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SERVIÇO PÚBLICO FEDERALMINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO PARÁCURSO DE LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA
CLÁUDIA DA FONSECA GOMESRUBENS FERNANDO GONÇALVES RIBEIRO JÚNIOR
ESTUDO DA GENOTOXICIDADE EM ERITRÓCITOS DE TILÁPIAS Oreochromis niloticus EXPOSTAS AO DICROMATO DE POTÁSSIO
BELÉM2011
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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO PARÁCURSO DE LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA
CLÁUDIA DA FONSECA GOMESRUBENS FERNANDO GONÇALVES RIBEIRO JÚNIOR
ESTUDO DA GENOTOXICIDADE EM ERITRÓCITOS DE TILÁPIAS Oreochromis niloticus EXPOSTAS AO DICROMATO DE POTÁSSIO
Trabalho Acadêmico de Conclusão de Curso apresentado ao Colegiado Específico de Biologia do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará – IFPA, como requisito para a obtenção do Grau em Licenciatura Plena em Biologia, sob a orientação do Prof. Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha.
BELÉM2011
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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO PARÁCURSO DE LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA
Cláudia da Fonseca GomesRubens Fernando Gonçalves Ribeiro Júnior
ESTUDO DA GENOTOXICIDADE EM HEMÁCIAS DE TILÁPIAS Oreochromis niloticus EXPOSTAS AO DICROMATO DE POTÁSSIO
Data de Defesa: ___/ ___/ ___
Conceito: ________________
Banca Examinadora
_____________________________________________Prof. Orientador: Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha, IFPA
_____________________________________________Prof. MsC. Carlos Manoel Fernandes - SEDUC
_____________________________________________Prof. MsC. Plínio Cerqueira dos Santos Cardoso - UFPA
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A Deus pela força em todos os momentos de nossas vidas, por meio da fé para enfrentarmos o desafio de alcançar um sonho;
A todos os nossos familiares que direta ou indiretamente ajudaram nessa conquista na conclusão de mais uma etapa de nossa formação profissional.
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AGRADECIMENTOS – CLÁUDIA GOMES
A Deus pela vida, pela oportunidade de estudar Biologia e pelos melhores 3 anos de minha vida.
Aos meus pais, Carlos Alberto e Maria de Nazaré, pelo apoio, demonstração de amor e pelo incentivo ao longo de minha vida.
Aos meus filhos, Christian e Carlinhos, pela compreensão devido à ausência nesses anos de formação acadêmica e amor a mim dedicado.
A toda minha família, em especial meu irmão, Rodrigo, pelo incentivo e apoio nesse período de minha vida.
Ao meu namorado, Rubens, pelo seu companheirismo, paciência, apoio e o amor a mim dedicado.
À minha segunda mãe, Ray, pelo fundamental apoio, paciência e dedicação durante o curso.
Ao meu professor orientador Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha, pela atenção na orientação, apoio, confiança e pelos valiosos ensinamentos durante o desenvolvimento deste trabalho durante a graduação.
Ao professor Laudemir Araújo, pelo apoio, atenção e ensinamentos transmitidos.
Aos colegas de coordenação de recursos pesqueiros do IFPA, Henrique e Síntia que muito me ajudaram na realização deste trabalho.
A todos os professores do curso de Licenciatura Plena em Biologia que colaboraram com a minha formação.
Aos colegas de turma do curso, especialmente a Bixinho, Camila, Dani, Jeh, Bárbara, Fernando, Brenna e Augusto, pelos melhores momentos de alegria e descontração.
Aos amigos, em especial Airton, Lili e Seu Luiz, que direta ou indiretamente contribuíram nessa conquista.
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AGRADECIMENTOS – RUBENS FERNANDO JÚNIOR
A Deus pela vida, pela oportunidade de estudar Biologia e pelos melhores 3 anos de minha vida.
Aos meus pais, Rubens Fernando e Ray, pelo apoio, demonstração de amor e pelo incentivo ao longo de minha vida.
À toda minha família, em especial minha avó Maria das Dores, meus tios Reinaldo (in memorian), Ronaldo, Wilton, Wilson (in memorian) e, principalmente, tio Washington, pela grande ajuda e incentivo nesses 3 anos de curso.
Ao meu segundo pai, tio Zeca, por participar da minha criação de vida, por ter paciência e amor por mim.
À minha namorada, Cláudia, pelo seu companheirismo, paciência, apoio e o amor a mim dedicado.
Ao meu professor orientador Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha, pela atenção na orientação, apoio, confiança e pelos valiosos ensinamentos durante o desenvolvimento deste trabalho durante a graduação.
Ao professor Laudemir Araújo, pelo apoio, atenção e ensinamentos transmitidos.
Aos colegas de coordenação de recursos pesqueiros do IFPA, Henrique e Síntia que muito me ajudaram na realização deste trabalho.
À aluna do 5º semestre de biologia do IFPA, Tassia Fernanda da Silva, pela grande ajuda na coleta do sangue e biometria dos peixes.
A todos os professores do curso de Licenciatura Plena em Biologia que colaboraram com a minha formação.
Aos amigos, em especial Éder Moreira e Moisés Júnior, que direta ou indiretamente contribuíram nessa conquista, através de incentivo e companheirismo.
Aos colegas de turma do curso, especialmente a Bixinho, Camila, Dani, Jeh, Bárbara, Fernando, Brenna, Augusto e Werena pelos melhores momentos de alegria e descontração.
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“Nunca se afaste dos seus sonhos, pois se eles se forem,
você continuará vivendo, mas terá deixado de existir”.
Charles Chaplin
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RESUMO
O crescimento urbano e industrial é um dos principais fatores responsáveis
pelo aumento da quantidade e complexidade dos resíduos que são lançados no
meio ambiente aquático, os quais provocam sérios problemas, ecológicos e
toxicológicos. O dicromato de potássio (K2Cr2O7) é um composto com diversas
aplicações na indústria, como: componente de cimento, objetos cromados, tintura de
tecidos e curtimento de couro. Diferentes organismos aquáticos como moluscos,
bivalves, peixes e anfíbios têm sido usados para investigação da genotoxicidade na
água, através de bioensaios. O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos
genotóxicos e mutagênicos do composto dicromato de potássio em tilápias do Nilo
(Oreochromis niloticus), através do Teste do Micronúcleo. O grupo (n = 7),
primeiramente não exposto, serviu de controle e após isso, foram submetidos à
concentração de 12 mg.L-1 (n = 7). Para cada 2.000 eritrócitos do sangue dos peixes
não foram encontrados micronúcleos no grupo controle. Já no grupo exposto ao
composto genotóxico durante 24h, a frequência foi 0.5 ± 0.94 e no grupo exposto por
48h foi 1.21 ± 1.42. Quanto às alterações morfonucleares, a frequência do grupo
controle, exposto 24h e exposto 48h foi de 2.14 ± 2.77, 2.93 ± 2.02 e 5.5 ± 5.98,
respectivamente. O resultado do teste paramétrico ANOVA: um critério mostrou
diferença significativa entre os grupos controle e expostos durante 48h para
micronúcleos e diferença estatisticamente não significativa para as anormalidades
morfonucleares. Os resultados confirmam o poder mutagênico do dicromato de
potássio e mostram que a espécie Oreochromis niloticus é um modelo experimental
adequado para monitorar a poluição de ecossistemas aquáticos.
PALAVRAS-CHAVE: Teste do Micronúcleo; Oreochromis niloticus; Dicromato de
potássio; Genotoxicidade.
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ABSTRACT
The urban and industrial growth is a major factor behind the increased
volume and complexity of waste being released into the aquatic environment, which
cause serious ecological and toxicological investigations. Potassium dichromate
(K2Cr2O7) is a compound with several applications in industry, such as: a component
of cement, chrome objects, dyeing cloth and leather tanning. Different aquatic
organisms such as mollusks, bivalves, fish and amphibians have been used for
investigation of genotoxicity in water, through the method. The aim of this study is to
evaluate the genotoxic and mutagenic effects of the compound potassium
dichromate in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) through the micronucleus test. The
group (n = 7), first non-exposed was the control and after it underwent a
concentration of 12 mg.L-1 (n = 7). For every 2,000 blood erythrocytes of fish
micronuclei were not found in the control group. In the group exposed to the
genotoxic compound for 24 hours, the frequency was 0.5 ± 0.94 in the group
exposed for 48 hours was 1.21 ± 1.42. For amendments morfonucleares, the
frequency of the control group, exposed and exposed 24 hours 48 hours was 2.14 ±
2.77, 2.93 ± 2.02 and 05.05 ± 5.98, respectively. The outcome of the ANOVA: a
significant difference between test and control groups were exposed for 48h to
micronuclei and statistically not significant abnormalities morfonucleares. The results
confirm the mutagenic power of potassium dichromate and show that the species
Oreochromis niloticus is an adequate experimental model to monitor pollution of
aquatic ecosystems.
KEY-WORDS: Micronucleus test; Oreochromis niloticus; Potassium dichromate,
Genotoxicity.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Espécime de Oreochromis niloticus......................................................... 31
Figura 2Aquários do Laboratório de Biologia Aquática do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do Pará................................................32
Figura 3Aquários contaminados com dicromato de potássio (K2Cr2O7) na
concentração de 12 mg.L-1......................................................................33
Figura 4Biometria dos peixes da espécie Oreochromis niloticus. (A) Medida do
Peso (g). (B) Medida do Comprimento (cm)............................................ 34
Figura 5 Coleta do sangue através da punção da veia caudal.............................. 34
Figura 6 Esfregaço do sangue na lâmina............................................................... 35
Figura 7 Preparação de duas lâminas para cada peixe......................................... 35
Figura 8 Lâminas coradas com Giemsa 5% secando ao ar................................... 36
Figura 9Eritrócitos de O. niloticus corados com Giemsa 5%, em ampliação de
1.000X. A seta indica um micronúcleo.....................................................40
Figura 10Anormalidade Morfológica Nuclear (AMN) encontrada em eritrócito de
O. niloticus. A seta indica uma invaginação do núcleo............................40
Figura 11Resultado do Teste ANOVA: um critério evidenciando diferença
significativa entre o controle e o grupo exposto no tempo de 48h...........42
Figura 12Representação das frequências de micronúcleos típicos (por 2.000
eritrócitos) em Oreochromis niloticus.......................................................42
Figura 13Resultado do Teste ANOVA: um critério evidenciando diferença
significativa entre o grupo controle e os expostos (p = 0,0765)...............43
Figura 14Representação das frequências de AMN (por 2.000 eritrócitos) em
Oreochromis niloticus...............................................................................43
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 12
2. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................... 18
2.1. Genotoxicidade em Organismos Aquáticos................................................... 18
2.2. Teste do micronúcleo (TMN).......................................................................... 21
2.3. Oreochromis niloticus..................................................................................... 24
2.4. Dicromato de Potássio................................................................................... 28
3. OBJETIVOS................................................................................................... 31
3.1. Objetivo Geral................................................................................................. 31
3.2. Objetivos Específicos..................................................................................... 31
4. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. 32
4.1. Materiais......................................................................................................... 32
4.1.1. Organismos Utilizados Como Bioindicadores................................................ 31
4.1.2. Coleta e Aclimatação Dos Animais................................................................ 33
4.2. Métodos.......................................................................................................... 34
4.2.1. Tratamento Dos Animais e Obtenção Do Sangue Para o Bioensaio......... 34
4.2.2. Teste do Micronúcleo..................................................................................... 35
4.2.3. Bioensaio com Oreochromis niloticus............................................................ 39
4.2.4. Análises Estatísticas....................................................................................... 40
5. RESULTADOS............................................................................................... 41
5.1. Teste do Micronúcleo..................................................................................... 43
5.2. Anormalidades Morfonucleares (AMN).......................................................... 44
6. DISCUSSÃO.................................................................................................. 45
6.1. Teste do Micronúcleo..................................................................................... 48
6.2. Alterações Morfológicas Nucleares................................................................ 49
7. CONCLUSÃO................................................................................................ 50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 51
APÊNDICES................................................................................................... 62
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1. INTRODUÇÃO
Com o advento da revolução industrial, a capacidade do homem para
modificar o ambiente tem se tornado ampla e profunda. Assim, após esse período,
um grande número de substâncias químicas tem sido lançado nos ecossistemas
aquáticos, terrestres e na atmosfera (Bertoletti, 2001).
Durante as últimas três décadas, a comunidade científica e agências
regulatórias têm tomado consciência a cerca dos impactos ambientais sobre a saúde
humana e a sustentabilidade dos ecossistemas (Bickham et al., 2000). Devido ao
processo industrial, a descarga de efluentes com elevados níveis de resíduos
metálicos nos corpos d’água torna-se cada vez mais preocupante. A verificação do
impacto destes materiais nas populações naturais é um alerta quanto ao estado de
contaminação de seres vivos (Campana et al., 2003).
A grande variedade de compostos produzidos pela atividade humana ao
longo de sua evolução e principalmente com o avanço tecnológico, onde os resíduos
dessas atividades passaram a ser prejudicial ao meio ambiente e aos seres que o
habitam, criou-se a necessidade de uma ciência que estudasse os efeitos tóxicos
nos organismos expostos a essas substâncias. Essa ciência é denominada de
toxicologia e pode ser definida como: “a ciência que define os limites de segurança
dos agentes químicos, entendendo-se por segurança a probabilidade de uma
substância não produzir danos em uma situação específica” (Schvartsman, 1985).
O risco que um agente químico impõe ao ambiente aquático é avaliado
através do julgamento científico da probabilidade dos danos que suas concentrações
ambientais podem causar (Panhota & Rocha, 2005).
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Testes de toxicidade são experimentos, nos quais organismos vivos são
colocados frente à compostos ou substâncias químicas e suas reações são
observadas, sendo seus efeitos crônicos ou agudos (Harmel, 2004).
Segundo Goldstein (1990), os testes de toxicidade têm como objetivo avaliar
os efeitos deletérios causados a organismos aquáticos representativos do ambiente
em várias concentrações de uma ou mais substâncias, durante um determinado
período de tempo. Eles visam exatamente a determinar os efeitos deletérios para a
comunidade aquática, causados pela emissão de agentes tóxicos (Bassoi, 1990).
Metais pesados, também denominados elementos traço, podem ser
essenciais ao metabolismo de organismos vivos, e, ao mesmo tempo, dependendo
de suas concentrações, altamente tóxicos (Porto, 2009). Neste caso, eles podem
apresentar potencial genotóxico, citotóxico e carcinogênico, uma vez que elementos
metálicos (como por exemplo, o cromo) apresentam resultados positivos
relacionados à toxicidade genética (Westphalen, 2006). Os impactos ambientais
provenientes dos metais pesados são mais preocupantes do que as excessivas
cargas orgânicas degradáveis (Oliveira & Pasqual, 2004).
