terapia genética: onde estamos e para onde iremos. esperança ou
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TERAPIA GÊNICA:Onde estamos e para onde iremos!
esperança ou ilusão?
Melissa Gava ArmeliniLaboratório de Reparo de DNADepartamento de Microbiologia
ICB -USP
Terapia Gênica“Intervenção médica baseada na modificação do
material genético de células vivas, resultando em benefício terapêutico.” (FDA, 1993)
Revolução da Medicina!!!
Alvos de Terapia Gênica
Doenças hereditárias:Imunodeficiência (ADA)
Fibrose cística
Hemofilia
Xeroderma Pigmentosum
Doenças adquiridas:Câncer
AIDS
Doenças com protocolos envolvendo Terapia Gênica
Estratégias de Terapia Gênica
In Vivo
Ex Vivo
? ? ?Mas como introduzir genes em um
organismo?
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1) Diretamente por injeção de DNA
•Útil para imunizações
2) Uso de lipossomos
3) Vetores virais.
Vetor Vantagens Desvantagens
Retrovírus(RNAss)
•Tempo maior de expressão do transgene•Alta eficiência de transdução ex vivo•Experiência clínica ex vivo• Baixa imunogenicidade
•Baixa eficiência de transdução in vivo•Tamanho do inserto limitado a 8 Kb•Infecta apenas células proliferativas•Integração aleatória podendo causar alterações gênicas •Manipulação e armazenamento extremamente difíceis
Terapia gênica para a síndrome X-SCID
Resultados:
As crianças começam a recuperar o sistema imunológico. Não precisam mais de injeção de imunoglobulinas!
Problemas:
Até 2005 apareceram 3 casos de leucemia, entre pacientes tratados com retrovírus: inserção do retrovírus próximo a um oncogene.
Uso de adenovírus para terapia gênica
Vetor Vantagens Desvantagens
Adenovirus(DNAds)
•Alta eficiência de infecção e transdução in vivo e ex vivo•Infecta células proliferativas e não proliferativas•Mais clinicamente testado•Capacidade de infectar vários tipos celulares
•Forte resposta imune•Tamanho do inserto limitado a 7,5 Kb•Condições de armazenamento e manipulação moderadamente difíceis•Permite apenas umaaplicação (se tanto).•Expressão transiente(epissomo)
+ + XPD
pCMV
KanR XPD
EGFPPI- ISce
I- ICeu
pSHIRES-XPD7,9 Kb
Dupla digestão
PI-Sce I/I-CeuI
AMPLIFICAÇÃO DO PLASMÍDEO
DIGESTÃO DO PLASMÍDEO COM PAC I
Transfecçãoem células HEK 293
Produção das partículas
recombinantes
Clonagem do cassete no pAdeno-X
Construção de um vetor
adenoviral
Produção de adenoGFP em células HEK 293
Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER)
Remove lesões que distorcem DNA;
Envolve múltiplas proteínas;
Subdividido em 2 vias: GGR e TCR
GGR: reparo do genoma global
TCR: reparo das fitas transcritas
Xeroderma pigmentosum (XP)
Síndrome rara
Herança autossômica recessiva;
Elevada incidência de câncer de pele;
Problemas neurológicos;
XP clássicos (XPA-XPG): deficientes em NER;
Xeroderma Pigmentosum Society
“Crianças da Lua”
Síndrome XP nos ajudou a entender vários aspectos da carcinogenesis: será que podemos ajudá-los?
O estudo começa in vitro...Luz visível Luz UV
2 meses após a infecção
Muotri et al. 2002.
Células de pacientes XP-D são mais resistentes a UV quando infectadas com AdXPD
Armelini et al, 2005
Principais conclusões dos ensaios in vitro
A transdução de XPA, XPC, XPD e XPV foi eficiente na correção do defeito molecular em células provenientes de pacientes XP;
Células XP
+ AdXPA
+ AdXPC
+ AdXPD
+ AdXPV
Expressão do transgene por, pelo menos, 2 meses!!
Sucesso na correção fenotípica de células provenientes de pacientes XP!!!!
Mas... e in vivo?
Detecção de GFP em camundongos infectados com AdXPA
Marchetto et al 2004
AdXPA protege camundongos XPA da UVB
3 semanas após UVMarchetto et al 2004
Histologia da pele de camundongos irradiados
XPA XPA + AdXPA selvagem
3 semanas após UV
Marchetto et al 2004
AdXPA previne formação de tumores induzidos por UVB em camundongos XPA-/-
Marchetto et al 2004
•1999/Setembro: Falecimento do jovem de 18 anos - JesseGelsinger submetido à terapia gênica com adenovírus recombinante
•Doença a ser tratada: Ornitina transcarbamilase (OTC-deficiência em uma enzima do ciclo da uréia, promovendo o acúmulo de substâncias tóxicas no fígado como amônia)
•Administração de vírus foi muito alta, causando violenta resposta imune
•O garoto morre poucos dias depois de falência generalizada dos órgãos
Questões que permanecem...
Adenovírus diretamente na pele de humanos?
De que vale uma terapia por apenas 2 meses?
Quantas vezes?
Uso de imunossupressores?
Uso de vetores menos imunogênicos, ex. AAV (vírus adeno-associado).
Vetor Vantagens Desvantagens
Virus AdenoAssociado(AAV) (DNAss)
•Transduzeficientemente uma grande variedade de células in vivo•Expresão prolongada in vivo (até 4 anos) •Baixa imunogenicidade•Nenhuma relação com infecções humanas•Integração preferencial(braço curto do cromossomo 19)• Diferentes sorotipos
•Condições de armazenamento e manipulação muito difíceis •Tamanho do inserto limitado a 4,5 Kb•Pouca experiência clínica•Pode ser neutralizado por anticorpos
Esquema da construção de um vetor adeno associado (AAV)
Plasmídeo principal
Plasmídeo “helper”+
Co- transfecção
Células HEK 293
72 horas, lisado celular
Gradiente de iodixanol
Partículas viraispurificadascromatografia
1) AAV infecta pele????
primer foward primer reverse
XPA EGFP
Neg
ativ
e co
ntro
l
AA
V-X
PA
-EG
FP
8
AAV-XPA-EGFP 1 AAV-XPA-EGFP 2 AAV-XPA-EGFP 5A B C A
XPA-EGFP
β - actin
A B C A B C
2) Quais os tipos celulares da pele que o AAV écapaz de infectar?
XPA-/- + AAV-XPA-EGFP 2XPA-/-
1
wt XPA-/-XPA-/- +AAV8
XPA-/- +AAV2
Tempo após a irradiação em
semanas
2
3
TERAPIA GÊNICA:
MUITA ESPERANÇA!!!
Agradecimentos
Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck – ICB/USPDr. Alysson Renato Muotri
Dra. Maria Carolina Nasser Marchetto
Dra. Keronninn Moreno de Lima Bessa
Ricardo Alexandre Leite
Carolina Quayle
Prof. Dr. Errol Friedberg – University of Texas
Suporte: