sumÁrio lista de figuras 9 lista de abreviaturas 11

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... 9

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................... 11

ABSTRACT ............................................................................................................................ 13

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14

1.1 Agente Etiológico e ciclo biológico .............................................................................................. 14

1.2 Epidemiologia e Fatores de risco ................................................................................................ 18

1.3 Manifestações clínicas................................................................................................................. 20

1.4 Os diferentes tipos de toxocaríase .............................................................................................. 21

1.5 Diagnóstico .................................................................................................................................. 22

1.6 Tratamento e controle ................................................................................................................ 26

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 27

3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 28

3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................................. 28

3.2 Objetivos Específicos ................................................................................................................... 28

4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 29

4.1 Aspectos éticos ............................................................................................................................ 29

4.2 Soroteca de camundongos .......................................................................................................... 29

4.3 Sorotecas de humanos ................................................................................................................ 30

4.4 .Identificação direta por bioinformática (HelmCop e Nematode.net) de epítopos lineares de

célula B específicos de T. canis e sua síntese. ................................................................................... 30

4.5 Lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 .................................................................................................... 32

4.6 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) .......................................................................... 32

4.6.1 ELISA anti-IgG em soros de camundongos com peptídeos sintetizados .............................. 33

4.6.1 ELISA anti-IgG de camundongos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-CTL1 e rTC-

CTL-2 .............................................................................................................................................. 34

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4.6.2 ELISA anti-IgG e anti-IgA em soros humanos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-

CTL1 e rTC-CTL-2............................................................................................................................ 34

4.6.3 ELISA anti-IgG1 e anti-IgG4 em soros humanos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-

CTL1 e rTC-CTL-2............................................................................................................................ 35

4.7 Análise Estatística ........................................................................................................................ 36

5. RESULTADOS .................................................................................................................. 37

5.1 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com peptídeos .............................. 37

5.2 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com lectinas recombinantes rTC-

CTL-1 e rTC-CTL-2. ............................................................................................................................. 46

5.3 Resultados do ELISA anti-IgG, -IgA, -IgG1 e -IgG4 de humanos com lectinas recombinantes rTC-

CTL-1 e rTC-CTL-2. ............................................................................................................................. 48

6. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 55

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 62

8. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 63

9. ANEXOS ............................................................................................................................. 72

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Machos e fêmeas de Toxocara canis ....................................................................... 14

Figura 2: Ovos contendo larvas L3 de Toxocara canis. .......................................................... 16

Figura 3: Larva L3 de Toxocara canis. ................................................................................... 17

Figura 4: Ciclo biológico Toxocara canis ............................................................................... 17

Figura 5: Reatividade do peptídeo 1 (EGGGGKKKG: miosina Toxocara canis) com soros de

camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG....... 38

Figura 6: Reatividade do peptídeo 2 (GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293)) com

soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-

IgG. ........................................................................................................................................... 39

Figura 7: Reatividade do peptídeo 3 (GGSKGFPPAPY: canal de potássio Toxocara canis)

com soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA

anti-IgG. .................................................................................................................................... 40

Figura 8: Reatividade do peptídeo 4 (PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo c E/S TES 32

Toxocara canis) com soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em

experimento de ELISA anti-IgG............................................................................................... 41

Figura 9: Reatividade do peptídeo 5 (YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293)) com

soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-

IgG. ........................................................................................................................................... 42

Figura 10: Reatividade do peptídeo 6 (KSDPDPKK: miosina Toxocara canis) com soros de

camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG....... 43

Figura 11: Curvas ROC das ELISAs utilizando os peptídeos como antígeno com os soros de

camundongos infectados por diferentes helmintoses. .............................................................. 44

Figura 12: Reatividade da lectina TC-CTL-1 com soros de camundongos infectados com

diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ...................................................... 46

Figura 13: Reatividade da lectina TC-CTL-2 com soros de camundongos infectados com

diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ...................................................... 47

Figura 14: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como

antígeno com os soros de camundongos infectados por diferentes helmintoses. ..................... 48

Figura 15: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de

humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ............. 49

10


antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 50


humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgA. ............. 51

Figura 18: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgA utilizando as lectinas recombinantes como



humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG4. ........... 53

Figura 20: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG4 utilizando as lectinas recombinantes como


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LISTA DE ABREVIATURAS

rTC-CTL-1: (recombinante) Toxocara canis – lectina tipo C -1.

rTC-CTL-2: : (recombinante) Toxocara canis – lectina tipo C -2.

ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.

ICB: Instituto de Ciências Biológicas.

UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais.

L3: Larva estágio 3.

ROC: Receiver Operator Curve.

cDNA: Ácido Desoxirribonucleico complementar.

DECIT: Departamento de Ciência e Tecnologia.

TES: Antígeno de excreção/secreção de larvas de Toxocara.

PCR: Reação em cadeia da polimerase.

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RESUMO

A toxocaríase humana é uma zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos

embrionados de nematódeos do gênero Toxocara, e em especial de Toxocara canis. No cão, é

uma parasitose intestinal crônica com distribuição mundial, com maiores prevalências em

países em desenvolvimento e de clima tropical. Nos seres humanos, Toxocara não completa

seu ciclo biológico, ocasionando em um quadro de larva migrans. O diagnóstico clínico da

toxocaríase humana é difícil devido à sintomatologia inespecífica e o diagnóstico laboratorial

geralmente é realizado por testes sorológicos indiretos e comercializado em kits (ELISA

NOVUM®, ELISA PU®; Toxocara CHEK®). Além disso, existe uma alta reação cruzada

com outras helmintoses e ao poliparasitismo em geral, diminuindo ainda mais a eficácia do

diagnóstico da toxocaríase. Devido a estes problemas, este estudo tem como objetivo avaliar o

desempenho de novos antígenos recombinantes e peptídeos de T. canis para o diagnóstico

sorológico da toxocaríase humana. Para predição de epitopos lineares para linfócitos B, o

programa BEPIPRED 1.0 foi usado e seis peptídeos sintetizados foram testados. Além disso,

duas sequências imunodominantes (rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2) do antígeno excretado e

secretado de T. canis foram selecionadas por screening em um banco de cDNA de larvas

deste helminto. Estas foram subclonadas, expressas em células BL21(DE3) e purificadas. Em

ensaios de ELISA, os peptídeos e as lectinas recombinates foram testados com soros de

camundongos (como pré-seleção para as mais promissoras) e humanos infectados por

diferentes helmintoses, para verificar o reconhecimento específico dos antígenos de T. canis.

Cálculos sobre especificidade e sensitividade de cada antígeno testado foram feitos, utilizando

análises das curvas ROC (Receiver Operator Curve) de cada ensaio. As lectinas do tipo C

recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 obtiveram 100% de sensibilidade e 100% de

especificidade no ensaio de ELISA anti-IgG com soros de camundongos. Porém, ao serem

testadas com soros humanos, observou-se uma alta reatividade cruzada com outras infecções

helmínticas, com melhor desempenho para rTC-CTL-1 em anticorpos anti-IgA e anti-IgG4,

com sensitividade de 72% e 96% e especificidade de 88.24% e 78.43%, respectivamente. Dos

6 peptídeos testados em ELISA anti-IgG com soros de camundongos, os peptídeos 1, 2 e 4

apresentaram 100% de sensitividade, e uma média de 58% de especificidade, obtendo grande

reatividade cruzada com a infecção por A. suum. Sugerimos novos testes com epítopos e

antígenos recombinantes modificados, para melhorar o desempenho para um diagnóstico mais

específico da toxocaríase humana.

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ABSTRACT

Toxocariasis is a zoonosis that affects humans by the accidential infection of

embryonated eggs of the nematode genus Toxocara and especially from T. canis. In the dog,

it causes chronic intestinal infection. Toxocara has a worldwide distribution with elevated

prevalences in underdeveloped countries and regions with tropical climate. In humans, the

parasite does not complete its life cycle, which causes a clinical picture of larva migrans. The

clinical diagnosis of human toxocariasis is difficult due to its unspecific symptoms and

diagnosis generally relies on indirect serological tests, which are commercially available

(ELISA NOVUM®, ELISA PU®; Toxocara CHEK®). Furthermore, there is a high cross-

reactivity with other helminths and polyparasitism in general, further decreasing the

efficiency of diagnosis of toxocariasis. For prediction linear epitopes for B-lymphocytes , the

BEPIPRED 1.0 was used and six synthesized peptides were tested . In addition, two

immunodominant sequences (rTC- CTL-1 and rTC-CT -2) secreted antigen and secreted T.

canis were selected for screening in a cDNA library larvae of the helminth. These were

subcloned, expressed in BL21 (DE3) cells and purified. In ELISA assays , the peptides and

lectins recombinates were tested in mice sera ( pre - selection as the most promising ) and

humans infected by different helminthiasis , to verify the specific recognition of antigens T.

canis. In each assay, sensitivity and specificity was calculated by performing a ROC

(Receiver Operator Curve) analysis. The anti-IgG ELISA with mouse sera revealed 100% of

sensitivity and specificity for the tested recombinant lectins. However, when tested with

human serum samples, a high cross-reactivity with other helminth infections resulted. The

best performance was achieved in anti-IgA and anti-IgG4 assays against rTC-CTL-1,

resulting in a sensitivity of 72,0% and 96,0% and specificity of 88,2% and 78,4%,

respectively. Out of the six peptides tested with mouse sera in anti-IgG ELISAs, peptides

number 1, 2 and 4 presented with a 100% sensitivity, but only a mean specificity o 58,0%.

Especially sera from mice infected with A. suum showed strong cross-reactivity. In order to

further improve the specific diagnosis of human toxocariasis, we suggest additional studies

with new and/or modified peptides or recombinant antigens.

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1. INTRODUÇÃO

A toxocaríase humana é uma zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos

embrionados de nematódeos do gênero Toxocara, especialmente Toxocara canis, cujo

hospedeiro definitivo é o cão (Barriga, 1991). Dentre as diferentes espécies, vale destacar o

Toxocara cati, que parasita gatos e o Toxocara vitulorum (parasito de ruminantes) que

possuem grande importância para a saúde pública (Rubinsky-Elefant et al., 2010). A

toxocaríase é uma parasitose crônica com distribuição mundial de maior prevalência em

países em desenvolvimento e de clima tropical. No entanto, a prevalência desta doença e seu

impacto na saúde pública são subestimados, mesmo em países desenvolvidos (Torgeson e

Budke 2006).

1.1 Agente Etiológico e ciclo biológico

O Toxocara é um nematódeo de grande importância para a saúde humana e animal. Ele

pertence ao filo Nemathelmintes, classe Nematoda, ordem Ascaroidea, família Ascaridae e

subfamília Ascarinae, sendo que o macho possui aproximadamente 4 a 10 centímetros, e a

fêmea entre 6 a 18 centímetros de comprimento (Figura 1), cujo hospedeiro definitivo é o cão

(Foreyt 2005).

Figura 1: Machos e fêmeas de Toxocara canis

O cão se infecta ao ingerir ovos embrionados de T. canis contendo larvas do terceiro

estágio (Schnieder et al., 2011). Os ovos ingeridos pelo cão sofrem ação do suco gástrico e as

larvas eclodem no intestino delgado, atravessa a parede intestinal, seguindo pela veia porta ou

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vasos linfáticos até o fígado, coração e então para os pulmões. Nos pulmões, as larvas

rompem os bronquíolos, alcançando a traquéia, quando são deglutidas e retornam ao intestino

delgado, onde se desenvolvem até a sua forma adulta. Após cerca de 4 a 5 semanas da

ingestão dos ovos, as fêmeas adultas de T. canis são capazes de produzir diariamente até

200.000 ovos, que serão eliminados juntamente com as fezes dos animais, tornando-se

infectante em duas a cinco semanas, sob condições ambientais adequadas de temperatura e

umidade (Schantz, 1989). A segunda rota de migração é a somática. Neste caso, quando as

larvas chegam aos pulmões há o retorno das mesmas para o coração, pelas veias pulmonares,

e assim sua migração é facilitada para qualquer parte do organismo seguindo a circulação

sanguínea. As larvas ainda podem passar por um estágio de hipobiose em tecidos ou órgãos

como fígado, rins, olhos e cérebro (Barriga 1988).

A idade do hospedeiro definitivo é determinante para o tipo de migração. Filhotes com

menos de cinco meses ainda não possuem resposta imunológica eficiente. Por isso, nesses

animais, as larvas migram pela via hepato-traqueal, retornando ao intestino delgado, onde

evoluem para as formas adultas. Aos seis meses, os cães montam uma resposta imunológica

adquirida contra o parasito. Dessa forma, as larvas que passam pelos pulmões retornam ao

coração, evadindo para os tecidos, onde permanecem em estado de hipobiose (Glickman et

al., 1978).

Os cães podem adquirir a infecção de outras maneiras que não a ingestão de ovos: a

migração transplacentária ocorre quando a cadela gestante possui larvas em hipobiose nos

tecidos, que são ativadas, provavelmente por alterações hormonais no terço final de gestação,

e alcançam o fígado dos fetos pela placenta. Os filhotes nascem com as larvas nos pulmões e,

a partir da segunda semana de vida, os parasitos adultos são aptos a produzir ovos. Além

dessa via, as larvas podem alcançar as glândulas mamárias e serem transmitidas pela via

lactogênica, desde a ingestão do colostro até 45 dias da lactação, com pico máximo de

eliminação na segunda semana. Nesse caso, a presença de ovos nas fezes dos filhotes se dá

duas semanas após a ingestão da larva pelo leite (Barriga, 1988).

As cadelas em puerpério são capazes de se infectar pela ingestão de parasitos adultos

contidos em vômitos e ovos nas fezes dos filhotes, durante a higienização da ninhada. Os cães

também podem ingerir as larvas infectantes em hipobiose dos tecidos de hospedeiros

paratênicos, como roedores e aves. Nestes animais, após a ingestão dos ovos embrionados,

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ocorre migração somática e as larvas permanecem em hipobiose sem concluir o ciclo

(Magnaval et al., 2001).

Uma vez expelidos, os ovos de T. canis (Figura 2) necessitam cerca de duas a seis

semanas sob condições favoráveis de temperatura (10-30ºC) e humidade para completar o

embrionamento e transformarem em larvas L3, da qual é o estágio da larva infectante para a

infecção. O aumento da temperatura pode acelerar o desenvolvimento dos ovos enquanto que

temperaturas abaixo de 10ºC e acima de 30ºC são hostis à maturação e sobrevivência destes.

Os ovos são muito resistentes e sobrevivem bem sobre a maioria dos invernos e climas

temperados, sobrevivendo por seis a doze meses. Alguns ovos podem ser capazes de

sobreviver em local fresco e úmido por dois a quatro anos ou mais (Gamboa 2005).

Nos seres humanos, que se comportam como hospedeiros paratênicos, a infecção por

Toxocara spp. é ocasionada pela ingestão de ovos embrionados deste nematódeo. A ingestão

de carne crua também tem sido apontada como fator de risco para aquisição de toxocaríase.

Estudos observaram que em adultos a prevalência foi de 7,8 vezes maior em pacientes com

histórico de ingestão de carne crua em relação àqueles que não possuíam esse hábito

(Morimatsu et al., 2006).

Figura 2: Ovos contendo larvas L3 de Toxocara canis.

17

Figura 3: Larva L3 de Toxocara canis. Fonte: www.cdc.gov

Ao serem ingeridos pelo homem, as larvas de T. canis (Figura 3) eclodem e

atravessam a parede do intestino delgado e ganham a circulação pela via hepática, migrando

por diversos órgãos como fígado, pulmão, coração e cérebro. Essa doença foi inicialmente

denominada de larva migrans visceral. Posteriormente, os casos com comprometimento

oftálmico receberam a denominação de larva migrans ocular, e atualmente essas síndromes

causadas por larvas de Toxocara spp. são conhecidas como toxocaríase visceral (TV) e

toxocaríase ocular (TO) (Magnaval et al., 2001).

Figura 4: Ciclo biológico Toxocara canis.

Fonte: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Toxocariasis.htm

http://www.cdc.gov/dpdx/toxocariasis/gallery.html

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1.2 Epidemiologia e Fatores de risco

A toxocaríase é uma zoonose de ampla distribuição mundial e possui uma grande

importância na saúde pública, visto que possui hospedeiros definitivos domésticos como cães

e gatos, e também hospedeiros selvagens como, por exemplo, raposas (Glickman et al., 1978).

O toxocara canis é um dos mais importantes helmintos gastrointestinais em cães, com

relatos de infecções de todas as partes do mundo. Estudos apontam que alguns países como

Nigéria, China e Itália possuem cerca de 50, 45 e 33% de cães positivos para este helminto.

No Brasil, os valores de positividade atingem de 45% até 99% em filhotes de cães

(Sowemimo, 2007; Dai et al., 2009; Habluetzel et al., 2003; Chieffi e Muller, 1976; Barriga

1988).

Esta zoonose é particularmente prevalente nos trópicos e sub-trópicos, em países menos

industrializados, onde o tratamento de cães e controle populacional é limitado. A infecção por

T. canis é uma importante causa de morbidade também em países ricos e industrializados,

especialmente em crianças e nas populações socioeconomicamente desfavorecidas (Torgerson

e Budke, 2006).

Outras espécies de Toxocara contribuem para a carga global de toxocaríase, mas sua

importância é bem menos entendida e definida, porém é importante lembrar que o T. cati

possui semelhante distribuição global como T. canis, e sua importância não pode ser ignorada.

Outras espécies como T. malaysiensis, que ocorre em gatos na Malásia e China, T. vitulorum,

que ocorre em ruminante, T. pteropodis (morcegos), e T. leonina, que ocorre em cães, gatos e

outros caninos e felinos, possuem certo potencial para causarem zoonose, porém sua

importância é muito mais limitada (Morgan, 2013).

Muitos fatores biológicos inerentes ao ciclo de vida do parasito contribuem para a

perpetuação dessa espécie. Entre esses, incluem-se as inúmeras vantagens da transmissão

vertical no hospedeiro definitivo jovem, garantido o início precoce da produção de ovos de

vermes adultos nestes. Além disso, a alta fecundidade, a sobrevivência prolongada de ovos no

ambiente, e a alta diversidade de hospedeiros definitivos e paratênicos, também são

fundamentais para o sucesso da espécie, resultando o Toxocara como um dos parasitos mais

difundidos e causando uma das zoonoses predominante em todo o mundo (Mcpherson, 2013).

19

A prevalência global de Toxocara spp. em seres humanos é influenciada por um grande e

complexo número de variáveis que estão ligados ao nível de desenvolvimento populacional,

geográfica, cultural e socioeconômico do local. Além disso, deve-se considerar também o

nível de heterogeneidade de susceptibilidade genética individual à infecção relacionado à

imunidade, co-infecção, genética, idade, sexo, nutrição e comportamento dos hospedeiros

definitivos e paratênicos como os cães e humanos (Viney e Graham, 2013).

Esses fatores, juntamente com o aumento da população humana e o alto índice de

migração global da população rural para a urbana (mais de 50% da população mundial agora

reside em áreas urbanas), aumentam ainda mais a interação entre os hospedeiros definitivos e

o homem, sugerindo que no mundo inteiro a importância da toxocaríase na saúde pública seja

cada vez maior (Macpherson, 2013). Entretanto, os fatores de risco para a transmissão da

doença variam consideravelmente em diferentes partes do mundo: a pobreza, a baixa

educação e problemas com descontrole e falta de tratamento dos hospedeiros definitivos

levará a ambientes altamente contaminados que em climas quentes e condições favoráveis irá

proporcionar oportunidade de transmissão ideal, principalmente se associada à falta de

higiene. Esses fatores de risco são observados em muitas partes do mundo (Dunsmore et al.,

1984).

Crianças, devido ao seu comportamento e seu contato próximo com animais domésticos,

principalmente cães, possuem mais contato com terra, colocam objetos em suas bocas e

associados à falta de higiene possuem um maior risco para contrair a doença. Em muitas

cidades, ambientes públicos como parques e playgrounds representam áreas de grande risco

para exposição humana aos ovos (Deplazes et al., 2011).

Estudos epidemiológicos na América Latina indicaram alta exposição de crianças por

Toxocara, resultando em uma prevalência de 28.8 a 62.3%. Áreas rurais, onde pessoas

possuem maior contato com solo e animais, tendem a uma maior prevalência, cerca de 35 a

42%, enquanto áreas semi-rurais possuem cerca de 15 a 20% e áreas urbanas por volta de 2 a

5%, principalmente em parques e playgrounds (Magnaval et al., 2001; Mendonca et al., 2012;

Maraghi et al., 2014). Em países industrializados, estudos sorológicos conduzidos em sua

maioria em crianças, apontam que a prevalência da toxocaríase varia de 0,7% na Nova

Zelândia, 1,6% no Japão, 2,4% na Dinamarca, 7,5% na Austrália, 14% nos Estados Unidos e

15% na Polônia (Fan et al., 2013). Em contrapartida, maior soroprevalência foi constatada em

20

países menos industrializados e tropicais como na África: 30% na Nigéria, 45% na

Suazilândia e 93% em La Reunion (África), 81% no Nepal, 63,2% na Indonésia e 58% na

Malásia (Ásia) e 36% no Brasil e 37% no Peru (América Do Sul) (Macpherson, 2013).

A alta soroprevalência de Toxocara reportada (14%) nos Estados Unidos, estima que

cerca de 1,3 a 2,8 milhões de pessoas possuem a infecção. Isso é um exemplo de que mesmo

em países ricos, a toxocaríase é uma zoonose de grande importância na sociedade, e junto

com outras helmintoses, são consideradas doenças negligenciadas e que não afetam somente

populações empobrecidas (Hotez, 2008).

1.3 Manifestações clínicas

No cão, os sinais da toxocaríase incluem diarreia, flatulência, distensão abdominal,

desidratação e atraso no desenvolvimento. A passagem das larvas pelos pulmões pode resultar

em tosse e quadro de pneumonia. Em migrações aberrantes, a migração larval pode ocasionar

alterações como celulite orbital e em infecções massivas, a morte do animal. A eosinofilia é

considerada a principal alteração hematológica na toxocaríase canina (Santarém et al., 2009).

Os sintomas clínicos da toxocaríase humana são causados pela migração da L3 de

Toxocara spp. através da corrente sanguínea para o interior de órgãos, incluindo músculo,

fígado, cérebro e olho. Essas migrações podem ser assintomáticas ou pode conduzir uma

ampla variedade de sintomas, dependendo do órgão invadido, a duração da migração,

intensidade da infecção, idade e resposta imunológica do hospedeiro (Despommier, 2003). A

sobrevivência de longo prazo das larvas de T. canis foi atribuída a duas estratégias

moleculares evoluídas pelo parasito: a larva libera substâncias de excreção-secreção que

incluem lectinas, mucinas e enzimas que interagem e modulam a imunidade do hospedeiro, e

secundariamente, a larva produz uma mucina de revestimento de superfície frouxamente

ligada na epicutícula do parasito. Esse revestimento permite o parasito escapar quando os

anticorpos e as células do hospedeiro aderem no mesmo, porém, esse processo resulta em uma

reação inflamatória em torno do local recém-desocupado (Maizels, 2013).

Em seres humanos a toxocaríase raramente é fatal, mas as respostas inflamatórias devido à

migração das larvas geralmente são associadas com linfadenopatia generalizada, hepatite

21

granulomatosa, endomiocardite, endoftalmite, asma e leucocitose, incluindo alta eosinofilia.

Muitos pacientes possuem hipergamaglobulinemia de IgG e IgE, manifestações cutâneas, e

raramente, meningoencefalite pode ocorrer. As infecções são geralmente autolimitadas e as

larvas ficam encapsuladas na musculatura e no fígado, e assim os sintomas desaparecem. As

síndromes da infecção por Toxocara spp. são relacionadas com a migração das larvas e da

resposta imune do hospedeiro em relação a isso (Despommier, 2003).

A toxocaríase humana possui duas classificações, que foram definidas originariamente: a

toxocaríase visceral e toxocaríase ocular. O entendimento da variedade clínica e dos sinais e

sintomas da toxocaríase evoluíram ao longo dos últimos 30 anos, e com a introdução de testes

de diagnósticos melhorados e de triagem soroepidemiológico, há uma maior compreensão da

base molecular e imunológica da evasão. Com isso, síndromes adicionais principais têm sido

descritas, como a toxocaríase comum ou disseminada, e a neurotoxocaríase (Fan et al., 2013;

Taylor et al., 1988; Smith et al., 2009).

1.4 Os diferentes tipos de toxocaríase

A toxocaríase visceral é a mais comum diagnosticada em crianças menores que oito anos

de idade, e está associada com a alta intensidade ou repetidas infecções larvais por T. canis,

das quais podem persistir por semanas ou meses. Os sintomas clássicos incluem febre,

hepatoesplenomegalia, dor abdominal, vômitos, diarreia, sintomas respiratórios como tosse e

chiados, asma, anorexia, perda de peso, fatiga, manifestações neurológicas, palidez e

ocasionalmente, urticária (Despommier, 2003).

A toxocaríase ocular é considerada rara em comparação a toxocaríase visceral, e acredita-

se que é resultado de uma baixa intensidade de infecção por T. canis, e também é mais

frequente em crianças. Casos de TO são normalmente unioculares e são causados pela

migração da L3 para o olho e resultante da reação imunológica neste. A deficiência visual

ocorre ao longo de dias ou semanas, e o nível de prejuízo depende da localização da larva.

Tardiamente, uma eosinofilia e um granuloma fibroso podem criar uma distorção e até mesmo

um descolamento da mácula, o que pode resultar em cegueira. Os impactos visuais dependem

da área específica envolvida. A toxocaríase ocular pode causar endoftalmite difusa ou papilite

(inflamação da extremidade do nervo óptico que entra no olho). Infecções em longo prazo por

22

Toxocara spp. podem levar até mesmo a uma corioretinite da membrana neovascular coroidal

(Despommier, 2003; CDC, 2011).

A toxocaríase comum ou disseminada é caracterizada pelo quadro de sintomas não

específicos da doença, sintomas leves ou assintomáticos. Inquéritos soroepidemiológicos

muitas vezes detectam anticorpos específicos anti-Toxocara em pessoas, porém o quadro

clínico não é claro, ou até mesmo é assintomático. Esses achados são caracterizados como a

toxocaríase comum e são as mais comuns, ou seja, a maioria das infecções por Toxocara

comportam desta maneira, principalmente em adultos saudáveis, o que de certa maneira

contribui para negligência e subnotificação da doença (Taylor et al., 1988).

A neurotoxocaríase, uma outra possível síndrome decorrente da infecção, surge a partir da

invasão de L3 de Toxocara no cérebro e cordão espinhal, causando meningite, encefalite,

mielite, vasculite cerebral e convulsões (Ruttinger et al., 1991).

1.5 Diagnóstico

O diagnóstico da toxocaríase humana pode ser realizado por meio direto e indireto

(exames sorológicos). O exame direto por meio de microscópio (exame histopatológico) de

Toxocara spp. em seres humanos é difícil e raramente feito, pois consiste na procura de larvas

no tecido por meio de biópsia. Além disso, as biópsias realizadas em tecidos humanos permite

a identificação do helminto por meio de PCR baseada em sequências ITS-1 e ITS-2 de rDNA

nuclear, porém este procedimento também raramente é feito e geralmente é realizado em

casos extremos da doença (Jacobs et al., 1997).

O imunodiagnóstico, que é um meio indireto de diagnóstico, é realizado por meio de

exames sorológicos que, na maioria dos testes, detectam anticoporpos circulantes no soro de

pacientes com alguma possível infecção por algum patógeno. Estes anticorpos, que são

denominados como imunoglobulinas, podem ser usados para revelar diagnóstico de várias

doenças (Abbas, 2013).

23

As imunoglobulinas constituem um grupo de glicoproteínas presentes no soro e fluidos

teciduais de todos os mamíferos e podem estar presentes na superfície celular onde funcionam

como receptores, ou também podem estar livres no sangue ou na linfa funcionando como

anticorpos. Quando a célula B entra em contato com o antígeno ela é ativada e é capaz de

liberar anticorpos, que passam a ser chamadas de plasmócitos. No ser humano existem cinco

classes de imunoglobulinas designadas como IgG, IgE, IgD, IgM e IgA.

O uso de subclasses de IgG em ensaios sorológicos podem ainda aumentar a

especificidade dos testes diagnósticos. Cada subclasse de IgG possui uma diferença biológica

e físico-químicas, e portanto, podem ser preferencialmente produzidas em resposta a

diferentes antígenos e condições patológicas (Watthanakulpanich et. al., 2008).

A IgA é a segunda imunoglobulina mais abundante no sangue. Ela é a predominante nas

secreções dos tratos gastrointestinal e respiratório, como também no colostro e leite humanos.

A IgA promove imunidade mucosa local contra vírus e parasitos e limita o crescimento

bacteriano nas superfícies mucosas. A IgA também funciona no trato gastrointestinal e mostra

uma resistência maior a enzimas proteolítica que outras classes de anticorpos (Abbas, 2013).

Na toxocaríase, esta possui grande importância devido a migração das larvas e estimulação da

ativação destes anticorpos pelas mucosas (Elefant et al., 2006).

O IgE embora presente em quantidades ínfimas no soro, é encontrada nas membranas

superficiais dos mastócitos e basófilos, possuindo peso molecular de 188.000. Ela é capaz de

sensibilizar as células nas superfícies das mucosas e ainda possui papel importante contra

helmintos, estando também associada a reações alérgicas (Abbas, 2013). Estas são

importantes na patologia da toxocaríase, que é caracterizada pela reação alérgica da migração

das larvas no homem, porém, será mais abundante na fase aguda da doença (Elefant et al.,

2006).

Em geral, o diagnóstico da toxocaríase possui vários problemas, especialmente em países

tropicais, onde o poliparasitismo é comum. O diagnóstico é feito com base na apresentação

clínica, anamnese do paciente, e principalmente pelo teste sorológico de ELISA (Enzyme

Linked Immuno Sorbent Assay), utilizando antígeno de excreção/secreção de larvas de

Toxocara (TES) comercializado em kits (ELISA NOVUM®, ELISA PU® and Toxocara

CHEK®) disponíveis e amplamente utilizados para diagnósticos e estudos sorológicos.

24

Porém, a diferença na qualidade dos antígenos utilizados e a falta de padronização de

resultados, juntamente com as diferenças populacionais de exposição ao poliparasitismo e

outros patógenos, reatividade cruzada, alimentação e condições sócio econômicas, dificultam

e tornam cada vez mais difícil o diagnóstico correto e a comparação de resultados e pesquisa

(Smith e Noordin, 2006).

O antígeno TES é um grupo de glicoproteínas secretadas pelo resultado do metabolismo

da larva do parasito durante seu desenvolvimento. Ele consiste em uma diversidade de

proteínas entre 30 a 400 kDa juntamente com grandes quantidades de carboidratos. Esta

mistura de substâncias e antígenos é altamente imunogênico durante a infecção, por isso é o

alvo principal de estudos envolvendo diagnóstico (Badley et al., 1987).

Durante o passar dos anos, vários estudos sobre o TES vem sendo realizado usando

técnicas de biologia molecular para classificar mais precisamente os componentes deste

antígeno. Com isso, uma combinação de sequências de peptídeos, anticorpos monoclonais e

técnicas de DNAs recombinantes, caracterizaram três conjuntos de proteínas e glicoproteínas

do antígeno TES, nomeados como: TES-26, TES-32/70 e TES-120. Dos quais possuem

grande importância na reação parasito-hospedeiro na toxocaríase (Maizels, 2013).

O uso de antígenos TES do parasita resultou num aumento da sensibilidade e

especificidade dos testes comerciais citados, porém como ainda existe uma reatividade

cruzada com antígenos de outras helmintoses, este teste deve ser usado com muito critério

para evitar resultados falsos positivos quando aplicado em áreas endêmicas (Turrientes et al.,

2011). Mesmo usando subclasses de IgG (Watthanakulpanich et al., 2008) ou antígenos

recombinantes do parasita (Mohamad et al., 2009), o problema da reatividade cruzada com

antígenos de outras helmintoses ainda continua. O poliparasitismo, principalmente por

helmintos gastrointestinais, podem reduzir a especificidade em cerca de 50% nos testes de

ELISA na detecção de anticorpos IgG e suas subclasses (Watthanakulpanich, 2008).

Devido ao problema da reatividade, soros de pacientes que forem positivos para Toxocara

spp. em testes de ELISA, devem ser confirmados por „western blotting‟ (WB) baseado no

reconhecimento de antígenos TES fracionados e nativos de larvas de T. canis, das quais vêm

demonstrando um aumento significante da especificidade da reatividade de bandas de baixo

25

peso molecular (24-32 kDa), anteriormente propostas como específicas deste helminto (Smith

et al., 2009).

Além dos antígenos providos diretamente dos parasitas, a bioinformática proporciona

informações sobre genomas, transcriptomas e proteomas que podem ser usadas para buscar

sequencias específicas em bancos de dados, resultando na previsão de candidatos para novas

vacinas, predição de antígenos/epítopos para diagnóstico ou de novas drogas (Albubacker et

al., 2011; Pinheiro et al., 2011).

Mais recentemente um novo banco de dados, HelmCoP, foi criado para helmintos que

já contem informações sobre várias espécies de helmintos e com a expectativa de incluir

genomas de mais 20 espécies em breve (Abubucker et al., 2011). Outro banco de dados,

Nematode.net, já contem informações sobre sequencias de ESTs/cDNA de 30 espécies de

nematódeos parasíticos (Martin et al., 2009). No caso do T. canis ainda não existe o genoma

completo disponível nos bancos de dados, porém, dispomos de publicação de sequencias

expressas deste, o que permite na utilização dessas técnicas de bioinformática para a predição

de epítopos específicos para diagnóstico (Zhou et al., 2011).

Em outra via do diagnóstico, as técnicas de imagem podem ser úteis para auxiliar este em

pacientes com toxocaríase. No caso da visceral, com um quadro mail definido, lesões

hepáticas ovais com cerca de 1.0 a 1.5 cm de diâmetro, características deste tipo de infecção,

podem ser detectadas em tomografia computadorizada, ressonância magnética e

ultrassonografia, ajudando na confirmação do diagnóstico. As lesões de Toxocara spp. são

diferentes de nódulos metastáticos pois estes tem margens difusas, tamanhos uniformes e

formas não esféricas (Lim, 2008).

Em relação aos diferentes tipos da doença, o diagnóstico da neurotoxocaríase também é

complicado e inclui os exames sorológicos para detectar a presença de anticorpos anti-

Toxocara, porém estes podem estar baixos ou até mesmo ausentes. Portanto a realização de

tomografia computadorizada e outros exames de imagens para possível visualização da larva

são cruciais para o diagnóstico correto (Finsterer e Auer, 2007). Nessa mesma linha, o

diagnóstico da TO também é complicado devido à ausência ou baixa presença de anticorpos

sanguíneos, e comparado a NT, difere-se apenas pelas técnicas de imagens que são

oftalmológicas, como a tomografia de coerência óptica (Arevalo et al., 2013).

26

1.6 Tratamento e controle

O tratamento quimioterápico em pacientes com toxocaríase varia de acordo com a

severidade e a localização dos sintomas. Pacientes com sintomas de toxocaríase visceral e

neurotoxocaríase são administrados anti-helmínticos como Albendazol, Tiabendazol e

Mebendazol juntamente com anti-inflamatórios corticoides para aliviar os sintomas causados

pela severa resposta inflamatória do sistema imune. No caso da toxocaríase ocular, o

tratamento é realizado com corticoides e procedimentos oftalmológicos delicados para

retirada da larva (Despommier, 2003; Magnaval e Glickman, 2006).

A grande variedade doméstica e selvagem de hospedeiros definitivos e paratênicos assim

como suas formas de transmissão de Toxocara spp. tornam o controle deste helminto

complicado. Dentro dos principais reservatórios e vias de transmissão do parasito como a

infecção intestinal do hospedeiro definitivo, ovos no ambiente, larvas nos hospedeiros

paratênicos e larvas somáticas nos hospedeiros, a população de mais fácil controle da

toxocaríase são os animais de estimação como os gatos e os cães (Schnieder, 2001). Existem

excelentes tratamentos para estes animais, e se estes forem feitos de forma correta, ocorre

uma considerável redução da contaminação ambiental por estes reservatórios do toxocara

(Palmer et al., 2010).

A educação da população também exerce importante papel para o controle deste helminto,

pois é fundamental para a redução da infecção humana. Os veterinários desempenham um

importante papel na educação dos donos dos animais domésticos, orientando quanto ao perigo

da zoonose, e alertando principalmente os pais das crianças e elas mesmas, para uma boa

educação higiênica ao se envolver com os animais (Palmer et al., 2010).

Outra medida crucial para a redução de Toxocara canis. no ambiente, é o controle do

número de cães errantes principalmente nas cidades onde as áreas de lazer são compartilhados

com estes animais por muitas pessoas e crianças. Esta medida foi alcançada em certo ponto

pela América do Norte, Europa e Austrália em cerca de 30 anos atrás, mostrando que é

possível tal medida (Beck, 1979).

27

Um costume importante educacional por parte dos donos, e que também contribui para a

diminuição da zoonose, é a coleta das fezes realizadas por seu cão em áreas públicas. Isto

pode permitir que as pessoas e os cães possam compartilhar áreas públicas com seus donos

nas grandes cidades. Restringir os cães em playgrounds, parques e jardins pode ser a medida

mais efetiva de controle, porém mais difícil de ser implantada além de causar transtornos nos

donos que podem fazer questão da companhia de seus animais de estimação (Kirchheimer e

Jacobs, 2008).

Uma boa higiene e o cozimento adequado dos alimentos pode impedir a ingestão acidental

de ovos encontrados no ambiente pelos homens. Infelizmente tais medidas de higiene, a

princípio são simples e fáceis de serem implementadas, porém na prática não é dessa forma,

especialmente devido ao grande contato do homem com o cão e às crianças que têm maior

dificuldade. Além disso, é relevante considerar a grande resistência dos ovos a produtos que

podem destruir o Toxocara spp. no ambiente, e o aumento da tendência global de comer carne

e vegetais cru ou mal cozidos, que facilita a transmissão deste helminto (Macpherson, 2005).

2. JUSTIFICATIVA

Devido à grande frequência de cães infectados por Toxocara canis e ao grande potencial

destes contaminarem o ambiente domiciliar, peridomiciliar e lugares públicos, como praças e

parques, a toxocaríase humana torna-se uma zoonose de importância para a saúde pública

(Hotez, 2008). As áreas rurais tendem a apresentar maior prevalência (35-42%) comparada a

semi-rural (15-20%), e urbana (2-5%). No entanto, as áreas urbanas, particularmente em

parques e praças, foram mostradas um elevado número de ovos de Toxocara acarretando em

um grande risco de infecçãonos seres humanos. Sendo assim, a toxocaríase é considerada uma

das importantes doenças negligenciadas, principalmente nas Américas (Macpherson, 2013).

O diagnóstico da infecção humana geralmente está sendo feito por testes indiretos,

aplicando testes de ELISA ou WB. Entretanto, mesmo os testes descritos com antígenos

fragmentados ou antígenos recombinantes demostram reatividades cruzadas com outras

helmintoses comumente encontradas em países tropicais e em desenvolvimento como o Brasil

(Turrientes et al., 2011). Dentre estas helmintoses, têm-se o Schistosoma mansoni,

28

Angiostrongylus, Strongyloides e ainda, a que possui maior reatividade cruzada, as espécies

de Ascaris (Smith et al., 1983).

Portanto, o presente estudo se justifica pela necessidade da busca por novos antígenos

para o diagnóstico da toxocaríase com uma sensitividade e especificidade efetiva,

principalmente tentando eliminar a reatividade cruzada no diagnóstico com outros helmintos,

especialmente com Ascaris lumbricoides, visto que ao contrário dos testes comerciais, que

ainda podem apresentar uma grande reatividade cruzada, usaremos lectinas recombinantes

imunodominantes (rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2) para o estudo.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar o desempenho de novos antígenos e peptídeos por meio de ensaios de ELISA

indireta com soros de camundongos e humanos infectados por diferentes espécies de

helmintos.

3.2 Objetivos Específicos

- Identificar novos antígenos e/ou epítopos de T. canis por meio da busca em bancos de

dados com genomas completos ou sequências de ESTs, como HelmCoP e

Nematode.net e selecionar sequências de peptídeos específicas para linfócitos B.

- Testar e avaliar peptídeos promissores em ensaios de ELISA anti-IgG com soros de

camundongos infectados por diferentes helmintoses.

- Testar e avaliar as lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 em ensaios de

ELISA anti-IgG com soros de camundongos infectados com diferentes helmintoses.

- Testar e avaliar as lectinas TC-CTL-1 e TC-CTL-2 em ensaios de ELISA anti-IgG,-

IgG1,-IgG4 e -IgA com soros de humanos infectados por diferentes helmintos.

29

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Aspectos éticos

O presente projeto é uma continuação do projeto de pesquisa intitulado “Identificação de

proteínas específicas para o imunodiagnóstico da larva migrans humana” (ETIC 223/02,

Parecer n° 124/02) e do projeto “Novo diagnóstico para toxocaríase humana” (Parecer CAEE

– 05548512.5.0000.5149) do Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas

da UFMG.

4.2 Soros de camundongos

Para os testes de ELISA com soros de camundongos infectados, foram utilizados

sorotecas do Laboratório de Helmintoses Intestinais do departamento de Parasitologia e

Laboratório de Esquistossomose e Imunohelmintologia localizado no ICB-UFMG. Sendo

assim, usou-se:

- Nove soros de camundongos C57BL/6 infectados 3 vezes com 500 ovos de T. canis,

sendo um intervalo de duas semanas em cada infecção: o soro foi coletado com 50 dias

pós infecção.

- Nove soros de camundongos C57BL/6 infectados 3 vezes com 500 ovos de Ascaris

suum, sendo um intervalo de duas semanas em cada infecção: o soro foi coletado com 50

dias pós-infecção.

- Oito soros de camundongos Swiss coinfectados por Schistosoma mansoni (infecção

injetada contendo 25 cercárias) e Angiostrongylus costaricensis (infecção realizada por

gavagem contendo 8 larvas L3). O soro foi coletado quando o camundongo possuía 125

dias pós-infecção de S. mansoni e 21 dias de infecção por Angiostrongylus, totalizando 3

semanas de co-infecção.

- Cinco soros de camundongos BALB/C infectados por meio subcutâneo contendo 25

cercarias de Schistosoma mansoni. O soro foi coletado com 50 dias pós-infecção.

30

- Seis soros de camundongos BALB/C infectados por meio subcutâneo contendo 700

larvas L3 de Strongyloides venezuelensis. O soro foi coletado com 14 dias pós-infecção.

- Quatro soros de camundongos BALB/C não infectados como controle negativo.

Em cada momento das infecções experimentais, os animais de cada grupo foram

anestesiados com injeção intraperitoneal de solução de ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10

mg/kg). Para cada 12-15 g foram aplicados 100 ml da solução e, quando necessário, aplicar

depois mais ¼ a ½ da dose inicial. Após confirmação da anestesia coletou-se a amostra de

sangue por punção cardíaca ou plexo braquial dos animais anestesiados. Posteriormente, cada

animal será eutanasiado por sobredose de ketamina e xilazina para realização de necropsia.

4.3 Soros de humanos

Os soros humanos de pacientes com exames de fezes positivos para Schistosoma mansoni,

Ascaris summ (infecção experimental em humanos, 70 dias pós-infecção), negativos e de

pacientes com toxocaríase confirmados por Western blot, que em parte já foram usados em

ensaios anteriores por Peixoto et al., 2011, foram obtidos pelas sorotecas do Laboratório de

Imunologia e Genômica de Parasitos e do Laboratório de Helmintoses Intestinais (ambos

ICB-UFMG). Cinco soros positivos por teste comercial de ELISA (RIDASCREEN®

Toxocara IgG, R-Biopharm, Alemanha) e com suspeita de toxocaríase por anamnese foram

fornecidos pelo Instituto Evandro Chagas de Belém, e acrescentados nos testes. Soros de

pacientes positivos para exames de fezes por ancilostomídeos também foram utilizados no

estudo, e fornecidos pelo Instituto Evandro Chagas do Pará.

Sendo assim, no total foram usados 25 soros de pacientes com Toxocara, 5 com Ascaris

suum (projeto Ascaris humano, Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, CAAE:

26945814.1.0000.5149), 20 com ancilostomídeos (projeto DECIT, Pará), 16 com Schistosoma

mansoni (projeto DECIT, Januária) e 10 negativos (projeto DECIT, Januária).

4.4 .Identificação direta por bioinformática (HelmCop e Nematode.net) de epítopos lineares

de célula B específicos de T. canis e sua síntese.

31

Os epítopos lineares para linfócitos B foram preditos usando o programa BEPIPRED

1.0 („B cell epitope prediction‟) (Larsen et al., 2006). O programa avalia todos os

aminoácidos da sequência dando uma pontuação baseado na hidrofilicidade (Parker, 1989) e

no método de cadeia de Markov. Vários aminoácidos seguidos com pontuação igual ou maior

que 1.3 formam um epítopo linear. O programa não apresenta limitações para o número

mínimo de aminoácidos para formar um epítopo. Para limitar esse tamanho, um script PERL

(filtro) do grupo da Profa. Daniella Bartholomeu foi criado para selecionar somente os

epítopos com tamanho igual ou maior que quinze aminoácidos (Freitas et al., 2011). Peptídeos

com alta similaridade com proteinas de de A. lumbricoides foram eliminados.

Após a busca, identificou-se um total de 154 proteínas de T. canis depositada no NCBI

(National Center for Biotechnology Information) na data de acesso em 24/07/2013, das quais

foram recuperadas para análise. Epítopos lineares de células B foram preditos utilizando o

programa Bepipred 1.0, considerando um valor de corte de 1.3, que representa 96% de

especificidade e 13% de sensibilidade.

Foram identificados 18 peptídeos não redundantes com alto potencial de ser um

epítopo. Para identificar potenciais epítopos específicos de T. canis, foi utilizado o algoritmo

BLASTP para alinhar os peptídeos não redundantes com o proteoma predito baseado no

genoma de A. summ versão 1.0 (contendo 18542 proteínas). Sendo assim, foram considerados

específicos epítopos com identidade e cobertura menor de 70%.

Um total de 15 epítopos foram considerados específicos para T. canis:

EAKNQDSTT; EGGGGKKKG; EIPTPDTTVSDD; ENGDPSDA; ESKPQPKAPAK;

GGRAPPKHDNP; GGSKGFPPAPY; KNRKPGDKSSE; KPETDSLAT; KQKGQNAT;

KSDPDPKK; NPADSMQA; PAATTTAAPGVTTT; SSKSKPQPKVP; YGPGAAAS.

Destes epítopos promissores, seis foram selecionados de acordo com sua origem e

sintetizados (JPT Peptide Technologies, Berlim, Alemanha):

1) EGGGGKKKG: miosina de T. canis.

2) GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293): fungo.

3) GGSKGFPPAPY: canal de potássio T. canis.

4) PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo E/S TES 32 T. canis.

32

5) YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293): fungo.

6) KSDPDPKK: miosina T. canis.

Os peptídeos foram recebidos liofilizados em uma concentração de 10 mg. Cada um deles

foi reconstituído em 1 mL de água bidestilada, resultando em uma concentração de 10

mg/mL. Estes foram aliquotados a 100 µL por tubo (10 tubos para cada peptídeo) e

armazenados em freezer -20ºC.

4.5 Lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2

As lectinas recombinantes TC-TCL-1 e TC-TCL-2 foram produzidas pelo grupo de

Dr. Bin Zhan da Escola de Medicina do Baylor College, localizada em Houston, Texas, EUA.

Estas lectinas foram selecionadas a partir de proteínas imunodominantes selecionadas por

screening em bancos de dados cDNA de larvas de T. canis, a partir do antígeno TES-32, e

após a seleção, foram subclonadas, expressas em células BL21(DE3) de Escherichia coli e

purificadas para os ensaios de ELISA.

4.6 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Ensaios de ELISA indireto foram utilizados para dosagem de anticorpos específicos

em soros de camundongos e de seres humanos, contra os peptídeos sintetizados e as lectinas

TC-CTL-1 e TC-CTL-2. No caso do ELISA de camundongos, foi usado como anticorpo

secundário anti-IgG (Anti-camundongo IgG peroxidase, anticorpo produzido em coelho,

SIGMA-ALDRICH®, EUA). Em ensaios com soros humanos, foram usados anti-IgG-AP

(Anti-Humano IgG, específico para cadeia y e conjugado de fosfatase alcalina, SIGMA-

ALDRICH®, EUA), anti-IgG1(Anti-Humano IgG1, Clone 8c/6-39, biotinilado, SIGMA-

ALDRICH®, EUA), anti-IgG4 (Anti-Humano IgG4-Biotinilado, clone HP-6025, biotinilado,

33

SIGMA – ALDRICH®, EUA) e anti-IgA-AP (Anti-Humano IgA,específico para cadeia α,

conjugado de fosfatase alcalina, SIGMA-ALDRICH®, EUA) como anticorpos secundários.

4.6.1 ELISA anti-IgG em soros de camundongos com peptídeos sintetizados

Para este teste foi usada a placa de 96 poços (COSTAR®, EUA, 96 poços, Nº2595,

vinil; para ensaios com proteínas). O ELISA indireto foi realizado em três etapas:

1) Sensibilização;

2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário;

3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação.

Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em água bidestilada

acrescida do peptídeo testado, em uma concentração de 10 µg/mL e volume total de 100 µl

por poço, incubados durante a noite à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda

etapa, da qual foi realizado o bloqueio com solução de PBS a 2% de albumina de soro bovina

(BSA, SIGMA-ALDRICH®, EUA) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o bloqueio, foi feito

duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e aplicado o

anticorpo primário (soros) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 0,05%, incubado

durante a noite em geladeira 4-8 ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a lavagem das

placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco vezes, e então

aplicado o anticorpo secundário IgG-peroxidase (SIGMA-ALDRICH®,USA) em uma

diluição de 1:5000 em PBS Tween 0,05%, 100 µl em cada poço, e incubado durante duas

horas à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita lavagem das placas com 200 µl em cada poço

de PBS Tween 0,05% por cinco vezes e feita a adição de 100 µl de substrato OPD (o-

phenylenediamine dihydrochloride, Thermo Scientific®, EUA) na concentração de 0,05

gramas diluído em 30 ml de tampão citrato-fosfato (Na2HPO4.12 H2O). A reação

colorimétrica em temperatura ambiente foi interrompida após 20 minutos pela adição de 50 µl

em cada poço de solução de parada (H2SO4 2M), e levada para leitura no leitor de ELISA

(Versa Max, Molecular Devices®) a 490 nm.

34

4.6.1 ELISA anti-IgG de camundongos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-CTL1

e rTC-CTL-2

Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade

de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas:




Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH

9,6) acrescido das lectinas rTC-CTL-1 ou rTC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL,

incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. A segunda e a terceira etapa foram realizadas

de acordo com o protocolo descrito no item 4.6.1.

4.6.2 ELISA anti-IgG e anti-IgA em soros humanos com lectinas recombinantes de

T.canis: rTC-CTL1 e rTC-CTL-2







9,6) acrescido da lectina TC-CTL-1 ou TC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL,

incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda

etapa, da qual foi realizado o bloqueio com solução de PBS a 2% de albumina de soro bovina

(BSA, SIGMA-ALDRICH®, EUA) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o bloqueio, foi feito

duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e aplicado o

anticorpo primário (soros humanos) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 0,05%,

incubado durante a noite em geladeira 2ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a lavagem

das placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco vezes, e

35

então aplicado o anticorpo secundário IgG fosfatase alcalina (SIGMA-ALDRICH®, EUA) ou

IgA fosfatase alcalina (SIGMA-ALDRICH®, EUA) em uma diluição de 1:5000 em PBS

Tween 0,05%, 100 µl em cada poço, e incubado durante duas horas à 37ºC. Após o tempo de

espera, foi feita lavagem das placas com 200 µl em cada poço de PBS Tween 0,05% por cinco

vezes e feita a adição de 100 µl de um par de comprimidos diluídos em água bidestilada de

substrato pNPP e tampão (SIGMAFAST™ p-Nitrophenyl Phosphate Tablets, SIGMA®,

EUA). Foi esperado 20 minutos em temperatura ambiente e sob abrigo da luz para a reação

colorimétrica e levada para leitura no leitor de ELISA (Versa Max, Molecular Devices®,

EUA) a 405 nm.

4.6.3 ELISA anti-IgG1 e anti-IgG4 em soros humanos com lectinas recombinantes de

T.canis: rTC-CTL1 e rTC-CTL-2





3) Diluição e adição do anticorpo secundário, aplicação da streptavidina ligada a

fosfatase alcalina e revelação.


9,6) acrescido da lectina rTC-CTL-1 ou rTC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL,

incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda

etapa, da qual foi realizado o bloqueio com 200 µl por poço de solução de PBS caseína

(Casein, Bovine Milk da marca CALBIOCHEM®) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o

bloqueio, foi feita duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e

aplicado o anticorpo primário (soros humanos) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween

0,05%, incubado durante a noite em geladeira 2ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a

lavagem das placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco

36

vezes, o anticorpo secundário IgG1 ou IgG4 biotinilados (ambos SIGMA-ALDRICH®, EUA)

em uma diluição de 1:5000 em PBS Tween 0,05%, 100 µg/mL em cada poço, e incubado

durante duas horas à 37ºC. Feito cinco lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS

Tween 0,05% e aplicado 100 µl de Streptavidina-AP (Streptavidin-Alkaline Phosphatase from

Streptomyces avidinii (SIGMA®, USA) na proporção de 1:2000 em tampão de bloqueio de

caseína 0,25% por uma hora e meia à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita lavagem das

placas com 200 µl em cada poço de PBS Tween 0,05% por cinco vezes e feita a adição de 100

µl de um par de comprimidos diluídos em água bidestilada de substrato pNPP e tampão

(SIGMAFAST™ p-Nitrophenyl Phosphate Tablets, SIGMA®, EUA). Foi esperado 40

minutos em temperatura ambiente para a reação colorimétrica e levada para leitura no leitor

de ELISA (Versa Max, Molecular Devices®) a 405 nm.

4.7 Análise Estatística

Os resultados da sorologia foram expressos em média ± desvio padrão. Utilizou-se o

teste de Kolmogorov-Smirnov, para verificar a normalidade das amostras e para comparação

entre os grupos com diferentes helmintoses. Para os valores que seguiram um padrão de

normalidade, foi utilizada análise variância ANOVA com ajuste pós-teste Tukey, e então

aplicado o Teste t de Student. Para aqueles que não seguiram padrão de normalidade, foi

utilizada como análise de variância o Kruskal-Wallis com ajuste de pós-teste Dunn`s, e então

aplicado o U-test de Mann-Whitney. Todos os testes e análises foram realizados pelo software

GraphPad Prism® 5 (GraphPad Software Inc.), considerando-se um nível de significância de

5% (p < 0,05).

Para fins de cálculo de porcentagens de especificidade e sensitividade dos peptídeos e

lectinas testados, foi utilizado a linha de corte definida pela curva ROC (Receiver Operator

Curve), que segundo Martinez et al. 2003, é uma função contínua da sensibilidade e

especificidade para diversos valores obtidos dentro do espaço amostral ligados por linha reta.

37

5. RESULTADOS

5.1 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com peptídeos

No total foram testados seis peptídeos, como referido antes na metodologia. O

Peptídeo 1 (Figura 5), refere-se a sequência EGGGGKKKG com origem de miosina de T.

canis. De acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov, as amostras seguem padrão de

normalidade e verifica-se uma diferença significativa entre a média dos soros negativos e a

média dos soros com infecção de T. canis (p ≤ 0.001). A sensibilidade do ensaio resultou em

100% dos soros com infecção de T. canis reconhecidos, porém, houve reatividade cruzada,

especialmente com soros de animas infectados com A. suum e com animais co-infectados com

S. mansoni e A. costaricensis, resultando em uma especificidade total do ensaio sorológico em

62,5%.

38

Peptídeo 1

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

isto

/Angio

Sch

isto

som

a

Strongyl

oides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0100%

37,5%100%

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

nm

]

0%0% 0%

Soros camundongos

Figura 5: Reatividade do peptídeo 1 (EGGGGKKKG: miosina T. canis) com soros de

camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG.

Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio

em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais:

Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por

Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8);

Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S.

venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha

pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor relação de

sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é

indicado.

O peptídeo 2 (Figura 6), refere-se a sequência GGRAPPKHDNP, depositado no banco

de dados com origem do fungo Aspergillus fumigatus (Af293). Na reação de ELISA, esse

peptídeo mostrou uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 53,13% (menor em

relação ao peptídeo 1). As amostras seguem um padrão de normalidade e verifica-se uma

diferença significativa entre a média dos soros negativos com a média dos soros com infecção

de T. canis (P=0.0166). Apesar da sensibilidade satisfatória de 100% de reconhecimento dos

soros de T. canis, novamente verificou-se uma reatividade cruzada principalmente com soros

de animais infectados por A. suum e animais co-infectados com S. mansoni e A. costaricensis,

o que resulta em uma especificidade de 53,13%.

39

Peptídeo 2

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

isto

/Angi

o

Sch

isto

som

a

Strongyl

oides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

nm

]

0%

100%

77,3%

0% 0%

100%

Soros camundongos

Figura 6: Reatividade do peptídeo 2 (GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293))

com soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de

ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto

com o valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos

experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos

infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A.

costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides:

infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados

(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor

relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada

grupo é indicado.

O peptídeo 3 (Figura 7) corresponde a sequência GGSKGFPPAPY, tendo como

origem parte do canal de potássio de T. canis. Em geral, foi observada uma reatividade menor

a este peptídeo. Na performance do teste para o grupo infectado com T. canis, resultou uma

sensitividade mais baixa que nos testes anteriores, de 77,78%, e uma especificidade de

62,50%. O teste segue padrão de normalidade e possui diferença significante entre a média

dos soros negativos e a média dos soros infectados por T. canis (P= 0.0049). Mesmo

apresentando esta diferença significante, o não reconhecimento de todos os soros infectados

40

por T. canis, o que não foi observado nos peptídeos anteriores, diminui sua sensibilidade,

porém o padrão de especificidade mantém o mesmo que os demais. De novo, soros de animais

infectados com A. suum demonstraram uma reatividade maior (p= 0.0080) quando

comparados com a infecção por T. canis.

Toxo

cara

A. s

uum

Sch

isto

/Ang

io

Sch

isto

som

a

Stron

gylo

ides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

Peptídeo 3

0%

100%

50%

0%

0%

75%

Ab

so

rb

ân

cia

[4

90

nm

]

Soros Camundongos

Figura 7: Reatividade do peptídeo 3 (GGSKGFPPAPY: canal de potássio T. canis) com

soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA

anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o

valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos







grupo é indicado.

O peptídeo 4 (Figura 8), é a sequência PAATTTAAPGVTTT e tem como origem na

lectina tipo E/S TES 32 de T. canis. Como observado nos dois primeiros peptídeos, este

mostrou uma sensibilidade de 100% e novamente seguiu um padrão de especificidade de

41

59,38%. De acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov, as amostras seguem padrão de

normalidade e novamente os valores da média dos soros negativos e os soros infectados por T.

canis possuem diferença significativa (P= 0.0025). Sua sensibilidade é satisfatória, porém

como observados em todos os outros peptídeos, também possui reatividade cruzada com A.

suum e os soros co-infectados.

Peptídeo 4

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

isto

/Angio

Sch

isto

Strongyl

oides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

nm

]

0%

100%

50%

0%100%

0%

Soros camundongos

Figura 8: Reatividade do peptídeo 4 (PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo c E/S TES 32 T.

canis) com soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento

de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto

com o valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos







grupo é indicado.

O peptídeo 5 (Figura 9) e o peptídeo 6 (Figura 10) correspondem as sequências

YGPGAAAS (origem do fungo Aspergillus fumigatus (Af293)) e KSDPDPKK (origem da

42

miosina de T. canis) respectivamente. Estes peptídeos, alcançaram resultados menos

promissores, sendo o Peptídeo 5 mostrando uma sensibilidade de 100%, porém baixa

especificidade de 34,38%, com reatividade em todos os grupos, inclusive os negativos (Figura

5). O Peptídeo 6, alcançou uma sensibilidade menor, de 88,89%, e uma especificidade de

40,63%, mostrando uma reatividade maior nos negativos do que nos soros infectados por T.

canis (Figura 6).

Peptídeo 5

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

isto

/Angio

Sch

isto

Strongyl

oides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

nm

]

33,3%

100%

75%

66,6%33,4%

100%

Soros camundongos

Figura 9: Reatividade do peptídeo 3 (YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293)) com

soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA

anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o

valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos







grupo é indicado.

43

Peptídeo 6

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

isto

/Angio

Sch

isto

Strongyl

oides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

nm

]75%

72%

33%0% 20%11%

Soros camundongos

Figura 10: Reatividade do peptídeo 3 (KSDPDPKK: miosina T. canis) com soros de

camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG.

Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio

em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais:

Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por

Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8);

Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S.

venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha

pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor relação de

sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é

indicado.

Com excessão do peptídeo 3 e 6, todos os soros de camundongos infectados por T.

canis apresentaram valores de absorbância acima do valor da linha de corte, resultando em

uma sensibilidade de 100% para estes soros, como se pode observar nos gráficos da curva

ROC (Figura 7).

Como em todos os peptídeos houve reatividade cruzada, principalmente com os soros

de camundongos infectados por A. suum, nenhum peptídeo atingiu 100% de especificidade.

As curvas ROC utilizadas na definição dos valores da linha de corte no ensaio de

ELISA com os peptídeos podem ser visualizados a seguir na Figura 11.

44

A) Curva ROC Peptídeo 1

0 50 100

150

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

B) Curva ROC Peptídeo 2

0 50 100

150

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

C) Curva ROC Peptídeo 3

0 50 100

150

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

D) Curva ROC Peptídeo 4

0 50 100

150

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

E) Curva ROC Peptídeo 5

0 20 40 60 80 100

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

F) Curva ROC Peptídeo 6

0 20 40 60 80 100

0

50

100

150

% S

en

sib

ilid

ad

e

% Especificidade

Figura 11: Curvas ROC das ELISAs utilizando os peptídeos como antígeno com os soros

de camundongos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC foram utilizadas

no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA com os peptídeos, de forma

maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T. canis. A) Curva ROC do

peptídeo 1 utilizando soros de camundongos com diferentes helmintoses e assim

45

respectivamente: B) Curva ROC do peptídeo 2 C) Curva ROC do peptídeo 3 D) Curva ROC

do peptídeo E) Curva ROC do peptídeo 5 F) Curva ROC do peptídeo 6. No eixo da ordenada

está representada a sensibilidade alcançada nos ensaios, e no eixo das abscissas está

representada a especificidade alcançada também nestes.

46

5.2 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com lectinas

recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2.

As lectinas recombinantes rTC-CTL-1 (Figura 12) e rTC-CTL-2 (Figura 13),

apresentaram no ensaio uma sensibilidade e especificidade de 100%, baseadas na curva ROC.

As amostras seguem padrão de normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, e os valores

da média dos resultados dos soros negativos e a média dos soros infectados por T.canis

possuem diferença significativa em ambas lectinas (P= 0.0001). Além disso, nestes ensaios,

pode-se constatar também uma diferença significativa entre a média dos valores dos soros

infectados por A. suum e a média dos valores dos soros infectados por T. canis, o que é um

resultado promissor devido à eliminação da reatividade cruzada (P= 0.0001).

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

ist/A

ngio

Sch

isto

som

a

Strongilo

ides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Lectina rTC-CTL-1

100%

Ab

sorb

ãn

cia

[4

90

nm

]

Soros de Camundongos

Figura 12: Reatividade da lectina rTC-CTL-1 com soros de camundongos infectados por

diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de

absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio em cada grupo (barra

horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: Toxocara: camundongos

infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por Ascaris suum (n=9);

Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-

infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. venezuelensis (n=6); e

Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha pontilhada corresponde à

linha de corte do experimento com base na melhor relação de sensitividade e especificidade

(análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é indicado.

47

Lectina rTC-CTL-2

Toxoca

ra

A. s

uum

Sch

ist/A

ngio

Sch

isto

som

a

Strongilo

ides

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

100%

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

nm

]

Soros de Camundongos

Figura 13: Reatividade da lectina rTC-CTL-2 com soros de camundongos infectados por

diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de

absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio em cada grupo (barra

horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: Toxocara: camundongos

infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por Ascaris suum (n=9);

Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-

infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. venezuelensis (n=6); e

Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha pontilhada corresponde à

linha de corte do experimento com base na melhor relação de sensitividade e especificidade

(análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é indicado.

Os camundongos infectados por T. canis, tanto para o antígeno rTC-CTL-1 e rTC-

CTL-2, apresentaram valores de absorbância acima do valor da linha de corte, resultando em

uma sensibilidade de 100%. Como nenhum dos soros infectados por outras helmintoses e

controle negativo apresentou valores acima da linha, a especificidade dos ensaios também

foram de 100%.

As curvas ROC utilizadas na definição dos valores da linha de corte no ensaio de

ELISA com as lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros de camundongos podem ser

visualizados a seguir na Figura 14.

48

A) ROC rTC-TCL-1 Soros Camundongos

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

100% - Especificidade

10

0%

- S

en

sib

ilid

ad

e

B) ROC rTC-TCL-2 Soros Camundongos

0 50 100

150

0

50

100

150

100% - Especificidade

10

0%

- S

en

sib

ilid

ad

e


antígeno com os soros de camundongos infectados por diferentes helmintoses. As curvas

ROC foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA com as

lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T. canis. A)

Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de camundongos com diferentes

helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de camundongos com

diferentes helmintoses. No eixo da ordenada está representada a sensibilidade alcançada no

ensaio, e no eixo das abscissas está representada a especificidade alcançada neste.

5.3 Resultados do ELISA anti-IgG, -IgA, -IgG1 e -IgG4 de humanos com lectinas

recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2.

Os resultados a seguir demonstram os testes de ELISA contra diferentes anticorpos

realizados com as lectinas recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 em soros de humanos. O

ELISA anti-IgG rTC-CTL-1 (Gráfico A, Figura 15), apresentou uma sensibilidade de 92% e

uma especificidade de 66.67% na reação. Nota-se que os soros infectados por Toxocara

possuem maior reatividade (92%) e em seguida, os soros infectados por Ancilostomídeos,

apresentaram também reatividade significativa de 40%. As amostras seguem padrão de

normalidade, e possuem diferenças significativas entre as médias dos soros infectados por

Toxocara e Ascaris (p= 0.0008), e também entre a média dos valores dos soros infectados por

Toxocara e negativos (p= 0.0164).

49

O ELISA anti-IgG rTC-CTL-2 (Gráfico B, Figura 15), apresentou sensibilidade de

76% e especificidade de 64.71%. Neste teste, observa-se uma sensibilidade menor e uma

especificidade também um pouco abaixo comparada ao rTC-CTL-1, e nota-se uma maior

reatividade com os soros infectados por Ascaris (40%). O teste de padrão de normalidade das

amostras por Kolmogorov-Smirnov deu negativo e não há uma diferença significativa entre o

valor das médias dos soros infectados por Toxocara com os soros infectados por Ascaris, mas,

a média entre os soros infectados por Toxocara e a média dos soros negativos, existe uma

diferença significativa (p= 0.0247).

Toxoca

ra

Asc

aris

Anci

lost

om.

Sch

isto

som

a

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

A) ELISA anti-IgG: rTC-CTL-1

92%

20%

40%

37.5% 20%

Soros humanos

Ab

sorb

ân

cia

[4

05

nm

]

Toxoca

ra

Asc

aris

Anci

lost

om.

Sch

isto

som

a

Neg

ativ

os

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

B) ELISA anti-IgG: rTC-CTL-2

76%

40%30%

37,5%20%

Soros humanos

Ab

sorb

ân

cia

[4

05

nm

]

Figura 15: Reatividade das lectinas recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros

de humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. O

título do gráfico corresponde a lectina utilizado como antígeno no ensaio: A) Ensaio de

ELISA anti-IgG utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-1; B) Ensaio de ELISA anti-IgG

utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-2. No eixo da ordenada, está representada a

absorbância ótica individual (405 nm). No eixo das abscissas, a coluna Toxocara corresponde

aos soros de humanos infectados por T. canis (n= 25), e assim respectivamente em cada

coluna os soros de humanos infectados por A. suum (n= 5), Ancilostomídeos (n= 20), S.

mansoni (n= 16), e controle negativo (n= 10). A linha pontilhada corresponde a linha de corte

do experimento, com base na melhor relação de Sensibilidade e Especificidade utilizando a

cuva ROC (Receiver Operator Curve).

50

As curvas ROC do ensaio de ELISA anti-IgG das lectinas recombinantes em soros de

humanos, utilizadas na definição dos valores da linha de corte, podem ser visualizadas na

figura 16.

A) ROC Anti-IgG rTC-TCL-1 Soros Humanos

0 50 100

150

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

B) ROC Anti-IgG rTC-TCL-2 Soros Humanos

0 50 100

150

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e


antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC

foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA anti-IgG

com as lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T.

canis. A) Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de humanos com diferentes

helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de humanos com



Os resultados para o teste de ELISA anti-IgA foram mais satisfatórios em relação ao

IgG. O IgA rTC-CTL-1 (Gráfico A, Figura 17), apresentou uma sensibilidade de 72% e uma

especificidade de 88.24%. Observa-se que a reatividade para soros infectados por Toxocara

alcançou 72%, e o mais importante destacar, seria a reatividade zero por soros infectados por

Ascaris, dos quais geralmente é o mais reativo após o Toxocara, o que difere dos outros

resultados apresentados. Sendo assim, este teste apresentou uma maior especificidade, com

pouca reatividade cruzada. O ensaio possui padrão de normalidade e a média dos valores dos

soros infectados por Toxocara e soros negativos, apresentam uma diferença significativa (p=

0.0125). Em relação aos soros infectados por Toxocara e Ascaris, estes são negativos para o

padrão de normalidade e possuem diferença significativa de P= 0.0037.

51

O ensaio de IgA rTC-CTL-2 (Gráfico B, Figura 17), mostrou uma sensibilidade de

92% e uma especificidade de 70.59%. Houve uma reatividade significativa com os soros

infectados por Ascaris (60%). As amostras de soros infectados por Toxocara e negativos não

seguem um padrão de normalidade, e o teste de significância mostrou que estes possuem

diferenças significativas (p= 0.0026). A média dos valores dos soros infectados por Toxocara

e Ascaris também não seguem um padrão de normalidade, e não possuem diferença

significativa (p=0.2006), mostrando assim novamente uma grande reatividade cruzada entre

as duas helmintoses.

A) ELISA anti-IgA: rTC-CTL-1

Toxoca

ra

Asc

aris

Anci

lost

om.

Sch

isto

som

a

Neg

ativ

os

0

1

2

372%

0%

10%18.75%

10%

Soros humanos

Ab

sorb

ân

cia

[4

05

nm

]

B) ELISA anti-IgA: rTC-CTL-2

Toxoca

ra

Asc

aris

Anci

lost

om.

Sch

isto

som

a

Neg

ativ

os

0

1

2

3

92%

60%

10% 37,5% 40%

Soros humanos

Ab

sorb

ân

cia

[4

05

nm

]


de humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgA. O

título do gráfico corresponde a lectina utilizado como antígeno no ensaio: A) Ensaio de

ELISA anti-IgA utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-1; B) Ensaio de ELISA anti-IgA

utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-2. No eixo da ordenada, está representada a

absorbância ótica individual (405 nm). No eixo das abscissas, a coluna Toxocara corresponde

aos soros de humanos infectados por T. canis (n= 25), e assim respectivamente em cada

coluna os soros de humanos infectados por A. suum (n= 5), Ancilostomídeos (n= 20), S.

mansoni (n= 16), e controle negativo (n= 10). A linha pontilhada corresponde a linha de corte

do experimento, com base na melhor relação de Sensibilidade e Especificidade utilizando a

cuva ROC (Receiver Operator Curve).

52

As curvas ROC do ensaio de ELISA anti-IgA das lectinas recombinantes em soros de

humanos, utilizadas na definição dos valores da linha de corte, podem ser visualizadas na

figura 18.

A) ROC Anti-IgA rTC-TCL-1 Soros Humanos

0 20 40 60 80

0

20

40

60

80

100

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

B) ROC Anti-IgA rTC-TCL-2 Soros Humanos

0 20 40 60 80 100

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

Figura 18: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgA utilizando as lectinas recombinantes como

antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC

foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA anti-IgG

com as lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T.

canis. A) Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de humanos com diferentes




O teste de ELISA anti-IgG1 não será incluído nos resultados devido à reatividade

insignificante apresentada nos testes de acordo com o protocolo seguido.

Para o ensaio de ELISA anti-IgG4 (Gráfico A, Figura 19), no antígeno rTC-CTL-1, foi

alcançada uma sensibilidade de 96%, e uma especificidade de 78.43%. Os testes de padrão de

normalidade das amostras deram negativos, e as diferenças são significativas entre a média

dos valores dos soros infectados por Toxocara e a média dos valores dos soros infectados por

Ascaris (p= 0.0011). Apesar de uma alta reatividade dos soros infectados por

Ancilostomídeos, houve também diferença significativa entre estes com os soros infectados

por Toxocara (p= 0.0081). Assim também se observa para os outros soros em relação ao

Toxocara.

53

No antígeno rTC-CTL-2 (Gráfico B, Figura 19), obteve-se uma sensibilidade de 64% e

uma especificidade de 66.67%. Os padrões de normalidade das amostras também deram

negativos, e observa-se diferença significativa entre a média dos valores dos soros de

Toxocara com a média dos valores dos soros infectados por Ascaris (p= 0.0050).

Diferentemente do rTC-CTL-1, não houve diferença estatisticamente significativa entre a

média dos valores dos soros infectados por Toxocara com a média dos valores dos soros

infectados por Anciolostomídeos, sugerindo uma alta reatividade cruzada entre os dois.

A) ELISA anti-IgG4: rTC-CTL-1

Toxoca

ra

Asc

aris

Anci

lost

om.

Sch

isto

som

a

Neg

ativ

os

0.01

0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

0.99

96%

10%

45%

6%10%

Soros Humanos

Ab

sorb

ân

cia

[4

90

5n

m]

B) ELISA anti-IgG4: rTC-CTL-2

Toxoca

ra

Asc

aris

Anci

lost

om.

Sch

isto

som

a

Neg

ativ

os

0.01

0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

0.99

Soros Humanos

64%

0%

65%

25%0%

Ab

sorb

ân

cia

[4

05

nm

]


de humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG4.

O título do gráfico corresponde a lectina utilizado como antígeno no ensaio: A) Ensaio de

ELISA anti-IgG4 utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-1; B) Ensaio de ELISA anti-

IgG4 utilizando a lectina rTC-CTL-2. No eixo da ordenada, está representada a absorbância

ótica individual (405 nm). No eixo das abscissas, a coluna Toxocara corresponde aos soros de

humanos infectados por T. canis (n= 25), e assim respectivamente em cada coluna os soros de

humanos infectados por A. suum (n= 5), Ancilostomídeos (n= 20), S. mansoni (n= 16), e

controle negativo (n= 10). A linha pontilhada corresponde a linha de corte do experimento,

com base na melhor relação de Sensibilidade e Especificidade utilizando a cuva ROC

(Receiver Operator Curve).

54

As curvas ROC dos ensaios de ELISA anti-IgG4 das lectinas recombinantes em soros

de humanos, utilizadas na definição dos valores da linha de corte, podem ser visualizadas na

figura 20.

A) ROC Anti-IgG4 rTC-TCL-1 Soros Humanos

0 20 40 60 80 100

0

50

100

150

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

B) ROC Anti-IgG4 rTC-TCL-2 Soros Humanos

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

% Especificidade

% S

en

sib

ilid

ad

e

Figura 20: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG4 utilizando as lectinas recombinantes

como antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. As curvas

ROC foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA anti-

IgG com as lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para

T. canis. A) Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de humanos com diferentes




55

6. DISCUSSÃO

A toxocaríase humana é uma zoonose da qual o homem é hospedeiro acidental, devido

à ingestão de ovos contendo a larva infectante do terceiro estágio (L3). Esta eclode no

intestino delgado, penetra a parede intestinal e atinge a circulação, mas não consegue

completar seu ciclo biológico, causando um quadro clínico de larva migrans. Durante a

migração as larvas podem atingir qualquer órgão ou tecido onde causam inflamações locais,

infiltração eosinofílica e formação de granulomas (Lima, 2005).

Como o T. canis não completa o ciclo biológico em humanos, o diagnóstico

parasitológico da toxocaríase humana não pode ser feito por exame de fezes, mas depende de

outras técnicas diretas ou indiretas, e, além disso, possui difícil diagnóstico clínico devido à

sintomatologia inespecífica (Pawlowski, 2001). Também, o diagnóstico histopatológico com

detecção de larvas em material de biópsias é muitas vezes frustrada e sem sucesso (Jacobs et

al., 1997).

Frente aos problemas de diagnóstico clínico e parasitológico, a maioria dos

laboratórios clínicos usam testes imunológicos indiretos, detectando anticorpos anti-Toxocara

no soro ou no fluído ocular do paciente. Os testes mais aplicados são ensaios

imunoenzimáticos (ELISA) e Western blot (WB), usando antígenos solúveis de larvas e

vermes adultos, ou antígenos secretados de larvas infectantes (Chieffi et al., 2009).

Mesmo com a descrição de antígenos que podem ser aplicados num teste

imunodiagnóstico para toxocaríase humana, a grande maioria dos estudos em áreas endêmicas

mostraram uma boa sensitividade, mas ao mesmo tempo uma alta reatividade cruzada com

antígenos de outras helmintoses intestinais, tais como Ascaris lumbricoides, Trichuris

trichiura, ancilostomídeos e/ou Strongyloides stercoralis (Smith et al., 1983;

Watthanakulpanich et al., 2008) .

Nas últimas décadas, a biologia molecular alcançou grandes avanços que resultaram

na publicação de genomas completos de vários organismos multicelulares, como a publicação

completa do genoma de A. suum (Jex et al., 2011), e a publicação de sequencias expressas de

T. canis (Zhou et al., 2011). Estes avanços nos proporcionam o uso da bioinformática como

instrumento para pesquisa de novos antígenos e epítopos que poderão ser utilizados como

diagnóstico de várias infecções.

56

Este trabalho utilizou banco de dados com sequencias expressas de T. canis para

predição de epítopos com objetivo de encontrar um diagnóstico eficaz para a toxocaríase

humana, tentando eliminar o máximo a reatividade cruzada com outras helmintoses.

Para o teste dos peptídeos sintetizados, foi utilizado modelo experimental com

camundongos infectados por diferentes helmintoses. No total, foram testados 6 epítopos em

ELISAs com anti-IgG, porém, destes, apenas 3 apresentaram resultados promissores. Para a

nossa surpresa, todos os peptídeos mostraram uma reatividade maior para soros infectados por

A. suum do que para T. canis.

A alta reatividade em soros de camundongos infectados por A. suum, observada nos

peptídeos, pode estar relacionado ao modelo experimental usado. Tanto para A. suum quando

para T. canis, os camundongos foram submetidos a três subseqüentes infecções com 500 ovos

larvados. Essa hiperinfecção no modelo experimental provavelmente não reflete uma situação

normal em áreas endêmicas, onde poucos indivíduos tem uma carga alta e o grande resto

apresenta com carga parasitária média ou baixa, como já foi demonstrado para diferentes

espécies de helmintos (Anderson & Medley, 1985).

Em nosso experimento, a hiperinfecção resultou em níves maiores de IgG em

camundongos infectados por A. suum quando comparado com camundongos infectados com

Toxocara. Isso pode ter ocorrido por causa de uma maior imunogenicidade das larvas do

terceiro estágio de A. suum ao sistema imune no modelo experimental. Outra explicação seria

que ainda existem lacunas no conhecimento do genoma de T. canis (Chen et al., 2012), e na

hora da seleção dos epítopos o programa de predição não conseguiu eliminar completamente

sequências semelhantes das duas espécies.

O genoma completo de T. canis ainda não está disponível e existem poucas

informações sobre as sequencias expressas deste parasito devido a pouca informação sobre os

processos moleculares e bioquímicos fundamentais subjacentes ao desenvolvimento e

sobrevivência do parasito e da interação parasito-hospedeiro (Zhou et al., 2011). Sendo assim,

as proteínas poderiam estar localizadas morfologicamente em locais desfavoráveis para serem

reconhecidas por anticorpos, e desta maneira, uma reduzida antigenicidade destas iria

desqualificá-los para uso em ensaios diagnósticos.

57

Apesar deste achado não esperado, os peptídeos 1, 2 e 4 apresentaram 100% de

sensitividade e uma média de 58% de especificidade. Este fator é algo positivo, pois, mesmo

levando em conta que os soros infectados por A. suum tenham maior reatividade, todos os

soros infectados por T. canis também reagiram, o que sugere um reconhecimento a favor do

diagnóstico da toxocaríase. Talvez modificações dos três epítopos selecionados possam ser

testados em futuros experimentos.

Para o diagnóstico da toxocaríase humana ainda não existem trabalhos sobre a

predição de epítopos e o uso deles em ensaios sorológicos. Porém, em outras infecções

parasitárias, houve sucesso nesta metodologia: Mendes et al. (2013) propôs a identificação de

epítopos de células B lineares do Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, para

serem utilizados no diagnóstico da doença, utilizando o ELISA. Na predição dos epítopos,

eles excluíram sequencias que também podem ser encontradas nos diferentes tipos de

Leishmania, para diminuir a chance da reatividade cruzada com estes parasitos. No total, eles

testaram quatro peptídeos, e nos ensaios realizados, chegaram a encontrar 95.8% de

sensibilidade e 88.5% de especificidade para o mais promissor.

Além deste artifício, outras metodologias de encontrar peptídeos específicos e

imunogênicos para T. canis também poderão ser exploradas, tendo como exemplo um estudo

realizado por Faria et al. (2011), do qual testou-se em uma matriz de alta escala (360

peptídeos sintetizados em uma membrana de celulose), vários epítopos preditos em células B

de Leshmania infantum, para identificar e selecionar aqueles que apresentarem maior

reatividade e serem utilizados para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina.

A fim de identificar e testar o desempenho de novos antígenos, neste trabalho também

foram feitos testes de ELISA com lectinas recombinantes a partir do antígeno TES 32: o rTC-

CTL-1 e rTC-CTL-2. Os dois antígenos se diferem apenas devido a uma pequena variante de

aminoácidos em sua composição e são uma das principais proteínas da superfície de larvas de

T. canis, e sua localização do anticorpo monoclonal mostrou que é expressa na cutícula do

parasita (Yamasaki et al., 1998; Page et al., 1992).

