sÍntese de novos hÍbridos monastrol-Ácidos graxos 6 …

i

FURG

Tese de Doutorado

SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS

GRAXOS 6-ALQUIL SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos

efeitos citotóxicos em linhagem celular de glioma de

rato (C6)

___________________________________

Patrick Martins De Oliveira

PPGQTA

Rio Grande, RS - Brasil

2016

ii

SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS

GRAXOS 6-ALQUIL SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos efeitos

citotóxicos em linhagem celular de glioma de rato (C6)

por

Patrick Martins De Oliveira

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Química Tecnológica e Ambiental da Universidade Federal

do Rio Grande (RS), como requisito parcial para obtenção

do título de DOUTOR EM QUÍMICA.

PPGQTA

Rio Grande, RS - Brasil

2016

iii

Universidade Federal do Rio Grande Escola de Química e Alimentos

Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental

A Comissão Examinadora abaixo assinada aprova a Tese de Doutorado

SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS GRAXOS 6-ALQUIL SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos efeitos

citotóxicos em linhagem celular de glioma de rato (C6)

elaborada por

PATRICK MARTINS DE OLIVEIRA

Como requisito parcial para a obtenção do título de

Doutor em Química

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Marcelo Gonçalves Montes D’Oca (Presidente, PPGQTA/FURG)

Prof. Dr. Gustavo Pozza Silveira (Membro, PPGQ/UFRGS)

Prof. Dr. Mariana Appel Hort (Membro, PPGCiSau/FURG)

Prof. Dr. Alex Fabiani Claro Flores (Membro, PPGQTA/FURG)

Prof. Dr. Marcelo de Godoi (Membro, PPGQTA/FURG)

Rio Grande, 18 de outubro de 2016.

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus por moldar meu caminho.

Agradeço à Universidade Federal do Rio Grande – FURG e ao Programa de

Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental pela oportunidade cedida, assim

como as agências financiadoras CAPES, CNPq e MCT/FINEP e a prefeitura do Rio

Grande pelo apoio financeiro.

Ao professor Marcelo Gonçalves Montes D’Oca pela orientação nessa etapa do

meu aperfeiçoamento acadêmico.

Aos membros do Kolbe pelo apoio técnico.

Aos professores do PPGQTA por compartilharem seus conhecimentos.

A meu pai, minha mãe, minha esposa e meus irmãos por escolha por estarem

presentes no decorrer dos melhores momentos da minha vida.

Ao Ernesto cuja memória permanecerá viva para sempre.

v

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... vi

LISTA DE ESQUEMAS ................................................................................................ ix

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ..................................................................xii

RESUMO .................................................................................................................... xiii

ABSTRACT .................................................................................................................xiv

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15

2. OBJETIVOS ............................................................................................................ 20

3. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 23

4. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ....................................... 42

5. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 76

6. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 78

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 93

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Nifedipina 1 ou BAY A1040®Bayer 16 ............................................................ 16

Figura 2. Monastrol 2 .................................................................................................... 17

Figura 3. Série do monastrol 2 e de seus análogos graxos (posição 5 e 6-substituída)

...................................................................................................................................... 19

Figura 4. Avaliação citotóxica do monastrol 2 e dos análogos graxos 23, 4a-c e 8a-c

frente a linhagem celular de glioma ............................................................................... 22

Figura 5. Estrutura do piperastrol 28 ............................................................................ 27

Figura 6. Composto tipo-Biginelli derivado do 2-hidroxi-1-naftaldeido (35) .................. 29

Figura 7. Resultados do teste de viabilidade celular para as moléculas Monastrol-

ácidos graxos-5C-alquil substituídas (Treptow et al., 2015) .......................................... 30

Figura 8. DHPMs de ocorrência natural e sintética ...................................................... 31

Figura 9. N-Acil homoserinas lactonas 52 de ocorrência natural .................................. 37

Figura 10. Espectro de RMN 1H (400 MHz/CDCl3) do composto 3b ............................ 54

Figura 11. Expansão da região do próton benzílico (400 MHz/CDCl3) do composto 3b

...................................................................................................................................... 55

Figura 12. Espectro de 13C (100 MHz/CDCl3) do composto 3b .................................... 56

Figura 13. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de

tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle

tratado com DMSO para os compostos 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de

pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle. ....................... 65



tratado com DMSO para os compostos 4a (esquerda) e 8a (direita). ANOVA seguido de

pós-teste de Tukey, *** p <0.001 com relação ao controle. ........................................... 66



tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4b (esquerda) e 8b (direita).

ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao

controle. ........................................................................................................................ 67

vii



tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4c (esquerda) e 8c (direita).


controle. ........................................................................................................................ 68

Figura 17. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de


tratado com DMSO para os compostos 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de

pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle. ....................... 69



tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4a (esquerda) e 8a (direita).


controle. ........................................................................................................................ 69



tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4b (esquerda) e 8b (direita).


controle. ........................................................................................................................ 70



tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4c (esquerda) e 8c (direita).


controle. ........................................................................................................................ 70

Figura 21. Composto 4a ............................................................................................... 80

Figura 22. Composto 4b ............................................................................................... 80

Figura 23. Composto 4c ............................................................................................... 81







viii









Figura 38. Composto 10a ............................................................................................. 89

Figura 39. Composto 10 b ............................................................................................ 89

Figura 40. Composto 10c ............................................................................................. 90

ix

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Reação multicomponente de Biginelli visando a síntese de

diidropirimidinonas/tionas funcionalizadas .................................................................... 16

Esquema 2. Retrossíntese das novas diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos 6-alquil

substituídas 3-10a-c derivadas de fontes renováveis ................................................... 20

Esquema 3. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c .................................................... 21

Esquema 4. Síntese de diidropirimidinonas 3-6a-c e diidropirimidintionas 7-10a-c ..... 21

Esquema 5. Síntese linear tradicional em três etapas vs. reação multicomponente .... 24

Esquema 6. Variedade estrutural baseada em primárias ou clássicas RMC e reações

secundárias ................................................................................................................... 25

Esquema 7. Síntese de dímeros do monastrol 32, 33a-e ............................................. 28

Esquema 8. Síntese de novas DHPMs-5-graxas ......................................................... 29

Esquema 9. Síntese de β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum (Oikawa et al.,

1978) ............................................................................................................................. 33

Esquema 10. Síntese dos β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum .................... 34

Esquema 11. Utilização de N,N´carbonildiimidazol na síntese de β-cetoésteres

aromáticos 48 ................................................................................................................ 34

Esquema 12. Síntese de β-cetoamidas via ácido de Meldrum (Pak et al., 1992) ......... 35

Esquema 13. Mecanismo de aminólise do Meldrum acilado com agente sililante ....... 36

Esquema 14. N-Azidoacil homoserina lactona e N-Acil homoserinas lactonas

funcionalizadas .............................................................................................................. 37

Esquema 15. Avaliação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de

solvente ......................................................................................................................... 38

Esquema 16. Aplicação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de

solventes ....................................................................................................................... 39

Esquema 17. Ácido sulfâmico suportado em sílica ...................................................... 40

Esquema 18. Uso de ácido sulfâmico suportado em nanopartículas magnéticas ........ 41

Esquema 19. Reação entre o ácido de Meldrum e diferentes carbodiimidas ............... 44

x

Esquema 20. Obtenção de um composto derivado de carbodiimidas .......................... 44

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c a partir da acilação do ácido de

Meldrum 13 com ácidos graxos 12a-c e posterior metanólise ...................................... 43

Tabela 2. Reação multicomponente de Biginelli usando β-cetoéster estárico 11b,

benzaldeído 17 e ureia 21 com diferentes catalisadores .............................................. 47

Tabela 3. Estruturas e rendimentos das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-6a-c

obtidas pela reação multicomponente de Biginelli ......................................................... 50


obtidas pela reação multicomponente de Biginelli ......................................................... 58

Tabela 5. Predição do coeficiente de partição (ClogP) dos compostos avaliados quanto

aos efeitos citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6). ........... 62

Tabela 6. Valores de IC50 para os compostos avaliados quanto aos efeitos

citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6) .............................. 73

xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ADMET/ADME Adsorção, distribuição, metabolismo, excreção e

toxicidade/adsorção, distribuição, metabolismo, excreção

BFI Bond-forming-index (índice de formação de ligação)

BHE Barreira hemato-encefálica

CCD Cromatografia em camada delgada

ClogP Coeficiente de partição

DCC Diciclohexilcarbodiimida

DHP Diidropiridina

DHPM Diidropirimidinona

DMAP Dimetilaminopiridina

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium

IV Espectroscopia de infravermelho

NMP Nanopartícula magnética

RMC Reação multicomponente

RMN Ressonância magnética nuclear

SFB Soro fetal bovino

SNC sistema nervoso central

xiii

RESUMO

Título: SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS GRAXOS 6-ALQUIL

SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos efeitos citotóxicos em linhagem celular de glioma

de rato (C6)

Autor: Patrick Martins De Oliveira

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Gonçalves Montes D’Oca

Este trabalho propôs a síntese de novas diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos

6-alquil substituídos (DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas) e a avaliação dos

análogos graxos do monastrol (Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos) quanto aos

efeitos citotóxicos em glioma de rato. As DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas foram

sintetizadas a partir da condensação multicomponente de Biginelli utilizando β-

cetoésteres graxos (C16:0, C18:0 e cis-C18:1), aldeídos aromáticos (benzaldeído, 3-

hidroxibenzaldeído, 4-hidroxibenzaldeído, 3-nitrobenzaldeído e 4-nitrobenzaldeído),

ureia ou tioureia e ácido sulfâmico como catalisador, sendo obtidas estruturas diversas

e complexas ainda inéditas na literatura, com rendimentos entre 60-85%. Devido ao

efeito antitumoral apresentado pelo monastrol, assim como do aumento da lipofilicidade

das novas estruturas com a possível facilitação na passagem por diferentes barreiras

celulares, as novas monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos foram analisadas quanto

aos seus efeitos citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6). De acordo com

os resultados as moléculas derivadas da tioureia, contendo as cadeias palmítica e

esteárica exibiram a maior atividade na diminuição da viabilidade celular e na

citotoxicidade na linhagem de glioma, com potencial na diminuição da viabilidade

celular 17 vezes superior ao monastrol e 6 vezes maior que seus análogos DHPMs-

ácidos graxos-5C-alquil substituídas, sendo definidas como potenciais candidatas para

a continuação dos estudos no tratamento de células tumorais.

Palavras-chaves: ácidos graxos; reação multicomponente; compostos de Biginelli;

atividade antitumoral; glioma

xiv

ABSTRACT

Title: SYNTHESIS OF NOVEL HYBRID MONASTROL C6-FATTY ACIDS: cytotoxic

effects against rat glioma cell line (C6)

Author: Patrick Martins De Oliveira

Advisor: Prof. Dr. Marcelo Gonçalves Montes D’Oca

This work presents the synthesis of novel hybrid dihydropyrimidinones/thiones-

fatty acids 6-alkyl substituted (DHPMs-fatty acid-C6-substituted). In addition, the

cytotoxic effects of a series of fatty monastrol analogues (C6-fatty acid-monastrol) was

investigated in rat glioma cell line. The novel C6-fatty acid-DHPMs were synthesized

from the Biginelli multicomponent condensation in 60-85% yields using fatty acid β-

ketoesters (C16:0, C18:0 and cis-C18:1), aromatic aldehydes (benzaldehyde, 3-

hydroxybenzaldehyde, 4 hydroxybenzaldehyde, 3-nitrobenzaldehyde and 4-

nitrobenzaldehyde), urea or thiourea and sulfamic acid as catalyst. Due to the antitumor

effect shown by monastrol as well as increasing the lipophilicity of the novel molecules

with possibility to facilitate the passage through various cellular barriers, the novel

hybrids monastrol-C6-fatty acid were analyzed for their cytotoxic effects on rat glioma

cell line (C6). According to results palmitic or stearic fatty acid derivatives exhibited the

greatest activity in viability and cytotoxicity reducing cell off glioma line, with the

potential in the decrease of cell viability 17 times higher than monastrol and 6 times

greater than its analogues C5-fatty acid-DHPMs. This finding suggests that the

increased lipophilicity of fatty acid monastrol offers a promising approach for the

development of new antitumoral compounds.

Keywords: fatty acids; multicomponent reaction; Biginelli compound; Antitumor activity;

glioma

15

1. INTRODUÇÃO

Condensações multicomponentes ou reações multicomponentes (RMCs) são

reações químicas que envolvem três ou mais compostos combinados em uma única

etapa com a geração de um único produto que contém partes majoritárias dos

reagentes.1 Devido a essa natureza, as RMCs são utilizadas na obtenção de novos

compostos com a redução de etapas reacionais de sínteses lineares.2 O resultado das

reações multicomponentes está intimamente ligado à natureza dos solventes, ao tipo

de catalisador utilizado e a razão molar (excessos) dos reagentes empregados,

tornando a otimização das condições reacionais um passo decisivo no

desenvolvimento e aplicação das RMCs, em comparação às reações sequenciais.

