UNIVERSIDADE DO ALGARVEInstituto Superior de Engenharia Departamento de Engenharia Alimentar

Mestrado em Tecnologia de Alimentos

Produo industrial de azeitona verde no Algarve: Parmetros fsico-qumicos e microbiolgicos

Maria do Carmo Alves

FARO 2010

UNIVERSIDADE DO ALGARVEInstituto Superior de Engenharia Departamento de Engenharia Alimentar

Mestrado em Tecnologia de Alimentos

Produo industrial de azeitona verde no Algarve: Parmetros fsico-qumicos e microbiolgicosRelatrio de projecto orientado por: Professora Doutora Clia Maria Brito Quintas Professora Doutora Maria Nelma Gaspar

Maria do Carmo AlvesFARO 2010

All truth, in the long run, is only common sense clarified. Thomas Huxley (1825-1895)

AgradecimentosAgradeo especialmente Professora Doutora Clia Maria Brito Quintas pela orientao ao longo do desenvolvimento desta tese, pela sua disponibilidade, pela partilha e transmisso de conhecimentos, mas sobretudo pelo estmulo e inspirao constantes. Professora Nelma Gaspar pela co-orientao desta tese, pela sua ateno, pelas suas sugestes e pela sua transmisso de conhecimentos no decorrer de todo o estudo. A todo o pessoal dos laboratrios de microbiologia, qumica e processamento alimentar do Departamento de Engenharia Alimentar pela ateno e auxlio presentes em todos os momentos desta tese. Ao meu colega de mestrado David Esprito Santo pela cooperao e ajuda. s estagirias Sara Hudges, Mnica Marques, Marlia Oliveira e Christina Silva pela colaborao no trabalho laboratorial. Ao senhor Hlder Madeira por ter fornecido as azeitonas utilizadas neste estudo. Fundao Eugnio de Almeida pela bolsa de mestrado concedida e pelo trabalho realizado no desenvolvimento da regio de vora.

Lista de abreviaturasAC AB Abs AL ANOVA AS C Cfo I CO2 DNA DNS EDTA FA FB G1 a G11 LAB HaeIII HinfI Log mg/L mg/mL N NaCl NaOH NP PA PB Pb PCR p/v rDNA RNA RFLP cido ctrico cido benzico Absorvncia cido lctico Anlise de varincia cido srbico Graus centgrados Enzima de restrio Dixido de carbono cido desoxirribonucleico cido dinitro saliclico Tetra - acetato de etileno diamina Fermentao A Fermentao B Grupo 1 a Grupo 11 Bactrias cido lcticas Enzima de restrio Enzima de restrio Logaritmo Miligrama por litro Miligrama por mililitro Normalidade Cloreto de sdio Hidrxido de sdio Norma Portuguesa Processo A Processo B Pares de bases Reaco em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction) Peso por volume DNA ribossomal cido ribonucleico Anlise de polimorfismos de fragmentos de restrio (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms. Docedil sulfato de sdio Tris-acetato-EDTA Unidades formadoras de colnias Temperatura (C) necessria para reduzir 10 vezes a populao de microrganismos

SDS TAE u.f.c Z

ResumoAs azeitonas de mesa so um alimento produzido e consumido sobretudo na regio Mediterrnica. No sul de Portugal, um dos mtodos de produo mais utilizados consiste em britar azeitonas ainda verdes da variedade Maanilha (Olea europaea pomiformis), e coloc-las directamente em salmoura at perderem parcialmente o sabor amargo. A azeitona britada caracterizada por uma cor verde escura, um aroma rico e pelo sabor amargo caracterstico. Na primeira parte deste trabalho estudaram-se as alteraes microbiolgicas e fsicoqumicas ocorridas durante a fermentao natural de azeitonas verdes britadas, produzidas numa indstria local. As azeitonas fermentaram temperatura ambiente, de acordo com dois processos: Processo A em que, a salmoura foi substituda durante a fermentao; Processo B em que, a salmoura no foi substituda durante todo o processo fermentativo. Foram monitorizadas as populaes de microrganismos totais a 30C, de bactrias lcticas, de enterobactrias, de leveduras e de fungos filamentosos. Os parmetros fsico-qumicos estudados foram o pH, a acidez titulvel, os acares redutores, os compostos fenlicos e a cor. No fim do processo de fermentao, (Processo A 55 dias, Processo B 77 dias) as leveduras constituam a populao microbiana dominante e observou-se um decrscimo da populao de fungos filamentosos ao longo do tempo. No foram detectadas colnias de Enterobacteriaceae no final das duas fermentaes estudadas. Foram identificados, por PCR-RFLP da regio ITS 6.8 rDNA, e sequenciao da regio D1-D2 do gene 26S rDNA, 109 isolados de leveduras presentes na salmoura da Fermentao A e da Fermentao B, pertencentes aos gneros Rhodotorula, Aureobasidium, Candida, Zygotorulaspora, Pichia, Citeromyces e Saccharomyces.

Na segunda parte deste trabalho estudaram-se vrios processos de conservao das azeitonas verdes britadas j fermentadas. As azeitonas foram submetidas a diferentes condies de utilizao de aditivos alimentares a temperatura e humidade ambiente e controladas. As populaes microbianas estudadas foram microrganismos totais a 30C, bactrias lcticas, enterobactrias, leveduras e fungos filamentosos. Em todas as condies investigadas a populao de leveduras diminuiu em funo do tempo. No final do estudo pesquisou-se, com resultado negativo, a presena de esporos de clostrdios sulfito redutores. Os parmetros fsico-qumicos testados na salmoura foram pH, acidez titulvel, concentrao de NaCl, concentrao de acares redutores, concentrao de compostos fenlicos e turbidez. A cor e a textura foram monitorizadas directamente na azeitona. Aps 150 dias, as propriedades organolpticas das azeitonas foram avaliadas por um painel de provadores. Em relao aos aditivos alimentares testados, considerou-se ser o HCL (coadjuvante tecnolgico) o mais adequado de forma melhorar a conservao deste produto.

Palavras-chave: Azeitonas verdes, fermentao, leveduras, conservao.

AbstractTable olives are a widespread food produced and consumed mainly in Mediterranean areas. In the south of Portugal a common method of production, is to crack green olives of the Manzanilla variety (Olea europaea pomiformis) and brine them directly after harvesting. The fruits are kept in the brining solutions until they partially lose their natural bitterness. Cracked green table olives are characterized by a fresh green color, a rich aroma and a residual bitterness. The first part of this work investigated the microbiological and physicochemical changes during the natural fermentation of cracked green olives carried out in a local industry. Olives fermented at room temperature, and involved two processes: Process A, olives brine was changed during the fermentation; Process B, olives were maintained in the same brine. The microbial populations studied were total viable counts, lactic acid bacteria, Enterobacteriaceae, yeasts, and moulds. The

physicochemical parameters monitored were pH, titratable acidity, reducing sugars, phenolics and colour. At the end of the fermentation (Process A- 55 days, Process B- 73 days), yeasts were the predominant microbial population. A decrease of the mould population was observed over time. No viable counts of Enterobacteriaceae where found in Process A and in Process B at the end of fermentation. Yeasts present in both processes over time were identified by pcr/rflp, from region ITS 6.8 rDNA, and sequence of region D1-D2 from gene 26S rDNA, 109 isolates from Process A and from Process B. The strains identified in the brine of fermentation belong to the genus Rhodotorula, Aureobasidium, Candida, Zygotorulaspora, Pichia, Citeromyces and Saccharomyces. The second part of this work studied various processes of conservation of cracked fermented green olives. Olives were packed in various conditions of utilization of

preservatives, acidifying agents and vacuum. The olives were kept at different temperature conditions: room temperature controlled temperature, with and without controlled humidity. The microbial populations studied were total viable counts, lactic acid bacteria, Enterobacteriaceae, yeasts, and moulds. In all the tested conditions the yeast population decreased. At the end of the study the olives were tested with a negative result for the presence of spores from sulfite reducing clostridia. The physicochemical parameters monitored in the brine were pH, titratable acidity, NaCl concentration, reducing sugars concentration, phenolic compounds concentration and turbidity. Colour and texture were monitored in the olives. After 150 days of storage the organoleptic properties of the olives was tested by a sensory panel. The food additive with better results for the conservation of this product was HCL (technological coadjuvant). Keywords: green olives, fermentations, yeasts, conservation.

ndice1. Introduo1.1 Vegetais fermentados, 2 1.1.1Azeitona de mesa, 2 1.1.2 Tipos de processamento de azeitona de mesa, 3 1.2 Azeitona verde britada, 6 1.2.1 Azeitona Maanilha, 7 1.2.2 Produo industrial de azeitona verde britada, 7 1.3 Fermentao de azeitona de mesa, 11 1.3.1 Caracterizao microbiolgica, 11 1.3.2 Caracterizao fsico-qumica, 13 1.4 Condies de armazenamento, 16

1

2.

Caracterizao fsico-qumica e microbiolgica da fermentao industrial de azeitona verde britada2.1 Materiais e mtodos, 19 2.1.1 Colheita de azeitonas, 19 2.1.2 Metodologia de produo, 19 2.1.3 Recolha de Amostras, 19 2.1.4 Parmetros microbiolgicos, 21 2.1.4.1. Isolamento e identificao de leveduras, 21 2.1.5 Parmetros fsico-qumicos, 24 2.1.6 Anlise estatstica, 25 2.2 Resultados, 26 2.2.1 Parmetros microbiolgicos, 26 2.2.1.1 Identificao de leveduras, 27 2.2.2 Parmetros fsico-qumicos, 30 2.3 Discusso de resultados, 35 2.4 Concluso, 43

19

3.

Estudo das condies de armazenamento de azeitona verde britada3.1 Materiais e mtodos, 44 3.1.1 Parmetros microbiolgicos, 46 3.1.2 Parmetros fsico-qumicos, 47 3.1.3 Anlise Sensorial, 49 3.1.4 Planeamento experimental, 49 3.2 Resultados, 52 3.2.1 Parmetros microbiolgicos, 52 3.2.2 Parmetros fsico-qumicos, 55 3.2.3 Anlise sensorial, 65 3.2.4 Estudo do efeito da utilizao de aditivos alimentares, 66 3.3 Discusso de resultados, 70 3.4 Concluso, 75

44

4.

Perspectivas futuras

76

Referncias bibliogrficas

77

ndice de FigurasFigura 1.1 Azeitona Maanilha verde britada 6

Figura 1.2. Fluxograma de produo industrial da azeitona verde britada

8

Figura 2.1 Localizao do ponto de recolha das amostras de salmoura nos fermentadores utilizados

20

Figura 2.2. Crescimento da microbiota durante a fermentao de azeitonas verdes britadas, PA (Figura 2.2A) e PB (Figura 2.2B)

26

Figura 2.3. Exemplo de perfis obtidos por RFLP de trs estirpes identificadas durante a fermentao de azeitonas verdes britadas

29

Figura 2.4. Evoluo da concentrao de acares redutores na salmoura ao longo do PA e do PB

31

Figura 2.5. Evoluo da concentrao de compostos fenlicos na salmoura ao longo do PA e do PB

31

Figura 2.6. Evoluo dos parmetros de cor L (Figura 2.6A), a (Figura 2.6B), e b (Figura 2.6C), na superfcie das azeitonas ao longo de fermentao do PA e do PB

33

Figura 3.1. Azeitonas verdes britadas j fermentadas e embaladas

44

Figura 3.2. Evoluo da microbiota durante o armazenamento de azeitonas verdes britadas nos grupos de 1 a 11

52-53

Figura 3.3 Evoluo da turbidez ao nas salmouras dos grupos 1 a 10 ao longo do tempo

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Figura 3.4. Evoluo do parmetro L nos grupos de 1 a 11

60

Figura 3.5. Evoluo do parmetro a nos grupos de 1 a 11

61

Figura 3.6. Evoluo do parmetro b nos grupos de 1 a 11

62

Figura 3.7. Evoluo da textura (N), ao longo do tempo nos grupos de 1 a 11

64

Figura 3.8. Resultados da preferncia do painel de provadores

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Figura 3.9. Modelo da variao da taxa de crescimento de fungos filamentosos em relao ao uso de aditivos alimentares

66

Figura 3.10. Modelo da variao do pH na salmoura em relao ao uso de aditivos alimentares

66

Figura 3.11. Modelo da variao da acidez da salmoura em relao ao uso de aditivos alimentares Figura 3.12. Modelo da variao da turbidez da salmoura em relao ao uso de aditivos alimentares

67

67

Figura 3.13 Modelo da variao da turbidez da salmoura em relao ao uso de aditivos alimentares

68

Figura 3.14. Desejabilidade obtida em cada condio

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ndice de TabelasTabela I. pK de alguns acidificantes e conservantes autorizados em azeitonas de mesa 17

Tabela II- Plano de amostragem

20

Tabela III- Reagentes utilizados na mistura para PCR (Mix)

23

Tabela IV- Frequncia no nmero de espcies de leveduras isoladas nos dois processos de fermentao estudados

28

Tabela V- Sucesso de leveduras ao longo do tempo

29

Tabela VI- Resultados de pH, Acidez total e concentrao de NaCl na salmoura, no PA e no PB

30

Tabela VII- Condies de armazenamento utilizadas neste estudo

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Tabela VIII- Condies testadas no design factorial D-optimal

49

Tabela IX- Respostas Design D-optimal

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Tabela X- Resultados dos valores de pH ao longo do tempo

55

Tabela XI- Resultados dos valores de acidez ao longo do tempo

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Tabela XII- Concentrao final de NaCl

57

Tabela XII- Concentrao final de acares redutores

57

Tabela XIV- Concentrao final de compostos fenlicos

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Tabela XV- Parmetros estabelecidos para a optimizao da conservao de azeitonas verdes britadas

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1. IntroduoA Oliveira (Olea europaea L.) uma das rvores mais caractersticas e apreciadas da regio Mediterrnica. O seu fruto, a azeitona, utilizado para a produo de azeite, cuja utilizao se encontra neste momento em plena expanso mundial. O azeite reconhecido pelos seus sabores e aromas, e por constituir uma opo saudvel, j que contm cidos gordos essenciais. A azeitona tambm consumida como azeitona de mesa e na regio mediterrnica existem inmeras formas tradicionais de a processar. Durante a sua preparao pode ser coberta de sal ou colocada em salmoura, inteira, retalhada, recheada, britada, verde, a mudar de cor, ou plenamente madura. A azeitona verde britada um produto tpico e muito apreciado no sul de Portugal, particularmente no Algarve onde a variedade mais utilizada a Maanilha. Este tipo de azeitona normalmente produzido pela populao rural para consumo familiar. um produto bastante procurado na restaurao, mas sempre produzido em pequena escala. Em Portugal, at 4 de Maro de 2009, existiam 22 empresas de transformao de azeitona reconhecidas pelo Ministrio da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas, das quais seis esto localizadas no Alentejo e nenhuma est localizada no Algarve (Anexo I). A indstria com maior produo de azeitona de mesa em Portugal situa-se na Praia de Mira, distrito de Coimbra. A presente investigao foi desenvolvida na Universidade do Algarve, Instituto Superior de Engenharia no mbito do Mestrado em Tecnologia dos Alimentos. Este estudo surgiu na sequncia de um estgio profissional realizado na empresa Hlder Madeira, Indstria e Comrcio de Azeitonas Unipessoal, Lda situada em Tavira e do interesse pessoal em conhecer melhor o processo de fermentao da azeitona verde britada que ainda se mantm bastante emprico. Este trabalho teve como finalidade, numa primeira fase contribuir para aprofundar o conhecimento do processo de fermentao subjacente produo de azeitona verde britada, e numa segunda fase melhorar as condies de armazenamento aps embalagem, de forma a obter um produto final que mantivesse as suas caractersticas naturais durante um tempo de prateleira mais alargado do que o actual, de modo a facilitar a sua armazenagem e comercializao, contribuindo assim para aumentar o valor comercial deste produto. A azeitona verde Maanilha foi colhida na regio de Tavira, em Outubro de 2008 e foi processada na empresa Hlder Madeira, Indstria e Comrcio de Azeitonas Unipessoal, Lda., seguindo dois mtodos de produo utilizados nesta unidade de produo.

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Estabeleceram-se os seguintes objectivos: - Conhecer a sucesso da microbiota e dos parmetros fsico-qumicos ao longo de dois processos de fermentao, realizados escala industrial; - Comparar os dois processos utilizados pelo produtor; - Identificar as espcies de leveduras presentes durante as fermentaes; - Estudar diferentes mtodos de conservao durante o perodo de armazenamento; Numa primeira fase, ao longo do Captulo 1 deste relatrio ser apresentada uma reviso bibliogrfica, relacionada com fermentaes de vrios tipos de azeitonas, o seu processamento e a sua caracterizao microbiolgica e fsico-qumica. Posteriormente, no Captulo 2, ser caracterizada a fermentao industrial de azeitona verde britada, trabalho laboratorial desenvolvido, os resultados obtidos e a interpretao e discusso dos mesmos. No Captulo 3, ser analisado o estudo das condies de armazenamento de azeitona verde britada embalada assim como as tcnicas utilizadas, os resultados obtidos e a interpretao e discusso dos mesmos.

1.1. Vegetais fermentadosO processo de fermentao de vegetais tem como objectivo principal a sua conservao e simultaneamente o desenvolvimento de aromas, sabores e textura caractersticos muito apreciados pelos consumidores. A origem da preservao de vegetais atravs da fermentao remonta antiguidade. A nvel mundial, muitos vegetais so fermentados em pequena escala, em casa ou em pequenas indstrias. As excepes, que apresentam um valor comercial significativo, so o chucrute, o pepino e as azeitonas de mesa (Wood, 1998). Apesar de no mundo inteiro existir uma enorme variedade de vegetais fermentados, as caractersticas do processo so muito semelhantes, envolvendo uma desidratao com sal, ou alternativamente a imerso dos vegetais em salmouras. Geralmente, o sal ou a salmoura so adicionados aos vegetais a fermentar temperatura ambiente (Hutkins, 2006).

1.1.1 Azeitona de mesa A azeitona o fruto da oliveira umas das rvores mais importantes nos pases Mediterrnicos cultivada para a produo de azeite e de azeitona de mesa (Sabatini et al., 2008). A maioria da produo destinada obteno de azeite e apenas 7 % a 10 % da produo mundial consumida como azeitona de mesa (Hutkins, 2006).

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A produo mundial de azeitonas de mesa cerca de 1,5 milhes de toneladas, das quais cerca de metade so produzidas na Europa, sobretudo em Espanha, Grcia, Itlia e Portugal (IOOC, 2005). As variedades mais utilizadas na produo de azeitonas de mesa so a Gordal (Olea europea regalis), a Clemente (tambm conhecida por Gordal Sevillano) e a Maanilha (Olea europea pomiformis) (Wood, 1998).

1.1.2. Tipos de processamento de azeitona de mesa Os tipos de processamento de azeitona de mesa com mais expresso econmica incluem o mtodo Espanhol, o mtodo Grego e o mtodo Californiano (Garrido-Fernndez et al., 1997). O mtodo Espanhol utiliza azeitonas verdes tratadas com hidrxido de sdio (NaOH) que so posteriormente fermentadas. No mtodo Grego, so utilizadas azeitonas maduras que so fermentadas sem pr-tratamento com NaOH. O terceiro tipo conhecido por estilo Californiano, utilizam-se azeitonas verdes que so tratados com NaOH mas que no so fermentadas (Hutkins., 2006). Mtodo Espanhol O fruto verde tratado com uma soluo de NaOH (0,5 % a 3,5 %) (p/v) durante 4 a 12 horas, de acordo com o calibre das azeitonas (Hutkins, 2006). Durante este perodo, o NaOH penetra na polpa, e por hidrlise, os compostos fenlicos (principalmente oleuropena) so degradados resultando sobretudo hidroxitirosol. Aps o tratamento alcalino as azeitonas so lavadas com mudanas de gua peridicas durante aproximadamente 24 horas (Robinson, 1988; GarridoFernndez et al., 1997; Snchez, et al., 2000). O pH das azeitonas depois do tratamento com NaOH deve ser inferior a 8. Durante esta fase de pr-tratamento a microbiota inicial do fruto sofre uma reduo (Hutkins, 2006). Os frutos so ento cobertos com salmoura contendo cerca de 5 a 12% de sal. Se a concentrao inicial da salmoura for baixa adicionado sal progressivamente ao longo do processo, de forma a obter uma concentrao final de sal de cerca de 8 a 9 %. Muitas vezes a salmoura acidificada com 3 % (p/v) de cido lctico (Robinson, 1988). Quando a fermentao termina, o pH da salmoura deve estar compreendido entre 3,5 e 4,2, com uma acidez titulvel entre 0,8 e 1,0 (Hutkins, 2006). Durante a fermentao de azeitonas segundo o estilo Espanhol, identificam-se fases distintas na evoluo dos microrganismos (Garrido-Fernndez et al., 1997): Numa primeira fase os grupos dominantes so as bactrias Gram negativas, frequentemente membros da famlia

Enterobacteriaceae. A segunda fase caracterizada por um crescimento progressivo das bactrias cido lcticas e das leveduras e um decrscimo gradual do nmero de bactrias Gram negativas. Na 3

terceira fase, observado um crescimento abundante de Lactobacillus, sobretudo Lactobacillus plantarum, tornando-se o grupo de microrganismos dominantes do final da fermentao (Panagou et al., 2006). Neste tipo de processamento de azeitona de mesa so frequentemente utilizadas culturas starter de Lactobaccillus produtoras de bacteriocinas o que lhes confere uma vantagem competitiva em relao microbiota natural presente nas azeitonas. As culturas starter utilizadas produzem cido lctico diminuindo o pH da salmoura (Leal-Snchez et al., 2003). Mtodo Grego As azeitonas produzidas segundo o mtodo Grego so azeitonas pretas no oxidadas. As azeitonas so colhidas quando o fruto atinge o estado final de maturao ou imediatamente antes, quando do mesocarpo est completamente negro. Depois da colheita as azeitonas so lavadas e colocadas em salmoura com concentrao entre 8 a 10 % (p/v) onde decorre a fermentao natural, sem pr-tratamento com NaOH. Os compostos fenlicos so parcialmente removidos por hidrlise e por difuso e diluio na salmoura (Nychas et al., 2002; Panagou et al., 2008). A fermentao deste tipo de azeitonas no mediada s por bactrias lcticas mas tambm por leveduras e bactrias Gram negativas. Numa fermentao bem sucedida a microbiota final ser constituda apenas por leveduras e bactrias lcticas, e a proporo entre as duas populaes determinante nas caractersticas do produto final. Segundo Garrido-Fernndez et al. (1997) as leveduras so responsveis pela fermentao de azeitonas estilo Grego e as bactrias lcticas encontram-se presentes em nmero comparativamente menor. Esta fermentao tem como produtos finais no s cido lctico mas tambm cido actico, cido ctrico e cido mlico. O pH final deste tipo de azeitonas, cerca de 4,5 e acidez inferior a 0,6% (Hutkins, 2006). O produto final caracterizado pelo sabor amargo caracterstico (Hutkins, 2006) e por um aroma frutado (Panagou et al., 2008). Mtodo Californiano O estado da Califrnia (EUA) um dos grandes produtores de azeitonas de mesa e, cerca de 90% a 95% da produo de azeitonas na Califrnia destina-se produo de azeitonas de mesa (Hutkins, 2006). Estima-se que em todo o mundo, 30 % da azeitona de mesa produzida seja preparada de acordo com este mtodo (Segvia-Bravo et al., 2008). O mtodo Californiano de produzir azeitonas de mesa pretas oxidadas baseia-se em 3 passos principais: tratamento alcalino; armazenamento em salmoura e tratamento trmico (Mafra et al., 2007). A variedade mais utilizada neste tipo de processamento a Maanilha. No inicio do processo, quando as azeitonas ainda esto verdes so colocadas em sucessivas solues de NaOH e entre cada uma destas solues so colocadas em tanques com injeco de ar. Durante este processo o fruto escurece gradualmente (Garcia et al., 1992). A soluo alcalina 4

