das pesquisas utilizando temperaturas entre 10 e 20ºC com variações
das taxas de aeração para avaliar a formação de compostos responsáveis pelas propriedades
organolépticas da cerveja.
Donnelly et al. (1999) estudaram a influência da concentração de extrato do mosto na
eficiência da fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades pelo
processo contínuo em um reator de leito fluidizado. As leveduras tipo ale utilizadas foram
imobilizadas em esferas de vidro poroso com diâmetros de 1 a 2 mm e tamanho de poro entre
60 e 300 μm. Os autores observaram uma significativa redução da taxa de consumo de
açúcares com o aumento da concentração de extrato do mosto. No entanto, foi destacado que
o mosto de 20ºP foi satisfatoriamente fermentado até sua atenuação limite.
Tata et al. (1999) compararam o desempenho de dois diferentes tipos de reatores com
leveduras imobilizadas durante a fermentação contínua de mostos com elevada concentração
de extrato (16ºP). Um dos reatores foi do tipo leito fluidizado utilizando esferas de vidro
poroso para a imobilização das leveduras. O outro reator foi do tipo “loop” contendo
carboneto de silício como suporte para a imobilização das células. Quando ambos os sistemas
foram operados como processos de duas etapas, foram obtidas atenuações quase completas do
extrato do mosto e o término da fermentação foi atingido em apenas metade do tempo
necessário para o processo descontínuo. Ambos os sistemas mostraram cinéticas de consumo
45
de açúcares similares, apresentando portanto, valores próximos de produtividade volumétrica.
Quando comparada com a fermentação descontínua, a concentração de álcoois superiores foi
menor e a de ésteres totais maior. A cerveja obtida no reator de leito fluidizado foi
considerada totalmente aceitável considerando suas propriedades organolépticas, embora estas
foram diferentes das cervejas convencionais obtidas pelo processo descontínuo. Segundo
esses autores, a redução do tempo de fermentação demonstrou a possibilidade do emprego da
fermentação contínua para produção de cervejas de altas densidades com leveduras
imobilizadas.
46
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados na Microcervejaria do Grupo de Microbiologia Aplicada e
Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de
Lorena/Universidade de São Paulo (EEL/USP).
3.1 METODOLOGIAS AVALIADAS PARA O PREPARO DO BAGAÇO DE MALTE
O bagaço de malte utilizado nos experimentos foi obtido em um processo de elaboração de
mostos 100% malte. Inicialmente, o material foi lavado com água e secado em estufa elétrica
a 50 ± 5ºC até atingir um teor de umidade de 10%. Em seguida, foram avaliados três
tratamentos de deslignificação para o preparo do bagaço de malte como suporte de
imobilização, os quais foram baseados em metodologias descritas por diferentes autores:
Tratamento 1 (MUSSATTO et al., 2006): Em uma primeira etapa o bagaço de malte foi
submetido a um tratamento ácido empregando uma solução de H2SO4 1,25% (p/v), numa
relação sólido:líquido de 1:8 g:ml. Essa etapa foi realizada em um reator de aço inoxidável
(construído na EEL/USP) de 50 l (volume total), sob agitação constante (0,7 rpm), à 120ºC
durante 17 min. Após a reação, o resíduo sólido obtido foi separado por centrifugação, lavado
com água até pH neutro e secado em estufa a 50 ± 5ºC até atingir um teor de umidade de
aproximadamente 50%. Posteriormente, esse material foi submetido a uma hidrólise alcalina
realizada no mesmo reator, utilizando uma solução de NaOH 2% (p/v) numa relação
sólido:líquido de 1:20 g:ml, à 121ºC durante 1,5 h. Após esse tempo, todo o conteúdo do
reator foi rapidamente descarregado em um recipiente de aço inoxidável imerso em banho de
gelo. O material sólido residual foi separado do licor por filtração em tecido 100% poliéster,
lavado com água para remover a soda residual e secado em estufa a 50 ± 5ºC até atingir um
47
teor umidade de 10%.
Tratamento 2 (XIAO; SUN, SUN, 2001): O bagaço de malte foi submetido a uma hidrólise
alcalina utilizando uma solução de NaOH 4% (p/v) numa relação sólido:líquido de 3:50 g:ml.
A reação foi realizada em frascos Erlenmeyer de 6 l (volume total) os quais foram mantidos
em incubadora de movimento rotatório (Cientec CT 713) a 120 rpm, 30ºC durante 18 h. Ao
término da reação, o resíduo sólido obtido foi separado do licor por filtração em tecido 100%
poliéster, lavado com água até pH neutro e secado em estufa a 50 ± 5ºC até atingir 10% de
umidade.
Tratamento 3 (BRÁNYIK et al. 2002): O bagaço de malte foi inicialmente tratado com
uma solução de HCl 3% (v/v) numa relação sólido:líquido de 1:15 g:ml. Essa etapa foi
realizada em um tanque de aço inoxidável de 125 l (volume total) sob agitação de 32 rpm, à
60oC durante 2,5 h. Após esse tempo, o material sólido residual foi separado por filtração em
tecido 100% poliéster, lavado com água até pH neutro e secado em estufa elétrica a 50 ± 5ºC,
até atingir aproximadamente 10% de umidade. Posteriormente, esse material foi tratado com
uma solução de NaOH 2% (p/v), numa relação sólido:líquido de 3:50 g:ml. Essa reação foi
conduzida em frascos Erlenmeyer de 6 l (volume total) os quais foram mantidos em
incubadora de movimento rotatório (Cientec CT 713) a 120 rpm, 30oC durante 24 h.
Finalmente, o resíduo sólido obtido foi separado do licor por filtração em tecido 100%
poliéster, lavado com água até pH neutro e secado em estufa a 50 ± 5ºC até atingir 10% de
umidade.
Uma vez escolhido o tratamento para preparo do bagaço de malte, o material parcialmente
deslignificado foi moído em moinho de facas (Manesco & Ranieri Ltda) e posteriormente
peneirado. Apenas as partículas que passaram em peneira de 16 mesh (abertura 1,0 mm) e que
ficaram retidas na de 28 mesh (abertura 0,6 mm), foram as escolhidas para uso como suporte
de imobilização durante a fermentação contínua.
48
3.2 CARACTERIZAÇÃO DOS MATERIAIS AVALIADOS COMO SUPORTE DE
IMOBILIZAÇÃO
O bagaço de malte na forma original (não tratado) e os três materiais obtidos a partir de seu
tratamento para preparo como suporte de imobilização, foram caracterizados quanto aos
teores de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas, baseando-se nas metodologias descritas por
Browning (1967) e Rocha (2000). Todas as análises foram feitas em triplicata e os
procedimentos realizados encontram-se descritos a seguir.
3.2.1 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UNIDADE
Amostras de aproximadamente 1 grama do bagaço de malte foram colocadas em uma balança
com secagem por ação de raios infravermelhos (Denver Instrument IR30). As amostras foram
mantidas a 100ºC até obter peso constante e a umidade do bagaço de malte foi então
determinada pela diferença de peso obtida antes e após o aquecimento.
3.2.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CELULOSE, HEMICELULOSE E LIGNINA
Aproximadamente 2 gramas de cada material foram transferidas para um béquer de 50 ml
contendo 10 ml de H2SO4 72% (p/p). A reação foi mantida em banho termostatizado a 45 ±
1°C, por 7 min, sob agitação constante. Após esse tempo, a reação foi interrompida pela
adição de 50 ml de água destilada e todo o conteúdo do béquer foi transferido para um frasco
Erlenmeyer de 500 ml, onde o volume total de água foi elevado para 275 ml. Em seguida, o
Erlenmeyer foi fechado com papel alumínio e autoclavado a 1 atm, 121°C durante 45 min,
49
para que ocorresse uma hidrólise completa dos oligômeros restantes. Após autoclavagem, o
frasco foi resfriado até temperatura ambiente e o material sólido foi separado da fração líquida
por filtração utilizando papel de filtro previamente tarado. O hidrolisado foi recolhido em um
balão volumétrico de 500 ml e o sólido contido no papel de filtro foi lavado com água
destilada até atingir o volume do balão. A lignina retida no papel de filtro foi lavada ainda
com cerca de 800 ml de água destilada e secada em estufa à 105°C até atingir peso constante
(aproximadamente 2 h). A relação entre o peso do resíduo e o peso inicial da amostra foi
utilizada para determinar a porcentagem de lignina insolúvel presente no material. A fração
líquida obtida foi analisada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para
determinação das concentrações de glicose, xilose e arabinose, as quais foram utilizadas para
o cálculo da porcentagem de celulose e hemicelulose presente na amostra (IRICK et al.,
1988). Para determinação da lignina solúvel, uma alíquota de 5 ml do hidrolisado foi
alcalinizada com 1 ml de NaOH 6M até atingir pH 12, diluída em balão volumétrico de 50 ml
e analisada por espectroscopia de UV (espectrofotômetro Beckman DU 640B) a um
comprimento de onda de 280 nm. Amostras do hidrolisado foram também analisadas por
CLAE para determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural, as quais
juntamente com a leitura de absorbância, foram empregadas para calcular a porcentagem de
lignina solúvel na amostra (APÊNDICE A).
Nas análises por CLAE, as concentrações de glicose, xilose e arabinose foram determinadas
utilizando um equipamento Waters, nas seguintes condições: coluna Bio-Rad Aminex HPX-
87H (300 x 7,8 mm); temperatura: 45°C; eluente: H2SO4 0,01N; fluxo 0,6 ml/min; volume de
amostra: 20 µL; detector: índice de refração. Antes da determinação por CLAE as amostras
foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 min, e os sobrenadantes foram devidamente diluídos
com água deionizada e passados por filtros C18 Sep-Pack Cartridge (Waters Associate –
Millipore). As concentrações destes compostos foram calculadas a partir de curvas de
50
calibração obtidas de soluções padrão. As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural
foram determinadas no mesmo equipamento, porém utilizando uma coluna Waters Resolve
C18 5 µm (3,9 x 300 mm); temperatura ambiente; eluente: acetonitrila/água (1/8 com 1% de
ácido acético), degaseificado; fluxo 0,8 ml/min; volume de amostra: 20 µl; e detector UV a
276 nm. As amostras foram previamente diluídas com água deionizada e filtradas em
membranas do tipo HSWP com poros de 0,45 µm (Waters Associates – Millipore). As
concentrações destes compostos foram calculadas a partir de curvas de calibração obtidas de
soluções padrões.
3.2.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS
Para determinação de teor de cinzas do bagaço, cerca de 1 grama da amostra foi colocada em
um cadinho de porcelana previamente tarado e aquecida em mufla elétrica à 800°C por 2 h.
As cinzas foram determinadas pela diferença de peso das amostras, antes e após a incineração.
Antes de serem pesadas, as amostras foram colocadas em um dessecador por 50 min.
3.3 MICRORGANISMO
O microrganismo utilizado nos experimentos foi uma levedura cervejeira Saccharomyces
cerevisiae tipo lager, doada pelo Instituto de Invertigaciones para la Industria Alimentícia
(Habana/Cuba). A cultura estoque foi mantida repicada em tubos de ensaio contendo ágar
malte inclinado e conservada sob refrigeração à 4ºC. Repiques com cerca de 24 h foram
utilizados para o preparo dos inóculos.
3.4 PREPARO DO INÓCULO
51
3.4.1 ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER
O meio utilizado para crescimento do inóculo foi preparado de forma a se obter a composição
dada na Tabela 3.1. Inicialmente foram preparadas duas soluções com o pH ajustado em 5,0
pela adição de ácido lático: uma solução contendo os sais e o extrato de levedura e outra
contendo adjunto com alto teor de maltose. A primeira solução foi esterilizada a 121°C por
20 min e a segunda foi autoclavada a 112°C por 15 min. Essas soluções foram então
misturadas assepticamente de forma a se obter a concentração desejada de cada nutriente no
meio de cultura.
Tabela 3.1 - Composição do meio utilizado para crescimento do inóculo nos ensaios em frascos Erlenmeyer.
Componente Concentração (g/l)
KH2PO4 5,0 (NH4)2SO4 2,0 MgSO4.7H2O 0,4 Extrato de levedura 5,0 Adjunto com alto teor de maltose 140,0
O inóculo foi preparado transferindo as células de dois tubos de repique para dois frascos
Erlenmeyer de 125 ml contendo 50 ml do meio descrito na Tabela 3.1. A transferência das
células foi feita em condições assépticas através da lavagem dos tubos de repique com o
próprio meio para crescimento do inóculo. Os frascos inoculados foram incubados à 30ºC em
agitador rotatório (Cientec CT 713) a 200 rpm durante 18 h. Após este tempo as células foram
separadas por centrifugação a 3500 rpm durante 20 min, lavadas com água destilada
esterilizada e novamente centrifugadas a 3500 rpm por 20 min. Finalmente, as células foram
ressuspensas em um certo volume de meio (Tabela 3.1) de forma a se obter uma suspensão, a
partir da qual foi calculado o volume necessário para fornecer uma concentração celular
52
inicial de 1 g/l no meio de fermentação.
3.4.2 ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT”
O meio utilizado para crescimento do inóculo foi preparado de forma a se obter a composição
dada na Tabela 3.2. Inicialmente foram preparadas duas soluções com o pH ajustado em 5,0
pela adição de ácido lático: uma solução contendo os sais e o extrato de levedura e outra
contendo adjunto com alto teor de maltose. A primeira solução foi esterilizada a 121°C por
20 min e a segunda foi autoclavada a 112°C por 15 min. Essas soluções foram então
misturadas assepticamente de forma a se obter a concentração desejada de cada nutriente no
meio de cultura.
Tabela 3.2 - Composição do meio utilizado para crescimento do inóculo nos ensaios em reator “airlift”.
Componente Concentração (g/l)
KH2PO4 5,0 (NH4)2SO4 2,0 MgSO4.7H2O 0,4 Extrato de levedura 1,0 Adjunto com alto teor de maltose 80,0
O inóculo foi preparado transferindo as células de dois tubos de repique para um frasco
Erlenmeyer de 1000 ml com 500 ml do meio descrito na Tabela 3.2. A transferência das
células foi feita em condições assépticas através da lavagem dos tubos de repique com o
próprio meio para crescimento do inóculo. Os frascos inoculados foram incubados à 30ºC em
agitador rotatório (Cientec CT 713) a 200 rpm durante 18 h. Após este tempo as células foram
separadas por centrifugação a 3500 rpm durante 20 min, lavadas com água destilada
esterilizada e novamente centrifugadas a 3500 rpm por 20 min. Finalmente, as células foram
ressuspensas em um certo volume de meio (Tabela 3.2) de forma a se obter uma suspensão, a
53
partir da qual foi calculado o volume necessário para fornecer uma concentração celular
inicial de 1 g/l no meio de fermentação.
3.4.3 ENSAIOS EM REATOR DE COLUNA DE BOLHAS
O inóculo foi preparado transferindo as células de dois tubos de repique para dois frascos
Erlenmeyer de 500 ml contendo 250 ml de mosto 100% malte com concentração de extrato
original de 10ºP. A transferência foi feita em condições assépticas através da lavagem dos
tubos de repique com o próprio mosto. Os frascos inoculados foram incubados à 30ºC em
agitador rotatório (Cientec CT 713) a 200 rpm durante 30 h. Após este tempo as células foram
separadas por centrifugação a 3500 rpm durante 20 min, lavadas com água destilada
esterilizada e novamente centrifugadas a 3500 rpm por 20 min. Finalmente, as células foram
ressuspensas em um certo volume de mosto de forma a se obter uma suspensão a partir da
qual foi calculado o volume necessário para fornecer uma concentração celular inicial de 1 g/l
no meio de fermentação.
3.5 PREPARO DOS MEIOS DE FERMENTAÇÃO
3.5.1 MEIO SINTÉTICO PARA ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER
O meio sintético utilizado nas fermentações descontínuas conduzidas em frascos Erlenmeyer
apresentou a mesma composição do meio empregado para crescimento do inóculo dado na
Tabela 3.1, sendo preparado de acordo com a metodologia descrita no item 3.4.1.
54
3.5.2 MEIO SINTÉTICO PARA ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT”
O meio sintético utilizado na fermentação contínua conduzida em reator “airlift” apresentou a
mesma composição do meio empregado para crescimento do inóculo dado na Tabela 3.2,
sendo preparado de acordo com a metodologia descrita no item 3.4.2.
3.5.3 ELABORAÇÃO DOS MOSTOS 100% MALTE E MALTE COM ADJUNTO
Para a elaboração dos mostos foram utilizadas matérias-primas das seguintes procedências:
Água: a água utilizada foi obtida do poço artesiano localizado no Campus I da EEL/USP.
Malte: o malte utilizado foi o malte claro do tipo Pilsen doado pela empresa Malteria do
Vale SA.
Lúpulo: foram utilizados dois tipos de lúpulo da marca Hopsteiner doados pela empresa
Wallerstein Industrial e Comercial Ltda: lúpulo aromático (na forma de “pellets”, tipo 90,
com aproximadamente 7% de α-ácidos) e lúpulo de amargor (na forma de extrato, extraído
com CO2, com aproximadamente 30% de α-ácidos).
Adjunto: foi utilizado o adjunto desidratado com alto teor de maltose obtido a partir de
milho (MOR-REX®1557), doado pela empresa Corn Products Brasil. As especificações
físico-químicas e a composição aproximada de açúcares deste adjunto estão apresentadas nas
Tabelas A.1 e A.2 do ANEXO A.
Os mostos 100% malte com diferentes concentrações de extrato original foram obtidos
através da diluição com água esterilizada, de um mosto base com uma concentração de extrato
original de 20ºP elaborado apenas com malte. Da mesma forma, os mostos com malte e
adjunto com diferentes concentrações de extrato original foram preparados a partir de
55
diluições de um mosto base com uma concentração de extrato original de 22ºP, elaborado
com 74% de malte e 26% de adjunto com alto teor maltose. Para o preparo dos mostos base
foram realizadas as seguintes etapas:
3.5.3.1 Mosturação
Esta operação foi realizada em um tanque de aço inoxidável de 125 l de capacidade total
provido de agitador (32 rpm), aquecimento elétrico, controlador e indicador digital de
temperatura e isolamento térmico (Figura 5). Para elaboração do mosto, o malte foi moído em
moinho de martelo e misturado com água (denominada água primária) à 35ºC na
concentração de 318 g/l. A essa mistura foi adicionado CaCl2 na proporção de 1,26 g/kg de
malte. Em seguida, o pH foi ajustado em 5,4 pela adição de H3PO4 85% (p/p).
Figura 5. Caldeira de mostura utilizada durante etapa de mosturação.
Durante o processo, a temperatura foi aumentada de 35 para 76ºC de acordo com o seguinte
perfil: 35ºC (mantido por 25 min), 45ºC (10 min), 52ºC (10 min), 62ºC (20 min), 72ºC
56
(20 min), 76ºC (10 min). Ao atingir 72ºC, foi realizado um teste com solução de iodo 0,02 N a
fim de verificar o término da sacarificação do malte (Figura 6). Depois de confirmada a
completa hidrólise do amido, pela ausência da coloração roxo-azulada característica da reação
com a solução de iodo (em temperatura ambiente), o meio foi aquecido até 76ºC com o
objetivo de inativar as enzimas presentes.
Figura 6. Teste do iodo. (A) presença de amido, (B) ausência de amido.
3.5.3.2 Filtração
A filtração da mostura para obtenção do mosto foi realizada em um recipiente de aço
inoxidável (tina de filtração) com capacidade de 120 l, contendo agitador, disco filtrante com
ranhuras e isolamento térmico (Figura 7). Nesta etapa, a casca do malte acumulada na parte
inferior da tina de filtração atuou como uma camada filtrante.
A B
57
Figura 7. Tina de filtração utilizada durante a etapa de filtração do mosto.
No preparo do mosto base com adjunto, após a filtração, a camada filtrante foi lavada com
100 l de água (denominada água secundária) à 75ºC.
3.5.3.3 Fervura
Após a filtração, o mosto foi transferido para o recipiente de fervura, um tanque encamisado
de 250 l de capacidade total, provido de aquecimento elétrico e isolamento térmico (Figura 8).
Na elaboração do mosto base com malte e adjunto, o adjunto com alto teor de maltose foi
adicionado no início da fervura, em uma relação adjunto:malte de 1:2,8. Cerca de 15 a 20 min
depois de iniciada a fervura o mosto foi suplementado com o lúpulo de amargor (extrato) em
uma proporção de 0,17 g/l de mosto no início da fervura. O mosto foi mantido em fervura
durante 90 min, permitindo uma evaporação máxima de até 20% do volume inicial. Faltando
15 min para o término da fervura foi adicionado o lúpulo aromático (em “pellets”), em
quantidade suficiente (0,95 g/l de mosto no início da fervura) para se obter, junto com o
lúpulo de amargor, uma concentração de 18 BU (unidades de amargor) na cerveja após a sua
58
diluição final.
Figura 8. Caldeira de fervura utilizada durante a etapa de cozimento do mosto.
3.5.3.4 Autoclavagem
Finalizada a etapa de fervura, o mosto foi transferido para recipientes de aço inoxidável
(barris de 30 ou 50 l), autoclavado à 112ºC por 15 min e posteriormente armazenado em
câmara refrigerada à 5ºC pelo tempo mínimo de 1 semana, prévio a sua utilização nos
experimentos. A autoclavagem do mosto teve como objetivo, além de manter a assepsia do
meio, favorecer a formação do complexo entre proteínas e polifenóis a quente (“trub” quente).
Por outro lado, a posterior manutenção em uma baixa temperatura do mosto autoclavado
visou à formação do complexo proteínas-polifenóis a frio (“trub” frio).
3.5.3.5 Armazenamento durante a fermentação contínua
Para separar do líquido os sedimentos (“trub”) formados a quente e a frio, o mosto foi filtrado
59
em placas de celulose (Leitz KS80), passando dos barris para um tanque de aço inoxidável de
180 l, pelo uso de pressão de CO2. Depois de filtrado, o mosto foi diluído com água
esterilizada até atingir a concentração de extrato original desejada em cada experimento e
mantido à 4ºC sob atmosfera de nitrogênio (0,2 atm) durante a fermentação contínua.
3.6 CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO
3.6.1 ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER
Estas fermentações foram realizadas por processo descontínuo em frascos Erlenmeyer de
125 ml contendo 50 ml do meio de fermentação e uma concentração inicial de células de
1 g/l. Os ensaios em presença do suporte foram realizados adicionando em cada frasco 1 g de
bagaço de malte esterilizado. Todas as fermentações foram conduzidas em duplicata, em
agitador rotatório (Cientec CT 713) à 15ºC, 120 rpm durante 110 h.
3.6.2 ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT”
3.6.2.1 Características do reator
Nesta etapa do trabalho foi utilizado um reator “airlift” cilíndrico de vidro com circulação
interna (de tubos concêntricos), de 7 l de capacidade total (Figura 9). A injeção de ar foi
efetuada pelo fundo do reator através de um tubo de 1 mm de diâmetro, utilizando ar filtrado
em membrana de 0,2 μm (Midisart 2000 – Sartorius). A temperatura da fermentação foi
mantida constante colocando o reator dentro de uma incubadora refrigerada. A alimentação do
mosto foi realizada pela parte inferior do reator, por meio de uma bomba peristáltica
60
(Masterflex C/L Modelo 77120-62, Cole-Parmer). No tubo de descarga (saída da cerveja
fermentada) foi colocada uma malha de aço inoxidável de 60 mesh (abertura 0,26 mm) para
evitar a perda do suporte. Outras características e dimensões deste reator estão apresentadas
na Figura do APÊNDICE C.
Figura 9. Reator “airlift” utilizado nos experimentos.
3.6.2.2 Operação inicial e processo fermentativo
Antes de realizar o processo fermentativo, o reator “airlift” foi esterilizado à 121ºC por
30 min. Posteriormente, o reator foi preenchido com uma suspensão esterilizada (121ºC,
20 min) contendo 60 g do suporte e 3 l de água destilada, sob aeração de 1,0 ± 0,2 l/min. O
reator contendo o suporte foi lavado continuamente com 50 l de água estéril e em seguida
alimentado com o meio sintético até se obter uma concentração de extrato de
aproximadamente 10ºP, quando foi então inoculado com a suspensão de leveduras.
No início da fermentação (do tempo 26 a 74 h), a qual foi realizada por processo contínuo, o
61
reator foi alimentado com o meio sintético utilizando uma taxa de diluição de 0,2 h-1.
Posteriormente, a taxa de diluição foi reduzida para 0,14 h-1 e a partir das 98 h de fermentação
o reator passou a ser alimentado continuamente com um mosto 100% malte de 7,5ºP. Ao
atingir 125 h de fermentação a taxa de diluição foi reduzida para 0,1 h-1, sendo mantida até as
175 h de processo, quando foi reduzida para 0,04 h-1.
A partir do tempo de 290 h, o mosto que alimentava o reator foi substituído por um mosto
100% malte com uma concentração de extrato original de 11,3ºP, porém, a taxa de diluição
foi mantida em 0,04 h-1 até o final da fermentação (362 h). Durante todo o experimento, a
temperatura foi mantida em 15ºC, o fluxo de ar foi de 0,8 ± 0,2 l/min e o volume de trabalho
utilizado foi de 3,7 l.
3.6.3 ENSAIOS EM REATOR DE COLUNA DE BOLHAS
3.6.3.1 Características do reator
As fermentações das cervejas de altas densidades foram conduzidas em um reator de coluna
de bolhas construído em aço inoxidável de 9,7 l de capacidade total (Figura 10).
A injeção de gases foi efetuada pelo fundo do reator através de uma malha de aço inoxidável
de 60 mesh (abertura 0,26 mm) que atuou como dispersor de bolhas. O ar e o CO2 foram
filtrados com membranas de 0,2 μm (Midisart 2000 – Sartorius) e os fluxos controlados com
medidores de fluxo mássicos (Aalborg GFM 17). A temperatura da fermentação foi mantida
constante através da circulação da água de um banho termostatizado pela camisa de
refrigeração. A alimentação do mosto foi realizada pela parte inferior do reator, por meio de
uma bomba peristáltica (Masterflex C/L Modelo 77120-62, Cole-Parmer). Na seção anterior
ao tubo de descarga (saída da cerveja fermentada) foi colocada uma malha de aço inoxidável
62
de 60 mesh (abertura 0,26 mm) para evitar a perda do suporte. Nos APÊNDICES D e E
encontram-se detalhadas as dimensões e características desse reator.
Figura 10. Reator de coluna de bolhas utilizado nos experimentos.
3.6.3.2 Operação inicial e processo fermentativo
A esterilização do reator de coluna de bolhas foi realizada pela injeção direta de vapor à 1 atm
(121ºC) por 30 min. Posteriormente, o reator foi preenchido com 100 g do suporte e mantido
por mais 30 min sob esterilização com vapor direto (1 atm). Após esse tempo o reator
contendo o suporte foi lavado continuamente com 50 l de água estéril e em seguida
alimentado com o mosto base diluído até se obter a concentração de extrato desejada no início
63
da fermentação, quando foi então inoculado com a suspensão de leveduras. Com exceção da
fermentação contínua dos mostos com malte e adjunto, onde foi utilizado mosto base com
adjunto diluído no início do processo fermentativo, em todos os outros experimentos foram
utilizados mosto base 100% malte diluídos durante a operação inicial do reator.
No início das fermentações contínuas (nas primeiras 18-20 h), os experimentos foram
conduzidos em regime descontínuo visando o aumento na concentração de células dentro do
reator. Nesta etapa o reator foi alimentado continuamente com mosto diluído (10,3 - 10,7ºP),
mantendo constantes a temperatura de fermentação (30oC) e o fluxo de ar (250 ml/min) até
atingir uma concentração de biomassa imobilizada suficientemente elevada
(> 0,3 g cél/g sup). Após esse tempo, o mosto diluído foi substituído pelos mostos com as
concentrações de extrato original requeridas para cada condição da fermentação.
No ensaio para avaliação do efeito da temperatura, o reator foi alimentado com mosto 100%
malte com concentração de extrato original de 15ºP, mantendo constante o fluxo de gases
(240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar) e a taxa de diluição (0,05 h-1) durante todo o processo
(60 dias). As temperaturas avaliadas foram 7, 10 e 15ºC.
No ensaio para avaliação do efeito da concentração de extrato original de mostos 100% malte,
foram utilizados mostos com concentrações de 13,4, 15,3, 16,6 e 18,5ºP. A taxa de diluição
(0,04 h-1), a temperatura (15ºC) e o fluxo de gases (200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar)
foram mantidos constantes durante todo o processo (23 dias).
No ensaio para avaliação do efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e
adjunto, foram utilizados mostos com concentrações de 14,3, 15,2 e 19,6ºP. A taxa de
diluição (0,04 h-1), a temperatura (15ºC) e o fluxo de gases (200 ml/min de CO2 e 50 ml/min
de ar) foram mantidos constantes durante todo o processo (20 dias).
Em todos os ensaios, o volume de trabalho utilizado foi de 5,2 l.
64
3.7 ACOMPANHAMENTO ANALÍTICO DOS EXPERIMENTOS
O acompanhamento das fermentações foi realizado por retiradas periódicas de amostras para
as seguintes determinações:
3.7.1 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS IMOBILIZADAS
A concentração de células imobilizadas no suporte foi determinada de acordo com a
metodologia descrita por Brányik et al. (2002). Uma amostra do meio de fermentação
contendo aproximadamente 1 g de biocatalisador imobilizado (levedura + suporte) foi retirada
de dentro do reator e colocada em uma proveta. O líquido sobrenadante (cerveja) foi
removido e o suporte lavado com 200 ml de água destilada. Em seguida, o suporte foi filtrado
e lavado com 400 ml de água destilada em uma malha de aço inoxidável de 60 mesh (abertura
0,26 mm), sendo posteriormente secado em estufa à 105ºC por 12 h. Aproximadamente 0,5 g
do biocatalisador seco foi adicionado em um frasco Erlenmeyer contendo 100 ml de uma
solução de NaOH 3% (p/v), onde foi mantido à 30ºC, por 24 h, sob agitação de 120 rpm.
Durante esse tempo, as células que estavam aderidas no suporte foram removidas, sendo isso
verificado por observação direta em microscópio. O suporte livre de células foi então filtrado
em malha de aço inoxidável de 100 mesh (abertura 0,15 mm) e após lavagem com 400 ml de
água destilada foi secado em estufa à 105ºC durante 5 h. A massa de células imobilizadas foi
determinada pela diferença de peso antes e depois do tratamento do suporte com NaOH. A
diferença do peso devido à perda de massa do próprio suporte durante o tratamento com
NaOH foi determinada realizando o mesmo procedimento para uma amostra do suporte sem
leveduras imobilizadas. Este valor foi desconsiderado da diferença total de massa observada,
restando apenas o valor referente à massa de células imobilizadas.
65
3.7.2 CONCENTRAÇÃO E VIABILIDADE DE CÉLULAS LIVRES
A concentração de células livres (não imobilizadas) em suspensão foi determinada através de
duas técnicas:
Por peso seco (expresso em g/l), após lavagem das células com água destilada e posterior
secagem em estufa à 105ºC até peso constante.
Por contagem em câmara de Neubauer (1/400 mm2 x 1/10 mm), expresso em cél/ml.
A viabilidade celular foi determinada pelo Método Internacional de Coloração com azul de
metileno, segundo as normas da ASBC (1996).
3.7.3 CONCENTRAÇÕES DE EXTRATO ORIGINAL, APARENTE E REAL, ETANOL E GRAU APARENTE
E REAL DE FERMENTAÇÃO
As concentrações de extrato original, aparente e real (ºP), etanol (% v/v) e os graus aparente e
real de fermentação (%), foram determinados em um equipamento específico para análise de
cervejas, Beer Analyser DSA 5000 (Anton-Paar, Austria). Antes de serem injetadas no
aparelho, as amostras retiradas na saída do reator foram degaseificadas através de agitação
vigorosa durante 5 min e centrifugadas a 3500 rpm por 15 min.
3.7.4 CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO AMINO LIVRE (FAN)
A concentração de nitrogênio amino livre (FAN) nas amostras foi determinada de acordo com
as normas da ASBC (1996), utilizando o método da ninidrina e leitura da absorção das
amostras a 570 nm (espectrofotômetro Hitachi Modelo U-1800).
66
3.7.5 CONCENTRAÇÃO DE DIACETILO, ÉSTERES E ÁLCOOIS SUPERIORES
As concentrações de diacetilo, ésteres e álcoois superiores nas amostras foram determinadas
por cromatografia gasosa na empresa FEMSA Cerveja Brasil. Para quantificação da
concentração de diacetilo (2,3-butanodiona) foi utilizada a técnica de amostragem do
“headspace” seguido por separação cromatográfica capilar e detecção por captura de elétrons,
de acordo com as normas da EBC (2004). Para as concentrações de acetato de etila, acetato de
isoamila, hexanoato de etila, n-propanol, isobutanol e álcoois amílico + isoamílico foi
empregado o método de amostragem do “headspace”, com detector de ionização de chama,
também de acordo com as normas da EBC (2004).
3.7.6 PH
Os valores de pH foram determinados por potenciometria em um aparelho da marca Benchtop
(Istek, Inc) modelo Eco Met P25, com correção de temperatura.
3.7.7 CONTAMINAÇÃO BACTERIANA
Observações em microscópio ótico, das amostras de cerveja na saída do reator e do mosto no
tanque de armazenamento, foram realizadas para verificar a possível presença de bactérias.
Para diferenciar as bactérias em gram-positivas e gram-negativas foi realizado o procedimento
de coloração de Gram conforme descrito por Tortora, Funke e Case (2005).
67
3.7.8 FOTOMICROGRAFIAS
As fotomicrografias das partículas do suporte foram feitas no Departamento de Materiais
(DEMAR) da EEL/USP, em um microscópio eletrônico de varredura da marca Leo 1450VP,
utilizado nos modos elétrons secundários (VPSE) e elétrons retro-espalhados (QBSD). Assim
que retirada do reator, a amostra de bagaço de malte com as leveduras imobilizadas foi
filtrada e lavada com 400 ml de água destilada em uma malha de aço inoxidável de 60 mesh
(abertura 0,26 mm), sendo em seguida secada à 50ºC durante 24 h. As partículas secas do
suporte foram aderidas sobre fitas dupla face de carbono dispostas em um disco de alumínio.
Todas as análises foram realizadas utilizando baixo vácuo (40 Pa).
3.8 METODOLOGIA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os parâmetros fermentativos avaliados durante os diferentes ensaios foram calculados de
acordo com Mozer (1985) e ASBC (1996).
O extrato original (também conhecido como extrato primitivo, densidade primitiva ou mosto
original) é a soma de todas as substâncias dissolvidas no mosto antes da fermentação
(KUNZE, 1996). O extrato real é a quantidade de extrato que permanece na cerveja
fermentada determinado após remoção, por destilação, do álcool presente. Quando a
concentração de extrato da cerveja fermentada é determinada através de um hidrômetro, a
leitura em ºP é aparente devido à presença de um novo composto, o álcool. O álcool, por ser
menos denso, causa uma leitura relativa em ºP ou aparente do extrato (WALLIN, 2006).
68
3.8.1 PARÂMETROS FERMENTATIVOS DE PROCESSOS DESCONTÍNUOS
Grau aparente de fermentação (%): GAF = 100*(Eo – Ea)/ Eo
Grau real de fermentação (%): GRF = 100*(Eo – Er)/ Eo
Velocidade de consumo de extrato (g/l h): Rs = (Eo – Er)/t
Produtividade volumétrica em etanol (g/l h): Rp = P/t
Velocidade específica máxima de crescimento celular (h-1): μX máx = (dX/X*dt)máx
Velocidade específica máxima de consumo de extrato (g ext/g cél h): μS máx = (dE/X*dt)máx
Velocidade específica máxima de produção de etanol (g et/g cél h): μP máx = (dP/X*dt)máx
Onde: t (h) = tempo de fermentação; Eo (g/l) = concentração de extrato original do mosto; Ea
(g/l) = concentração de extrato aparente da cerveja; Er (g/l) = concentração de extrato real da
cerveja; P (g/l) = concentração de etanol; X (g/l) = concentração de células em suspensão no;
dX (g/l) = concentração de células em suspensão geradas no instante dt; dE (g/l) =
concentração de extrato consumido no instante dt; dP (g/l) = concentração de etanol
produzido no instante dt.
As velocidades específicas máximas foram calculadas utilizando as equações do método
geométrico de cálculo de derivadas proposto por Le Duy e Zajic (1973).
3.8.2 PARÂMETROS FERMENTATIVOS DE PROCESSOS CONTÍNUOS
Vazão específica de alimentação ou taxa de diluição (h-1): D = F/V
Tempo de residência no reator (h): tR = 1/D
Grau aparente de fermentação (%): GAF = 100*(Eo – Ea)/ Eo
Grau real de fermentação (%): GRF = 100*(Eo – Er)/ Eo
69
Velocidade de consumo de extrato (g/l h): Rs = (Eo – Er)*D
Produtividade volumétrica em etanol (g/l h): Rp = P*D
Velocidade específica de consumo de extrato (g ext/g cél h): μs = (Eo – Er)*D/Xtot
Velocidade específica de produção de etanol (g et/g cél h): μp = P*D/Xtot
Onde: F = vazão volumétrica de alimentação do meio (l/h); V = volume de meio no reator (l);
Eo = concentração de extrato original do mosto (g/l); Ea = concentração de extrato aparente
da cerveja na saída do reator (g/l); Er = concentração de extrato real da cerveja na saída do
reator (g/l); P = concentração de etanol na saída do reator (g/l); Xtot = concentração de células
totais (livres + imobilizadas) dentro do reator (g/l).
3.9 ANÁLISE SENSORIAL – TESTE TRIANGULAR
Esta análise foi realizada com a cerveja produzida durante a fermentação contínua do mosto
100% malte de 18,5ºP, à 15ºC, com um fluxo constante de gases (25 ml/min de ar e
300 ml/min de CO2) e uma taxa de diluição de 0,025 h-1. Assim que produzida, a cerveja foi
mantida em um tanque de aço inoxidável (volume total = 25 l) refrigerado à 2ºC, durante 2
semanas. Após esse período de maturação, a cerveja foi filtrada e diluída com água
esterilizada para obter uma concentração de etanol de 4,7% (v/v). Posteriormente, a cerveja
diluída foi mantida durante 24 h à 0ºC sob 2 atm de pressão de CO2, sendo em seguida
engarrafada em recipientes de 600 ml. A cerveja foi então pasteurizada em banho-maria à
60ºC durante 30 min e depois colocada em geladeira até o momento da análise.
O teste triangular foi utilizado para avaliar se existia diferença de sabor entre essa cerveja
produzida pelo processo contínuo e uma cerveja de mercado produzida pelo processo
descontínuo.
70
Os testes foram realizados em cabines individuais iluminadas com uma luz vermelha. As
amostras foram servidas em copos plásticos descartáveis de 250 ml, codificados com números
aleatórios de três dígitos, contendo 100 ml de cerveja à 5ºC. Cada provador recebeu três
amostras codificadas, sendo instruído que duas eram idênticas e uma era diferente. Além das
amostras, cada provador recebeu também uma ficha de avaliação (APÊNDICE B). Foi
solicitado então aos provadores avaliar cada produto, da esquerda para a direita, e selecionar a
amostra diferente marcando na ficha de avaliação. A ordem de apresentação das amostras foi
casualizada e balanceada de acordo com o seguinte delineamento: ABA, BAB, AAB, BBA,
ABB e BAA. A análise estatística dos resultados foi baseada no número de julgamentos
corretos comparado ao número de julgamentos totais (30 pessoas participaram como
provadores). A significância estatística do teste triangular foi obtida a partir de uma tabela
específica desse método, publicada pela ASBC (1996).
71
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 PREPARO DO BAGAÇO DE MALTE PARA USO COMO SUPORTE DE
IMOBILIZAÇÃO
Diversos estudos na produção de bebidas alcoólicas, tais como vinho (BALLI et al., 2003) e
cerveja (BARDI et al., 1996), têm destacado a necessidade de submeter os materiais
lignocelulósicos a um tratamento de deslignificação alcalina para que estes possam ser usados
como suporte de imobilização de leveduras. A remoção da lignina desses materiais, além de
permitir o aumento da área superficial pela formação de novos orifícios e poros, contribui
também com a imobilização celular pois favorece as forças de van der Waals, as ligações
químicas e ligações por pontes de hidrogênio entre os grupos hidroxila da celulose e os grupos
carboxila, hidroxila e amino da parede celular das leveduras (BARDI; KOUTINAS, 1994).
Para escolher a metodologia a ser empregada para o preparo do bagaço de malte, foram
testados três tratamentos de deslignificação alcalina descritos por diferentes autores (Tabela
4.1). O tratamento onde se utilizou a maior temperatura de reação (MUSSATTO et al., 2006)
permitiu uma maior remoção da lignina do bagaço de malte, porém, a estrutura do material foi
severamente danificada, tornando-se um pó. Apesar da estrutura altamente celulósica, esse pó
mostrou-se inadequado para uso como suporte de imobilização, pois em um ensaio preliminar
em reator “airlift” observou-se o acúmulo do material na superfície do meio líquido e sua
posterior perda pelo tubo de descarga do reator. Devido a estes problemas, o tratamento
descrito por Mussatto et al. (2006) não foi escolhido para preparo do bagaço de malte.
Segundo Masschelein, Ryder e Simon (1994), a utilização de reatores com partículas em
movimento, como os de leito fluidizado, requer o uso de suportes que sejam
significativamente mais densos do que o meio de fermentação, já que partículas pouco densas
72
podem ser arrastadas para a superfície.
Tabela 4.1 - Composição química (% peso seco) do bagaço de malte na forma original (não tratado) e após os tratamentos de deslignificação alcalina descrito por diferentes autores.
Composição Original Mussatto et al., (2006)a
Xiao, Sun e Sun (2001)b
Brányik et al., (2002)c
Celulose (%) 16,78 92,59 46,29 52,70 Hemicelulose (%) 28,42 0,38 16,51 14,17 Lignina (%) 27,78 6,14 22,86 21,82
Klason 22,96 4,85 20,05 19,48 Solúvel em ácido 4,82 1,29 2,81 2,34
Cinzas (%) 4,60 0,72 5,55 4,17 Outros (%)d 22,42 0,17 8,79 7,14 Condições da deslignificação alcalina: a: 2% (p/v) NaOH, 1,5 h, 45 rpm, 120ºC, 1:20 (g:ml) b: 4% (p/v) NaOH, 18 h, 120 rpm, 30ºC, 3:50 (g:ml) c: 2% (p/v) NaOH, 24 h, 120 rpm, 30ºC, 3:50 (g:ml) d: Outros, correspondem a proteínas e extrativos.
Dentre as metodologias de deslignificação alcalina que empregaram uma menor temperatura
de reação, aquela proposta por Brányik et al. (2002) foi a que proporcionou os melhores
resultados. Tal metodologia consistiu em um tratamento inicial do bagaço de malte (prévio à
hidrólise com NaOH) com HCl para hidrolisar o endosperma amiláceo residual. No entanto,
os tratamentos com ácidos diluídos são também altamente eficientes para remoção da
hemicelulose dos materiais lignocelulósicos (McMILLAN, 1994). Conseqüentemente, devido
à remoção da hemicelulose, o material torna-se mais poroso, facilitando a difusão e a
impregnação do NaOH na etapa posterior o que favorece o processo de deslignificação
(ZHAO et al., 2002). Como resultado destas duas etapas seqüenciais de tratamento, ácido e
alcalino, obteve-se um material com teores mais baixos de hemicelulose e lignina e
provavelmente mais poroso do que aquele obtido de acordo com a metodologia descrita por
Xiao, Sun e Sun (2001). Além disso, mais da metade da composição química deste material é
constituída por celulose. Todas estas características sugerem que o material obtido de acordo
com Brányik et al. (2002) é mais adequado para uso como suporte de imobilização de
73
0 20 40 60 80 100 1200
10
20
30
40
Xliv
res (g
/l)
Imobilizadas (Ensaio com bagaço)
Xim
ob (m
g cé
l/g su
p)
Tempo (h)
0
2
4
6
8
10
Livres (Ensaio com bagaço) Livres (Ensaio sem bagaço)
leveduras. Logo, este tratamento foi escolhido para o preparo do bagaço de malte no presente
trabalho.
4.2 TESTES PRELIMINARES PARA AVALIAÇÃO DO BAGAÇO DE MALTE COMO
SUPORTE DE IMOBILIZAÇÃO DE LEVEDURAS
4.2.1 ENSAIOS EM FRASCOS ERLENMEYER
Estes ensaios iniciais foram realizados em meio sintético, com o objetivo de verificar a
capacidade do bagaço de malte em atuar como suporte de imobilização da levedura cervejeira.
Ensaios em ausência do suporte (células livres) foram também realizados a fim de se
comparar o desempenho da fermentação em ambos os sistemas.
Figura 11. Concentração de células livres (Xlivres) e imobilizadas (Ximob) durante a fermentação de meio sintético em frascos Erlenmeyer.
74
Os resultados obtidos mostraram que a levedura foi capaz de se imobilizar no bagaço de malte
e que a concentração de células imobilizadas aumentou durante o processo fermentativo,
atingindo um valor máximo de 30 mg cél/g sup em 62 h de fermentação (Figura 11). Uma
análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV) revelou que a imobilização das células
no bagaço de malte ocorreu tanto na superfície como no interior dos poros do suporte
(Figura 12).
Figura 12. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas durante a fermentação de meio sintético em frascos Erlenmeyer. Ampliação: 2000 vezes.
A concentração de células livres foi similar nas duas fermentações (em presença ou não de
suporte) durante as primeiras 62 h (Figura 11), porém, a concentração de etanol foi superior
nos ensaios com suporte (Figura 13). Resultados similares foram observados durante a
fermentação descontínua de vinho com leveduras imobilizadas em serragem de madeira
75
0 20 40 60 80 100 120
60
80
100
120
140
Extrato (Ensaio com bagaço) Extrato (Ensaio sem bagaço)
Extra
to (g
/l)
Tempo (h)
0
5
10
15
20
25
Etan
ol (g
/l)
Etanol (Ensaio com bagaço) Etanol (Ensaio sem bagaço)
deslignificada (BARDI; KOUTINAS, 1994). Segundo esses autores, a velocidade de
produção de etanol em meio com células imobilizadas no material celulósico foi maior do que
em meio com células livres pois no biocatalizador imobilizado a atividade catalítica das
enzimas envolvidas no processo foi maior.
No presente trabalho, a concentração de células imobilizadas diminuiu significativamente ao
final do processo, provavelmente devido à baixa quantidade de substrato (extrato) presente no
meio de fermentação. A concentração de células livres ao final do processo foi maior no meio
sem adição do suporte (8,8 g/l), no entanto, a conversão de substrato em produto foi melhor
nos meios contendo células imobilizadas, uma vez que, uma maior concentração de etanol foi
produzida a partir de um consumo menor de extrato.
Figura 13. Consumo de extrato e produção de etanol durante a fermentação de meio sintético em
frascos Erlenmeyer.
76
0 50 100 150 200 250 300 350 4000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Xim
ob (g
cél
/g su
p); .
......
. D (h
-1)
Tempo (h)
0
1
2
3
4
5
6
Xliv
res (g
/l)
Meio sintético Mosto 7,5oP Mosto 11,3oP
4.2.2 ENSAIO EM REATOR “AIRLIFT” COM CIRCULAÇÃO INTERNA
Após a realização das fermentações descontínuas em frascos Erlenmeyer, realizou-se um
ensaio em reator “airlift” com circulação interna, para avaliar o desempenho do bagaço de
malte como suporte de imobilização da levedura cervejeira em um processo contínuo de
fermentação.
