sistemática molecular de thaptomys thomas, 1916 (rodentia...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Sistemática Molecular de Thaptomys Thomas, 1916
(Rodentia, Cricetidae)
Juçara Albina da Silva Gomes
Vitória, ES
Fevereiro, 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Sistemática Molecular de Thaptomys Thomas, 1916
(Rodentia, Cricetidae)
Juçara Albina da Silva Gomes
Orientador(a): Valéria Fagundes
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas (Biologia Animal) da Universidade
Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Biologia Animal.
Vitória, ES
Fevereiro, 2008
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Gomes, Juçara Albina da Silva, 1982- G633s
Sistemática molecular de Thaptomys Thomas, 1916 (Rodentia, Cricetidae) / Juçara Albina da Silva Gomes. – 2008.
45 f. : il. Orientadora: Valéria Fagundes. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal) – Universidade
Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Humanas e Naturais.
1. Diversidade biológica. 2. Citocromo b. 3. Thaptomys. I.
Fagundes, Valéria. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências Humanas e Naturais. III. Título.
CDU: 57
AGRADECIMENTOS
Diversas pessoas colaboraram direta ou indiretamente para este trabalho, com
sugestões, idéias, críticas e opiniões. Outros contribuíram com amizade, carinho e afeto,
provavelmente os ingredientes mais importantes para um bom trabalho. Temendo esquecer
alguém, agradeço a todos que conviveram comigo, torceram por mim e/ou me ajudaram de
alguma forma nesses últimos dois anos, em especial algumas pessoas que gostaria de
destacar:
À minha orientadora, Profª Drª Valéria Fagundes, a quem admiro e respeito
e com quem aprendi muito nos últimos três anos. Val, obrigada por todo o
apoio, dedicação e paciência.
Ao Dr. Ulyses F. J. Pardinãs pela doação dos tecidos da Argentina e pela
atenção demonstrada em muitos e-mails trocados.
Ao Dr. Guillermo D’Élia pela doação de uma das seqüências de Thaptomys
da Argentina.
Aos Profs. Drs. Leonora Costa e Yuri Leite pela concessão de alguns
tecidos de Thaptomys de Minas Gerais.
À Profª Drª Lena Geise pela concessão de tecidos do Rio de Janeiro.
À Profª Drª Renata Pardini pela concessão de tecidos de São Paulo e Bahia.
À Raquel Teixeira Moura pela doação de tecidos da Bahia.
Ao Prof. Dr. João Alves Oliveira pela concessão de tecidos do Paraná.
A Conservation International, pela bolsa concedida no programa CEPF
(Critical Ecosystem Partnership Fund).
Ao CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico), pela bolsa concedida através do Programa de Taxonomia.
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Espírito Santo (FAPES) pelo
financiamento de projeto de pesquisa (Processo 31.179.103/2005)
Ao Fundo de Apoio à Ciência e Tecnologia do Município de Vitória
(FACITEC) pelo financiamento de projeto de pesquisa (Processo
4.355.161/06)
À Profª Drª Patrícia Fernandes (UFES) e ao Núcleo de Genética Humana e
Molecular (NGHM) pela disponibilização do espaço físico e equipamentos
em muitos momentos da execução deste trabalho.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal
(PPGBAN) com quem aprendi muito nesses dois anos de mestrado.
Ao nosso estimado Secretário do PPGBAN Bruno Reggio, pelos muitos
favores prestados. Bruno, o que seria de nós, pobres alunos do mestrado,
sem você.
À minha família, irmãos, sobrinhos e cunhadas (e cunhado também) por
sempre confiar e acreditar em mim, especialmente meu pai, Seu Fernando,
minha mãe, Dona Maria e meu irmão mais novo, Johnathan, pelo apoio,
incentivo e dedicação durante todos estes anos e principalmente pela
paciência em agüentar muitas das minhas crises. Família, muito obrigada
por sempre acreditar na minha capacidade de atingir meus objetivos. Amo
muito vocês.
Aos amigos do Laboratório de Genética Animal: Arturo Martinelli, Clara
Scarpati, Cristie Setúbal, Ernesto Pozzatto, Leonardo Baião, Lorena Dinelli,
Ludmilla Coutinho, Lucas Vianna, Roberta Paresque, Sara Posses, Victor
Colombi; e em especial às amigas Marianna Machado e Núbia Thomazini
pelos muitos momentos vividos juntas durante os últimos três anos. Galera,
obrigada pela torcida e principalmente, pela compreensão nos meus
momentos de desespero.
