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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

CAMILA BARBOSA PINHEIRO JEREISSATI

ANÁLISE PROTEÔMICA DE PLASTÍDEOS DO ENDOSPERMA DE SEMENTES EM

DESENVOLVIMENTO DE PINHÃO MANSO (Jatropha curcas L.)

Fortaleza – CE 2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

CAMILA BARBOSA PINHEIRO JEREISSATI

ANÁLISE PROTEÔMICA DE PLASTÍDEOS DO ENDOSPERMA DE SEMENTES EM

DESENVOLVIMENTO DE PINHÃO MANSO (Jatropha curcas L.)

Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica vegetal. Orientador: Prof. Francisco A. P. Campos. Co-orientador: Prof. Fabio C. S. Nogueira.

Camila Barbosa Pinheiro Jereissati

Fortaleza - CE 2015

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CAMILA BARBOSA PINHEIRO JEREISSATI

ANÁLISE PROTEÔMICA DE PLASTÍDEOS DO ENDOSPERMA DE SEMENTES EM

DESENVOLVIMENTO DE PINHÃO MANSO (Jatropha curcas L.)

Aprovada em: 24 de fevereiro de 2015

BANCA EXAMINADORA

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Com amor, dedico aos Meus Pais.

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AGRADECIMENTOS

A Deus agradeço pela benção diária e pela graça de viver!

Aos meus pais Maria Edvani Barbosa Pinheiro e Francisco das Chagas Almeida Pinheiro

por todo amor, dediação, apoio e zelo. Por serem exemplo do real significado do amor e de

bons princípios. A vocês dedico todas as minhas conquistas. À vocês todo o meu amor e

gratidão!

Ào meu esposo, Emmanuel de Sousa Jereissati, meu amor, companheiro, confidente, por ter

me acompanho e me apoidado durante toda a minha formação acadêmica! Obrigada por

caminhar ao meu lado!

Ao Professor Francisco de Assis de Paiva Campos, por tamanha contribuição durante toda

minha formação acadêmica, por todos os ensinamentos. Por ter me apresentado e

possibilitado vivenciar ricas experiências, não somente no seu laboratório como em outros

centros de pesquisa. E por ser um exemplo de profissional competente e comprometido,

cientista admirável, o qual tem todo o meu respeito e estima. Muito obrigada professor!

Ao Professor Fábio Cesar Sousa Nogueira, agradeço por toda orientação, conselhos, apoio

e amizade. Sua competência, disciplina, dedicação e compromisso profissional são

inspiradores. Sua contribuição foi fundamental para a execução bem sucedida desse trabalho.

Ao Professor Gilberto Barbosa Domont, por todo suporte e colaboração para o

desenvolvimento desse trabalho, por me receber sempre de forma tão acolhedora. Também

agradeço por sua estimada presença e contribuições como membro da banca examinadora

desta tese.

À Professora Arlete Aparecida Soares, a quem adimiro desde a minha graduação. Obrigada

pelos ensinamentos e agradáveis contribuições durante a realização de experimentos no seu

laboratório.

Ao Professor Osmundo Brilhante, a quem tenho profundo respeito e estima. Agradeço sua

prezada presença como membro da banca e por todas as sugestões e contribuições feitas ao

trabalho.

Ao Mohib e à Emanolella (Manu), pela parceria, amizade, agradável convívio, por terem sido

sempre tão prestativos. Agradeço especialmente ao Mohib por ter contribuído sempre de forma

tão intensa durante a execução desse trabalho.

Ao Dr. Paulo Costa Carvalho, pela colaboração e suporte durante a análise dos dados

proteômicos.

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Aos integrantes do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas do Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do Ceará (UFC), em especial à Magda (Magdazinha),

Verônica (Vevé), Washington que me ajudaram sempre de forma bastante prestativa durante

parte da condução experimetal e ao Fabiano, Antônio, Tiago, Muciana e Gabriela conviver

com todos vocês foi um prazer!

À Unidade Proteômica do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro e

aos seus integrantes e colaboradores.em especial ao Gabriel Araújo e Rafael Melani.

Aos meus irmãos Bruno e Milena Barbosa Pinheiro pelo estímulo, confiança e por nossa

verdadeira relação de união e amor. Aos meus queridos cunhados Silvana Medeiros,

(comadre) e Igor Maia. E ao meu Príncipezinho: Samuel (Samuca) por me proporcionar tanta

alegria!

À família Sousa Jereissati: minha querida sogra Tânia Maria, Tio Francisco, Isabele,

Warnney, Nicoly, Yasmin, Raquel , Léo e Leozinho por todo amor, apoio e torcida.

Aos meus tios, em especial à tia Liduina, pela sua presença, dedicação, apoio e amor.

Minhas conquistas pessoais e profissionais também são impulsionadas pela senhora! Obrigada

tia!

À Carol (Carólis), Danielle (Dani), Jacilane (Jaci) e Raquel (Kelites), amigas desde a

graduação, passando pelo mestrado e doutorado (ufaaa :)!!!). Espero que a nossa amizade

perdure por muitas e muitas outras fases! Obrigada pelo apoio e por proporcionarem

momentos de leveza e descontração, principalmente naqueles dias mais difíceis! Um lanche

faz a diferença!

A todos os integrantes do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal do Ceará.

Às queridas amigas de sempre Camila (Kemilis), Areti (Boquitchas) e Rejane (Rejanuda),

por estarem sempre na torcida, pela força e apoio no meu dia a dia!

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições:

- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Banco do Nordeste (BNB), Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Petróleo Brasileiro (PETROBRAS), das quais recebeu auxílio financeiro.

- Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará (UFC).

- Laboratório de Química de Proteínas – Unidade de Proteômica do Instituto de Química (UFRJ).

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RESUMO O pinhão manso (Jatropha curcas L.) é uma planta nativa da América, pertencente à família Euphorbiaceae. Atualmente, ela desperta interesse econômico principalmente por se tratar de uma oleaginosa com potencial para a produção de biodiesel. Entretanto, a presença de ésteres de forbol (uma classe de diterpeno), que são os principais constituintes tóxicos das sementes, limita uma melhor utilização dessa planta, por inviabilizar o uso do resíduo de extração do óleo das sementes na alimentação animal, bem como, por apresentar atividade pró-carcinogênica e ação inflamatória. A análise proteômica de plastídeos, isolados de sementes em desenvolvimento de pinhão manso, é uma importante vertente de estudo, pois tanto a síntese de ácidos graxos como dos ésteres de forbol, os dois compostos mais atrativos no estudo de Jatropha curcas, ocorrem nos plastídeos. O estudo proteômico dessa organela torna-se crucial para melhor compreender e explorar não somente as vias biossintéticas desses dois compostos, como de outras vias metabólicas, além de proporcionar um conjunto de dados que pode ser utilizado em pesquisas voltadas para o desenvolvimento de genótipos com características mais adequadas para aplicações industriais. No presente trabalho, realizou-se uma análise proteômica de plastídeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, que estavam nos estágios iniciais de deposição de lipídios e proteínas de reserva (25-30DAA), confirmados por meio de análises histológica e histoquímica. As proteínas extraídas dos plastídeos foram digeridas com tripsina e os peptídeos foram aplicados no sistema de nano-LC EASYII acoplado online ao espectrômetro de massa nano ESI LTQ-Orbitrap velos, o que resultou na identificação 1103 proteínas, representando 804 grupos de proteínas, dos quais 923 foram consideradas identificações verdadeiras. Isso expandiu consideravelmente o repertório de proteínas do pinhão manso até agora identificas. Dentre as proteínas identificadas, apenas 5 são codificadas pelo genoma plastidial, e nenhuma delas está envolvida na fotossíntese, o que evidencia a natureza não fotossintética dos plastídeos isolados. Homólogos de 824, dentre as 923 proteínas identificadas, estavam presentes nos bancos de dados PPDB, SUBA e PlProt, enquanto homólogos para 13 proteínas não foram encontrados em nenhum dos três bancos de dados plastidiais, mas foram detectados como plastidiais por pelo menos um dos três programas de predição de localização subcelular utilizados (TargetP, ChloroP, PlantMPloc). A classificação funcional mostrou que a maioria das proteínas identificadas pertencia ao metabolismo dos aminoácidos, seguido dos metabolismos dos carboidratos, energético e dos lipídios. As subunidades maiores e menores da Rubisco foram identificadas, e sua presença nos plastídeos foi considerada uma característica adaptativa para contrabalancear a perda de um terço do carbono na forma de CO2 como um resultado da conversão de carboidratos em óleo através da glicólise. Apesar de enzimas envolvidas na biossíntese de diversos precursores dos diterpenóides terem sido identificadas, não foi detectado nenhuma terpeno sintase/ciclase, o que sugere que os plastídeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento não sintetizam ésteres de forbol, apesar de uma grande quantidade desse composto ser encontrada neste tecido. Como conclusão, o presente trabalho proporciona insights sobre as principais vias biossíntéticas, e sobre características peculiares dos plastideos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento.

Palavras chave: Jatropha curcas. Proteômica de oleaginosas. Proteômica plastidial, Proteômica de plantas. Ésteres de forbol.

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ABSTRACT

Jatropha curcas L. is a plant native to America and belongs to the Euphorbiaceae family. Currently it is gaining economical interest mainly because it is an oilseed crop with potential to produce biodiesel. However, presence of phorbol esters (a class of diterpenes) that are the major toxic constituents of the seeds, limits a better usage of the plant, by making the use of the residue, obtained after the oil extraction from the seeds, unfeasible for animal feed, due to its pro-carcinogenic activity and inflammatory action. Proteomic analysis of the plastids isolated from developing seeds of Jatropha is important because the synthesis of fatty acid as well as phorbol esters, the two most attractive compounds in the study of Jatropha curcas, occur in plastids. Proteomic analysis of this organelle is crucial to better understand and explore not only the biosynthetic pathway of these two compounds but other metabolic pathways , and addtionaly providing foundation for researchs that aimed to develope genotypes with more suitable characteristics for industrial applications. In this study, we performed a proteomic analysis of plastids isolated from the endosperm of developing Jatropha curcas seeds that were in the initial stage of deposition of protein and lipid reserves. Proteins extracted from the plastids were digested with trypsin, and the peptides were applied to an EASY-nano LC system coupled online to an ESI-LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer, and this led to the identification of 1103 proteins representing 804 protein groups, of which 923 were considered as true identifications, and this considerably expands the repertoire of J. curcas proteins identified so far. Of the identified proteins, only five are encoded in the plastid genome, and none of them are involved in photosynthesis, evidentiating the nonphotosynthetic nature of the isolated plastids. Homologues for 824 out of 923 identified proteins were present in three different plastids proteins databases i.e. PPDB, SUBA and PlProt, while homologues for 13 proteins were not found in any of these three databases but were marked as plastidial by at least one of the three prediction programs used (TargetP, ChloroP and PlantMPloc). Functional classification showed that proteins belonging to amino acids metabolism comprise the main functional class, followed by carbohydrate, energy, and lipid metabolisms. The small and large subunits of Rubisco were identified, and their presence in plastids is considered to be an adaptive feature counterbalancing for the loss of one-third of the carbon as CO2 as a result of the conversion of carbohydrate to oil through glycolysis. While several enzymes involved in the biosynthesis of several precursors of diterpenoids were identified, we were unable to identify any terpene synthase/cyclase, which suggests that the plastids isolated from the endosperm of developing seeds do not synthesize phorbol esters. In conclusion, this study provides insights into the major biosynthetic pathways and certain unique features of the plastids from the endosperm of developing seeds at the whole proteome level.

Keywords: Jatropha curcas. Proteomics of oil crop. Plastid proteomics. Plant

proteomics. Phorbol esters

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Aspectos morfológicos do pinhão manso. 17

Figura 2 Distribuição de plantas do pinhão manso no mundo (World Agroforesty Centre - WAC, 2013). 18

Figura 3 Visão geral das principais reações envolvidas na síntese de ácidos graxos e triacilglicerídeos (Bates; Stymne; Ohlrogge, 2013). 23

Figura 4 Estruturas formadoras dos ésteres de forbol (Adaptado de EVANS, 1986). 27

Figura 5 Estruturas de seis tipos de ésteres de forbol identificados em Jatropha curcas (Hass et al., 2002). 28

Figura 6 Diversidade de formas de plastídeos e suas interconversões (Adaptado de JARVIS; LÓPEZ-JUEZ, 2013). 31

Figura 7 Esquema do LTQ Orbitrap Velos. 42

Figura 8 Processo adotado para o preparo da amostra para ser analisada por espectrometria de massa. 50

Figura 9 Esquema mostrando as etapas adotadas para a análise dos dados obtidos por espectrometria de massa. 53

Figura 10 Histologia e histoquímica do endosperma de sementes do pinhão manso com 25 e 30 DAA.

55

Figura 11 Isolamento dos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão manso. 57

Figura 12 Diagrama de Venn mostrando o número de proteínas marcadas como plastidial. 61

Figura 13 Diagrama mostrando a comparação entre o proteoma plastidial do pinhão manso e as proteínas identificadas a partir de outros tipos de plastídeos. 64

Figura 14 Classificação funcional das proteínas identificadas no endosperma de plastídeo do pinhão manso, baseada no mapeamento das vias metabólicas pelo KEGG.

66

Figura 15 A enzima aleno ciclase oxidase faz parte do processo de conversão do acido linolênico à ácido jasmônico. 100

Figura 16 Via biossintética dos ésteres de forbol em plantas, segundo Dewick (2002).

103

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Comparação entre a composição de ácidos graxos (%) nas principais oleaginosas comerciais e no pinhão manso.

21

Tabela 2 Transportadores dos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no banco de dados do TCDB.

70

Tabela 3 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos aminoácidos, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

80

Tabela 4 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos carboidratos, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

89

Tabela 5 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos lipídios, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

97

Tabela 6 Proteínas relacionadas com o metabolismo secundário, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

104

12

LISTA DE TABELAS SUPLEMENTARES

Tabela suplementar 1

Total de proteínas identififcadas e seus grupos correspondentes (planilha 1). Proteínas que apareceram em pelo menos duas replicatas biológicas as quais foram analizadas quanto a sua localização subcelular e função (planilha 2).

Tabela suplementar 2 Novas proteínas identificadas a partir do plastídeos de sementes em desenvolvimento do pinhão manso.

Tabela suplementar 3 Classificação das proteínas de acordo com o banco de dados de transportadores (http://www.tcdb.org/).

Tabela suplementar 4 Mapeamento das proteínas identificadas por meio das vias metabólicas do KEGG.

13

SUMÁRIO

RESUMO ............................................................................................................................................. 8

ABSTRACT ......................................................................................................................................... 9

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 10

LISTA DE TABELAS ....................................................................................................................... 11

LISTA DE TABELAS SUPLEMENTARES .................................................................................. 12

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 14

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................................... 16

2.1 O PINHÃO MANSO ............................................................................................................................ 16

2.2 LIPÍDIOS ........................................................................................................................................... 19

2.2.1 Síntese de ácidos graxos..................................................................................................... 20

2.3 TOXICIDADE DA SEMENTE ................................................................................................................ 24

2.3.1 Curcina ................................................................................................................................... 24

2.3.2. Ésteres de forbol .................................................................................................................. 25

2.4 PLASTÍDEOS: SUA IMPORTÂNCIA NO ESTUDO DE SEMENTES DE PINHÃO MANSO ........................... 29

2.5 GENÔMICA, TRANCRIPTÔMICA E PROTEÔMICA DO PINHÃO MANSO .............................................. 32

2.6 PROTEÔMICA DE PLANTAS .............................................................................................................. 34

2.7 PROTEÔMICA DE PLASTÍDEOS ......................................................................................................... 36

2.8 ESTRATÉGIAS PROTEÔMICAS .......................................................................................................... 37

2.9 ESPECTROMETRIA DE MASSA .......................................................................................................... 38

2.9.1 Ionização por electrospray ................................................................................................... 39

2.9.2 LTQ-Orbitrap velos ............................................................................................................... 40

3 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 43

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................................ 43

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 43

4. METODOLOGIA ........................................................................................................................... 44

4.1 MATERIAL VEGETAL ......................................................................................................................... 44

4.2 PREPARAÇÃO HISTOLÓGICA DE SEMENTES EM DESENVOLVIMENTO DO PINHÃO MANSO ............... 44

4.3 PREPARAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SEMENTES EM DESENVOLVIMENTO DO PINHÃO MANSO ............. 44

4.4 ISOLAMENTO DE PLASTÍDEOS DO ENDOSPERMA DE SEMENTES EM DESENVOLVIMENTO DO PINHÃO

MANSO .................................................................................................................................................... 45

4.5 PROCESSAMENTO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO

(MET) .................................................................................................................................................... 46

4.6 ESTABELECIMENTO DE MAPAS BIDIMENSIONAIS DA FRAÇÃO ENRIQUECIDA DE PLASTÍDEOS ......... 46

4.6.1 Extração de proteínas .......................................................................................................... 46

4.6.2 Eletroforese bidimensional, revelação e análise da imagem ......................................... 47

4.7 DIGESTÃO PROTEICA EM SOLUÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS PEPTÍDEOS ............................................ 47

4.7.1 Digestão proteica .................................................................................................................. 47

4.7.2 Purificação dos peptídeos utilizando spin columns ......................................................... 48

4.8 NANO-LC MS/MS ........................................................................................................................... 48

4.9 ANÁLISE DOS DADOS ....................................................................................................................... 51

4.9.1 Interpretação dos espectros de MS/MS ............................................................................ 51

4.9.2 Processamento e filtragem dos dados............................................................................... 51

14

4.9.3 Descrição e classificação funcional das proteínas .......................................................... 51

4.9.4 Obtenção dos ortólogos ....................................................................................................... 52

4.9.5 Localização subcelular das proteínas ................................................................................ 52

4.9.6 Disponibilização dos dados brutos e tabelas suplementares ......................................... 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 54

5.1 MATERIAL VEGETAL ......................................................................................................................... 54

5.2 ISOLAMENTO DE PLASTÍDEOS .......................................................................................................... 56

5.3 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL ..................................................................................................... 56

5.4 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS ...................................................................................................... 58

5.4.1 Proteínas codificadas no genoma plastidial ...................................................................... 58

5.4.2 Localização subcelular ......................................................................................................... 59

5.5 COMPARAÇÃO COM OUTROS PLASTIDOMAS DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS ................................ 63

5.6 CLASSIFICAÇÃO FUNCIONAL DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS ........................................................ 65

5.7 PRINCIPAIS CLASSES FUNCIONAIS IDENTIFICADAS NAS ANÁLISES PROTEÔMICAS DE PLASTÍDEOS

DO ENDOSPERMA DE SEMENTES EM DESENVOLVIMENTO DE PINHÃO MANSO ...................................... 67

5.7.1 Proteínas relacionadas com atividade transportadora .................................................... 67

5.7.2 Proteínas relacionadas com metabolismo dos aminoácidos ......................................... 79

5.7.3 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos carboidratos ....................................... 87

5.7.4 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos lipídios ................................................ 96

5.7.5 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos Terpenóides .................................... 101

6 CONCLUSÃO ............................................................................................................................... 106

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................................ 107

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 108

14

1 INTRODUÇÃO

A espécie Jatropha curcas, popularmente conhecida como pinhão manso, é uma

oleaginosa, pertencente à família Euphorbiaceae, cultivada principalmente nas regiões

tropicais e subtropicais. Alguns atributos, tais como baixo custo de produção, alto teor de

óleo das sementes, tolerância à seca, capacidade de prosperar em solo degradado, e

possibilidade de ser plantada em terras marginais, inadequadas para as culturas

alimentares, faz com que esta planta seja extremamente atrativa economicamente para a

produção de biodiesel (FAIRLESS, 2007). No entanto, o pinhão manso apresenta algumas

características indesejáveis, tais como uma maior proporção de flores masculinas do que de

femininas, o que limita a sua produtividade; e a presença de ésteres de forbol, um diterpeno

extremamente tóxico que impede a utilização do resíduo remanescente da extração do óleo,

rico em proteínas, na alimentação animal (YE et al., 2009).

A síntese de ácidos graxos e ésteres de forbol, bastante visados nos estudos com o

pinhão manso ocorre nos plastídeos. Os ácidos graxos possibilitam a utilização dessa

espécie para a produção de biodiesel em larga escala; e os ésteres de forbol, são os

principais compostos tóxicos presentes nas sementes. Os plastídeos são organelas de

células de algas e vegetais, de origem endossimbiótica, e são sítios de uma diversidade de

vias bioquímicas, como de síntese de ácidos graxos, de muitos aminoácidos, de vários

outros metabólitos primários e secundários, e de assimilação do carbono, enxofre e

nitrogênio (FISCHER, 2011). O estudo detalhado dessas organelas em sementes de pinhão

manso, torna-se, portanto, crucial para melhor entender e explorar não somente a

biossíntese dos ácidos graxos e ésteres de forbol, mas também para obtenção de um maior

conhecimento de como se processa as diversas vias metabólicas que neles ocorrem.

Análises transcriptômica e genômica podem ser utilizadas para revelar e tornar cada

vez mais claro os mecanismos regulatórios e metabólicos que ocorrem nas células. No

entanto, quando essas análises são realizadas nos plastídeos, elas podem não ser tão

informativas, pois a quantidade de genes expressos nessas organelas é insuficiente para

explicar os dados extensos e precisos da diversidade bioquímica que nelas ocorrem. Por

exemplo, o sequenciamento do genoma do cloroplasto de tomate, do plastídeo de cenoura e

do cloroplasto do pinhão manso mostrou que eles são compostos por apenas 114 , 115 e

130, genes, respectivamente (KAHLAU et al., 2006, RUHLMAN et al., 2006 e ASIF et al.,

2010). Apesar da baixa quantidade de genes no genoma plastidial, infere-se, a partir de

dados experimentais e de bioinformática, que a quantidade de proteínas nesta organela é

cerca de 2700. Isto é devido ao fato de aproximadamente 95% das proteínas plastidiais

15

serem expressas a partir do genoma nuclear e importadas do citoplasma para os plastídeos

(SOLL, 2002; MILLAR et.al., 2006; BARSAN et al., 2010).

A maioria das proteínas codificada no genoma dos cloroplastos desempenha um

papel nos eventos fotossintéticos como: componentes da maquinaria de expressão gênica

do cloroplasto e subunidades de seis complexos fotossintéticos, e apenas algumas

proteínas estão envolvidas em outros processos como na regulação do metabolismo de

carbono (KAMAL et al., 2012; MAJERAN et al., 2012). No pinhão manso, o estudo do

proteoma de plastídeos não fotossintéticos possibilitará um aumento na identificação de

outras proteínas plastidiais e proporcionará informações que eventualmente poderão ser

aplicadas para obtenção de plantas que produzam sementes com maior teor de ácidos

graxos, apropriados para a produção de biocombustíveis, e livre de compostos tóxicos,

garantindo a segurança biológica durante o manuseio quando a extração do óleo é

efetuada, e permitindo que o seu produto possa ser utilizado como alimento para animais.

Dessa forma, o presente trabalho, com o intuito de conhecer as enzimas envolvidas

nas vias metabólicas que ocorrem nos plastídeos, analisou o proteoma de plastídeos não

fotossintéticos, isolados a partir do endosperma de sementes em desenvolvimento de

pinhão manso, por meio de nanocromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de

massa (nanoLC-MS/MS).

16

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 O pinhão manso

O pinhão manso (Jatropha curcas L.) é uma planta nativa da América, atualmente

também é encontrada em países da África e Ásia (SILITONGA et al., 2013; World

Agroforesty Centre (WAC), 2013). Essa espécie pertence à família Euphorbiaceae,

subfamília Crotonideae e gênero Jatropha, o qual inclui cerca de 175 espécies

(OPENSHAW, 2000; LAKSHMINARAYANA; SUJATHA, 2001). A representação morfológica

dessa planta e sua distribuição mundial podem ser observadas nas figuras 1 e 2

respectivamente.

O pinhão manso pode ser cultivado em áreas de solos pouco férteis e de clima

desfavorável à maioria das culturas alimentares tradicionais, como por exemplo, no

semiárido nordestino, pois essa espécie é bastante resistente à seca (FRANCIS, 2005). Por

ser perene, também contribui para a conservação do solo e reduz o custo de produção, fator

importante para sua viabilidade econômica, especialmente na agricultura familiar. Em várias

partes do mundo representantes do gênero Jatropha são utilizados para a recuperação de

áreas em processo de desertificação e de terras improdutivas, já que as folhas, ao cair

durante os meses do inverno, acumulam-se no solo em torno da zona da raiz das plantas,

melhorando a fertilidade do mesmo (KUMAR; SHARMA, 2011). Além dessas propriedades,

o pinhão manso é uma oleaginosa que pode ser utilizada para a produção de biodiesel

devido às características do óleo armazenado nas suas sementes (ATABANI et al., 2013).

Estudos sobre fontes renováveis de energia vêm se intensificando nos últimos anos

com o objetivo de se obter alternativas que minimizem problemas como a escassez e a alta

no preço do petróleo, e que proporcionem menor agressão ambiental. Dentre essas fontes,

o biodiesel pode ser importante também para reduzir a importação de óleo diesel, podendo

ser promissor para o desenvolvimento econômico do Brasil (FAZAL et al., 2011).

O biodiesel é definido como ésteres monoalquílicos de óleos vegetais e gorduras

animais produzidos através do processo de transesterificação (BALAT, 2011; XUE, GRIFT,

HANSEN, 2011). Ele é biodegradável, renovávele produz menos emissões nocivas ao meio

ambiente, sendo portanto ecologicamente mais aceito que o diesel de gasolina (MOFIJUR et

al., 2012). O biodiesel obtido do pinhão manso, portanto, é reportado como sendo uma boa

alternativa para substituir o diesel de gasolina, devido à sua disponibilidade, potencial de

sustentabilidade e apresentar menores preços no mercado (BERCHMANS; HIRATA, 2008).

17

Figura 1 - Aspectos morfológicos do pinhão manso. (http://bibdigital.rjb.csic.es] |Date=1880-1883|Author=Francisco Manuel Blanco (O.S.A.). ommons.wikimedia.org/wiki/File: Jatropha_curcas_Blanco2.384.png)

18

Nativa: Belize, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicaragua Panama.

Exótica: Angola, Antígua e Barbuda, Argentina, Bahamas, Barbados, Benim, Bolívia, Brasil, Burquina Faso, Camboja, Camarões, Cabo Verde, República Africana Central, Chade, China, Colombia, Costa do Marfim, Cuba, República Democrática do Congo, Domínica, República Dominicana, Equador, Egito, Eritreia, Etiópia, Guiana Francesa, República Gabonesa, República da Gâmbia, Gana, Grenada, Guadalupe, Guiné, Guiné-Bissau, Haiti, Índia, Indonésia, Jamaica, Japão, Quenia, Laos, Libéria, Madagascar, Malawi, Malásia, República do Mali, Martinica, Mauritânia, Montserrat, Moçambique, Myanmar, Namíbia, Nepal, Antilhas Neerlandesas, Nigéria, Peru, Filipinas, Portugal, Porto Rico, República Democrática de São Tomé e Príncipe, Senegal, Serra Leoa, Somália, África do Sul, Sri Lanca, Federação de São Cristóvão e Neves, Santa Lúcia, São Vicente e Granadinas, Tanzania, Tailândia, República Togolesa, Trindade e Tobago, Uganda, US, Venezuela, Vietnã, Ilhas Virginia (US), Zanzibar, República do Zimbábue.

Figura 2 - Distribuição de plantas do pinhão manso no mundo (World Agroforesty Centre (WAC), 2013; SILITONGA et al. 2013).

19

O biodiesel do pinhão manso, quanto às propriedades fluidodinâmicas, massa

específica e viscosidade, atendem às especificações da Portaria ANP no310/2001

(Petrodiesel- óleo diesel mineral); o ponto de fulgor, parâmetro importante para a segurança

durante o manuseio do combustível, apresenta valor dentro das especificações da Portaria

ANP no 42/2004 (MELO et al., 2006). As propriedades do biodiesel do pinhão manso

atendem às especificações da D6751-02 ASTM, que é a especificação padrão para o

biodiesel (B100 -biodiesel puro) e indica que o mesmo é adequado para ser utilizado em

motores a diesel (MOFIJUR et al., 2013).

Por se tratar de uma oleaginosa, com potencial para produção de biodiesel,

considerações sobre os lipídios se fazem pertinentes.

2.2 Lipídios

Os lipídios apresentam importantes funções biológicas para as plantas. Gorduras e

óleos são formas importantes de armazenamento de carbono reduzido em muitas sementes

e são compostos capazes de produzir grande quantidade de energia (SLABAS; FAWCETT,

1992). Além dos lipídios de reserva, são também importantes os fosfolipídios polares,

constituintes essenciais do sistema de membranas celulares e organelas. A organização das

membranas afeta diretamente a normalidade dos processos fisiológicos em sementes, como

a germinação, a dormência, a manifestação do vigor, a tolerância à dessecação e o

condicionamento fisiológico (NERY, 2006). Outros lipídios como as ceras, que constituem a

cutícula reduzem a perda de água de tecidos expostos e dificultam a invasão de patógenos,

proporcionando proteção à planta; os terpenóides (isoprenóides) incluem os carotenóides

que estão envolvidos na fotossíntese e os esteróis os quais estão presentes em muitas

membranas vegetais, também desempenham função de destaque nos vegetais

(BUCHANAN et al., 2000). Além de desempenhar papeis biológicos importantes, o óleo

produzido por uma variedade de oleaginosas, como a soja, o babaçu, o girassol, a canola, o

amendoim, a mamona e o pinhão manso, desperta interesse econômico para a sociedade,

na medida em que o mesmo é vinculado à produção de biodiesel (SUBRAMANIAN et al.,

2005). Em se tratando do semiárido do Nordeste brasileiro, a produção de biodiesel a partir

do óleo de mamona vem recebendo grande destaque. Contudo, outras oleaginosas

adaptadas ao clima desfavorável dessa região, como o pinhão manso, objeto de estudo

desse trabalho, merecem estudos mais aprofundados.

20

2.2.1 Síntese de ácidos graxos

A composição de ácidos graxos do óleo determina as suas propriedades e sua

utilidade. A maioria das plantas produz apenas um pequeno número de ácidos graxos com

16 ou 18 carbonos de comprimento, com nenhuma a três duplas ligações em posições

específicas. Estes são muitas vezes referidos como os ácidos graxos "comuns" e eles são

os ácidos graxos predominantes de óleos vegetais comerciais, como da soja (Glycine max

L., Fabaceae), dendê (Elaeis guineensis., Arecaceae), canola (Brassica napus L.,

Brassicaceae) e girassol (Helianthus annuus L., Asteraceae) (SMITH, 2007). Dentro do

reino vegetal, no entanto, um conjunto diversificado de ácidos graxos "incomuns" é

sintetizado, muitos dos quais seriam matérias-primas industriais valiosas se disponíveis em

quantidades suficientes. Esses ácidos graxos diferem dos ácidos graxos comuns em

aspectos como o comprimento da cadeia, grau de insaturação e posição de dupla ligação,

ou pela presença de funções químicas, tais como hidroxila, grupos acetilênicos e

halogênicos (BADAMI e PATIL, 1981). Embora estes ácidos graxos possam estar presentes

em níveis elevados em óleos de sementes, eles são geralmente encontrados somente em

um pequeno número de espécies de plantas, a maioria das quais não tem características

agronômicas adequadas à produção comercial, sendo a mamona uma exceção, pois produz

ácido ricinoléico, ácido graxo incomum, em altos níveis e apresenta características que

possibilitam sua aplicação comercial, sendo matéria prima para a produção de biodiesel e

lubrificante.

A composição de ácidos graxos do óleo do pinhão manso apresenta um predomínio

de ácido oléico (C18: 1) seguido de ácido linoléico (C18: 2). O seu óleo atende aos

requisitos necessários para produção de combustível como baixa acidez e boa estabilidade

em relação ao óleo de soja, baixa viscosidade, em comparação com óleo de mamona. O

óleo fresco desta planta é inodoro e incolor (ACHTENA et al., 2008; ABDULLA et al, 2011).

A composição dos principais ácidos graxos das principais oleaginosas comerciais e do

pinhão manso está apresentada na tabela 1.

21

Tabela 1 - Composição de ácidos graxos (%) nas principais oleaginosas comerciais e no pinhão manso (aSMITH, 2007; bCONCEIÇÃO et al., 2007; cACHTENA et al., 2008).

Ácido graxo Sojaa Palmaa

(mesocarpo) Palmaa

(amendoa) Canolaa Girassola Mamonab Pinhão mansoc

Laurico (C12:0)

45

Mirístico (C14:0)

18

Palmítico (C16:0) 9 48 9 4 7 0.7 14,54

Esteárico (C18:0) 4 4 3 2 5 0,9 6,3

Oléico (C18:1) 24 36 15 60 19 2.8 42,02

Linoléico (C18:2) 54 10 8 20 68 4.4 35,38

Linolênico (C18:3) 8 11 1 0.2

Ricinoleico (C18:1ω)

90.2

22

Como já mencionado, a síntese de ácidos graxos (FA) ocorre nos plastídeos (Figura

3a), já a montagem da molécula de triacilglicerídeos (TAG) pode ocorrer tanto no retículo

endoplasmático (ER) como nos oleossomos (Figura 3 b, c) (CHAPMAN; DYER; MULLEN,

2012). Na maioria das sementes, o carbono é entregue a síntese dos ácidos graxos através

da via da glicólise sendo as hexoses e / ou trioses os principais carboidratos que entram nos

plastídeos. Os plastídeos de sementes oleaginosas em desenvolvimento não são

fotossintéticos (leucoplastos). Eles, portanto, têm que importar moléculas do citosol para

gerar precursores para biossíntese dos ácidos graxos, sendo o ATP, NADH, NADPH e o

acetil – CoA seus precursores diretos. Nos leucoplastos de endosperma de mamona o

substrato mais utilizado na biossíntese de ácidos graxos é o malato, pois seus leucoplastos

contêm a enzima málica dependente de NADP, que pode funcionar tanto no fornecimento

de carbono, como de NADPH para a biossíntese dos ácidos graxos. Essa enzima, por

conferir à mamona a capacidade de gerar piruvato e NADPH dentro do leucoplasto, está

envolvida com a capacidade excepcional de síntese e estocagem de lipídios no endosperma

de suas sementes (SHEARER et al., 2004).

A via de síntese de ácidos graxos nos plastídeos determina o comprimento da cadeia

(até 18 átomos de carbono) e o nível de ácidos graxo saturados no óleo das sementes. A

primeira enzima que atua nessa via é a acetil-CoA carboxilase (ACCase). Assim como nos

animais, leveduras e bactérias, em plantas a ACCase é altamente regulada e é um ponto

chave de controle sobre o fluxo de carbono para os ácidos graxos (NIKOLAU; OHLROGGE;

WURTELE, 2003). A formação dos ácidos graxos ocorre por intermédio da proteína

carreadora de grupo acila (ACP), através de um ciclo de quatro reações que alonga a cadeia

acila com dois átomos de carbono em cada ciclo. Decorridos sete ciclos, a molécula de acil-

ACP contendo 16 carbonos saturados pode ser hidrolisada pela ação da acil-ACP

tioesterase (FatB) ou ser mais alongada a 18:0-ACP, pela ação da cetoacil- ACP sintase II

(KASII), a qual é, em seguida, dessaturada para 18: 1-ACP e hidrolisada pela tioesterase A

(FatA) (LI-BEISSON et al., 2013). Os ácidos graxos livres resultantes, 16:0 e 18:1, são os

principais produtos da síntese de ácidos graxos nos plastídeos, e suas proporções relativas

são determinadas pelas atividades da FatA, FatB, 18:0-ACP desaturase (SAD) e KASII . O

comprimento e presença de insaturação da cadeia de ácidos graxos nas sementes podem

ser alterados através da manipulação gênica direcionada a qualquer uma destas quatro

enzimas (CAHOON et al., 2010). A figura 3 ilustra esquematicamente as etapas de síntese

dos ácidos graxos e triacilgliceróis.

23

Figura 3 - Visão geral das principais reações envolvidas na síntese de ácidos graxos e triacilglicerídeos. (a) síntese de ácido graxo nos plastídeos; (b) edição do grupo Acil e (c) a síntese de TAG. As linhas tracejadas representam as reações de transferência de do grupo acil. Linhas verdes representam a síntese de novo de TAG, as linhas azuis, a síntese de DAG derivados de PC, as linhas de laranja são edição de acil e roxo representa fosfolipídios: aciltransferase diacilglicerol (PDAT). DAG (1) é de novo sintetizado DAG e DAG (2) é derivado do PC DAG. Abreviaturas: substratos estão em negrito: ACP, proteína transportadora do grupo acil; DAG, diacilglicerol; FFA, ácidos graxos livres; G3P, glicerol-3-fosfato; LPA, ácido lisofosfatídico; LPC, lisofosfatidilcolina; Mal, malonato; PA, ácido fosfatídico; PC, fosfatidilcolina; PUFA, ácidos graxos poliinsaturados; TAG, triglicérides. As reações enzimáticas estão em itálico: ACCase, acetil-CoA carboxilase; CPT, CDP-colina: DAG cholinephosphotransferase; DGAT, acil-CoA: aciltransferase do DAG; FAD, dessaturase de ácido graxo; FAS, sintase dos ácidos graxos; FATA, acil-ACP tioesterase A; FatB, acil-ACP tioesterase B; GPAT, acil-CoA: aciltransferase G3P; KASII, ketoacil- ACP sintase II; LACS, acil-CoA sintetase de cadeia longa; LPAAT, acil CoA: LPA aciltransferase; LPCAT, acil-CoA: aciltransferase de LPC; PAP, PA fosfatase; PDCT, PC: DAG colinefossfotransferase; PLC, fosfolipase C; PLD, fosfolipase D; SAD, desaturase do stearoil-ACP (BATES; STYMNE; OHLROGGE, 2013).

24

2.3 Toxicidade da semente

Apesar de o pinhão manso poder ser utilizado para diversos fins, ele possui

compostos tóxicos e antinutricionais dos quais citam-se: taninos, saponinas, fitatos, curcina

e ésteres de forbol (ABDELGADIR; STADEN, 2013; DEVAPPA et al., 2012), que limitam seu

melhor aproveitamento. Os ésteres de forbol e curcina são os fitoquímicos mais tóxicos do

pinhão manso (DEVAPPA et al., 2010). Tais compostos serão descritos a seguir.

2.3.1 Curcina

Muitas plantas contêm proteínas que são capazes de inativar ribossomos, as quais

apresentam atividade N-glicosídica sendo estas denominadas de proteínas inativadoras de

ribossomo (RIPs). As RIPs são divididas em três classes: tipo I, tipo II e tipo III (LUO et al.,

2007).

As RIPs do tipo I consistem de um polipeptídeo de cadeia única com peso molecular

variando de 24 a 30 KDa e ponto isoelétrico em pH alcalino. As proteínas “pokeweed”

antiviral (PAP), tricosantina (TCS) e curcina, presentes em Phytolacca americana,

Trichosanthes kirilowii e J. curcas, respectivamente, são exemplos de RIP do tipo I (HUANG

et al., 2008). As RIPs do tipo II apresentam duas cadeias ligadas entre si: uma cadeia A,

similar a cadeia da RIP do tipo I, a qual possui a atividade catalítica N-glicosídica, e uma

cadeia B, uma lectina, galactose específica, com atividade de se ligar a carboidrato, a qual

reconhece e se liga à receptores específicos da membrana celular, possibilitando sua

entrada na célula e levando à morte celular. A RIP do tipo II melhor estudada é a ricina,

presente em Ricinus communis. A abrina, viscumina, ebulina e nigrina, são também

representantes desse tipo de RIP, apresentando mesma estrutura e função que a ricina (XU;

LIU, 2004). As RIPs do tipo III são consideradas uma peculiaridade da RIP do tipo I, sendo

encontrada, no milho, a b-32; e na cevada, JIP60 (HUANG et al., 2008). Elas são peptídeos

de cadeia única, consistindo de um domínio N-terminal semelhante ao da RIP do tipo I,

ligado a um domínio C-terminal com função desconhecida (HAO et al., 2001).

A curcina é uma RIP do tipo I e está presente no pinhão manso. As RIPs tipo I são

relatadas como não-tóxicas ou menos tóxicas em relação às RIPs do tipo II, já que apesar

de possuir atividade catalítica é desprovida de sítio de reconhecimento a carboidratos

conjugados às proteínas da membrana celular, não sendo capazes de se ligar à célula.

Apesar disso, Mohamed et al. (2014) demonstraram o potencial tóxico da curcina, a qual

inibiu significativamente a proliferação celular, tanto em células normais como com câncer.

25

2.3.2. Ésteres de forbol

Os principais agentes tóxicos na torta de sementes do pinhão manso são os ésteres

de forbol (RATNADASS; WINK 2012; JING et al., 2005; MAKKAR; BECKER, 1997).

Aproximadamente 0,377-1,193 mg/g de ésteres de forbol são retidos na torta de semente do

pinhão manso após a extração mecânica do óleo (EL RAFEI et al., 2011).

Ésteres de forbol são diterpenos tetracíclicos que ocorrem naturalmente nos

membros das famílias Euphorbiaceae e Thymelaeaceae, que possuem dois grupos hidroxila

de átomos de carbono vizinhos esterificados a ácidos graxos (OHTANI et al., 2012; GANDHI

et al., 1995). Assim como os demais diterpenos, eles são produzidos nos plastídeos

(BUCHANAN, 2000).

A estrutura dos ésteres de forbol é dependente do esqueleto de carbono diterpeno

tetracíclico conhecido como tigliane (Figura 4a), porção alcoólica fundamental nos ésteres

de forbol. O tigliane contem quatro anéis: A, B, C e D. A hidroxilação de sua estrutura básica

em diferentes posições (Figura 4b), seguida de ligação de ésteres a várias moléculas ácidas

resultam na formação de uma larga variedade de compostos de ésteres de forbol, no 4ß-12-

O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TAP) (Figura 4c), por exemplo, o qual foi observado

primeiramente em plantas do gênero Croton (GOEL et al., 2007).

Duas categorias de forbol, α e ß, que diferem no seu grupo hidroxila no anel C,

distinguem a forma ativa da inativa. A localização do grupo hidroxila dita a forma ativa (ß) ou

inativa (α), que resulta em arranjo espacial do anel D. O 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato

(TPA), também conhecido como forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (MCKERNAN et al.,

2012), é relatado como o mais potente dos ésteres de forbol biologicamente ativos no

pinhão manso (GOEL et al., 2007; SMITH et al., 1983). Ésteres de forbol biologicamente

ativos são anfifílicos, apresentando ambos os domínios, hidrofílico e hidrofóbico, e afetam

várias funções celulares, agindo principalmente na membrana plasmática (BERTOLINI et al.,

2003; BUSTROS et al., 1985). A forma inativa dos ésteres de forbol apresenta propriedade

lipofílica e físico-química similares às da forma ativa (ß), entretanto elas não são capazes de

ativar a PKC (proteína quinase C) devido às mudanças conformacionais (SILINSKY;

SEARL, 2003).

Os ésteres de forbol e seus derivados podem induzir uma grande diversidade de

efeitos biológicos em concentrações consideravelmente baixas. Sendo responsáveis, por

exemplo, por efeitos irritantes na pele e pela promoção de tumores.

Os efeitos biológicos promovidos por esse diterpeno ocorrem devido à interação dos

ésteres de forbol com a proteína quinase C (PKC), enzima que regula várias vias de

26

transdução de sinal (RATNADASS; WINK, 2012; GOEL et al., 2007). Eles ligam-se e,

consequentemente, modificam as atividades dos receptores dos fosfolipídios de membrana

(LI et al., 2010; GOEL et al., 2007). Essa capacidade é conferida devido à analogia

estrutural apresentada entre os ésteres de forbol e o diacilglicerol (DAG), mensageiro

secundário lipídico que ativa PKC na sinalização celular (DEVAPPA et al., 2010; GANDHI et

al., 1995). Os ésteres de forbol atuam no mesmo mecanismo que o DAG, no entanto, ao

contrário deste, que é rapidamente hidrolisado, os ésteres de forbol apresentam efeito

prolongado devido à maior meia-vida biológica (HE, 2011; MOSIOR; NEWTON, 1995). Ao

estimular a PKC, que está envolvida na transdução de sinal e nos processos de

desenvolvimento da maioria das células e tecidos, os ésteres de forbol consequentemente

interferem na atividade de várias enzimas, biossíntese de proteínas, DNA, poliaminas,

processos de diferenciação celular e expressão gênica, produzindo uma variedade de

efeitos biológicos, em uma ampla gama de organismos (GOEL et al., 2007).

Os ésteres de forbol apresentam atividades pró-carcinogênica e ação inflamatória. A

resposta inflamatória se dá devido aos ésteres de forbol mobilizarem fosfolipídios, liberando

ácido araquidônico e causando a secreção de prostaglandinas. Já a atividade promotora de

tumor, parece estar relacionada com a capacidade apresentada pelos ésteres de forbol de

substituir o DAG, e também às suas habilidades de estimular a síntese de proteínas, síntese

de RNA e DNA, comportando-se como agentes mitogênicos (BLUMBERG, 2010).

Diversos estudos mostram os efeitos biológicos dos ésteres de forbol. Adolf et al.

(1984) verificaram o efeito irritante na pele ocasionado por ésteres de forbol presentes em

óleos de sementes de pinhão manso; Hirota et al. (1988) verificaram que esse composto,

extraído da planta, induz a formação de tumor; Wink et al. (1997) observaram a atividade

inseticida de ésteres de forbol presentes em sementes de pinhão manso.

Diversos ésteres de forbol foram isolados a partir do pinhão manso , dentre esses

citam-se: o 12-desoxi-l-6 hidroxiforbol, que tem uma estrutura de diéster de ácido

dicarboxílico macrocíclico, isolado por Hirota et al. (1988); jatrofol, isolado por

Naengchomnong et al. (1994); seis compostos de ésteres de forbol, fatores C1-C6, isolados

a partir de óleo de semente do pinhão manso , por Hass et al. (2002) (Figura 5).

27

Figura 4 - Estruturas formadoras dos ésteres de forbol: a) Tigliane: estrutura base dos ésteres de forbol; b) Forbol: estrutura resultante da hidroxilações do tigliane; c) Estrutura do tetradecanoil forbol-13-acetato (TPA), exemplo de éster de forbol (Adaptado de EVANS, 1986).

28

Figura 5 - Estruturas de seis tipos de ésteres de forbol identificados no pinhão manso (Adaptado de Hass et al., 2002).

29

Os principais compostos que despertam interesse para o estudo do pinhão manso

são a rica presença de óleo nas sementes, com potencial para produção de biodiesel, e a

presença de ésteres de forbol que limitam sua utilização. Não somente a síntese dos ácidos

graxos e dos ésteres de forbol ocorre nos plastídeos, como também diversas outras vias

metabólicas. Dessa forma, o estudo do proteoma desta organela poderá propiciar o

conhecimento das enzimas envolvidas em muitas vias metabólicas. A seguir serão feitas

algumas considerações sobre os plastídeos.

2.4 Plastídeos: sua importância no estudo de sementes de pinhão manso

Os plastídeos são organelas derivadas de um processo de endossimbiose, estão

presentes nas células de plantas e desempenham importantes funções metabólicas

(KLEFFMANN et al., 2007; KEELING, 2010; JARVIS; LÓPEZ-JUEZ, 2013).

O processo de endossimbiose apresenta como consequência a Transferência de

genes: a perda de vários genes plastidiais, os quais foram completamente perdidos ou

transferidos para o genoma nuclear da célula hospedeira. Os plastídeos das células de

plantas apresentam um genoma pequeno, com cerca de 100 genes, codificando apenas

uma pequena proporção do conteúdo de proteínas das cianobactérias ancestrais de vida

livre e dessas organelas atuais. A grande maioria das proteínas plastidiais de plantas, cerca

de 3000, são codificadas no núcleo e importadas para os plastídeos após sua tradução no

citosol (ROLLAND et al., 2012; JARVIS, 2008). Dessa forma, apesar de possuírem DNA

circular próprio, os plastídeos, necessitam das proteínas codificadas pelo genoma nuclear,

pois não possuem toda a informação genética necessária à sua função, por isso são

considerados organelas semi-autônomas (LI; CHIU, 2010; JARVIS;LÓPEZ-JUEZ, 2013;

ROLLAND et al., 2012).

Segundo Neuhaus e Emes (2000), os plastídeos estão envolvidos em importantes

processos biossintéticos: do amido; de grupos fenólicos em aminoácidos aromáticos; de

bases purínicas e pirimidínicas; da clorofila; dos ácidos graxos e de isoprenóides, também

chamados de terpenóides.

A oxidação de carboidratos também pode ocorrer nos plastídeos através da via

oxidativa das pentoses fosfato. Vários fitohormônios incluindo ácido abscísico, derivados de

isoprenóides e brassinosteróides são também oriundos da atividade dos plastídeos (LOPEZ-

JUEZ; PYKE, 2005).De acordo com Rolland et al. (2012), existe uma comunicação e

coordenação entre as várias funções desempenhadas pelos plastídeos e os demais

compartimentos celulares. Por exemplo, muitas vias bioquímicas localizadas nos plastídeos

30

funcionam a partir dos metabólitos provenientes do citosol, assim como aquelas que

ocorrem no núcleo e citoplasma dependem de moléculas produzidas nos plastídeos, sejam

elas, carboidratos, ácidos graxos, lipídios, nucleotídeos, alcalóides, isoprenóides, hormônios

precursores, aminoácidos, vitaminas, etc (JOYARD et al., 2009; JOYARD et al., 2010;

LINKA; WEBER, 2010; LUNN, 2007; ROLLAND et al., 2012). Esse fato enfatiza a

importância da atuação das proteínas transportadoras.

Todos os plastídeos são derivados dos proplastídeos (a princípio: “eoplastos”, eo-:

early – plastídeos indiferenciados), os quais estão presentes nas regiões meristemáticas da

planta. Dependendo da função que irá desempenhar na célula, os proplastídeos podem se

diferenciar em várias formas, incluindo cloroplastos, responsáveis pelo processo de

fotossíntese; cromoplastos, importante na síntese e armazenamento de pigmentos,

acumulando carotenoides em flores e frutos; amiloplastos, acumulam amido, estatólitos

para a detecção da gravidade; elaioplastos, para estocar lipídio em gotículas lipídicas

conhecidas como plastoglobulos; etioplastos, formados em plântulas que crescem no

escuro, são progenitores de cloroplastos, acumulam precursores de clorofila, em estruturas

membranosas paracristalinas conhecidas como corpos prolamelares – (PLB), prontos para a

rápida diferenciação quando expostos à luz; gerontoplastos, os quais se formam durante a

senescência, para reciclagem de nutrientes através da desmontagem da maquinaria

fotossintética e autofagia (NEUHAUS; EMES, 2000; DAHER et al., 2010; JARVIS; LÓPEZ-

JUEZ, 2013; ROLLAND et al., 2012; INABA; INABA, 2010). A figura 6 ilustra diversos tipos

de plastídeos.

De acordo com o metabolismo energético, os plastídeos podem ser classificados

como fotossintéticos (autotrófico) e não fotossintéticos (heterotrófico) (DAHER et al., 2010,

JARVIS; LÓPEZ-JUEZ, 2013). Os plastídeos fotossintéticos, os cloroplastos, sintetizam

açúcares fosfatos que são catabolizados por processos oxidativos para produzir NADPH e

ATP. Enquanto os plastídeos não fotossintéticos necessitam importar açucares fosfatos e

ATP a partir do citosol para manter seu metabolismo anabólico (VOTHKNECHT;

WESTHOFF, 2001; DAHER et al., 2010).

31

Figura 6 - Diversidade de formas de plastídeos (proplastideos, cloroplastos, amiloplastos, cromoplastos, etioplastos, elaioplastos e gerontoplastos) e suas interconversões. Plastídeos existem em diferentes formas, a identidade e abundância de cada uma são controladas por sinais ambientais e de desenvolvimento. As interconversões ocorrem pela importação de proteínas codificadas pelo núcleo de forma regulada (Adaptado de JARVIS; LÓPEZ-JUEZ, 2013).

32

2.5 Genômica, Trancriptômica e Proteômica do Pinhão Manso

O genoma do pinhão manso foi sequenciado em 2010 (SATO et al., 2010). Em 2012,

ele foi atualizado (HIRAKAWA et al., 2012) pela adição de sequências de ácido

desoxirribonucleico (DNA) gerados através da plataforma de sequenciamento e dos dados

de transcriptoma disponíveis nos bancos de dados públicos, aumentando

consideravelmente o número de genes com estrutura completa.

Os primeiros dados transcriptômicos do pinhão manso foram fornecidos por Costa et

al., (2010), por meio da construção de duas bibliotecas de cDNA, uma a partir de sementes

em desenvolvimento e outra a partir de sementes em germinação. Ainda em 2010, dois

novos trabalhos transcriptômicos, através da produção de bibliotecas de cDNA, com

sementes em desenvolvimento do pinhão manso foram publicados (GOMES et al., 2010;

NATARAJAN et al., 2010). O estudo realizado por Natarajan et al. a partir de sementes em

oito fases de desenvolvimento observou a presença de uma grande quantidade de genes

relacionados à resposta ao estresse, à resistência à doença e ao desenvolvimento da

planta, ao metabolismo de carboidratos e muitos outros genes importantes envolvidos em

várias atividades metabólicas.

King et al. (2011), sequenciaram o transcriptoma de sementes do pinhão manso em

desenvolvimento. Natarajan et al. (2011) prepararam uma biblioteca de cDNA a partir de

RNA extraído a partir de cinco diferentes órgãos da planta: raízes, folhas, flores maduras,

sementes maduras e em desenvolvimento e embrião. Nesse trabalho eles enriqueceram os

dados para o metabolismo lipídico no pinhão manso, ao identificarem e discutirem as

proteínas de todas as vias relacionadas com o metabolismo de lipídios. Chen et al. (2011)

realizaram o estudo do transcriptoma de embrião do pinhão manso em três diferentes

estádios do desenvolvimento, a partir da construção de três bibliotecas de cDNA,

identificando 2295, 1646 e 1512 genes, respectivamente. Eles enfatizaram que as proteínas

do metabolismo de lipídios não são apenas importantes para o acúmulo de óleo, mas

também para a embriogênese, morfogênese, respostas de defesa e mecanismos de

adaptação das plantas.

Em 2012, Eswaran e colaboradores construíram uma biblioteca de cDNA a partir de

raízes do pinhão manso cultivadas em altas concentrações salinas, e compararam com a de

plantas não tratadas. Eles relataram 1.240 ESTs, referentes a genes relacionados com o

estresse abiótico. Este transcriptoma responsivo ao estresse ajuda na compreensão da

capacidade de adaptação do pinhão manso a ambientes adversos.

33

Além da construção destas bibliotecas de cDNA, vários estudos transcriptômicos

também foram feitos para a análise do perfil da expressão de genes envolvidos no

metabolismo de lipídeos (GU et al., 2011; XU et al., 2011; GU et al., 2012, JIANG et al.,

2012), os quais forneceram informações importantes sobre essa via durante o

desenvolvimento da semente do pinhão manso.

Diante da disponibilidade de dados provenientes do sequenciamento genômico e de

uma multiplicidade de informações transcriptômicas, a análise proteômica em larga escala

passa a contar com um bom aparato, que permite produzir informações importantes e

consistentes sobre as proteínas expressas, sejam elas relacionadas com o metabolismo

lipídico, com a produção de componentes tóxicos, ou com qualquer outra via metabólica.

Dentre os trabalhos proteômicos com o pinhão manso realizados, encontra-se o de

Liang et al. (2007), que estudaram as alterações proteômicas em plântulas de pinhão manso

submetidas ao estresse por frio, e identificaram oito proteínas, envolvidas no processo de

fotossíntese, as quais eram diferencialmente expressas nessa condição.

Yang et al. (2009) analisaram o proteoma do endosperma de sementes em

germinação do pinhão manso e identificaram 50 proteínas, das quais citam-se: proteínas de

sinalização, proteínas relacionadas com a mobilização de lipídio, as sintases de ATP, e

proteínas envolvidas no estresse oxidativo. Uma análise comparativa entre proteoma do

embrião e do endosperma de sementes do pinhão manso foi realizada por Liu et al. (2009),

utilizando a abordagem baseada em eletroforese bidimensional de proteínas (2-DE), neste

trabalho foi possível observar 380 e 533 proteínas (spots) para o embrião e endosperma,

respectivamente, e identificados, através de análise por LC-MS / MS, 14 proteínas

diferencialmente expressas entre os dois tecidos. Os autores concluíram que as proteínas

do endosperma estavam relacionadas aos processos catabólicos, enquanto as do embrião,

aos anabólicos.

Popluechai et al. (2011) analisaram por proteômica os oleossomos do pinhão manso

e identificaram 10 proteínas diferentes, sendo três oleosinas os principais constituintes. Liu

et al. (2011) realizaram um outro estudo proteômico diferencial do endosperma e embrião de

sementes maduras do pinhão manso, utilizando abordagem 2-DE. Eles identificaram 28

proteínas e verificaram, em ambas as amostras, a presença tanto de proteínas necessárias

para a germinação das sementes, como de proteínas relacionadas com a mobilização de

óleo, transdução de sinal, proteínas de transcrição e síntese de proteínas do ciclo celular.

34

Recentemente, o proteoma de toda a semente em seis fases de desenvolvimento

diferentes foi analisado utilizando 2-DE (LIU et al., 2013). A análise das proteínas

diferencialmente expressas através de MALDI-TOF / TOF resultou na identificação de 104

proteínas, classificadas em 10 categorias funcionais diferentes. Eles demonstraram que as

proteínas relacionadas com o metabolismo energético estavam envolvidas no fluxo de

carbono para o acúmulo de lipídios nas sementes. Booranasrisak et al. (2013) investigaram

o proteoma de sementes do pinhão manso em oito fases de desenvolvimento, por meio da

abordagem proteômica shotgun que resultou na identificação de 22 proteínas relacionadas

com o metabolismo dos ácidos graxos.

Soares et al. (2014) ao analisar o proteoma do integumento interno, de sementes em

desenvolvimento do pinhão manso, identificaram diversas peptidases e outras enzimas

hidrolíticas que desempenham um papel chave no processo de morte celular programada e

proteínas relacionadas com a arquitetura e modificação da parede celular. Os autores

sugeriram que as células do integumento interno mobilizam um conjunto de hidrolases para

a produção de fontes de carbono e nitrogênio a partir de proteínas, carboidratos e lipídios

disponíveis dentro das células. Liu et al. (2015) realizaram uma análise proteômica de

oleossomos de semente maduras do pinhão manso, por nanoLC-MS/MS, identificando 83

proteínas.

Do exposto, percebe-se que diversos grupos de pesquisa estão focados em estudos

pós-genômicos do pinhão manso, buscando conhecer e desvendar as vias metabólicas e

suas peculiaridades. No entanto, ainda há muito a ser pesquisado e descoberto. Com esse

propósito, o presente trabalho foi conduzido para proporcionar uma maior abrangência de

informações no tocante ao proteoma do pinhão manso. Para tanto, apostamos no estudo

proteômico em larga escala dos plastídeos, já que essa organela é sítio de síntese de

diversas vias biossintéticas, como já previamente mencionado. Antes de iniciar uma

abordagem sobre proteômica plastidial, serão feitas considerações sobre proteômica de

plantas.

2.6 Proteômica de plantas

O termo proteoma descreve as proteínas expressas por um organismo em

determinado período de desenvolvimento e condição ambiental e inclui suas isoformas e

modificações pós-traducionais (WILKINS et al., 1996; WILKINS et al., 1996b; DE HOOG;

MANN, 2004). A proteômica fornece dados referentes às funções, modificações, localização,

compartimentalização e interações proteicas (BAGINSKY, 2009).

35

A tardia disponibilização dos genomas de organismos vegetais sequenciados atrasou

a aplicação da proteômica no estudo de plantas. Inicialmente, os estudos proteômicos de

plantas eram realizados por meio de comparações entre os perfis de eletroforeses

bidimensionais, com o objetivo de identificar alterações no padrão de expressão de

proteínas em diferentes condições (THIELLEMENT; BAHRMAN et al. 1999). Os avanços

nas técnicas de biologia molecular favoreceram a produção de dados genômicos e

transcriptômicos em larga escala, e, consequentemente, impulsionaram os estudos

proteômicos de plantas, já que as estratégias proteômicas são dependentes da presença de

bancos de dados (GRAVES; HAYSTEAD, 2002; ZHU et al., 2003; DE HOOG; MANN, 2004;

CHAMPAGNE; BOUTRY, 2013). O estudo de organismos modelos, como a Arabidopsis

thaliana e a Oryza sativa, por exemplo, cujos genomas foram os primeiros disponibilizados,

foi fundamental para esse progresso.

Aliado a isso, melhorias na extração, separação, quantificação e identificação das

proteínas vegetais, propiciaram a realização da análise proteômica de elevado desempenho

e possibilitaram um melhor estudo sobre os mecanismos moleculares de plantas envolvidos

no seu crescimento, desenvolvimento e interação com o ambiente, já que as proteínas

atuam nas principais vias de sinalização e rotas bioquímicas (CHEN; HARMON, 2006).

Essas melhorias foram fundamentais pois o uso de metodologias específicas é fundamental

para o estudo proteômico de plantas. Especialmente durante a extração e preparação da

amostra, devido à célula vegetal possuir uma parede celular rígida, uma parte significativa

do espaço celular ocupado pelo vacúolo e uma série de compostos que dificultam a análise

proteica, como proteases, compostos fenólicos e metabólitos secundários (ROSE; BASHIR

et al., 2004).

O estudo proteômico pode ser direcionado para diferentes finalidades. A análise

proteômica diferencial é realizada através da comparação entre as proteínas expressas por

indivíduos em diferentes condições ambientais e/ou do desenvolvimento. Nos estudos

proteômicos quanto à tolerância à seca e ao estresse biótico e abiótico, por exemplo, o uso

dessa abordagem é bem apropriado, pois permite a obtenção de dados quanto ao

desenvolvimento, crescimento e produtividade da planta, os quais podem ser utilizados para

reduzir possíveis perdas econômicas (AGRAWAL et al., 2012;. SALEKDEH; KOMATSU,

2007). Nesse caso, os métodos de quantificação geralmente são utilizados, pois permitem a

análise da abundância das proteínas em diferentes condições. A análise proteômica

descritiva é uma abordagem fundamental para o estudo em larga escala da expressão

proteica de uma amostra, cedendo informações importantes sobre o metabolismo da

amostra em estudo, a partir da identificação e análise funcional do maior número possível de

36

proteínas, aquelas em concentrações suficientes para serem detectadas por espectrometria

de massa (HASHIGUCHI et al., 2010). Essa abordagem pode ser utilizada para a

compreensão do padrão de expressão e do mecanismo de regulação das enzimas

presentes nas sementes de diferentes plantas.

Um considerável progresso é observado quanto à caracterização do proteoma de

sementes maduras e em desenvolvimento de plantas oleaginosas, as quais acumulam

principalmente óleo e proteínas (HAJDUCH et al., 2011). O presente trabalho tem como foco

analisar o proteoma de plastídeos presentes no endosperma de semente em

desenvolvimento do pinhão manso.

2.7 Proteômica de plastídeos

Os estudos proteômicos de organelas objetiva analisar uma amostra proteica

originada a partir de preparações enriquecidas da organela de interesse, e que a

contribuição de outras estruturas subcelulares seja minimizada (DUCLOS; DESJARDINS,

2008). Abordagens experimentais, através do fracionamento celular e purificação da

organela de interesse, mediado por centrifugações, aliada à espectrometria de massa para

identificação de peptídeos, têm sido utilizadas para determinação da localização subcelular

das proteínas (BRUNET et al., 2003; KOMATSU et al., 2003; MILLAR, 2004; ANDERSEN;

MANN, 2006). Elas têm possibilitado a identificação de um número significativo de proteínas

de diferentes compartimentos celulares, tais como plastídeos (PELTIER et al., 2002);

(SCHUBERT et al., 2002); (FRISO et al., 2004); (PELTIER et al., 2006); (FERRO et al.,

2003); (FROEHLICH et al., 2003); (KLEFFMANN et al., 2004), núcleo (BAE et al., 2003);

(CALIKOWSKI et al., 2003); (PENDLE et al., 2005), membrana plasmática (DUNKLEY et

al., 2006) e mitocôndria (KRUFT et al., 2001); (MILLAR et al., 2001).

Para se certificar quanto à localização das proteínas identificadas, a utilização de

ferramentas de predição subcelular e de informações depositadas nos bancos de dados são

fundamentais. De acordo com Lopez-Juez e Pyke (2005), algoritmos têm sido desenvolvidos

baseados nas propriedades dos peptídeos sinais e adicionalmente refinados em

sequências determinadas experimentalmente para identificação dos peptídeos transientes.

Isso permite uma diferenciação das proteínas plastidiais codificadas in situ, daquelas

provenientes do citosol, ampliando o conhecimento sobre as proteínas presentes nessa

organela. Ferramentas de predição específicas, tais como TargetP, ChloroP e Predotar são

capazes de detectar a presença dos peptídeos transientes. Entretanto sozinhas não são

suficientes para classificar todas as proteínas plastidiais. Por exemplo, análises através do

uso de ferramentas de predição subcelular, mostraram que dentre as proteínas detectadas

experimentalmente em cloroplasto de Arabdopsis, 30 % não apresentam os peptídeos

37

transientes específicos (ROLLAND et al., 2012, FERRO et al., 2010, JARVIS, 2008,

KLEFFMANN et al., 2004). Esse resultado se deve ao fato de que proteínas codificadas nos

plastídeos não apresentam o peptídeo transiente, como é o caso da maioria das proteínas

da membrana externa do envelope plastidial; além do que algumas proteínas plastidiais não

seguem a via de importação canônica (ROLLAND et al., 2012; ARMBRUSTER et al., 2009;

KLEFFMANN et al., 2006; MIRAS et al., 2007; MIRAS et al., 2002; NADA; SOLL, 2004;

NANJO et al., 2006; VILLAREJO et al., 2005) e portanto não contém um peptídeo transiente

clássico. Esses fatos mostram a necessidade de se realizar a proteômica subcelular para

proporcionar dados experimentais sobre a localização subcelular das proteínas plastidiais

(ROLLAND et al., 2012 ;BAGINSKY et al., 2004).

Uma abordagem complementar à espectrometria de massas é a expressão e

visualização de proteínas fluorescentes ligadas a proteínas de interesse. Centenas de

proteínas de Arabidopsis foram identificadas desta maneira, e formam um conjunto de

dados importantes para a determinação de localização subcelular (KOROLEVA et al., 2005;

TIAN et al., 2004; CUTLER et al., 2000; LI; EHRHARDT; RHEE, 2006). É importante

ressaltar que essa abordagem representa a única fonte de dados de localização subcelular,

para estruturas celulares vivas intactas.

No que se refere aos estudos voltados para a analise proteômica suborganelar

plastidial, apesar da importância dos plastídeos não fotossintéticos, o proteoma de

cloroplasto é consideravelmente o mais estudado (FERRO et al., 2003; YTTERBERG et al.,

2006). No que diz respeito aos plastídeos heterotróficos, poucos estudos proteômicos como

de cromoplastos de pimentão (SIDDIQUE et al., 2006), amiloplastos do endosperma de trigo

(ANDON et al, 2002; BALMER et al., 2006), amiloplastos de tubérculo (STENSBALLE et al.,

2008), etioplastos de arroz (von ZYCHLINSKI et al., 2005) e plastídeos não diferenciados de

células cultivadas de tabaco BY2 (BAGINSKY et al., 2004), foram analisados.

2.8 Estratégias proteômicas

A análise de proteínas por espectrometria de massa pode ser realizada utilizando

três estratégias proteômicas: bottom-up, top-down e middle-down. Nas análises de proteínas

por “bottom-up”, inicialmente, uma amostra proteica é enzimaticamente digerida

(comumente com a tripsina) em peptídeos (CHAIT, 2006). Quando a análise por “bottom-up”

é realizada em uma mistura complexa de proteínas, fracionada por cromatografia líquida,

livre de gel, ela é denominada análise proteômica por “shotgun”. A análise proteômica por

"top-down", é utilizada para caracterizar proteínas intactas. Nesse processo, as proteínas

38

intactas, e não os peptídeos, são submetidas à análise por espectrometria de massas. Essa

abordagem apresenta-se mais vantajosa em estudos voltados para análise de modificação

pós-traducional (PTM) e para a determinação de isoformas proteicas (ZHANG et al., 2013).

O terceiro procedimento que pode ser utilizado é análise proteômica por “middle – down”,

um híbrido das metodologias bottom-up e top-down (WU et al., 2012). A proteômica por

middle-down analisa fragmentos de peptídeos maiores que os da proteômica por bottom-up,

diminuindo a redundância de peptídeos entre as proteínas (ZHANG et al., 2013).

Dentre as estratégias apresentadas, bottom-up é amplamente usada, na medida em

que o peptídeo a ser analisado, é mais passível, que a proteína intacta, à introdução à fase

gasosa, apresenta relação massa/carga (m/z) mais adequada às habilidades dos

espectrômetros de massas, os peptídeos são mais facilmente fracionados, ionizados e

fragmentados (ZHANG et al., 2013). Entretanto, o aumento da complexidade introduzida por

essa abordagem (ao gerar múltiplos peptídeos a partir de uma proteína) requer outro nível

de separação, independente de um fracionamento proteico previamente aplicado, antes que

uma análise aprofundada possa ser realizada pelo espectrômetro de massas. Por essa

razão, peptídeos são tipicamente separados por cromatografia de fase reversa.

Devido às vantagens oferecidas pelo “shotgun”, o presente trabalho foi conduzido

fazendo uso dessa estratégia.

2.9 Espectrometria de massa

O rápido avanço na resolução, acurácia, sensibilidade e velocidade de varredura dos

espectrômetros de massas nos últimos anos, fez com que a espectrometria de massa seja

uma ferramenta fundamental no processo de identificação e análise de proteínas em larga

escala (ZHANG et al., 2013).

A espectrometria de massas é uma técnica analítica que permite a identificação da

composição química de um composto isolado, ou de diferentes compostos em misturas

complexas. Essa identificação é realizada através da determinação de suas massas

moleculares em Daltons (Da), a partir da obtenção da razão entre a massa e a carga (m/z)

de íons na fase gasosa, através da análise das moléculas com carga elétrica líquida,

positiva ou negativa, baseada na sua movimentação através de um campo elétrico ou

magnético, no espectrômetro de massa (DOMON; AEBERSOLD, 2006). Dessa forma, a

identificação de compostos através da espectrometria de massa, é alcançada através da

formação de íons-molécula e de seus respectivos íons-fragmentos. Conhecendo o valor de

39

m/z de uma molécula é possível inferir sua composição química elementar, e com isso

determinar sua estrutura (Van BRAMER, 1998).

Um espectrômetro de massas é constituído por 3 partes: a fonte de íons,

responsável pelo processo de ionização das moléculas, e vaporização da amostra; o

analisador de massas, que realiza a separação dos íons de acordo com sua m/z, através

de aplicações de campos elétricos e magnéticos, determinando a relação m/z; e o detector,

responsável pela detecção e amplificação dos íons, registra o número de íons de cada valor

m/z (NOGUEIRA, 2012).

2.9.1 Ionização por electrospray

Dois avanços tecnológicos permitiram que a cromatografia líquida viesse a ter maior

aplicabilidade na proteômica: a introdução da tecnologia do electrospray (ionização por

electrospray - ESI) (FENN et al., 1989) e miniaturização do emissor ESI. O princípio do

eletrospray consiste na formação de um spray, o qual sai do cromatógrafo na fase líquida e

entra no espectrômetro de massas na fase gasosa, isso é possível devido à combinação de

um nebulizador e uma voltagem aplicada ao fim do capilar por onde atravessam os

peptídeos. As gotículas geradas evaporam-se rapidamente gerando os analitos carregados

(MANN et al., 2001; COTTE-RODRIGUEZ et al., 2013). Esta tecnologia permitiu que uma

variedade de moléculas fosse transferida para a fase gasosa sem fragmentação, incluindo

moléculas extremamente grandes, tais como as proteínas. A miniaturização do emissor ESI,

permitiu uma redução tanto nos fluxos no LC como nas quantidades de amostras,

possibilitando um aumento na sensibilidade (WILM; MANN,1994; EMMETT; CAPRIOLI,

1994). Esta versão do ESI, atualmente conhecida como nano-ESI, é a base para análise

proteômica LC-MS, que foi a técnica ultilizada no presente trabalho.