penetra 1-2 mm na polpa do fruto (Marsilio et al., 2001). Depois da cor preta ser alcanada este processo, que intercala tratamento alcalino com lavagens em tanques com injeco de ar, contnua at o pH ser aproximadamente 8 (Brenes et al., 1995). A presena de oxignio numa concentrao elevada promove reaces de escurecimento, como a polimerizao dos compostos fenlicos primeiro em compostos castanhos e depois negros (Hutkins, 2006). A cor formada no estvel e depois da oxidao desaparece progressivamente. Para estabilizar a cor negra formada os frutos podem ser imersos durante algumas horas em glucanato de ferro (Garca et al., 1986). Os compostos fenlicos tm um papel importante na formao da cor negra caracterstica deste tipo de azeitona de mesa, so o substrato utilizado pelas enzimas oxidativas. Enquanto noutros alimentos o escurecimento oxidativo resulta em perdas nutricionais, em azeitonas de mesa produzidas segundo o mtodo Californiano estas reaces so parte de transformaes desejveis e essenciais que contribuem para a complexidade da cor. (Marslio et al., 2001). As azeitonas produzidas de acordo com o mtodo Californiano, apresentam um pH superior a 4,6. A sua preservao s possvel atravs de esterilizao (Codex Alimentarius 66/1981). Para alm destes 3 tipos de processamento de azeitona de mesa (mtodo Espanhol, mtodo Grego e mtodo Californiano) existem outras formas de processamento com menor expresso econmica mas que so caractersticas de determinadas regies. Em Portugal a azeitona galega mista fermentada naturalmente e inteira sendo uma das azeitonas de mesa mais caractersticas do pas. No caso do Algarve as azeitonas de mesa mais caractersticas so a azeitona madura no fermentada que desidratada em camadas de sal e a azeitona verde britada.

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1.2 Azeitona verde britadaOs frutos so colhidos antes da maturao e no so submetidas a tratamentos com NaOH, sendo fermentadas de modo a eliminar o sabor amargo, pelo menos parcialmente (GarridoFernndez et al., 1997). As azeitonas so colocadas directamente em salmoura e so preservadas por fermentao natural (IOOC, 2004). As azeitonas produzidas segundo este mtodo so apreciadas pelos consumidores pelas suas caractersticas organolpticas e por serem um produto natural (Garrido-Fernndez et al., 1997; Panagou et al, 2003; Panagou, 2006; Arroyo-Lpez, et al., 2007 e 2008a; Hurtado et al., 2008; Medina et al., 2008). O seu sabor completamente diferente das azeitonas tratadas com NaOH, sobretudo devido ao sabor amargo residual que se mantm mesmo depois um longo perodo em salmoura. No Algarve as azeitonas Maanilha verdes britadas (Figura 1.1) so o mtodo mais popular de produzir azeitonas de mesa. Tradicionalmente as azeitonas so esmagadas com uma pedra e so colocadas em salmoura de forma a diminuir o sabor amargo. Quando necessrio obter um efeito de preservao a salmoura mantida ou pode ser substituda vrias vezes no perodo at um ms, de modo a obter um produto pronto para consumo. Quando necessrio acelerar este processo, as azeitonas so lavadas vrias vezes em gua doce ou colocadas em sacos de rede em guas correntes como ribeiras antes de serem colocadas em salmoura. Um dos ingredientes mais importantes no processamento da azeitona de mesa britada o sal marinho utilizado na preparao da salmoura. As salinas podem ser encontradas ao longo de toda a costa Algarvia, com especial evidncia na zona de Castro Marim, Tavira e Faro. As azeitonas britadas podem ser temperadas aps a fermentao com alho, limo, nveda (ou erva das azeitonas), tomilho, orgos ou louro.

Figura 1.1. Azeitona Maanilha verde britada, antes do processamento (esquerda) e no fim do processamento (direita)

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1.2.1 Azeitona Maanilha A azeitona da variedade Maanilha (Olea europea pomiformis) tem uma forma esfrica, mais utilizada na produo de azeitona de mesa do que de azeite e uma variedade cujas azeitonas so susceptveis de sofrer danos na superfcie exterior quando sujeita a tratamento com NaOH, segundo o mtodo espanhol. Este fruto muito susceptvel a danos na epiderme que podem ocorrer durante a colheita ou transporte. Estas mazelas na superfcie da azeitona, mantm-se at depois do processo de fermentao (Kouraba et al., 2004; Segvia-Bravo et al., 2009). muito importante que na colheita e transporte da azeitona, os frutos sejam submetidos ao mnimo possvel de deteriorao. Quando as azeitonas caem no cho durante a colheita, quando so colocadas nas caixas onde so transportadas ou ainda durante o transporte ou recepo de produto ficam susceptveis a danos como feridas e manchas na superfcie do fruto. Os microrganismos podem infectar o produto atravs das feridas abertas e acelerar a sua deteriorao. Uma vez que os contedos celulares so expostos ocorrem reaces de oxidao e microrganismos patognicos podem penetrar atravs do local onde o produto fica exposto (Eskin e Robinson, 2001). Os danos fsicos a que a azeitona est constantemente sujeita no s aceleram a sua deteriorao como tambm diminuem o seu valor comercial. A integridade do fruto um dos factores determinantes na avaliao feita pelos consumidores no acto da compra de azeitona de mesa. Durante a fermentao de azeitona da variedade Maanilha o pH relativamente alto, superior a 4,5 (Kailis e Harris, 2007).

1.2.2 Produo industrial de azeitona verde britada A azeitona verde colhida entre Setembro e Outubro. O processamento industrial de azeitona verde britada foi resumido no fluxograma de produo (Figura 1.2) que se divide em trs etapas. A primeira fase inclui a recepo do fruto, a colocao em salmoura e o inicio da fermentao. A segunda fase tem como objectivo seleccionar e eliminar as azeitonas com defeitos e renovar a salmoura, o que permite eliminar e diluir os compostos das azeitonas presentes na salmoura, acelerando assim o processo de diminuio do amargor tpico das azeitonas verdes. A terceira fase compreende o embalamento e a distribuio do produto.

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Fluxograma de produo

Figura 1.2. Fluxograma de produo industrial da azeitona verde britada

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A azeitona verde recepcionada no cais de descarga onde colocada em caixas de plstico. ento pesada na plataforma de pesagem. Durante o dia, a azeitona vai sendo armazenada na zona do incio da linha de produo, sendo processada no fim do dia em que foi recepcionada, de modo a impedir que ocorra um amadurecimento excessivo ou perda de qualidade da matria prima. O processamento inicia-se com a etapa de lavagem da azeitona que previamente transferida para um tanque equipado com um tapete elevatrio. A eficincia desta operao determina o sucesso do processo fermentativo, sendo por isso importante remover eficazmente todo o tipo de matrias estranhas azeitona. O cloro removido da gua da rede de distribuio municipal por filtrao, de modo a garantir a sobrevivncia da microbiota presente na azeitona. Em seguida a azeitona passa num despedunculador que retira os pednculos e folhas ainda presentes nas azeitonas. Depois das duas primeiras etapas a azeitona passa num calibrador vibratrio, para separar e remover os frutos de calibre inferior, popularmente designado por perdigoto e que utilizado na produo de azeite. Posteriormente a azeitona escolhida manualmente, sendo retirada a azeitona com defeitos (esmagada, pisada, etc). Passa depois no calibrador de cordas, onde separada em funo dos calibres. Cai directamente nas britadeiras, onde esmagada entre duas placas de ao inoxidvel e fica assim pronta para a fermentao. A distncia entre as duas placas que britam a azeitona regulada em conformidade com o calibre da azeitona. Esta distncia deve ser suficiente para britar a azeitona sem esmagar o caroo. As azeitonas (80 Kg) so colocadas em bides de polietileno de alta densidade (200 L), so cobertas com salmoura e o bido fechado. O produto fica assim em estgio, durante um perodo que pode estender-se entre um ms a um ano. A salmoura utilizada nesta etapa tem uma concentrao de sal compreendida entre 5 a 10 % (p/v). A fermentao decorre temperatura ambiente. Antes de seguir para a fase de embalagem, a azeitona passa de novo no calibrador vibratrio, mas desta vez para eliminar caroos e metades. Procede-se de novo a uma escolha manual, onde eliminada a azeitona com defeitos. Se for necessrio produto para colocar no circuito de venda, a salmoura renovada de modo a diminuir o tempo de fermentao. A terceira fase do processo a embalagem, que normalmente decorre ou no prprio dia da distribuio ou no dia anterior. A azeitona retirada da segunda salmoura (manualmente com um escorredor) e embalada com orgos, louro, limo e alho. O lquido de cobertura utilizado na 9

embalagem uma salmoura com de 3 % de NaCl. As embalagens so ento distribudas podendo ser armazenadas durante um perodo mximo de 24 horas.

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1.3. Fermentao de azeitona de mesaA fermentao um processo bioenergtico de decomposio de substncias orgnicas, induzido por microrganismos ou por enzimas. A fermentao pode ser definida como uma alterao a nvel bioqumico em que a oxidao anaerbica ou parcialmente anaerbica dos hidratos de carbono levada a cabo por microrganismos ou enzimas de origem animal ou vegetal (Lopes et al., 1996). Na maioria dos vegetais, quando existem as condies ideais de humidade, concentrao de sal e temperatura ocorre uma fermentao cido lctica. O tipo de vegetal, a temperatura, os substratos disponveis, a concentrao de sal e o pH constituem alguns dos parmetros que determinam quais os grupos de microrganismos dominantes em cada fase do processo.

1.3.1. Caracterizao microbiolgica Nos frutos e vegetais, a populao microbiana presente, o tipo e a sua presena quantitativa dependem do solo, da gua, dos tipos de fertilizantes utilizados durante a produo e da qualidade do ar. So frequentemente identificadas bactrias pertencentes ao gnero Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Clostridium e Enterobacter (Ray, 2001). A microbiota de vegetais frescos tipicamente dominada por bactrias aerbias obrigatrias ou aerbias facultativas e leveduras, enquanto as bactrias lcticas constituem uma pequena fraco da populao inicial (Wood, 1998). As azeitonas podem ficar contaminadas com enterobactrias durante a colheita ou a lavagem (Spyropoulou et al., 2001) sendo este grupo de bactrias considerado um indicador da higiene durante o processamento. A salmoura utilizada na conservao de azeitonas, pode ser uma fonte de contaminao microbiolgica, devendo por isso ser preparada diariamente (Ray, 2001). Pode existir a tendncia de facilitar o trabalho dirio, preparando-se grandes quantidades de salmoura que pode no ser utilizada de imediato, ficando por isso susceptvel a contaminaes microbiolgicas, qumicas e fsicas desde que o tanque de armazenamento da salmoura no esteja correctamente fechado. Segundo vrios autores (Garrido-Fernndez et al., 1997; Sanchz et al., 2000 Panagou et al., 2006), a sucesso dos microrganismos durante a fermentao de azeitona verde caracterizada por um perodo inicial dominado por bactrias Gram negativas, principalmente enterobactrias, seguido por um crescimento de bactrias lcticas e leveduras e pela diminuio gradual das bactrias Gram negativas. Quando o nmero de bactrias lcticas superior ao nmero de leveduras, a fermentao lctica favorecida e obtm-se um produto com um valor pH baixo, inferior a 4,5. Quando acontece o contrrio, as azeitonas produzem um sabor mais suave com um pH acima dos 4,5 (Garrido