Contudo a eficiência atômica, assim como as condições reacionais empregadas

(geralmente simples e de baixa necessidade energética) definem as RMCs como uma

poderosa ferramenta para a síntese orgânica e a química medicinal.3

Uma das mais relevantes RMCs é a reação tricomponente de Biginelli

(desenvolvida pelo químico Pietro Biginelli) que envolve uma condensação simples de

acetoacetatos, aldeídos (em sua maioria aromáticos) e ureia ou tioureia, gerando

compostos conhecidos como compostos de Biginelli ou diidropirimidinonas (DHPMs)4

(Esquema 1). Do ponto de vista sintético as RMCs (e por consequência a RMC de

Biginelli) possibilitam a geração de grandes bibliotecas de compostos com elevada

complexidade e a aplicação dos mesmos na pesquisa e descobertas de potenciais

fármacos.5-7 Por este motivo as RMCs representam um dos pilares da química

combinatória e da síntese orientada para a diversidade, as colocando em um ponto

central no estudo e desenvolvimento de metodologias sintéticas modernas voltadas a

química medicinal.8 Dessa forma, um dos grandes atributos da RMC de Biginelli

consiste na diversidade dos blocos de construção tolerados na condensação, sendo

responsável pela geração de um grande grupo de moléculas baseados em uma

estrutura comum e facilmente sintetizadas pela variação dos precursores. 9

16

Esquema 1. Reação multicomponente de Biginelli visando a síntese de

diidropirimidinonas/tionas

Além da geração de bibliotecas de compostos com elevada diversidade e

complexidade outro fator de elevada relevância apresentado pelas RMCs é a ligação

com os aspectos básicos da química verde.10 Premissas como prevenção da geração

de resíduos, economia de átomos, eficiência energética e redução na formação de

subprodutos, são comuns as RMCs e a química verde – tornando as condensações

multicomponentes um passo importante para obtenção de estruturas diversificadas e

complexas com importantes aspectos ambientais.11, 12

Somado a esses fatos, da geração de bibliotecas diversificadas e complexas

com atributos ambientalmente favoráveis, uma das aplicações mais importante dos

compostos de Biginelli é a de moduladores de processos biológicos, sendo

notadamente reconhecidos na química medicinal. Primariamente os compostos de

Biginelli, devido a sua similaridade estrutural com as diidropiridinas (DHPs) e a natural

analogia ao perfil farmacológico dessas na modulação do canal de cálcio como a

apresentada pela nifedipina (1) (Figura 1), foram testados como bloqueadores de canal

de cálcio sendo demonstrada a atividade anti-hipertensiva das DHPMs similar a das

DHPs.13-15

Figura 1. Nifedipina 1 ou BAY A1040®Bayer 16

17

Além da aplicação clássica como bloqueadores do canal de cálcio outros efeitos

farmacológicos e biológicos importantes das DHPMs foram pesquisados incluindo a

atividade anti-inflamatória17, bactericida, antiviral18, antifúngica19 e antioxidante20

demonstrando assim o elevado potencial farmacológico e a ampla gama de processos

biológicos atrativamente afetados diretamente pelas DHPMs.

Ainda dentro das aplicações nas modulações de processos biológicos, as

DHPMs foram identificadas como potenciais agentes antitumorais, estando envolvidas

no bloqueio da mitose pela inibição da cinesina, uma proteína importante para o

processo mitótico.21, 22 Estudos baseados em bibliotecas de moléculas com baixo peso

molecular (>500 g/mol) demonstraram a capacidade das DHPMs, principalmente do

monastrol (2) (Figura 2), em atuar na inibição da cinesina,21-26 sendo que compostos

com capacidade de perturbar a mitose celular (série ordenada de eventos

fundamentalmente mecânicos em que cópias idênticas do genoma são movidas dentro

da célula) tem demonstrado eficácia no tratamento de diversas linhagens tumorais.21

Figura 2. Monastrol (2)

Nosso grupo de pesquisa tem em sua principal linha de investigação a síntese

de novos compostos derivados de ácidos graxos visando a avaliação da sua atividade

biológica/farmacológica.27-34 Essa linha relaciona a influência da presença de cadeias

graxas na atividade de compostos orgânicos através do desenvolvimento de

metodologias para a síntese de novas moléculas nitrogenadas graxas de interesse

farmacológico e tecnológico – estruturalmente simples e de baixo custo, assim como o

aumento da lipofilicidade de moléculas notadamente ativas biologicamente. O aumento

da lipofilicidade tem impacto direto sobre o perfil farmacocinético – sendo uma

18

propriedade físico-química chave na determinação das propriedades ADMET

(adsorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade),35 consistindo em

propriedades relevantes para a admissão de novos fármacos. No caso específico do

sistema nervoso central (SNC), o aumento da lipofilicidade pode ser um ponto chave

para a entrega de fármacos devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE),

elemento formado por camadas de células que separam o sangue do parênquima

cerebral, sendo a BHE seletiva a passagem de substâncias de acordo com

características bioquímicas.36

Dentro dessa linha, o estudo de Treptow e colaboradores34 baseou-se na

funcionalização da estrutura básica das DHPMs através da inserção de cadeias graxas

na posição 5 do heterocíclico. Este estudo relacionou a atividade biológica dos

compostos de Biginelli graxos e diferentes linhagens tumorais, comprovando a elevada

atividade dos derivados graxos análogos ao monastrol.

A atuação destes compostos como agentes antitumorais e os efeitos sobre a

lipofilicidade gerados com a funcionalização graxa na posição 5 do heterocíclico

incentivaram a criação de uma biblioteca de diidropirimidinonas/tionas 6-substituídas

com cadeias graxas inéditas e análogas as estruturas sintetizadas por Treptow e

colaboradores34 e a aplicação dos compostos análogos ao monastrol na avaliação do

efeito citotóxico na linhagem celular de glioma de rato (C6) (em comparação ao

monastrol e ao análogo diidropirimidinona 5-substituída derivada da cadeia palmítica),

conforme exposto na Figura 3.

19

Figura 3. Série do monastrol (2) e de seus análogos graxos (substituídos na posição 5

e 6)

20

2. OBJETIVOS

Objetivo geral

O objetivo geral do estudo foi realizar a síntese de novas

diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos 6-alquil substituídas híbridas 3-10a-c (DHPMs-

ácidos graxos-6C-substituídas) utilizando como precursores β-cetoésteres graxos (βce)

11a-c obtidos a partir de ácidos graxos 12a-c (saturados e insaturados) derivados de

fontes renováveis e avaliar o possível efeito citotóxico dos compostos sintetizados

derivados do monastrol (Esquema 2).

Esquema 2. Retrossíntese das novas diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos 6-alquil

substituídas 3-10a-c derivadas de fontes renováveis

Objetivos específicos

Realizar a síntese dos β-cetoésteres graxos (βce) 11a-c a partir da

acilação do ácido de Meldrum (13) com ácidos graxos 12a-c usando

como agentes de acoplamento DCC (14) e DMAP (15) seguido da

abertura com metanol (Esquema 3);

21

Esquema 3. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c

Realizar a síntese de diidropirimidinonas 3-6a-c e diidropirimidintionas 7-

10a-c (DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas) com substituinte graxo na

posição 6 a partir da reação multicomponente de Biginelli, usando a

condensação de β-cetoésteres graxos (βce) 11a-c, diferentes aldeídos

aromáticos 17-20 e ureia (21) e/ou tioureia (22) com aplicação do ácido

sulfâmico (23) como catalisador (Esquema 4);

Esquema 4. Síntese de diidropirimidinonas 3-6a-c e diidropirimidintionas 7-10a-c

Realizar a caracterização e a elucidação estrutural das moléculas

sintetizadas análogas ao monastrol (Monastrol-ácidos graxos-6C-

22

substituídas) através do ponto de fusão, ressonância magnética nuclear

de próton (RMN1H) e ressonância magnética nuclear de carbono

(RMN13C)

Avaliar a atividade das moléculas graxas análogas do oxo-monastrol 4a-c

e do Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídas 8a-c frente à linhagem

celular de glioma de rato (C6) e comparar com o monastrol (2) e com o

seu análogo diidropirimidinona 24 derivado da cadeia palmítica 5-

substituída (Figura 4);

Figura 4. Avaliação citotóxica do monastrol (2) e dos análogos graxos 23, 4a-c e 8a-c

frente a linhagem celular de glioma

23

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. Aplicação das RMCs na química medicinal

A tarefa de selecionar um potencial e seletivo modulador molecular no vasto

espaço químico (o espaço químico de moléculas com massa molecular inferior a 500

g/mol – correspondendo a moléculas pequenas – construídas a partir de elementos

comuns – como carbono, hidrogênio, nitrogênio, enxofre e oxigênio – pode estender

10200 estruturas)37 é extremamente elaborada. Ainda que o espaço de compostos

biologicamente atrativos (espaço químico biologicamente relevante) seja uma

constrição do espaço químico38 este espaço ainda é constituído por uma grande

variedade de estruturas; devido a essa grande variedade de estruturas, no projeto de

novos potenciais fármacos o conceito de compostos híbridos é notadamente uma

feramente útil, visto que a partir de estruturas notadamente ativas biologicamente é

possível estabelecer novos compostos com atividade farmacológica melhorada. A

síntese de compostos híbridos baseia-se na combinação de grupos farmacofóricos de

diferentes substâncias bioativas para produzir um novo composto híbrido com afinidade

e eficácia melhorada,39 sendo que essa estratégia conduz a compostos com

seletividade e perfil modificados, diferentes dos efeitos originais ou de modo sinérgico,

com possível redução nos efeitos secundários.40

Muitas características são ligadas as reações multicomponentes, tais como

elevada economia de átomos (com a maioria dos átomos, ou mesmo a totalidade,

sendo incluídas no produto-alvo), alta eficiência (com rendimentos maiores em

comparação a reações sequênciais em múltiplas etapas na obtenção de um mesmo

alvo-sintético), convergência (diversos compostos iniciais são combinados em uma

reação para formar o alvo-sintético) e elevado índice de formação de ligações ou BFI,

do inglês bond-forming-index (diversas ligações de átomos, excetuando o hidrogênio,

são formadas em uma transformação sintética).41 Dessa forma, as reações

multicomponentes oferecem uma alternativa prática para a síntese sequencial em

múltiplas etapas,42 além do alto potencial exploratório quanto ao escopo químico e de

24

serem idealmente aplicadas para a geração de bibliotecas de compostos2 (Esquema

5). Diversas reações multicomponentes são descritas na literatura – como as reações

multicomponentes de Ugi,43 Passerini,44 Van Leusen,45 Strecker,46 Hantzsch,47 e

Biginelli,4 entre outras, além de suas variações – sendo classificadas como reações

clássicas da síntese orgânica. Adicionalmente, as reações multicomponentes oferecem

alta compatibilidade com grupos funcionais ortogonais não protegidos, que em um

segundo nível, podem aumentar a diversidade de estrutura pela introdução de grupos

funcionais nas reações multicomponentes primárias e transformações subsequentes,

tais como formação de anel. Essa estratégia em duas etapas é aplicada na química

combinatória e medicinal para a criação de fármacos inéditos.48, 49 Essa estratégia em

duas etapas é ilustrada no Esquema 6.

Esquema 5. Síntese linear tradicional em três etapas vs. reação multicomponente

25

Esquema 6. Variedade estrutural baseada em primárias ou clássicas RMC e reações

secundárias

Dessa forma, a síntese simples e rápida de compostos biologicamente

relevantes gerados pelas reações multicomponentes assim como a possibilidade de

diversidade estrutural dos compostos gerados nessas reações – as define como uma

ferramenta no projeto, desenvolvimento e descoberta de compostos biologicamente

ativos.42

Uma grande necessidade ligada ao projeto de novos fármacos é a síntese de

compostos com possibilidade de aplicação como agentes antitumorais, devido a grande

taxa de mortalidade e heterogeneidade dos tipos de câncer. O câncer é definido como

um conjunto de mais de 100 doenças com possibilidade de acometer todos os órgãos

do corpo.50 Os tumores de sistema nervoso central (SNC) são de elevada relevância

quando se trata de estudo de novos fármacos, devido à alta taxa de mortalidade

apresentada e de suas co-morbidades. Os tumores de sistema nervoso central se

dividem em neuroma (tumor de células neuronais) e glioma (tumores de células gliais)

considerado o tumor primário mais comum no cérebro (de 50 a 60% destes).51 Apesar

dos tratamentos atualmente aplicados, pacientes diagnosticados apresentam uma

sobrevida média baixa com o quadro permanecendo inalterado ao longo das últimas

décadas.52, 53 As causas desta recorrência parecem ser principalmente a proliferação

de alta invasividade e a resistência à radiação.54 Além disso, os tumores do SNC

podem progredir rapidamente com geração de metáteses em diversas partes do

organismo ou outras funções vitais.2, 55

Apesar do grande número de fármacos utilizados no tratamento destas

patologias a efetividade é pequena devido a entrada destes compostos no SNC ser

dificultada pela presença da barreira hemato-encefálica (BHE), elemento da

26

neurovasculatura que serve como um impedimento para a entrada ilimitada de

substâncias no cérebro, limitando fortemente a gama de propriedades físico-químicas

das substâncias que entram no SNC, fazendo com que muitos fármacos sejam

desenvolvidos conforme estas orientações (CARVEY et al, 2009; UPTON, 2007). O

desenvolvimento de novos fármacos não é relacionado exclusivamente ao

reconhecimento específico e potente dos alvos farmacodinâmicos – mas igualmente a

entrega eficiência aos sítios de destino. Os efeitos farmacológicos e terapêuticos de

determinado fármaco são associados a passagem por diversas barreiras celulares

visando uma resposta in vivo. A permeabilidade através de várias barreiras celulares é

ligada a diversas propriedades como solubilidade, estabilidade e efeito de primeira

passagem, além das propriedades farmacocinéticas (taxa de depuração, meia-vida

biológica, e volume de distribuição entre outras). Pelas amplas ligações com as

propriedades ADMET e a adequação geral de candidatos a fármacos, a lipofilicidade

tem emergido como um parâmetro crítico na descoberta e projetos de novos fármacos.

A lipofilicidade se refere à capacidade se dissolver em substâncias apolares, sendo

reconhecida como um fator importante para a passagem bem sucedido de fármacos.35,

56, 57 A relação entre o aumento da lipofilicidade de compostos e sua avaliação

citotóxica foi relatada por Hudgines e colaboradores58 – sendo possível estabelecer

inclusive no teste in vitro o aumento do potencial inibitório contra as linhagens tumorais

de tumor de próstata (PC3), glioma (U87) e melanoma com o aumento da lipofilicidade

das estruturas dos análogos ao fenilacetato (25), com destaque para o 1-naftilacetato

(26) e 4-iodo- fenilacetato (27).