Durante as primeiras 26 h o experimento foi conduzido em regime descontínuo empregando
meio sintético com a mesma composição utilizada para preparo do inóculo. Esse intervalo de
tempo foi caracterizado por um acentuado aumento da biomassa de células livres, que passou
de 1,25 g/l para 3,39 g/l (Figura 14). Após 26 h, o reator passou a ser alimentado
continuamente com uma taxa de diluição (D) igual a 0,2 h-1.
Figura 14. Concentração de células livres (Xlivres) e imobilizadas (Ximob) durante a fermentação
contínua em reator “airlift” empregando diferentes taxas de diluição (D).
Estudos anteriores (BRÁNYIK et al., 2002) relatam que a velocidade de ligação das leveduras
77
no bagaço de malte durante a fermentação com alimentação contínua de meio sintético é
superior àquela obtida com alimentação contínua de mosto. Esse fenômeno pode ser
explicado pela competição entre as células e as proteínas do mosto, pelos sítios de adesão na
superfície do suporte. As proteínas adsorvidas formam uma camada hidrofílica nos sítios de
interação das células, atenuando a adesão das leveduras. Por esse motivo, entre 26 h e 74 h de
fermentação, a alimentação contínua do reator foi realizada com meio sintético.
Nota-se na Figura 14 que durante a aplicação da taxa de diluição de 0,2 h-1 não foi observada
adesão das células na superfície do suporte. Além disso, os resultados revelaram que o reator
operou em condições próximas às de lavagem (“wash-out”) pois a concentração de células
livres em suspensão diminuiu de 3,39 g/l para 0,33 g/l no tempo de 74 h. Por esses motivos,
diferentes taxas de diluição, inferiores a 0,2 h-1, foram utilizadas na seqüência deste processo,
visando favorecer novamente o crescimento celular e a imobilização das células nas partículas
do suporte. A redução de D para 0,14 h-1 contribuiu com o aumento da concentração de
células livres e proporcionou também a imobilização das leveduras no bagaço de malte. Logo,
a partir das 98 h de fermentação, o reator passou a ser alimentando continuamente com mosto
diluído (7,5°P). Nesta etapa observou-se que, de uma forma geral, na medida em que a taxa de
diluição foi diminuída de 0,14 para 0,04 h-1, a concentração de células imobilizadas (Ximob) foi
aumentando progressivamente, atingindo o valor máximo de 0,31 g cél/g sup, às 290 h de
fermentação (Figura 14). Neste tempo, obteve-se na saída do reator uma cerveja com uma
concentração de extrato de 2,35°P e uma concentração de etanol de 2,67% (v/v) (Figura 15).
A partir do tempo de 290 h, o mosto diluído que alimentava o reator foi substituído por um
mosto com uma concentração maior de extrato (11,3°P), porém, a taxa de diluição foi mantida
em 0,04 h-1. Nessas novas condições, a concentração de leveduras imobilizadas no final da
fermentação (362 h) atingiu um valor máximo de 0,37 g cél/g sup (Figura 14) e a cerveja na
saída do reator apresentou concentrações de extrato e etanol de 2,56°P e 4,62% (v/v),
78
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
2
4
6
8
10
12
Ext
rato
apa
rent
e (o P)
Eta
nol (
% v
/v);
pH
Tempo (h)
Meio sintético Mosto 7,5oP Mosto 11,3oP
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
......
.. D
(h-1
)
respectivamente (Figura 15). Este valor de concentração de etanol foi maior do que o valor
obtido por Brányik et al. (2002) (4,2% v/v), durante a fermentação contínua de cerveja com
leveduras imobilizadas em bagaço de malte, empregando um mosto com 13°P e D igual a
0,04 h-1. Os melhores resultados obtidos no presente trabalho podem estar relacionados com o
desempenho da levedura utilizada e/ou com a composição do mosto empregado.
Figura 15. Concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a fermentação contínua em reator “airlift” empregando diferentes taxas de diluição (D).
Observações realizadas em microscópio eletrônico de varredura (MEV) revelaram que a
distribuição das células na superfície do suporte ocorreu de forma heterogênea, com acúmulos
locais de biomassa dentro de fissuras, poros e fibras entrelaçadas, o que sugere a existência de
sítios preferenciais de ligação (Figura 16).
De acordo com Bráynik et al. (2002), o contato entre a superfície do bagaço de malte com a
superfície das leveduras resulta em interações espontâneas e energeticamente favoráveis que
levam à adesão estável das células. O acúmulo das leveduras no bagaço de malte é também
79
sustentado pela aspereza da superfície do suporte, a qual serve como proteção das células
contra as tensões de cisalhamento exercidas pela turbulência no reator (BRÁYNIK et al.,
2004c).
Figura 16. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas durante a fermentação em reator “airlift”. Ampliação: 1000 vezes.
É importante destacar que a fermentação foi finalizada em um tempo de 362 h pois a partir daí
começaram a ocorrer alguns problemas no processo, relacionados principalmente com o
acúmulo do suporte na malha localizada no tubo de descarga do reator. Tal acúmulo causou
um entupimento na saída da cerveja, provocando como conseqüência, um aumento da pressão
dentro do reator. Na etapa seguinte do trabalho, um novo reator (de coluna de bolhas) foi
então planejado, desenhado e construído especialmente para conduzir as fermentações de
cervejas de altas densidades pelo processo contínuo, de forma a evitar os problemas aqui
80
observados.
4.3 FERMENTAÇÃO PRIMÁRIA DE CERVEJAS DE ALTAS DENSIDADES POR
PROCESSO CONTÍNUO EM REATOR DE COLUNA DE BOLHAS
4.3.1 EFEITO DA TEMPERATURA
4.3.1.1 Avaliação dos parâmetros fermentativos
O desempenho da fermentação de cerveja é influenciado pelas variáveis operacionais
utilizadas, tais como a temperatura, a concentração do mosto, a concentração de oxigênio
dissolvido e a concentração inicial do inóculo, entre outras. O controle adequado dessas
variáveis é fundamental para manter um bom desempenho do processo e a qualidade do
produto (BRIGGS et al., 2004). Segundo Debourg (1993), a temperatura é uma das variáveis
mais importantes que afetam não apenas a velocidade de fermentação, mas também o sabor
das cervejas. Para avaliar o efeito da temperatura durante a fermentação primária de cervejas
de altas densidades pelo processo contínuo, realizou-se um experimento utilizando esta
variável em três diferentes níveis: 15, 10 e 7ºC. Neste experimento, o fluxo total de gases
(240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar) foi mantido constante e o reator de coluna de bolhas
foi alimentado continuamente com um mosto (100% malte) com concentração de extrato
original de 15ºP, a uma taxa de diluição constante de 0,05 h-1 (tR = 20 h). O efeito da
temperatura foi avaliado nos parâmetros fermentativos e na formação dos compostos
responsáveis pelo sabor das cervejas (compostos voláteis). Durante a fermentação, o sistema
somente foi considerado em estado estacionário para cada temperatura após um período
mínimo de 10 tempos de residência (200 h). O estado estacionário para as diferentes
81
0 10 20 30 40 50 600
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (d)
Ext
rato
apa
rent
e (o P)
; p
H
15 10 7 15
0
2
4
6
8
10
Temperatura (oC)
Eta
nol (
% v
/v)
temperaturas utilizadas pode ser verificado na Figura 17, onde se observa ao final de cada
período, para duas amostras consecutivas, uma diferença na concentração de etanol inferior a
5%.
Figura 17. Efeito da temperatura na concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,05 h-1).
O consumo de extrato aparente diminuiu com a queda da temperatura de fermentação. Logo, a
concentração de extrato no meio aumentou e, conseqüentemente, a concentração de etanol na
cerveja à saída do reator foi menor (Figura 17). Na etapa final do processo, quando a
temperatura foi aumentada de 7 para 15ºC observou-se um aumento no consumo do extrato
aparente e, portanto, uma maior concentração de etanol (6% v/v) foi obtida na cerveja
produzida. De acordo com Brányik et al. (2004a), o aumento da temperatura de fermentação
induz o crescimento celular ou aumenta o nível da atividade metabólica do microorganismo,
82
0 10 20 30 40 50 600,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (d)
Xim
ob (g
cél
/g su
p);
----
-- D
(h-1
)
15 10 7 15
0
4
8
12
16
20
24
Temperatura (oC)
X
livre
s (g/l)
;
Xim
ob (g
/l) X
tota
is (g
/l)
proporcionando desta forma um maior consumo dos açúcares do mosto e um aumento na
produção de etanol.
As variações na temperatura de fermentação influenciaram também na concentração de
células totais (Xtotal) e de células livres (Xlivres) presentes no reator (Figura 18). Em ambos os
casos, a concentração de células diminuiu à medida que a temperatura da fermentação foi
diminuída. Apesar disso, a concentração de células totais (células livres + células
imobilizadas por volume de reator) manteve-se em valores elevados (acima de 19 g/l) durante
todo o processo.
Figura 18. Efeito da temperatura na concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas (Ximob) e totais (Xtotais) durante a fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de diluição, D: 0,05 h-1).
A dependência da concentração de células livres com as diferentes temperaturas não pode ser
considerada apenas como o resultado das variações da cinética de crescimento dessas células
83
livres, pois a velocidade de crescimento das células imobilizadas também influencia Xlivres
através da perda de células das camadas de leveduras na superfície do suporte (Brányik et al.,
2004a).
Ao contrário da concentração de células livres e de células totais, a concentração de células
imobilizadas no bagaço de malte (massa de células por gramas de suporte) não foi afetada
pelas variações da temperatura de fermentação, pois continuou aumentando gradualmente até
atingir 1,16 g cél/g sup no final da fermentação. Brányik et al. (2004a) também relataram um
efeito não significativo da temperatura (de 13 a 16ºC) na concentração de leveduras
imobilizadas em bagaço de malte durante a fermentação contínua em reator “gas-lift” de
mosto com uma concentração de extrato original de 14ºP e empregando um fluxo total de
gases de 250 ml/min. Porém, nesse caso, os autores obtiveram valores similares de Ximob
(cerca de 0,65 g cél/g sup), independente da temperatura empregada. Por outro lado, apesar da
estabilidade mecânica do suporte, esses autores observaram uma desintegração gradual das
partículas de bagaço de malte, causada por colisões das partículas entre si e das partículas
com as paredes do reator. Devido à desintegração, as partículas tornaram-se menores e foram
perdidas pelo tubo de saída do reator. O estresse mecânico provocado por essas colisões pode
ter sido um dos motivos do menor valor de Ximob encontrado por esses autores, quando
comparado ao valor máximo obtido no presente estudo. De acordo com Verbelen et al.
(2006), o reator “gas-lift” proporciona uma circulação mais intensa para um mesmo fluxo de
gás do que um reator de coluna de bolhas, devido ao tubo de circulação interna que cria uma
região de “elevação” no centro do reator e uma região de “descida” por fora do tubo. Além
disso, diferenças fisiológicas entre as leveduras e as variações na composição dos mostos
utilizados são também fatores que podem estar relacionados com as diferenças nos valores de
Ximob obtidos em ambos os trabalhos. A Figura 19 mostra uma partícula do suporte com as
leveduras imobilizadas no final do experimento.
84
Figura 19. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas durante a fermentação contínua para avaliação do efeito da temperatura em reator de coluna de bolhas. Ampliação: 1500 vezes.
A viabilidade das células livres em suspensão não foi influenciada pelas variações de
temperatura, mantendo-se em torno dos 90% (Figura 20). Nessa figura observa-se também
que a concentração de células livres (em cél/ml) determinada pela contagem em câmara de
Neubauer, acompanhou as variações da concentração de células livres (em g/l) determinada
por peso seco durante a alimentação contínua de mosto com D = 0,05 h-1, numa relação média
aproximada de 1x107 cél/ml para cada g/l, ou seja, 1010 cél/g.
85
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 600,0
3,0x107
6,0x107
9,0x107
1,2x108
1,5x108
Tempo (d)
Xliv
res (c
él/m
l)
15 10 7 15
0
3
6
9
12
15
Temperatura (oC)
Xliv
res (g
/l)
V
iabi
lidad
e (%
)
Figura 20. Efeito da temperatura na viabilidade e concentração de células livres (Xlivres), determinadas
por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l), durante a fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,05 h-1).
A Tabela 4.2 apresenta os parâmetros fermentativos obtidos em função da temperatura de
fermentação no final de cada período. Observa-se nessa tabela que o consumo de nitrogênio
amino livre (FAN), os graus aparente e real de fermentação, a velocidade de consumo de
extrato e a produtividade volumétrica em etanol aumentaram com o aumento da temperatura
de fermentação do mosto. O aumento da temperatura também favoreceu a produtividade
volumétrica em etanol durante a fermentação descontínua de mostos de 15 e 20ºP
(DRAGONE et al., 2003), e a velocidade de consumo dos açúcares durante a fermentação
descontínua de mostos com aproximadamente 10ºP (ENGASSER et al., 1981). Segundo
Engasser et al. (1981), a influência da temperatura no consumo de açúcares tais como glicose
ou maltose, pode ser representada por uma dependência do tipo Arrhenius, entre a velocidade
86
máxima de consumo desses açúcares e a temperatura de fermentação.
As velocidades específicas de consumo de extrato e de produção de etanol, também
apresentaram uma relação direta com a temperatura de fermentação, sendo que, quanto maior
a temperatura utilizada, maiores foram os valores obtidos para estes parâmetros. Similar efeito
da temperatura nas velocidades específicas máximas de consumo de extrato e de produção de
etanol foi relatado por Dragone (2002) durante a fermentação descontínua de mosto com
concentração de extrato original de 15ºP em escala piloto (140 l).
Tabela 4.2 - Efeito da temperatura nos parâmetros da fermentação contínua de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,05 h-1).
Temperatura (ºC) 15
(fase inicial)10 7 15
(fase final) Etanol (% v/v) 5,5 4,8 4,0 6,0 Extrato aparente (oP) 5,2 6,0 7,5 4,2 Extrato real (oP) 7,2 7,7 8,8 6,3 Nitrogênio amino livre - FAN (mg/l)
115 125 128 109
Consumo de FAN (mg/l) 65 55 52 69 Grau aparente de fermentação (%)
65,9 59,4 49,5 72,2
Grau real de fermentação (%)
55,3 50,0 42,0 60,4
Velocidade de consumo de extrato (g/l h)
5,37 4,58 3,50 5,61
Produtividade volumétrica em etanol (g/l h)
2,14 1,83 1,40 2,24
Velocidade específica de consumo de extrato (g ext/g cél h)
0,258 0,223 0,183 0,266
Velocidade específica de produção de etanol (g et/g cél h)
0,103 0,089 0,073 0,106
4.3.1.2 Comparação com parâmetros fermentativos de fermentações descontínuas
87
Nesta etapa foram realizadas fermentações no reator de coluna de bolhas, também com
mostos com concentração de extrato original de 15ºP, a 15, 10 e 7ºC, porém em anaerobiose e
por processo descontínuo sem leveduras imobilizadas (apenas células livres) visando
comparar os parâmetros fermentativos do processo descontínuo, com os valores obtidos
durante a fermentação contínua com leveduras imobilizadas no bagaço de malte. Para se ter
uma boa comparação desses parâmetros, as fermentações descontínuas foram avaliadas nos
tempos onde foram atingidas as mesmas concentrações de etanol no final dos períodos para
cada temperatura da fermentação contínua. Dessa forma, os ensaios descontínuos a 15, 10 e
7ºC, foram avaliados quando a concentração de etanol atingiu 5,5, 4,8 e 4% (v/v),
respectivamente (Tabela 4.3).
Tabela 4.3 - Efeito da temperatura nos parâmetros da fermentação descontínua de mosto (100% malte) de 15ºP, no reator de coluna de bolhas.