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Fernndez et al., 1997; Nychas et al., 2002; Tassou et al., 2002; Chammem et al., 2005; Panagou et al., 2006 e 2008). A maioria das populaes de bactrias lcticas encontradas em azeitonas verdes no tratadas com NaOH pertence ao gnero Lactobacillus, sobretudo L. plantarum e L. pentosus (Segvia-Bravo et al., 2007; Hurtado et al., 2008). Outros autores referem que a populao de bactrias lcticas neste tipo de azeitonas era constituda por L. brevis (50 %), L. casei e Enterococcus spp. (Randazzo et al., 2004). Na prtica, so muitos os factores que determinam o equilbrio da contribuio das vrias espcies de bactrias lcticas ao longo da fermentao, especialmente os parmetros intrnsecos do vegetal, a concentrao de sal utilizada, a temperatura e a capacidade tampo da salmoura (Hurtado et al., 2009). Muitas vezes, durante a fermentao espontnea de azeitonas Maanilha no tratadas com NaOH, as bactrias lcticas no so detectadas na salmoura (De la Torre et al., 1993; Oliveira et al., 2004). A inibio do crescimento deste tipo de bactrias atribuda presena de compostos antimicrobianos presentes na salmoura como por exemplo compostos fenlicos (Medina et al., 2008 e 2009). As leveduras desempenham um papel fundamental em todas as fermentaes de azeitonas, especialmente nas azeitonas naturais entre elas as processadas de acordo com o estilo Grego (Arroyo-Lpez et al., 2006). As leveduras predominantes na fermentao de azeitonas verdes, pertencem maioritariamente, aos gneros Candida, Pichia, Kluyveromyces, Cryptococcus e Saccharomyces (Arroyo-Lpez et al., 2006; Hernandz et al., 2007; Hurtado et al., 2008; Rodriguez-Gmez et al., 2010). Durante a fermentao ou armazenamento, as leveduras podem produzir compostos como etanol, glicerol, estrs e outros compostos volteis que influenciam directamente a textura e o desenvolvimento de aromas especficos de azeitonas fermentadas (Garrido-Fernndez et al., 1997). A capacidade de algumas leveduras para degradar os polissacardeos da parede celular do fruto constitui a causa mais importante da perda de textura do produto final. atribuda capacidade pectinoltica, as espcies de Cryptococcus spp. presentes sobretudo no fruto verde. Esta capacidade muito importante em leveduras como Debaryomyces hansenii, Candida rugosa ou Rhodotorula minuta que podem estar presentes durante a fermentao (Hernandz et al., 2007). Algumas leveduras isoladas em azeitonas verdes apresentam capacidade lipoltica, aumentado a quantidade de cidos gordos livres durante a fermentao. Alguns compostos volteis como o propanol e o 2-butanol so gerados por catabolismo de cidos gordos livres (Montao et al., 2003). Leveduras isoladas em azeitonas verdes como Saccharomyces cerevisiae e Pichia galeiformis no revelam capacidade lipoltica, contudo esta caracterstica muito pronunciado em estirpes de Candida boidinii (Marquina et al., 1992; Rodriguez-Gmez et al., 2010). 12

Hernandz et al. (2007) isolaram estirpes de Pichia anomala e Saccharomyces cerevisiae catalase positivas, sugerindo que as leveduras tambm possam ter um papel importante na conservao, protegendo o produto final da oxidao dos cidos gordos insaturados. Outra caracterstica tecnolgica atribuda a leveduras isoladas durante a fermentao de vegetais, a sua capacidade killer que lhes permite produzirem protenas txicas ou glicoproteinas, causando a morte a outras espcies sensveis (Schmitt e Breining, 2002). Estirpes isoladas durante a fermentao de azeitonas verdes, apresentaram uma capacidade killer bastante abrangente, sobretudo pertencentes s espcies Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces marxianus, Pichia guilliermondi, Pichia anmala e Saccharomyces cerevisiae (Hernandz et al., 2008). Pode existir formao de gs nas azeitonas, que se acumula entre a epiderme e a polpa do fruto, provocando uma separao das duas estruturas, abrindo fissuras ou formando bolhas. Esta ocorrncia conhecida popularmente por olho de peixe. A produo de gs est associada ao crescimento de bactrias coliformes, contudo se a fermentao for controlada correctamente em relao ao teor de NaCl e ao pH estes microrganismos no estaro presentes durante a fermentao de azeitonas. Em relao s leveduras produtoras de gs este problema no to fcil de controlar, uma vez que as leveduras esto naturalmente presentes em grande nmero nas azeitonas. GarridoFernndez et al. (1997) referem que leveduras pertencentes aos gneros Saccharomyces ou Pichia podem produzir grandes quantidades de gs.

1.3.2. Caracterizao fsico-qumica Os principais constituintes da polpa da azeitona so gua, lpidos e acares (GarridoFernndez et al., 1997). Os acares solveis so o componente mais importante em qualquer fermentao de azeitona constituindo a fonte de carbono primria que suporta o crescimento da microbiota presente. A maioria desses acares so acares redutores (Garrido-Fernndez et al., 1997). Os substratos contidos nas azeitonas difundem-se para a salmoura onde so degradados (Sanchz et al., 2000). No caso das azeitonas britadas esta difuso, assim como a difuso de NaCl para o interior do fruto, d-se mais rapidamente devido exposio dos tecidos internos do fruto provocada pela britagem (Arroyo-Lpez et al., 2007). Durante a fermentao, os microrganismos presentes usam os nutrientes das azeitonas, especialmente os acares, produzindo cidos que baixam o pH do produto (Hutkins, 2006; Cocolin e Ercolini, 2008). Consequentemente, a acidez da salmoura aumenta e o pH decresce sendo estes factores determinantes para uma fermentao bem sucedida e um produto seguro (Spyropoulou et al., 2001). Os cidos orgnicos produzidos pela microbiota durante a fermentao so fundamentais 13

contribuindo para o desenvolvimento de aromas caractersticos no produto final. Estes cidos em equilbrio com os seus sais actuam como um tampo estabilizando o pH da salmoura. Esta capacidade tamponizante pode no ser desejvel na medida em que no permite que durante a fermentao se obtenha o pH ptimo (Marsilio et al., 2008). Sendo assim os parmetros fsicoqumicos mais frequentemente utilizados na avaliao da qualidade de azeitonas de mesa so a acidez livre, o pH e a concentrao de NaCl. O aroma caracterstico das azeitonas fermentadas est relacionado com a presena de compostos volteis como hidrocarbonetos, lcoois, aldedos, cetonas, steres e outros compostos (Walker, 1998; Sabatini et al., 2008). A eliminao do sabor amargo nas azeitonas que no so tratadas com NaOH, d-se principalmente por diluio e hidrlise enzimtica dos compostos fenlicos presentes, dos quais o mais importante a oleuropeina (Arroyo-Lpez et al., 2007). A terminologia composto fenlico inclui um nmero muito grande de metabolitos secundrios dos vegetais. A maioria dos antioxidantes naturais, com excepo dos tocoferois, so compostos fenlicos (Ray, 2001). As -glucosidases e esterases presentes no fruto, catalizam a ruptura das ligaes glisosdicas e ligaes ster libertando hidroxitirosol das molculas de oleuropeina e do glicosideo hidroxitirosol. Os 3 compostos envolvidos na reaco so chamados compostos hidroxilicos, uma vez que tm um grupo hidroxil na sua estrutura (Ray, 2001; Arroyo-Lpez et al., 2007; Segvia-Bravo et al., 2009). A concentrao destes compostos decresce durante o processamento da azeitona verde, contudo a concentrao respectiva no diminui em todos os compostos fenlicos j a do grupo tirosol no se altera. A hidrlise da oleuropeina tambm acontece por hidrlise qumica mas em menor proporo (Segvia-Bravo et al., 2009). Esta reaco fundamental no desenvolvimento do sabor e nas reaces de escurecimento. Numa 2 fase o hidroxitirosol oxidado pela polifenoloxidase produzindo polmeros de cor escura (Segvia-Bravo et al., 2009). O escurecimento ocorre tambm devido troca de magnsio por hidrognio na molcula de clorofila o que resulta na perda de cor verde, devido produo de feofitinas que so castanhas (Martins e Silva, 2002; MnguezMosqura et al., 2004). As bactrias lcticas e tambm algumas espcies de leveduras fermentativas como Saccharomyces cerevisiae podem produzir a enzima -glucosidase (Ciafardini et al., 2001; Restuccia et al., 2002). As azeitonas so conhecidas por serem boas fontes de fitoesterois, escaleno, composto fenlicos e lpidos monoinsaturados que apresentam propriedades biolgicas desejveis. O consumo de polifenois benfico para a sade humana uma vez que a sua actividade antioxidante est associada com uma diminuio do risco de doenas cardacas resultante da proteco contra a 14

oxidao das lipoproteinas de baixa densidade. Testes realizados in vivo mostraram que aps a ingesto de azeitonas a concentrao de polifenois no sangue aumenta, provando que este compostos esto biodisponiveis (Andrikopoulos, 2010).

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1.4 Condies de armazenamentoO tempo de prateleira de alimentos o perodo durante o qual o produto mantm a sua qualidade ptima (Eskin e Robinson, 2001). A cor assim como a textura e o sabor desempenham um papel essencial na aceitao de um produto por parte do consumidor. Em geral, o nico factor que os produtores de azeitonas britadas utilizam para controlar o processo de fermentao a quantidade de NaCl adicionada. O sal aumenta a difuso de fluidos das clulas para a salmoura e confere um sabor caracterstico ao produto (Hui et al., 2004). No processamento de azeitonas de mesa, o NaCl essencial para a segurana e para o desenvolvimento do sabor caracterstico e estabilizao do produto final (Bautista-Gallego et al., 2010). A actividade da gua (aw), a temperatura e o pH so os factores mais importantes que determinam a taxa de deteriorao e o crescimento de microrganismos em alimentos (Eskin e Robinson, 2001). De acordo com o IOOC (2004), a salmoura usada na embalagem de azeitonas de mesa definida como uma soluo de sais em gua potvel, com ou sem a adio de outros ingredientes. A salmoura deve ser translcida, livre de ingredientes no autorizados e obedecer a regras de higiene especficas. So autorizados ingredientes como vinagre, azeite, aucares, matrias comestveis como cebola, pimentos, anchovas, especiarias e ervas aromticas ou extractos naturais e aromas (IOOC, 2004). As azeitonas submetidas a uma fermentao natural, devem apresentar uma percentagem mnima de 6% de NaCl, um pH mximo de 4,3 e uma percentagem de cido lctico de 0,3 % (p/v), as azeitonas e a salmoura devem estar isentas de qualquer tipo de degradao microbiana, e estar livres de microrganismos patognicos e metabolitos produzidos pelos mesmos. O volume de produto coberto com salmoura no deve nunca ocupar menos de 90% do volume total do recipiente de embalagem (IOOC, 2004). Os microrganismos de referncia na pasteurizao de azeitonas de mesa so as bactrias produtoras de cidos propinicos, com uma temperatura de referncia de 62,4C e um valor de (Z) de 5,25 C. Estes microrganismos esto relacionados com o aparecimento do efeito designado por zapatera. Tm a capacidade de utilizar o cido lctico no seu metabolismo produzindo cido propinico, cido actico e CO2, podendo levar a um aumento de pH, o que favorece o crescimento de espcies de Clostridium. Este tipo de degradao caracteriza-se por um odor amanteigado desagradvel e muito forte, pode ocorrer sobretudo quando o pH superior a 4,5 e quando a concentrao de NaCl baixa (Garrido-Fernndez et al., 1997). Este fenmeno frequente, sobretudo em azeitonas colocadas directamente em salmoura e fermentadas naturalmente, foi associado presena de cidos gordos de cadeia curta (Montao et al., 1992).