Atividade antitumoral das diidropirimidinonas

As DHPMs exibem uma grande gama de diferentes atividades farmacológicas,

tais como atividade antiviral, anti-inflamatória, antibactericida, antifungica, antiepilética,

antimalárica entre outras. Devido à alta incidência do câncer, assim como da

dificuldade atrelada ao tratamento, a atividade antitumoral de compostos é

extremamente relevante na pesquisa, sendo atualmente este um tópico fundamental no

estudo desses heterocíclicos.59

27

Os adutos de Biginelli são uma estrutura promissora para o tratamento de

tumores, sendo o monastrol (2) um exemplo de aduto de Biginelli empregado em

estudos para o tratamento de tumores. Mayer e colaboradores descreveram pela

primeira vez o efeito do monastrol na atividade antitumoral, demonstrado a ação direta

do monastrol na interrupção da mitose inibindo a atividade motora na cinesina EG5,

uma proteína envolvida na formação do fuso bipolar.60 A partir dessa aplicação o

monastrol se tornou o alvo de inúmeras publicações como potencial agente antitumoral.

Russowsky e colaboradores sintetizaram 11 compostos análogos ao monastrol,

sendo o piperastrol (28) considerado um potente agente antitumoral contra diversas

linhagens de células tumorais (baseados na concentração do composto para inibir o

crescimento celular em 50% do efeito máximo - EC50, IC50 ou GI50) tais como linhagens

de mama (MCF-7), rim (786-0), colón (HT-29), melanona (UACC62) e ovário

(OVCAR03) (Figura 5). O piperastrol demonstrou resultado de 1,9 µg/mL contra a

linhagem de mama MCF-7 e de 2,0 µg/mL contra a linhagem de rim 786-0, além das

demais linhagens nas quais apresentou concentração inferior a 6,6 µg/mL (sendo que

piperastrol demonstrou atividade 30 vezes superior ao monastrol). Além do piperastrol,

Russowsky e colaboradores obtiveram excelentes resultados com os outros

compostos, sendo que com exceção da linhagem de células tumorais colón HT-29 os

derivados do monastrol foram mais potentes que os derivados oxo- sugerindo a

importância da presença de enxofre para a atividade anti-proliferativa.61

Figura 5. Estrutura do piperastrol 28

Kamal e colaboradores estudaram a síntese de dímeros do monastrol é a

avaliação deles como potencial agente citotóxico em linhagens tumorais humanas. A

síntese dos dibenzaldeídos substituídos 29 foi realizada a partir de compostos de

28

dibromo, sendo os dibenzaldeídos utilizados na condensação de Biginelli com tioureia e

acetoacetato de etila 30 ou acetoacetato de 2-carboxilato-pirrolidina 31 conforme

demonstrado no Esquema 7. Foram obtidas 10 estruturas de análogos ao monastrol

(32, 33a-e) sendo aplicadas na inibição da viabilidade celular de uma série de

linhagens tumorais - MCF-7b (câncer de mama), A431c (câncer de pele), Colo-205d

(câncer de cólon), A549 (câncer de pulmão) sendo que as mesmas demonstram

atividade de moderada a baixa.62

Esquema 7. Síntese de dímeros do monastrol 32, 33a-e

Kaur e colaboradores estudaram a condensação de 2-aminobenzimidazol 34

com acetoacetato de etila e diferentes aldeídos (aromáticos e heteroaromáticos),

obtendo bons rendimentos (exceto para os aldeídos funcionalizados com grupos

retiradores como OH nas posições –orto e –para). A inibição da viabilidade celular foi

estudada contra as linhagens PC3 (células de câncer de próstata), NCI-H1299 (células

de câncer de pulmão) e HCT116 p53 (−/−) (células de câncer de colón), demonstrando

atividade inibitória de moderada a excelente, com destaque para o composto derivado

do 2-hidroxi-1-naftaldeido 35 (Figura 6) que apresentou IC50=37 μM para inibição em

cultura de PC3 e IC50=40 μM para inibição em cultura de NCI-H1299.63

29

Figura 6. Composto tipo-Biginelli derivado do 2-hidroxi-1-naftaldeido (35)

Treptow e colaboradores34 desenvolveram a síntese de uma série de

diidropirimidinonas-ácidos graxos 5- alquil substituídas (DHPMs-5C-graxas) através da

condensação de acetoacetatos graxos, aldeídos aromáticos e ureia ou tioureia obtendo

15 compostos inéditos. A síntese foi realizada em duas etapas com a etapa inicial

sintetizando acetoacetato graxos (36) pela reação de transesterificação de álcoois

graxos (37) e acetoacetato de metila (38) e a segunda etapa pela condensação de

Biginelli propriamente dita (Esquema 8).

Esquema 8. Síntese de novas DHPMs-5-graxas

Após a etapa de síntese foram testadas quanto ao efeito da citotoxicidade em

linhagens tumorais de C6-rato e U-138-MG glioma humano. Esse estudo demonstrou

que as moléculas análogas ao monastrol derivadas das cadeias palmítica e oleica

30

demonstraram melhor resultados que a temozolamida (39), demonstrando assim o

potencial da funcionalização com cadeias graxas em fármacos antimorais. A Figura 7

mostra o efeito das DHPMs na viabilidade celular para a linhagem celular de glioma

humano U-138-MG após 24 horas de tratamento.

Figura 7. Resultados do teste de viabilidade celular para as moléculas Monastrol-

ácidos graxos-5C-alquil substituídas (Treptow et al., 2015)

31

3.2. Síntese das DHPMs

Dentro das diversas possibilidades geradas pelas reações multicomponentes –

as 3,4-diidropirimidinonas constituem uma importante classe de compostos com

excelentes propriedades farmacológicas.64 As 3,4-diidropirimidinonas, adutos de

Biginelli, compostos de Biginelli ou simplesmente diidropirimidinonas (DHPMs) foram

sintetizados primeiramente pelo químico italiano Pietro Biginelli em 1891, sendo uma

das primeiras reações multicomponentes realizadas. Os compostos sintetizados nessa

reação multicomponente – as 3,4-diidropirimidin-2(1H)-onas/tionas DHPMs, adutos de

Biginelli ou compostos de Biginelli – envolvem a reação de compostos 1,3-

dicarbonílicos, aldeídos e ureia (24) ou tioureia (25) em uma única etapa, possuindo

tanto ocorrência natural, como no caso de alguns alcaloides marinhos presentes nas

batzeladinas (40) ou de natureza sintética, como no caso do SNAP-6383 (41) um

potencial agente no combate da hiperplasia prostática benigna. A variação dos três

componentes ou blocos de construção gera uma enorme gama de produtos derivados

com uma ampla diversidade estrutural.65

Figura 8. DHPMs de ocorrência natural e sintética

Os três precursores utilizados na RMC de Biginelli podem ser generalizados em

compostos dicarbonílicos, aldeídos e compostos do tipo ureia, sendo que a

combinação desses três blocos de construção gera uma enorme gama de compostos

com grande diversidade e complexidade.9

32

A maior variação nos blocos de construção ao qual são submetidos os

compostos de Biginelli compreende a variação no bloco correspondente ao aldeído 9,

sendo utilizados em sua maioria compostos aromáticos com diferentes orientações de

substituição (orto-, meta- e para-), funcionalizados com grupos doadores e retiradores

de elétrons. Preferencialmente os maiores rendimentos são obtidos com aldeídos

aromáticos substituídos nas posições orto- e meta- com grupos eletro-retiradores. A

substituição em orto- gera menores rendimentos com grupos mais volumosos devido

ao impedimento estérico.4, 9, 64, 65 A literatura ainda relata a utilização de aldeídos

alifáticos e aldeídos heterocíclicos.

Outra variação responsável pela diversidade e complexidade das

diidropirimidinonas é no bloco da ureia e derivados. O último bloco de construção

passível de alteração é o dos compostos dicarbonílicos, que podem exibir uma ampla

gama de funções orgânicas, como tioester, cetoesteres, cetos, cetoamidas, etc.

Síntese de compostos 1,3-Dicarbonilicos

Os três precursores utilizados na RMC de Biginelli podem ser generalizados em

compostos 1,3-dicarbonílicos, aldeídos e compostos do tipo ureia, sendo que a

combinação desses três blocos de construção gera uma enorme gama de compostos

com grande diversidade e complexidade.9 Dentre os blocos construtores o bloco

relativo aos compostos 1,3-dicarbonílicos é o mais relevante com podendo exibir uma

ampla gama de funções orgânicas, como tioester, cetoesteres, cetos, cetoamidas, etc.

Uma importante via de obtenção de blocos construtores do tipo dicarbonílicos

altamente funcionalizados visando a geração de diidropirimidinonas 6-funcionalizadas

consiste na funcionalização do ácido de Meldrum e posterior geração de compostos do

tipo 1,3-dicarbonílicos com funcionalização no grupo ceto.

Oikawa e colaboradores sintetizaram uma série de β-cetoésteres a partir da

acilação direta do ácido de Meldrum com diferentes cloretos de acila utilizando piridina

como catalisador. Neste caso, após a etapa da acilação o Meldrum acilado foi

submetido a reação de alcóolise na presença de diferentes álcoois como metanol,

33

etanol, álcool terc-butílico, álcool benzílico e tricloroetanol, sendo obtidos uma grande

variedade de β-cetoesteres (42),66 conforme Esquema 9.

Esquema 9. Síntese de β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum (Oikawa et al.,

1978)

Baseado no mesmo princípio Lacotte e colaboradores67 visando obter

precursores para uma condensação de Biginelli sintetizaram uma série de β-cetoester

a partir da acilação do ácido de Meldrum com diferentes ácidos carboxílicos (43), sendo

os mesmos tratados álcool 4-metoxibenzílico (44), conforme Esquema 10, produzindo

β-cetoésteres aromáticos (45).

Em outro estudo Shimkin e colaboradores68 realizaram a acilação do ácido de

Meldrum com diferentes grupos arílicos a partir de imidazois de ácido carboxílico (46),

obtendo um Meldrum acilado com aromático (47) seguido da abertura com etanol,

sendo obtidos β-cetoésteres (48). Além da aplicação dessa reação com N,N´-

carbonildiimidazol, outros três métodos foram utilizados; cloretos de acila e piridina,

cloretos de acila e DMAP e cloretos de acila com DCC, com a segunda etapa de

alcóolise mantida inalterada. Dentro os métodos, o método com N,N´carbonildiimidazol

foi o que demonstrou maior rendimento, independente do grupo arílico utilizado sendo

exposto no Esquema 11.

34

Esquema 10. Síntese dos β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum

Esquema 11. Utilização de N,N´carbonildiimidazol na síntese de β-cetoésteres

aromáticos 48

35

Além da alcóolise do Meldrum acilado a estrutura acilada pode reagir com outros

nucleófilos, tais como aminas, gerando β-cetoamidas. A aminólise do Meldrum acilado

visando a obtenção de β-cetoamidas (49) foi estuda por Pak e colaboradores69 a partir

da acilação do Meldrum com diferentes cloretos de acila, sendo o produto da acilação

refluxado em benzeno com diferentes aminas primárias e secundárias (50) sendo

obtidas as β-cetoamidas.

Esquema 12. Síntese de β-cetoamidas via ácido de Meldrum (Pak et al., 1992)

Contudo os estudos desenvolvidos por Janikowska e colaboradores70, 71

demonstraram a baixa eficiência de aminas secundárias na aminólise direta de

Meldrum acilado, com a obtenção de baixos rendimentos (26-50%), em oposição aos

experimentos realizados na aminólise direta do Meldrum com aminas primárias que

obtiveram rendimentos elevados. Para contornar os problemas relacionados à baixa

nucleofilicidade das aminas secundárias foi testada a adição do agente sililante

clorotrimetilsilano (51) ao meio. No Esquema 13 é exposto o mecanismo da reação

com adição de agente sililante, com a formação do intermediário entre o

triclorometilsilano e a amina secundária, com rendimentos finais entre 93-96%.

36

Esquema 13. Mecanismo de aminólise do Meldrum acilado com agente sililante

Outra aplicação sintética do Meldrum acilado é na síntese das N-Acil

Homoserinas Lactonas (NAHLs) (52) (Figura 9), compostos que mimimetizam

moléculas responsáveis pelo quorum sensing de bactérias. O quorum sensing é um

processo baseado em moléculas sinalizadoras de baixo peso molecular para

comunicar informações sobre as densidades populacionais locais, visando controlar e

coordenar seu comportamento, sendo estas moléculas de sinalização – conhecidas

como auto indutores – responsáveis por um papel chave em um complexo mecanismo

de comunicação célula a célula.72

37

Figura 9. N-Acil homoserinas lactonas 52 de ocorrência natural

Thomanek e colaboradores 73 sintetizaram NAHL funcionalizados com ácido 10-

azidodecanóico (53) a partir do ácido de Meldrum e ácido 12-azidododecanóico (54)

(via DCC e DMAP). Além da funcionalização na cadeia graxa foram realizados estudos

com diferentes substituintes no anel da lactona (55) (Esquema 14) gerando N-Acil

Homoserinas lactonas funcionalizadas (56).

Esquema 14. N-Azidoacil homoserina lactona e N-Acil homoserinas lactonas

funcionalizadas

38

Reação de Biginelli utilizando ácido sulfâmico

Diversos catalisadores foram amplamente estudados e aplicados na reação de

Biginelli, sendo que atualmente os catalisadores verdes tem recebido maior atenção.

Dentro desse contexto o ácido sulfâmico, devido as suas características excepcionais

de estabilidade, não-volatilidade, não corrosividade, atoxicidade e baixo custo,74 se

mostra um potencial catalisador para as condensações de Biginelli (tanto nas formas

suportadas quanto não-suportadas).