Temperatura (ºC) 15 10 7 Etanol (% v/v) 5,5 4,8 4,0 Tempo de fermentação (h)
64 97 142
Extrato aparente (oP) 4,9 6,3 7,6 Extrato real (oP) 6,8 7,9 9,0 Grau aparente de fermentação (%)
67,3 58,6 49
Grau real de fermentação (%)
56,4 49,3 41,5
μX máx / Tempo de fermentação (h)
0,066 / 5 0,043 / 10 0,029 / 5
Velocidade de consumo de extrato (g/l h)
1,69 0,98 0,56
μS máx / Tempo de fermentação (h)
0,939 / 20 0,640 / 10 0,559 / 35
Produtividade volumétrica em etanol (g/l h)
0,67 0,39 0,22
μP máx / Tempo de fermentação (h)
0,368 / 30 0,277 / 40 0,263 / 40
μX máx = Velocidade específica máxima de crescimento celular (h-1) μS máx = Velocidade específica máxima de consumo de extrato (g ext/g cél h) μP máx = Velocidade específica máxima de produção de etanol (g et/g cél h)
88
As velocidades específicas máximas de crescimento celular, consumo de extrato e produção
de etanol foram calculadas a partir dos dados ajustados das concentrações de células em
suspensão, extrato e etanol durante a fase exponencial de crescimento, utilizando o método
geométrico de cálculo de derivadas proposto por Le Duy e Zajic (1973).
Na Tabela 4.3 observa-se que com o aumento da temperatura da fermentação descontínua o
tempo necessário para atingir a concentração desejada de etanol foi menor. Segundo Munroe
(1994), quanto maior a temperatura da fermentação, maior a velocidade metabólica da
levedura, que passa a consumir substrato e convertê-lo em produto mais rapidamente. Isso
permite concluir que a fermentação descontínua de mostos cervejeiros com altas densidades
pode ser completada em um tempo menor quando a temperatura do processo é aumentada
(CASEY; MAGNUS, INGLEDEW, 1984).
Comparando os parâmetros fermentativos obtidos no processo descontínuo (Tabela 4.3) com
aqueles obtidos no processo contínuo (Tabela 4.2), observa-se que os valores de extrato
aparente, extrato real, grau aparente e grau real de fermentação foram bastante similares para
cada temperatura avaliada. Por outro lado, os valores de velocidade de consumo de extrato e
produtividade volumétrica em etanol na fermentação contínua foram superiores aos obtidos
nas fermentações descontínuas, sendo que essa diferença foi maior quanto menor a
temperatura utilizada. A velocidade de consumo de extrato foi 218, 367 e 525% superior no
processo contínuo quando comparado ao descontínuo para as temperaturas de 15, 10 e 7ºC,
respectivamente. Para a produtividade volumétrica em etanol estes valores correspondem a
219, 369 e 536%, respectivamente. O aumento significativo desses dois parâmetros
fermentativos na fermentação contínua se deve à elevada concentração de células totais (livres
+ imobilizadas) mantidas no reator de bolhas durante todo o processo. Por outro lado, as
velocidades específicas de consumo de extrato e de produção de etanol, foram maiores nas
89
fermentações descontínuas do que nas contínuas. Para as temperaturas de 15, 10 e 7ºC,
respectivamente, as velocidades específicas máximas de consumo de extrato foram 264, 187 e
205% superiores nos processos descontínuos e as velocidades específicas de produção de
etanol foram 257, 211 e 260% maiores. É importante destacar que, as velocidades específicas
para a fermentação contínua foram calculadas considerando a soma da concentração de
células livres e imobilizadas. De acordo com Brányik et al. (2004a), a velocidade específica
de consumo de extrato durante a fermentação contínua com células imobilizadas pode ser
calculada a partir da velocidade de consumo de extrato e sua respectiva concentração de
células totais (livres + imobilizadas).
Segundo Willaert (2000), o metabolismo das células imobilizadas depende da posição que
estas ocupam no suporte. As células localizadas na superfície encontram-se em contato direto
com o mosto e se comportam como células livres em suspensão (BRÁNYIK et al., 2005).
Logo, os resultados aqui obtidos sugerem que o metabolismo das células no sistema contínuo
foi mais lento que o metabolismo das células livres no sistema descontínuo devido à forma de
condução do processo. De acordo com Brányik, Vicente e Teixeira (2005) a espessura média
da “biopelícula” de leveduras imobilizadas em bagaço de malte é aproximadamente 10 μm.
Portanto, segundo esses autores, a causa da menor atividade metabólica é a condição
fisiológica diferente (por exemplo, o “envelhecimento”) das células imobilizadas, mais do que
as limitações da difusão de substrato nas camadas de leveduras.
Outra comparação interessante a ser feita é com relação ao volume de cerveja produzido em
cada processo, contínuo e descontínuo. Nos tempos finais das fermentações descontínuas (64,
97 e 142 h para as temperaturas de 15, 10 e 7ºC, respectivamente), o volume de cerveja
produzida foi igual ao volume útil do reator de coluna de bolhas, ou seja, 5,2 l. Considerando
os mesmos tempos finais de fermentação, calcularam-se os litros de cerveja que seriam
obtidos na fermentação contínua no reator de coluna de bolhas, utilizando um valor de D igual
90
a 0,05 h-1. Tais valores corresponderam a 16,64, 25,22 e 36,92 l de cerveja, respectivamente,
para os tempos de 64, 97 e 142 h de fermentação. Portanto, uma vez atingido o estado
estacionário, o processo contínuo permitiria aumentos de 220, 385 e 610% no volume de
cerveja produzida quando comparado com os processos descontínuos conduzidos a 15, 10 e
7ºC, respectivamente.
4.3.1.3 Produção de compostos relacionados com o sabor e aroma da cerveja
As amostras retiradas ao final de cada período da fermentação contínua com leveduras
imobilizadas no bagaço de malte, foram analisadas também para determinação da
concentração de diversos compostos voláteis, que são responsáveis pelo sabor e aroma das
cervejas. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4.4, a qual mostra a
concentração de ésteres, álcoois superiores e diacetilo nas cervejas produzidas, em função da
temperatura de fermentação utilizada.
Observa-se na Tabela 4.4 que o acetato de etila foi o principal éster encontrado nas cervejas
obtidas por processo contínuo. De fato, de acordo com Smogrovicová e Dömény (1999), o
acetato de etila é o éster presente em maior concentração nas cervejas, correspondendo
normalmente a mais que 30% da concentração total de ésteres.
Em termos da influência da temperatura na produção total de ésteres, observou-se que a
produção destes compostos foi favorecida quanto menor a temperatura utilizada na
fermentação. Os dados encontrados na literatura sobre este efeito são bastante contraditórios.
Enquanto alguns autores relatam que a produção de ésteres aumenta quando a temperatura da
fermentação é diminuída (KUNZE, 1996), outros (STEWART; RUSSELL, 1998 e
SMOGROVICOVÁ; DÖMÉNY, 1999) reportaram que a produção de ésteres aumenta
quando a temperatura da fermentação é aumentada. Segundo Verstrepen et al. (2003), o efeito
91
da temperatura na produção de ésteres, não é o mesmo para todas as cepas de leveduras. Além
disso, a produção de ésteres varia entre as distintas cepas de leveduras, devido às diferenças
na atividade da enzima álcool acetiltransferase entre as espécies destes microorganismos
(RAMOS-JEUNEHOMME; LAUB, MASSCHELEIN, 1991).
Tabela 4.4 - Efeito da temperatura na produção de compostos voláteis durante a fermentação contínua
de mosto (100% malte) de 15ºP no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 240 ml/min de CO2 e 10 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,05 h-1).
Temperatura (ºC) Composto (mg/l) 15
(fase inicial) 10 7 15
(fase final) Acetato de Etila 44,4 48,2 103,9 52,9 Acetato de Isoamila 1,45 0,38 0,81 0,98
Hexanoato de etila 0,42 0,16 0,17 0,29
Total de ésteres 46,27 48,74 104,88 54,17
n-propanol 29,2 18,0 15,6 32,4 Isobutanol 16,2 12,0 11,7 18,6 Álcoois amílico + isoamílico 66,2 51,1 46,0 70,7
Total de álcoois superiores 111,6 81,1 73,3 121,7
Relação Álcoois:Ésteres 2,4:1 1,7:1 0,7:1 2,2:1
Diacetilo na 0,555 0,488 0,685 na: não analisado
Ao contrário da concentração total de ésteres, a concentração total dos álcoois superiores
diminuiu com a redução da temperatura de fermentação (Tabela 4.4). Este resultado está de
acordo com o que foi descrito por Stewart e Russell (1998). Segundo estes autores as
condições que limitam o crescimento das leveduras, tais como baixas temperaturas e elevadas
pressões, reduzem a produção de álcoois superiores. Dentre estas condições a síntese de
álcoois superiores é suscetível principalmente às mudanças de temperatura (WILLAERT;
NEDOVIC, 2006). Por outro lado, as condições que promovem o crescimento das leveduras,
tais como o aumento na disponibilidae de oxigênio e a suplementação do mosto com
92
aminoácidos, estimulam a produção destes álcoois (STEWART; RUSSELL,1998). A redução
da concentração total de álcoois superiores com a diminuição da temperatura de fermentação
(de 15 a 0ºC) foi também observada por Kopsahelis, Kanellaki e Bekatorou (2007) durante a
fermentação de mosto de 12ºP pelo processo descontínuo repetido, utilizando leveduras
imobilizadas em bagaço de malte parcialmente deslignificado. Os valores obtidos por esses
autores (81 a 119 mg/l) foram menores em comparação à concentração encontrada em
cervejas maturadas (130 mg/l).
Assim como a concentração total dos álcoois superiores, a concentração de diacetilo nas
cervejas à saída do reator de coluna de bolhas também aumentou com o aumento da
temperatura de fermentação (Tabela 4.4). Um comportamento similar foi observado por
Smogrovicová e Dömény (1999) variando a temperatura (de 5 a 20ºC) durante as
fermentações descontínuas de cerveja com leveduras imobilizadas em DEAE-celulose.
Alguns autores consideram que a concentração de diacetilo em mostos fermentados é
dependente da velocidade de formação do precursor do diacetilo (α-acetolactato), bem como
da descarboxilação oxidativa desse precursor para formar o diacetilo e também da redução do
diacetilo a acetoína (STEWART; RUSSELL, 1998). Desta forma, condições de fermentação
que favorecem a velocidade de crescimento das leveduras, tais como elevadas temperaturas,
podem aumentar os níveis de α-acetolactato e conseqüentemente a concentração de diacetilo
no mosto fermentado (WILLAERT; NEDOVIC, 2006).
É importante destacar que o diacetilo é um dos compostos de grande influência no sabor das
cervejas, sendo que sua presença em elevadas concentrações (> 0,20 mg/l) pode conferir um
sabor “amanteigado” à cerveja maturada (ANGELINO, 1991). No presente trabalho, elevados
valores de concentração de diacetilo foram obtidos para todas as cervejas produzidas nas três
diferentes temperaturas. No entanto, estes valores estão nos níveis normalmente encontrados
nas cervejas não maturadas. Após o período de maturação, a concentração de diacetilo nas
93
cervejas é reduzida. Brányik et al. (2004a), produziram cervejas com concentrações de
diacetilo (de 0,4 a 0,6 mg/l) similares às encontradas no presente trabalho. Após um período
de 10 dias de maturação descontínua à 4ºC, a concentração de diacetilo nestas cervejas foi
reduzida para menos que 0,05 mg/l, ou seja, ficou abaixo do limiar de percepção de sabor
estabelecido para este composto. Contudo, o sabor de uma cerveja não depende apenas das
quantidades absolutas de cada composto individualmente, mas também das quantidades
relativas entre álcoois superiores e ésteres. De acordo com a literatura a relação ótima entre os
álcoois superiores e os ésteres (A:E) varia de 2,5-3:1 (KUNZE, 1996) a 4,1-4,7:1
(SMOGROVICOVÁ; DÖMÉNY, 1999). No presente trabalho, as relações A:E que mais se
aproximaram destes valores foram obtidas nas cervejas produzidas à 15ºC (2,2-2,4:1).
4.3.2 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE EXTRATO ORIGINAL DE MOSTOS PURO MALTE
4.3.2.1 Avaliação dos parâmetros fermentativos
Esta etapa do trabalho teve como objetivo avaliar a influência da concentração de extrato
original (13,4, 15,3, 16,6, e 18,5ºP) de mostos 100% malte, nos parâmetros fermentativos da
fermentação primária de cervejas de altas densidades pelo processo contínuo em reator de
coluna de bolhas. Durante a fermentação, a taxa de diluição (D), a temperatura de
fermentação e o fluxo de gases, foram mantidos constantes em 0,04 h-1, 15oC e 250 ml/min
(200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar), respectivamente. Para cada concentração de extrato
avaliada, o sistema foi considerado em estado estacionário após um período mínimo
correspondente a 3 tempos de residência (75 h).
94
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
10
12
14
18,516,615,313,410,3Extrato original (oP)
Ext
rato
apa
rent
e (o P)
; p
H
Tempo (d)
0
2
4
6
8
10
Eta
nol (
% v
/v)
Figura 21. Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Ao final de cada período (Figura 21) observa-se que, enquanto o pH se manteve estável em
aproximadamente 4, a concentração de extrato aparente e de etanol nas cervejas à saída do
reator aumentou quanto maior a concentração de extrato original dos mostos utilizados na
alimentação do reator. Por outro lado, os graus aparente e real de fermentação diminuíram
com a utilização de mostos mais concentrados (Tabela 4.5). Virkajärvi et al. (2002) também
observaram uma diminuição dos graus aparente e real de fermentação quanto maior a
concentração de extrato original do mosto utilizado na alimentação.
95
Tabela 4.5 - Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte nos parâmetros da fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Concentração de extrato original do mosto (ºP)
13,4 15,3 16,6 18,5
Etanol (% v/v) 5,7 6,1 6,4 7,0 Extrato aparente (oP) 2,8 4,1 5,0 6,0 Extrato real (oP) 4,8 6,2 7,3 8,4 Nitrogênio amino livre - FAN (mg/l) 51 64 47 104 Consumo de FAN (mg/l) 133 135 173 134 Grau aparente de fermentação (%) 78,9 73,4 69,7 67,3 Grau real de fermentação (%) 65,6 61,4 58,5 56,8 Velocidade de consumo de extrato (g/l h)
4,49 4,83 5,02 5,46
Velocidade específica de consumo de extrato (g ext/g cél h)
0,600 0,508 0,478 0,400
Produtividade volumétrica em etanol (g/l h)
1,79 1,93 2,01 2,19
Velocidade específica de produção de etanol (g et/g cél h)
0,239 0,203 0,191 0,160
Com exceção do mosto de 16,6ºP, o consumo de nitrogênio amino livre manteve-se constante
apesar das variações na concentração de extrato do mosto na alimentação do reator, com uma
média de 134 mg/l (Tabela 4.5). A velocidade de consumo de extrato e a produtividade
volumétrica em etanol aumentaram na medida em que se utilizou um mosto com maior
concentração de extrato original. Entretanto, o mesmo não ocorre para as velocidades
específicas (g/gcélulas totais h) de extrato consumido e de etanol produzido, as quais diminuíram
quanto maior a concentração de extrato original do mosto empregado. Tal diminuição é
resultado do aumento na concentração de células totais quando os mostos na alimentação
foram substituídos por mostos mais concentrados (Figura 22). Nessa figura observa-se
também que a concentração de células livres nas cervejas aumentou com o aumento da
concentração de extrato original do mosto, atingindo o valor máximo de 8,3 g/l para o mosto
de 18,5ºP.
96
0 5 10 15 20 250,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
18,516,615,313,410,3Extrato original (oP)
Xim
ob (g
cél
/g su
p);
----
-- D
(h-1
)
Tempo (d)
0
3
6
9
12
15
Xliv
res (g
/l);
X
imob
(g/l)
Xto
tais (g
/l)
Figura 22. Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas (Ximob) e totais (Xtotais), durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição, D: 0,04 h-
1; temperatura: 15ºC).
Este comportamento pode estar relacionado com a diminuição dos graus aparente e real de
fermentação que teriam causado uma menor floculação das leveduras, permitindo desta forma
que um maior número de células em suspensão permanecesse na cerveja verde à saída do
reator (VIRKAJÄRVI et al., 2002). Por outro lado, o aumento na concentração de extrato
original dos mostos que alimentavam continuamente o reator não influenciou na concentração
de leveduras imobilizadas no bagaço de malte, a qual se manteve constante em cerca de
0,33 g cél/g sup (Figura 22). A Figura 23 mostra uma partícula do suporte com as leveduras
imobilizadas no final do experimento.
