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Espécie ID gene recA ID MALDI-TOF
n/%
Não identificadas
n/%
B. cenocepacia 49 20 / 24% 11 / 21,7%
B. multivorans 12 3 / 3,6% 5 / 6%
B. vietnamiensis 10 3 / 3,6% 1 / 1,2%
B. lata 6 0 1 / 1,2%
B. pyrrocinia 3 0 0
B. ambifaria 1 0 1 / 1,2%
B. contaminans 1 0 0
B. stabilis 1 0 0
MH07 - 032
Análise comparativa entre o sequenciamento do gene recA
e a técnica de MALDI-TOF na identificação de espécies do
complexo Burkholderia cepacia
LORENA C.C. FEHLBERG1; RODRIGO CAYÔ1; DIEGO M. ASSIS2; ROSANA H. V. PEREIRA3; LUIS J. NETO3; ANA C. GALES1; ELIZABETH A. MARQUES3
1. Laboratório Alerta, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo/SP
2. Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo/SP
3. Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), Rio de Janeiro/RJ
RESUMO MODIFICADO
Introdução: A identificação rápida e confiável de bactérias isoladas de amostras clínicas é de extrema importância para guiar a terapia antimicrobiana. A espectrometria de massa por MALDI-TOF (matrix assisted lazer desorption/ionization - time of flight) (MT) permite a análise
de macromoléculas biológicas, as quais podem ser um importante marcador na classificação e identificação de microorganismos. Objetivo: Comparar o sequenciamento do gene recA e a técnica de MT na identificação de isolados clínicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram analisadas 83 amostras pertencentes ao CBc (49 B. cenocepacia; 10 B. vietnamiensis; 12 B. multivorans; 6 B. lata; 3 B. pyrrocinia; 1 B. contaminans; 1 B. stabilis; 1 B. ambifaria), previamente identificadas pelo sequenciamento do gene recA,
considerado método padrão-ouro para a identificação do CBc. Posteriormente, foi realizada a identificação pela técnica de MT. A extração de proteínas totais foi realizada em duas etapas. A 1ª etapa consistiu na lavagem da colônia isolada com água:etanol (3:1) seguida de
centrifugação (2 min/13.000 rpm). A 2ª etapa consistiu na ressuspensão do sedimento em 50 uL de ácido fórmico 70% e 50 uL de acetonitrila, seguida de centrifugação (2 min/13.000 rpm). Em uma placa de aço inox de 96 poços, foi inoculado 1 µL do sobrenadante de cada
amostra, em triplicata, seguido de 1 µL da matriz ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/ml). As amostras foram analisadas em espectrômetro de massa Microflex LT (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) utilizando o programa MALDI-Biotyper 2.0. Como controle da
extração e da identificação foi utilizada a cepa B. cepacia ATCC 25608. Resultados: O MT não conseguiu identificar 23% (n=19) das amostras e em 45,7% (n=38) dos casos somente foi possível a identificação do gênero Burkholderia. Em 27/38 amostras (70,9%), o sistema MT
reportou de 2 a 3 espécies de Burkholderia em uma mesma amostra, sendo que em 10/27 (37%) isolados nenhuma identificação da espécie foi concordante com a identificação genotípica. A concordância entre as duas técnicas utilizadas para a identificação da espécie foi
observada em 45,7% dos isolados. O tempo médio gasto para a análise de uma placa de MT foi de 2 horas e 30 minutos. Conclusão: O sistema MT não apresentou boa concordância na identificação das espécies do CBc e, além disso, o tempo gasto na identificação foi
superior ao reportado na literatura.
INTRODUÇÃO
O complexo Burkholderia cepacia (CBc) constitui um grupo de microrganismos Gram-negativos não fermentadores da
glicose amplamente encontrados no meio ambiente. Embora a maioria das espécies deste gênero tenha sido descrita
inicialmente como fitopatógenos, estes microrganismos têm sido identificados com uma frequência cada vez maior
como patógenos oportunistas em unidades hospitalares. A principal patologia associada às infecções causadas por
espécies do CBc é a “síndrome cepacia”, um quadro séptico muito frequente em pacientes com fibrose cística,
caracterizado por um declínio da função pulmonar, com posterior bacteremia e, em muitos casos, o óbito [1].
Atualmente, o CBc é formado por 17 espécies, as quais apresentam aproximadamente 95% de similaridade genética,
de acordo com estudos realizados com o sequenciamento do gene recA. As espécies que fazem parte do CBc são: B. ambifaria, B. anthina, B. arboris, B. cenocepacia, B. cepacia, B. contaminans, B. diffusa, B. dolosa, B. lata, B. latens, B. metallica, B. multivorans, B. pyrrocinia, B. seminalis, B. stabilis, B. ubonensis e B. vietnamiensis [1].