A viabilidade do ácido sulfâmico como catalisador em sistemas com ausência de

solvente foi estudada por Chen e colaboradores. Nesse estudo, primariamente, foi

avaliada a condensação multicomponente entre o acetato de etila , benzaldeído e ureia

com diferentes quantidades de ácido sulfâmico, variando entre 10 e 40%, temperaturas

reacionais (100 e 120°C) e diferentes tempos reacionais (entre 8 e 20 minutos). O

melhor resultado (94%) obtido nessa avaliação prévia foi com 30mol% de ácido

sulfâmico a 120 °C durante 8 minutos. Após esse resultado inicial o escopo dos blocos

de construção foi variado (Esquema 15) gerando uma biblioteca de compostos em

rendimentos excelentes (80-96%), comprovando a eficácia do ácido sulfâmico como

catalisador independente da variação estrutural empregada nos blocos de

construção.75

Esquema 15. Avaliação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de

solvente

39

Outro estudo que avaliou o ácido sulfâmico como catalisador da reação de

Biginelli em sistemas com ausência de solvente foi avaliada em um estudo de Yao e

colaboradores a partir da condensação de acetato de metila ou etila, diferentes

aldeídos aromáticos, e do 5-aminotetrazol (57) (Esquema 16) gerando derivados das

DHPMs altamente funcionalizados (58). A reação foi realizada a 120°C e empregando

10%mol de ácido sulfâmico, sendo os rendimentos obtidos na faixa de 77 a 88%.76

Esquema 16. Aplicação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de

solventes

Outro trabalho estudou o uso comparativo do aquecimento convencional e do

aquecimento via micro-ondas utilizando a relação estequiométrica de 1:1:1,5

(aldeído:1,3-dicarbonílico:ureia/tioureia) e 20% de ácido sulfâmico em ambas formas de

aquecimento; os rendimentos obtidos para o aquecimento convencional ficaram na

faixa de 64 a 80% em períodos de até 7 horas enquanto com o aquecimento via

microondas foi de 84 a 93% usando períodos inferiores a 3,5 minutos.77

Shen e colaboradores (2012) empregaram ácido sulfâmico na catálise da

condensação de Biginelli, utilizando 10% mol de catalisador em etanol a 90 °C de 7 a 9

horas sendo obtidos rendimentos entre 76 e 90%. A condensação de Biginelli foi

40

realizada utilizando a relação estequiométrica de 1:1:1 (aldeído:1,3-

dicarbonílico:carbonato de fenilguanidina).78

Em outro estudo, Jetti e colaboradores utilizaram como suporte para o ácido

sulfâmico sílica, catalisando a reação multicomponente com sílica ligada a N-propil

ácido sulfâmico. A reação foi realizada empregando uma relação estequiométrica de

1:1:1 (aldeído:1,3-dicarbonílico:ureia/tioureia) e 200 mg da sílica funcionalizada com

ácido sulfâmico (2,4% mol de SO3H) para 2,5 mmol de aldeído. A reação foi realizada

utilizando etanol como solvente a 80°C, conforme demonstrado no Esquema 17. Os

rendimentos da reação ficaram na faixa de 90 a 95% com o tempo reacional variando

entre 3 e 4 horas.79

Esquema 17. Ácido sulfâmico suportado em sílica

A catálise da condensação de Biginelli via ácido sulfâmico suportado foi

estudada por Toosi e colaboradores, sendo o ácido sulfâmico suportado em

nanopartículas magnéticas de Fe3O4. As nanopartículas magnéticas foram obtidas a

partir da coprecipitação dos íons Fe2+ e Fe3+, seguido do revestimento por 3-

aminopropil-trietoxisilano e posterior reação com ácido clorossulfúrico. A condensação

de Biginelli foi realizada utilizando a relação estequiométrica de 1:1,2:1,5 (aldeído:1,3-

dicarbonílico:ureia/tioureia) e 120 mg da nanopartícula magnética funcionalizada com

ácido sulfâmico (para 1 mmol de aldeído) a 100 °C durante 2 horas. Os rendimentos

41

obtidos para os derivados da ureia ficaram entre 80 e 92% e para os compostos

derivados da tioureia na faixa de 75 a 85% (Esquema 18).80

Esquema 18. Uso de ácido sulfâmico suportado em nanopartículas magnéticas

42

4. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

4.1. Síntese dos β-cetoésteres 13a-c

A partir dos estudos desenvolvidos por Oikawa e colaboradores e Lacotte e

colaboradores 66, 67 sobre a síntese de compostos 1,3-dicarbonílicos a partir da acilação

do ácido de Meldrum foram desenvolvidas duas metodologias para a síntese dos β-

cetoésteres. A primeira metodologia envolveu a adição em uma única etapa do ácido

graxo, DCC, DMAP, ácido de Meldrum e piridina; e a segunda metodologia ocorreu em

duas etapas, adição do ácido graxo, DCC e DMAP seguido da adição de uma mistura

de ácido de Meldrum e piridina. Em ambos as metodologias a etapa de alcóolise foi

realizada para obtenção dos respectivos β-cetoésteres 11a-c.

Com a reação em uma única etapa foram observados rendimentos de

moderados a bons (Tabela 1) conforme já descrito por Brinkerhoff e colaboradores29

sendo os rendimentos moderados atribuídos a possível reação paralela do DCC e do

ácido de Meldrum. Visando contornar essa reação, foi estudada a acilação em duas

etapas. Nessa metodologia a adição do ácido de Meldrum foi realizada após a ativação

do ácido graxo pela presença de DCC seguido da etapa de alcóolise para levar a

formação dos β-cetoésteres graxos 11a-c. No processo acima, em duas etapas, a

formação de subprodutos foi evitada levando a formação dos β-cetoésteres graxos

13a-c em bom rendimentos (Tabela 1).

43

Tabela 1. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c a partir da acilação do ácido de

Meldrum 13 com ácidos graxos 12a-c e posterior metanólise

Ácido graxo β-Cetoésteres 13a-c Rend. (%)a Rend. (%)b

65 80

69 84

70 81

a: etapa de acilação do ácido de Meldrum (13) com ácidos graxos (12a-c) realizada em uma

única etapa; b: etapa de acilação do ácido de Meldrum (13) com ácidos graxos (12a-c) realizada em duas

etapas (i) reação do ácido graxo (12a-c) com DMAP e DCC (ii) seguido da adição do ácido de Meldrum

(13) e piridina;

A reação entre o DDC e o ácidos de Meldrum foi descrita na literatura em um

estudo de Augustin e Giinther em condições similares a utilizada anteriormente.81

Neste trabalho a reação do ácido de Meldrum foi realizada com diferentes

carbodiimidas (Esquema 19) sendo obtidos rendimentos entre 60 e 70% para os

produtos de condensação (59).

44

Esquema 19. Reação entre o ácido de Meldrum e diferentes carbodiimidas

Em outro estudo dos mesmos autores o produto da reação do ácido de Meldrum

com carbodiimida foi tratada com etanol sendo obtido um éster derivado de

carbodiimidas (Esquema 20).

Esquema 20. Obtenção de um composto derivado de carbodiimidas

Após a obtenção dos β-cetoésteres 11a-c os compostos foram caracterizados.

Os dados de ressonância magnética dos compostos sintetizados foram condizentes

com os dados da literatura conforme descrito por Brinkerhoff e colaboradores.29

45

4.2. Síntese das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas

3-10a-c

Baseado no estudo anterior da síntese de diidropirimidinonas graxas 5-

substituídas34 a síntese dos novos análogos diidropirimidinonas graxas 6-substituídas,

alvo sintético deste trabalho, foi realizada a partir da condensação tricomponente de

Biginelli entre os β-cetoésteres graxos, aldeídos aromáticos e ureia ou tioureia, usando

como reação protótipo a condensação de β-cetoéster esteárico 11a, benzaldeído 17 e

ureia 21. A reação foi realizada nas mesmas condições reacionais utilizando refluxo em

acetonitrila e ácido sulfâmico como catalisador.

Como um dos objetivos era a avaliação de um catalisador verde na reação de

Biginelli, e impulsionado pelos estudos já realizados em nosso grupo de pesquisa74, o

ácido sulfâmico foi escolhido como catalisador para a reação de Biginelli sendo

aplicado inicialmente nas mesmas quantidades catalíticas descritas por Treptow e

colaboradores.34 Entretanto, os rendimentos obtidos para a síntese das

diidropirimidinonas graxas 6-substituídas não foram satisfatórios, sendo aplicadas

modificações na reação protótipo como variação do solvente e da quantidade de ácido

sulfâmico empregada. Como observado na

46

Tabela 2, o ácido sulfâmico devido a sua acidez moderada se mostrou eficiente quando

empregado em maiores proporções.

47

Tabela 2. Reação multicomponente de Biginelli usando β-cetoéster estárico 11b,

benzaldeído 17 e ureia 21 com diferentes catalisadores

Entradaa Solvente Catalisador Catalisador

(%mol) Rendimento (%)b

1 MeCN

NH2SO3H 10 50

2 NH2SO3H 20 55

3 MeOH

NH2SO3H 10 50

4 NH2SO3H 20 65

5 EtOH

NH2SO3H 10 45

6 NH2SO3H 20 48

7

MeOH

NH2SO3H 40 83

8 NH2SO3H 60 85

9 NH2SO3H 80 75

10 NH2SO3H 100 81

11 MeCN InCl3 10 26

12 MeOH InCl3 10 42

13 MeCN InCl3 20 30

14 MeOH InCl3 20 44

15 MeCN SnCl3 10 36

16 MeOH SnCl3 10 38

17 MeCN SnCl3 20 40

14 MeOH SnCl3 20 32

a: Reação multicomponente de Biginelli 1 eqv.:1 eqv.:1,3 eqv. (respectivamente β-cetoesteres,

aldeído, ureia); refluxo de solvente; 24 horas; b: Composto isolado por cromatografia em coluna

48

Apesar da maior quantidade empregada a aplicação do ácido sulfâmico

apresenta inúmeras vantagens, como a baixa toxicidade apresentada pelo mesmo,

assim como do baixo valor e da possibilidade de reutilização, devido a heterogeneidade

do mesmo no meio. De acordo com o resultado os maiores rendimentos foram obtidos

em metanol com 60% de ácido sulfâmico (entrada 8). A diminuição no rendimento em

valores superiores a 60% pode ter ocorrido devido a possibilidade da ocorrência de

reações paralelas e concorrentes com efeitos diretos sobre o rendimento da reação.

A reação foi acompanhada por CCD sendo monitorado o consumo dos

reagentes limitantes (β-cetoéster esteárico e benzaldeído). A DHPM graxa 3b foi

observada após 24h de reação sendo isolada por coluna cromatográfica (7:3

hexano:acetoacetato de etila) com rendimento final de 50%. O rendimento observado

foi inferior a estrutura análoga DHPM graxa 5-substituida obtida nas mesmas

condições. Essa diferença entre os rendimentos das estruturas análogos 5 e 6

substituidas foi atribuída a diferença na reatividade dos compostos 1,3-dicarbonílicos

empregados, acetoacetato graxoe β-cetoester graxo, respectivamente.

Srilatha e colaboradores82 estudaram o comportamento e a influência da cadeia

alquílica na reação de esterificação de ácidos carboxílicos. Em seus estudos, foi

concluído que a medida que ocorrem adições de carbono na cadeia alquilica, aumenta

o efeito indutivo restringindo o ataque nucleofílico do álcool ao ácido carboxílico. Outro

ponto decisivo é o componente estérico que aumenta com o aumento da cadeia

alquilica do ácido, sendo o impedimento estérico ligado ao tamanho molecular que rege

a indução com a repulsão eletrônica entre os átomos não ligados das moléculas. Neste

caso diminui a densidade eletrônica na região e alterando as diversas ligações

intermoleculares da ligação, sendo os fatores chaves a reatividade restrita dos

compostos graxos a natureza indutiva e estérica. Esse fator de diminuição de

reatividade é recorrente e pode ser verificado inclusive na síntese de heterocíclos

nitrogenados baseados em blocos precursores tais como PHQs,28 DHPMs34 e DHPs.

Ainda, o ácido sulfâmico teve seu desempenho comparado com a catálise

desempenhada pelo cloreto de índio e pelo cloreto de estanho sendo superior aos dois

ácidos de Lewis, confirmando a eficiência da catálise com ácido sulfâmico frente a

sistemas clássicos de catálise.

49

Baseado no resultado demonstrado com metanol como solvente e 60% de ácido

sulfâmico como catalisador, a próxima etapa envolveu a variação nos blocos de

construção com variação nos β-cetoésteres assim como nos aldeídos envolvidos,

sendo realizada a síntese de uma série de diidropirimidinonas (3-6a-c).

50


obtidas pela reação multicomponente de Biginelli

Entradaa β-Cetoésteres

11a-c

DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas

3-6a-cb

Rend. (%)c

1

83

2

78

3

81

51

4

67

5

74

6

85

7

83

52

8

61

9

67

10

68

11

71

53

12

60


aldeído, ureia); refluxo de CH3OH; 24 horas; b: DHPMs-6C-graxas (3-6a-c) elucidadas estruturalmente

por IV, RMN1H e RMN

13C;

c: Composto isolado por cromatografia em coluna.

Conforme pode ser demonstrado na

54

Tabela 3, foram sintetizados compostos com elevada diversidade e complexidade, em

bons rendimentos. A variação estrutural empregada na porção aromática do heterociclo

foi realizada de maneira a obter diferentes grupos funcionais, doadores e retiradores de

densidade eletrônica, nas posições meta e para do anel aromático. A variação

estrutural na posição seis do anel empregou três cadeias graxas, tanto saturadas

quanto insaturada, sendo as mesmas derivadas de fontes renováveis. Os compostos

foram identificados através de Espectroscopia de RMN de hidrogênio e carbono.

Abaixo é apresentado o espectro de RMN de hidrogênio do composto 3b (Figura 10).

Figura 10. Espectro de RMN de 1H (400 MHz/CDCl3) do composto 3b

Observando o espectro de hidrogênio foi possível identificar os sinais referentes

ao composto 3b. Em 0,88 ppm foi possível observar um tripleto relativo aos hidrogênios

da metila da cadeia graxa; em 1,32 o multipleto referente ao CH2 da cadeia graxa, em

1,58 os hidrogênios relativos aos hidrogênios homoalílicos e em 2,70 ppm o sinal

relativo aos prótons alílicos. O simpleto relativo aos sinais dos prótons da metoxila foi

55

percebido em 3,6 ppm. Em 5,37 ppm foi observado o dupleto relativo ao hidrogênio

benzílico H4 onde a expansão dessa região se encontra explicitada na Figura 11. Os

sinais relativos aos hidrogênios ligados ao nitrogênio do heterociclo são definidos em

5,9 ppm e 8,0 ppm. A região dos prótons ligados ao anel aromático é definida no

multipleto em 7,55.

Figura 11. Expansão da região do próton benzílico (400 MHz/CDCl3) do composto 3b

O espectro de carbono do composto 3b é ilustrado na Figura 12. Em 165,7 é

exposto o carbono do éster e em 153,2 é ilustrado o carbono da posição 2 do

heterociclo. Por sua vez, em 151,0 é exibido o sinal referente ao carbono vinílico da

posição 6. Em 143,8 é exposto o sinal do carbono relativo ao carbono da porção do

aldeído ligado ao heterociclo. Entre 126,4 e 128,7 ppm estão os sinais relativos aos

carbonos aromáticos e em 100,8 o carbono na posição 5. Em 55,7 está o sinal do

carbono benzilico, na região de 50,93 ppm é definido o sinal do carbono da metoxila; os

sinais definidos entre 22,65 e 29,66 são relativos aos carbonos da cadeia graxa estão

56

entre 28,20 e 31,89 ppm e os sinais do carbono terminal e alfa-terminal estão

sinalizados respectivamente em 22,69 e 13,99 ppm, respectivamente.

Figura 12. Espectro de RMN de 13C (100 MHz/CDCl3) do composto 3b

Somado as diidropirimidinonas, foram sintetizadas uma série de

diidropirimidintionas 8-12a-c, sendo os resultados demonstrados na

57

Tabela 4.

58

Tabela 4. Estruturas e rendimentos das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas

7-10a-c obtidas pela reação multicomponente de Biginelli

Entradaa β-Cetoésteres

13a-c

DHPMs-6C-graxas

8-12a-cb Rend. (%)c

13

76

14

81

15

77

59

16

67

17

78

18

74

19

75

60

20

64

21

64

22

60

23

68

61

24

63


aldeído, tioureia); refluxo de CH3OH; 24 horas; b: DHPMs-6C-graxas (7-11a-c) elucidadas

estruturalmente por IV, RMN1H e RMN

13C;

c: Composto isolado por cromatografia em coluna.

Assim como na síntese das diidropirimidinonas, as diidropirimidintionas foram

obtidas com grande diversidade estrutural devido ao caráter modular da reação. Foram

realizadas variações na posição 6 heterociclo a partir da modificação do β-cetoéstres e

na porção do aldeído, com diferentes grupos doadores e retiradores na posição meta e

para do aromático.

4.3. Avaliação da atividade antitumoral dos hibridos

Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos

Baseado nos trabalhos anteriores sobre a atividade das DHPMs como fármacos

antitumorais60 e principalmente relacionando a atividade do monastrol como potencial

fármaco (Russowsky et al., 2006) a avaliação da atividade antitumoral foi focado nos

derivados graxos do monastrol. Em artigo anterior34 foram avaliadas diferentes DHPMs

graxas sendo demonstrado no mesmo a relação do monastrol com a maior atividade

antiproliferativa, sendo o atual estudo focado nos hibridos DHPMs graxas 6-

substituidas análogos ao monastrol. Por esse motivo, foram avaliados 3 derivados

graxos do monastrol e 3 derivados graxos do oxo-monastrol, além do derivado graxo

hibrido DHPM 5-substituido que demonstrou maior potencial como fármaco antitumoral

sintetizado por Treptow e colaboradores34 e o próprio monastrol , usado nesse estudo

como controle positivo, visando avaliar o efeito da inserção da cadeia graxa na

atividade antitumoral.

62

As DHPMs tiveram sua citotoxicidade avaliadas frente à linhagem celular de

glioma de rato (C6) sendo esse estudo desenvolvido em parceria com o grupo de

pesquisa da professora Ana Paula Horn do Laboratório de Cultura Celular do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande – FURG. As moléculas

foram avaliadas quanto à citotoxicidade (contagem celular), à viabilidade celular (MTT),

à necrose (marcação com iodeto de própidio) e a potência (IC50).

A

Tabela 5 resume as estruturas testadas mostrando o coeficiente de partição

(ClogP) dos compostos avaliados.

Tabela 5. Predição do coeficiente de partição (ClogP) dos compostos avaliados quanto

aos efeitos citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6).

Composto

Estrutura

Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídas

LogPa

tPSA Å Crippen

23

Viswanadhan

26

Broto

17

Controle

positivo

graxo -

Hibrido oxo-

monastrol-

C16:0-5-

substituído

6,06

(±0,47)

5,90

(±0,49)

7,11

(±1,01) 87,66

Controle

positivo –

monastrol

1,57

(±0,47)

1,91

(±0,49)

1,23

(±0,88) 70,59

63

Híbrido

monastrol-

C16:0-6-

substituído

5,72

(±0,47)

5,56

(±0,49)

6,82

(±1,04) 87,66

Híbrido

monastrol-

C18:0-6-

substituído

5,47

(±0,47)

6,35

(±0,49)

7,73

(±1,06) 87,66

Híbrido

monastrol-

C18:1-6-

substituído

6,23

(±0,47)

6,09

(±0,49)

7,01

(±1,11) 87,66

Híbrido

monastrol-

C16:0-6-

substituído

7,15

(±0,47)

7,19

(±0,49)

6,82

(±1,09) 70,59

64

Híbrido

monastrol-

C18:0-6-

substituído

7,98

(±0,47)

7,98

(±0,49)

8,24

(±1,11) 70,59

Híbrido

monastrol-

C18:1-6-

substituído

7,66

(±0,47)

7,72

(±0,49)

8,53

(±1,16) 70,59

a: CLog P e tPSA calculados utilizando o software Chem Draw Ultra

® 12.0.2.1076

O teste de contagem celular realizado após o intervalo de 48 horas de

tratamento com as DHPMs em linhagem celular de glioma mostrou que todas as

moléculas testadas apresentam efeito antitumoral. As moléculas 4b, 8a e 8b

apresentaram melhores resultados, com redução no número de células viáveis desde a

menor concentração, sendo que as moléculas 8a e 8b, derivadas da tioureia e dos

ácidos palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0), respectivamente, mostraram uma maior

redução, com diferença estatística de 0,001 quando comparadas ao grupo controle. As

figuras abaixo trazem a contagem celular na linhagem C6.

65



tratado com DMSO para os composto 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de

pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle.

66



tratado com DMSO para os composto 4a (esquerda) e 8a (direita). ANOVA seguido de

pós-teste de Tukey, *** p <0.001 com relação ao controle.

67



tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4b (esquerda) e 8b (direita).


controle.

68



tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4c (esquerda) e 8c (direita).


controle.

O MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromídio], teste que estima

quantidade de células viáveis através do metabolismo mitocondrial, demonstrou que

todas moléculas testadas apresentam redução na viabilidade celular, confirmando a

hipótese de que as DHPMs sintetizadas seriam efetivas no tratamento antitumoral.

Neste teste, as moléculas 4a, 4b, 8a, 8b e 8c apresentaram resultados

significativos desde a menor concentração testada (5µM), sendo que destas 4b, 8a e

8b apresentaram diferença de 0,001, indo ao encontro dos resultados obtidos na

contagem celular.

69

A funcionalização da cadeia graxa demonstrou ser relevante para a

potencialização do efeito in vitro. Entre as cadeias derivadas do ácido palmítico e do

ácido esteárico não foi notada diferença, desde que mantidos dentro do mesmo

grupamento tio ou oxo. E a combinação da funcionalização da cadeia graxa somada a

presença de um grupo tio, segundo os dados obtidos neste estudo, potencializam o

efeito das DHPMs testadas. As figuras a seguir trazem o ensaio de MTT.

Figura 17. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle

tratado com DMSO para os composto 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle.


70

tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4a (esquerda) e 8a (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao

controle.


tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4b (esquerda) e 8b (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao

controle.


tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4c (esquerda) e 8c (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao

controle.

71

O iodeto de propídeo foi marcado nas imagens em campo escuro nos

compostos de analisados comprovando que o mecanismo antitumoral das moléculas

testadas envolve necrose celular ou apoptose tardia, conforme demonstrado nas

imagens do ANEXO 2.

A avalição do IC50 (

72

Tabela 6) e do teste do MTT corrobora com os resultados obtidos até então, onde as

moléculas 8a e 8b são as mais potentes das moléculas testadas chegando a uma

inibição de 50% em concentrações de na concentração de 5 µM e 6 µM,

respectivamente. Além disso, podemos observar que todas as moléculas, com exceção

da 4c, apresentam valores de IC50 melhores que a molécula utilizada neste estudo

como controle positivo (monastrol), demostrando que a funcionalização com adição de

cadeia graxa é capaz de potencializar o efeito da molécula mesmo in vitro.

73

Tabela 6. Valores de IC50 para os compostos avaliados quanto aos efeitos

citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6)

Composto IC50 (µM) Composto IC50 (µM)

Oxo Tio

16,68

(14,47-19,23)

87,83

(58,34-132,2)

79,37

(49,76-126,6)

5,11

(4,13-6,32)

21,77

(18,65-25,41)

6,85

(6,18-7,60)

166,4

(78,40-353,00)

38,36

(25,87- 56,90)

74

O resultado apresentado pelo composto 4a foi semelhante ao resultado obtido

pelo monastrol em relação ao potencial de inibição, já o composto 4b foi superior ao

monastrol, evidenciando que o aumento da cadeia graxa nos compostos oxo- pode

influenciar no caráter inibitório. Porém o resultado exposto pelo composto 4c foi inferior

ao monastrol, possivelmente devido a presença da insaturação no carbono 9 que altera

a conformação da molécula no espaço modificando a ação desta in vitro. Em relação

ao controle positivo graxo 24 o comportamento do composto oxo- foi inferior ao controle

graxo, com exceção do composto 4b o qual apresentou equivalência da eficácia

inibitória.

Os compostos derivados da tioureia 8a, 8b e 8c quando comparados ao

monastrol (controle) apresentaram resultados superiores em relação a eficácia inibitória

comprovando assim o efeito da inserção da cadeia graxa nas estruturas análogos ao

monastrol. Entre os composto 8a e 8b não houve diferença em relação a eficácia

inibitória demonstrando o aumento da cadeia graxa não foi relevante nos compostos

análogos ao monastrol. Quando comparados com o controle positivo graxo Hibrido

monastrol-C16:0 5-substituído 24 ambos compostos 8a e 8b foram mais eficazes

apresentado o IC50 inferior a metade do valor apresentado pelo valor do 24,

demonstrado o alto potencial inibitória destas estruturas.

Outra informação relevante quanto ao IC50 foi a diferença nos resultados em

relação a comparação dos análogos do monastrol 8a, 8b e 8c e dos análogos ao oxo-

monastrol 4a, 4b e 4c. Os compostos híbridos da condensação com tioureia tiveram

resultados superiores de IC50 quando comparados aos compostos híbridos análogos

derivados da condensação com ureia, esse dado pode indicar que a presença do

enxofre facilita a ação antitumoral. Esse resultado foi condizente com o apresentado

por Russowsky e colaboradores,61 demonstrando a importância da condensação

utilizando tioureia na reação de Biginelli.

Ainda, a presença da instauração, seja nas moléculas derivadas do monastrol e

do oxo-monastrol, reduz a potência destes compostos. Isso possivelmente ocorre

75

devido a mudança conformacional gerada pela presença da instauração, e com isso

dificultando a interação da molécula com o sítio de ligação com a cinesina.

76

5. CONCLUSÃO

A síntese de novos híbridos DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-10a-c a

partir de precursores graxos foi concluída com a obtenção de 24 novos compostos.

A síntese dos β-cetoésteres graxos foi realizada baseada na acilação de ácidos

graxos e posterior metanólise com obtenção de β-cetoésteres 13a-c funcionalizados na

posição ceto com diferentes cadeias graxas em rendimentos de 80-84%.

A síntese das oxo- e tio-DHPMs graxas 6-substituidas envolveu a condensação

multicomponente de β-cetoésteres graxos 11a-c, diferentes aldeídos aromáticos e

ureia ou tioureia sendo a reação multicomponente de Biginelli catalisada por ácido

sulfâmico, um catalisador verde com elevadas características ambientalmente

amigáveis. O rendimento da síntese das oxo-DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas foi

entre 60-85% e das tio- DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas graxas 6-substituidas foi

entre 60-81%, sendo todas as estruturas Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos

caracterizadas por espectro de RMN de1H e 13C.

Os resultados do ensaio com MTT mostram que todas as moléculas testadas

apresentaram ação antitumoral e que as moléculas com cadeias graxas saturadas

derivadas da tioureia induzem uma significativa queda na viabilidade celular desde a

menor concentração utilizada e que essa redução segue uma curva concentração-

resposta, qualificando as moléculas 8a e 8b como mais eficazes. Além disso, a

marcação com IP sugere que as DHPMs apresentaram mecanismo antitumoral

envolvendo necrose celular ou apoptose tardia. O teste de contagem celular demonstra

a ação das DHPMs na linhagem celular C6, provando sua ação já que todos os

compostos tiveram diminuição no número de células após o tratamento, sendo que as

moléculas 8a e 8b apresentaram melhores resultados (diferença siginificativa de 0,001

desde a menor concentração de tratamento). Dentro das moléculas avaliadas, os

resultados demonstrados pelo IC50 indicam como moléculas com maior possibilidade

farmacológico 8a e 8b derivadas das cadeias palmítica (C16:0) e esteárica (C18:0),

respectivamente devido a ambas serem as moléculas mais potentes. Todas as

diidropirimidinonas graxas 6-substiutídas com cadeias graxas demonstraram potencial

77

superior ao do monastrol (com exceção da molécula 4c) – porém apenas as moléculas

8a e 8b mostraram potencial inibitório superior a molécula 24 (diidropirimidinonas

graxas 5-substiutídas com cadeias graxas). Os resultados dos testes indicam que as

oxo-DHPM graxas 6-substituidas e as tio-DHPM graxas 6-substituidas testadas

apresentam atividade antitumoral in vitro em uma linhagem de tumor cerebral maligno,

e dentre estas os compostos 8a e 8b obtiveram resultados superiores ao monastrol

(controle positivo) e ao controle Hibrido monastrol-C16:0-5-substituído (controle positivo

graxo), sendo promissoras para futuros experimentos in vivo.

78

6. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1. Materiais

Os reagentes e solventes utilizados nas etapas sintéticas foram obtidos

comercialmente e purificados, quando necessário, por destilação ou métodos

específicos. O ácido de Meldrum (SIGMA-ALDRICH), empregado na síntese dos β-

cetoésteres, foi purificado de acordo com o procedimento de Armarego e

Colaboradores 22. A piridina foi destilada de acordo com Perrin e Armarego 83. O DCC,

empregado como agente de acoplamento, foi triturado e seco sob vácuo a temperatura

ambiente, sendo que outras medidas de purificação como as descritas por Armarego e

Colaboradores 22 não foram necessárias. O diclorometano empregado como solvente

das reações de acilação foi desumidificado em duas etapas – desumidificação prévia

com sulfato magnésio e destilação com pentóxido de sódio 83. Os demais reagentes

empregados foram utilizados em seu grau comercial.

As reações foram monitoradas por CCD em sílica gel Merck 60GF245. Os

produtos obtidos foram purificados em coluna cromatográfica utilizando sílica gel

(ACROS 60-200 mesh).

As análises de ressonância magnética nuclear 1H e 13C foram realizadas nos

aparelhos Varian VNMRS operando a 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C

(INSTITUTO DE QUÍMICA - UFRGS), BRUKER DPX-400 operando a 400 MHz para 1H

e 100 MHz para 13C (DEPARTAMENTO DE QUÍMICA - UFSM) e Varian VNMRS

operando a 400 MHz para 1H e 100 MHz para 13C (CENTRAL ANALÍTICA DA ESCOLA

DE QUÍMICA E ALIMENTOS/FURG). Os deslocamentos químicos (δ) foram

registrados em ppm. Os espectros de RMN 1H tiveram seus dados expressos em

multiplicidade (s, simpleto, d, dupleto, t, tripleto e m, multipleto) e constante de

acoplamentos.

79

6.2. Síntese dos novos híbridos DHPMs-ácidos graxos-

6C- substituídas

Síntese dos β-cetoésteres graxos 13a-c:

Etapa 1 - Acilação do ácido de meldrum: Em um balão de fundo redondo de 25

mL foram adicionados o ácido graxo 12a-c (1 mmol), o DCC (14) (1,1 mmol) e o DMAP

(0,3 mmol) (15) dissolvidos em diclorometano seco (15 mL). A reação foi mantida sob

agitação constante e atmosfera de nitrogênio gasoso a temperatura ambiente durante

30 minutos. Após esse intervalo foi adicionado com o auxílio de um funil de adição o

ácido de Meldrum (13) (2 mmol) e a piridina (3,6 mmol) em diclorometano seco (10

mL). Após 24 horas a reação foi tratada usando extração líquido-líquido (duas lavagens

com 25 mL de solução de 10% de ácido clorídrico e uma lavagem com 25 mL de água

destilada) sendo a fase orgânica seca com sulfato de magnésio e o solvente evaporado

sobre pressão reduzida, com o bruto reacional da etapa de acilação do ácido de

Meldrum utilizado sem prévia purificação.

Etapa 2 - Metanólise do acido de Meldrum: O Meldrum acilado foi dissolvido em

metanol (25 mL) sendo a reação mantida por 24 horas sob refluxo de metanol. Após

esse intervalo o metanol foi removido por em rotaevaporador. Os β-cetoésteres (11a-c)

foram obtidos por separação em coluna cromatográfica (97: 3 hexano/éter).

Síntese das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-12a-c:

Em um balão de 25 mL de fundo redondo foram adicionados os β-cetoésteres

11a-c (1 mmol), diferentes aldeídos aromáticos 17-20 (1 mmol), ureia (21) ou tioureia

(22) (1,3 mmol) e ácido sulfâmico (60 mol%), utilizado como catalisador sendo o

conteúdo reacional dissolvido em metanol (5 mL). A reação foi mantida em refluxo

durante 24 horas, sendo monitorada em CCD (6:4 hexano:acetato de etila). Após esse

intervalo o metanol foi removido em rotaevaporador, sendo o bruto reacional purificado

por coluna cromatográfica (7:3 hexano:acetato).

80

Dados espectroscópicos dos compostos Monastrol-ácidos graxos-6C-

substituídas:

Figura 21. Composto 4a

metil 4-(3-hidroxifenil)-2-oxo-6-pentadecil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 4a: Fórmula molecular: C27H42N2O4; Massa molecular 458,63: g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 78%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,93 (br. s., 1H), 6,99 –

7,19 (m, 1H), 6,80 (br. s., 1H), 6,71 (d, J = 7.82 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 7.83 Hz, 1H), 5,27

(br. s., 1H), 3,62 (br. s., 3H), 2,52 – 2,75 (m, 2H), 1,45 – 1,64 (m, 2H), 1,16 – 1,38 (m,

24H), 0,89 (t, J = 6.85 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 166,0; 156,8; 154,1;

150,8; 144,9; 129,9; 118,0; 115,3; 113,3; 100,9; 55,1; 51,3; 50,6; 31,9; 29,7; 29,7; 29,6;

29,6; 29,4; 28,3; 22,7; 14,1.

Figura 22. Composto 4b

metil 6-heptadecil-4-(3-hidroxifenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 4b: Fórmula molecular: C29H46N2O4; Massa molecular: 486,69 g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 85%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,03 (br. s., 1H), 7,09 (t, J =

7.95 Hz, 1H), 6,83 (s, 1H), 6,75 (d, J = 7.82 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 8,07 Hz, 1H), 6,49 (br.

81

s., 1H), 5,27 (d, J = 2.69 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,49 – 2,71 (m, 2H), 1,44 – 1,61 (m, 2H),

1,19 – 1,35 (m, 24H), 0,90 (t, J = 7.10 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm

166,0; 156,7; 154,4; 150,7; 144,9; 129,9; 118,1; 115,4; 113,2; 100,9; 55,1; 51,3; 31,9;

29,8; 29,7; 29,7; 29,6; 29,4; 29,4; 28,4, 22,7, 14,1.

Figura 23. Composto 4c

(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-hidroxifenil)-2-oxo-1,2,3,4-

tetrahidropirimidina-5-carboxilato 4c: Fórmula molecular: C29H44N2O4; Massa

molecular: 484,67 g.mol-1; Óleo; Rendimento: 68%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm

8,21 (br. s., 1H), 7,25 – 7,35 (m, 6H), 5,99 (br. s., 1H), 5,40 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 5,31 –

5,39 (m, 2H), 3,63 (s, 3H), 2,66 – 2,78 (m, 2H), 1,98 – 2,09 (m, 4H), 1,57 – 1,67 (m,

2H), 1,24 – 1,42 (m, 21H), 0,90 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm

165,8; 153,5; 151,1; 143,7; 130,0; 129,8; 128,8; 127,9; 126,5; 100,7; 55,6; 51,1; 31,9;

31,9; 31,9; 29,8; 29,7; 29,5; 29,4; 29,4; 29,3; 29,3; 29,3; 29,2; 28,3; 27,3; 27,2; 22,7;

14,1.


82

metil 4-(3-hidroxifenil)-6-pentadecil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 8a: Fórmula molecular: C27H42N2O3S; Massa molecular: 474,70 g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 81%; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,14 (t, J = 7,83 Hz, 1H),

6,76 – 6,79 (m, 1H), 6,75 – 6,76 (m, 1H), 6,69 – 6,72 (m, 1H), 5,28 (s, 1H), 3,66 (s, 3H),

2,69 – 2,84 (m, 2H), 1,56 – 1,69 (m, 2H), 1,31 (s, 24H), 0,92 (t, J = 7.10 Hz, 3H). RMN

13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 175,2; 166,1; 157,4; 148,9; 144,6; 129,3; 117,4; 114,5;

113,1; 101,3; 54,8; 50,3; 31,7; 30,3; 29,4; 29,4; 29,3; 29,3; 29,3; 29,1; 29,1; 28,2; 22,3;

13,0.


metil 6-heptadecil-4-(3-hidroxifenil)-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 8b: Fórmula molecular: C29H46N2O3S; Massa molecular: 502,75 g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 74%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,81 (br. s., 1H), 7,34 (br.

s., 1H), 7,19 (t, J = 7,95 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 7,58 Hz, 1H), 6,78 (s, 1H), 5.36 (d, J =

3,42 Hz, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,66 – 2,77 (m, 2H), 1,54 – 1,67 (m, 2H), 1,28 (s, 24H), 0,90

(t, J = 6,85 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 174,8; 165,6; 156,3; 147,4;

143,8; 130,2; 118,7; 115,6; 113,6; 102,2, 55,8; 51,5; 31,9; 31,6; 29,7; 29,6; 29,6; 29,5;

29,5; 29,3; 29,3; 28,2; 22,7; 14,1.

83


(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-hidroxifenil)-2-tioxo-1,2,3, 4-

tetrahidropirimidina-5-carboxilato 8c: Fórmula molecular: C29H44N2O3S; Massa

molecular: 500,74 g.mol-1; Óleo; Rendimento: 60%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm

8,43 (s, 1H), 7,90 (br. s., 1H), 7,25 – 7,36 (m, 5H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 5,34 – 5,39

(m, 2H), 3,64 (s, 3H), 2,76 – 2,85 (m, 1H), 2,62 – 2,74 (m, 1H), 1,96 – 2,11 (m, 4H),

1,56 – 1,67 (m, 2H), 1,22 – 1,44 (m, 20H), 0,90 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100

MHz, CDCl3) δ ppm 174,8; 165,6; 156,3; 147,4; 143,8; 130,2; 118,7; 115,6; 113,6;

102,2; 55,8; 51,5; 31,9; 31,6; 29,7; 29,6; 29,6; 29,5; 29,5; 29,3; 29,3; 28,2; 22,7; 14,1.

Dados espectroscópicos dos compostos DHPM-ácidos graxos-6C-

substituídas:


metil 2-oxo-6-pentadecil-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato 3a:

Fórmula molecular: C27H42N2O3; Massa molecular 442,63: g.mol-1; Sólido; P.F. 122-124

°C ; Rendimento: 83%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,20 – 8,41 (m, 1H), 7,22 –

7,36 (m, 5H), 6,07 – 6,24 (m, 1H), 5,40 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,72 (t, J =

7.70 Hz, 2H), 1,55 – 1,68 (m, 2H), 1,24 – 1,37 (m, 24H), 0,90 (t, J = 6 Hz, 3H). RMN 13C

(100 MHz, CDCl3) δ ppm 171,2; 165,9; 151,3; 143,8, 130,0; 128,8; 127,9; 126,5; 100,6;

84

60,4; 55,6; 51,1; 31,9; 31,9; 29,7; 29,7; 29,7; 29,6; 29,5; 29,4; 28,3; 22,7; 21,0; 14,2;

14,1.


metil 6-heptadecil-2-oxo-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato 3b:

Fórmula molecular: C29H46N2O3; Massa molecular 470,90: g.mol-1; Sólido; P.F. 129-131

°C; Rendimento: 74%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,00 (s, 1H), 7,23 – 7,29 (m,

5H), 5,92 (s, 1H), 5,37 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 3,60 (s, 3H), 2,66 – 2,74 (m, 2H), 1,56 – 1,63

(m, 2H), 1,25 – 1,36 (m, 30H), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ

ppm 165,7 153,5; 151,0 143,8; 128,7; 128;8; 126,4; 100,8; 55,7; 50,93; 31,82, 22,65;

29,66; 29,61; 29,52; 29,41; 29,32; 29,30; 28,20; 22,69; 13,99.


(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-2-oxo-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 3c: Fórmula molecular: C29H44N2O3; Massa molecular 468,67: g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 67%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,62 (br. s., 1H), 7,20 – 7,38

(m, 5H), 6,42 (br. s., 1H), 5,30 – 5,45 (m, 3H), 3,63 (s, 3H), 2,72 (t, J = 7,70 Hz, 2H),

1,92 – 2,13 (m, 4H), 1, 55 - 1.67 (m, 2H), 1.21 - 1.43 (m, 20H), 0.91 (t, J = 6.00 Hz, 3H).

85

RMN 13C (100 MHz, CDCl3) 165,9; 154,1; 151,4; 143,8; 130,0; 129,8; 128,7; 127,8;

126,5; 100,5; 55,4; 51,1; 31,9; 31,8; 29,8; 29,8; 29,6; 29,4; 29,4; 29,3; 29,3; 29,3; 28,3;

27,3; 27,2; 27,2; 25,7; 22,7; 14,1.


metil 4-(4-hidroxifenil)-2-oxo-6-pentadecil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 5a: Fórmula molecular: C27H42N2O4; Massa molecular: 458,63 g.mol-1;

Sólido; P.F. 131-134 °C ; Rendimento: 81%; Rendimento: 74%; Rendimento: 67%.

RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,56 - 7.85 (m, 1H), 6,99 (d, J = 8,31 Hz, 2H), 6,50 –

6,56 (m, J = 8,56 Hz, 2H), 6,43 (br. s., 1H), 5,29 (d, J = 2,69 Hz, 1H), 3,64 (s, 3H), 2,82

(d, J = 13,20 Hz, 1H), 2,62 (s, 1H), 1,54 – 1,65 (m, 2H), 1,23 – 1,42 (m, 24H), 0,.90 (t, J

= 6,80 Hz, 3H).


(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(4-hidrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-

5-carboxilato 3c: Fórmula molecular: C29H44N2O4; Massa molecular 484,67: g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 71%. RMN 1H (400 MHz, C2D6OS) δ ppm 9,09 (s, 1H), 7,60 (br. s.,

86

1H), 7,02 (d, J = 8,00 Hz, 2H), 6,68 (d, J = 8,00 Hz, 2H), 5,34 (t, J = 5,14 Hz, 2H), 5,04

(d, J = 3,18 Hz, 1H), 3,52 (s, 3H), 2,54 – 2,70 (m, 2H), 1,90 – 2,07 (m, 4H), 1,52 (br. s.,

2H), 1,25 (s, 12H), 1,28 (s, 8H), 0,85 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, C2D6OS)

δ ppm 166,0; 157,0; 152,9; 152,9; 135,7; 130,1; 127,8; 115,5; 99,5; 53,7; 51,1; 31,8;

31,0; 29,6; 29,5; 29,3; 29,2; 29,1; 29,0; 28,6; 27,1; 27,1; 22,6; 14,4.


metil 4-(3-nitrofenil)-2-oxo-6-pentadecil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato

6a: Fórmula molecular: C27H41N3O5; Massa molecular: 487,63 g.mol-1; Sólido; P.F. 125-

128 °C ; Rendimento: 67%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8,11 – 8,23 (m, 2H), 7,67 (d, J

= 7,82 Hz, 1H), 7,44 – 7,57 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 5,97 (br. s., 1H), 5,53 (d, J = 3,18 Hz,

1H), 3,66 (s, 3H), 2,76 (t, J = 6,85 Hz, 2H), 1,64 (br. s., 4H), 1,20 – 1,42 (m, 22H), 0,90

(t, J = 6,72 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 165,3, 152,6, 151,9, 148,5,

145,7, 132,6, 129,9, 123,0, 121,7, 100,0, 55,2, 51,4, 32,1, 31,9, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5,

29,4, 29,4, 29,3, 28,2, 22,7, 14,1.


metil 6-heptadecil-4-(3-nitrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato

6b: Fórmula molecular: C29H45N3O5; Massa molecular: 515,68 g.mol-1; P.F. 130-134 °C;

87

Rendimento: 61%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8,10 – 8,24 (m, 2H), 7,68 (d, J = 8,31 Hz,

1H), 7,45 – 7,59 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 5,96 (br. s., 1H), 5,53 (d, J = 3,18 Hz, 1H), 3,66

(s, 3H), 2,77 (t, J = 6,85 Hz, 2H), 1,64 (br. s., 4H), 1,19 – 1,36 (m, 24H), 0,90 (t, J = 6,80

Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 189,6; 165,3; 152,6; 151,8; 148,6; 145,7;

134,6; 132,6; 129,9; 128,6; 124,5; 123,0; 121,7; 100,0; 55,2; 51,4; 32,1; 31,9; 29,7;

29,7; 29,6; 29,5; 29,4; 29,4; 29,3; 28,2; 22,7; 14,1.


(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-nitrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 6c: Fórmula molecular: C29H43N3O5; Massa molecular: 513,67 g.mol-1;

Óleo; Rendimento: 60%; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8,12 – 8,27 (m, 2H), 7,74

(d, J = 7,83 Hz, 1H), 7,60 (t, J = 7,95 Hz, 1H), 5,48 (d, J = 2,90 Hz, 1H), 5,28 – 5,42 (m,

2H), 3,64 (s, 3H), 2,66 – 2,91 (m, 2H), 2,05 – 2,04 (m, 4H), 1,59 – 1,75 (m, 2H), 1,28 –

1,45 (m, 20H), 0,90 (t, J = 6,72 Hz, 3H).


metil 6-pentadecil-4-fenil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato 7a:

Fórmula molecular: C27H42N2O2S; Massa molecular 458,70: g.mol-1; Sólido; P.F. 107-

110 °C; Rendimento: 78%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,58 – 8,67 (m, 1H), 8,11

88

(br. s., 1H), 7,22 – 7,38 (m, 5H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,79 (s, 1H),

2.71 (s, 1H), 1,56 – 1,67 (m, 2H), 1,22 – 1,42 (m, 24H), 0,90 (t, J = 6,00 Hz, 3H). RMN

13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 174,5, 165,5, 148,0, 142,4, 128,9, 128,3, 126,7, 102,0,

55,8, 51,4, 31,9, 31,3, 29,8, 29,7, 29,7, 29,7, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 28,6, 28,4,

26,4, 25,3, 22,7, 14,1.


metil 6-heptadecil-4-fenil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5- carboxilato 7b:

Fórmula molecular: C29H46N2O2S; Massa molecular 486,75: g.mol-1; Sólido; P.F. 116-

118 °C; Rendimento:78%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,29 – 7,38 (m, 5H), 5,41

(d, J = 3,18 Hz, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,74 – 2,85 (m, 1H), 2,64 – 2,74 (m, 1H), 1,63 (s, 2H),

1,24 – 1,35 (m, 26H), 0,90 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm

175,0, 165,4, 147,2, 142,3, 129,0, 128,4, 126,7, 102,2, 56,2, 51,4, 31,9, 31,6, 29,8,

29,7, 29,7, 29.7, 29,6, 29,5, 29,5, 29,4, 29,3, 28,2, 22,7, 14.1.


metil 4-(4-hidroxefenil)-6-pentadecil-2-tioxo-1,2,3,4- tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 9a: Fórmula molecular: C27H42N2O3S; Massa molecular 474,70: g.mol-1;

89

Sólido; P.F. 122-124 °C; Rendimento: 77%; RMN 1H (400 MHz, C2D6OS) d 7,77 (d, J

= 8,56 Hz, 2H), 6,94 (d, J = 8,56 Hz, 2H), 5,08 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 3,54 (s, 3H), 2,69

(d, J = 7,34 Hz, 2H), 1,42 – 1,58 (m, 2H), 1,24 (br. s., 24H), 0,85 (t, J = 6,60 Hz, 3H).

RMN 13C (100 MHz, C2D6OS) δ ppm 191,3; 174,6; 165,8; 163,8; 157,4; 149,7; 134,4;

132,5; 128,9; 128,0; 116,3; 115,6; 100,8; 53,9; 51,4; 31,8; 30,3; 29,6; 29,5; 29,5; 29,5;

29,3; 29,2; 29,2; 28,8; 22,6; 14,4.


metil 4-(3-nitrofenil)-6-pentadecil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 10a: Fórmula molecular: C27H41N3O4S; Massa molecular 503,70: g.mol-1;

Sólido; P.F. 115-118 °C; Rendimento: 77%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,74 (d,

J = 1,47 Hz, 1H), 8,50 – 8,53 (m, 1H), 8,25 – 8,27 (m, 1H), 7,79 (t, J = 7,83 Hz, 1H),

5,54 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 3,63 – 3,74 (m, 3H), 2,65 – 2,90 (m, 2H), 1,64 (br. s., 2H),

1,21 – 1,34 (m, 22H), 0,90 (t, 6.72 Hz, 3H).

Figura 39. Composto 10 b

metil 6-heptadecil-4-(3-nitrofenil)-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-

carboxilato 10b: Fórmula molecular: C29H45N3O4S; Massa molecular: 531,75 g.mol-1;

90

Sólido; P.F. 126-129 °C;; Rendimento: 64%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,19 –

8,17 (m, 2H), 7,53 - 7,66 (m, 2H), 5,54 (d, J = 2,69 Hz, 1H), 3,59 – 3,76 (m, 2H), 2,66 –

2,81 (m, 1H), 2,55 (s, 1H), 1,58 – 1,69 (m, 2H), 1,28 (s, 28H), 0,90 (t, J = 6,72 Hz, 3H).


(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-nitrofenil)-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-

5- carboxilato 10c: Fórmula molecular: C29H43N3O4S; Massa molecular: 529,73 g.mol-

1; Óleo; Rendimento: 63%; RMN 1H (400 MHz, C2D6OS) δ ppm 9,78 (d, J = 2,20 Hz,

1H), 8,69 – 8,70 (m, 1H), 8,54 - (m, 1H), 8,35 - 8,33 (m, 1H), 8,17 – 8,14 (m, 1H), 5,23

– 5,39 (m, 3H), 3,57 (s, 3H), 2,64 – 2,83 (m, 2H), 1,88 – 2,05 (m, 4H), 1,53 (d, J = 6,85

Hz, 2H), 1,14 – 1,37 (m, 20H), 0,76 – 0,89 (t, J= 6,9 Hz, 3H).

6.3. Avaliação da atividade antitumoral:

Modelo experimental e cultura de células

Os experimentos foram realizados com uma linhagem celular de glioma derivada

de rato (C6) obtidas da ATCC (American Type Culture Collection). A linhagem foi

cultivada no meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), suplementado com

10% de soro fetal bovino (SFB) e os antibióticos penicilina e estreptomicina (1%) e

fungizona (1%). As células foram mantidas por no máximo 30 passagens em

incubadora com 5% de CO2 e temperatura de 37 ºC.

91

Tratamento e grupos experimentais

Para a escolha das concentrações a serem analisadas nos experimentos, as

DHPMs foram testadas em diferentes concentrações sendo escolhidas as

concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM. As concentrações foram escolhidas a partir dos

resultados de viabilidade celular, utilizando-se o marcador iodeto de propídeo para

avaliação. Os grupos experimentais do trabalho foram divididos em: 1) Controle veículo

(tratado com DMSO) 2) DHPMs (tratadas com as DHPMs nas concetrações indicadas).

Foram realizados experimentos em duplicatas totalizando n=4 poços.

Preparo das placas para os ensaios

Os ensaios de viabilidade e citotoxicidade foram realizados em placas de 96

poços. As células foram semeadas em meio DMEM suplementado com 10% de

solução de soro fetal bovino (SFB) em uma concentração de 5x103 células/poço..

Todos os tratamentos foram iniciados 24h após o preparo das placas e as análises dos

resultados foram acompanhadas em 48h.

Ensaio de viabilidade celular

O ensaio de viabilidade celular via MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolio bromídio) tem por objetivo estimar a viabilidade através do

metabolismo celular, particularmente o mitocondrial. O método consiste na absorção do

sal de MTT pelas células, sendo reduzido no interior da mitocôndria a um produto

chamado formazan (sendo acumulado dentro da célula na cadeia respiratória das

mitocôndrias). A reação de redução só ocorre em células metabolicamente intactas,

com isso, o número de células viáveis é proporcional à produção de formazan 84. Após

48h de tratamento com as DHPMs, para estimativa da viabilidade celular, foram

adicionados 50 µL da solução de MTT (solução estoque de 5 mg/ml). As células foram

incubadas por 2h a 37°C sendo após esse intervalo removido o meio dos poços,

adicionando-se sobre as células 150µL de DMSO. A quantificação foi realizada por

espectrofotometria em leitor ELISA a 490nm e os resultados foram expressos em

porcentagem.

92

Marcação com iodeto de propídeo (IP)

O método utilizando-se de marcação com iodeto de propídeo foi realizado com o

objetivo de avaliar a permeabilidade das membranas celulares e a exposição do DNA,

parâmetros que indicam morte celular principalmente por necrose das células 85,

sugerindo citotoxicidade. Após 48h de tratamento, as células foram incubadas durante

1h a 37°C com 1 µL da solução de IP (solução estoque de 1mM). No final da

incubação, a fluorescência foi excitada por um microscópio invertido (Olympus IX71,

Tokyo, Japão) e as imagens de fluorescência e campo claro foram capturadas por uma

câmera acoplada ao microscópio.

Contagem celular

No final de 48h de tratamento foi realizada a contagem de células possibilitando

a estimava do número de células viáveis por poço. Foram retiradas alíquotas de 100 µL

de cada poço para contagem em câmara de Neubauer, realizada no microscópio

estereoscópio.

Cálculo da concentração inibitória 50% (IC50)

Os dados foram plotados no software GraphPad Prism® Prism 5 for Windows

Version 5.03 para análise. A IC50 foi determinada a partir de uma regressão linear,

onde foi relacionado o percentual de inibição como uma função do logaritmo das

concentrações testadas, admitindo-se um intervalo de confiança de 99% (p < 0,01),

para a reta obtida.

Análises Estatísticas

Os dados estatísticos foram expressos como média ± desvio padrão e foram

submetidos a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida de pós-teste de Tukey-

Kramer para múltiplas comparações. Diferenças entre as médias foram avaliadas como

significativas quando p<0,05.

93

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ANEXO 1. Espectro dos compostos Monastrol-ácidos

graxos-6C-substituídos e DHPM-ácidos graxos-6C-

substituídas

Figura 1. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-

substituído 4a ............................................................................................................... 3

Figura 2. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-

substituído 4a ............................................................................................................... 4


substituído 4b ............................................................................................................... 5


substituído 4b ............................................................................................................... 6


substituído 4c ............................................................................................................... 7


substituído 4c ............................................................................................................... 8

Figura 7. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-

substituído 8a ............................................................................................................... 9

Figura 8. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-

substituído 8a ............................................................................................................. 10


substituído 8b ............................................................................................................. 11


substituído 8b ............................................................................................................. 12


substituído 8c ............................................................................................................. 13


substituído 8c ............................................................................................................. 14

Figura 13. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-

substituída 3a ............................................................................................................. 15

Figura 14. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-

substituída 3a ............................................................................................................. 16


substituída 3b ............................................................................................................. 17


substituída 3b ............................................................................................................. 18


substituída 3c ............................................................................................................. 19


substituída 3c ............................................................................................................. 20


substituída 5a ............................................................................................................. 21

Figura 20. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-

substituída 5c ............................................................................................................. 22

Figura 21. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-

substituída 5c ............................................................................................................. 23


substituída 6a ............................................................................................................. 24


substituída 6a ............................................................................................................. 25


substituída 6b ............................................................................................................. 26


substituída 6b ............................................................................................................. 27

Figura 26. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-

substituída 6c ............................................................................................................. 28


substituída 7a ............................................................................................................. 29


substituída 7a ............................................................................................................. 30


substituída 7b ............................................................................................................. 31


substituída 7b ............................................................................................................. 32


substituída 9a ............................................................................................................. 33

Figura 32. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-

substituída 9a ............................................................................................................. 34


substituída 10a ........................................................................................................... 35


substituída 10b ........................................................................................................... 36


substituída 10c ........................................................................................................... 37