Várias substâncias são indicadas para serem utilizadas como substância de
referência em testes de sensibilidade, entre elas sulfato de cobre (CuSO4.5H2O),
cloreto de cádmio (CdCl2), cloreto de potássio (KCl), sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O),
dodecil sulfato de sódio (C12H25NaSO4), cloreto de sódio (NaCl) e dicromato de
potássio (K2Cr2O7) (EPA, 1989; Lewis, 1995;Alves,2002).
O cromo é um metal de transição com três estados de oxidação: +2, +3 e
+6, formando diversos compostos coloridos. O cromo trivalente é essencial na
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nutrição humana, com atuação no metabolismo da glicose, mas o cromo
hexavalente é a forma menos estável e mais biologicamente reativa, altamente
tóxica, genotóxica e carcinogênica (Templeton, 2000; Csuros & Csuros, 2002).
A contaminação ambiental com os compostos tóxicos, produzidos por
atividades industriais, domésticas e agrícolas, resulta em alterações no equilíbrio
biológico e ecológico das populações de animais e vegetais presentes nos
ambientes aquáticos (Nakagome et al., 2007). Uma vez carreados para dentro dos
corpos d’água, os compostos tóxicos podem interagir diretamente com a biota por
ingestão e contato, ou se depositar nos sedimentos (Magalhães & Filho, 2008).
Essas interações podem afetar o crescimento, desenvolvimento, a
reprodução e favorecer a ocorrência de doenças, mudanças bioquímicas,
fisiológicas e comportamentais nos organismos aquáticos (Markaverich et al., 2002).
Além disso, esses poluentes podem também agir indiretamente alterando os ciclos
naturais de matéria e energia, provocando a desestabilização dos ecossistemas
aquáticos e, reduzindo significativamente a capacidade de reestruturação desses
sistemas (Rand & Petrocelli, 1985).
As substâncias químicas têm um potencial tóxico que depende da
concentração no ponto de contato dos organismos no ambiente. É baseado neste
ponto que os seres vivos desencadeiam sua capacidade de proteção, que consiste
principalmente na habilidade do organismo de metabolização e excreção dos
agentes agressores (Knie & Lopes, 2004).
A exposição a metais pesados é conhecida por causar alteração nos
parâmetros hematológicos em peixes (Heath, 1995). Um parâmetro utilizado na
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bioindicação é a geração de fragmentos de material genético, conhecidos como
micronúcleos (MN), devido à atividade de agentes clastogênicos que provocam
quebras cromossômicas. Esses fragmentos surgem no citoplasma quando uma
parte dos cromossomos, cromátides ou cromossomos inteiros não são incorporados
nos núcleos das células filhas na mitose, frequentemente, porque estes fragmentos
não têm centrômeros; estas partes deixadas para trás são incorporadas nos núcleos
secundários, conhecidos como micronúcleos (Schmid, 1975; Heddle et al., 1983;
Ribeiro et al., 2003).
O interesse crescente em genotoxicidade causados por poluentes
ambientais conduziu ao desenvolvimento de testes para detectar e identificar
genotoxicantes no ar, água e terra (Grisolia & Cordeiro, 2000). Embora haja um
número grande de ensaios para avaliar a genotoxicidade, apenas um número
relativamente pequeno é empregado na avaliação de misturas complexas (Claxton
et al., 1998). Alguns métodos são empregados de forma isolada ou combinados,
para verificar a habilidade de medir genotoxicidade, particularmente em águas de
superfície naturais (Reifferscheid & Grummt, 2000), tais como: SMART (Karekar et
al., 2000; Amaral et al., 2005; 2006; Pantaleão et al., 2007); Micronúcleos (Ma et al.,
1995; Wang, 1999; Moraes & Jordão, 2001; Çavas & Ergene-Gözükara, 2003; 2005;
Andrade et al., 2004; Buschini et al., 2004; Pantaleão et al., 2006); Cometa (Andrade
et al., 2004); Ames (Karekar et al., 2000; Ohe et al., 2003).
Neste trabalho foi utilizado o Teste do Micronúcleo que, quando comparado
com outras técnicas de detecção de danos no DNA, tem algumas vantagens: (1) é
feito rapidamente; (2) não é complexo; (3) apresenta baixo custo; (4) sua preparação
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e análise são simples e mais fáceis que o teste de aberrações cromossômicas
(Rocha et al., 2009a).
Os micronúcleos são, estruturalmente, núcleos representando o material
genético que foi perdido pelo núcleo principal, como conseqüência de um dano
genético que pode ser causado por agentes físicos, químicos ou biológicos, capazes
de interferir no processo de ligação do cromossomo às fibras do fuso, ou que
possam induzir a perda de material genético (cromossomos inteiros ou fragmentos).
O teste do micronúcleo, portanto, detecta mutagênese cromossômica em eucariotos
do tipo clastogênese, aneugênese e danos no fuso mitótico (Silva et al., 2003).
O teste do micronúcleo em eritrócitos e linfócitos pode ser utilizado como
indicador dos efeitos tóxicos em determinadas populações-alvo (Berces et al., 1993).
Em peixes, os testes do micronúcleo písceo geralmente são feitos utilizando
eritrócitos, embora os tecidos do fígado e das células branquiais também sejam
usados (Ferraro, 2003; Benincá, 2006).
Para biomonitorar esses elementos mutagênicos, a análise de micronúcleos
utilizando sangue periférico, em vez de tecidos é muito vantajosa, uma vez que
células vermelhas de sangue periférico são tão sensíveis quanto às células dos rins,
principal órgão hematopoiético dos peixes e, muito mais fácil de obter uma amostra.
Nos organismos com tamanho adequado, amostras de sangue periférico também
permitem o acompanhamento da reação do organismo ao poluente por meio de
amostragens diferentes (Grisolia, 2002).
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Neste sentido, utilizamos como bioindicadores de toxicidade as tilápias do
Nilo: Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1757). Considerando que os peixes estão
entre os organismos atualmente utilizados para a observação de micronúcleos nos
ensaios de genotoxicidade (Grisolia, 2002).
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2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Genotoxicidade em Organismos Aquáticos
A genotoxicidade é o setor da genética que estuda os processos que alteram
a base genética da vida, quer seja em sua estrutura físico-química, o DNA (ácido
desoxirribonucléico), processo este classificado de mutagênese; quer seja na
alteração do determinismo genético ao nível celular ou orgânico, identificados
respectivamente como: carcinogênese e teratogênese. Também, a genotoxicidade
estuda, sob o aspecto genético, o que perturba a vida ou induz a morte tanto em
nível de célula como de organismo. Por ser uma especialidade relativamente
recente, e se situa na interface entre toxicologia e genética, por isto denominada,
frequentemente, também, de genética toxicológica (Silva et al., 2003).
Entre os contaminantes aquáticos decorrentes das atividades
antropogênicas, os agrotóxicos são os mais perigosos, justamente pelo fato de
terem sido concebidos para eliminar alguma forma de vida e, por isso, atingirem
também de modo letal espécies não-alvo. No ambiente aquático, os agrotóxicos
provocam impactos em múltiplos níveis, incluindo moléculas, tecidos, órgãos,
indivíduos, populações e comunidades (Grisolia, 2005).
Os efluentes domésticos geralmente contaminam a água com patógenos,
substâncias orgânicas degradáveis por bactérias e com detergentes. Os efluentes
agropecuários apresentam alta carga de fertilizantes, praguicidas e detritos animais.
Já os efluentes industriais são constituídos por substâncias tóxicas, que podem ser
divididos em dois grupos, os compostos orgânicos (petróleo e derivados, fenóis) e
inorgânicos (metais pesados) (Felemberg, 1980).
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Os impactos ambientais provenientes dos metais pesados são mais
preocupantes do que as excessivas cargas orgânicas degradáveis (Oliveira &
Pasqual, 2004). Metais tóxicos e suas combinações tendem a se acumular nos
organismos (Ferraro et al., 2004) e muitos são potentes mutágenos capazes de
induzir tumores em humanos e animais experimentais (Matsumoto et al., 2006).
Sem dúvida, o crescimento urbano e industrial é um dos principais fatores
responsáveis pelo aumento da quantidade e complexidade dos resíduos que são
lançados no meio ambiente, os quais provocam sérios problemas ecológicos e
toxicológicos para a maioria dos países desenvolvidos e em desenvolvimento
(Barbosa, 2000).
Segundo Rand et al. (1995), tóxico é um agente que produz efeito adverso
no sistema biológico, alterando sua estrutura ou função, ou pode também provocar a
morte. Pode ser introduzido deliberadamente ou acidentalmente nos ecossistemas
aquáticos, prejudicando a qualidade da água e tornando-a desfavorável à
preservação da vida aquática e à saúde humana.
Na avaliação do impacto de substâncias tóxicas em sistemas aquáticos, as
análises químicas são muito importantes, mas são limitadas e insuficientes para a
real compreensão dos processos e interações com o meio e a biota, e na estimação
dos efeitos na estrutura e função ecológica (Manrique, 2009). Para suprir estas
limitações os testes ecotoxicológicos com organismos aquáticos são utilizados, pois
permitem testar hipóteses mais abrangentes relativas à saúde dos sistemas hídricos
submetidas às mais diversas formas de poluição química (Espíndola et al., 2003).
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Assim, duas grandes preocupações têm levado ao uso de testes de
toxicidade genética para identificar mutágenos químicos e caracterizar seus efeitos.
A primeira é a indução de mutação em células germinativas, que pode, tanto afetar a
desempenho reprodutivo do indivíduo, como resultar em doenças genéticas nas
gerações futuras. A segunda preocupação é baseada no papel da mutação em
células somáticas, na iniciação e progressão de doenças degenerativas como o
câncer (Ribeiro, 2003).
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2.2. Teste do micronúcleo (TMN)
O teste do micronúcleo (TMN), desenvolvido por Schmid (1975) utilizando
células da medula óssea de mamíferos, tem sido aplicado extensivamente para
testar a genotoxicidade de produtos químicos. O teste tem sido utilizado, com
sucesso, em invertebrados, peixes e anfíbios, sendo estes monitores biológicos de
áreas contaminadas (ensaio in situ), e na análise de compostos para determinar sua
genotoxicidade, após a exposição direta ou indireta em vivo (Jaylet et al., 1986;
Hose et al., 1987; Brunetti et al., 1988; De Flora et al., 1993; Nepomuceno et al.,
1997).
Pelo teste dos micronúcleos podem-se detectar compostos que interferem
na formação do fuso mitótico, alterando a distribuição equitativa dos cromossomos
durante a divisão celular, ou ao nível de proteínas diretamente envolvidas na
segregação cromossômica, com a vantagem de ser mais rápido que a análise de
aberrações cromossômicas (Al-Sabti & Metcalfe, 1995). Assim, este teste detecta
tanto eventos aneugênicos (alterações no número de cromossomos do genoma,
devido a erros na distribuição destes durante o processo de divisão celular), quanto
eventos clastogênicos (quebras que produzem alterações na estrutura dos
cromossomos).
Micronúcleos resultam de lesões no DNA ou cromossomos, ou em nível de
proteínas direta ou indiretamente envolvidas na segregação cromossômica (como a
tubulina, por exemplo). A formação de micronúcleos depende da perda de
fragmentos cromossômicos ou de cromossomos inteiros, e requer divisão mitótica
ou meiótica (Kirsch-Volders et al., 1998).
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Sabe-se que perdas cromossômicas e a não segregação de cromossomos
(não disjunção), são importantes eventos no câncer e que eles são causados por
defeitos no fuso, centrômero ou como uma conseqüência da não-condensação da
estrutura cromossômica antes da metáfase (Fenech, 2000).
As vantagens do teste do micronúcleo incluem, além da simplicidade e
rapidez: (1) MN pode ser observado durante o ciclo celular, e o número de células
contáveis é ilimitado; (2) A contagem pode ser feita por qualquer pessoa com pouco
treinamento em citogenética; (3) não é necessário um cariótipo favorável; (4) o MN
formado persiste pelo menos até a próxima intérfase; (5) não é necessário nenhum
reagente para bloquear o fuso (Heddle et al., 1983).
Uma das vantagens, também, é que pode ser aplicado em qualquer
população de células em proliferação sem depender do cariótipo envolvido. Devido
aos peixes terem um grande número de cromossomos, e muitas vezes de pequeno
tamanho, as análises das metáfases para avaliação de aberrações cromossômicas
são dificultadas, enquanto que o estudo de micronúcleos é fácil e possível de ser
realizado em eritrócitos, devido ao fato destes serem nucleados (Hayashi et al.,
1998).
Em avaliações ecotoxicológicas como as de Llorene et al. (2002), Porto et al.
(2005) e Nigro et al. (2006), o teste do micronúcleo também vem ganhando
importância. Gauthier et al. (1999) propuseram o uso desse teste em golfinhos para
monitorar populações expostas a ambientes contaminados. Cavas et al. (2005)
comprovaram em peixes os efeitos genotóxico e citotóxico de metais pesados, como
cádmio e cobre, observados previamente em mamíferos.
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Em estudo com animais de uma região poluída por rejeitos industriais,
verificaram que o número de micronúcleos em células sanguíneas de tartarugas
correlaciona-se positivamente com os níveis de mercúrio e DDT nos tecidos dos
animais. Ensaios envolvendo este tipo de abordagem são bons modelos para a
avaliação dos riscos da exposição a fatores ambientais e fornecem subsídios para o
potencial efeito sobre a saúde das populações residentes na mesma região e para o
manejo dos animais expostos (Swartz et al., 2003).
Normann et al. (2008) investigaram a genotoxicidade do composto dicromato
de potássio, utilizando o teste do micronúcleo, em Hypostomus plecotomus.
Na bacia amazônica este teste já foi utilizado para avaliação mutagênica de
altas concentrações de mercúrio encontradas no Rio Madeira, examinando-se três
espécies comercialmente importantes da região (Prochilodus nigricas, curimatã;
Mylossoma duriventris, pacu branco; e Hoplias malabaricus, traíra) onde se mostrou
ação genotóxica significativa quando comparado ao controle negativo (área não
poluída) utilizando-se peixes do Rio Solimões (Porto et al., 2005).