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Entre os aditivos autorizados pelo IOOC (2004) a ser utilizados em azeitonas de mesa encontram-se conservantes (cido srbico e o cido benzico), acidificantes (cido lctico, cido ctrico e cido tartrico), antioxidantes, agentes de firmeza (clcio) e coadjuvantes tecnolgicos como culturas starter, CO2, hidrxido de sdio e cido hidroclordrico. Uma das formas de regular o pH a adio de cidos orgnicos fracos. Quando um cido orgnico fraco adicionado a um alimento, algumas molculas dissociam-se, dependendo do pH e pK do alimento e da temperatura. Como resultado, a concentrao de ies H + no ambiente interfere com os mecanismos celulares dos microrganismos (Lambert e Stratford, 1999).Tabela I- pK de alguns acidificantes e conservantes autorizados em azeitonas de mesa

cido Actico Propinico Lctico Ctrico Srbico Benzico

pK 4.8 4.9 3.8 3.1 4.8 4.2

% Dissociada a pH 4 5 6 15.5 65.1 94.9 12.4 58.3 93.3 60.8 93.9 99.3 81.8 99.6 >99.1 18.0 70.0 95.9 40.7 87.2 98.6

Funo Acidificante Acidificante Acidificante Acidificante Conservante Conservante

Concentrao mxima permitida IOOC (2004) BPF 15 g/kg 15 g/kg 0.5 g/kg 1 g/kg

Os cidos benzico e srbico so frequentemente utilizados como conservantes em azeitonas de mesa, tendo o cido srbico demonstrado maior eficcia na inibio de leveduras. Em azeitonas fermentadas naturalmente e sem tratamento trmico, a levedura Issatchenkia occidentalis mostrou grande resistncia a conservantes podendo ser tomado em conta como microrganismo alvo neste tipo de produto (Arroyo-Lpez et al., 2006). Um dos problemas observado durante o perodo de conservao de azeitonas no tratadas com NaOH prende-se com a instabilidade do produto, demonstrada pelo aparecimento de contentores dilatados, derrames de salmoura e escurecimento devido a alteraes fsico-qumicas e actividade microbiolgica. Este facto est relacionado com a produo de CO 2 originado pela respirao dos frutos durante os primeiros dias de armazenamento, com uma elevada concentrao de acares residuais e pela presena de microrganismos em nmero elevado (Arroyo-Lpez et al., 2009). Este problema pode ser minimizado por lavagens adicionais do fruto que diminuem a concentrao de acares e de compostos fenlicos, diminudo tambm a actividade microbiana e as reaces de escurecimento, contudo as lavagens podem tambm aumentar o pH e diminuir a acidez uma vez que os cidos em soluo na salmoura so descartados (Arroyo-Lpez et al., 2007). Quando a azeitona britada, as trocas osmticas entre a polpa e a soluo envolvente so facilitadas, permitindo que 17

apenas com uma lavagem, se reduza a concentrao de acares e compostos fenlicos em cerca de 50% (Arroyo-Lpez et al., 2008a). A imerso de azeitonas previamente processadas em salmoura, numa soluo cida, mostrou ser eficaz na preveno da oxidao dos compostos fenlicos minimizando os efeitos do escurecimento enzimtico e oxidativo (Segvia-Bravo et al., 2010).

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2- Caracterizao fsico-qumica e microbiolgica da fermentao industrial de azeitona verde britada

2.1. Materiais e mtodos2.1.1. Colheita de azeitonas As azeitonas utilizadas neste trabalho de investigao foram colhidas manualmente no fim do ms de Outubro de 2008 por pequenos produtores da regio de Tavira e transportadas pelos produtores at fbrica em caixas, baldes ou cestos. O nmero de produtores habituais que fornecem azeitona Maanilha empresa Hlder Madeira Indstria e Comrcio de Azeitonas, Unipessoal, Lda muito elevado, sendo por isso difcil garantir a uniformidade da matria prima.

2.1.2. Metodologia de produo As azeitonas transportadas e entregues na fbrica foram pesadas e no fim do dia de recepo deu-se incio ao processamento que tem inicio com uma lavagem com gua de rede desprovida de cloro. Foram retirados os pednculos e folhas, em seguida foram calibradas onde foram removidos os calibres demasiado pequenos. Posteriormente foram escolhidas manualmente, de modo a eliminar as azeitonas com defeitos. Antes de serem britadas, as azeitonas foram calibradas num calibrador de cordas. A britagem foi realizada por esmagamento entre duas placas de ao inoxidvel. Imediatamente a seguir britagem as azeitonas foram transportadas num tapete rolante e caem para bides de polietileno de alta densidade, com a capacidade de 200 L. Em cada bido foram colocados cerca de 80 kg de azeitonas, que foram posteriormente cobertas com salmoura. Os bides so fechados e mantidos temperatura ambiente. Foram estudados dois processos fermentativos: Processo A (PA): o teor inicial de sal na salmoura era cerca de 6% (p/v) sendo a salmoura substituda ao 36 dia de fermentao (55 dias). Processo B (PB): o teor inicial de sal na salmoura era cerca de 8% (p/v) tendo-se mantido a mesma salmoura at ao final da fermentao (77 dias).

2.1.3. Recolha de amostras As amostras de salmoura e das azeitonas foram recolhidas de acordo com o plano de amostragem estabelecido (Tabela II) de forma a acompanhar a evoluo do processo fermentativo.

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Tabela II- Plano de amostragem

Dia de recolha de amostras Processo A 1 3 6 8 10 15 17 21 24 29 36 38 43 45 49 52 Processo B 1 3 6 8 10 15 17 21 24 29 38 45 52 56 65 73

A recolha das amostras de salmoura foi efectuada, em condies de assepsia, usando um tubo de plstico (0,5 m de comprimento) desinfectado com uma soluo de hipoclorito de sdio. As amostras foram colhidas a um tero da altura do recipiente de armazenamento (bido) (Fig. 2.1) e colocadas em tubos falcon de 50 mL e transportadas para o Laboratrio de Microbiologia no Instituto Superior de Engenharia (Universidade do Algarve) em condies de refrigerao (5 C). Estas amostras foram utilizadas para o estudo microbiolgico, medio de pH, da acidez e da concentrao de NaCl. Foram tambm recolhidas amostras de azeitonas com colheres de plstico desinfectadas. Estas amostras de azeitonas foram colocadas e transportadas em sacos de stomacher estreis e foram usadas na determinao da cor.

Figura 2.1. Localizao do ponto de recolha das amostras de salmoura nos fermentadores utilizados: esquerda- vista lateral; direita- vista superior

Aps a recolha, os bides foram imediatamente fechados permanecendo assim at recolha da amostra seguinte. O procedimento de recolha foi idntico para os dois processos de fermentao. De cada amostra retirou-se 6 mL de salmoura que foram centrifugados a 10 000 r.p.m durante 10 minutos temperatura de 4 C e o sobrenadante foi congelado (-20 C). Estas amostras foram usadas na determinao de acares e compostos fenlicos.

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2.1.4 Parmetros microbiolgicos Aps a homogeneizao da salmoura recolhida, efectuou-se uma srie de diluies decimais sucessivas utilizando soluo de Ringer (Merck) como diluente. Posteriormente, procedeu-se inoculao nos meios de cultura adequados, para determinar a microbiota total, as contagens de leveduras, fungos filamentosos, bactrias lcticas e enterobactrias. Contagem da microbiota total a 30C Procedeu-se inoculao por espalhamento, em duplicado, de 0,1 mL de cada uma das diluies decimais na superfcie do meio de cultura Tryptic Soy Agar, pH 5 (TSA-Scharlau). As placas foram incubadas a 30 C durante 5 dias. Contagem de leveduras Procedeu-se inoculao por espalhamento, em duplicado, de 0,1 mL de cada uma das diluies decimais na superfcie do meio de cultura Malt Extract Agar, pH 5 (MEA-Scharlau). As placas foram incubadas a 25 C durante 5 dias. Contagem de fungos filamentosos Procedeu-se inoculao por espalhamento, em duplicado, de 0,1 mL de cada uma das diluies decimais na superfcie do meio de cultura Rose Bengal Chloramphenicol Agar, pH 5 (Biokar Diagnostics). As placas foram incubadas a 25 C durante 5 dias. Contagem de bactrias lcticas Procedeu-se inoculao por incorporao em duplicado de 1 mL de cada uma das diluies decimais no meio de cultura Man, Rugosa and Sharpe Agar, pH 5 (MRS-Oxoid) com cicloheximida (0,05 %). Aps inoculao e solidificao cobriu-se o meio de cultura com uma camada do mesmo meio. As placas foram incubadas a 30 C durante 5 dias. Contagem de enterobactrias Procedeu-se inoculao por espalhamento de 0,1 mL de cada uma das diluie decimais, em duplicado, na superfcie do meio de cultura Chromocult Agar, pH 5 (Oxoid). As placas foram incubadas a 37 C durante 2 dias.

2.1.4.1. Isolamento e identificao de leveduras Aps contagem das leveduras nas placas de MEA e de Rose Bengal, seleccionaram-se as colnias isoladas e repicaram-se para placas com Potato Dextrose Agar (PDA-Scharlau). Aps 2 dias de incubao a 25 C foram observadas ao microscpio para verificar que se tratavam de leveduras e se eram colnias puras. Sempre que necessrio, repicou-se novamente para assegurar a pureza das culturas.

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Manuteno das culturas de leveduras As culturas de leveduras isoladas em PDA foram conservadas a temperatura de refrigerao, em tubos inclinados do mesmo meio. As leveduras foram repicadas para novo meio de cultura com intervalos de 30 dias. Identificao de leveduras A classificao e identificao fenotpica de leveduras tem sido baseada em caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas. Mais recentemente, tm sido desenvolvidos vrios mtodos baseados na biologia molecular que permitem a identificar algumas leveduras. Contudo, as bases de dados existentes at data no permitem identificar um nmero elevado de espcies. Neste trabalho, as leveduras foram identificadas de acordo com o mtodo utilizado por Esteve-Zarzoso et al. (1999): amplificou-se a regio 5.8S-ITS do rRNA, utilizando os primers ITS1 e ITS4; os produtos da reaco de PCR foram digeridos pelas endonucleases CfoI, HaeIII e HinfI, originando padres de restrio nicos para cada espcie. Utilizou-se tambm a sequenciao da regio D1/D2 do gene 26S rRNA para realizar confirmaes e sempre que o RFLP no permitiu realizar a identificao. Extraco de DNA As leveduras cresceram em meio de cultura lquido yeast malt (0,5 % peptona, 0,3 % extracto de levedura, 0,3 % malte, 1% glucose), a 25 C durante 16 h com agitao numa incubadora orbital (IKA KS 4000i). As culturas foram centrifugadas a 12000 rpm a 4 C durante 5 minutos numa centrfuga (Eppendorf 5415 R). Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 2 mL de gua destilada ultra pura estril. Procedeu-se novamente a uma centrifugao a 12000 rpm a 4 C durante 5 minutos. Adicionou-se ao pellet 500 l de uma soluo de sorbitol 0,9 M e 35 l de uma soluo de zymolyase 1 mg/mL. Aps agitao, incubou-se a 37 C durante 60 minutos, posteriormente centrifugou-se novamente a 12000 rpm a 4 C durante 5 minutos. Substituiu-se o sobrenadante por 500 l de uma soluo de 50 mM Tris HCl, 20 mM EDTA e adicionou-se ainda 13 l de uma soluo SDS (dodecil sulfato de sdio) a 10 %. Posteriormente, agitou-se e incubouse durante 5 minutos a 65 C. Adicionou-se 200 l de acetato de potssio 5 M e colocou-se em gelo durante 10 minutos. Centrifugou-se 15 minutos a 13000 rpm a 4 C. Retirou-se o sobrenadante para um novo microtubo contendo 700 l de isopropanol (-20 C) e incubou-se novamente temperatura ambiente (cerca de 20 C) durante 10 minutos. Aps uma nova centrifugao durante 15 minutos a 4 C a 12000 rpm, retirou-se o sobrenadante e lavou-se o pellet com etanol a 70 %. Efectuou-se uma nova centrifugao durante 3 minutos a 4 C a 12000 rpm e retirou-se cuidadosamente o etanol e o seu excesso com um papel absorvente. Deixou-se evaporar o etanol a 37 C. Ressuspendeu-se o 22