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

24.3

1

1.9

0

1.9

1

2.9

1

0.9

5

1.9

7

1.0

3

0.9

5

0.8

47.9

3

7.1

17.0

97.0

76.8

06.7

66.7

46.7

26.7

0

5.2

7

3.6

2

2.7

02.6

92.6

82.6

72.6

22.6

0

1.5

7 1.5

5

1.5

2

1.3

3 1.3

21.3

01.2

71.2

50.9

10.8

90.8

8

Figura 1. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4a

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

166.0

1 156.7

8154.0

9150.7

9

144.9

4

129.8

9

117.9

8 115.3

0113.2

9

100.8

8

55.1

1

51.2

650.6

4

31.9

329.7

329.6

829.3

828.2

8

22.6

9

14.1

1

Figura 2. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4a

9 8 7 6 5 4 3 2 1

2.7

4

24.4

9

1.5

7

1.5

7

2.6

3

0.8

5

0.7

4

1.7

3

0.8

4

0.8

7

0.7

08.0

3

7.1

1 7.0

97.0

7 6.8

36.7

66.7

46.7

26.4

9 5.2

75.2

6

3.6

3

2.7

02.6

52.5

7

1.5

41.5

1 1.3

21.2

81.2

20.9

20.9

00.8

9

Figura 3. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4b

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

165.9

7

156.7

2154.4

1150.7

4

144.9

4

129.8

9

118.1

3115.4

0113.1

7

100.9

3

55.1

1

51.2

8

31.9

529.7

529.6

928.4

2

22.7

0

14.1

3

Figura 4. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4b

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

20.7

1

1.9

9

3.9

7

2.0

1

2.9

9

1.8

6

1.1

7

0.9

5

5.4

9

0.9

38.2

1

7.3

37.3

3 7.3

27.3

17.2

87.2

87.2

77.2

77.2

6 5.9

9

5.4

05.4

05.3

75.3

65.3

5

3.6

3

2.7

52.7

42.7

32.7

22.7

1

2.0

62.0

52.0

42.0

32.0

21.6

41.3

81.3

71.3

21.2

91.2

81.2

60.9

20.9

00.8

9

Figura 5. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4c

180 160 140 120 100 80 60 40 20

165.8

2

153.5

2151.0

9

143.7

4

130.0

0129.7

9128.7

8126.5

0

100.6

6 55.6

4

51.1

1

31.9

229.5

429.2

227.2

222.7

0

14.1

2

Figura 6. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4c

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

2

24.0

6

2.0

8

2.0

3

3.0

2

0.9

9

0.9

7

0.9

5

1.0

7

1.0

1

7.1

6 7.1

47.1

26.7

76.7

76.7

66.7

66.7

56.7

2

5.2

8

3.6

6

2.8

12.7

92.7

72.7

52.7

32.7

21.6

71.6

51.6

31.6

1

1.3

1

0.9

30.9

20.9

0

Figura 7. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8a

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

175.1

6

166.1

2

157.4

3

148.9

5

144.6

1

129.2

9

117.3

9114.5

5113.1

2

101.3

3

54.8

3

50.3

0

31.6

629.3

729.3

429.0

528.2

222.3

1

13.0

2

Figura 8. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8a

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.7

5

32.5

9

2.6

5

2.0

0

3.2

5

1.0

8

0.5

3

1.6

0

1.1

3

1.0

9

1.0

1

0.9

37.8

1

7.3

4

7.1

97.1

76.8

4 6.7

86.7

76.7

6

5.3

65.3

5

3.6

7

2.7

42.7

22.7

12.7

02.7

02.6

9

1.6

31.6

21.5

9

1.5

5

1.2

8

0.9

20.9

00.8

8

Figura 9. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8b

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

174.7

9

165.5

6

156.2

9

147.3

8143.8

1 130.2

0

118.6

9115.6

2113.6

3

102.2

1

77.2

0

55.8

0 51.4

9

31.9

129.7

029.6

529.3

428.1

5 22.6

7 14.0

6

Figura 10. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8b

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

20.1

0

1.9

8

3.8

7

0.9

6

1.0

5

2.9

3

1.7

4

1.0

6

5.0

4

0.9

3

0.9

28.4

3

7.9

0

7.3

37.3

27.3

1 7.2

97.2

87.2

87.2

77.2

6

5.4

05.3

95.3

75.3

75.3

65.3

5

3.6

4

2.8

22.8

12.7

92.7

7

2.7

02.6

82.0

62.0

42.0

21.6

31.3

61.3

41.3

21.2

9

0.9

20.9

00.8

8

Figura 11. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8c

180 160 140 120 100 80 60 40 20

174.5

7

165.4

6

147.7

6

142.3

7

130.0

8130.0

0

128.9

2126.6

9

102.1

1

55.9

2

51.4

0

31.9

229.7

929.5

429.3

527.2

5

22.7

0

14.1

3

Figura 12. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8c

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

25.0

9

2.0

0

1.9

4

2.9

8

0.9

8

0.9

0

5.1

9

0.9

6

8.3

78.3

28.3

18.1

0

7.3

27.3

27.3

17.2

97.2

87.2

7

6.1

96.1

76.1

16.0

35.9

8

5.4

05.4

0

3.6

3

2.7

4 2.7

22.7

0

1.6

41.6

2 1.3

31.3

01.2

81.2

71.2

60.9

20.9

00.8

9

Figura 13. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3a

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

171.1

8 165.8

6

151.2

8 143.7

8

130.0

0128.7

6126.5

0

100.5

9

60.4

1

55.5

6

51.1

0

31.9

429.7

329.3

828.3

0

22.7

021.0

4

14.2

014.1

3

Figura 14. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3a

Figura 15. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3b

Figura 16. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3b

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

3.0

0

20.3

7

1.9

8

4.0

6

2.0

4

2.9

4

3.0

1

0.9

4

5.0

7

0.9

58.6

2

7.3

27.3

17.2

97.2

87.2

77.2

6

6.4

2

5.3

9 5.3

95.3

75.3

65.3

5

3.6

3

2.7

32.7

22.7

0

2.0

62.0

5 2.0

32.0

21.6

41.6

2

1.5

81.3

71.3

31.3

0

0.9

30.9

10.8

9

0.0

3

Figura 17. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3c

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

165.8

8

154.0

8151.4

3

143.8

2

130.2

4130.1

2129.9

7129.8

2128.7

3126.4

7

100.5

2

55.4

3

51.0

7

31.9

329.8

129.5

6 29.3

627.2

625.6

622.7

0

14.1

414.0

9

Figura 18. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3c

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

23.8

8

1.8

4

0.9

2

0.9

1

2.8

0

0.9

3

0.9

3

1.9

1

1.9

0

0.7

3

7.7

77.7

37.6

8

7.0

06.9

8

6.5

46.5

26.4

36.3

7

5.2

95.2

9

3.6

4

2.8

42.8

1

2.6

2

1.6

31.6

1 1.3

21.2

8

0.9

20.9

00.8

9


9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

19.5

7

1.8

4

3.7

1

1.7

9

2.6

6

0.8

8

1.9

2

1.9

1

1.9

1

0.8

8

0.8

69.0

9

7.6

0

7.0

3 7.0

1

6.7

06.6

96.6

76.6

6

5.3

55.3

45.3

25.0

55.0

4

3.5

2

2.6

5 2.6

42.6

32.6

22.6

1

2.0

01.9

91.9

7

1.5

21.2

81.2

5

0.8

70.8

60.8

4

Figura 20. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 5c

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

166.0

4

157.0

4152.9

5 152.8

8 135.7

5 130.1

0127.7

6

115.4

8

99.4

8

53.7

251.1

3

31.7

629.5

829.1

627.0

6

22.5

7

14.4

0

Figura 21. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 5c

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

23.2

1

4.1

8

1.7

5

2.6

4

0.8

8

0.7

9

0.9

4

1.7

2

0.8

8

1.6

78.1

9

7.6

67.5

4 7.5

27.5

07.2

8

5.9

7

5.5

35.5

3

3.6

6

2.7

82.7

62.7

5

1.6

4

1.3

21.2

8

0.9

20.9

00.8

8

0.0

2


180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

165.3

3

152.6

5151.8

5148.5

4145.6

6

132.6

2129.8

9

123.0

2121.7

1

99.9

6

77.2

1 55.1

7

51.3

7

32.0

7 31.9

229.7

0

29.3

528.1

9

22.6

8

14.0

9


9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

25.3

7

4.0

4

1.5

7

2.5

1

0.8

1

0.7

7

1.0

4

1.6

3

0.8

2

1.6

2

8.1

98.1

78.1

5

7.6

67.5

57.5

37.2

8

5.9

6

5.5

45.5

3

3.6

6

2.7

82.7

72.7

5 1.6

4

1.3

21.2

8

0.9

20.9

00.8

9

0.0

2


180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

189.6

5

165.3

3

152.6

3151.8

4148.5

5145.6

6

134.5

5132.6

1129.8

9128.5

8124.5

2123.0

3121.7

1

99.9

6

55.1

8

51.3

7

32.0

831.9

329.7

029.3

528.1

9

22.6

8

14.0

9


9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

25.5

3

2.4

8

4.8

3

2.3

8

3.5

7

2.0

1

0.9

8

1.0

4

1.0

7

1.7

38.2

08.1

77.7

57.7

3 7.6

07.5

8

5.4

85.3

55.3

4

3.7

13.6

42.8

62.8

52.8

4 2.8

32.8

12.7

62.7

42.7

32.0

52.0

41.6

8 1.6

61.6

41.3

51.3

0

0.9

20.9

00.8

9

Figura 26. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 6c

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

24.1

9

2.0

3

1.7

8

2.7

7

0.8

9

4.6

7

0.8

7

0.8

8

8.6

48.6

38.6

3

8.1

1

7.3

37.3

17.3

07.2

97.2

7 7.2

77.2

6

5.4

05.3

9

3.6

3

2.7

92.7

1

1.6

31.6

1

1.3

4 1.3

21.2

8

0.9

10.9

00.8

8


180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

174.4

8

165.5

0

147.9

6

142.4

0

128.8

9 126.7

1

102.0

4

83.0

7 55.8

2

51.3

7

33.4

531.9

4

29.3

828.4

126.3

9

22.7

0

14.1

4


9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

27.1

4

2.0

0

1.7

4

2.7

3

0.8

2

5.9

1

0.7

37.3

67.3

47.3

1 7.3

17.2

97.2

8

5.4

25.4

1

3.6

6

2.8

22.7

62.7

02.6

5

1.6

31.3

41.3

31.2

8

0.9

20.9

00.8

9

0.0

2


180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

174.9

7

165.4

0

147.2

5

142.3

3

129.0

0 126.6

7

102.2

4

56.2

1

51.4

3

31.9

429.7

329.3

829.3

3

22.7

0

14.1

3

0.0

1

Figura 30. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 7b

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

24.2

9

1.9

7

1.7

9

2.8

9

0.9

0

1.7

2

1.6

47.7

87.7

5

6.9

56.9

3

5.0

85.0

7

3.5

4

2.7

02.6

8

1.5

2

1.2

4

0.8

70.8

50.8

4

Figura 31. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 9a

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

191.3

3

174.6

4

165.8

4163.8

0

157.4

1

149.7

1

134.4

1132.5

4128.9

2 128.0

0

116.3

0115.6

5

100.8

4

53.8

551.4

2

31.8

029.5

629.5

228.7

6

22.5

9

14.4

0

Figura 32. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 9a

9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

22.5

8

2.1

6

1.7

8

2.7

9

0.8

8

0.8

4

0.7

8

0.6

7

0.6

6

8.7

58.7

48.5

38.5

28.5

18.5

18.2

78.2

78.2

58.2

57.8

17.7

97.7

7

5.5

55.5

4

3.6

93.6

8

2.8

02.7

82.7

5

1.6

4

1.3

91.3

01.2

81.2

5

0.9

00.8

90.8

80.8

8

0.0

2


9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

1

28.1

7

2.6

7

0.5

2

1.3

3

1.9

7

0.5

6

0.3

9

1.7

6

0.4

9

1.1

68.1

9 8.1

7

7.9

6

7.6

47.5

77.5

5 7.2

9

5.5

45.5

4

3.6

93.6

7

2.8

42.8

32.7

82.7

42.6

92.5

5

1.6

51.6

3

1.2

8

0.9

20.9

00.8

8

0.0

2


9 8 7 6 5 4 3 2 1

3.0

0

19.7

2

1.9

2

3.7

7

1.9

4

2.8

2

2.8

8

0.9

9

0.5

90.5

8

0.5

7

0.8

79.7

89.7

8

8.7

08.7

08.6

98.5

28.5

28.3

58.3

38.1

68.1

58.1

4

5.5

55.3

45.3

35.3

15.3

0

3.5

7

2.7

6 2.7

42.7

22.7

0

1.9

91.9

81.9

71.5

41.5

21.2

8

1.2

21.1

90.8

5

0.8

30.8

1

Figura 35. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 10c

ANEXO 2. Teste de marcação com iodeto de propídeo

na linhagem celular de glioma de rato (C6)

Figura 1. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato

(C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das

DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os

composto 24 (esquerda) e 2 (direita). Fotos em campo claro à esquerda e

fluorescência à direita. .................................................................................................. 2




composto 4a (esquerda) e 8a (direita). Fotos em campo claro à esquerda e





composto 4b (esquerda) e 8b (direita). Fotos em campo claro à esquerda e





composto 4c (esquerda) e 8c (direita). Fotos em campo claro à esquerda e


Controle positivo graxo - Hibrido oxo-monastrol-C16:0-5-substituído 24

Concentração Controle positivo – monastrol 2 Concentração

C

C

5 µM 5 µM

10 µM 10 µM

25 µM 25 µM

50 µM 50 µM

Figura 1. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os

compostos 24 (esquerda) e 2 (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.

Híbrido monastrol-C16:0-6-substituído 4a

Concentração Híbrido monastrol-C16:0-6-substituído

8a Concentração

C

C

5 µM 5 µM

10 µM 10 µM

25 µM 25 µM

50 µM 50 µM


compostos 4a (esquerda) e 8a (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.

Híbrido monastrol-C18:0-6-substituído 4b


8b Concentração

C

C

5 µM 5 µM

10 µM 10 µM

25 µM 25 µM

50 µM 50 µM


compostos 4b (esquerda) e 8b (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.

Híbrido monastrol-C18:1-6-substituído 4c


8c Concentração

C

C

5 µM 5 µM

10 µM 10 µM

25 µM 25 µM

50 µM 50 µM


compostos 4c (esquerda) e 8c (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.

sÍntese de novos hÍbridos monastrol-Ácidos graxos 6 …

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