97
Figura 23. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte com leveduras imobilizadas durante a
fermentação contínua para avaliação do efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte em reator de coluna de bolhas. Ampliação: 1770 vezes.
De acordo com a Figura 24 a viabilidade das células livres se manteve elevada (acima dos
90%) durante todo o processo. Observa-se ainda nessa figura que para os mostos com 13,4,
15,3 e 16,6ºP, a relação entre a concentração de células livres determinada por contagem em
câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l) não foi constante durante o processo,
variando de 0,61 a 1,02 g/l para cada 1x107 cél/ml. Porém, essa faixa de valores não foi
mantida durante a fermentação do mosto com 18,5ºP, principalmente no final do processo
contínuo, onde 1x107 cél/ml corresponderam a 0,39 g/l. Tal diferença estaria indicando uma
mudança no estado fisiológico das leveduras livres nesse período da fermentação, a qual pode
estar relacionada a um provável estresse osmótico devido à elevada concentração de etanol no
meio e ao longo tempo da fermentação.
98
0 5 10 15 20 250,0
5,0x107
1,0x108
1,5x108
2,0x108
2,5x108
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Xliv
res (c
él/m
l)
Tempo (d)
Extrato original (oP)10,3 13,4 15,3 16,6 18,5
0
5
10
15
20
25
Xliv
res (g
/l)
V
iabi
lidad
e (%
)
Figura 24. Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na viabilidade e
concentração de células livres (Xlivres), determinadas por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l), durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
4.3.2.2 Produção de compostos relacionados com o sabor e aroma
Durante a fermentação contínua de mostos puro malte, a produção de ésteres apresentou
diferentes comportamentos, os quais foram dependentes da concentração de extrato original
do mosto utilizado na alimentação do reator (Tabela 4.6). Enquanto a concentração de acetato
de etila aumentou consideravelmente com o aumento da concentração de extrato original do
mosto, as concentrações de acetato de isoamila e de hexanoato de etila tiveram seus valores
reduzidos, permanecendo praticamente constantes quando foram utilizados os mostos mais
concentrados (16,6 e 18,5ºP). De acordo com Verstrepen et al. (2003) a elevada produção de
ésteres acetato, principalmente acetato de etila, é um dos problemas mais comuns encontrados
na elaboração de cervejas de altas densidades, já que elevadas concentrações desse composto
99
(acima de 30 mg/l) proporciona um acentuado aroma de frutas ou de solventes à cerveja.
Athanasios et al. (2007) observaram também um aumento da concentração de acetato de etila
com o aumento da concentração inicial de açúcares do mosto de uva (de 7 a 12,5ºBe) na
fermentação para produção de vinho pelo processo descontínuo repetido, com leveduras
imobilizadas em bagaço de malte.
Tabela 4.6 - Efeito da concentração de extrato original de mostos puro malte na produção de compostos voláteis durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Concentração de extrato original do mosto (ºP) Composto (mg/l) 13,4 15,3 16,6 18,5 Acetato de Etila 42,9 63,0 222,0 251,9 Acetato de Isoamila
1,02 0,67 0,38 0,35
Hexanoato de Etila 0,12 0,07 0,06 0,07
Total de ésteres 44,04 63,74 222,44 252,32
n-propanol 21,1 25,5 29,9 35,5 Isobutanol 44,6 34,6 30,9 28,7 Álcoois amílico + isoamílico
82,8 85,2 75,2 76,5
Total de álcoois superiores
148,5 145,3 136,0 140,7
Relação Álcoois:Ésteres 3,4:1 2,3:1 0,6:1 0,6:1
Diacetilo 0,249 0,363 0,363 0,770
Assim como a produção de ésteres, a produção de álcoois superiores também apresentou
diferentes comportamentos conforme a concentração de extrato do mosto utilizado. Por
exemplo, enquanto a concentração de n-propanol aumentou com o aumento na concentração
de extrato do mosto, a concentração de isobutanol diminuiu e a produção dos álcoois amílico
+ isoamílico não foi influenciada significativamente (Tabela 4.6).
Por outro lado, a concentração de extrato original do mosto apresentou um efeito significativo
na produção do diacetilo. Na Tabela 4.6 observa-se que a concentração desse composto
100
aumentou com o aumento na concentração de extrato original, atingindo um valor máximo de
0,770 mg/l na fermentação do mosto de 18,5ºP.
As relações entre as concentrações de álcoois superiores e ésteres (A:E) que mais se
aproximaram das consideradas como adequadas (2,5-3:1) (KUNZE, 1996) para uma cerveja
com sabor balanceado, foram as obtidas durante a fermentação contínua dos mostos com 13,4
e 15,3ºP. Com a utilização dos mostos mais concentrados (16,6 e 18,5ºP) foram obtidas
cervejas com uma baixa relação A:E, devido à elevada produção de ésteres.
Considerando que as cervejas encontradas no mercado brasileiro contêm em média 4,7% (v/v)
de etanol e, sabendo que as cervejas obtidas por processos de altas densidades necessitam de
uma etapa final de diluição para atingir esses níveis de concentração de etanol, fez-se então
uma estimativa das concentrações de ésteres, álcoois superiores e diacetilo que estariam
presentes nas cervejas de altas densidades após a diluição para uma concentração final de
etanol de 4,7% (v/v). Tais valores estão apresentados na Tabela 4.7 a qual também apresenta
os valores típicos de concentração desses compostos encontrados em cervejas do mercado,
segundo dados da literatura (BAXTER; HUGHES, 2001; KUNZE, 1996).
Observa-se nessa tabela que os valores estimados de concentração de ésteres e diacetilo na
cerveja diluída, manteriam a mesma tendência observada na cerveja à saída do reator (Tabela
4.6), aumentando quanto maior a concentração de extrato original do mosto utilizado. Por
outro lado, a concentração total de álcoois superiores também manteria a mesma tendência
observada na cerveja sem diluir à saída do reator, porém, diminuindo com o aumento da
concentração de extrato original do mosto.
101
Tabela 4.7 - Concentração de compostos voláteis nas cervejas encontradas no mercado e nas cervejas obtidas por processo contínuo empregando mostos puro malte com diferentes concentrações originais de extrato (valores estimados para uma concentração final de etanol de 4,7% v/v).
Concentração de extrato original do mosto (ºP) Composto (mg/l)
Cervejas do mercado 13,4 15,3 16,6 18,5
Acetato de Etila 10 – 60 35,5 48,3 163,8 170,3 Acetato de Isoamila
0,5 – 5,0
0,84 0,51 0,28 0,24
Hexanoato de etila 0,1 – 0,5 0,099 0,054 0,044 0,047
Total de ésteres 10,6 – 65,5 36,44 48,86 164,12 170,59
n-propanol 3 – 16 17,5 19,6 22,1 24,0 Isobutanol 5 – 20 36,9 26,5 22,8 19,4 Álcoois amílico + isoamílico
38 – 100
68,5 65,3 55,5 51,7
Total de álcoois superiores
46 – 136 122,9 111,4 100,4 95,1
Diacetilo 0,01 – 0,40 0,206 0,278 0,268 0,521
4.3.3 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE EXTRATO ORIGINAL DE MOSTOS COM ADJUNTO
4.3.3.1 Avaliação dos parâmetros fermentativos
Nesta etapa do trabalho, mostos elaborados com 74% de malte e 26% de adjunto com elevada
concentração de maltose, foram utilizados para a produção de cervejas de altas densidades
pelo processo contínuo em reator de coluna de bolhas. O objetivo deste estudo foi avaliar a
influência da concentração de extrato original do mosto nos parâmetros fermentativos e na
produção de compostos voláteis relacionados com o sabor das cervejas. Este ensaio permitiu
também comparar o desempenho da fermentação contínua de mostos de altas densidades
elaborados com adjuntos, com a fermentação contínua de mostos de altas densidades
elaborados com 100% de malte (puro malte). O experimento foi realizado com mostos
contendo diferentes concentrações de extrato original (14,3, 15,2 e 19,6ºP), mantendo
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19,615,214,3Extrato original (oP)
10,5
Eta
nol (
% v
/v)
constantes a taxa de diluição (0,04 h-1), a temperatura de fermentação (15oC) e o fluxo de
gases (250 ml/min: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar). Para cada concentração de extrato
avaliada o sistema foi considerado em estado estacionário após um período mínimo
correspondente a 3 tempos de residência (75 h).
Figura 25. Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto, na concentração de extrato aparente, etanol e pH, durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Os resultados revelaram que, assim como foi observado na fermentação dos mostos puro
malte, na fermentação dos mostos com adjunto o pH também se manteve estável em
aproximadamente 4 e a concentração de etanol nas cervejas à saída do reator aumentou
quanto maior a concentração de extrato original dos mostos utilizados na alimentação (Figura
25). A concentração de extrato aparente também foi maior quando se utilizou mostos mais
concentrados, porém, este aumento apenas foi evidenciado quando se utilizou o mosto de
maior densidade específica (19,6ºP).
103
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Xim
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Xliv
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/l);
X
imob
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Xto
tais (g
/l)
Figura 26. Efeito da concentração do extrato original de mostos com malte e adjunto, na concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas (Ximob) e totais (Xtotais), durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição, D: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Com relação à concentração celular, observa-se na Figura 26 que houve um aumento
significativo na concentração de leveduras imobilizadas nas partículas do suporte durante o
estágio inicial de fermentação no reator de coluna de bolhas. Na verdade, a alimentação do
reator com o mosto de baixa concentração de extrato original (10,5oP) permitiu alcançar uma
elevada concentração de células imobilizadas (> 0,3 g cél/g sup) já nas primeiras 100 h de
fermentação. Alguns autores, utilizando meio sintético para favorecer a adesão espontânea das
leveduras cervejeiras na superfície das partículas de bagaço de malte, necessitaram de tempos
maiores para se obter 0,3 g cél/g sup, os quais variaram de 135 h a 225 h (BRÁNYIK et al.,
2002; BRÁNYIK; VICENTE, TEIXEIRA, 2005).
Logo, a metodologia utilizada no presente trabalho parece ser mais interessante por dois
104
motivos: além de reduzir o tempo da etapa inicial de imobilização das leveduras, a utilização,
durante esse período, de mostos elaborados com adjuntos e diluídos em substituição aos
meios sintéticos, pode ser considerada como uma vantagem operacional e econômica dada a
facilidade com que estes poderiam ser elaborados pela própria cervejaria, sem a necessidade
de utilizar equipamentos e reagentes adicionais.
Durante o experimento, a concentração de células imobilizadas no bagaço de malte aumentou
com o aumento da concentração do extrato original, atingindo um valor máximo de
0,68 g cél/g sup no final da fermentação. Este valor foi superior ao observado no final da
fermentação do mosto puro malte (0,33 g cél/g sup). Além disso, o comportamento da
imobilização celular em mosto puro malte foi diferente. Nesse caso, a concentração de células
imobilizadas aumentou apenas no estágio inicial de fermentação e praticamente não variou
quando se utilizaram mostos com diferentes concentrações de extrato original (Figura 22).
Esta diferença de comportamento foi bastante evidente quando se utilizaram os mostos mais
concentrados, e pode estar relacionada com a presença de mais proteínas no mosto puro malte
o qual continha uma concentração de nitrogênio amino livre de 238 mg/l (Tabela 4.5),
enquanto que no mosto elaborado com adjuntos este valor correspondeu a 179 mg/l (Tabela
4.7). As proteínas poderiam estar competindo com as leveduras pelos sítios ativos de adsorção
no bagaço de malte, sendo que, quanto maior a concentração de proteínas no meio, mais
difícil se tornaria a imobilização das leveduras no suporte.
Em mostos elaborados com adjuntos, a concentração de células livres praticamente não foi
influenciada pelo aumento da concentração de extrato do mosto, mantendo-se constante em
uma média de 2,5 g/l (Figura 27). No entanto, a viabilidade das células livres foi afetada
quando se utilizou os mostos concentrados. O mesmo não ocorreu quando se empregou
mostos puro malte, provavelmente devido a um melhor balanço entre carboidratos e
nitrogênio presentes no meio. Nos mostos elaborados com adjunto, a quantidade de nitrogênio
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/l)
V
iabi
lidad
e (%
)
livre era menor, o que pode ter interferido na viabilidade celular. De acordo com Russell
(2006), a concentração de nitrogênio amino livre, que inclui aminoácidos (exceto prolina),
amônia e grupos nitrogênio α-amino, afeta parâmetros da fermentação tais como o
crescimento celular, a viabilidade e a velocidade de fermentação.
Figura 27. Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto, na viabilidade e concentração de células livres (Xlivres) determinadas por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l), durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
A relação entre as células livres determinadas por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml)
e por peso seco (g/l) não foi constante durante o processo, variando de 0,45 a 0,78 g/l para
cada 1x107 cél/ml. Quando se utilizou mostos puro malte, esta variação foi maior,
correspondendo de 0,61 a 1,02 g/l para cada 1x107 cél/ml. Estes resultados sugerem que em
mostos puro malte as células conseguem acumular mais nutrientes do que em mostos com
malte e adjunto, de forma que se tornam mais “pesadas”. Porém, no mosto puro malte com
maior concentração de extrato esta relação foi reduzida significativamente para um valor de
106
0,39 g/l para cada 1x107 cél/ml. Isso provavelmente ocorreu devido a uma condição de
estresse osmótico, como foi explicado anteriormente, o que teria levado às células a consumir
seus nutrientes de reserva, tornando-se desta forma mais leve.
A Tabela 4.8 mostra o efeito da concentração de extrato original de mostos com adjuntos em
vários parâmetros fermentativos. Observa-se nesta tabela que os graus aparente e real de
fermentação foram mínimos durante a fermentação contínua do mosto com maior
concentração de extrato. O mesmo fato foi observado durante a fermentação do mosto puro
malte (Tabela 4.5).
Tabela 4.8 - Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto nos parâmetros da fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Concentração de extrato original do mosto (ºP) 14,3 15,2 19,6 Etanol (% v/v) 4,9 5,5 6,6 Extrato aparente (oP) 5,4 5,0 7,9 Extrato real (oP) 7,1 7,0 10,1 Nitrogênio amino livre - FAN (mg/l) 55 48 58 Consumo de FAN (mg/l) 61 73 121 Grau aparente de fermentação (%) 62,1 66,8 59,8 Grau real de fermentação (%) 52,1 56,0 50,8 Velocidade de consumo de extrato (g/l h) 3,84 4,37 5,19 Velocidade específica de consumo de extrato (g ext/g cél h)
0,444 0,439 0,375
Produtividade volumétrica de etanol (g/l h)
1,53 1,75 2,09
Velocidade específica de produção de etanol (g et/g cél h)
0,177 0,176 0,151
Por outro lado, em mostos com adjunto, o consumo de nitrogênio amino livre foi favorecido
com o aumento da concentração de extrato original, enquanto que em mostos puro malte este
consumo permaneceu constante independente da concentração do mosto utilizado.
Alguns parâmetros fermentativos apresentaram o mesmo comportamento em mostos puro
malte e em mostos com adjunto. Por exemplo, na medida em que se utilizou mostos mais
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)
Extrato Original (oP)
GA
F Adj (%
); G
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) G
AF M
alte (%
); G
RF M
alte (%
)
concentrados, as velocidades de consumo de extrato e de produção de etanol foram sempre
aumentadas, enquanto que as velocidades específicas de consumo de extrato e de produção de
etanol foram sempre diminuídas.
Comparando a fermentação contínua dos mostos elaborados com malte e adjunto, com a
fermentação contínua dos mostos elaborados apenas com malte, observou-se que a
composição do mosto influenciou significativamente nos parâmetros fermentativos do
processo de elaboração das cervejas de altas densidades. A Figura 28 mostra que a
fermentação contínua dos mostos 100% malte proporcionou concentrações de etanol e graus
aparente e real de fermentação superiores aos obtidos na fermentação dos mostos elaborados
com 74% de malte e 26% de adjunto.
Figura 28. Efeito da composição do mosto na concentração de etanol, grau aparente (GAF) e real
(GRF) de fermentação para diferentes concentrações de extrato original. (Adj: mostos elaborados com 74% de malte e 26% de adjunto. Malte: mostos elaborados com 100% de malte).