À turma de mestrado 2006, principalmente aos amigos Geovanni Loiola,
Silvia Lopes e Vilácio Caldara Júnior. Amigos, mais uma conquista que
obtivemos juntos. Torço muito por vocês, sempre.
Às minhas amigas Carla Zandonadi, Núbia Thomazini e Silvia Lopes por
toda amizade, companheirismo e paciência, principalmente nos momentos
mais delicados da execução deste trabalho. Meninas, obrigada por tudo. A
amizade de vocês foi, é e sempre será muito importante na minha vida.
Aos amigos da graduação, turma 2001/1, que mesmo distantes estiveram
presentes nestes últimos anos. Muitas saudades de todos vocês.
SUMÁRIO
Lista de tabelas................................................................................................................... 07
Lista de figuras................................................................................................................... 08
Resumo .............................................................................................................................. 09
Abstract .............................................................................................................................. 11
Introdução .......................................................................................................................... 12
Material e Métodos ........................................................................................................... 14
Amostras, extrações e sequenciamento ........................................................................ 14
Análise das Sequências ................................................................................................. 18
Análises Intrapopulacionais ......................................................................................... 18
Análises Interpopulacionais ......................................................................................... 18
Relações filogenéticas intraespecíficas ........................................................................ 19
Resultados........................................................................................................................... 20
Caracterização genética das populações ...................................................................... 20
Análises demográficas das populações ......................................................................... 24
Análises interpopulacionais .......................................................................................... 26
Relações filogenéticas .................................................................................................... 27
Testando os cenários hipotéticos .................................................................................. 28
Discussão............................................................................................................................. 33
Composição Sistemática de Thaptomys ....................................................................... 35
Referências ........................................................................................................................ 39
Apêndice ............................................................................................................................ 44
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Procedência, número de indivíduos (n) e número diplóide (2n) de
Thaptomys.........................................................................................................................
16
Tabela 2. Posição dos 71 sítios polimórficos em cada haplótipo (H) determinado por
833 pb do gene mitocondrial citocromo b em
Thaptomys..................................................................................................................................................
21
Tabela 3. Freqüências relativas (em porcentagem) de cada haplótipo do gene
mitocondrial citb de Thaptomys por localidade. No quadrado sombreado estão
localidades distantes entre si a menos de 200 km. Abreviações para as localidades
estão na Tabela 1...............................................................................................................
22
Tabela 4. Número de haplótipos (nH), número de sítios polimórficos por população
(nSP), diversidade haplotípica (h), diversidade nucleotídica (dn), testes de distribuição
de freqüências pareadas (SSD e τ) e valores dos testes D de Tajima e Fs de Fu de
Thaptomys. Abreviações para as localidades estão na Tabela 1.......................................
23
Tabela 5. Valores par-a-par de Φst entre as populações (abaixo) e distância geográfica
em quilômetros entre as populações (acima)....................................................................
26
Tabela 6. Número de migrantes por geração (Nm) para cada par de populações............ 27
Tabela 7. Análise da variação genética (AMOVA) entre grupos, testando os diferentes
cenários da organização taxonômica em Thaptomys........................................................
32
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cenários hipotéticos da organização taxonômica. a) Thaptomys é um gêneno
monotípico, segundo Musser & Carleton (2005); b) Thaptomys é subdividido em dois
táxons, segundo Cabrera (1961); c) Thaptomys é dividido em dois táxons com
cariótipos distintos, segundo Ventura et al. (2004); d) Thaptomys é dividido em dois
táxons, com uma forma variante, segundo Moreira (2007)...............................................