Os íons em fase gasosa que chegam diretamente da fonte eletrospray acoplada ao

cromatógrafo líquido são introduzidos no interior do analisador do espectrômetro de massas,

o qual, essencialmente, mede a razão massa-carga (m/z) de um analito, dentro de certa

resolução.

Analisadores de massa híbridos, os quais melhoraram significativamente análise

proteômica, foram introduzidos recentemente (ZHANG et al., 2013). Por exemplo, o LTQ-

Orbitrap, apresenta um sistema “íon-trap-linear” acoplado ao Orbitrap, que por sua vez,

utiliza a “transformada de Fourier”, combinando medidas de alta acurácia com um alto

desempenho na aquisição de dados de MS (OLSEN et al., 2009).

40

O presente trabalho foi realizado usando um espectrômetro de massas LTQ-Orbitrap

velos (Thermo Fisher Scientific). Os princípios operacionais desta máquina, assim como a

sua influência na análise de peptídeos, serão discutidos a seguir.

2.9.2 LTQ-Orbitrap velos

O LTQ-Orbitrap é composto por um híbrido de dois analisadores de massas.

Dependendo do tipo de método adotado este tipo de instrumento, LTQ-Orbitrap, é possível

obter espectros de MS e MS/MS em alta e baixa resolução. Em experimentos de baixa

resolução é possível usar apenas o LTQ. Em experimentos de alta resolução é possível usar

apenas o Orbitrap ou a combinação dos dois, este foi o método adotado no presente

trabalho. Os espectros de MS1 foram adquiridos no Orbitrap em alta resolução, e os

espectros de MS2 foram adquiridos no LTQ. Os íons introduzidos a partir da fonte ESI, já

em fase gasosa, são afunilados dentro do equipamento e conduzidos até um LTQ, que

transporta e acumula os íons no c-trap. Deste, os íons passam para o analisador de massas

Orbitrap (OLSEN et al., 2009).

O LTQ Orbitrap Velos é um espectrômetro de massa de alto desempenho que

apresenta esse sistema híbrido e foi o equipamento utilizado no presente trabalho. A forma

de ionização da amostra utilizada, acoplada ao LTQ Orbitrap velos, foi o nanoESI. Os tipos

de analisadores, desse instrumento, ulizados no presente trabalho estão descritos a seguir.

O LTQ é um analisador do tipo “Linear Ion Trap”, um quadrupolo composto de hastes

hiperbólicas, onde cada haste é dividida em três seções axiais sucessivas. Estas três

secções adjacentes quando submetidas a uma discreta voltagem DC são capazes de

aprisionar e armazenar íons ao longo do eixo z na secção central. Os íons aprisionados são

ejetados pelas aberturas presentes na secção central das hastes na posição X e, então, são

detectados por dois detectores. As outras duas voltagens necessárias na operação do LTQ

são as voltagens RF, que aplicadas aos pares de hastes X e Y servem para aprisionar os

íons, e as voltagens AC, que aplicadas às hastes X possibilitam o isolamento, a excitação e

a ejeção dos íons (SCHWARTZ et al., 2002). Comparado com o ion trap antecedente (3-D

ion trap), o LTQ possui vantagens, como os reduzidos efeitos das cargas num determinado

espaço, aumento na eficiência de aprisionamento de íons e aumento na sensibilidade

(SCHWARTZ et al., 2002; YATES et al., 2009).

O Orbitrap é um tipo de analisador de massa, apresentado em 2000 por Makarov, e

comercialmente disponível em 2005, combinado com o LTQ. O Orbitrap juntamente com o

analisador de ressonância de íon cíclotron (ICR – ion cyclotron resonance), são as duas

principais configurações que utilizam a Transformada de Fourier (FT) para converter os

41

sinais de ondas prescritos pela órbita dos íons em sinais referentes ao espectro de massas

(m/z). Esses dois analisadores operam de maneira muito semelhante, contudo os íons no

Orbitrap são aprisionados no interior do trap apenas por um campo elétrico, enquanto no

ICR o aprisionamento dos íons envolve também ação de campo magnético, e passam a

orbitar ao redor de um eletrodo central com oscilações harmônicas, das quais são obtidas as

frequências em então deconvoluidas pela FT (HOFFMANN; STROOBANT, 2007). Os íons

aprisionados são excitados por pulsos de radio frequência para que descrevam órbitas

coerentes, e com detectores são medidos os sinais elétricos dos íons que passam próximos

a eles ao longo de um período, produzindo um sinal periódico. Como a frequência de um íon

em sua órbita é determinada pelo seu m/z, os sinais detectados são posteriormente

desconvoluídos pela aplicação da FT.

A energia inicial com a qual os íons são introduzidos no orbitrap gera uma força

centrífuga que é balanceada pela força eletrostática atraindo os íons para o eletrodo central

fazendo-os girar em trajetória espiral. O movimento axial dos íons ao longo do eletrodo

central é dependente da sua razão massa-carga e as oscilações observadas entre as duas

laterais do orbitrap, as quais são separadas entre si por um anel de cerâmica, são

detectadas e por Transformada de Fourier, são obtidos os espectros com a m/z acurada

(MAKAROV, 2000; HU et al., 2005).

As características do Orbitrap são alta resolução de até 150000, acurácia de 2-5ppm

ou de 1-2 ppm com calibração interna (OLSEN et al., 2005) alcance de m/z de 6000 e

variação dinâmica maior que 1000 (HU et al., 2005; MAKAROV et al.,2006; YATES et al.,

2006). Quando acoplado com o LTQ, o instrumento híbrido (LTQ-Orbitrap) possui as

vantagens de alta resolução e acurácia do Orbitrap e a velocidade e sensibilidade do LTQ

(MAKAROV et al., 2006; YATES et al., 2009). O LTQ-Orbitrap consiste de 3 partes

principais: o LTQ que aprisiona, seleciona e fragmenta os íons; o C-trap, que armazena e

ejeta os íons para o Orbitrap; e o Orbitrap, que detecta os íons em alta resolução.

Em 2009 foi lançada a versão do espectrômetro de massa LTQ- Orbitrap Velos

(OLSEN et al., 2009; SECOND et al.2009). Três principais características o diferenciam da

sua versão anterior: (1) introdução de um sistema mais eficiente de transmissão de íons

entre atmosfera /vácuo (S-Lenz); (2) um novo LTQ com duas câmeras que trabalham em

diferentes pressões - câmara de alta pressão: aprisiona e a ativa os íons de forma mais

eficiente; - câmara de baixa pressão: permite o escaneamento e a detecção dos íons de

forma mais rápida; (3) uma eficiente integração entre C-Trap e a câmera de colisão em alta

energia (High-energy Collision Dissociation – HCD) (OLSEN et al., 2009). A figura 7 ilustra o

esquema dos contituintes do LTQ Orbitrap velos.

42

Figura 7 - Esquema do LTQ Orbitrap Velos: Íons introduzidos através da fonte ESI são armazenados pelo Ion Trap e enviados ao Orbitrap para escaneamento dos precursores em alta resolução. Enquanto isso, novos peptídeos de íons são novamente armazenados pelo íon trap, fragmentados e medido por . MS/MS S-lens = Stacked Ring Ion Guide, High Pressure Cell e Low Pressure Cell = Dual ion trap, C-trap HCD collision Cell = Combo HCD collision cell. (Adaptado de Olsen et al., 2009). -

43

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Analisar o proteoma de plastídeos isolados do endosperma de sementes em

desenvolvimento de pinhão manso (Jatropha curcas), pela estratégia proteômica “shotgun”.

3.2 Objetivos Específicos

Isolar os plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão

manso.

Identificar as proteínas plastidiais extraídas através da busca dos espectros de

MS/MS contra o banco de dados de proteínas do pinhão manso, utilizando

algoritmos de busca presentes em programas computacionais.

Analisar a localização subcelular das proteínas identificadas.

Realizar a classificação funcional das proteínas identificadas.

44

4. METODOLOGIA

4.1 Material vegetal

As sementes de pinhão manso, de plantas com três anos, foram obtidas no campo

experimental do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal do Ceará, localizado

no município de Pentecostes. O endosperma das sementes em desenvolvimento, com 25 a

30 dias após a antese (DAA), foi o tecido utilizado para a obtenção de uma fração

enriquecida de plastídeos. A eliminação dos integumentos e do embrião foi realizada

manualmente.

A escolha dos estágios do desenvolvimento das sementes foi realizada com base na

caracterização morfológica e histoquímica realizada pelo nosso grupo de pesquisa

(PINHEIRO, 2010).

4.2 Preparação histológica de sementes em desenvolvimento do pinhão manso

As sementes do pinhão manso em desenvolvimento, com 25 e 30 dias após a

antese (DAA) foram coletadas e armazenadas em frascos contendo o fixador Karnovsky

(KARNOVSKY,1965) por 48 horas. As amostras das sementes em desenvolvimento,

imersas em Karnovsky, foram então lavadas 4 vezes, por cinco minutos, com tampão fosfato

0,2M e em seguida passaram por um processo de desidratação em concentrações

crescentes de etanol (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%), por uma

hora em cada concentração. Após a desidratação as amostras foram postas em solução de

pré-infiltração (50% álcool e 50% de resina básica LEICA HISTORESIN Embedding Kit), sob

vácuo. Após 48 horas, as amostras foram postas na solução de infiltração (LEICA

HISTORESIN Embedding Kit), permanecendo nesta por 10 dias sob pressão negativa.

Secções de 5μm, obtidas em micrótomo LEICA 2065, foram coradas com azul de toluidina

0,12%-Bórax 5%, durante 10 minutos e fucsina básica 0.025%, durante 1 minuto. As

lâminas foram analisadas em microscópio de luz.

4.3 Preparação histoquímica de sementes em desenvolvimento do pinhão manso

Análises histoquímicas de endosperma sementes do pinhão manso em

desenvolvimento com 25 e 30 DAA foram realizadas utilizando-se reagentes específicos à

identificação de lipídios e proteínas.

Para determinação de lipídios, cortes frescos a mão livre foram realizados no

endosperma de sementes em desenvolvimento nos estágios acima citados e colocados em

contato com Sudan IV 2% em etanol 92%, por 30 minutos. Em seguida foram lavados

rapidamente em uma série decrescente de etanol 70%, 50% e 30%, finalizando com água.

45

Em seguida, os cortes mais finos foram selecionados para serem analisados imediatamente

em microscópio de luz.

Para detecção de proteínas as amostras do endosperma das sementes em

desenvolvimento nos diferentes estágios, acima citados, foram imersas em Karnovsky e

então lavadas quatro vezes por cinco minutos com tampão fosfato 0,2M e, em seguida,

passaram por um processo de desidratação em concentrações crescentes de etanol (10%,

20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%), por uma hora em cada concentração.

Após a desidratação as amostras foram postas em solução de pré-infiltração (50% álcool e

50% de resina básica LEICA HISTORESIN Embedding Kit), sob vácuo. Após 48 horas, as

amostras foram postas na solução de infiltração (LEICA HISTORESIN Embedding Kit)

permanecendo nesta por 10 dias sob pressão negativa.

Secções de 5μm, obtidas em micrótomo LEICA 2065, foram coradas com Xylidine

Ponceau (XP) 0,1% em ácido acético 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente e em

seguida lavadas com ácido acético 3% por 15 minutos, e posteriormente lavados 2 vezes,

rapidamente, em água. Após montagem em entelan foram analisados em microscópio de

luz.

4.4 Isolamento de plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do

pinhão manso

Para a obtenção da fração enriquecida de plastídeos, do endosperma de sementes

com 25 a 30 DAA, foi adotada a metodologia baseada em Boyle, Hemmingsen e Dennis

(1986) com algumas modificações. Primeiramente, 15g do tecido foram isolados, picotados,

e posteriormente homogeneizados em 20 ml de tampão de homogeneização (TH) acrescido

de albumina sérica bovina (BSA) e Ficoll, durante 10 minutos. Após a homogeneização, o

material foi filtrado em membrana cheesecloth. O material retido na membrana foi

novamente homogeneizado em 10 ml de TH acrescido de BSA e Ficoll durante 10 minutos.

O filtrado foi, então, centrifugado a 200g, durante 10 minutos, a 6 oC. O precipitado foi

descartado e o sobrenadante foi centrifugado a 6000g, durante 15 minutos, a 6 oC. O

sobrenadante foi então descartado e o precipitado foi solubilizado em 2,5ml de TH sem BSA

e Ficoll. Essa fração foi denominada de fração enriquecida de organelas. No topo de um

tubo falcon, contendo gradiente descontínuo de PBF-Percoll 10%-22%-35%, foi colocada a

fração enriquecida de organelas. O tubo foi centrifugado (Sigma, 4K15) em rotor swing-out a

5000g, durante 45 minutos, com aceleração 8 e desaceleração zero, a 4 oC. A banda

formada na interface da camada 22-35%, foi coletada e diluída com 20 ml de TH sem BSA e

Ficoll e em seguida centrifugada a 1000g, durante 10 minutos, a 6 oC, seguido de descarte

46

do sobrenadante. O precipitado obtido foi denominado de fração enriquecida de plastídeos.

O procedimento descrito nesse tópico está ilustrado na figura 8.

4.5 Processamento da amostra para análise por microscopia eletrônica de

transmissão (MET)

A fração obtida no final do processo de isolamento dos plastídeos foi fixada em

Karnovsky (KARNOVSKY, 1965), lavada em tampão cacodilato 0,05 M durante 10 minutos

por três vezes. Em seguida, pós-fixada em tetróxido de ósmio 1%, durante uma hora; lavada

três vezes em tampão cacodilato 0,05 M, durante 15 minutos. Posteriormente, a fração foi

desidratada em soluções de álcool de concentrações progressivamente crescentes de 15 %,

30 %, 50 %, 85 %, 90 % (duas vezes consecutivas) e 100 % (três vezes consecutivas),

durante 20 minutos em cada solução. Em seguida foi infiltrada em concentrações crescentes

de resina L.R.White em etanol, finalizando o processo de infiltração, após 4 dias, com os

explantes imersos em solução de L.R.White puro; incluídas em solução de L.R.White com

ativador, durante 3 dias, sob luz UV e refrigeração, para possibilitar a polimerização. As

amostras infiltradas foram primeiramente submetidas a cortes semi-finos de 500 nm para

uma triagem do material antes da visualização ao microscópio eletrônico de transmissão.

Esses cortes foram feitos em ultramicrótomo, modelo Leica Ultracut UCT, da Leica,

utilizando-se facas de diamante, colocados em lâminas sob água, secos em chapa quente, e

corados em azul de toluidina e observados em microscópio óptico, Axioskop, da Carl Zeiss.

Após essa triagem, trocou-se a espessura de corte para 60nm (cortes ultrafinos) utilizando-

se facas de diamante. Esses cortes foram coletados em grades de cobre de malha 200

cobertas com formvar e carbono. O contraste dos cortes foi em seguida realizado com

acetato de uranila 2%, durante 1 hora. Os cortes foram visualizados diretamente em

microscópio eletrônico de transmissão, Jeol 1011, operando a 80 kV.

4.6 Estabelecimento de mapas bidimensionais da fração enriquecida de plastídeos

4.6.1 Extração de proteínas

A fração enriquecida de plastídeos, após ser liofilizada, foi submetida ao processo de

extração proteica seguindo a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2005). O material

plastidial foi homogeneizado em tampão piridina (piridina 50 mM, tiouréia 10 mM, SDS 1%,

pH 5,0) com polivinil-polipirrolidona em uma proporção de 1:40:2 (p/v/p), respectivamente. A

mistura permaneceu sob agitação, a 4ºC, por quatro horas, em seguida centrifugada a

10.000 g por 40 min. Para permitir a precipitação das proteínas, foi adicionada ao

sobrenadante, acetona gelada contendo 10% de ácido tricloroacético (TCA), na proporção

1:4(v/v), overnight, a -20 oC. Os tubos foram centrifugados a 10.000 g por 20 min, seguido

de descarte do sobrenadante. O precipitado obtido, contendo as proteínas, foi lavado em

47

acetona gelada, agitado até adquirir o aspecto de suspensão, sendo em seguida

centrifugado a 10.000 g por 5 minutos e o sobrenadante descartado. Essa lavagem foi

realizada no mínimo duas vezes para livrar a amostra de qualquer traço de TCA. O

precipitado final, seco a vácuo no dessecador, foi dissolvido em uréia/tiureia (7M/2M), a

concentração de proteínas foi em seguida mensurada utilizando o método de Bradford

(BRADFORD, 1976).

4.6.2 Eletroforese bidimensional, revelação e análise da imagem

Alíquota da amostra da fração enriquecida de plastídeos, contendo 300 µg de

proteínas, foi diluída em solução de reidratação (uréia 7 M, tiouréia 2 M, DTT 65 mM,

CHAPS 1% p/v, pharmalyte 0,5% v/v e azul de bromofenol 0,002% p/v) para um volume final

de 200 μl; este foi utilizado para reidratar passivamente tiras de IPG de 11 cm (Pharmacia

Biotech) durante 12 horas. A focalização isoelétrica foi realizada no equipamento EttanTM

IPGPhorTM (GE-Healthcare) de acordo com o seguinte programa: 1o passo: 500 volts por

2horas; 2o passo: 4000 volts por 2 horas e 30 minutos e 3o passo 10000 volts até atingir

18000 volts. Após a focalização as tiras de IPG foram equilibradas sob agitação em solução

(tris 50 mM, glicerol 30 %, uréia 6M, SDS 2% e azul de bromofenol) com DTT (1% p/v) por

15 minutos, para a redução das proteínas e, em seguida, alquiladas com IAA (3% p/v)

também em solução de equilíbrio por 15 minutos. Terminado o equilíbrio, as tiras, após

lavagem rápida no tampão de corrida para livrá-los do excesso de solução de equilíbrio,

foram levadas ao topo do gel da segunda dimensão e cobertas com tampão de corrida. O

SDS-PAGE da segunda dimensão foi realizado em sistema vertical em géis 15% de 14 x 14

cm. Os 15 primeiros minutos da corrida ocorreu a 10 mA/gel, em seguida a 20 mA/gel até

que o indicador (azul de bromofenol) saísse do gel. Terminada a corrida, o gel foi corado

com Coomassie Phast Gel Blue R 350 e armazenado em solução de glicerol 5%.

Os géis foram escaneados utilizando-se o programa LabScan v. 5.0 (GEHealthcare)

no ImageScanner (Amersham Biosciences) com sistema integrado de transparência, em

seguida foram submetidos à análise utilizando o programa ImageMaster 2D Platinum.

4.7 Digestão proteica em solução e purificação dos peptídeos

4.7.1 Digestão proteica

Antes de iniciar o processo de digestão com tripsina, 40 ug de proteínas plastidiais

do endosperma foram reduzidas em solução de ditiotreitrol (DTT) 10 mM, durante 30

minutos a 56 oC. Em seguida, foram alquiladas em solução de iodo acetamida (IAA) 55mM,

48

por 30 minutos a temperatura ambiente, no escuro. Após a diluição da concentração da

uréia para 1M, as amostras foram digeridas com tripsina (Promega), overnight, a 37 oC.

Após a interrupção da reação de digestão das proteínas com tripsina, através da adição de

ácido fórmico, com volume suficiente para atingir uma concentração final de 2%, deu-se

procedimento à purificação dos peptídeos, seguido de secagem em centrífuga evaporadora

(speed vac). O processo de extração e digestão proteica (Figura 8) foi realizado para sete

replicas biológicas.

4.7.2 Purificação dos peptídeos utilizando spin columns

Antes da aplicação ao nano-LC MS/MS, a purificação dos peptídeos foi procedida

utilizando spin columns preenchidas com resina C-18. Para tanto, inicialmente foi realizada a

ativação da resina, através do acréscimo de 200 µl de acetonitrila (ACN) 100% às spin

columns, seguido de centrifugação a 1000 rpm durante 2 minutos, esse processo foi

repetido três vezes. Em seguida a coluna foi equilibrada acrescentando-se 200 µl de 0,1%

de ácido fórmico (FA), seguido de centrifugação a 1000 rpm durante 2 minutos, esse

processo foi repetido três vezes. Após equilíbrio da coluna, as amostras foram dissolvidas

em 200 µl de FA 0,1%, aplicadas nas spin columns pré-tratadas que foram centrifugadas a

500 rpm durante 5 minutos. As spin columns foram lavadas com 200 µL de FA 0,1%. Os

peptídeos retidos foram eluídos das spin columns, encaixadas a microtubos novos,

aplicando 100 µl de ACN 60% / FA 0.1% e centrifugando a 500 rpm durante três minutos

(passo repetido três vezes). Os peptídeos eluidos foram secos em centrífuga evaporadora

(speed vac) e armazenados a -20 oC para posterior uso (Figura 8).

4.8 Nano-LC MS/MS

Os peptídeos obtidos foram dissolvidos em 32 µL de ácido fórmico 0,5%, dos quais 4

µL foram aplicados no EASY-nano LC system (Proxeon Biosystem) acoplado on-line ao

espectrômetro de massa ESI-LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos

foram eluidos de uma coluna trap (150 µm ID x 2 cm), preenchida manualmente com resina

ReproSil 5 µm (C-18) (Dr. Maisch, Germany) e de uma nano-coluna (coluna analítica)

(100µm IDx 15 cm), preenchida com o mesmo material (3 µm), utilizando gradientes da fase

A (ácido fórmico 0,1%, ACN 5%) e B (ácido fórmico 0,1%, ACN 95%), em três passos que

duraram um total de 2 horas: i. gradiente de 5% a 35% fase B por 107 minutos; ii. 35% a

90% fase B durante 8 minutos; iii. 90% fase B durante 5 minutos. Após cada corrida a

coluna foi lavada com fase B 90% e reequilibrada com a fase A.

Os espectros de massa foram obtidos em um modo positivo utilizando pesquisa por

varredura MS, análise dependente de dados - “data - dependent analysis” (DDA) e aquisição

49

dos espectros de massa em tandem (MS/MS). Cada consistiu de uma varredura de

pesquisa de uma razão massa/carga na faixa de 350-2000 e resolução de 60.000 com um

valor alvo de 1x10-6 íons. A varredura foi seguida pelo aquisição dos espectros de MS/MS

dos 10 íons mais intensos no LTQ utilizando a dissociação induzida por colisão (CID), e os

íons previamente fragmentados foram excluídos por 60 segundos. A visualização dos

espectros e de todas as informações resultantes do espectrômetro no formato Raw foi

realizada pelo programa X-Calibur v.2.1 (Thermo Scientific). Cada replicata biológica foi

adquirida três vezes e gerou três arquivos raw, representando três replicatas técnicas. A

figura 8 ilustra o processo adotado para o preparo da amostra para ser analisada por

espectrometria de massa.

50

Figura 8 - Processo adotado para o preparo da amostra para ser analisada por espectrometria de massa.

51

4.9 Análise dos dados

4.9.1 Interpretação dos espectros de MS/MS

Os arquivos no formato Raw, obtidos do espectrômetro de massa, foram convertidos

para o formato MS2, utilizando o programa RawXtractor e então submetidos ao ProLuCID

v.1.0.0.35 (XU et al., 2006). A busca dos espectros MS/MS foi realizada contra o banco de

dados de proteínas do pinhão manso (HIRAKAWA et al., 2012), disponível no site

http://www.kazusa.or.jp/jatropha/ Setembro de 2012, combinado com as proteínas

codificadas a partir do genoma de cloroplasto do pinhão manso (ASIF et al., 2010), baixadas

no National Center for Biotechnology Information (NCBI), em setembro de 2012. Esse banco

de dados, obtido dessa combinação, foi montado e convertido em um formato reconhecível

pelo ProLuCID através da ferramenta FastaDBXtractor, do programa PatternLab. A busca foi

realizada seguindo os seguintes parâmetros: hidrólise tríptica completa, análises incluindo

dois sítios de clivagem perdidos pela tripsina (two missed cleavages), oxidação da metionina

como modificação variável, carbamidometilação como modificação fixa e tolerância do íon

precursor de 50 ppm.