Primeiramente foi testado em modelo experimental de camundongos infectados por

diferentes helmintoses. Nos resultados encontrados nestes ensaios, obtivemos 100% de

sensibilidade e 100% de especificidade para as duas lectinas recombiantes. A princípio, isto

58

significou que estas poderiam ser muito promissoras, apesar de que infecções de modelo

experimental, principalmente as utilizadas neste trabalho, induzem uma resposta bem

específica e imunogênica por parte dos camundongos.

A alta especificidade encontrada nestes ensaios são promissores e sugere que as

lectinas recombinantes realmente tenham melhor desempenho que o antígeno TES. Em um

estudo recente realizado por Lescano et al. (2012), em que se investigou o nível de anticorpos

IgG em camundongos BALB/C co-infectados por T. canis e outras helmintoses e

protozoários, utilizando o antígeno TES, encontrou-se baixa reatividade cruzada, com exceção

dos camundongos infectados por A. suum. Portanto, é de considerável destaque o desempenho

destas lectinas nos ensaios com camundongos.

Outro estudo realizado por Yamasaki et al. (2000), comparou o ELISA utilizando

antígeno TES e o ELISA utilizando a proteína TC-CTL-1 em soros humanos infectados por

diferentes helmintoses, e conseguiu diminuir a reatividade cruzada de 43% para 2% na

lectina. Esta, portanto, demonstra o alto potencial da lectina para um diagnóstico bem

específico da toxocaríase.

Neste estudo, além dos testes das lectinas recombinantes em soros de camundongos,

realizamos também testes em soros humanos com diferentes helmintoses, a fim de verificar o

seu desempenho em uma situação mais real, ou seja, em infecções naturais e de acordo com a

maioria dos cenários encontrados onde a doença prevalece, das quais, o homem possui grande

contato com outras parasitoses.

No Brasil, infecções por diferentes helmintos como S. mansoni, A. lumbricoides,

Trichuris trichiura, e outros vermes intestinais, ainda são comuns, especialmente em áreas

rurais de baixa renda. Esta prevalência ocorre devido a fatores como condições ambientais

favoráveis, boa disponibilidade de hospedeiros intermediários e a pobreza generalizada

acarretando em baixo nível educacional, gerando baixos níveis de higiene e saneamento

(Geiger, 2008). Visto esse cenário, utilizamos soros de pacientes infectados de áreas

endêmicas para diversas parasitoses, inclusive soros de indivíduos que foram negativos nos

exames de fezes.

Primeiramente, os antígenos rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 foram testados por ELISA anti-

IgG total. Nos resultados, obtivemos uma sensibilidade satisfatória de 92% para rTC-CTL-1 e

59

76% para rTC-CTL-2, e uma especificidade de 66% e 64% respectivamente para T. canis.

Mais uma vez ocorreu reatividade cruzada. O rTC-CTL-1 mostrou melhor desempenho e

menor reatividade por Ascaris, porém, apresentou uma maior reatividade por soros humanos

infectados por ancilostomídeos.

A reatividade cruzada entre T. canis e outras helmintoses encontradas neste teste com

as lectinas pode ter uma explicação: Sabe-se que as lectinas do tipo C são receptores de

superfície de células com um papel central na ativação do sistema imunológico dos

vertebrados (Loukas & Maizels, 2000). Os genes que codificam C-TLs são amplamente

representados entre vários invertebrados, incluindo artrópodes e moluscos, no qual são

produzidos em resposta a lesão ou infecção (Takahashi et al., 1985). A clonagem e a

caracterização do TES-32 de T. canis revelaram as primeiras lectinas tipo C provido de um

parasito, e que essas proteínas possuem semelhança estrutural com as C-TLs do hospedeiro

vertebrado, talvez atuando na modulação da resposta imune ou ajudando na evasão do

parasito (Loukas & Maizels, 2000).

Apesar do TES-32 ser prevalentemente específico de T. canis, lectinas do tipo C

também foram identificadas em outros nematódeos, como Necator americanos (Doub et al.,

2000), Ancylostoma ceylanicum (L. Harrison, GenBank AF172652), A. suum (J. Daub e M.

Blaxter, Gen Bank AW165750), Haemonchus contortus (D. Jasmer, GenBank AI723481),

entre outros. Portanto, a reatividade cruzada em nosso estudo poderia ser explicada pela

presença e semelhança de lectinas em diferentes espécies de nematódeos.

Foi encontrada também uma elevada reatividade em soros de indivíduos infectados

por S. mansoni (37.5%). Apesar de serem de outra classe de helmintos (Trematoda), durante o

ciclo biológico desta parasitose ocorre migração de formas larvais entre tecidos atingindo

também os pulmões, acarretando uma grande resposta imunológica por parte do hospedeiro

(Jenkins et al., 2005). Em relação às lectinas do tipo C, trematódeos não possuem estas,

porém, como no caso do S. mansoni, elas podem reconhecer glicoproteínas que são

absorvidas no tegumento das larvas e adultos, e entre estas, anticorpos IgG (Loukas &

Maizels, 2000). Isso pode ter resultado no reconhecimento dos CTLs em soros de indivíduos

infectados com S. mansoni, especialmente por parte das lectinas recombinates rTC-CTL-1 e

rTC-CTL-2.

60

Ambas lectinas, apresentaram reatividade de 20% em soros de indivíduos negativos.

Este resultado pode estar ligado ao fato de que estes soros foram coletados de pessoas que

moram em áreas insalubres e com alta prevalência de outras parasitoses. Além disso, um

carboidrato trissacarídeo não metilado encontrado no antígeno TES, é idêntico ao encontrado

no sangue humano ABO, dos quais possuem o antígeno H (Loukas e Maizels, 2000). Essa

característica estrutural pode gerar o reconhecimento das lectinas recombinantes por parte dos

anticorpos do hospedeiro, o que pode explicar a reatividade encontrada nos indivíduos

negativos.

Além do teste anti-IgG, foram realizados também ensaios de ELISA anti-IgA,

utilizando os mesmos soros de humanos infectados por diferentes helmintoses, a fim de

avaliar e entender o desempenho das lectinas para estes anticorpos.

Ao contrário do que foi visto no ELISA anti-IgG, os resultados destes ensaios foram

mais específicos. O rTC-CTL-1 e o rTC-CTL-2 demonstrou sensitividade de 72% e 92%

respectivamente, e uma especificidade de 88.42% e 70.59% respectivamente. Apesar de

apresentar uma menor reatividade para soros de T. canis, a lectina rTC-CTL-1 não

demonstrou reatividade com soros de pacientes infectados por Ascaris, o que é um resultado

interessante devido à alta reatividade cruzada encontrada geralmente entre estas duas

helmintoses. Além disso, também atingiu menor reatividade para os outros soros, o que gerou

uma maior especificidade geral do teste. Já o contrário foi observado para rTC-CTL-2, que

apesar de maior reatividade para soros de T. canis, houve grande reconhecimento também por

soros infectados pelas outras infecções, e inclusive pelos soros negativos (40%).

Um estudo sorológico para diagnóstico da toxocaríase, utilizando o antígeno TES, em

pacientes de área rural no estado de São Paulo, encontrou cerca de 59% de reatividade para o

anticorpo IgA anti-Toxocara. Porém, o autor destaca que apenas cinco dos pacientes foram

positivos também para IgG e IgE específicos de Toxocara, ou seja, nem todos os pacientes

positivos para IgG anti-Toxocara no estudo obteve reatividade para o anticorpo IgA (Prestes-

Carneiro et al., 2008).

Elefant et al. (2006), sugerem que a presença dos anticorpos específicos IgA na

toxocaríase, usando como antígeno o TES, podem ser usados para o diagnóstico e

monitoramento da eficácia do tratamento da infecção. Em outro estudo, os mesmos

61

pesquisadores investigaram por imunoblot anticorpos IgA em pacientes com diferentes

manifestações de toxocaríase, antes, durante e após o tratamento. Eles constataram que o

reconhecimento em imunoblot por anticorpos anti-IgA caiu de 65.4% antes, para apenas

11.8% após tratamento (Elefant et al., 2011).

Portanto, os resultados encontrados referente ao anticorpo IgA nesse estudo, podem

condizer com a fase e o estado em que a infecção se encontra no paciente, sendo os soros de

maior reatividade estarem em uma fase mais aguda da doença, ou seja, uma fase de migração

de larvas.

Neste estudo foi feito ELISA anti-IgG1, também utilizando os soros humanos com

diferentes infecções a fim de verificar o desempenho das lecitinas recombinantes.

Infelizmente, os resultados deste ensaio tiveram uma reatividade insignificante em ambos os

grupos de indivíduos e, portanto, não foram demonstrados.

A importância do IgG1 no diagnóstico da toxocaríase é notável, mas somente foi

observada quando foi usado uma mistura de diferentes proteínas secretadas do parasito. Em

um estudo realizado com pacientes acometidos por diferentes tipos de toxocaríase, Obwaller

et al. (1998) utilizou o antígeno TES em ensaios de ELISA contra subclasses de IgG, e

reportou que a subclasse predominante nos pacientes com toxocaríase é IgG1. Além disso, ele

constatou que esta era significantemente maior em pacientes com a forma visceral da doença.

Em outro estudo com soros de humanos infectados por diferentes helmintos,

Watthanakulpanich et. al. (2008) mostraram que a subclasse IgG1 contra o antígeno TES

obteve maior sensitividade (60%) em relação ao IgG total (50%), e uma maior especificidade

(76% contra 73% de IgG), sugerindo assim, melhor desempenho para o diagnóstico da

toxocaríase.

Utilizando os mesmos soros de humanos infectados por diferentes helmintoses,

realizamos também ensaios de ELISA anti-IgG4. Mais uma vez, a lectina rTC-CTL-1

demonstrou o melhor desempenho, pois além de possuir grande reatividade para os soros

infectados por T. canis (96%), apresentou baixa reatividade para os outros soros. Apesar

disso, é importante destacar que a reatividade pelos soros de pacientes com ancilostomídeos

foram significativas em relação aos demais soros testados, atingindo 45% para rTC-CTL-1.

62

Noordin e colegas (2005) demonstraram em ELISAs anti-IgG4 com antígeno TES a

alta especificidade, porém, o ensaio foi menos sensível comparado ao anti-IgG total. Portanto,

os autores sugeriram uma combinação dos dois ensaios para aumentar tanto a sensibilidade

quando a especificidade dos testes diagnósticos para toxocaríase, principalmente quando os

resultados sorológicos foram correlacionados com sintomas clínicos e laboratoriais (Noordin

et al., 2005).

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A toxocaríase é um helminto de grande importância na saúde pública e possui

prevalências elevadas em todo o mundo. Seu diagnóstico específico em seres humanos baseia-

se, na maioria dos casos, em testes indiretos e é muito difícil. Especialmente o fato da elevada

reatividade cruzada com antígenos de outros helmintos tornam testes sorológicos um desafio

para o diagnóstico.

Com a intenção de descobrir e testar novos antígenos recombinantes e peptídeos

selecionados por bioinformática, nós fizemos ensaios iniciais com rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2,

além de seis epítopos diferentes. Os ensaios com as lectinas recombinantes demonstraram um

excelente desempenho em camundongos para a detecção da infecção por T. canis. Porém, em

humanos o desempenho dos ensaios caiu consideravelmente devido as persistentes

reatividades cruzadas com outras infecções helmínticas.

Os ensaios de ELISA com os seis epítopos selecionados por bioinformática revelaram

em apenas dois epítopos um desempenho promissor para o diagnóstico da toxocaríase, porém,

com alta reatividade cruzada com a infecção por Ascaris em modelos experimentais.

Após este estudo, conclui-se que este foi um importante pontapé inicial e futuros testes

com antígenos e/ou epítopos modificados devem ser realizados devido ao persistente

problema da reatividade cruzada, principalmente em infecções com espécies de Ascaris.

63

8. REFERÊNCIAS

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9. ANEXOS

sumÁrio lista de figuras 9 lista de abreviaturas 11

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