24
2.3. Oreochromis niloticus
Segundo Elder (1990), a seleção da espécie que deverá ser utilizada como
indicadora dos efeitos contaminantes é uma característica importante em um teste
de toxicidade, pois a resposta do teste com um pequeno grupo de organismos,
geralmente é usada para representar uma comunidade inteira. Assim, a seleção do
organismo-teste é normalmente baseada em alguns critérios, tais como:
sensibilidade; fácil manutenção em laboratório, biologia e ecologia da espécie,
reprodutibilidade dos resultados; relevância econômica da espécie, entre outros.
No Brasil, os organismos-teste utilizados são geralmente espécies exóticas,
que, segundo Cairns (1993), são frequentemente utilizadas para determinar a
toxicidade de efluentes em ambientes aquáticos nos quais elas não possuem
nenhuma relevância ecológica, ou mesmo ocorrência. Entretanto, o uso de espécies
autóctones nos testes de toxicidade deverá gradualmente substituir as espécies
alóctones atualmente utilizadas nos testes já padronizados, Segundo Chapman
(1995), é ideal usar em testes laboratoriais as mesmas espécies que são
encontradas em campo, já que são esses os organismos que se deseja proteger.
Entre os peixes de água doce do Brasil, as tilápias são espécies exóticas
invasoras que têm sido usadas como organismos bioindicadores de poluição por
apresentarem ampla distribuição geográfica e características ecológicas conhecidas
(Arias et al., 2007; Souza & Fontanetti, 2007). As tilápias são peixes ósseos,
Actinopterygii: Perciformes, Cichlidae, de corpo alto e comprimido e apresentam
escamas dérmicas implantadas, boca terminal e brânquias (Nelson, 2006).
25
Intensamente usada na piscicultura mundial, a tilápia está entre as espécies
mais indicadas para o cultivo intensivo em regiões tropicais. Essa espécie apresenta
qualidades interessantes para a produção piscícola como o curto ciclo de
reprodução e rápido crescimento (Ribeiro & Caetano-Filho, 1995). São também
peixes muito utilizados em estudos que unem a genética toxicológica e os estudos
de biomonitoramento ambiental (Souza & Fontanetti, 2007).
Tilápia é um nome comum utilizado para denominar um grande número de
espécies de ciclídeos (Perciformes), provenientes da África, pertencentes ao grupo
Tilapiine, divididos em 3 gêneros: Tilapia, Sarotherodon e Oreochromis, sendo este
último de grande importância na aquicultura mundial (Mc Andrew, 2000).
A ordem Perciformes engloba o maior número de vertebrados presentes no
planeta. Tal número é representativo de 18 subordens, 148 famílias,
aproximadamente 1500 gêneros e 9300 espécies; podendo ser encontradas em
habitats de água salgada, salobra e doce (regiões tropicais e subtropicais). Para a
identificação dessa ordem, os taxonomistas se utilizam das seguintes
características: escamas ctenóides ou ciclóides; nadadeiras dorsal, ventral e anal
quase sempre com espinhos; nadadeiras ventrais em posição anterior, logo abaixo
das peitorais; nadadeira dorsal com 17 raios principais; pré-maxila protrátil; escamas
na lateral da cabeça; ausência de nadadeira adiposa; ausência de duto na bexiga
natatória (Nelson, 1994). Segundo o mesmo autor, as principais famílias de
Perciformes de água doce da América do Sul estão incluídas nas subordens:
Percoidei (Scianidae) e Labroidei (Gobiidae e Cichlidae).
A família Cichlidae é representada na América do Sul por 50 gêneros e
cerca de 450 espécies, equivalente a 10% de sua ictiofauna. Os representantes
26
desta família como os Tucunarés, Acarás, Jacundás ou peixes-sabão e as tilápias
apresentam as seguintes características em comum: um ocelo no corpo; uma narina
de cada lado do focinho; linha lateral dividida em dois segmentos, sendo o primeiro,
superior, entre o final do opérculo até a linha que passa pelo meio da nadadeira
dorsal e o segundo, inferior, desse nível até a extremidade do pedúnculo caudal; 16
ou excepcionalmente 14 raios caudais principais; raios, ductos e pungentes em
número de 7 a 25 na nadadeira dorsal; 3 a 15 na anal e 1 na ventral; escamas
ctenóides, ásperas ao tato. (Kullander, 1986).
As tilápias são naturais da África, de Israel e da Jordânia e devido a seu
potencial para a aquicultura, tiveram sua distribuição expandida para todos os
continentes nos últimos cinquenta anos. A motivação inicial deveu-se ao fato de ser
uma espécie apropriada para a piscicultura de subsistência em países em
desenvolvimento (Lovshin, 1997).
A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) apresenta hábito alimentar onívoro e
utiliza eficientemente os carboidratos da dieta (Viola & Arieli, 1983; Anderson et al.,
1984; Degani & Revach, 1991; Shiau, 1997).
A espécie Oreochromis niloticus (tilápia do Nilo), foi introduzida no Brasil em
1971, procedente da Costa do Marfim, África (Castagnolli, 1992). É uma espécie
bastante rústica, de hábito alimentar fitoplanctófago que aceita, também, outros tipos
de alimento, inclusive alimentos artificiais, em todos os estágios de vida (Santiago et
al., 1987).
Oreochromis niloticus apresenta sistema de determinação sexual de tipo
XX/XY, demonstrado através da análise do complexo sinaptonêmico (Foresti et al.,
27
1993; Carrasco; Penman; Bromage, 1999), neste caso o primeiro par cromossômico
seria o responsável pela determinação do sexo, apesar de não haver uma
diferenciação morfológica notável entre os membros desse par, o que dificulta sua
distinção em preparações cromossômicas mitóticas. Segundo Leonhardt et al.
(2006), a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) apresenta um cariótipo com 44
cromossomos (2n = 44).
28
2.4. Dicromato de Potássio
A ocorrência natural de sais de metais pesados é muito rara. Quando estes
compostos são encontrados no meio ambiente aquático têm origem em atividades
industriais. Estas substâncias são introduzidas no meio ambiente através de
efluentes não tratados de indústrias (Chepcanoff, 2001).
O cromo é definido como um elemento metálico de cor cinza. Classificado
como um dos elementos de transição, seu número atômico é 24 (Valko et al., 2005).
Este metal pesado ocorre naturalmente e pode ser encontrado em rochas, animais,
plantas, solo e gases, podendo também formar uma grande variedade de compostos
altamente tóxicos. O grau de toxidade do cromo pode variar com seu estado de
oxidação (Paulino, 1993).
O cromo (VI) existente no meio ambiente é quase todo proveniente das
atividades humanas, originando-se de emissões das fabricações de cimento,
fundições, soldagem, mineração de cobre, lixos urbanos e industriais, incineração,
utilização em curtumes e fertilizantes, entre outros. Nestas regiões o solo pode
apresentar teores acima do permitido, principalmente, devido ao mau descarte
desse elemento pelas atividades industriais. Os resíduos possuem alto poder de
contaminação, quando não são convenientemente tratados e simplesmente
abandonados em corpos d’água, aterros industriais ou mesmo lixeiras clandestinas.
Com facilidade, o cromo atinge o lençol freático ou mesmo reservatórios ou rios que
são as fontes de abastecimento de água das cidades (CETESB, 2005). Este metal
também pode entrar no sistema de água potável, oriundo de inibidores de corrosão
usados nos tanques de água (Visvanathan et al., 1989).
29
O cromo metálico parece ser nocivo à saúde, o cromo hexavalente está
classificado pela CERCLA – The Comprehensive Environmental Response,
Composion, and Liability (1997) em 18º lugar na lista das substâncias perigosas
(AZEVEDO & CHASIN,2003).
Os compostos de cromo (VI) penetram através das membranas biológicas e
são reduzidos para cromo (III) causando danos à estrutura celular. Neste caso
também ocorre um aumento na concentração de cromo (III) acima do normal,
causando um desequilíbrio e transformando o cromo (III) em tóxico (Paulino, 1993)
O dicromato de potássio tem aparência de cristais laranja avermelhados
brilhantes, ponto de fusão a 398ºC, ponto de ebulição a 500ºC e densidade (g cm- 3)
de 2.676. No ambiente são três os números de oxidação do metal: cromo(0),
cromo(III) e cromo(VI). Cromo(III) tem ocorrência natural no meio ambiente,
enquanto cromo(VI) e cromo(0) são geralmente produzidos por processos
industriais. Os compostos hexavalentes de Cromo são, geralmente, mais tóxicos do
que os trivalentes, podendo chegar a ter efeito letal, se absorvido através da pele,
ingerido ou inalado (Harmel, 2004).
Essa substância é um composto químico com diversas aplicações na
indústria, como componente de cimento, tintas de impressão, objetos cromados,
tintura de tecidos, curtimento de couro, perfumes sintéticos, borracha, vernizes e
detergentes (Pecher & Fernandes, 1984). Segundo Felcman (1985), o dicromato de
potássio é um composto de cromo importante por sua utilização industrial e,
processos fotoquímicos, produção de pigmentos, formulações para preservar
madeiras, entre outras aplicações.
30
A concentração total de um elemento químico não é um dado suficiente para
avaliar seus efeitos sobre os seres vivos e meio ambiente, pois dependendo de sua
forma físico-química (especiação), tem-se diferentes graus de toxicidade, de
solubilidade, taxa de absorção por seres vivos e reações de complexação
(Chepcanoff, 2001).
Este trabalho visa analisar a frequência de micronúcleos (MN) típicos e
anormalidades morfonucleares (AMN) em eritrócitos periféricos de tilápias do Nilo
(Oreochromis niloticus) expostas ao dicromato de potássio, substância altamente
genotóxica, a fim de analisar os efeitos genotóxicos e mutagênicos desse composto.
31
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar os efeitos genotóxicos e mutagênicos do composto dicromato de
potássio nas tilápias do Nilo Oreochromis niloticus.
3.2. Objetivos Específicos
- Investigar a frequência de micronúcleos e outras anormalidades nucleares
em eritrócitos periféricos das tilápias do Nilo Oreochromis niloticus expostos ao
dicromato de potássio;
- Verificar (ou confirmar) se a tilápia do Nilo pode ser considerada um
modelo experimental adequado para o biomonitoramento da poluição de
ecossistemas aquáticos por compostos de cromo.
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Materiais
4.1.1. Organismos Utilizados Como Bioindicadores
Foram utilizados peixes da espécie Oreochromis niloticus (Figura 1) que são
originalmente da África, porém, foram introduzidos na bacia Amazônica para a
piscicultura e já ocorrem naturalmente nessa região ocupando diferentes nichos
tróficos. Essa espécie foi escolhida por ser de fácil adaptação e manutenção nas
condições laboratoriais.
Figura 1 – Espécime de Oreochromis niloticus. Foto: Autores (2011).
33
4.1.2. Coleta e Aclimatação Dos Animais
As tilápias utilizadas nos bioensaios foram adquiridas junto à Empresa
Pesque & Pague, no município de Belém. Os peixes foram mantidos em aquários
(Figura 2), sob manejo, no Laboratório de Biologia Aquática do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do Pará (IFPA), em Belém – PA.
Figura 2 – Aquários do Laboratório de Biologia Aquática do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará. Foto: Autores (2011).
Os aquários funcionaram em sistema semi-estático, com limpeza e troca de
1/3 da água a cada 48 horas. Durante este período os peixes foram alimentados
diariamente, com ração comercial (28% de proteína bruta). Estas condições foram
mantidas durante o período de aclimatação. Após a contaminação, apenas foi
suspensa a troca de água. Os peixes foram mantidos em água desclorificada,
temperatura controlada (em torno de 28ºC), aeração constante e periodicidade
luminosa (14/10 h) por um período de aclimatação de 15 dias.
34
4.2. Métodos
4.2.1. Tratamento Dos Animais e Obtenção Do Sangue Para o Bioensaio
As tilápias foram submetidas ao tratamento com dicromato de potássio na
concentração de 12 mg.L-1 (Figura 3). Os espécimes foram expostos ao
contaminante a partir da água (via hídrica). Decorrido o período de aclimatação, o
bioensaio teve início.
Figura 3 – Aquários contaminados com dicromato de potássio (K2Cr2O7) na concentração de 12 mg.L-1. Foto: Autores (2011).
Foi realizada a biometria dos organismos. Os peixes apresentaram
comprimento médio de 16.79 ± 1.78 cm e peso médio de 83.76 ± 19.55 g (Figura 4).
Os dados sobre a biometria encontram-se no apêndice A.
35
Figura 4 – Biometria dos peixes da espécie Oreochromis niloticus. (A) Medida do Peso (g). (B) Medida do Comprimento (cm). Foto: Autores (2011).
Para a obtenção do sangue, os peixes foram primeiramente anestesiados
com gelo, por cerca de 3 minutos (Normann et al., 2008). Em seguida, com o auxílio
de uma seringa heparinizada, uma gota de sangue foi coletada através da punção
da veia caudal (Figura 5), sendo posteriormente, colocada em lâmina e
imediatamente feito o esfregaço (Figura 6) para o Teste do micronúcleo, foram
confeccionadas duas lâminas de cada animal (Figura 7).
Figura 5 – Coleta do sangue através da punção da veia caudal. Foto: Autores (2011).
A B
36
Figura 6 – Esfregaço do sangue na lâmina. Foto: Autores (2011).
Figura 7 – Preparação de duas lâminas por peixe. Foto: Autores (2011).
37
4.2.2. Teste do Micronúcleo
Para a análise dos Micronúcleos (MN) foi empregada a técnica descrita por
Heddle (1973), com algumas modificações. Assim, uma vez coletado o sangue do
peixe, imediatamente foi pingada uma gota em lâmina bem limpa; com o auxílio de
uma lamínula, foi feito o esfregaço, que secou ao ar, em temperatura ambiente.
Após a secagem, fez-se a fixação em etanol absoluto por 10 minutos e a
lâmina foi corada com solução de Giemsa 5%, diluída em tampão fosfato a pH 6,8,
por 10 minutos e lavada em água corrente (Figura 8).
Figura 8 – Lâminas coradas com Giemsa 5% secando ao ar. Foto: Autores (2011).
Somente foram consideradas as células com a membrana citoplasmática
intacta. As lâminas para o escore de MN e AMN foram observadas ao microscópio
sob ampliação de 1000X, no Laboratório de Biologia Aquática do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do Pará. Foram analisados, em teste cego, 1.000
eritrócitos por lâmina e, assim, 2.000 por animal.
Em nosso estudo os MN foram definidos como corpos citoplasmáticos
esféricos ou ovais, não conectados ao núcleo principal, com diâmetro de 1/30 – 1/10
do núcleo maior e no mesmo plano óptico deste (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Ayllon &
38
Garcia-Vazquez, 2000). Três outras anormalidades nucleares foram também
consideradas: brotos, lobos e invaginações (Ayllon & Garcia-Vazquez, 2000;
Bolognesi et al., 2006).
39
4.2.3. Bioensaio com Oreochromis niloticus
Os espécimes de O. niloticus foram mantidos sob densidade de um indivíduo
por aquário de 30 L. Para esse bioensaio foram utilizados 7 tilápias, as quais
primeiramente, foram utilizadas como controle e depois contaminadas com o
dicromato de potássio. Após 24 horas (um dia) de exposição, foi coletado sangue e
as lâminas preparadas para a análise de micronúcleos. O mesmo procedimento foi
realizado depois de 48 horas (dois dias) de exposição.
O Teste de micronúcleos foi realizado pela análise de 2.000 eritrócitos por
animal, incluindo aquelas com micronúcleos típicos e alterações na forma do núcleo.
No total, foram averiguados 42.000 eritrócitos neste bioensaio.
40
4.2.4. Análises Estatísticas
A normalidade dos dados foi avaliada por meio do teste de Kolmogorov-
Smirnov. Para comparar diferenças entre grupos controle e tratados, os resultados
foram avaliados por meio do teste paramétrico ANOVA: um critério. Quando da
presença de diferença significativa a ANOVA foi seguida do Teste de Tukey. Todas
as análises estatísticas foram efetuadas com o programa BioEstat 5.0 (Ayres et al.,
2007) e o nível mínimo de significância considerado nas análises foi de 0,05.
41
5. RESULTADOS
No Teste do Micronúcleo, foram analisadas 2.000 células por espécime. Do
total de células contadas, o número de micronúcleos típicos encontrados (Figura 9)
foi bastante reduzido. Entretanto, de acordo com nossa proposta, as alterações
morfológicas nucleares (Figura 10) também foram analisadas e apareceram com
maior freqüência.
Figura 9 – Eritrócitos de O. niloticus corados com Giemsa 5%, em ampliação de 1.000X. A seta indica um micronúcleo. Foto: Autores (2011).
Figura 10 – Anormalidade Morfológica Nuclear (AMN) encontrada em eritrócito de O. niloticus. A seta indica uma invaginação do núcleo. Foto: Autores (2011).
42
Das 42.000 células analisadas, 14.000 foram para cada grupo: controle,
exposto durante 24h e 48h de contaminação. No controle, 30 células se
apresentaram alteradas (apenas com alterações morfológicas nucleares); no grupo
exposto durante 24h foram encontradas 48 células alteradas (micronúcleos típicos +
alterações morfonucleares) e no grupo exposto durante 48h foram encontradas 94
células alteradas (micronúcleos típicos + alterações morfonucleares). No total dos
dois grupos (24h e 48h) expostos ao dicromato de potássio, foram encontradas 142
células alteradas (micronúcleos típicos + alterações morfonucleares).
Os resultados encontrados são também apresentados na Tabela 1, onde
estão disponibilizadas as médias e os desvios padrões de micronúcleos e alterações
morfológicas nucleares.
Tabela 1 - Médias e desvios de micronúcleos (MN) e alterações
morfonucleares (AMN) de Oreochromis niloticus expostos ao dicromato de potássio
em tempos diferentes.
MÉDIA E DESVIO PADRÃO DE MN E AMN / 2000 CÉLULAS
MN AMN MN+AMN
Controle 0 2.14 ± 2.77 1.07 ± 2.21
24h 0.5 ± 0.94 2.93 ± 2.02 1.71 ± 1.98
48h 1.21 ± 1.42 5.5 ± 5.98 3.36 ± 4.79
43
5.1. Teste do Micronúcleo
Os dados obtidos no Teste do Micronúcleo foram tratados estatisticamente
com o teste de Análise de Variância (ANOVA: um critério) e a diferença mostrou-se
significativa apenas entre os grupos controle e tratado no tempo de 48h (Figura 11).
Figura 11 - Resultado do Teste ANOVA: um critério evidenciando diferença significativa entre o controle e o grupo exposto no tempo de 48h. Obtido no BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007).
A frequência de micronúcleos (MN) típicos apresentou-se nula no grupo
controle. Nos grupos expostos, com tempos distintos, foi observado um aumento
significativo dessa ocorrência (Figura 12).
Figura 12 – Representação das frequências de micronúcleos típicos (por 2.000 eritrócitos) em Oreochromis niloticus.
44
5.2. Anormalidades Morfonucleares (AMN)
Os valores das anormalidades morfonucleares encontradas, também foram
avaliadas estatisticamente com o teste de Análise de Variância (ANOVA: um critério)
não apresentando diferença significativa entre os grupos controle, tratados 24h e
48h (Figuras 13 e 14)
Figura 13 - Resultado do Teste ANOVA: um critério evidenciando diferença significativa entre o grupo controle e os expostos (p = 0,0765).
Figura 14 – Representação das frequências de AMN (por 2.000 eritrócitos) em Oreochromis niloticus.
45
6. DISCUSSÃO
O uso de diferentes ensaios e sistemas biológicos garante uma triagem mais
apurada dos efeitos causados por contaminantes no ambiente aquático. Nesse
sentido, vários biomarcadores estão sendo desenvolvidos e dentre eles, os
biomarcadores genéticos vêm alcançando grande aceitação (Ramsdorf, 2007).
O desenvolvimento de novas metodologias e aplicação de técnicas mais
refinadas para a avaliação da genotoxicidade em ambientes aquáticos são objetos
de muitos estudos científicos (Van der Oost et al., 2003).
Os resultados obtidos nesta pesquisa científica demonstraram
primeiramente que os peixes da espécie Oreochromis niloticus podem desempenhar
um bom modelo experimental, sendo indicadores de efeitos genotóxicos de
xenobiontes.
No presente estudo observou-se também um índice basal nulo para
micronúcleos típicos, o que não é muito comum, apesar de não ser um resultado
extraordinário, já que outros trabalhos demonstram baixas frequências para o índice
basal de micronúcleos em peixes (Tabela 2).
ESPÉCIES FREQUÊNCIA REFERÊNCIAS
46
BASAL BIBLIOGRÁFICAS
Astyanax bimaculatos 0.6 ± 0.7 Silva, 2009.
Hoplias malabaricus 0.33 ± 0.52 Ferraro et al., 2004.
Aequidens tetramerus 0.5 ± 1.15 Rocha et al., No prelo 2011.
Eigenmannia virescens 0.1 ± 0.31 Bücker et al.,2006
Tilapia rendalli 0.2 ± 0.3 Palhares & Grisolia, 2002.
Oreochromis niloticus 0.4 ± 0.4 Palhares & Grisolia, 2002.
Neste trabalho, os peixes O. niloticus foram expostos ao dicromato de
potássio na concentração de 12 mg.L-1, conforme valor encontrado na literatura
(Palhares & Grisolia, 2002). Maximizando assim, as chances de observação de
efeitos genotóxicos e direcionando o foco de nossa pesquisa para as diferenças
encontradas nos resultados entre os grupos estudados: controle, 24h e 48h.
Neste sentido, foi observado um aumento na geração de acidentes
clastogênicos, resultando na formação de micronúcleos típicos e anormalidades
morfológicas nucleares. Havendo, portanto, uma relação direta entre bioabsorção de
cromo e a formação de micronúcleos conjuntamente às alterações morfológicas
nucleares. Confirmando os resultados obtidos nas diferentes literaturas Al-Sabti &
Metcalfe (1995), Dillon et al. (1998) Kohlpoth et al. (1999) e Messer et al. (1999),
Palhares & Grisolia, 2002.
Um ponto favorável ao uso de O. niloticus em bioensaios de genotoxicidade
está relacionado a sua facilidade de manutenção em laboratório, onde os efeitos
antagônicos de substâncias presentes no meio podem ser totalmente ou
parcialmente eliminados. Por outro lado no teste de micronúcleo em peixes têm sido
47
amplamente utilizado eritrócitos, por serem nucleados, de fácil manipulação e não
exigirem a etapa de dissociação celular requerida por outros tipos celulares.
48
6.1. Teste do Micronúcleo
Em nossa pesquisa de micronúcleos e outras anormalidades nucleares,
analisamos 2.000 eritrócitos por espécime, porém há na literatura uma grande
divergência quanto ao número de células que devem ser utilizadas: 1.000 (Ayllon &
Garcia-Vazquez, 2000; Gravato & Santos, 2002; Russo et al., 2004); 1.500 (Cavas,
2008); 2.000 (Palhares & Grisolia, 2002; Ramsdorf, 2007; Normann et al., 2008,
Ferraro, 2009; Kirschbaum et al., 2009); 3.000 (Galindo & Moreira, 2009; Grisolia et
al., 2005; Grisolia et al., 2009); 4.000 (Metcalfe, 1988; Ferraro et al., 2004; Bolognesi
et al., 2006); 5.000 (Porto et al, 2005; Andreikënaitë et al., 2007).
Percebemos que o aumento na geração de micronúcleos nos animais
tratados nesse bioensaio, apresentou diferença significativa apenas entre os grupos
controle e exposto por 48h, o que foi demonstrado por meio do teste estatístico
paramétrico ANOVA : um critério (p < 0,01). Logo evidenciando que quanto maior o
tempo de exposição maior a incidência de MN.
49
6.2. Alterações Morfológicas Nucleares
O registro de ocorrência de outras anormalidades nucleares, além dos
micronúcleos, também tem sido considerado como um indicador verdadeiramente
útil na avaliação de efeitos genotóxicos e citotóxicos de contaminantes em
organismos aquáticos (Cavas & Ergene-Gozukara, 2003; Dailianis et al., 2003;
Ferraro et al., 2004; Baršienë et al., 2006; Matsumoto et al., 2006).
Do mesmo modo que em Ferraro (2003), As alterações morfológicas
nucleares descritas em trabalhos anteriores foram encontradas e fotografadas no
presente estudo. Embora, muitas destas pudessem ser facilmente identificadas
dentro de um determinado tipo, outras mostraram-se dúbias quanto à sua
caracterização e, por este motivo, todas as alterações morfológicas nucleares foram
computadas em conjunto.
Foi verificado que para alterações morfológicas nucleares as diferenças não
foram estatisticamente significativas quando comparados os grupos: controle,
exposto 24h e 48h. Nossos resultados divergem dos resultados encontrados por
Ferraro et al., (2004), que estudaram os efeitos mutagênicos do tributilestanho (TBT)
e do chumbo inorgânico sobre peixes Hoplias malabaricus.
Em todo o caso, os resultados que encontramos confirmam os efeitos
clastogênicos do dicromato de potássio. Portanto, é necessário a prevenção de
acidentes ambientais e industriais, por conta deste composto ser tóxico e tal qual
muitos compostos de cromo devem ser tratados antes de sua liberação para o meio
ambiente, evitando assim a contaminação ambiental (Stern, 1982; Langard &
Vigander, 1983; Galvão & Corey, 1987; WHO, 1988; Bidstrup & Wagg, 1989).
50
7. CONCLUSÃO
1 – As frequências de micronúcleos aumentaram significativamente nos
animais dos grupos submetidos ao dicromato de potássio em tempos de exposição
diferentes.
2 – Quando consideramos as anormalidades morfonucleares, a diferença
não foi significativa entre os grupos: controle, tratados 24h e 48h.
3 – Os resultados aqui obtidos com tilápias Oreochromis niloticus expostos
ao dicromato de potássio confirmam o poder mutagênico desse composto e indicam
maior efeito genotóxico sobre os eritrócitos.
4 – A espécie Oreochromis niloticus representa um modelo experimental útil
de monitoramente da poluição em ambientes aquáticos.
51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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62
Apêndice A – Biometria dos peixes (Oreochromis niloticus). Tabela com os
comprimentos e pesos dos peixes utilizados nos experimentos (comprimento médio:
16.79 ± 1.78 cm. Peso médio: 83.76 ± 19.55 g).
Peixe Comprimento (cm) Peso (g)
01 17 86,1
02 19 110,1
03 17 67,6
04 17 81,1
05 14 51,4
06 18,5 98,6
07 15 91,4
63
Apêndice B – Dados da contagem de 2000 células (eritrócitos) por animal, de
girinos, com o aumento de 1000x. Tabelas exibidas na ordem de contagem
evidenciando os peixes, número de células normais, alterações morfonucleares,
micronúcleos e o total de células observadas. (1) Grupo controle, (2) Grupo exposto
durante 24h e (3) Grupo exposto durante 48h.
1 – Controle
PEIXE NORMALALTERAÇÃO
MORFONUCLEAR
MICRONÚCLE
OTOTAL
01 1999 1 0 2000
02 1987 13 0 2000
03 1993 7 0 2000
04 1995 5 0 2000
05 1998 2 0 2000
06 1999 1 0 2000
07 1999 1 0 2000
2 – Exposto durante 24h
PEIXE NORMALALTERAÇÃO
MORFONUCLEAR
MICRONÚCLE
OTOTAL
01 1997 3 0 2000
02 1994 5 1 2000
03 1994 3 3 2000
04 1988 10 2 2000
05 1990 10 0 2000
06 1995 4 1 2000
07 1994 6 0 2000
64
3 – Exposto durante 48h
PEIXE NORMALALTERAÇÃO
MORFONUCLEAR
MICRONÚCLE
OTOTAL
01 1989 7 4 2000
02 1989 9 2 2000
03 1989 9 2 2000
04 1985 14 1 2000
05 1988 10 2 2000
06 1987 10 3 2000
07 1979 18 3 2000
65
Apêndice C – Dados da contagem de 2000 células (eritrócitos) por animal, de peixes, com o aumento de 100x. Tabelas evidenciando os peixes, número de células normais, células alteradas (micronúcleos + alterações morfonucleares) e o total de células observadas. (1) Grupo Controle, (2) Grupo Exposto durante 24h e (3) Grupo Exposto durante 48h.
1 – Controle
PEIXE NORMALCÉLULAS
ALTERADASTOTAL
01 1999 1 2000
02 1987 13 2000
03 1993 7 2000
04 1995 5 2000
05 1998 2 2000
06 1999 1 2000
07 1999 1 2000
2 – Exposto durante 24h
PEIXE NORMALCÉLULAS
ALTERADASTOTAL
01 1997 3 2000
02 1994 6 2000
03 1994 6 2000
04 1988 12 2000
05 1990 10 2000
06 1995 5 2000
07 1994 6 2000
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3 – Exposto durante 48h
PEIXE NORMALCÉLULAS
ALTERADASTOTAL
01 1989 11 2000
02 1989 11 2000
03 1989 11 2000
04 1985 15 2000
05 1988 12 2000
06 1987 13 2000
07 1979 21 2000