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/l h)
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/l h)
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S Adj (g
/g h
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P Adj (g
/g h
) μ
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/g h
); μ
P Mal
te (g
/g h
)
As velocidades de consumo de extrato e de produção de etanol também foram maiores
quando se utilizou mostos 100% malte (Figura 29). A menor velocidade de consumo de
extrato nos mostos com adjunto, provavelmente foi devido à menor concentração de
nitrogênio amino livre presente neste meio (YOUNIS; STEWART, 1999).
Figura 29. Efeito da composição do mosto nas velocidades de consumo de extrato (RS) e de produção
de etanol (RP) e nas velocidades específicas de consumo de extrato (μS) e de produção de etanol (μP) para diferentes concentrações de extrato original. (Adj: mostos elaborados com 74% de malte e 26% de adjunto. Malte: mostos elaborados com 100% de malte).
4.3.3.2 Produção de compostos relacionados com o sabor
Assim como foi observado durante a fermentação contínua dos mostos puro malte, na
fermentação dos mostos com malte e adjunto também ocorreu um aumento na produção de
ésteres à medida que a concentração de extrato original do mosto foi aumentada (Tabela 4.9).
Dentre esses compostos, mais uma vez o acetato de etila foi o éster produzido em maior
109
quantidade. O aumento na concentração de extrato do mosto também favoreceu a produção de
álcoois superiores e de diacetilo nas cervejas.
Um fato de grande importância observado foi que a produção de ésteres nos mostos com
adjunto foi seis vezes menor que a produção de ésteres nos mostos puro malte, o que é
bastante interessante já que elevadas concentrações (acima de 30 mg/l) destes compostos
conferem um sabor frutado à cerveja (ANGELINO, 1991). Por outro lado, essas cervejas com
baixas concentrações de ésteres apresentaram concentrações de álcoois superiores mais
elevadas do que as obtidas a partir de mostos puro malte (Tabelas 4.6 e 4.9).
Conseqüentemente, as relações entre as concentrações de álcoois superiores e ésteres (A:E)
nas cervejas a partir de mostos com adjuntos foram maiores do que as relações encontradas
nas cervejas elaboradas a partir de mostos puro malte.
Tabela 4.9 – Efeito da concentração de extrato original de mostos com malte e adjunto na produção de compostos voláteis durante a fermentação primária de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Composto (mg/l) Concentração de extrato original do mosto (ºP) 14,3 15,2 19,6 Acetato de Etila 21,4 26,0 40,5 Acetato de Isoamila 0,39 0,69 1,66 Hexanoato de Etila 0,06 0,10 0,15
Total de ésteres 21,85 26,79 42,31
n-propanol 20,9 26,0 70,5 Isobutanol 21,2 27,3 45,5 Álcoois amílico + isoamílico 51,0 65,6 115,2
Total de álcoois superiores 93,1 118,8 231,2
Relação Álcoois:Ésteres 4,3:1 4,4:1 5,5:1
Diacetilo 0,601 0,368 0,837
Na fermentação contínua dos mostos de 14,3ºP e 15,2ºP, por exemplo, foram obtidas relações
A:E consideradas como ótimas (4,1-4,7:1) para cervejas tipo lager, segundo Smogrovicová e
Dömény (1999). A fermentação do mosto mais concentrado (19,6ºP) apresentou uma elevada
110
relação A:E devido à alta concentração de álcoois superiores.
Comparando as concentrações de ésteres, álcoois superiores e diacetilo obtidas durante a
fermentação contínua do mosto com adjunto de 15,2ºP com aquelas obtidas durante a
fermentação do mosto 100% malte de 15,3ºP observou-se que a composição do mosto exerceu
uma influência significativa na produção de alguns desses compostos voláteis. Enquanto as
concentrações de acetato de isoamila, hexanoato de etila, n-propanol e de diacetilo foram
praticamente iguais para ambos os mostos, as concentrações de acetato de etila, isobutanol e
álcoois amílico + isoamílico foram superiores quando se utilizou o mosto elaborado apenas
com malte (Figura 30). De acordo com Younis e Stewart (1999), mostos de altas densidades
elaborados somente com malte apresentam níveis mais altos de glicose e/ou frutose do que
mostos elaborados com malte e adjuntos de elevados teores de maltose. Também de acordo
com estes autores, quanto maior a concentração de glicose e/ou frutose no mosto, maior a
produção de ésteres durante a fermentação, o que justifica os resultados encontrados no
presente trabalho. Durante a fermentação de mostos de altas densidades (Extrato original =
20ºP) suplementados com xaropes de alta concentração de maltose (30% de xarope contendo
70% de maltose), Younis e Stewart (1999) obtiveram uma concentração de acetato de etila na
cerveja produzida até 17% menor do que a concentração encontrada na cerveja produzida a
partir de mostos elaborados apenas com malte. Existem duas possíveis explicações para
justificar este resultado: uma delas é que o metabolismo de glicose em leveduras leva à
produção de acetil-CoA, o que favorece a produção de ésteres. Outra explicação seria que a
glicose causa uma expressão mais acentuada dos genes ATF1 e/ou ATF2 da enzima éster
sintase, o que resulta no aumento da atividade dessa enzima (VERSTREPEN et al., 2003). Por
esses motivos, mostos elaborados com malte e adjuntos de alta concentração de maltose são
apropriados para a produção de cervejas de altas densidades, pois o elevado teor de maltose e
o baixo teor de glicose evitam a produção elevada de ésteres acetato (YOUNIS; STEWART,
111
0
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Acetato
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de Etila
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ílico
+ Is
oam
ílico
(mg/
l)
2000).
Figura 30. Efeito da composição do mosto (□: mosto com malte e adjunto; ■: mosto puro malte) de
15ºP na produção de compostos voláteis durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Fluxo de gases: 200 ml/min de CO2 e 50 ml/min de ar; taxa de diluição: 0,04 h-1; temperatura: 15ºC).
Em uma etapa final deste estudo, assim como foi feito para as cervejas obtidas de mostos puro
malte, fez-se também aqui uma comparação entre as concentrações de compostos voláteis
normalmente encontradas em cervejas de mercado, com a possível concentração desses
compostos que estaria presente nas cervejas elaboradas a partir de mostos com malte e
adjunto, quando estas fossem diluídas para uma concentração final de etanol de 4,7% (v/v).
Esses valores foram plotados no gráfico apresentado na Figura 31. Observa-se nessa figura
que, apenas a cerveja obtida a partir do mosto de 19,6ºP apresentaria todos os ésteres em
112
concentrações dentro da faixa típica observada em cervejas do mercado. No entanto, nas
cervejas obtidas a partir dos mostos de 14,3ºP e 15,2ºP, as concentrações de ésteres que não
caíram dentro dessa faixa, ficaram muito próximas do limite inferior normalmente
encontrado. Estes resultados foram melhores do que os obtidos com as cervejas de mostos
puro malte (Tabela 4.7), onde, na maioria dos casos, as concentrações dos ésteres presentes na
cerveja estariam fora dos níveis típico do mercado.
Figura 31. Concentração de compostos voláteis nas cervejas encontradas no mercado (▬) e nas cervejas obtidas por processo contínuo empregando mostos com malte e adjunto com diferentes concentrações originais de extrato (■: 14,3ºP; ○: 15,2ºP; ×: 19,6ºP). Valores estimados para uma concentração final de etanol de 4,7% v/v e apresentados como porcentagem dos valores máximos para cervejas do mercado.
Dentre os álcoois superiores analisados, apenas a concentração de álcoois amílico +
isoamílico estaria dentro da faixa sugerida. Porém, isso seria válido para todas as cervejas
obtidas a partir do mosto elaborado com malte e adjunto, independente da concentração de
extrato utilizada. Por outro lado, os valores das concentrações de n-propanol e isobutanol
0
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Acetato de Etila
Acetato de Isoamila
Hexanoato de Etila
n-propanolIsobutanol
Álcoois Amílico + Isoamílico
Diacetilo
113
seriam elevados para todas as cervejas. Esses valores foram idênticos aos obtidos nas cervejas
elaboradas a partir de mostos puro malte, as quais também apresentariam apenas a
concentração de álcoois amílico + isoamílico em níveis do mercado (Tabela 4.7).
Com relação à concentração de diacetilo, a Figura 31 mostra que apenas a cerveja elaborada
com mosto de 15,2ºP (malte + adjunto) apresentaria este composto em níveis adequados,
sendo que nas duas outras cervejas produzidas (mostos de 14,3ºP e 19,6ºP) ele estaria presente
em níveis mais elevados. Quando se utilizaram mostos puro malte (Tabela 4.7), a
concentração de diacetilo apenas estaria fora da faixa típica de mercado na cerveja produzida
a partir do mosto mais concentrado.
De uma forma geral, os resultados obtidos sugerem que as cervejas elaboradas com mostos
com adjunto apresentaram os compostos voláteis (relacionados com o sabor) em níveis mais
adequados aos de mercado do que as cervejas elaboradas com mosto puro malte. Isso porque
a concentração de álcoois amílico + isoamílico estaria dentro da faixa esperada, a
concentração de ésteres seria muito próxima aos valores típicos encontrados e a concentração
de diacetilo após a maturação da cerveja seria reduzida provavelmente a níveis adequados
para consumo. Além disso, as concentrações de n-propanol e isobutanol estariam muito
próximas dos valores aceitáveis de mercado, principalmente para as cervejas obtidas a partir
de mostos de 14,3ºP e de 15,2ºP.
4.3.4 EFEITO DA AERAÇÃO
A aeração é uma variável de grande influência na eficiência da fermentação e na formação
dos compostos responsáveis pelo sabor das cervejas (DEBOURG, 1993). Um excesso de
oxigênio durante a fermentação, além de causar uma excessiva produção de biomassa, pode
proporcionar também uma baixa produção de ésteres e uma elevada formação de acetaldeído,
114
diacetilo e álcoois superiores. A explicação para esse comportamento se baseia no aumento da
biosíntese de precursores de aminoácidos devido ao rápido crescimento das leveduras, o que
favorece a formação de álcoois superiores, oxo-ácidos, ácidos orgânicos e dicetonas vicinais
(NORTON; D´AMORE, 1994). Por este motivo, a escolha de uma condição adequada de
aeração é de grande importância para que a fermentação seja realizada com elevada eficiência
e a formação de compostos voláteis (relacionados com o sabor das cervejas) ocorra de forma
controlada.
Na fermentação contínua de mosto com uma concentração de extrato original de 14ºP, a 13 e
16ºC, Brányik et al. (2004a) obtiveram relações ótimas entre a concentração de álcoois
superiores e ésteres quando a agitação foi induzida apenas por CO2 puro (fluxo de ar =
0 ml/min). No presente estudo, diferentes fluxos de CO2 e ar, foram utilizados durante a
fermentação de mostos de altas densidades (15 e 18,5ºP) pelo processo contínuo com as
leveduras imobilizadas no bagaço de malte, visando avaliar o efeito da aeração no
desempenho do processo fermentativo. A fermentação foi realizada com mosto puro malte, no
reator de coluna de bolhas à 15ºC, empregando as seguintes relações entre CO2 e ar (em
ml/min): 330:3,3; 330:6,6 e 300:25.
Observa-se na Figura 32 que a produção de etanol diminuiu gradativamente durante a
fermentação contínua do mosto de 15ºP, onde se utilizou uma taxa de diluição igual a 0,04 h-1
(tR = 25 h) e fluxo um de gases constante (330 ml/min de CO2 e 3,3 ml/min ar). Embora um
pseudo estado estacionário pudesse ter sido considerado após o tempo de 15,5 d (372 h)
quando a concentração de etanol permaneceu por volta de 5% (v/v), ao manter as condições
de fermentação durante um período superior a 16 tempos de residência (16,7 d) observou-se
que o sistema ainda se encontrava instável. Além disso, o aumento da concentração de extrato
aparente na cerveja à saída do reator durante estes 17 dias de fermentação também
demonstrou que não foi possível atingir um estado estacionário quando se utilizou um baixo
115
0 5 10 15 20 25 30 35 400
2
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Fluxo de gases (ml/min)
Extrato original (oP)
Tempo (d)
Ext
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apa
rent
e (o P)
;
pH
0
2
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6
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Ar:
150
CO
2: 150
Ar: 25Ar: 6,6Ar: 3,3CO2: 300CO2: 330CO2: 330Ar: 250
18,51510,7
Eta
nol (
% v
/v)
fluxo de ar na fermentação. No final desse período (22,5 d) foram atingidas as concentrações
máxima de extrato aparente e mínima de etanol, correspondentes a 6,4ºP e 4,7% (v/v),
respectivamente. Nesse instante, o grau aparente de fermentação foi de 57% e o grau real de
fermentação, 48,1%. O pH pouco variou durante este período, permanecendo na faixa de 4,2 a
4,6.
Figura 32. Efeito da aeração na concentração de extrato aparente, etanol e pH durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas com leveduras imobilizadas em bagaço de malte (Temperatura: 15ºC).
Visando atingir o estado estacionário na fermentação contínua do mosto de 18,5ºP, a taxa de
diluição foi reduzida de 0,04 h-1 para 0,025 h-1 (tR = 40 h) e o fluxo de ar aumentado de
3,3 ml/min para 6,6 ml/min, mantendo o fluxo de CO2 em 330 ml/min. Apesar destas
mudanças nas condições do processo, o sistema não alcançou a estabilidade em um tempo de
10 dias de fermentação. Nesse período, o pH se manteve constante, porém a concentração de
116
etanol diminuiu constantemente até atingir um valor mínimo de 4,4% (v/v), e o extrato
aparente foi aumentando até uma concentração máxima de 9,5ºP (Figura 32). Nesse instante,
o grau aparente de fermentação foi 48,8% e o grau real de fermentação 41,7%.
Após o tempo de 32,5 dias de processo (10 dias de fermentação do mosto de 18,5ºP), o
sistema foi mantido durante 24 h sob intensa aeração, aumentando o fluxo de ar para
150 ml/min e diminuindo o fluxo de CO2 para 150 ml/min. Esta etapa teve como objetivo
melhorar o desempenho do microorganismo, aumentando a viabilidade celular. De acordo
com Van de Winkel (1995), para garantir a estabilidade operacional de sistemas contínuos
mantendo uma elevada viabilidade das leveduras durante períodos prolongados de
fermentação, é necessário realizar ciclos periódicos de elevada aeração.
Na seqüência, após o tempo de 33,5 d, o fluxo de ar foi aumentado para 25 ml/min e o fluxo
de CO2 reduzido para 300 ml/min, mantendo a taxa de diluição em 0,025 h-1. Nessas novas
condições, foi possível atingir a estabilidade do sistema após 3 tempos de residência (120 h ou
5 d), obtendo-se uma concentração de etanol de 8,4% (v/v) e uma concentração de extrato
aparente de 2,9ºP. Depois de alcançado o estado estacionário, os graus aparente e real de
fermentação foram de 84% e 70,2%, respectivamente.
Em relação à concentração celular, observa-se na Figura 33 que durante a fermentação
contínua do mosto de 15ºP houve um aumento na concentração de leveduras imobilizadas no
bagaço de malte, atingindo um valor máximo de 0,45 g cél/g sup no tempo de 22,5 d. No
entanto, esse valor não aumentou durante a fermentação contínua do mosto de 18,5ºP,
mantendo-se praticamente constante até o final do processo. Isso pode ter ocorrido devido à
composição do mosto utilizado. Como foram empregados mostos puro malte, quanto maior a
concentração de extrato original do mosto, maior a quantidade de proteínas no meio de
fermentação que podem estar competindo com as leveduras pelos sítios de adsorção na
superfície do bagaço (BRÁNYIK et al., 2002).
117
0 5 10 15 20 25 30 35 400,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Fluxo de gases (ml/min)
Extrato original (oP)
Tempo (d)
Xim
ob (g
bio
/g su
p);
----
-- D
(h-1
)
10,7 15 18,5
CO2: 300Ar: 25
CO2: 330Ar: 6,6
CO2: 330Ar: 3,3Ar: 250 C
O2: 1
50
Ar:
150
0
3
6
9
12
15
Xliv
res (g
/l);
X
imob
(g/l)
Xto
tais (g
/l)
Figura 33. Efeito da aeração na concentração de células livres (Xlivres), imobilizadas (Ximob) e totais
(Xtotais) durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades por processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Temperatura: 15ºC).