4.9.2 Processamento e filtragem dos dados

A validação estatística dos resultados obtidos da pesquisa, derivados do ProLuCID,

foi realizada no SEPro – Search Engine Processor (SEPro) (CARVALHO et al., 2012). Nele,

os peptídeos identificados foram processados / filtrados usando uma taxa de 1% de falsa

descoberta (FDR), para o controle de qualidade das proteínas identificadas. A interface

gráfica do usuário (GUI) do SEPRO fornece informações sobre a identificação das proteínas

totais, os grupos de proteínas, proteínas com máxima parcimônia, peptídeos relacionados a

cada proteína, dentre outras. Além dessas informações, é possível realizar o download das

sequencias FASTA das proteínas identificadas, as quais podem ser necessárias e utilizadas

em análises à jusante.

4.9.3 Descrição e classificação funcional das proteínas

As sequencias fastas das proteínas identificadas foram submetidas a um blast contra

o banco de dados não redundante do NCBI e suas vias metabólicas mapeadas pelo KEGG

(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), utilizando a ferramenta de anotação

Blast2GO (CONESA; GÖTZ, 2008) (www.blast2go.org). As proteínas que o KEGG não foi

capaz de mapear (http://www.genome.jp/kegg/) foram manualmente classificadas em

classes funcionais (DEMARTINI et al., 2011).

52

4.9.4 Obtenção dos ortólogos

Para se determinar os ortólogos das proteínas identificadas do pinhão manso

presentes em Ricinus e em Arabidopsis, foi realizado um blast local contra as sequencias

das proteínas destas espécies baixadas, respectivamente, dos bancos de dados UniProt

(http://www.uniprot.org) e TAIR (http://www.arabidopsis.org/), em Outubro de 2012,

utilizando um valor de corte do evalue de -20.

4.9.5 Localização subcelular das proteínas

A predição da localização subcelular das proteínas identificadas foi realizada com

base nos programas Plant-mPLoc v.2.0 (CHOU; SHEN, 2010)

(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant/), TargetP (EMANUELSSON et al., 2000)

(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) e ChloroP (EMANUELSSON et al., 1999)

(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/); e através da busca em três banco de dados

públicos de plastídeos: plant proteome databases: PPDB (SUN et al., 2009),

Subcellular localisation database for Arabidopsis proteins: SUBA (HEAZLEWOOD et al.,

2007) e plastid protein database: PlProt (KLEFFMANN et al., 2006). A fim de verificar a

presença dos homólogos das proteínas identificadas neste estudo, nos proteomas dos

outros tipos de plastídeos como, amiloplastos, embrioplasto, cloroplasto e cromoplasto, foi

realizado um blast contra as sequencias de proteínas obtidas a partir da análise de outros

plastídeos, utilizando BLASTP (ALTSCHUL et al., 1990), com um valor de expectativa de

corte de 1e-20. Para maximizar o número de proteínas utilizadas para a comparação com os

nossos dados, sequências de proteínas de diferentes plastidomas analisados foram

combinados. Os dados de amiloplastos foram obtidos a partir de Balmer et al. (2006) e

Stensballe et al. (2008), os de cromoplastos a partir de Siddique et al. (2006), Barsan et al.

(2010) e Zeng et al. (2011), os de cloroplastos a partir de Kleffmann et al. (2004), Zybailov

et al. (2008), Friso et al. (2010) e Joyard et al. (2010) e os de embrioplastos a partir de Jain

et al. (2008) e Demartini et al. (2011). A figura 9 mostra esquematicamente as etapas

adotadas para a análise dos dados obtidos por espectrometria de massa.

4.9.6 Disponibilização dos dados brutos e tabelas suplementares

As tabelas suplementares estão disponíveis no material suplementar do artigo:

Proteome analysis of plastids from developing seeds of Jatropha curcas L., na revista:

Journal of Proteome Research. 2013 Nov 1;12(11):5137-45. via internet no:

http://pubs.acs.org. Os dados brutos de espectrometria de massa estão disponíveis no:

yoda.iq.ufrj.br/plastids/.

53

Figura 9 - Esquema mostrando as etapas adotadas para a análise dos dados obtidos por espectrometria de massa.

54

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Material vegetal

A escolha dos estágios de desenvolvimento do endosperma das sementes de pinhão

manso, para a condução dos experimentos proteômicos de plastídeos, foi realizada com

base na caracterização morfológica, histológica e histoquímica. A caracterização

morfológica mostrou que a partir de 25 DAA, o endosperma já está em processo de

celularização sendo, portanto, possível separá-lo do integumento nas sementes de pinhão

manso, o que viabiliza a coleta e comparação de ambos tecidos em estágios similares.

Nesse estágio, de acordo com os dados histoquímicos obtidos, não é verificada deposição

de lipídios (Figura 10 C1) ou proteínas (Figura 10 D1) no endosperma das sementes. Aos 30

DAA é possível detectar o início da deposição de lipídios (Figura 10 C2) e proteínas (Figura

10 D2).

Um dos objetivos do presente trabalho é adquirir um maior conhecimento sobre as

enzimas envolvidas nas biossíntese dos ácidos graxos e dos ésteres de forbol, bem como

nas outras vias metabólicas que ocorrem nos plastídeos. Diante dos resultados obtidos das

análises morfológica, histológica e histoquímica as sementes com características

morfológicas típicas dos estágios entre 25 e 30 DAA, foram as utilizadas para o isolamento

de plastídeos do endosperma, pois aos:

25 DAA: é um estágio que antecede imediatamente a deposição de lipídios. Não foi

observada a deposição de lipídios nesse estágio, entretanto Annarao et al. (2008) os

detectou em estágios anteriores a 30 DAA. Isso indica que aos 25 DAA pode estar

ocorrendo início da síntese de ácidos graxos que servirão de precursores para a

formação de triacilgliceróis. Nesse estágio, o endosperma já pode ser visualizado e

possível de ser isolado do restante da semente para posterior isolamento de

plastídeos.

30 DAA: nesse estágio ainda não há grande deposição de proteínas de reserva, as

quais poderiam interferir no enriquecimento dos plastídeos e limitariam a detecção

de um maior número de proteínas. Além disso, nesse estágio, o metabolismo de

lipídios possivelmente encontra-se bastante ativo, pois se trata de estágios iniciais da

síntese ácidos graxos.

55

Figura 10 – Histologia e histoquímica do endosperma de sementes do pinhão manso com 25 e 30 DAA. Morfologia da semente do pinhão manso com 25 DAA (A1) e 30 DAA (A2). Secção longitudinal; teste histoquímico com Sudan IV, específico para lipídios totais e teste histoquímico com Xylidine Ponceau, específico para proteínas totais do endosperma da semente do pinhão manso com 25 DAA (B1, C1, D1, respectivamente) e 30 DAA (B2, C2, D2, respectivamente). Aos 30 DAA pode-se observar o início da deposição de lipídios (C2) e de proteínas (D2), através da visualização dos grânulos vermelhos. Barra: 0,05mm

56

5.2 Isolamento de plastídeos

O processo de isolamento de plastídeos ocorreu através de uma série de

centrifugações, dentre as quais o passo de centrifugação em gradiente descontínuo de PBF-

Percoll, foi fundamental para a obtenção de uma fração enriquecida de plastídeos localizada

na interface das camadas de 35-22% do gradiente de PBF-Percoll (Figura 11A). A

averiguação de que a composição dessa amostra era composta predominantemente por

plastídeos foi realizada por microscopia eletrônica de transmissão (Figura 11B). Na análise

por MET foi possível observar que a fração localizada da interface das camadas de 35 e

22% do gradiente de PBF-Percoll é composta na sua maioria por único tipo de organela,

apresentando um alto padrão de homogeneidade. Segundo Miernyk et al. (1989) os

leucoplastos in situ são tipicamente ovóides, entretanto quando isolados sob condições

isosmótica apresentam forma esférica com uma matriz granular uniforme, poucos

plastoglobulos e sem membrana elaborada no estroma, ou seja, sem tilacóides, tais

características se assemelham às observadas nessa fração (Figura 11B). Os plastídeos

observados nessa fração apresentaram tamanhos variados, intactos na sua maioria. Essa

fração foi, dessa forma, denominada de fração enriquecida de plastídeos.

A utilização de gradiente descontínuo de Percoll é descrita na literatura como um

método importante no isolamento de plastídeos, essa técnica mostrou ser eficiente na

separação dos leucoplastos, das frações citosólicas mitocondrial e peroxissomal, por Gupta

e Singh (1996), Smith et. al. (1992), Negm et. al. (1995), Shearer et. al. (2004), Primavesi et.

al. (2008) e Jain et. al. (2008).

O protocolo de isolamento de leucoplasto utilizado no presente trabalho baseou-se

no proposto por Boyle et. al. (1986), com algumas modificações, e, assim como os acima

relacionados, utiliza gradiente descontínuo de Percoll. Este protocolo mostrou-se eficiente

na obtenção de uma fração enriquecida de leucoplastos, como mostrado nos resultados

obtidos por MET.

5.3 Eletroforese bidimensional

As análises dos géis obtidos a partir da fração enriquecida de plastídeos mostraram

que na faixa de pH de 4 a 7, a distribuição dos “spots” se deu de forma bastante uniforme,

com baixa sobreposição observada entre os mesmos. Os “spots” apresentam-se bem

definidos isso possivelmente ocorreu devido ao decréscimo de interferentes que foram

progressivamente sendo retirados durante a série de centrifugações necessárias para a

obtenção da fração enriquecida de plastídeos (Figura 11C).

57

Figura 11 - Isolamento dos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão manso. a) Os plastídeos foram isolados em gradiente de PBF-Percoll. A fração enriquecida de plastídeos se localiza na interface das camadas de 35-22% do gradiente de PBF-Percoll. b) A análise por microscopia eletrônica de transmissão dessa amostra segure que essa fração é enrriquecida de plastídeos (Barra 2µm). c) Eletroforese bidimensional (2-DE) das proteínas extraídas da amostra enriquecida de plastídeos. A extração proteica foi realizada utilizando tampão contendo SDS. Foram aplicadas ao gel 300µg de proteína.

58

5.4 Identificação das proteínas

Após a digestão em solução e análise por LC-MS/MS de cada uma das sete

replicatas biológicas das proteínas extraídas dos plastídeos, isolados a partir do

endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão manso, utilizando um FDR de 1%,

foram identificadas 1.103 proteínas, representando 804 grupos de proteínas, das quais 923

eram proteínas presentes em pelo menos duas das sete replicatas biológicas. Estas

proteínas foram as utilizadas para a análise e discussão dos dados (Tabela suplementar 1).

Diversos trabalhos proteômicos com o pinhão manso foram realizados. Dentre esses

citam-se os desenvolvidos por Liang et al. (2007); Yang et al. (2009), Liu et al. (2009);

Popluechai et al. (2011), Liu et al. (2011), Liu et al. (2013); Booranasrisak et al. (2013); Liu

et al. (2015), os quais identificaram respectivamente 8, 50, 14, 10, 28, 104, 22, 83 proteínas,

quantidades bem inferior à obtida no presente trabaho.

Os dados produzidos nesse trabalho foram publicados em 2013 (PINHEIRO et al.,

2013), sendo o primeiro estudo proteômico realizado de forma mais profunda no pinhão

manso. Em 2014 novos estudos proteômicos, em profundidade, com o pinhão manso foram

realizados: Soares et al. (2014) ao analisar o proteoma do integumento interno, de sementes

em desenvolvimento do pinhão manso, identificaram 1770 proteínas. Shah (2014) em sua

tese sobre a análise do proteôma do endosperma de sementes em desenvolvimento do

pinhão manso, identificou 1760 proteínas.

5.4.1 Proteínas codificadas no genoma plastidial

Dentre as proteínas identificadas somente 5 são codificadas no genoma do

plastídeo, sendo elas: ATP synthase cf1 alpha subunit, ATP synthase beta subunit,

acetylcarboxylase carboxyltransferase beta subunit, hypothetical chloroplast rf1, e ribulose-

bisphosphate carboxylase oxygenase large subunit.

O genoma plastidial codifica 110 genes distintos, dentre esses, 78 codificam para

proteínas com funções relacionadas à fotossíntese (DELANNOY et al., 2011). Portanto a

escassez de proteínas fotossintéticas, na fração de plastídeos do endosperma de sementes

em desenvolvimento do pinhão manso, está de acordo com sua natureza não fotossintética.

O número reduzido de identificações de proteínas codificadas no genoma plastídial é

coerente com o fato de que a maioria das proteínas plastidiais é codificada no núcleo,

traduzida no citosol, exportada para a organela e direcionada a um dos seus

compartimentos suborganelar, apenas um pequeno número de polipeptídios derivam da

expressão de genes plastidiais (DAHER et al., 2010). Segundo Soll (2002), Milla et al.

(2006), Barsan et al. (2010), o genoma plastidial é composto por 110 – 130 genes, enquanto

59

o número de proteínas dentro dos plastídeos é cerca de 2700 proteínas. Assim

aproximadamente 95% das proteinas plastidiais são expressas a partir do genoma nuclear e

exportadas do citoplasma para os plastídeos.

5.4.2 Localização subcelular

Para avaliar as proteínas identificadas de acordo com suas respectivas localizações

subcelulares, elas foram submetidas a três programas de predição subcelular disponíveis na

web: Plant-mPLoc, ChloroP e TargetP. Essa análise mostrou que, dentre as 923

identificações verdadeiras, 161 proteínas possuíam um peptídeo trânsito plastidial em todos

os três programas de predição subcelular, 99 proteínas foram consideradas plastidiais, por

pelo menos dois dos três programas, ao passo que 258 proteínas foram identificadas como

plastidial por pelo menos um dos três programas de predição utilizados subcelular (Figura

12A). Desta forma, um total de 518 proteínas foram marcadas como plastidiais com base

nesses três programas de predição.

Além disso, a pesquisa por homólogos das proteínas identificadas em três bases de

dados de proteínas plastidiais, PlProt, PPDB e SUBA mostrou que 566, 349 e 750 proteínas

plastidiais homólogas foram encontradas nestas bases de dados, respectivamente (Figura

12B). Dentre as 923 proteínas, 296 possuíam homólogos nessas três bases de dados, 249

em pelo menos dois bancos de dados e 279 em pelo menos um dos três bancos de dados.

A análise mostrou que homólogos para 824 dentre as 923 proteínas identificadas nos

plastídeos do endosperma estavam presentes em pelo menos um dos três bancos de dados

utilizados, enquanto homólogos de 13 proteínas (Tabela suplementar 1) não foram

encontrados em nenhum dos 3 bancos de dados e em nenhum dos proteomas dos quatro

tipos de plastídeos, utilizados no presente trabalho para a comparação, mas foram

marcados como plastidiais por pelo menos um dos três programas de predição utilizados. A

localização dos homólogos dessas treze novas proteínas plastidiais foi pesquisada em

diferentes bancos de dados, e a maioria dessas proteínas ainda não estavam anotadas

quanto a sua localização subcelular nem no banco de dados do NCBI nem no Uniprot,

enquanto que no banco de dados do TAIR a maioria delas está anotada para diferentes

localizações subcelulares (Tabela suplementar 2).

Uma proteína foi identificada como proteína plastidial se esta foi reconhecida como

plastidial por pelo menos um dos três programas de predição de localização subcelular, se

ela apresentou homologia com as proteínas presentes em pelo menos um dos três bancos

de dados de proteínas plastidiais, ou se ela apresentou homologia com as proteínas

presentes no proteoma dos quatro tipos de plastídeos utilizados no presente trabalho para a

60

comparação com a análise proteômica dos plastídeos do endosperma. Através da

combinação dessas três ferramentas, 869 proteínas foram classificadas como plastidiais

(Tabela suplementar 1), enquanto 54 proteínas não foram classificadas como plastidiais e,

portanto, a sua presença na fração plastidial pode decorrer de associação não específica

com os plastídeos durante o procedimento de purificação, o qual é uma ocorrência bastante

comum em estudos proteômicos plastidiais (DEMARTINI et al., 2011).

61

Figura 12 - Diagrama de Venn (OLIVEROS, 2007) mostrando o número de proteínas marcadas como plastidial por cada um dos três programas de predição subcelular: ChloroP, TargetP e Plant mPLoc. (A); nas três bases de dados plastidiais utilizadas: plProt, PPDB e SUBA (B).

62

A maioria das importações das proteínas plastidiais codificadas no núcleo é dirigida

pela porção N-terminal do peptídeo sinal alvo denominado de peptídeo transiente.

Acreditava-se inicialmente que todas as proteínas plastidiais tinham peptídeo

trânsito e sistemas de classificação semelhantes. No entanto, pode haver algumas

diferenças entre as organelas devido à existência de características subplastidiais

específicas incluindo estruturas membranosas, vesículas ou corpos de inclusão. Várias

proteínas plastidiais conhecidas também parecem não possuir peptídeo trânsito, o que

mostra que proteínas de cloroplastos podem ter uma rota alternativa através da via

secretora, e se tornam N-glicosiladas antes de entrarem no cloroplasto. De forma geral,

estima-se que todos os programas baseados em previsões in silico para a localização de

proteínas plastidiais deixam de reconhecer quase metade das proteínas próprias dessa

organela (DAHER et al., 2010)

Portanto é de extrema importância fazer uso, além de programas de predição

subcelular, dos bancos de dados plastidiais, pois estes fazem uso de estratégias que vão

além da averiguação da existência de peptídeo transiente, incluindo, por exemplo, métodos

quantitativos como o LOPIT (Localiaztion of Organelle Proteins by Isotope Tagging) que por

meio da marcação química tem emergido como uma abordagem poderosa com o intuito de

identificar proteínas localizadas no plastídeo e proporcionar informações sobre funções

plastídeo específica (DUNKLEY et al., 2004).

A maior porcentagem de proteínas identificadas como plastidial foi obtida a partir da

análise do banco de dados de localização subcelular de proteínas de Arabdopsis (SUBA).

Tal resultado se justifica pelo fato de que o SUBA se baseia em uma maior diversidade de

fontes de dados, quando comparado aos demais bancos de dados utilizados no presente

trabalho. Dentre as fontes de informações utilizadas para construir o SUBA citam-se: fusão

de proteínas com emissão de fluorescência, utilizadas para definir localizações subcelulares

com, pelo menos, 1100 experimentos relacionados concluídos em Arabidopsis; a

espectrometria de massa, como ferramenta proteômica de localização subcelular dos

componentes subcelulares em Arabidopsis a partir da qual já foram produzidos informações

de localização para aproximadamente 2600 proteínas; referências da literatura, informações

de localização por anotações do Swiss-Prot (2000 proteínas) e localização inferida a partir

de descrições de genes (2.700 proteínas); e em diversos programas disponíveis os quais

fornecem informações de predição quanto a localização subcelular para proteínas com base

na sequencia de aminoácidos (HEAZLEWOOD et al., 2007). Agrupando todas essas

63

informações o banco de dados SUBA fornece um poderoso meio de se avaliar a localização

subcelular de proteínas.

5.5 Comparação com outros plastidomas das proteínas identificadas

As buscas dos homólogos das proteínas identificadas nos plastídeos não

fotossintéticos do pinhão manso foram realizadas para compará-las com aquelas

identificadas nos outros tipos de plastídeos (amiloplasto, cromoplasto, cloroplasto e

embrioplasto) de outras espécies de plantas (trigo, batata, pimentão, laranja, Arabidopsis

thaliana e Brassica napus) (Figura 13) (Tabela suplementar 1). Para isso, os dados

proteômicos dessas diferentes análises proteômicas foram agrupados por tipo de plastídeo:

amiloplastos, cromoplastos, cloroplastos e embrioplastos. Nossos resultados mostraram que

para as proteínas plastidiais presentes no endosperma do pinhão manso 424, 402, 618 e

585 apresentam homologias com as proteínas identificadas em amiloplastos, embrioplastos,

cloroplastos e cromoplastos, respectivamente (Tabela suplementar 1).

64

Figura 13 - Diagrama mostrando a comparação entre o proteoma plastidial do pinhão manso e as proteínas identificadas a partir de outros tipos de plastídeos. Eixo-X mostra diferentes tipos de plastídeos, os quais os proteomas foram utilizados para comparação como proteoma plastidial do endosperma do pinhão manso. Eixo-Y, à esquerda do diagrama, mostra o número total de proteínas dos sete plastidomas utilizados para a comparação, enquanto o eixo-Y à direita, mostra o número de homólogos, desses sete plastidomas, identificados no proteoma de plastídeo do endosperma do pinhão manso.

65

5.6 Classificação funcional das proteínas identificadas

As 923 proteínas, presentes em pelo menos duas replicatas biológicas foram

mapeadas quanto às vias metabólicas de acordo com a classificação funcional do KEGG,

através da ferramenta de anotação funcional do Blast2go (CONESA; GÖTZ, 2008). Esta

classificação funcional mostrou que as proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos

é a classe funcional principal, seguido por aquelas que estão envolvidas no metabolismo de

carboidratos, energia e lipídios (Figura 14). A discussão das principais classes funcionais, as

quais tiveram uma maior porcentagem das proteínas identificadas, serão feitas a seguir.

66

Figura 14 - Classificação funcional das proteínas identificadas no endosperma de plastídeo do pinhão manso, baseada no mapeamento das vias metabólicas pelo KEGG. Eixo-X mostra as classes funcionais enquanto o eixo-Y mostra a porcentagem de proteínas presentes em cada grupo.

67

5.7 Principais classes funcionais identificadas nas análises proteômicas de plastídeos

do endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão manso

5.7.1 Proteínas relacionadas com atividade transportadora

Durante a análise dos dados obtidos foi feito uma busca das proteínas que

apresentavam atividade transportadora, através do banco de dados de transportadores –

TCDB (http://www.tcdb.org/). Dentre as proteínas identificadas, quase 14% foram

classificadas como transportadoras (Figura 14, Tabela 2, Tabela suplementar 3), esse

resultado é esperado já que os plastídeos são organelas com intensa atividade metabólica,

os quais requerem troca de metabólitos entre eles e outros compartimentos na célula. Três

principais classes de transportadores foram atribuídas pelo TCDB: tranportadores ativos

primários, proteínas canais, e carreadores (Carrier) com 58, 40 e 20 representantes,

respectivamente. O reconhecimento de peptídeos alvo de uma pré-proteína plastidial é

realizado pelo complexo Toc da membrana externa e o complexo Tic da membrana interna,

que forma um sistema de translocação bem caracterizado (STENGEL et al., 2009). As

proteínas referentes ao complexo Toc identificadas foram a Toc75, Toc33, e Toc132. A

proteína Toc75 constitui o principal poro do complexo Toc de onde as pré-proteínas passam

através do envelope externo, e acredita-se ser a proteína mais abundante do envelope

externo (JARVIS; SOLL, 2002). A Toc33 reconhece as pré-proteínas na sua chegada ao

envelope exterior (JARVIS; SOLL, 2002); em Arabidopsis, elas apresentaram envolvimento

no desenvolvimento dos cloroplastos dos tecidos recém-formados (JARVIS et al., 1998);

portanto sua identificação nos plastídeos de sementes em desenvolvimento de pinhão

manso é bastante coerente. A proteína Toc 159, principal componente receptor do complexo

Toc, não foi identificada em nosso estudo. No entanto, Toc132 compensa a ausência da

Toc159 normalmente expressa, proporcionando uma via de importação alternativa

independente da Toc159, como observado por Bauer et al. (2000) em cloroplastos de

Arabidopsis. A Toc132 não foi identificada em análise proteômica de outros plastídeos não

fotossintetizantes, como amiloplasto do trigo (BALMER et al., 2006), cromoplasto de

pimentão (SIDDIQUE et al., 2006), cromoplasto de tomate (BARSAN et al., 2010),

cromoplasto de laranja (ZENG et al., 2011) embrioplasto de Brassica napus (DEMARTINI et

al., 2011), etioplasto de arroz (VON ZYCHLINSKI et al., 2005; REILAND et al., 2011) e

proplastídeo de tabaco (BAGINSKY et al., 2004). Além da identificação de proteínas

membros do complexo Toc, também foram identificadas nas amostras de plastídeos do

endosperma, dois membros do complexo Tic: Tic110 e Tic40.

As proteínas Tic110 são componentes universais do sistema de translocação do

envelope interno, a elas é atribuída a função de recrutar proteínas chaperonas para o

68

complexo Tic (JARVIS; SOLL, 2002). Também foi identificado um homólogo da Hsp93 de

Arabidopsis. Esta chaperona do estroma atua em conjunto com as duas proteínas do

complexos Tic aqui identificadas, Tic110 e Tic40, para fornecer a força motriz para a

translocação da pré-proteína. Essas três proteínas não se associam com o complexo Toc de

maneira específica, elas mediam a importação de todas as proteínas que chegam ao

envelope interior de uma maneira não seletiva (KOVACHEVA et al., 2005). Entre as 129

proteínas que foram classificadas como transportadora, 17 foram proteínas chaperonas do

choque térmico Hsp70. As proteínas Hsp70, bem como as outras famílias de chaperonas,

são conhecidas por interagir com proteínas recém-formadas para impedir sua agregação e

enovelamento incorretos. Esse mesmo tipo de função é desempenhado por essas

chaperonas durante o transporte de proteínas para os plastídeos, onde elas realizavam a

importação de proteínas para a mitocôndria e retículo endoplasmático. Lá, elas mantêm as

proteínas recém-formadas, parcialmente desdobrada, redobrando-as depois de terem sido

totalmente importadas para as organelas (SCHATZ; DOBBERSTEIN, 1996; SU; LI, 2010). A

identificação de um elevado número dessas proteínas chaperonas comprova o extenso

processo de transporte de proteínas para os plastídeos de sementes em desenvolvimento

de J.curcas.

Os plastídeos heterotróficos importam diferentes tipos de açucares fosfatos, assim

como ATPs exógenos via transportadores de ATP/ADP (NTTs), para realizar seu

metabolismo energético. Além da identificação de homólogos da proteína carreadora de

ADP/ATP, foi possível identificar dois transportadores associados ao malato, o transportador

do 2-oxoglutarato/malato e o do glutamato/malato, os quais são necessários para

assimilação plastidial da amônia (RIEBESEEL et al., 2010). Dessa forma, para fornecer a

fonte de carbono para a síntese de aminoácidos nos plastídeos, o 2-oxoglutarato, depois de

ser sintetizado no citoplasma ou na mitocôndria, direciona-se para os plastídeos por meio

desses transportadores (RIEBESEEL et al., 2010; WEBER; LINKA, 2011).

Além do seu papel na assimilação de amônia em órgãos fotossintéticos, verificou-se

que o transportador do 2-oxoglutarate/malate tem um importante papel na acumulação de

aminoácidos e proteínas durante o desenvolvimento da semente. A repressão antisenso do

gene correspondente para este transportador resulta em elevado acumulo de ácidos

orgânicos, amônia, Asn, Asp, Gln e Glu, e também na redução do peso da semente,

diminuição do nível de aminoácidos e de armazenamento de proteínas em sementes de

ervilha (RIEBESEEL et al., 2010).

Dentre os transportadores de açucares, foi possível identificar o transportador da

fosfato/fosfoenolpiruvato (PPT). A fosfoenolpiruvato (PEP) atua como uma fonte primária de

carbono para a síntese de novo dos ácidos graxos nos plastídeos, sendo importada pelo

PPT, e convertida a piruvato juntamente com o PEP derivado da Rubisco (SCHWENDER et

69

al., 2004), a qual ocorre em sementes verdes e não verdes de oleaginosas (TRONCOSO-

PONCE et al., 2011), sendo considerada uma característica adaptativa para contrabalancear

a perda de um terço de carbono, como CO2, como resultado da conversão de carboidratos a

óleo através da glicólise (SCHWENDER et al., 2004). A identificação da piruvato quinase

plastidial juntamente com o PPT e as duas subunidades da Rubisco corroboram com essa

afirmação.

A identificação dos transportadores de trioses fosfatos (TPT), ao invés de

transportadores de hexoses fosfatos indica que assim como nos etioplastos de arroz (VON

ZYCHLINSKI et al., 2005; KLEFFMANN et al., 2007) os plastídeos do endoperma do pinhão

manso importam trioses fosfato, que podem ser convertidas a hexoses fosfato. Além disso,

a identificação de TPT nos plastídeos do pinhão manso contradiz o conceito de que este

translocador está presente apenas em tecidos fotossinteticamente ativos (FL GGE et al.

2011).

70

Tabela 2 - Transportadores dos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no banco de dados do TCDB.

Protein ID Description Class description Subclass description

Jcr4S03513.30 annexin, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00014.190 Aquaporin PIP1.1, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00097.120 Aquaporin PIP1.3, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S02148.40 aquaporin pip2-7 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S05431.20 aquaporin tip2-3 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01065.40 Chloroplast inner envelope protein tic110 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S08787.20 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S02598.30 heat shock 70 kda mitochondrial-like Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00447.50 Heat shock 70 kDa protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S03314.10 heat shock protein 70 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S07413.10 heat shock protein 70 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S11847.20 heat shock protein 70 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S14531.10 heat shock protein 70 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00002.460 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00151.70 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01168.40 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01616.30 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01616.40 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01075.10 Heat shock 70 kDa protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S10760.10 Heat shock 70 kDa protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S07929.20 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S22943.10 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4U31058.10 heat shock protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S09885.10 Aquaporin PIP1.3, putative Channels/pores α-Type channels

71

Jcr4S09350.30 tonoplast intrinsic protein Channels/pores α-Type channels

Jcr4U31394.20 tonoplast intrinsic protein Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00458.120 tonoplast intrinsic protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01391.80 tonoplast intrinsic protein, putative Channels/pores α-Type channels

Jcr4S01065.30 translocon at the inner envelope membra of chloroplas 110 Channels/pores α-Type channels

Jcr4S00149.30 conserved hypothetical protein Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S00182.60 conserved hypothetical protein Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S03986.10 porin voltage-dependent anion-selective channel protein Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S05688.10 porin voltage-dependent anion-selective channel protein Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S07364.30 porin voltage-dependent anion-selective channel protein Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S00017.190 sorting and assembly machinery (sam50) protein, putative Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S01532.40 sorting and assembly machinery (sam50) protein, putative Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S05024.30 conserved hypothetical protein Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S00084.120 voltage-dependent anion-selective channel, putative Channels/pores β-Barrel porins

Jcr4S01977.50 50S ribosomal protein L1p, putative Channels/pores Pore-forming toxins

(proteins and peptides)

Jcr4S04438.10 vesicle-fusing atpase-like Channels/pores Vesicle fusion pores

Jcr4S00042.30 2-oxoglutarate/malate translocator, chloroplast precursor, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00017.150 ADP,ATP carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00017.160 ADP,ATP carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00605.70 ADP,ATP carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

72

Jcr4S00960.80 ADP,ATP carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00453.40 bile acid na+ symporter family protein

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00066.90 cysteine protease, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S03342.10 cysteine protease, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S04373.10 mitochondrial oxoglutarate/malate carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00075.100 Glutathione-regulated potassium-efflux system protein kefB,

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S03704.20 Grave disease carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00405.90 leucine zipper-ef-hand containing transmembrane protein,

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S01943.60 mitochondrial phosphate carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S01943.70 mitochondrial phosphate carrier protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S04175.10 mitochondrial uncoupling protein, putative Eletrochemical Porters (uniporters,

73

potential-driven transporters

symporters, antiporters)

Jcr4S01502.20 mitochondrial uncoupling protein

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S13679.40 Plastidic ATP/ADP-transporter, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S01535.50 Sialin, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00166.130 Sodium-dependent phosphate transport protein, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S00700.110 Triose phosphate/phosphate translocator, non-green plastid, chloroplast precursor, putative

Eletrochemical potential-driven

transporters Porters (uniporters,

symporters, antiporters)

Jcr4S06648.20 Endomembrane protein 70 protein family

Incompletely characterized transport

systems

Recognized transporters of unknown biochemical

mechanism

Jcr4S14077.30 Endomembrane protein 70 protein family

Incompletely characterized transport

systems

Recognized transporters of unknown biochemical

mechanism

Jcr4S00866.100 endomembrane protein emp70, putative

Incompletely characterized transport

systems

Recognized transporters of unknown biochemical

mechanism

Jcr4S00004.420 multicopper oxidase, putative

Incompletely characterized transport

systems

Recognized transporters of unknown biochemical

mechanism

Jcr4S00259.20 Putative uncharacterized protein Incompletely

characterized transport Recognized transporters of

unknown biochemical

74

systems mechanism

Jcr4S01276.30 Putative uncharacterized protein

Incompletely characterized transport

systems

Recognized transporters of unknown biochemical

mechanism

Jcr4S01425.30 transmembrane 9 superfamily member 4-like

Incompletely characterized transport

systems

Recognized transporters of unknown biochemical

mechanism

Jcr4S04988.30 dynamin-related protein 1a

Incompletely characterized transport

systems Putative transport proteins

Jcr4S01275.40 prli-interacting factor l, putative

Incompletely characterized transport

systems Putative transport proteins

Jcr4S19853.10 abc transporter b family member 19-like Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S22663.10 abc transporter b family member 19-like Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S05721.10 abc transporter family of the mitochondria family Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S03559.30 amidase family protein Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00049.120 ATP synthase alpha subunit vacuolar, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

gi|225544131|ref|YP_002720119.1| atp synthase beta subunit

Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00559.20 atp synthase beta subunit Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4U33359.10 atp synthase beta subunit Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00914.20 ATP synthase beta subunit, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

75

Jcr4S01269.80 ATP synthase beta subunit, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

gi|225544109|ref|YP_002720097.1| atp synthase cf1 alpha subunit

Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00868.20 ATP synthase f1, gamma subunit, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00386.10 atp synthase subunit beta Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00004.60 ATP synthase subunit beta vacuolar, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00190.30 ATP-dependent clp protease, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00244.10 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00622.70 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00785.10 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S05722.10 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S07146.20 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S10928.40 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4U30714.10 autoinhibited h+ atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S03461.30 calcium-transporting atpase endoplasmic reticulum-type-like Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S01757.40 Transitional endoplasmic reticulum ATPase, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S02560.50 cell division cycle protein 48 homolog Primary active P-P-bond-hydrolysis-driven

76

transporters transporters

Jcr4S12692.10 dead-box atp-dependent rna helicase 53-like Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00027.120 dead-box atp-dependent rna helicase chloroplastic-like Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00039.10 eukaryotic translation elongation factor, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00770.140 heat shock protein binding protein, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S01567.20 mitochondrial import inner membrane translocase subunit tim17, putative

Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S11341.10 ATP synthase delta chain, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S01029.40 plasma membrane h+-atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S01673.10 plasma membrane h+-atpase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S12130.10 Translocase of chloroplast 120, chloroplastic-like Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S12284.40 Protein grpE, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S05015.10 protein translocase, putative TOC132 Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00335.40 Protein YME1, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S02899.20 Pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump, putative

Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00582.40 Pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump, putative

Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S01939.40 stromal 70 kda heat shock protein Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

77

Jcr4U29722.20 stromal 70 kda heat shock protein Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00009.170 Transitional endoplasmic reticulum ATPase, putative Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S03217.20 translocase of chloroplast 33 Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S00380.90 translocon tic40 Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S05696.30 vacuolar h+-translocating inorganic pyrophosphatase Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S07738.30 v-type proton atpase subunit b2 Primary active transporters

P-P-bond-hydrolysis-driven transporters

Jcr4S01307.20 predicted protein [Populus trichocarpa] Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S27372.10 NADH-plastoquinone oxidoreductase, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00770.110 NADH dehydrogenase, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00087.220 NADH-plastoquinone oxidoreductase, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00169.120 NADH-ubiquinone oxidoreductase 18 kDa subunit, mitochondrial precursor, putative

Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00074.40 NADH-ubiquinone oxidoreductase 24 kD subunit, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00209.90 NADH-ubiquinone oxidoreductase 39 kD subunit, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00273.70 NADH-ubiquinone oxidoreductase flavoprotein, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S00494.40 NADH-ubiquinone oxidoreductase, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S21979.10 NADH-ubiquinone oxidoreductase, putative Primary active Oxidoreduction-driven

78

transporters transporters

Jcr4S01331.30 cytochrome C1, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S03585.60 cytochrome C1, putative Primary active transporters

Oxidoreduction-driven transporters

Jcr4S09082.10 succinate dehydrogenase Transport electron

carriers Transmembrane 2-electron

transfer carriers

Jcr4S09027.20 Stomatin-1, putative Accessory factors

involved in transport Auxiliary transport proteins

79

5.7.2 Proteínas relacionadas com metabolismo dos aminoácidos

As proteínas relacionadas com a biossíntese dos aminoácidos compreenderam a

principal classe funcional encontrada na análise dos dados proteômicos dos plastídeos do

endosperma (Figura 14, Tabela suplementar 4 e Tabela 3), elas apresentam representantes

de todas as vias para a síntese de todas as classes de aminoácidos, inclusive a via do ácido

chiquímico para a síntese do triptofano, tirosina e fenilalanina. Esses aminoácidos também

funcionam como precursores de diversos produtos naturais como os pigmentos, alcaloides,

hormônios, e componentes da parede celular (MAEDA; DUDAREVA, 2012). Dentre as

proteínas presentes na via do ácido chiquímico, foram identificadas as enzimas 3-deoxi-7-

fosfoheptulonato sintase, 3-dehydroquinato sintase e 3-fosfochiquimato 1-

carboxiviniltransferase, esta última sendo alvo do herbicida, amplamente utlizado, glifosato.

Também foram identificados três enzimas da via de corismato a triptofano: a antranilato

sintase, indole-3-glicerol-fosfato sintase e triptofano sintase.

Várias enzimas relacionadas com a assimilação do nitrogênio, tais como, a glutamato

sintase, a glutamato dehidrogenase e aspartato transaminase, e com a assimilação do

enxofre, como a sulfito redutase e a cisteina desulfurase, foram identificadas, o que reforça

a importante função dos plastídeos como sítios de biossíntese de aminoácidos que serão

utilizados para a síntese de proteínas no endosperma em desenvolvimento.

80

Tabela 3 - Proteínas relacionadas com o metabolismo dos aminoácidos, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

ProteinID Protein description Best Ricinus

communisHit Best Arabidopsis thaliana Hit Final locaization

Jcr4S00021.320 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RKN5 AT4G29010.1 P

Jcr4S00035.80 delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase 1 protein B9R960 AT5G62530.1 P

Jcr4S00115.180 aldehyde dehydrogenase, putative B9RZQ0 AT3G66658.2 P

Jcr4S00219.60 alanine aminotransferase, putative B9SPJ9 AT1G70580.4 P

Jcr4S00529.80 alcohol dehydrogenase, putative B9T7D8 AT1G77120.1 P

Jcr4S00558.90 Delta3,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase, mitochondrial precursor, putative B9RM93 AT5G43280.1 P

Jcr4S00616.80 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RT76 AT3G06860.1 P

Jcr4S00742.70 acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial, putative B9SA57 AT5G48230.2 P

Jcr4S01649.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9T4Y7 AT3G51050.1 P

Jcr4S01936.100 aldehyde dehydrogenase - - P

Jcr4S02497.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S02965.20 alcohol dehydrogenase, putative B9SJJ8 AT1G77120.1 P

Jcr4S03123.10 like zinc-binding alcohol dehydrogenase family protein B9RHN6 AT5G63620.1 P

Jcr4S03546.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S04843.20 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme a hydrolase-like B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S04843.30 3-hydroxyisobutyryl- hydrolase-like protein 4 B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S08423.20 aldehyde dehydrogenase family 2 member mitochondrial-like B9RB49 AT1G23800.1 P

Jcr4S11660.10 betaine aldehyde dehydrogenase B9R8Y8 AT1G74920.1 P

Jcr4S26962.10 aldehyde dehydrogenase family 3 member h1 B9S2Y3 AT1G44170.2 P

Jcr4S00601.10 Ethanolamine-phosphate cytidylyltransferase, putative B9S1W1 AT2G38670.1 P

Jcr4S01018.60 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9RWL7 AT2G33150.1 P

Jcr4S05415.60 glutathione peroxidase, putative B9RCA6 AT4G11600.1 P

Jcr4S15816.20 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9S554 AT2G33150.1 P

81

Jcr4S20632.10 ethanolamine-phosphate cytidylyltransferase B9S1W1 AT2G38670.1 P

Jcr4S00014.100 dihydrolipoamide dehydrogenase, putative B9RZW7 AT1G48030.2 P

Jcr4S00056.90 6-phosphogluconate dehydrogenase, putative B9SXT4 AT3G02360.1 P

Jcr4S00085.60 6-phosphogluconate dehydrogenase, putative B9RVA7 AT5G41670.2 P

Jcr4S00087.160 serine hydroxymethyltransferase, putative B9S1D7 AT4G32520.2 P

Jcr4S00112.160 dihydrolipoamide dehydrogenase, putative B9RZN2 AT3G16950.1 P

Jcr4S00118.80 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, putative B9RMA8 AT5G13110.1 P

Jcr4S00167.190 serine hydroxymethyltransferase, putative B9SMX7 AT4G37930.1 P

Jcr4S00168.90 pyruvate dehydrogenase, putative B9RFW4 AT5G50850.1 P

Jcr4S00192.30 2-oxoisovalerate dehydrogenase, putative B9SBN1 AT1G55510.1 P

Jcr4S00306.100 dihydrolipoamide acetyltransferase component of PDH B9S5V2 AT1G54220.2 P

Jcr4S00593.140 acetolactate synthase, putative B9RAF1 AT3G48560.1 P

Jcr4S01023.80 catalase, putative B9S6U0 AT4G35090.1 P

Jcr4S01086.110 isopropylmalate synthase, putative B9SX30 AT1G74040.1 P

Jcr4S01159.40 catalase, putative Q01297 AT4G35090.1 P

Jcr4S01405.50 succinate semialdehyde dehydrogenase B9SUZ1 AT1G79440.1 P

Jcr4S01488.20 2-oxoglutarate dehydrogenase, E1 component B9SR46 AT3G55410.1 P

Jcr4S01522.20 Acetolactate synthase protein B9SV00 AT2G31810.1 P

Jcr4S01952.20 isocitrate dehydrogenase B9SR98 AT1G65930.1 P

Jcr4S01954.30 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of PDH B9ST02 AT3G25860.1 P

Jcr4S02278.30 dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of PDH B9SLH2 AT1G34430.1 P

Jcr4S04049.10 serine hydroxymethyltransferase 2 B9SMX7 AT5G26780.2 P

Jcr4S04459.20 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase B9RX74 AT2G14170.1 P

Jcr4S04485.30 2-oxoglutarate dehydrogenase e2 subunit B9SVA1 AT4G26910.1 P

Jcr4S05073.10 glycine hydroxymethyltransferase B9SMK7 AT4G37930.1 P

Jcr4S05113.10 lysosomal beta glucosidase-like B9SD66 AT5G20950.2 P

Jcr4S05758.10 nadp-specific isocitrate B9SMI9 AT1G54340.1 P

Jcr4S05886.10 isocitrate dehydrogenase-like protein B9SFA3 AT5G14590.1 P

82

Jcr4S06189.10 2-isopropylmalate synthase B9SX30 AT1G74040.1 P

Jcr4S06785.30 6-phosphogluconate dehydrogenase, putative B9SXT4 AT3G02360.1 P

Jcr4S09697.10 aconitate hydratase 1 B9SXB6 AT4G35830.1 P

Jcr4S10276.10 isocitrate dehydrogenase B9S0K1 AT5G03290.1 P

Jcr4S12978.30 glucose-6-phosphate dehydrogenase B9T826 AT5G35790.1 P

Jcr4S15391.10 dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of PDH B9SLH2 AT1G34430.1 P

Jcr4S19661.10 Catalase Q01297 AT4G35090.1 P

Jcr4S00005.300 threonine synthase, putative B9RK44 AT4G29840.1 P

Jcr4S00007.430 prolyl 4-hydroxylase alpha subunit, putative B9RSW4 AT5G18900.1 P

Jcr4S00031.150 glutamate dehydrogenase, putative B9SHF8 AT5G18170.1 P

Jcr4S00037.70 aspartate aminotransferase, putative B9RNY6 AT4G31990.2 P

Jcr4S00043.20 thiosulfate sulfertansferase, putative B9RHZ9 AT1G79230.1 P

Jcr4S00057.100 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, putative B9RDA3 AT2G45300.1 P

Jcr4S00063.210 aminomethyltransferase, putative B9RXI7 AT1G11860.3 P

Jcr4S00074.70 trytophan synthase alpha subunit, putative B9S4R8 AT3G54640.1 P

Jcr4S00083.90 aminomethyltransferase, putative B9RBS7 AT4G12130.1 P

Jcr4S00106.40 pentatricopeptide repeat-containing protein, putative B9RSY7 AT3G06350.1 P

Jcr4S00131.20 alanine aminotransferase, putative B9SPJ9 AT1G72330.1 P

Jcr4S00193.50 glutamate synthase, putative B9RII5 AT5G53460.3 P

Jcr4S00194.20 dihydrodipicolinate synthase B9S6U4 AT2G45440.1 P

Jcr4S00216.100 Anthranilate synthase component II, putative B9SNH9 AT1G25220.1 P

Jcr4S00219.80 anthranilate phosphoribosyltransferase, putative B9SPJ6 AT1G70570.1 P

Jcr4S00238.90 cysteine synthase, putative B9RDU1 AT3G61440.1 P

Jcr4S00241.120 glutamate dehydrogenase, putative B9RA12 AT5G07440.2 P

Jcr4S00256.20 3-isopropylmalate dehydratase, putative B9SQS5 AT4G13430.1 P

Jcr4S00269.70 glutamate dehydrogenase, putative B9RA12 AT5G07440.2 P

Jcr4S00284.60 argininosuccinate lyase, putative B9RJX6 AT5G10920.1 P

Jcr4S00287.130 IAA-amino acid hydrolase ILR1 precursor, putative B9RQ74 AT1G51760.1 P

83

Jcr4S00298.40 N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase, putative B9S765 AT2G19940.2 P

Jcr4S00300.150 threonine dehydratase/deaminase, putative B9SRK6 AT3G10050.1 P

Jcr4S00306.20 threonine synthase, putative B9S5U4 AT4G29840.1 P

Jcr4S00502.90 Aminotransferase ybdL, putative B9RJ63 AT1G77670.1 P

Jcr4S00506.30 carbamoyl-phosphate synthase small chain B9SLD2 AT3G27740.1 P

Jcr4S00543.40 aspartate kinase, putative B9RGY9 AT5G14060.2 P

Jcr4S00607.40 chorismate synthase B9SUA2 AT1G48850.1 P

Jcr4S00611.150 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase B9SI90 AT5G17920.2 P

Jcr4S00683.20 beta-alanine-pyruvate aminotransferase B9SZ94 AT2G38400.1 P

Jcr4S00703.30 cysteine synthase, putative B9SFU8 AT2G43750.2 P

Jcr4S00771.10 Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase 1, chloroplast, putative B9T0A7 AT4G39980.1 P

Jcr4S00781.30 3-isopropylmalate dehydratase, putative B9SXE3 AT2G43090.1 P

Jcr4S00791.20 branched-chain-amino-acid aminotransferase 3 B9SX80 AT3G49680.1 P

Jcr4S00846.60 adenylosuccinate synthetase, putative B9SL58 AT3G57610.1 P

Jcr4S00862.40 D-alanine aminotransferase, putative B9RS41 AT5G57850.1 P

Jcr4S00995.30 ornithine carbamoyltransferase, putative B9R7X3 AT1G75330.1 P

Jcr4S01018.30 dihydroxy-acid dehydratase, putative B9RWL5 AT3G23940.1 P

Jcr4S01114.20 ketol-acid reductoisomerase, chloroplast precursor, putative B9SGJ6 AT3G58610.3 P