As espécies que constituem o CBc, bem como outras espécies da família Burkholderiaceae, apresentam crescimento
lento em meios de cultura e, muitas vezes, o seu isolamento a partir de amostras clínicas é dificultado pelo crescimento
mais rápido de outros microrganismos que podem estar presentes na amostra. Além disso, a identificação laboratorial a
partir de provas bioquímicas manuais ou com sistemas disponíveis comercialmente geralmente é difícil e conflitante,
pois algumas espécies bacterianas não estão presentes no banco de dados destes sistemas. Por outro lado, as técnicas
moleculares, apesar da sua alta acurácia, não são amplamente acessíveis aos laboratórios de microbiologia clínica [2].
A identificação rápida e confiável de agentes infecciosos a partir de amostras clínicas constitui um fator de extrema
importância para introdução da terapia antimicrobiana adequada. Atualmente, a espectrometria de massa por MALDI-
TOF (Matrix Assisted Laser Dessorption Ionization/Time-of-Flight) tem sido cada vez mais utilizada para a identificação
de microrganismos, podendo ser aplicada para a identificação de bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, leveduras
e fungos filamentosos. É considerado um método rápido, prático, barato, sendo baseado nos espectros de massa
espécie-específicos, os quais contem predominantemente proteínas conservadas do DNA ribossomal [3]. Os espectros
de massa gerados de acordo com o perfil protéico da amostra são comparados com uma série de espectros
depositados no banco de dados do software Biotyper MALDI 2.0 para, então, determinar a espécie bacteriana.
O objetivo deste trabalho foi comparar a acurácia da espectrometria de massa MALDI-TOF com o sequenciamento do
gene recA na identificação de espécies pertencentes ao CBc.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisadas 83 amostras clínicas pertencentes ao CBc (Figura 1), previamente identificadas pelo
sequenciamento do gene recA, considerado o método padrão-ouro para a identificação destas espécies. Estes isolados
foram coletados de diferentes sítios corpóreos de pacientes atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto,
Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
As amostras foram semeadas em ágar Burkholderia cepacia, suplementado com polimixina 75.000 IU, gentamicina
2,5 mg e ticarcilina 50 mg (Oxoid; Basingstoke; Inglaterra). Após o isolamento bacteriano, foi realizada a extração das
proteínas de acordo com o esquema apresentado na Figura 2. Cada amostra foi inoculada em triplicata em uma placa
de aço inox e, posteriormente, esta placa foi introduzida no espectrômetro de massas Microflex LT MALDI-TOF (Bruker
Daltonics, Alemanha). Os resultados foram analisados no software MALDI Biotyper versão 2.0 (Bruker Daltonics,
Alemanha). Conforme especificado pelo fabricante, os critérios para a identificação bacteriana são: scores ≥ 2 e entre
1.7 e 1.9 foram considerados como identificação confiável para a espécie e para o gênero bacteriano, respectivamente,
enquanto scores de identificação abaixo de 1.7 foram considerados como não confiáveis, não sendo possível realizar a
identificação bacteriana. Como controle da extração e da leitura das proteínas, foi utilizada a cepa Burkholderia cepacia ATCC 25608.
1
49
1
6
12
3
1
10
B. ambifaria
B. cenocepacia
B. contaminans
B. lata
B. multivorans
B. pyrrocinia
B. stabilis
B. vietnamiensis
Figura 1. Distribuição das espécies bacterianas do complexo Burkholderia cepacia analisadas neste estudo. RESULTADOS
Figura 2. Demonstração da técnica de extração das proteínas e princípio da identificação dos microrganismos pela espectrometria de massa
MALDI-TOF.
Tabela 1. Identificação das espécies bacterianas do complexo Burkholderia cepacia pela espectrometria de
massa MALDI-TOF em comparação com o sequencimento do gene recA.
A concordância entre as duas técnicas utilizadas para identificação do gênero Burkholderia foi observada em 64 (77%)
amostras. Entretanto, não foi possível realizar a identificação bacteriana pelo MALDI-TOF em 19 (23%) isolados
estudados (Figura 3).
Em 38 isolados (45,7%) somente foi possível realizar a identificação correta do gênero Burkholderia, sendo as espécies
discordantes com as identificadas pelo sequenciamento do gene recA. Em 27 das 38 amostras (70,9%) o MALDI-TOF
reportou de duas a três espécies diferentes de Burkholderia para uma mesma amostra, sendo que em 37% (10/27) dos
isolados nenhuma identificação da espécie foi concordante com a identificação genotípica.