DNA em 50 l de gua destilada ultra pura estril e armazenou-se a -20 C. Esta soluo foi diluda de 1:4 quando utilizada nas reaces de PCR. Reaco em cadeia da polimerase (PCR) A amplificao da regio 5.8S-ITS realizou-se de acordo com Esteve-Zarzoso et al. (1999). Para tal utilizaram-se os primers ITS1 (0,5 M) (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) e ITS4 (0,5 M) (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC.3) (White et al., 1990). Prepararam-se as reaces de PCR num volume de 100 l de acordo com a Tabela III. Distribuiu-se 97 l da mix em cada tubo de PCR e adicionou-se 3 l de DNA a cada um.Tabela III Reagentes utilizados na mistura para PCR (Mix)

Reagentes Concentrao Volume (L) Primer forward ITS 1 0,5 M 2 Primer reverse ITS 4 0,5 M 2 Desoxiribonucletidos 10 M 10 MgCl2 1,5 mM 10 DNA polimerase 5 unidades 1 Tampo do enzima 1x 20 gua ultra pura estril 52 DNA 3 Total 1000 A amplificao decorreu num termociclador (Thermo Electrons Px2 Thermal Cycler) atravs de um passo de desnaturao inicial a 94 C durante 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturao a 95 C durante 1 minuto, annealing a 55,5 C durante 2 minutos e extenso a 72 C durante 2 minutos. No final ocorreu um passo de extenso a 72 C durante 10 minutos. Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose (1 %) em TAE (1X) contendo 5 l de brometo de etdio. Os tamanhos dos fragmentos de DNA obtidos foram estimados por comparao com um marcador de DNA (100 bp Ladder, Biorad). Aps a electroforese (100 V), os gis foram visualizados no sistema G-Box Syngene- Genesys 10 UV Scanner. Anlise de polimorfismos de fragmentos de restrio (Restriction Fragment Length Polymorphisms - RFLPs) Os produtos resultantes das reaces de PCR (uma aliquota constituda por 13 l) foram digeridos com as endocucleases de restrio Cfo I, Hae III e Hinf I (Bioron). As misturas foram incubadas 12 h horas, a 37C e os fragmentos de restrio foram separados em gis de agarose 3 % em tampo TAE (1x). Aps electroforese (130 V) os gis foram corados com brometo de etdio (1,5 mg/L) e visualizados no sistema G-Box Syngene- Genesys 10 UV Scanner. Os tamanhos dos 23

fragmentos de DNA resultantes da restrio foram estimados por comparao com um marcador de DNA (100 bp Ladder, Biorad). Os perfis de restrio obtidos foram gravados e comparados com os publicados (Guillmon et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Sabate et al., 2002; Llanos-Frutos et al., 2004; Arroyo-Lpez et al., 2006).

2.1.5 Parmetros fsico-qumicos Determinao de pH A determinao do pH foi realizada por medio directa utilizando um potencimetro (Hanna Instruments, HI 8424). Antes da determinao do valor de pH de cada amostra o aparelho foi calibrado, utilizando duas solues padro, de pH 4 e de pH 7. Determinao de acidez total da salmoura Pesaram-se 10 g de salmoura e adicionaram-se 50 mL de gua destilada e procedeu-se titulao com uma soluo de NaOH 0,1 N, utilizando como indicador, uma soluo de fenolftalena 1%. A acidez foi expressa em gramas de cido lctico por 100 mL de salmoura. Determinao da concentrao de NaCl na salmoura A determinao de NaCl foi realizada por medio directa utilizando um medidor de salinidade (Hanna Instruments, HI 98203). Antes da determinao da percentagem de sal de cada amostra o aparelho foi calibrado, utilizando uma soluo padro com 30 g/L de NaCl. Determinao de acares redutores A concentrao de acares redutores na salmoura foi determinada pelo mtodo do cido dinitro saliclico (DNS). Adicionou-se 1 mL de DNS a 1 mL da diluio adequada de salmoura. Depois de 5 minutos em banho de gua a 100 C foi lida a absorvncia, a 540 nm, num espectofotmetro (GenesysTM

10 series), utilizando gua destilada como branco. As concentraes

foram calculadas usando uma curva de calibrao de glucose (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 g/L) (Maldonado et al., 2008). Determinao de compostos fenlicos Foi utilizado o mtodo de Folin-Ciocalteau para determinar a concentrao total de compostos fenlicos na salmoura. Adicionou-se a 0,2 mL de cada amostra na diluio adequada, 1 mL de reagente de Folin-Ciocalteau (0,5 N) e 0,8 mL de soluo saturada de carbonato de sdio (7,5 %). Depois de 30 minutos, ao abrigo da luz, foi lida a absorvncia a 765 nm. Utilizou-se uma curva de calibrao de cido glico com concentraes compreendidas entre 0-0,1 g/L. Para as diluies de cido glico e para o branco utilizou-se uma soluo com 3% de NaCl (Huang et al., 2006).

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Determinao da cor Utilizou-se um colormetro (Dr Lange Spectro-colour, Neutex, spectral- QC, Espanha) para avaliao da cor na superfcie das azeitonas. A cor foi medida em termos dos parmetros L (luminosidade; L= 100 branco, L= 0 preto) a (-a: verde, +a= azul) e b (-b= azul, +b = amarelo). Em cada ponto de anlise foram usadas 3 azeitonas e foram efectuadas 6 medies em cada azeitona (Martins e Silva, 2002).

2.1.6 Anlise estatstica Os resultados das anlises microbiolgicas e fsico-qumicas resultam da mdia de duas determinaes em cada ponto de amostragem, excepto para a cor onde resultam da mdia de 6 medies em cada uma das 3 amostras

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2.2 ResultadosAo longo das duas fermentaes de azeitonas verdes britadas (PA e PB), foram observadas alteraes microbiolgicas e fsico-qumicas na salmoura, que se encontram registadas no presente Captulo. 2.2.1 Parmetros microbiolgicos O crescimento da microbiota na salmoura da fermentao do PA e do PB est representada na Figura 2.2.8 7 6 log ufc/mL 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

A

Tempo (dia)8 7

B

6log ufc/mL 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tempo (dia) Figura 2.2. Crescimento da microbiota durante a fermentao de azeitonas verdes britadas, PA (Figura 2.2A) e PB (Figura 2.2B). Contagem de microrganismos totais a 30C (), leveduras (), fungos filamentosos () e Enterobacteriacea ()

Como possvel observar nas figuras 2.2A e 2.2B o nmero de unidades formadoras de colnias por mililitro de salmoura (ufc/mL) de microrganismos mesfilos totais e de leveduras, manteve-se estacionrio durante os primeiros 8 dias, tendo-se observado de seguida uma fase de 26

crescimento exponencial, atingindo a fase estacionria aps 20 dias de estudo. A populao de leveduras atingiu valores de 6,0 e 6,5 log 10 ufc/mL de salmoura, no Processo A e B, respectivamente. Em relao populao de fungos filamentosos, foi possvel observar a sua presena desde o inicio das 2 fermentaes estudadas. Contudo, esta populao foi diminuindo at cerca do dia 40 do estudo. A partir da atingiu o valor de 1 ufc/mL de salmoura, tendo-se mantido constante at ao final do estudo. A populao de enterobactrias foi detectada (2,6-3,5 ufc/ mL de salmoura) durante os primeiros 30 dias de fermentao. Seguidamente observou-se um declnio e no foi possvel contabilizar colnias a partir do dia 49 na Fermentao A e do dia 38 na Fermentao B. O nmero de bactrias lcticas nas duas fermentaes foi inferior a 1 ufc/ mL de salmoura.

2.2.1.1 Identificao de leveduras No decurso das fermentaes A e B, foram identificados respectivamente 62 e 47 isolados de leveduras na salmoura. A amplificao da regio 5,8S rRNA-ITS permitiu obter bandas com tamanho compreendido entre 450 bp (Pichia galeiformis) e 850 pb (Saccharomyces cerevisiae). A identificao de cada isolado est registada na Tabela IV, onde possvel consultar o tamanho em (pb) dos amplificados e dos fragmentos obtidos pelas endonucleases de restrio (CfoI, Hae III e Hinf).

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Tabela IV- Frequncia do nmero de espcies de leveduras isoladas no PA e no PB

Espcies identificadas A Rhodotorula mucilaginosa Candida diddensiae Candida oleophila Aureobasidium pullulans Candida quercitrusa Candida boidinii Zygotorulaspora mrakii Pichia galeiformis Saccharomyces cerevisiae Citeromyces matritensis 620 630 640 580 600 720 660 450 850

Perfil de restrio Cfo 1(HaspA I) 300+250+100 280+160+120 280+280 170+170+90 280+205 320+300+90 300+300 220+100+80 400+320+140 Hae 111 (bsur1) 420+210 410+120+90 410+140+85 450+140 400+120+90 700 400+100+80 300+90+80 Hinf I 330+220+90 310+310 310+310 270+170+120 300+190+110 350+190+160 320+190+120 220+190

Processo de fermentao (nmero de isolados) PA PB 1 3 1 1 3 38 1 10 4 62 3 6 47 1 4 1 4 1 27 Soma 2 7 1 5 2 3 65 1 13 10 109 (%) 1,8 6,4 0,9 4,6 1,8 2,8 59,6 0,9 11,9 9,2

330+250+190+140 380+360+120 420+200+100 400+320 Total

700 320+200+100+80

As estirpes identificadas na salmoura da Fermentao A pertencem s espcies Rhodotorula mucilaginosa, Candida diddensiae, Aureobasidium pullulans, Candida quercitrusa, Candida boidinii, Zygotorulaspora mrakii, Pichia galeiformis, Saccharomyces cerevisiae, Citeromyces matritensis. Na fermentao B foram identificadas Rhodotorula mucilaginosa, Candida diddensiae, Aureobasidium pullulans, Candida quercitrusa, Candida oleophila, Zygotorulaspora mrakii, Saccharomyces cerevisiae e Citeromyces matritensis. Todas as espcies isoladas foram identificadas. Na figura 2.3 apresenta-se a fotografia de um gel de RFLP aps a colorao com brometo de etdio (1,5 mg/L) dos perfis correspondentes a trs espcies A. pullulans, C. quercitrusa e Cit. matritensis. O perfil de RFLP da espcie C. quercitrusa no constava na bibliografia disponvel (Guillmon et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Sabate et al., 2002; Llanos-Frutos et al., 2004; Coton et al., 2006; Arroyo-Lpez et al., 2006) tendo sido identificado apenas por sequenciao.

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A. pullulans

C. quercitrusa

Cit. matritensis

Figura 2.3. Exemplo de perfis obtidos por RFLP de trs estirpes identificadas durante a fermentao de azeitonas verdes britadas. L1- Marcador de peso molecular (100-1000 pb); L2- Amplificado estirpe 1; L3- digerido Cfo I; L4- digerido Hae III; L5- digerido HinfI; L6- Marcador de peso molecular (100-1000 pb); L7- Marcador de peso molecular (1001000 pb); L8- Amplificado estirpe 2; L9- digerido Cfo I; L10- digerido Hae III; L11- digerido HinfI; L12 - Marcador de peso molecular (100-1000 pb); L13- Marcador de peso molecular (100-1000 pb); L14- Amplificado estirpe 2; L15 digerido Cfo I; L16- digerido Hae III; L17- digerido HinfI; L18 - Marcador de peso molecular (100-1000 pb)

A sucesso de leveduras ao longo do tempo no PA e no PB est representada na Tabela V.Tabela V- Sucesso de leveduras ao longo do tempo no PA e no PB

possvel verificar que Zygotorulaspora mrakii a levedura dominante ao longo de todo o processo e a nica presente no final das duas fermentaes estudadas.