15
Figura 2. Localidades de Thaptomys no Brasil e Argentina (AR). UNA=Una, BA;
EBSL=Estação Biológica de Santa Lúcia, Santa Teresa, ES; PEPA=Parque Estadual da
Pedra Azul, Domingos Martins, ES; PNC=Parque Nacional do Caparaó, Dores do Rio
Preto, ES; FER=Fervedouro, MG; OPR=Ouro Preto, MG; PNI=Parque Nacional de
Itatiaia, RJ; PSQ=Santa Rita do Passa-Quatro, MG; DMR=Delfim Moreira, MG;
SJBV=São João da Boa Vista, SP; RMG=Reserva de Morro Grande, Ibiúna, SP;
EBB=Estação Biológica de Boracéia, Salesópolis, SP; IGU=Iguape, SP;
PIR=Piraquara, PR; MAQ=Maquiné, RS; MIS=Arroio Cuña Pirú, Misiones,
Argentina............................................................................................................................
17
Figura 3. Distribuição das diferenças nucleotídicas par-a-par entre os indivíduos de
cada população (distribuição mismatch) de Thaptomys. As colunas indicam as
freqüências observadas, enquanto as linhas indicam a freqüência esperada baseada no
modelo de expansão populacional. Os valores do eixo X indicam o número de
diferenças entre os haplótipos e o eixo Y a freqüência dos haplótipos.............................
25
Figura 4. Rede de haplótipos representando as relações filogenéticas entre os
haplótipos do gene citb. O tamanho dos círculos é proporcional à freqüência de cada
haplótipo na amostra total. Os haplótipos estão designados na Tabela 3..........................
29
Figura 5. Árvores filogenéticas: a) Método de Parcimônia; b) Método de Máxima
Verossimilhança utilizando o modelo TrN + G + I. Valores de bootstrap acima de 50%
estão representados sobre os galhos. Akodon orophilus (Aor), Akodon cursor (Acu),
Necromys lasiurus (Nla), Necromys urichi (Nur) e Oxymycterus delator (Ode) foram
utilizados como grupos externos. Para detalhes, ver Tabela 3..........................................
30
Figura 6. Cenário hipotético da organização sistemática de Thaptomys, baseado em
dados de seqüências de DNA: Thaptomys é subdividido em quatro filogrupos distintos
geneticamente.....................................................................................................................
31
9
RESUMO
Thaptomys é um gênero monotípico, sendo Thaptomys nigrita sua única espécie
reconhecida, embora a história taxonômica do gênero revele que mais de uma espécie já
foi descrita na literatura. Atualmente, existem quatro cenários taxonômicos apresentados
na literatura para o gênero: 1) Uma única espécie, sem divisão subespecífica, com grande
distribuição geográfica; 2) Uma espécie com duas subespécies, sendo Thaptomys nigrita
nigrita distribuída entre o sul da Bahia até o norte de Santa Catarina e Thaptomys nigrita
subterraneus distribuída do sul de São Paulo até o norte do Rio Grande do Sul, incluindo o
leste do Paraguai e o nordeste da Argentina; 3) Duas espécies com distinção cariotípica,
sendo Thaptomys sp. restrita ao sul da Bahia com 2n=50 e Thaptomys nigrita ocorrendo no
restante da distribuição do gênero com 2n=52; 4) Duas espécies, com uma forma variante,
com diferenciação morfológica, sendo Thaptomys sp. encontrado no sul da Bahia e
Thaptomys nigrita representado pelo indivíduos encontrados no resto da distribuição do
gênero, e uma forma variante encontrada no Paraná. Dessa forma, o objetivo deste trabalho
foi avaliar os quatro cenários de divisão do gênero Thaptomys utilizando marcadores
moleculares, e testar a existência de mais de uma unidade taxonômica para o gênero, a
partir do estudo de 833 pb do gene nuclear citocromo b (citb). Para isso foram feitas
análises de variabilidade genética intrapopulacionais, análises de demográficas das
populações, análises filogenéticas e análises de variação molecular interpopulacional
(AMOVA). Nossos resultados revelaram que as populações das extremidades da
distribuição de Thaptomys se encontram em equilíbrio demográfico e as populações do
centro da distribuição estão em expansão populacional. Os tempos desde a expansão
revelam que as populações do norte se expandiram em direção ao sul e as populações do
sul em direção ao norte. As análises filogenéticas e as análises de AMOVA revelam a
existência de quatro unidades evolutivamente significantes. Dessa forma, propomos a
10
existência de quatro unidades taxonômicas para o gênero Thaptomys: Thaptomys sp1, com
2n=50 para o sul da Bahia, Thaptomys nigrita para Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de
Janeiro e norte de São Paulo, com 2n=52; Thaptomys sp 2 para o centro e leste de São
Paulo e Thaptomys subterraneus para sul de São Paulo até o Rio Grande do Sul, incluindo
o nordeste da Argentina.