Jcr4S01179.70 Transaminase mtnE, putative B9S7T6 AT4G33680.1 P

Jcr4S01230.30 3-dehydroquinate synthase, putative B9SUG6 AT5G66120.2 P

Jcr4S01379.50 2-oxoisovalerate dehydrogenase, putative B9S2P3 AT1G21400.1 P

Jcr4S01391.20 peroxiredoxins, prx-1, prx-2, prx-3, putative B9SVY3 AT5G06290.1 P

Jcr4S01452.20 tryptophan synthase beta chain, putative B9RXQ0 AT4G27070.1 P

Jcr4S01456.10 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, putative B9RYA3 AT4G34200.1 P

Jcr4S01495.10 ketol-acid reductoisomerase B9S999 AT3G58610.3 P

Jcr4S01526.10 arginine biosynthesis protein argJ 1, putative B9SZB6 AT2G37500.1 P

Jcr4S01536.60 anthranilate phosphoribosyltransferase, putative B9RB03 AT5G17990.1 P

Jcr4S01654.20 hypothetical protein B9RGV5 AT1G31860.1 P

84

Jcr4S01729.30 aspartate aminotransferase B9SSK3 AT2G22250.1 P

Jcr4S01733.40 cystathionine gamma-synthase, putative B9SVH8 AT3G01120.1 P

Jcr4S01934.20 dna repair endonuclease uvh1 B9SZ05 AT5G41150.1 P

Jcr4S02009.80 glutathione reductase, putative B9S4S9 AT3G54660.1 P

Jcr4S02094.30 peroxiredoxin-like protein B9SRG0 AT3G52960.1 P

Jcr4S02113.30 diaminopimelate epimerase B9T434 AT3G53580.1 P

Jcr4S02115.60 glycine dehydrogenase, putative B9RRS7 AT4G33010.1 P

Jcr4S02120.40 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase B9RQ33 AT5G17920.2 P

Jcr4S02230.40 ATP binding protein, putative B9SK20 AT1G29900.1 P

Jcr4S02755.10 aspartate aminotransferase B9SW33 AT2G30970.2 P

Jcr4S02899.20 Pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump B9RVB3 AT1G15690.1 P

Jcr4S02937.30 diaminopimelate decarboxylase B9RH82 AT5G11880.1 P

Jcr4S03019.60 3-isopropylmalate dehydrogenase, putative B9SWT3 AT1G80560.1 P

Jcr4S03046.70 D-alanine-D-alanine ligase B9T6C3 AT3G08840.2 P

Jcr4S03107.10 Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase 1 B9RJN2 AT1G22410.1 P

Jcr4S03391.70 aspartate semialdehyde dehydrogenase, putative B9T4M3 AT1G14810.1 P

Jcr4S03552.30 iaa-amino acid hydrolase ilr1 B9SWZ5 AT3G02875.1 P

Jcr4S03559.30 amidase family protein B9SWW4 AT3G17970.1 P

Jcr4S03703.10 gamma-aminobutyrate transaminase-like protein B9S4Y5 AT3G22200.1 P

Jcr4S03737.40 alanine-glyoxylate aminotransferase-like protein B9T1D1 AT4G39660.1 P

Jcr4S03782.20 aspartate-semialdehyde dehydrogenase-like B9T4M3 AT1G14810.1 P

Jcr4S03885.40 anthranilate synthase component I, putative B9SI04 AT2G29690.1 P

Jcr4S03927.10 chorismate synthase B9SUA2 AT1G48850.2 P

Jcr4S03927.30 para-aminobenzoate synthase, putative B9SUA1 AT2G28880.1 P

Jcr4S03959.50 ATP phosphoribosyltransferase, putative B9TB20 AT1G09795.1 P

Jcr4S04505.10 cystathionine beta-lyase B9RGV9 AT3G57050.1 P

Jcr4S04674.40 Acetylornithine aminotransferase, mitochondrial B9RI18 AT1G80600.1 P

Jcr4S04925.20 d-3-phosphoglycerate dehydrogenase, putative B9R765 AT4G34200.1 P

85

Jcr4S05012.40 indole-3-glycerol phosphate synthase B9T1U0 AT5G48220.1 P

Jcr4S05017.10 amidophosphoribosyltransferase B9RG60 AT4G34740.1 P

Jcr4S05121.10 aspartokinase-homoserine dehydrogenase B9SHP2 AT4G19710.2 P

Jcr4S05146.20 2-oxoisovalerate dehydrogenase e1 alpha subunit B9RRD6 AT5G09300.2 P

Jcr4S05276.10 aspartate-semialdehyde dehydrogenase-like B9T4M3 AT1G14810.1 P

Jcr4S05297.40 histidinol dehydrogenase, putative B9SBW3 AT5G63890.1 P

Jcr4S05382.10 2-cys peroxiredoxin-like protein B9SVY3 AT5G06290.1 P

Jcr4S05576.10 argininosuccinate synthase B9S599 AT4G24830.1 P

Jcr4S05906.20 branched-chain-amino-acid aminotransferase 3 B9SX80 AT5G65780.1 P

Jcr4S06087.10 aspartate aminotransferase B9SW33 AT2G30970.2 P

Jcr4S06246.20 phosphoserine aminotransferase B9S6T4 AT4G35630.1 P

Jcr4S06393.70 betaine-aldehyde dehydrogenase, putative B9R8Y8 AT1G74920.2 P

Jcr4S06751.50 tryptophan synthase beta chain B9SZR3 AT5G38530.1 P

Jcr4S07331.30 Glutamate-cysteine ligase, chloroplast precursor, putative B9RCB6 AT4G23100.3 P

Jcr4S07458.10 ll-diaminopimelate aminotransferase B9S7T6 AT4G33680.1 P

Jcr4S07645.20 dihydropyrimidine dehydrogenase B9T6I2 AT3G17810.1 P

Jcr4S08020.20 lipoamide acyltransferase component B9RT82 AT3G06850.2 P

Jcr4S08055.20 IAA-amino acid hydrolase ILR1 precursor, putative B9RQ74 AT1G51760.1 P

Jcr4S08461.30 dihydrodipicolinate reductase family protein B9T529 AT3G59890.2 P

Jcr4S09294.30 glycine dehydrogenase B9RRS7 AT4G33010.2 P

Jcr4S10779.30 glycine decarboxylase complex h-protein B9SQ93 AT2G35120.1 P

Jcr4S11667.10 Peroxiredoxin, putative B9RTW9 AT3G06050.1 P

Jcr4S12146.20 ll-diaminopimelate aminotransferase B9S7T6 AT4G33680.1 P

Jcr4S12247.10 bifunctional aspartokinase homoserine dehydrogenase 1 B9SHP2 AT4G19710.1 P

Jcr4S15232.20 acetylglutamate kinase B9RYI2 AT3G57560.1 P

Jcr4S21265.10 elongation factor 1-alpha, putative B9TJS6 AT1G07930.2 P

Jcr4S21636.10 bifunctional aspartokinase homoserine dehydrogenase 1 B9SHP2 AT1G31230.1 P

Jcr4S23772.10 2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase B9T0A7 AT1G22410.1 P

86

Jcr4S26811.10 atp phosphoribosyltransferase - AT1G09795.1 P

Jcr4S26942.10 dihydroxy-acid dehydratase B9RWL5 AT3G23940.1 P

Jcr4U29446.10 homoserine kinase B9RVC9 AT2G17265.1 P

Jcr4U29642.10 aminomethyltransferase, putative B9RC39 AT4G12130.1 P

Jcr4U29906.10 diaminopimelate decarboxylase B9RH82 AT5G11880.1 P

Jcr4U30964.10 aspartate aminotransferase B9RNY6 AT4G31990.4 P

Jcr4U30996.10 branched-chain-amino-acid aminotransferase 3 B9SX80 AT5G65780.1 P

Jcr4U36405.10 Ketol-acid reductoisomerase, chloroplast, putative B9S999 AT3G58610.3 P

87

5.7.3 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos carboidratos

Várias vias metabólicas e transportadores que permitem que os plastídeos

heterotróficos sejam supridos de poder redutor e de fontes de carbono a serem utilizados

nas vias biossintéticas que ocorrem nos plastídeos foram identificadas durante as análises

dos dados proteômicos do endosperma em desenvolvimento de J.curcas (Figura 14, Tabela

suplementar 4 e Tabela 4). Proteínas relacionadas ao metabolismo de carboidrados

compuseram a segunda maior classe funcional do presente estudo. Os dados mostraram

que em sementes em desenvolvimento do pinhão manso a disponibilidade de compostos de

carbono e poder redutor para serem utilizados para síntese de ácidos graxos nos plastídeos

é garantida pela atuação da via glicolítica e da via oxidativa das petonse fosfato (OPP). A

maioria das enzimas envolvidas na OPP foi identificada, incluindo a glicose-6-fosfato

dehidrogenase, fosfogluconato dehydrogenase e 6-fosfogluconolactonase. Com exceção da

fosfogliceromutase, todas as enzimas da via glicolítica foram identificadas, essa informação

mostra uma possibilidade de funcionamento da via glicolítica nos plastídeos do pinhão

manso e indica que, pelo menos, os plastídeos dos tecidos que armazenam lipídios têm a

capacidade de formar fosfoenolpiruvato através de uma via glicolítica completa (FL GGE et

al., 2011). Essas informações validam resultados obtidos em estudos transcriptômicos em

sementes em desenvolvimento (JIANG et al., 2012), e dá suporte à ideia de que essa via

esta em pleno funcionamento nos plastídeos.

Como mencionado anteriormente, o transportador de fosfato/fosfoenolpiruvato

identificado nos plastídeos do endosperma em desenvolvimento de J.curcas suprirá os

plastídeos com fosfoenolpiruvato adicional.

O piruvato produzido na etapa final da glicolise é o precursor do acetil-CoA, o

substrato para a síntese de novo dos ácidos graxos. Em óleo de palma, foi observado que

um elevado acúmulo do óleo está correlacionado com o aumento da regulação da glicólise

(BOURGIS et al., 2011). Os autores mostraram que o conteúdo de triacilglicerol era muito

baixo nos estágios iniciais do amadurecimento do fruto quando comparado com o conteúdo

de açúcar, o qual decresceu somente nos estágios finais do amadurecimento, e isso dá

suporte à proposta de que os intermediários resultantes da degradação de açúcares através

da via glicolítica durante o amadurecimento de frutos são importantes para aumentar a taxa

de síntese dos ácidos graxos.

Devido ao fato de que os acetil-CoA não podem atravessar as membranas, sua

síntese no plastídeos ocorre principalmente por meio do complexo da piruvato

desidrogenase (PDHC) (OLIVER et al., 2009). Esse complexo é composto por três enzimas,

a piruvato desidrogenase (E1), dihidrolipoilisina acetiltransferase (E2) e dihidrolipoil

desidrogenase (E3), todas elas foram identificadas nos plastídeos do endosperma em

desenvolvimento do pinhão manso.

88

Além destas enzimas, também foi identificada a acetil-CoA-sintetase, que pode

proporcionar uma via alternativa para a síntese de acetil-CoA em plastídeos usando acetato

como substrato. Embora o papel central do PDHC no fornecimento de acetil-CoA para a

síntese de ácidos graxos em plastídeos seja amplamente reconhecida (TRONCOSO-

PONCE et al., 2011), alguns sugerem que as sintetases-CoA não têm função óbvia.

89

Tabela 4 - Proteínas relacionadas com o metabolismo dos carboidratos, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

ProteinID Protein description Best Ricinus

communisHit Best Arabidopsis thaliana

Hit Final locaization

gi|225544132 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain G1D766 ATCG00490.1 P

gi|225544133 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S00001.200 pyruvate kinase, putative B9RIP4 AT5G52920.1 P

Jcr4S00014.100 dihydrolipoamide dehydrogenase, putative B9RZW7 AT1G48030.2 P

Jcr4S00021.320 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RKN5 AT4G29010.1 P

Jcr4S00035.80 delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase 1 protein B9R960 AT5G62530.1 P

Jcr4S00043.140 phosphoglycerate kinase, putative B9RHY4 AT3G12780.1 P

Jcr4S00043.160 phosphoglycerate kinase, putative B9RHY3 AT1G79550.2 P

Jcr4S00049.40 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, putative B9RHV9 AT1G16300.1 P

Jcr4S00056.120 malate dehydrogenase, putative B9S7S1 AT2G22780.1 P

Jcr4S00056.90 6-phosphogluconate dehydrogenase, putative B9SXT4 AT3G02360.1 P

Jcr4S00057.90 transketolase, putative B9RDA1 AT2G45290.1 P

Jcr4S00085.60 6-phosphogluconate dehydrogenase, putative B9RVA7 AT5G41670.2 P

Jcr4S00100.140 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, putative B9RAL0 AT3G04120.1 P

Jcr4S00112.160 dihydrolipoamide dehydrogenase, putative B9RZN2 AT3G16950.1 P

Jcr4S00115.180 aldehyde dehydrogenase, putative B9RZQ0 AT3G66658.2 P

Jcr4S00118.80 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, putative B9RMA8 AT5G13110.1 P

Jcr4S00125.80 Succinyl-CoA ligase [GDP-forming] subunit alpha-2 B9RL91 AT5G23250.1 P

Jcr4S00137.20 Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1 precursor B9S459 AT1G09870.1 P

Jcr4S00167.190 serine hydroxymethyltransferase, putative B9SMX7 AT4G37930.1 P

Jcr4S00168.90 pyruvate dehydrogenase, putative B9RFW4 AT5G50850.1 P

Jcr4S00171.20 enolase, putative B9R9N6 AT2G36530.1 P

Jcr4S00192.30 2-oxoisovalerate dehydrogenase, putative B9SBN1 AT1G55510.1 P

90

Jcr4S00202.110 dtdp-glucose 4-6-dehydratase, putative B9SAR7 AT3G62830.2 P

Jcr4S00205.140 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, putative B9RAL0 AT1G13440.1 P

Jcr4S00215.140 citrate synthase, putative B9REL6 AT2G44350.1 P

Jcr4S00219.60 alanine aminotransferase, putative B9SPJ9 AT1G70580.4 P

Jcr4S00225.120 pyruvate dehydrogenase, putative B9S0Z5 AT2G34590.1 P

Jcr4S00273.150 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, putative B9RAL0 AT3G04120.1 P

Jcr4S00306.100 dihydrolipoamide acetyltransferase component of PDH B9S5V2 AT1G54220.2 P

Jcr4S00312.60 pyruvate dehydrogenase, putative B9RNK3 AT1G01090.1 P

Jcr4S00335.30 UDP-sulfoquinovose synthase, putative B9RRR0 AT4G33030.1 P

Jcr4S00376.60 ribose-5-phosphate isomerase, putative B9REQ4 AT3G04790.1 P

Jcr4S00416.90 α-carboxyl-tansferase (α-CT) subunit of Het-ACCase B9SPE5 AT2G38040.2 P

Jcr4S00529.80 alcohol dehydrogenase, putative B9T7D8 AT1G77120.1 P

Jcr4S00535.90 monodehydroascorbate reductase, putative B9RCH2 AT1G63940.4 P

Jcr4S00558.90 Delta3,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase B9RM93 AT5G43280.1 P

Jcr4S00559.30 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain G1D766 ATCG00490.1 P

Jcr4S00559.40 hexokinase, putative B9RKH7 AT4G29130.1 P

Jcr4S00575.60 pyruvate dehydrogenase, putative B9S2H9 AT1G59900.1 P

Jcr4S00583.140 coated vesicle membrane protein, putative B9S9V9 AT3G07680.1 P

Jcr4S00593.140 acetolactate synthase, putative B9RAF1 AT3G48560.1 P

Jcr4S00616.80 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RT76 AT3G06860.1 P

Jcr4S00679.30 hexokinase, putative B9R883 AT1G47840.1 P

Jcr4S00702.40 6-phosphofructokinase chloroplastic-like B9SXI3 AT2G22480.1 P

Jcr4S00736.30 aconitase, putative B9T2U5 AT2G05710.1 P

Jcr4S00742.70 acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial, putative B9SA57 AT5G48230.2 P

Jcr4S00779.10 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase, putative B9RFK4 AT1G56500.1 P

Jcr4S00816.10 glycogen phosphorylase, putative B9SJB6 AT3G29320.1 P

Jcr4S00816.20 glycogen phosphorylase, putative B9SJB6 AT3G29320.1 P

Jcr4S00867.30 hexokinase, putative B9RQD9 AT2G19860.2 P

91

Jcr4S00867.40 hexokinase, putative B9RKH7 AT4G29130.1 P

Jcr4S00903.50 transaldolase-like protein B9T2V8 AT1G12230.1 P

Jcr4S01020.50 Transaldolase, putative B9RG09 AT5G13420.1 P

Jcr4S01023.80 catalase, putative B9S6U0 AT4G35090.1 P

Jcr4S01070.130 Malate dehydrogenase, putative B9T172 AT2G22780.1 P

Jcr4S01086.110 isopropylmalate synthase, putative B9SX30 AT1G74040.1 P

Jcr4S01089.60 isocitrate dehydrogenase B9S0K1 AT5G03290.1 P

Jcr4S01159.40 catalase, putative Q01297 AT4G35090.1 P

Jcr4S01232.50 Biotin carboxyl carrier protein subunit of of Het-ACCase B9RM56 AT5G16390.1 P

Jcr4S01237.40 Rhythmically expressedprotein 2 protein, putative B9SQ78 AT5G44730.1 P

Jcr4S01247.10 alpha- glucan phosphorylase l chloroplastic amyloplastic B9RCW0 AT3G29320.1 P

Jcr4S01279.50 glucose-1-phosphate adenylyltransferase, putative B9RH66 AT4G39210.1 P

Jcr4S01405.50 succinate semialdehyde dehydrogenase B9SUZ1 AT1G79440.1 P

Jcr4S01488.20 2-oxoglutarate dehydrogenase, E1 component B9SR46 AT3G55410.1 P

Jcr4S01507.10 monocopper oxidase-like protein sku5 B9T2V6 AT4G12420.2 Jcr4S01507.30 Transaldolase B9T2V8 AT1G12230.1 P

Jcr4S01522.20 Acetolactate synthase protein B9SV00 AT2G31810.1 P

Jcr4S01606.10 malate dehydrogenase, putative B9T172 AT2G22780.1 P

Jcr4S01649.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9T4Y7 AT3G51050.1 P

Jcr4S01662.90 NADH-cytochrome B5 reductase, putative B9SEP3 AT5G20080.1 P

Jcr4S01786.40 fructose-bisphosphate aldolase B9SJY9 AT2G01140.1 P

Jcr4S01799.10 enolase, putative B9R9N6 AT2G36530.1 P

Jcr4S01869.40 polygalacturonase, putative B9RIT4 AT3G48950.1 Jcr4S01892.10 enolase, putative B9RE72 AT1G74030.1 P

Jcr4S01924.30 pyruvate kinase, putative B9SRM0 AT2G36580.1 P

Jcr4S01926.10 ferredoxin-dependent glutamate synthase B9SLP5 AT5G04140.2 P

Jcr4S01936.100 aldehyde dehydrogenase - - P

Jcr4S01952.20 isocitrate dehydrogenase B9SR98 AT1G65930.1 P

92

Jcr4S01954.30 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of PDH B9ST02 AT3G25860.1 P

Jcr4S01955.80 neutral alpha-glucosidase ab precursor, putative B9STU2 AT5G63840.1 P

Jcr4S01990.50 Glucose-1-phosphate adenylyltransferase B9SF14 AT5G48300.1 P

Jcr4S02122.20 ribokinase, putative B9SU49 AT1G17160.1 P

Jcr4S02212.70 phosphoglucomutase, putative B9T3D2 AT5G17530.2 P

Jcr4S02278.30 dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of PDH B9SLH2 AT1G34430.1 P

Jcr4S02325.10 Glucan endo-1,3-beta-glucosidase precursor, putative B9SP53 AT2G01630.1 P

Jcr4S02463.10 malate dehydrogenase, putative B9RLY1 AT3G47520.1 P

Jcr4S02497.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S02762.40 pyruvate kinase, putative B9SRM0 AT3G52990.1 P

Jcr4S02839.20 triosephosphate isomerase, putative B9STC9 AT2G21170.1 P

Jcr4S02947.70 sucrose synthase, putative B9RT94 AT5G49190.1 P

Jcr4S02965.20 alcohol dehydrogenase, putative B9SJJ8 AT1G77120.1 P

Jcr4S03116.20 pyruvate kinase, putative B9RGK5 AT5G08570.1 P

Jcr4S03123.10 like zinc-binding alcohol dehydrogenase family protein B9RHN6 AT5G63620.1 P

Jcr4S03281.10 nadp-dependent malic enzyme B9RQE8 AT1G79750.1 P

Jcr4S03284.30 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acid aldolase, putative B9T7S7 AT4G10750.1 P

Jcr4S03295.10 mitochondrial malate dehydrogenase B9SE47 AT1G53240.1 P

Jcr4S03449.40 biotin carboxylase precursor B9S1E2 AT5G35360.1 P

Jcr4S03546.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S03705.10 starch branching enzyme ii B9T792 AT5G03650.1 P

Jcr4S04015.10 carboxyvinyl-carboxyphosphonate phosphorylmutase B9T359 AT1G21440.1 P

Jcr4S04049.10 serine hydroxymethyltransferase 2 B9SMX7 AT5G26780.2 P

Jcr4S04160.60 pyruvate kinase, putative B9S7Y5 AT3G22960.1 P

Jcr4S04459.20 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase B9RX74 AT2G14170.1 P

Jcr4S04485.30 2-oxoglutarate dehydrogenase e2 subunit B9SVA1 AT4G26910.1 P

Jcr4S04708.30 Ribulose bisphosphate carboxylase small chain B9T055 AT5G38410.1 P

Jcr4S04843.20 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme a hydrolase-like B9RPB0 AT4G13360.1 P

93

Jcr4S04843.30 3-hydroxyisobutyryl- hydrolase-like protein 4 B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S05073.10 glycine hydroxymethyltransferase B9SMK7 AT4G37930.1 P

Jcr4S05113.10 lysosomal beta glucosidase-like B9SD66 AT5G20950.2 P

Jcr4S05336.10 malate dehydrogenase, putative B9RLY1 AT3G47520.1 P

Jcr4S05468.40 malate dehydrogenase, putative B9RLY1 AT3G47520.1 P

Jcr4S05758.10 nadp-specific isocitrate B9SMI9 AT1G54340.1 P

Jcr4S05886.10 isocitrate dehydrogenase-like protein B9SFA3 AT5G14590.1 P

Jcr4S06157.30 plastidic aldolase B9RHD4 AT4G38970.1 P

Jcr4S06189.10 2-isopropylmalate synthase B9SX30 AT1G74040.1 P

Jcr4S06387.30 Succinyl-CoA ligase [GDP-forming] subunit alpha-2 B9RL91 AT5G23250.1 P

Jcr4S06733.10 citrate synthase B9T369 AT3G58750.1 P

Jcr4S06785.30 6-phosphogluconate dehydrogenase, putative B9SXT4 AT3G02360.1 P

Jcr4S06787.10 Aconitase, putative B9SDW5 AT4G35830.1 P

Jcr4S06916.10 Ribokinase B9SU49 AT1G17160.1 P

Jcr4S07026.30 fumarate hydratase B9SAW4 AT2G47510.2 P

Jcr4S07085.10 pyruvate kinase, putative B9S7Y4 AT3G22960.1 P

Jcr4S07306.10 fructose-bisphosphate aldolase B9SRH4 AT2G36460.1 P

Jcr4S07356.10 succinate dehydrogenase B9SWW3 AT5G66760.1 P

Jcr4S07424.30 Fructokinase B9RDH7 AT1G66430.1 P

Jcr4S07494.70 pyruvate kinase, putative B9RTH5 AT3G22960.1 P

Jcr4S08423.20 aldehyde dehydrogenase family 2 member B9RB49 AT1G23800.1 P

Jcr4S08446.20 formate dehydrogenase B9RUT7 AT5G14780.1 P

Jcr4S08822.30 acetyl-CoA synthetase, putative B9RGS6 AT5G36880.2 P

Jcr4S08992.20 myo inositol monophosphatase, putative B9SDQ6 AT1G31190.1 P

Jcr4S09082.10 succinate dehydrogenase B9SWW3 AT5G66760.1 P

Jcr4S09225.20 glucose-6-phosphate isomerase B9RJU9 AT4G24620.1 P

Jcr4S09385.10 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain G1D766 ATCG00490.1 P