A concentração de células livres pouco variou durante todo o processo, independente da
aeração utilizada, atingindo um valor mínimo de 2,1 g/l quando o reator foi alimentado com o
mosto de 18,5ºP, e um valor máximo de 2,5 g/l ao final da fermentação. No entanto, a
viabilidade das células livres foi afetada quando a fermentação foi realizada com uma baixa
aeração (3,3 ou 6,6 ml/min de ar). A Figura 34 mostra que durante a fermentação do mosto
com concentração de extrato original de 15ºP, a viabilidade celular diminuiu
gradativamentede 95% para 86% no final do período (22,5 d). Posteriormente, na fermentação
contínua do mosto mais concentrado (18,5ºP) com baixo fluxo de ar (6,6 ml/min), a
118
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25 30 35 400,0
5,0x107
1,0x108
1,5x108
2,0x108
2,5x108
Fluxo de gases (ml/min)
Extrato original (oP)
Tempo (d)
Xliv
res (c
él/m
l)
0
5
10
15
20
25
Ar: 25Ar: 6,6Ar: 3,3CO2: 300CO2: 330CO2: 330Ar: 250
18,51510,7
Xliv
res (g
/l)
Via
bilid
ade
(%)
CO
2: 150
Ar:
150
viabilidade das células livres foi reduzida ainda mais, atingindo 82%, com um valor mínimo
de 68% observado no tempo de 31,7 d. Na seqüência do processo, a utilização de uma aeração
mais intensa (150 ml/min de ar) durante um curto período de tempo (24 h) e posterior o
emprego de um fluxo de ar de 25 ml/min, permitiram a recuperação da viabilidade das células
livres, que alcançou novamente valores de 95% durante o estado estacionário da fermentação
contínua do mosto de 18,5ºP.
Figura 34. Efeito da aeração na viabilidade e concentração de células livres (Xlivres) determinadas por contagem em câmara de Neubauer (cél/ml) e por peso seco (g/l), durante a fermentação primária para produção de cervejas de altas densidades pelo processo contínuo no reator de coluna de bolhas (Temperatura: 15ºC).
Os resultados obtidos nesta etapa do trabalho demonstraram que um adequado suprimento de
ar durante a fermentação contínua de mostos de altas densidades em reator de coluna de
bolhas, é essencial para que o processo seja realizado com eficiência. Em presença de baixos
fluxos de ar (3,3 ou 6,6 ml/min) o desempenho da fermentação foi negativamente afetado,
provavelmente devido à queda na viabilidade das células. Com o aumento no fluxo de ar para
119
25 ml/min, a viabilidade celular tornou-se elevada novamente, a produção de etanol foi
favorecida e o sistema conseguiu atingir o estado estacionário. De acordo com Wackerbauer
et al. (2004), o fornecimento de ar durante a fermentação contínua é fundamental para manter
a integridade da membrana celular da levedura devido a que os ácidos graxos insaturados e
esteróis que a compõem são sintetizados exclusivamente em presença de oxigênio.
4.3.5 ANÁLISE SENSORIAL DA CERVEJA DE ALTA DENSIDADE – TESTE TRIANGULAR
O teste triangular é um teste normalmente aplicado para determinar se existe diferença
perceptível entre dois produtos comparando-se três amostras, das quais, duas delas são iguais
e uma diferente. No procedimento deste teste pode-se pedir para o julgador identificar a
amostra diferente ou para identificar a amostra com maior intensidade de algum atributo
(STONE; SIDEL, 1985).
No presente trabalho, realizou-se uma análise sensorial da cerveja de alta densidade produzida
durante o estado estacionário da fermentação contínua do mosto de 18,5ºP (Item 4.3.4). O
teste triangular foi então aplicado para avaliar se existia diferença de sabor entre essa cerveja
e uma cerveja nacional do mercado brasileiro elaborada pelo processo descontínuo. Os
resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4.10, onde se observa que em um total de 30
respostas obtidas, apenas 2 julgamentos foram incorretos.
De acordo com a ASBC (1996), a diferença entre as amostras somente é considerada
significativa quando o número de respostas corretas for igual ou superior ao valor mínimo
tabelado, para diferentes níveis de probabilidade. Dessa forma, para um total de 30 respostas,
o número mínimo de respostas corretas tabelado é de 15, 17 e 19, para os níveis de
probabilidade de 5, 1 e 0,1%, respectivamente. Portanto, como o número de respostas corretas
obtidas neste ensaio (28) foi maior que os valores mínimos tabelados, é possível afirmar que
120
as duas amostras de cerveja avaliadas apresentaram uma diferença sensorial de sabor
significativa ao nível de 0,1% de probabilidade.
Tabela 4.10 - Respostas obtidas no teste triangular para avaliar a diferença de sabor entre a cerveja produzida por processo contínuo no reator de coluna de bolhas e uma cerveja nacional de mercado elaborada pelo processo descontínuo.
Provador Resposta Provador Resposta Provador Resposta 1 c 11 c 21 c 2 c 12 c 22 c 3 c 13 c 23 c 4 c 14 c 24 c 5 c 15 c 25 c 6 c 16 X 26 c 7 c 17 X 27 c 8 c 18 c 28 c 9 c 19 c 29 c 10 c 20 c 30 c c: Resposta correta. X: Resposta incorreta.
4.3.6 ASSEPSIA DO SISTEMA PARA OS DIFERENTES ENSAIOS
As análises em microscópio ótico das amostras de cerveja na saída do reator e do mosto no
tanque de armazenamento para os diferentes ensaios revelaram que não houve contaminação
bacteriana durante as fermentações contínuas.
121
5 CONCLUSÕES
Os resultados experimentais obtidos neste trabalho permitiram concluir que:
O bagaço de malte atuou com eficiência como suporte para a imobilização das leveduras
cervejeiras, mantendo sua integridade durante todo o processo e proporcionando a adesão das
células tanto em sua superfície como no interior de fissuras e poros.
A fermentação primária de cervejas tipo lager de altas densidades por processo contínuo
com leveduras imobilizadas em bagaço de malte, não foi realizada com sucesso em reator
“airlift” devido a problemas de entupimento na saída da cerveja.
Durante a fase inicial de imobilização das leveduras, a utilização de mosto elaborado com
adjunto com uma baixa concentração de extrato original (10,5oP), permitiu obter uma elevada
concentração de células imobilizadas (> 0,3 g cél/g sup) em um tempo menor quando
comparado a outros trabalhos que utilizaram meios sintéticos durante essa fase.
As variáveis do processo: temperatura de fermentação, concentração de extrato original e
composição do mosto na alimentação do reator, influenciaram significativamente nos
parâmetros fermentativos e na produção de compostos voláteis relacionados com o sabor das
cervejas de altas densidades, produzidas por processo contínuo em reator de coluna de bolhas.
Na produção de cerveja pelo processo contínuo utilizando mosto puro malte de 15ºP, o
aumento da temperatura de fermentação, de 7 para 15ºC, proporcionou um aumento no
consumo de nitrogênio amino livre (FAN), nos graus aparente e real de fermentação, na
velocidade de consumo de extrato e na produtividade volumétrica em etanol. Na temperatura
máxima avaliada (15ºC) obteve-se uma cerveja com uma relação entre as concentrações de
álcoois superiores e ésteres, próxima à relação considerada como ótima pela literatura para
cervejas produzidas pelo processo descontínuo.
122
O aumento na concentração de extrato original do mosto (elaborado com 100% malte ou
com malte e adjunto de alto teor de maltose) na faixa de 13,4ºP a 19,6ºP, favoreceu a
produtividade volumétrica em etanol. No entanto, nos mostos puro malte com concentração
de extrato original acima de 15ºP, houve uma elevada produção de ésteres, causando um
desequilíbrio na concentração dos compostos voláteis responsáveis pelo sabor das cervejas.
A fermentação contínua dos mostos elaborados apenas com malte (100% malte)
apresentou um melhor desempenho (maior velocidade de consumo de extrato e maior
produção de etanol) do que a fermentação contínua dos mostos elaborados com 74% de malte
e 26% de adjunto com alto teor de maltose. Por outro lado, as cervejas elaboradas a partir de
mostos com adjunto apresentaram os compostos voláteis (responsáveis pelo sabor) em níveis
mais próximos aos encontrados nas cervejas de mercado (obtidas pelo processo tradicional de
fermentação descontínua com células livres).
A imobilização das células no bagaço de malte foi afetada pelo aumento da concentração
de extrato do mosto, principalmente a partir de mostos puro malte, os quais continham
elevados teores de proteína competindo com as leveduras pelos sítios de absorção do bagaço.
Um adequado suprimento de ar durante a fermentação contínua dos mostos de altas
densidades em reator de coluna de bolhas, foi essencial para que o processo fosse realizado
com eficiência. Com a utilização de baixos fluxos de ar (3,3 ml/min e 6,6 ml/min), o sistema
não conseguiu atingir o estado estacionário.
A análise sensorial através do teste triangular, entre uma cerveja de alta densidade (extrato
original: 18,5ºP) produzida pelo processo contínuo e uma cerveja nacional do mercado
brasileiro elaborada pelo processo descontínuo, apresentou uma diferença de sabor
significativa ao nível de 0,1% de probabilidade.
De uma forma geral conclui-se que a fermentação para produção de cervejas de altas
123
densidades por processo contínuo utilizando leveduras imobilizadas em bagaço de malte,
pode ser realizada com um bom desempenho a uma temperatura de 15ºC, empregando mostos
elaborados com adjunto. Nessas condições, além da cerveja obtida apresentar características
similares às das cervejas de mercado, o uso de adjunto em substituição parcial ao malte
contribui reduzindo o custo global do processo. No entanto deve-se tomar cuidado de
fornecer, de tempos em tempos, uma elevada demanda de ar ao sistema para poder aumentar a
viabilidade celular (que diminui com o decorrer da fermentação) e assim dar seqüência ao
processo por longos períodos.
124
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132
APÊNDICES
APÊNDICE A – Equações utilizadas para determinação da porcentagem de celulose,
hemicelulose, lignina e cinzas.
As equações abaixo, foram utilizadas para determinação da porcentagem de celulose,
hemicelulose, cinzas, lignina insolúvel ou Klason (IRICK et al., 1988) e lignina solúvel
(ROCHA, 2000), presentes no bagaço de malte e nos materiais testados como suporte de
imobilização.
% celulose = Gli*5000*Fc*Fph/(PA*PSA)
% hemicelulose = (Xil*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)+(Arab*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)
% lignina insolúvel = PR*10000/(PA*PSA)
% lignina solúvel = (4,187x10-2*(Ahid280-Apd280)-3,279x10-4)*200
Apd280 = (Cfurf*Efurf)/200+(CHMF*EHMF)/200
% cinzas = PC*100/PA
Onde: Ahid280 = absorbância do hidrolisado a 280 nm; Cfurf = concentração de furfural no
hidrolisado (g/l); CHMF = concentração de hidroximetilfurfural no hidrolisado (g/l); Efurf =
absortividade do furfural (146,85 l/g cm); EHMF = absortividade do hidroximetilfurfural
(114 l/g cm); Fc = fator de conversão (0,9 para a celulose e 0,88 para a hemicelulose); Fph =
fator de perda de hidrólise (1,055 para celulose e 1,155 para hemicelulose); Gli, Xil, Ara =
concentração de glicose, xilose e arabinose, respectivamente (g/l); PA = peso inicial da
amostra (g); PC = peso de cinzas (g); PR = peso do resíduo de lignina (g); PSA = peso seco da
amostra (%).
133
APÊNDICE B – Modelo de ficha de avaliação para teste triangular.
Figura 35. Modelo da ficha de avaliação utilizada no teste triangular para avaliar a diferença de sabor entre a cerveja produzida por processo contínuo no reator de coluna de bolhas e uma cerveja nacional de mercado elaborada pelo processo descontínuo.
DATA:......................
NOME:.................................................................................................................................
Você está recebendo 3 amostras codificadas. Duas amostras são iguais e uma é
diferente.
Por favor, avalie o sabor das amostras da esquerda para a direita.
Circule a amostra DIFERENTE.
306 189 731
COMENTÁRIOS:..............................................................................................................
134
APÊNDICE C – Esquema do reator “airlift” utilizado nos experimentos.
Figura 36. Características e dimensões (em mm) do reator “airlift” utilizado nos experimentos.
70
135
489
210
15
34
Saída de cerveja fermentada
Retirada de amostras
Entrada de ar Entrada de mosto
Controle de pressão
Malha de aço inoxidável
135
APÊNDICE D – Dimensões do reator de coluna de bolhas utilizado nas fermentações para
produção de cervejas de altas densidades.
Figura 37. Dimensões (em mm) do reator de coluna de bolhas utilizado nos experimentos.
barVAC- 1. 0
100
PSI
40
1.0
30"
0
20
2.03.0
4 .0
6 .0
80
60
5.0
1980
920
240
120
160
57
1210
27
140
90
88
136
APÊNDICE E – Características do reator de coluna de bolhas utilizado nas fermentações para
produção de cervejas de altas densidades.
Figura 38. Vista frontal (A) e lateral (B) do reator de coluna de bolhas utilizado nos experimentos.
barVAC- 1. 0
100
PSI
40
1.0
30"
0
20
2.0
3.0
4 .0
6 .0
80
60
5.0A B
Saída de cerveja fermentada
Retirada de amostras
Entrada de ar
Entrada de mosto
Controle de pressão
Malha de aço inoxidável
137
ANEXOS
ANEXO A – Especificações do adjunto MOR-REX® 1557
Tabela A.1 - Especificações físico-químicas do adjunto com alto teor de maltose MOR-REX® 1557 Especificação Mínimo Máximo
Umidade (%) - 5,0
pH 4,5 5,5
Tabela A.2 - Composição aproximada em açúcares do adjunto com alto teor de maltose MOR-REX® 1557
Açúcar Mínimo (%) Máximo (%)
Dextrose - 12
Maltose 42 -
Maltotriose 10 -
Dextrinas 23 28
138
ANEXO B – Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte utilizado como suporte de
imobilização das leveduras durante a fermentação contínua para produção de cervejas de altas
densidades.
Figura 39. Fotomicrografia de partícula de bagaço de malte utilizado como suporte. Ampliação: 1000 vezes.
139
ANEXO C – Trabalhos premiados.
Dois trabalhos apresentados com os resultados obtidos no presente estudo foram reconhecidos
em eventos de divulgação nacional.
O trabalho “Aproveitamento de subproduto da indústria cervejeira como suporte para
imobilização de leveduras”, recebeu o prêmio Leopold Hartman – 1º lugar no XIX Congresso
Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos realizado em 2004, em Recife – PE.
O trabalho “Utilização de mostos concentrados na produção de cervejas pelo processo
contínuo: novas tendências para o aumento da produtividade”, recebeu o prêmio sbCTA-PR
de Incentivo à Pesquisa Renato João Sossela de Freitas – 1º lugar da área de Microbiologia,
Micotoxicologia e Biotecnologia no XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de
Alimentos realizado em 2006, em Curitiba – PR.
140
ANEXO D – Recomendações para futuros trabalhos.
Para complementar este estudo dando continuidade à fermentação primária para produção de
cervejas de altas densidades pelo processo contínuo utilizando o bagaço de malte como
suporte de imobilização das leveduras, são dadas as seguintes sugestões:
Realizar uma análise comparativa dos custos envolvidos na fermentação primária para
produção das cervejas de altas densidades pelo processo contínuo em relação aos custos do
processo tradicional de fermentação pelo processo descontínuo.
Avaliar a possibilidade de ampliação de escala do sistema.
Comparar o desempenho da levedura cervejeira utilizada neste trabalho com outras
leveduras tipo lager e ale, durante a fermentação primária pelo processo contínuo.
Propor uma etapa de maturação contínua acoplada ao sistema contínuo de fermentação
primária.