PALAVRAS-CHAVE: Diversidade populacional, Citocromo b, Thaptomys
11
ABSTRACT
Thaptomys is a monotypic genus. Thaptomys nigrita is only species recognized to
the genus to the moment, although the taxonomic history of genus reveals more than one
species has been described in the literature. Currently, there are four scenarios presented in
taxonomic literature for the genus: 1) A single species, without subspecies, with wide
geographical distribution, 2) One species with two subspecies, being Thaptomys nigrita
nigrita distributed between southern of Bahia to northern of Santa Catarina and Thaptomys
nigrita subterraneus distributed south of São Paulo to the north of Rio Grande do Sul,
including eastern of Paraguay and northeastern of Argentina; 3) Two species with
karyotype distinction, being Thaptomys sp. restricted to the south of Bahia with 2n = 50
and Thaptomys nigrita occurring in the rest of the genus distribution with 2n = 52, 4) Two
species with morphological differentiation and one variant form, being Thaptomys sp.
found in southern of Bahia and Thaptomys nigrita represented by the individuals found in
the rest of the distribution of the genus, and a variant form found in Paraná. Thus, the
objective of this study was to evaluate the four scenarios to the genus Thaptomys using
molecular markers, and to test the existence of more than one taxonomic unit for the genus,
from the study of 833 bp of nuclear gene cytochrome b (cit b). For this, we used population
genetics analyzes, phylogenetic analyzes and analyzes of molecular variation (AMOVA).
Our results revealed that the populations of the ends of the distribution are balanced
demographic and population center of the distribution are expanding population. The time
since the expansion reveal that the northern populations expanded to southward and
southern populations expanded to northward. Phylogenetic analyzes and AMOVA reveal
the existence of four evolutionarily significant units. Thus, we propose the existence of
four taxonomic units for the genus Thaptomys: Thaptomys sp1, with 2n = 50 to the south of
Bahia, Thaptomys nigrita to Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro and north of São
Paulo, with 2n = 52; Thaptomys sp 2 to the center and east of São Paulo and Thaptomys
subterraneus to south of São Paulo to Rio Grande do Sul, including northeastern to
Argentina.
KEY WORDS: Population genetics, Cytochrome b, Thaptomys
12
INTRODUÇÃO
O gênero Thaptomys Thomas, 1916 pertence à família Cricetidae, subfamília
Sigmodontinae, tribo Akodontini. Na compilação mais recente de mamíferos do mundo,
Thaptomys é um gênero monotípico, endêmico da América do Sul, distribuído desde a
Bahia até o Rio Grande do Sul na costa atlântica brasileira, leste do Paraguai e nordeste da
Argentina (Musser & Carleton 2005). Os roedores desse gênero apresentam olhos
reduzidos, cauda extremamente curta, rostro curto, ossos nasais longos e incisivos
proodontes, caracteres associados ao hábito semifossorial. Apresentam hábitos
predominantemente diurnos e parecem não realizar grandes deslocamentos migratórios,
sendo sua área de vida inferior a 100 metros (Hershkovitz 1998). Thaptomys nigrita
Lichtenstein, 1829 é a única espécie atualmente reconhecida nesse gênero (Musser &
Carleton 2005).
Embora atualmente monotípico, a história taxonômica de Thaptomys revela que
mais de uma espécie já foi reconhecida para o gênero. Lichtenstein (1829) descreveu Mus
nigrita, com localidade-tipo nos arredores do Rio de Janeiro. Mais tarde essa espécie foi
transferida para o gênero Hesperomys por Wagner (1843). Em 1873, Hensel descreveu a
espécie Hesperomys subterraneus, com a localidade-tipo restrita à Taquara do Mundo
Novo, Rio Grande do Sul. Em 1898, Trouessart incluiu M. nigrita e H. subterraneus no
gênero Akodon, sem especificar subgêneros, sendo as espécies chamadas de A. nigrita e A.