Jcr4S09385.30 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

94

Jcr4S09697.10 aconitate hydratase 1 B9SXB6 AT4G35830.1 P

Jcr4S10100.10 pyruvate kinase P55964 AT1G32440.1 P

Jcr4S10276.10 isocitrate dehydrogenase B9S0K1 AT5G03290.1 P

Jcr4S11428.10 glycogen phosphorylase, putative B9SJB6 AT3G29320.1 P

Jcr4S11660.10 betaine aldehyde dehydrogenase B9R8Y8 AT1G74920.1 P

Jcr4S11801.30 succinate dehydrogenase B9SLS5 AT5G40650.1 P

Jcr4S12978.30 glucose-6-phosphate dehydrogenase B9T826 AT5G35790.1 P

Jcr4S14120.10 fructose-bisphosphate aldolase B9SRH4 AT2G36460.1 P

Jcr4S15391.10 dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of PDH B9SLH2 AT1G34430.1 P

Jcr4S15868.10 aconitate hydratase B9T2U5 AT4G35830.2 P

Jcr4S15954.10 phosphoglucosamine mutase family protein B9T3D2 AT5G17530.3 P

Jcr4S16256.20 enolase chloroplastic-like B9RE72 AT1G74030.1 P

Jcr4S16847.20 6-phosphogluconolactonase B9RWU5 AT5G24400.1 P

Jcr4S18322.10 pyruvate kinase isozyme chloroplastic-like B9S1I3 AT1G32440.1 P

Jcr4S19239.10 triosephosphate isomerase B9T4H8 AT3G55440.1 P

Jcr4S19646.10 succinate dehydrogenase B9SLS5 AT5G40650.1 P

Jcr4S19661.10 Catalase Q01297 AT4G35090.1 P

Jcr4S19720.20 isocitrate dehydrogenase B9SRZ2 AT4G35260.1 P

Jcr4S21143.10 transaldolase-like protein B9T2V8 AT1G12230.1 P

Jcr4S21649.10 malate dehydrogenase, putative B9T172 AT2G22780.1 P

Jcr4S25260.10 biotin carboxylase B9S1E2 AT5G35360.2 P

Jcr4S26055.10 phosphoglucosamine mutase family protein B9T3D2 AT5G17530.2 P

Jcr4S26116.20 haloacid dehalogenase-like hydrolase domain B9RFK4 AT1G56500.1 P

Jcr4S26159.10 monodehydroascorbate reductase B9RCH2 AT1G63940.3 P

Jcr4S26247.20 Phosphoglucomutase B9R9J6 AT5G51820.1 P

Jcr4S26962.10 aldehyde dehydrogenase family 3 member h1 B9S2Y3 AT1G44170.2 P

Jcr4S27076.10 Glucan endo-1,3-beta-glucosidase precursor, putative B9SP53 AT2G01630.1 P

Jcr4S27524.10 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase c subunit B9RBN8 AT3G04120.1 P

95

Jcr4U29393.10 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B9RAL0 AT1G13440.1 P

Jcr4U29862.20 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4U29928.10 myo inositol monophosphatase, putative B9SDQ6 AT1G31190.1 P

Jcr4U31193.10 nad-malate dehydrogenase B9RLY1 AT3G47520.1 P

Jcr4U31237.20 acetyl-coenzyme a carboxylase carboxyl transferase subunit alpha - - P

Jcr4U32160.10 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4U32796.10 dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component 3 ofPDH B9S5V2 AT1G54220.2 P

Jcr4U38770.10 myo inositol monophosphatase, putative B9SDQ6 AT1G31190.1 P

96

5.7.4 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos lipídios

Enzimas de diferentes vias para a síntese de diversas classes de lipídios foram

identificadas. Dentre elas, todas as enzimas envolvidas na biossíntese dos ácidos graxos

incluindo a oleoil-[proteína carreadora de acil]-hidrolase (FatA) que atua sobre os tioésteres

da proteína carreadora de acil dos ácidos graxos com C12 a C18 (Figura 14, Tabela

suplementar 4 e Tabela 5). A única desaturase identificada foi a estearoil ACP desaturase

(SAD), uma enzima plastidial solúvel que catalisa a primeira etapa de desaturação na

biossíntese dos ácidos graxos, convertedo o estearoil-ACP em oleoil-ACP. Estudos

transcriptômicos, (COSTA et al., 2010; JIANG et al., 2012), mostraram a expressão de

diversos genes da desaturase, incluindo transcritos da oleato desaturase (FAD2) e linoleato

desaturase (FAD3), mas esses são codificados para a expressão de isoformas depositadas

em outros compartimentos celulares, não plastidial, e dessa forma não puderam ser

detectados no presente estudo.

Alguns ácidos graxos podem desempenhar funções em vias de transdução do sinal.

Por exemplo, os jasmonatos atuam tanto como reguladores de crescimento quanto como

mensageiros secundários. A aleno óxido ciclase, uma enzima que utiliza ácidos graxos

como substrato é importante para a síntese de jasmonatos. Já fosfolipase D é uma enzima

que atua na via de transdução do sinal. Ambas as enzimas foram identificadas no presente

trabalho.

A enzima aleno ciclase oxidase faz parte do processo de conversão do acido

linolênico a ácido jasmônico. O ácido linolênico é um dos principais ácidos graxos presentes

no óleo do pinhão manso. A presença dessa enzima sugere que em condições de estresse

abiótico ela seja ativa para síntese e liberação de substâncias relacionadas com o

mecanismo de defesa da planta, como é caso do ácdo jasmônico (Figura 15). Este último

hidrolisa a fosfatidilcolina para liberar ácido fosfatídico que pode induzir várias mudanças de

sinalização envolvendo Ca2+ e outros alvos, tais como proteínas quinases e actina.

97

Tabela 5 - Proteínas relacionadas com o metabolismo dos lipídios, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

ProteinID Protein description Best Ricinus

communis Hit Best Arabidopsis

thaliana Hit Final locaization

gi|225544133|ref|YP_002720121.1| acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S00021.320 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RKN5 AT4G29010.1 P

Jcr4S00035.80 delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase 1 protein B9R960 AT5G62530.1 P

Jcr4S00115.180 aldehyde dehydrogenase, putative B9RZQ0 AT3G66658.2 P

Jcr4S00219.60 alanine aminotransferase, putative B9SPJ9 AT1G70580.4 P

Jcr4S00335.30 UDP-sulfoquinovose synthase, putative B9RRR0 AT4G33030.1 P

Jcr4S00416.90 α-carboxyl-tansferase (α-CT) subunit of Het-ACCase B9SPE5 AT2G38040.2 P

Jcr4S00529.80 alcohol dehydrogenase, putative B9T7D8 AT1G77120.1 P

Jcr4S00558.90 Delta3,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase B9RM93 AT5G43280.1 P

Jcr4S00616.80 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RT76 AT3G06860.1 P

Jcr4S00742.70 acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial, putative B9SA57 AT5G48230.2 P

Jcr4S01232.50 Biotin carboxyl carrier protein subunit of of Het-ACCase B9RM56 AT5G16390.1 P

Jcr4S01649.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9T4Y7 AT3G51050.1 P

Jcr4S01936.100 aldehyde dehydrogenase - - P

Jcr4S02497.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S02965.20 alcohol dehydrogenase, putative B9SJJ8 AT1G77120.1 P

Jcr4S03123.10 like zinc-binding alcohol dehydrogenase family protein B9RHN6 AT5G63620.1 P

Jcr4S03449.40 biotin carboxylase precursor B9S1E2 AT5G35360.1 P

Jcr4S03546.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S04843.20 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme a hydrolase-like B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S04843.30 3-hydroxyisobutyryl- hydrolase-like protein 4 B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S08423.20 aldehyde dehydrogenase family 2 member mitochondrial-like B9RB49 AT1G23800.1 P

98

Jcr4S09385.30 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S11660.10 betaine aldehyde dehydrogenase B9R8Y8 AT1G74920.1 P

Jcr4S25260.10 biotin carboxylase B9S1E2 AT5G35360.2 P

Jcr4S26962.10 aldehyde dehydrogenase family 3 member h1 B9S2Y3 AT1G44170.2 P

Jcr4U29862.20 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4U31237.20 acetyl-coenzyme a carboxylase carboxyl transferase subunit alpha - - P

Jcr4U32160.10 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S00004.100 s-adenosyl-l-methionine:delta24-sterol-C- methyltransferase B9R8F7 AT1G20330.1 P

Jcr4S00086.110 phopholipase D alpha, putative B9RV56 AT1G52570.1 P

Jcr4S00266.140 Allene oxide cyclase 4, chloroplast precursor, putative B9SWL5 AT1G13280.1 P

Jcr4S00273.200 Ketoacyl-ACP Reductase (KAR) B9RMM7 AT1G24360.1 P

Jcr4S00378.100 glycerol-3-phosphate dehydrogenase, putative B9SUD3 AT3G10370.1 P

Jcr4S00539.70 Oleoyl-acyl carrier protein thioesterase, putative A9XK92 AT3G25110.1 P

Jcr4S00601.10 Ethanolamine-phosphate cytidylyltransferase, putative B9S1W1 AT2G38670.1 P

Jcr4S00783.20 acyl-CoA oxidase, putative B9SH72 AT4G16760.1 Jcr4S00818.130 Acyl-CoA synthetase B9RF63 AT5G27600.1 P

Jcr4S00903.20 beta-ketoacyl-acp synthase III A6N6J4 AT1G62640.2 P

Jcr4S01018.60 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9RWL7 AT2G33150.1 P

Jcr4S01081.40 glycerophosphodiesterase-like protein B9SSQ8 AT5G55480.1 P

Jcr4S01110.50 long-chain-fatty-acid CoA ligase, putative B9RJ88 AT1G77590.1 P

Jcr4S01175.60 O-acyltransferase (WSD1-like) family protein B9SBH9 AT5G53390.1 P

Jcr4S01274.20 short chain alcohol dehydrogenase, putative B9S3X6 AT4G03140.1 P

Jcr4S01370.20 stearoyl-acyl-carrier protein desaturase B9T0X0 AT2G43710.2 P

Jcr4S01398.30 calcium ion binding protein, putative B9SQU8 AT4G26740.1 P

Jcr4S02541.50 50 kDa β-ketoavyl-ACP synthase (KASB) Q41135 AT5G46290.1 P

Jcr4S03070.30 stearoyl-acyl carrier protein desaturase B9RM11 AT3G02630.1 P

Jcr4S03070.40 stearoyl-acyl-carrier protein desaturase B9RM11 AT3G02630.1 P

Jcr4S03253.10 Enoyl-ACP reductase precursor (EAR) B9T5D7 AT2G05990.2 P

99

Jcr4S03522.10 stearoyl-ACP desaturase B5AY36 AT1G43800.1 P

Jcr4S03605.60 short-chain dehydrogenase, putative B9RXD8 AT4G05530.1 P

Jcr4S04655.30 beta-ketoacyl-acp synthase ii B9RR59 AT1G74960.3 P

Jcr4S04735.20 malonyl -acyl carrier protein transacylase B9RRJ0 AT2G30200.1 P

Jcr4S05415.60 glutathione peroxidase, putative B9RCA6 AT4G11600.1 P

Jcr4S08397.10 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase, putative B9RYN0 AT5G46290.1 P

Jcr4S09454.10 momilactone a synthase-like B9SWZ4 AT4G03140.1 P

Jcr4S10126.30 S-adenosyl-l-methionine:delta24-sterol-C-methyltransferase B9RVM5 AT5G13710.2 P

Jcr4S13936.20 stearoyl-acyl-carrier protein desaturase B9RM12 AT3G02630.1 P

Jcr4S15816.20 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9S554 AT2G33150.1 P

Jcr4S20073.10 acyl-acp thioesterase - - P

Jcr4S20632.10 ethanolamine-phosphate cytidylyltransferase B9S1W1 AT2G38670.1 P

Jcr4S27123.10 beta-ketoacyl-acp synthase ii B9RR59 AT1G74960.3 P

Jcr4U30974.10 ketoacyl-acp reductase B9RMM7 AT1G24360.1 P

100

Figura 15 - A enzima aleno ciclase oxidase faz parte do processo de conversão do acido linolênico à ácido jasmônico. O ácido linolênico é um dos pricipais ácidos graxos presentes no óleo do pinhão manso. A presença dessa enzima sugere que em condições de estresse abiótico ela seja ativa para síntese e liberação de substâncias relacionadas com o mecanismo de defesa da planta, como é caso do ácido jasmônico (BUCHANAN, 2000).

101

5.7.5 Proteínas relacionadas com o metabolismo dos Terpenóides

Os terpenos são o maior grupo de fitoquímicos, os quais exibem diversas funções na

mediação de interações benéficas e antagônicos entre os organismos. Espécies de Jatropha

são ricas em terpenóides. Dentre os terpenos, os diterpenos, são os mais estudados desse

gênero, sendo os ésteres de forbol o diterpeno de maior interesse no estudo de Jatropha

curcas (DEVAPPA et al., 2010).

Em plantas os diterpenóides são sintetizados em três passos principais. No primeiro,

a unidade de isopreno isopentenil difosfato (IPP) é sintetizada através da via do 1-desoxi-D-

xilulose-5-fosfato (DXP), quatro das sete enzimas que compõem essa via foram

identificadas no presente trabalho: 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase, 2 - C-

metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferase, 4 - (citidina 5'-difosfato)-2-C-metil-D-eritritol-

quinase, e (E) -4 - hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-sintase. Com isso, sugere-se que a via

DOXP encontra-se em funcionamento nos plastídeos, como sugerido previamente nos

estudos transcriptômicos de sementes do pinhão manso em desenvolvimento (KING et al.,

2011).

Numa segunda etapa, o isoprenil difosfato sintase catalisa a síntese dos precursores

intermediários do difosfato: geranil difosfato, farnesil difosfato, e geranilgeranil difosfato

(GGPP) a partir da unidade do isopreno. Nas amostras de proteínas plastidiais do

endosperma em desenvolmento do pinhão manso, a GGPP sintase foi identificada. Essa

enzima é responsável pela síntese do GGPP, um precursor de diversos diterpenos.

Entretanto não foram identificadas enzimas envolvidas na síntese de outros precursores do

GGPP.

O terceiro passo na formação dos diversos diterpenóides ocorre pela ação da

terpeno sintase/ciclase, mas nenhuma delas foi identificada no presente trabalho. As

proteínas relacionadas com o metabolismo secundário, presentes nos plastídeos do

endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, estão listadas na tabela 6

(ver figura 14 e tabela suplementar 4).

Em estudo transcriptômico de sementes em desenvolvimento de J.curcas, King et al.

(2011) também não identificaram transcritos para as terpeno sintase, embora tenham

detectado todos os transcritos que codificam para enzimas da via DOXP.

As enzimas que podem estar envolvidas na síntese de ésteres de forbol foram

detectadas a partir dos estudos transcriptômicos e proteômicos de sementes de pinhão

manso realizados por Costa et al. (2010) e Soares et al. (2014). Dentre estas, pode-se

destacar transcritos envolvidos nas vias biossintéticas do isopentenil pirofosfato (IPP) e do

102

dimetilalil pirofosfato (DPP) que são os precursores de todas as classes de terpenos

sintetizados em plantas. Estes compostos são sintetizados tanto a partir de vias que

ocorrem no citoplasma (via do mevalonato), quanto de vias que ocorrem nos plastídeos (via

do 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato - DXP) (ZULAK; BOHLMANN, 2010).

O geranilgeranilpirofosfato (GGPP), sintetizado pela ação da geranilgeranilpirofosfato

sintase, é o substrato de uma ampla variedade de ciclases que catalisam a formação de

diterpenos cíclicos os quais serão processados de diferentes maneiras culminando com a

síntese de diterpenos específicos (YAMAGUCHI, 2008). Embora ainda sem evidência

experimental, acredita-se que os ésteres de forbol são sintetizados a partir do casbeno que

é sintetizado através da ciclização do geranilgeranilpirofosfato pela sintase do casbeno. A

via biossintética do forbol ainda não está completamente delineada, mas segundo Dewick

(2002) pode se originar a partir da ciclização do geranilgeranilpirofosfato (GGPP) (Figura

16), que cria um cátion contendo um anel de 14 membros. A perda de um próton quando da

formação do anel do ciclopropano leva à formação do casbeno, composto que na mamona

(Ricinus communis) é um metabólito antifúngico. O casbeno é provavelmente o precursor do

forbol. Dessa maneira, a via de síntese dos ésteres de forbol a partir do

geranilgeranilpirofosfato não tem intermediários comuns com a síntese de diterpenos

importantes para o metabolismo primário das plantas, como , por exemplo, as giberelinas. A

sintase do casbeno foi isolada primeiramente de folhas da mamoneira (Ricinus communis) e

usa o geranilgeranilpirofosfato como substrato para produzir diretamente o casbeno, uma

fitoalexina.

Diante dos dados expostos, sugere-se que os plastídeos isolados a partir do

endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso não sintetizam ésteres de

forbol. Um suporte experimental para essa proposta encontra-se na observação feita por He

et al. (2011), ao mostrarem que a maior deposição de ésteres de forbol em semente do

pinhão manso ocorre no tegma e não no endosperma. O tégma é um tecido de origem

materna, o qual se origina a partir do integumento interno das sementes, ele é importante

para a transferência de nutrientes dos tecidos de origem materna para o endosperma e o

embrião. Na semente madura esse tecido se reduz a uma fina camada, que juntamente com

a testa formam a casca da semente.

103

Figura 16 - Via biossintética dos ésteres de forbol em plantas, segundo Dewick (2002).

104

Tabela 6 - Proteínas relacionadas com o metabolismo secundário, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.

ProteinID Protein description Best Ricinus

communisHit Best Arabidopsis

thaliana Hit Final locaization

Jcr4S00021.320 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RKN5 AT4G29010.1 P

Jcr4S00035.80 delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase B9R960 AT5G62530.1 P

Jcr4S00115.180 aldehyde dehydrogenase, putative B9RZQ0 AT3G66658.2 P

Jcr4S00558.90 Delta3,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase B9RM93 AT5G43280.1 P

Jcr4S00616.80 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RT76 AT3G06860.1 P

Jcr4S00742.70 acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial, putative B9SA57 AT5G48230.2 P

Jcr4S01649.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9T4Y7 AT3G51050.1 P

Jcr4S01936.100 aldehyde dehydrogenase - - P

Jcr4S02497.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S03546.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P

Jcr4S04843.20 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme a hydrolase-like B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S04843.30 3-hydroxyisobutyryl- hydrolase-like protein 4 B9RPB0 AT4G13360.1 P

Jcr4S08423.20 aldehyde dehydrogenase Family B9RB49 AT1G23800.1 P

Jcr4S11660.10 betaine aldehyde dehydrogenase B9R8Y8 AT1G74920.1 P

Jcr4S26962.10 aldehyde dehydrogenase family 3 member B9S2Y3 AT1G44170.2 P

Jcr4S01018.60 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9RWL7 AT2G33150.1 P

Jcr4S15816.20 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9S554 AT2G33150.1 P

gi|225544133 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S00416.90 α-carboxyl-tansferase (α-CT) subunit of Het-ACCase B9SPE5 AT2G38040.2 P

Jcr4S01232.50 Biotin carboxyl carrier protein subunit of of Het-ACCase B9RM56 AT5G16390.1 P

Jcr4S03449.40 biotin carboxylase precursor B9S1E2 AT5G35360.1 P

Jcr4S09385.30 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S25260.10 biotin carboxylase B9S1E2 AT5G35360.2 P

105

Jcr4U29862.20 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4U31237.20 acetyl-coenzyme a carboxylase carboxyl transferase subunit - - P

Jcr4U32160.10 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P

Jcr4S00057.90 transketolase, putative B9RDA1 AT2G45290.1 P

Jcr4S00202.110 dtdp-glucose 4-6-dehydratase, putative B9SAR7 AT3G62830.2 P

Jcr4S00225.120 pyruvate dehydrogenase, putative B9S0Z5 AT2G34590.1 P

Jcr4S00089.150 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase B9RB24 AT5G62790.1 P

Jcr4S00528.60 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase B9S047 AT2G02500.1 P

Jcr4S01187.50 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase B9SWB7 AT5G60600.1 P

Jcr4S05483.10 4-diphosphocytidyl-2-c-methyl-d-erythritol kinase B9SB47 AT2G26930.1 P

Jcr4S07015.40 geranylgeranyl pyrophosphate synthase-related protein B9SUY3 AT4G38460.1 P

Jcr4S01069.20 curcin precursor B9RRJ1 - -

Jcr4S12813.10 curcin B9RRJ1 - -

106

6 CONCLUSÃO

O presente trabalho realizou a primeira análise do proteoma dos plastídeos isolados

do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso. Utilizando os dados de

sequencia do genoma do pinhão manso, foi possível identificar 923 proteínas relacionadas

com diversas atividades metabólicas. Além da identificação das proteínas responsáveis pela

biossíntese de ácidos graxos e de outras importantes vias metabólicas, que ocorrem nos

plastídeos, também foram identificadas uma série de proteínas transportadoras relacionadas

com a captação de fontes de carbono e nitrogênio, que são fontes necessárias para

promover as vias biossintéticas. Apesar de várias enzimas, envolvidas na síntese dos

precursores de diterpenos, terem sido identificadas, nenhuma terpeno sintase/ciclase foi

detectada. Dessa forma, possivelmente os plastídeos, isolados a partir do endosperma de

sementes em desenvolvimento do pinhão manso, não sintetizam ésteres de forbol.

O estudo exposto fornece insights sobre as principais vias biossintéticas e mostra

características originais dos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento

em nível de proteoma. Além disso, abre prerrogativa para o estudo proteômico dos

plastídeos do integumento de sementes do pinhão manso em desenvolvimento para se

obter uma maior amplitude de dados referentes às proteínas plastidiais envolvidas na

síntese dos ésteres de forbol, bem como nas demais vias metabólicas que ocorrem nos

plastídeos.

Os dados aqui produzidos foram publicados (PINHEIRO et al., 2013).

107

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os dados obtidos por He et al. (2011), permitem formular a hipótese de que as

enzimas relacionadas com a síntese dos ésteres de forbol, com foco para sintase do

casbeno, estejam localizadas nos plastídeos do tegma. Outra possibilidade é que a enzima

sintase do casbeno possa estar presente em outros tecidos que não na semente, nos quais

ocorrem a síntese dos ésteres de forbol sendo estes, em seguida, transportados até as

sementes.

Os dados produzidos pelos estudos proteômicos do pinhão manso, tornam-se

cruciais para melhor compreender e explorar as diversas vias biossintéticas que ocorrem

nos plastídeos, e proporcionar um maior alicerce de dados aos experimentos de

melhoramento genético. No pinhão manso as vias metabólicas de biossíntese dos lipídios e

dos ésteres de forbol são as que despertam maior interesse para o melhoramento. Seja

para produzir óleo de melhor qualidade e em maior quantidade, ou para diminuir o nível dos

compostos tóxicos, principalmente os ésteres de forbol (terpenóide).

Levando em conta a ampla gama de funções que os terpenóides desempenham em

plantas, tais como defesa, reguladores de crescimento, etc (KIRBY; KEASLING, 2009), é

patente que a interferência em reações que produzam precursores comuns à síntese de

várias classes de terpenos, pode ter consequências drásticas para a planta. Por exemplo, a

inibição da síntese de geranilgeranilpirofosfato (GGPP) pelo silenciamento da GGPP

sintase, certamente levaria a uma dramática redução na síntese tanto de diterpenos, como,

por exemplo, de giberelinas, bem como de carotenóides uma vez que o

geranilgeranilpirofosfato é precursor destes. Neste contexto, é interessante chamar a

atenção que a despeito de várias tentativas exitosas de silenciar genes envolvidos na

sintese de terpenóides (JASSBI et al., 2007), o efeito do silenciamento destes genes no

desempenho da planta em condições de campo ainda não foi analisada.

A hipótese de que a síntese dos ésteres de forbol tem o casbeno como intermediário,

poderá ser testada através de experimentos onde a expressão da sintase do casbeno é

transitoriamente bloqueada através de silenciamento gênico mediado por vírus (VIGS). Daí

tamanho o interesse em continuar a busca pelo conhecimento da via síntese dos ésteres de

forbol.

108

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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