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2.2.2 Parmetros fsico-qumicos Na Tabela VI pode observar-se que durante os dois processos fermentativos os valores de pH desceram gradualmente durante o primeiro ms de fermentao. No Processo A, os valores de pH estabilizaram entre 4,4 - 4,3 at ao fim da fermentao. Por sua vez, no Processo B o valor final do pH atingiu o valor de 4,5 no dia 73 de fermentao, comparativamente mais elevado que no Processo A. A acidez total no final do Processo A variou entre 0,30 e 0,33 g cido lctico/100 mL salmoura e no final do processo B entre 0,51 e 0,54 g cido lctico/100 mL salmoura. A concentrao de NaCl no Processo A decresceu de 6,0 para 5,2 g NaCl/ 100 mL de salmoura no dia 36 de fermentao. No dia 36 de fermentao a salmoura do Processo A foi renovada, apresentando assim no dia 38 uma concentrao de NaCl de 7,1 g NaCl/ 100 mL e no dia em que o produtor considerou o processo terminado apresentou 4,3 g NaCl/ 100 mL. No processo B a concentrao inicial de NaCl era de 8,4 g NaCl/ 100 mL tendo atingindo o equilibro entre 3,4 e 4 g NaCl/ 100 mL no final da fermentao.Tabela VI- Resultados de pH, Acidez total e concentrao de NaCl na salmoura, no PA e no PB.

Tempo (dia) 1 3 6 8 10 15 17 21 24 29 36 38 43 45 49 52 56 65 73

pH A 4.69 4.66 4.67 4.48 4.46 4.50 4.46 4.39 4.41 4.35 4.40 4.33 4.38 4.40 4.34 4.34 B 4.59 4.63 4.65 4.39 4.42 4.48 4.52 4.34 4.34 4.25 4.36 4.39 4.35 4.35 4.43 4.46

Acidez NaCl (g/ 100 mL) (g/ 100 mL) A B A B 0.37 0.31 0.39 0.38 6.0 8.4 0.43 0.41 5.2 7.6 0.47 0.41 5.5 7.2 0.58 0.49 5.4 6.9 0.54 0.50 4.6 5.9 0.57 0.50 4.7 4.4 0.65 0.54 4.7 4.4 0.62 0.55 4.5 4.7 0.56 0.58 4.9 4.8 0.57 5.2 0.32 0.56 7.1 4.3 0.32 6.4 0.32 0.55 5.9 4.8 0.33 5.1 0.30 0.53 4.3 4.0 0.56 3.4 0.51 3.6 0.54 3.8

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A evoluo da concentrao de acares redutores na salmoura encontra-se registada na Figura 2.4.18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tempo (dia)

Acares redutores (g/L)

Figura 2.4. Evoluo da concentrao de acares redutores na salmoura ao longo do PA ( ) e do PB ( ).

Observa-se na Figura 2.4 que a concentrao inicial de acares redutores na salmoura aumentou nos dois processos fermentativos, no PA at ao dia 10 e no PB at dia 17. No PA depois da renovao da salmoura a concentrao de acares redutores decresceu atingindo valores 2 g/L de salmoura, no final da fermentao. No PB, depois do dia 17 de fermentao a concentrao de acares redutores na salmoura foi decrescendo de forma constante, tendo este fermentao terminado com 4,5 g/L de salmoura. A evoluo da concentrao de compostos fenlicos na salmoura encontra-se registada na Figura 2.5.Concentrao compostos fenlicos (g cido glico /L) 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tempo (dias)

Figura 2.5. Evoluo da concentrao de compostos fenlicos na salmoura ao longo do PA ( ) e do PB ( ).

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Na Figura 2.5 verifica-se que durante a fermentao do PA, a concentrao de compostos fenlicos na salmoura aumentou at 5 g/L no dia 8 de fermentao, tendo ento estabilizado at renovao de salmoura no dia 36 de fermentao, depois do que a concentrao se manteve constante em 3 g/L salmoura. Em relao ao Processo B a concentrao de compostos fenlicos na salmoura aumentou at ao dia 15 de fermentao e em seguida manteve-se constante com valores de 4 g/L at ao final do processo.

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A evoluo dos canais de cor (parmetros L, a e b) est representada na Figura 2.670 60 50 40 L 30 20 10 0 0 4 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

A

B10 20 30 40 50 60 70 80 90

-10 -2 0-4 a -6

-8-10 -12 -14

30 25 20 15 10 5 0 b

C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Tempo (dia) Figura 2.6. Evoluo dos parmetros de cor L (Figura 2.6A), a (Figura 2.6B), e b (Figura 2.6C), na superfcie das azeitonas ao longo de fermentao do PA () e do PB ()

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O parmetro L (luminosidade) na superfcie das azeitonas em ambos os processos, sofreu uma diminuio inicial at ao 36 dia de fermentao, tendo-se mantido constante a partir da (Fig 2.6a) os valores variaram entre 60,3 e 45,9 na Fermentao A e entre 60,3 e 57,4 na Fermentao B. Registou-se o mesmo perfil de comportamento em relao ao parmetro de cor b (azul-amarelo), que inicialmente apresentava valores de 24,7 e no final era de 17,4 e 14,8 no Processo A e B respectivamente (Fig. 2.6b). Em relao ao parmetro a (verde-vermelho), verificou-se um valor inicial no fruto verde de -10,02, e um valor final no Processo A e no Processo B de 0,4 e 0,9 respectivamente (Fig. 2.6c). Nos dois processos de fermentao o valor deste parmetro variou bastante afastando-se da zona da cor verde para a zona dos vermelhos e castanhos.

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2.3. Discusso de resultadosNeste trabalho estudou-se a evoluo de parmetros microbiolgicos e fsico-qumicos na salmoura de duas fermentaes de azeitona verde britada (Processo A e Processo B). No Processo A, a salmoura foi renovada ao 36 dia de fermentao, tendo o produtor assumido que o produto estava pronto para comercializao a partir do 55 dia de fermentao, data em que terminou o estudo deste processo. No caso da Processo B a salmoura no foi renovada por opo do produtor, este produto ficou pronto para venda a partir do 77 dia de fermentao, data em que foi iniciado o estudo descrito no captulo seguinte. Em relao evoluo da microbiota ao longo dos dois processos de fermentao, observouse que as leveduras constituam o grupo dominante, atingindo populaes com valores na ordem de 6 e 7 log 10 ufc/mL de salmoura, respectivamente no Processo A e no Processo B. Segundo Garrido-Fernndez et al. (1997) as leveduras podem estar presentes durante todo o processo fermentativo atingindo valores entre 4 e 6 log 10 ufc/mL de salmoura. Hurtado et al. (2008) em relao a fermentao de azeitonas Arbequina observaram que as leveduras eram o grupo dominante do processo fermentativo com valores de 6 log 10 ufc/mL de salmoura, enquanto Arroyo-Lpez et al. (2007) estudaram azeitonas directamente colocadas em salmoura sem prtratamento com NaOH (11% NaCl,) e registaram valores de 6,5 log 10 ufc/mL de salmoura. Hernandz et al. (2007) registaram contagens de 5,0 log ufc/mL de leveduras no final do processo fermentativo. A importncia das leveduras em azeitonas verdes sem tratamento alcalino foi tambm reportada por Hernandz et al. (2007); Arroyo-Lpez et al. (2008) e por Hurtado et al. (2008). Neste tipo de produtos as leveduras tm um papel muito importante no desenvolvimento de sabores e aromas, uma vez que durante o seu metabolismo produzem compostos como lcoois, acetato de etilo, acetaldeo e cidos orgnicos (Hernandz et al., 2007; Arroyo-Lpez et al., 2008). Algumas espcies esto associadas hidrlise de oleuropeina catalisada pela enzima -glucosidase (Ciafardini e Zullo, 2002). A dominncia deste grupo pode ser explicada pela sua tolerncia aos compostos fenlicos e s concentraes de NaCl usadas no processamento de azeitona (ArroyoLpez et al., 2009). A populao de fungos filamentosos diminuiu at atingir um valor constante de 1 log ufc/mL nos dois processos estudados. Quando no so exequveis condies de anaerobiose podem crescer fungos na superfcie do recipiente de fermentao como Penicillium e Aspergillus. Estes fungos podem provocar alteraes de textura ou sintetizar compostos ftidos (Garrido-Fernndez et al., 1997; Hutkins, 2006). Observou-se que a populao de enterobactrias presente nas salmouras decresceu desde o incio dos dois processos estudados e no foram encontradas colnias destes microrganismos 35

pertencentes famlia Enterobacteriacea a partir do dia 49 na Fermentao A e do dia 38 na Fermentao B. Arroyo-Lpez et al. (2007) e Hurtado et al. (2008) mostraram que em fermentaes das variedades Arbequina e Maanilha-Alorea as enterobactrias apresentavam uma evoluo crescente no inicio dos processos seguida pelo seu desaparecimento. O mesmo perfil de crescimento foi descrito por Chorianopoulos et al. (2005). Contagens muito elevadas de enterobactrias representam um risco devido produo de compostos que alteram o sabor do produto final e produo de gs que pode dar origem a um problema muito comum descrito em azeitonas de mesa e que consiste na formao de bolhas de gs entre a polpa e a epiderme do fruto. Este problema vulgarmente conhecido como olho de peixe (Garrido-Fernndez et al., 1997). As enterobactrias so um microrganismo indicador de boas prticas de fabrico, logo a sua ausncia no final da fermentao sugere boas condies de higiene ao longo do processamento. No foram detectadas colnias viveis de bactrias lcticas. Vrios autores estudaram a possibilidade de populaes deste grupo de microrganismos serem inibidas pelos compostos fenlicos presentes na salmoura durante a fermentao de azeitonas verdes naturais. Quando as azeitonas so submetidas a um pr-tratamento com NaOH, este composto penetra na polpa da azeitona e degrada por hidrlise os compostos fenlicos, que so ento diludos e eliminados por lavagens sucessivas (Robinson, 1988; Garrido-Fernndez et al., 1997; Snchez et al., 2000). No caso de azeitonas verdes naturais os compostos fenlicos permanecem na salmoura podendo inibir o crescimento de bactrias lcticas. Ruiz-Barba et al. (1990) estudaram os factores inibitrios da estirpe Lactobacillus plantarum em azeitonas naturais que no sofreram tratamento alcalino tendo concludo que os compostos fenlicos apresentam um efeito bactericida em relao a este organismo, atravs de alteraes na parede celular e na membrana plasmtica. Foram identificados, por PCR-RFLP, 62 isolados de leveduras presentes na Fermentao A e 47 isolados presentes na Fermentao B. Os isolados recolhidos na salmoura da Fermentao A pertencem s espcies Rhodotorula mucilaginosa, Candida diddensiae, Aureobasidium pullulans, Candida quercitrusa, Candida boidinii, Zygotorulaspora mrakii, Pichia galeiformis,

Saccharomyces cerevisiae e Citeromyces matritensis. Na Fermentao B foram identificadas Rhodotorula mucilaginosa, Candida diddensiae, Aureobasidium pullulans, Candida quercitrusa, Zygotorulaspora mrakii, Saccharomyces cerevisiae, Citeromyces matritensis e Candida oleophila. No total foram identificadas 10 espcies diferentes das quais 9 pertencem ao filo Ascomicota e apenas uma espcie pertencente ao filo Basidiomycota. A regio ITS das leveduras isoladas originou produtos de PCR entre os 450 pb (P. galeiformis) e 850 pb (S. cerevisiae). Dos 10 perfis ITS-RFLP obtidos, 9 foram identificados como Rhodotorula mucilaginosa, Candida diddensiae Aureobasidium pullulans, Candida oleophila, Candida boidinii, Zygotorulaspora mrakii, Pichia 36

galeiformis, Citeromyces matritensis e Saccharomyces cerevisiae. No caso das leveduras que cujos perfis no se encontravam na base de dados foram identificadas por sequenciao da regio D1/D2 do gene26 S rRNA como Candida quercitrusa. Na Fermentao A, foram isoladas no 3 dia fermentao as espcies R. mucilaginosa, A. pullulans e C. quercitrusa. No 3 dia de fermentao foram tambm isoladas as espcies C. diddensiae e C. boidinii que esteve presente at ao final deste estudo. No dia 8 de fermentao foi tambm isolada P. galeiformis. A estirpe Zygotorulaspora mrakii foi isolada a partir do 17 dia de fermentao e as espcies S. cerevisiae e Cit. matritensis a partir do dia 29 de processamento e tal como C. boidinii foram encontradas at ao final deste estudo. No caso da Fermentao B foram isoladas apenas no 3 dia de fermentao as estirpes R. mucilaginosa, C. oleophila e C. quercitrusa. A espcie A. pullulans foi identificada desde o inicio at ao 6 dia de fermentao. Foi tambm identificada desde o inicio do estudo a espcie C. diddensiae at ao 17 dia e Zygotorulaspora mrakii que foi a nica levedura identificada aps o 52 dia de fermentao. A espcie Cit. matritensis foi isolada entre o 10 e 45 dia e S. cerevisiae entre o 29 e 52 dia de fermentao. Verificou-se que as leveduras isoladas com maior frequncia nos dois processos estudados foram Zygotorulaspora mrakii (59,6 %), S. cerevisiae (11,9 %) e Cit. matritensis (9,2 %). A frequncia de isolados de Zygotorulaspora mrakii no Processo A 61,3 % e no Processo B 57,4 %. No final do Processo A (55 dias), estavam presentes C. boidinii, S. cerevisiae (11,9 %), Cit. matritensis e Zygotorulaspora mrakii. No final do Processo B as nicas leveduras presentes pertenciam a espcie Zygotorulaspora mrakii. A espcie R. mucilaginosa apresenta uma tonalidade rosa/coral e em 1969 Vaughn et al. descrevem leveduras que formam colnias rosa que so responsveis por alteraes de textura de azeitonas. Esta espcie no fermentativa mas tem a capacidade de utilizar sacarose, frutose e glucose como fonte de carbono. O gnero Rhodotorula pertence famlia Sporidiobolaceae e ao filo Basidiomycota. Foi o nico basidiomiceto isolado nas duas fermentaes estudadas. Esta levedura foi isolada em azeitonas de mesa produzidas artesanalmente por Marquina et al. (1992) e por Campaniello et al. (2005) que isolou R. mucilaginosa em azeitonas verdes fermentadas naturalmente. As estirpes de gnero Rhodotorula isoladas em fermentaes naturais de azeitonas tendem a estar presentes apenas no incio do processo (Hurtado et al., 2008). O gnero Aureobasidium pertence famlia Dothioraceae. A espcie A. pullulans no fermentativa e ainda no tinha sido descrita em azeitonas de mesa. Encontra-se no solo, na gua, em ambientes salinos e como saprfito em folhas e madeiras. Produz variadas enzimas como lipases, proteases, esterases e hemicelulases. Produz pululano, um polissacardeo solvel em gua com inmeras aplicaes comerciais e industriais. um dos microrganismos mais utilizados no 37

biocontrolo de enfermidades ps-colheita em frutos e vegetais e apresenta actividade antagonista em relao ao fungo filamentoso Botrytis cinerea em morangos, mas e uvas (Lima et al., 1997; Zallar et al., 2008). utilizado na produo de filmes finos, transparentes, resistentes a gorduras e impermeveis ao O2, usados sobretudo na indstria alimentar (Deshpande et al., 1992; Liu et al., 2008). A estirpe A. pullulans produz um pigmento escuro que pode conferir-lhe tonalidades entre o verde-escuro e preto (Singh et al., 2008). Foram isoladas e identificadas estirpes de leveduras de 4 espcies diferentes que pertencem ao gnero Candida da famlia Saccharomycetaceae: Candida diddensiae, C. oleophila, C. quercitrusa e C. boidinii. Foram isoladas leveduras da espcie C. diddensiae em azeitonas de mesa, com frequncia (Arroyo-Lpez et al., 2006; Hernandz et al., 2007; Hurtado et al., 2009; Romo-Sanchz et al., 2010). Segundo Hurtado et al. (2008), esta espcie est presente durante aproximadamente os primeiros 28 dias de fermentao, no presente estudo a ultima colnia de C. diddensiae foi isolada no dia 10 e 17 de fermentao respectivamente para o processo A e processo B. Hurtado et al. (2010) inocularam uma fermentao de azeitonas verdes Arbequina com C. diddensiae e verificaram que foram inibidas bactrias lcticas e enterobactrias. A levedura C. oleophila j foi isolada em azeitonas de mesa (Marquina et al., 1992). Esta levedura tem a capacidade de fermentar a glucose e tal como A. pullulans est relacionada com infeces ps colheita em frutos e vegetais (Lima et al., 1997). A espcie C. quercitrusa est sobretudo relacionada com insectos, uvas e vinho (Chavan et al., 2009; Shuang-Shi et al., 2010) e anteriormente a este estudo nunca tinha sido descrita em azeitonas de mesa. Foram j anteriormente isoladas e identificadas leveduras da espcie C. boidinii em azeitonas de mesa (Marquina et al., 1992), pretas oxidadas (Arroyo-Lpez et al., 2006) e em azeitonas verdes fermentadas naturalmente (Hurtado et al., 2008; Rodriguez-Gmez et al., 2010). Esta espcie apresenta uma acentuada actividade lipoltica (Rodriguez-Gmez et al., 2010). A espcie P. galeiformis foi, pela primeira vez, identificada em azeitonas de mesa por Rodriguez-Gmez et al. (2010) que testou os 46 isolados desta espcie obtidos em relao actividade lipoltica e obteve-se em todos os casos resultados negativos. Foi recentemente reclassificada como Pichia manshurica (Ueda-Nishimura et al., 2001). Outra levedura da famlia Saccharomycetaceae que foi identificada neste estudo pertence ao gnero Citeromyces, espcie Cit. matritensis. Esta levedura foi pela primeira vez isolada do solo, tem a capacidade de fermentar a glucose e a sacarose, tem sido relacionada com fermentaes de produtos animais, como salsichas

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(Encinas et al., 2000) e j foi descrita durante a fermentao natural de azeitonas pretas (Coton et al., 2006). J foram anteriormente identificadas leveduras da espcie S. cereviseae (Marquina et al., 1992; Arroyo-Lpez et al., 2006; Hrnandez et al., 2007; Rodriguz-Gomez et al., 2010) em azeitonas de mesa verdes submetidas a fermentao natural. Esta levedura pode produzir enzimas como esterases e catalases e geralmente no apresenta actividade pectinoltica ou lipoltica (Hrnandez et al., 2007; Rodriguz-Gomez et al., 2010). Foram identificadas estirpes de S. cerevisiae com a capacidade de produzir -glucosidases que hidrolisaram oleuropeina in vitro (Ciafardini et al., 2001 e 2006). Esta caracterstica pode ser benfica na fermentao de azeitonas verdes britadas, uma vez que a hidrlise da oleuropeina reduz o sabor amargo das azeitonas. A levedura isolada com mais frequncia nas duas fermentaes estudadas foi Zygotorulaspora mrakii. O gnero Zygotorulaspora pertence famlia Saccharomycetaceae, foi pela primeira vez reconhecido por Kurtzman (2003), tem a capacidade de fermentar acares como glucose e galactose. Esta levedura era anteriormente reconhecida como Zygosaccharomyces mrakii e j foi isolada em guas residuais de um lagar (Esteve-Zarzoso et al., 2003). Segundo o Codex Alimentarius (66/1981) e a NP 3034 (1987) e o pH final das azeitonas naturais fermentadas deve ser igual ou inferior a 4,5 e a concentrao de sal deve ser no igual ou superior a 6 % (g NaCl/ 100 mL de salmoura). De acordo com IOOC (2004) este tipo de azeitonas, deve apresentar um pH mximo de 4,3, uma acidez mnima de 0,3 % (g cido lctico/100 mL salmoura) e 6 % de NaCl. Neste trabalho verificou-se que o pH final das duas fermentaes estudadas foi de 4,3 e 4,5 na Fermentao A e B respectivamente. Segundo o Codex Alimentarius (66/1981) e a NP 3034 (1987) os valores de pH registados no presente estudo, encontram-se no limite recomendvel, contudo segundo as directrizes da IOOC (2004), o valor de pH da Fermentao B encontra-se acima do recomendvel, no sendo suficientemente baixo para inibir a germinao de esporos de Clostridium botulinum (Nout e Rombouts, 1992). A acidez total no final dos dois processos, foi de 0,3 e 0,5 g cido lctico/100 mL de salmoura, nas fermentaes A e B respectivamente. Pode-se assumir que a renovao de salmoura durante o processo de Fermentao A, exerceu uma aco prejudicial em relao acidez final do produto. A acidez total na Fermentao A (0,3 g cido lctico/100 mL de salmoura) inferior acidez da Fermentao B (0,5 g cido lctico/100 mL de salmoura). Devido renovao da salmoura no Processo A, os cidos produzidos durante os primeiros 36 dias de fermentao foram eliminados uma vez que se encontravam em soluo na salmoura descartada, provocando um decrscimo na acidez da salmoura. Apesar dos dois valores de acidez, se encontrarem em 39

conformidade com as recomendaes da IOOC (2004), o valor da Fermentao A corresponde exactamente ao valor mnimo desejvel. A concentrao final de sal nas duas fermentaes foi 4 g NaCl/100 mL de salmoura, inferior ao recomendado. Foi observado um decrscimo no contedo de sal da salmoura devido ao estabelecimento de um equilbrio entre o meio envolvente e as azeitonas. A adio de NaCl a vegetais fermentados promove a inibio de microrganismos patognicos e o crescimento de microrganismo fermentativos assim como beneficia a difuso de compostos das azeitonas para a salmoura, melhorando o sabor e aroma do produto final (Hui et al., 2004). A britagem das azeitonas, provoca uma ruptura dos tecidos que facilita a difuso de vrios compostos entre as clulas das azeitonas e a salmoura. Entre estes compostos esto os acares redutores e os compostos fenlicos. Os acares redutores so consumidos pelos microrganismos presentes na fermentao de azeitonas, e o seu teor na salmoura diminuam ao longo do processo. Verificou-se nos dois processos estudados que a concentrao de acares redutores na salmoura aumentou at ao dia 10 e 17 respectivamente no PA e no PB. Em seguida sofreu um declnio at ao final dos dois processos. No caso do PA, a renovao de salmoura promoveu a eliminao de acares. Este passo do processamento provocou uma diminuio da concentrao de acares redutores de 7,7 g/L para 2,6 g/L de salmoura (Fig. 2.4). Observou-se uma relao entre o inicio do crescimento exponencial da populao de leveduras, que ocorreu nos dois processos a partir do dia 8 de fermentao e o consumo de acares redutores que teve inicio nos dias 10 e 17 de fermentao no PA e PB respectivamente. A concentrao de acares redutores no final das duas fermentaes foi de 2,1 g/L na Fermentao A e 4,5 g/L na Fermentao B. A presena de acares fermentveis no final do processamento de azeitonas pode permitir a continuao da fermentao durante o perodo de armazenamento (Arroyo-Lpez et al., 2009). A actividade microbiana depois de o produto estar embalado, pode provocar salmouras turvas, produo de gs dilatando as embalagens no caso de serem de plstico ou derramamento de lquido de embalagem no caso de estarem acondicionadas em frascos de vidro, podem ser ainda produzidos aromas indesejveis e alteraes de textura (Hernandz et al., 2007; Arroyo-Lpez et al., 2008). A concentrao de compostos fenlicos na salmoura apresentou um comportamento semelhante ao observado na evoluo de acares redutores. Nos dois processos estudados, durante os primeiros 10 dias de fermentao a concentrao de compostos fenlicos na salmoura aumentou. Em seguida, a concentrao destes compostos na salmoura do Processo B manteve-se constante at ao fim do processo fermentativo. No caso do Processo A a renovao