Os espectros de massa gerados a partir das espécies sabidamente identificadas pelo gene recA demonstram que a
dificuldade na diferenciação interespécies pode ser ocasionada pela alta semelhança entre os picos de massa para as
diferentes espécies estudadas, conforme demonstrado na Figura 4.
Identificado
Não identificado
23%(n=19)
77%
(n=64)
A 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Gênero Gênero+espécie
45,7
31,3
CONCLUSÃO
A identificação das espécies dentro do CBc pelo MALDI-TOF foi abaixo do reportado na literatura [4];
O tempo de leitura de uma placa contendo 96 poços foi de, aproximadamente, 2 horas e 30 minutos, tempo superior
ao reportado na literatura [5];
A dificuldade na diferenciação das espécies do CBc pode ser ocasionada pela semelhança entre os espectros de
massa destas espécies;
Apesar de inúmeras tentativas diferentes de extração das proteínas e inúmeras repetições, não foi possível realizar a
identificação bacteriana em 23% dos isolados de CBc estudados.
B
Figura 3. Distribuição dos resultados obtidos a partir do MALDI-TOF para a identificação bacteriana do complexo Burkholderia cepacia. A. Porcentagem de amostras identificadas e não identificadas pelo MALDI-TOF. B. Porcentagem de amostras as quais o
MALDI-TOF foi capaz de identificar somente o gênero e o gênero e a espécie.
26
05
.05
9
65
05
.75
6
44
11
.87
3
71
69
.35
2
48
04
.35
8
35
89
.25
9
76
96
.41
3
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58
.08
3
96
09
.92
4
82
65
.17
4
51
92
.98
1
* Burkholderia ambifaria_alerta\0_E7\1\1SLin
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
Inte
ns. [a
.u.]
51
96
.50
9
73
84
.30
4
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.97
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44
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.90
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03
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.87
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95
.13
2
96
00
.40
8
* Burkholderia ATCC_alerta\0_F7\1\1SLin
0
1000
2000
3000
Inte
ns. [a
.u.]
73
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.15
9
51
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.67
7
64
90
.48
1
44
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.59
3
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.30
1
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* Burkholderia cenocepacia_alerta\0_E4\1\1SLin
0
1000
2000
3000
Inte
ns. [a
.u.]
51
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.81
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91
.30
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08
.54
3
* Burkholderia lata_alerta\0_F1\1\1SLin
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns. [a
.u.]
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000m/z
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.78
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.23
2
* Burkholderia pyrrocinia_alerta\0_E1\1\1SLin
0.0
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0.8
4x10
Inte
ns. [a
.u.]
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00
.23
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.97
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.97
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.88
2
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0
* Burkholderia stabilis_alerta\0_F10\1\1SLin
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2000
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Inte
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.u.]
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.22
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* Burkholderia vietnamiensis_alerta\0_E10\1\1SLin
0.0
0.2
0.4
0.6
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4x10
Inte
ns. [a
.u.]
51
97
.08
6
48
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.33
2
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.86
6
26
05
.69
9
44
12
.29
3
35
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.99
7
96
08
.57
6
73
11
.34
6
* Burkholderia multivorans_alerta\0_F4\1\1SLin
0
2000
4000
6000
Inte
ns. [a
.u.]
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000m/z
Figura 4. Espectros de massa gerados a partir do software MALDI Biotyper 2.0 para as amostras do complexo Burkholderia cepacia estudadas.
Referências
1. Sousa SA, CG Ramos, JH Leitão. 2011. Inter J Microbiol. ID607575. [Epub ahead of print].
2. Shelly DB, T Spilker, EJ Gracely, T Coenye, P Vandamme, JJ LiPuma. 2000. J Clin Microbiol. 38: 3112-3115.
3. JO Lay, Jr. 2001. Mass Spectrometry Rev. 20: 172-194.
4. Degand N, E Carbonnelle, B Dauphin, JL Beretti, M Le Bourgeois, I Sermet-Gaudelus, C Segonds, P Berche, X Nassif, A Ferroni. 2008. J Clin Microbiol. 46: 3361-3367.
5. Mellmann A, J Cloud, T Maier, U Keckevoet, I Ramminger, P Iwen, J Dunn, G Hall, D Wilson, P LaSala, M Kostrzewa, D Harmsen. 2008 J Clin Microbiol. 46:1946-1954.
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