subterraneus. Em 1916, Thomas descreveu o gênero Thaptomys para acomodar a espécie
Hesperomys subterraneus Hensel, 1873, tornando Taquara do Mundo Novo, Rio Grande
do Sul a localidade-tipo de Thaptomys. Em 1932, Gyldenstolpe incluiu A. nigrita no
gênero Thaptomys, ficando o gênero representado por duas espécies: Thaptomys
subterraneus e Thaptomys nigrita. Contudo, Ellerman (1941) considerou Thaptomys
subgênero de Akodon, embora o considerasse “um grupo bem diferenciado” dentro da tribo
Akodontini, chamando as espécies de Akodon (Thaptomys) nigrita e Akodon (Thaptomys)
subterraneus. Em estudo subseqüente, Cabrera (1961) sinonimizou as duas espécies, e as
separou em duas subespécies: Akodon (Thaptomys) nigrita nigrita, distribuída entre o sul
da Bahia até o norte de Santa Catarina e Akodon (Thaptomys) nigrita subterraneus,
distribuída do sul de São Paulo até o norte do Rio Grande do Sul, incluindo o leste do
Paraguai e o nordeste da Argentina. No entanto, esta divisão subespecífica não foi citada
pelos autores subseqüentes (Reig 1987).
13
Thaptomys foi considerado um gênero válido a partir dos estudos de Hershkovitz
(1990, 1998), nos quais o autor destacou características morfológicas que seriam
suficientes para distinguir Thaptomys como um gênero à parte de Akodon. Sua opinião foi
posteriormente corroborada por estudos moleculares utilizando o gene mitocondrial
citocromo b (Smith & Patton 1999), que revelaram divergência genética alta entre os
gêneros Akodon e Thaptomys, reafirmando-os como grupos-irmãos.
Estudos citogenéticos mostraram que no gênero Thaptomys é observado um
cariótipo muito conservado, com 2n=52 na maior parte de sua distribuição geográfica
(Yonenaga 1975; Souza 1981; Fagundes 1993; Paresque 2001), exceto para indivíduos
coletados no município de Una, sul da Bahia, que apresentaram 2n=50 (Ventura et al.
2004). As análises de comparação cariotípica usando técnicas de bandeamento
cromossômico e localização de telômeros pela técnica de FISH (Fluorescent in situ
hybridization) sugeriram que uma fusão cromossômica seria o evento suficiente para atuar
como barreira reprodutiva entre as duas formas cromossômicas. Assim, Ventura et al.
(2004) sugeriram a existência de dois táxons distintos pelo cariótipo: Thaptomys sp.
(2n=50) para o sul da Bahia e Thaptomys nigrita (2n=52) para o restante da distribuição
geográfica.
Um estudo recente de morfometria craniana revelou uma diferenciação grande entre
os indivíduos de Una, Bahia e os indivíduos do restante da distribuição de Thaptomys,
reafirmando a hipótese de uma possível separação entre os indivíduos com cariótipos
distintos, e sugerindo a existência de pelo menos duas unidades evolutivas independentes:
Thaptomys sp. (2n=50 e NF=50) para o sul da Bahia e Thaptomys nigrita (2n=52 e NF=52)
para o restante da distribuição (Moreira 2007). Além dessa separação, Moreira encontrou
uma grande variação morfológica nos indivíduos coletados nos municípios de Piraquara e
Telêmaco Borba, no estado do Paraná, quando comparados aos indivíduos das outras
localidades.
Dessa forma, baseando-se em dados da literatura, observam-se quatro cenários para
a organização taxônomica do gênero Thaptomys: i) Uma única espécie, sem divisão
subespecífica, com grande distribuição geográfica (Musser & Carleton 2005; Figura 1a); ii)
Uma espécie com duas subespécies, sendo Thaptomys nigrita nigrita distribuída entre o sul
da Bahia até o norte de Santa Catarina e Thaptomys nigrita subterraneus distribuída do sul
de São Paulo até o norte do Rio Grande do Sul, incluindo o leste do Paraguai e o nordeste
da Argentina (Cabrera 1961; Figura 1b); iii) Duas espécies com distinção cariotípica,
sendo Thaptomys sp. restrita ao sul da Bahia com 2n=50 e Thaptomys nigrita ocorrendo no
14
restante da distribuição do gênero com 2n=52 (Ventura et al. 2004; Figura 1c); iv) Duas
espécies, com uma forma variante, com diferenciação morfológica, sendo Thaptomys sp.
encontrada no sul da Bahia e Thaptomys nigrita representado pelo indivíduos encontrados
no resto da distribuição do gênero, e a forma variante encontrada no Paraná (Moreira 2007;
Figura 1d).
Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar os quatro cenários de divisão do
gênero Thaptomys utilizando marcadores moleculares, e testar a existência de mais de uma
unidade taxonômica para o gênero.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras, extração e sequenciamento do DNA
Foram analisados 74 exemplares do gênero Thaptomys provenientes de 15
localidades do Brasil e uma da Argentina (Tabela 1, Figura 2, Apêndice). A seqüência de
um exemplar da Estação Biológica de Boracéia, São Paulo foi obtida do Genbank (número
de acesso AF108666).
Amostras de tecido (orelha, fígado, músculo) foram submetidas ao protocolo de
extração de DNA total (SDS/NaCl/Proteinase K) segundo Bruford et al. (1992). O gene
mitocondrial citocromo b (citb) foi amplificado através da clonagem in vitro pela Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizando-se os primers MVZ 05 (5’-
CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’; Smith & Patton 1991) e MVZ 14 (5’-
GGTCTTCATCTYHGGYTTACAAGAC-3’; Smith & Patton, 1993), gerando um
fragmento de 1140 pb; ou os primers MVZ 05 e MVZ 16 (5’-
AAATAGGAARTATCAYTCTGGTTTRAT-3’; Smith & Patton 1993), gerando um
fragmento de 860 pb.
Após a amplificação, o tamanho dos fragmentos dos produtos de PCR foi estimado
utilizando gel de agarose 1% e marcador molecular de 1 Kb (Invitrogen, Inc.). Os produtos
de PCR foram purificados com o Kit de Purificação de PCR (Invitrogen, Inc.),
quantificados utilizando eletroforese em agarose 2% e o marcador molecular Low Ladder
Mass (Invitrogen, Inc.) e seqüenciados utilizando-se os primers MVZ 05 e MVZ 127 (5’-
CTACCATGAGGACAAATATC-3’) em um seqüenciador automático ABI 377 (Applied
Biosystems).
15
Figura 1. Cenários hipotéticos da organização taxonômica. a) Thaptomys é um gênero
monotípico, segundo Musser & Carleton (2005); b) Thaptomys é subdividido em dois
táxons, segundo Cabrera (1961); c) Thaptomys é dividido em dois táxons com cariótipos
distintos, segundo Ventura et al. (2004); d) Thaptomys é dividido em dois táxons, com uma
forma variante, segundo Moreira (2007).
16
Tabela 1. Procedência, número de indivíduos (n) e número diplóide (2n) de
Thaptomys.
PAÍS ESTADO MUNÍCIPIO SIGLA1 n 2n
2
BRASIL
Bahia Una UNA 8 50
Espírito Santo
Santa Teresa EBSL 14 52
Domingos Martins PEPA 4 52
Dores do Rio Preto PNC 5 52
Minas Gerais
Delfim Moreira DMR 1 ND
Passa Quatro PSQ 1 ND
Ouro Preto OPR 1 ND
Fervedouro FER 7 ND
Rio de Janeiro Itatiaia PNI 2 52
São Paulo
Salesópolis EBB 1 ND
São João da Boa Vista SJBV 1 52
Ibiúna RMG 7 52
Iguape IGU 8 52
Paraná Piraquara PIR 6 52
Rio Grande do Sul Maquiné MAQ 5 52
ARGENTINA Misiones Arroio Cunã Pirú MIS 3 ND
TOTAL 74
1 Detalhes no Apêndice.
2 ND=não determinado
17
Figura 2. Localidades de Thaptomys no Brasil e Argentina (AR). UNA=Una, BA;
EBSL=Estação Biológica de Santa Lúcia, Santa Teresa, ES; PEPA=Parque Estadual da
Pedra Azul, Domingos Martins, ES; PNC=Parque Nacional do Caparaó, Dores do Rio
Preto, ES; FER=Fervedouro, MG; OPR=Ouro Preto, MG; PNI=Parque Nacional de
Itatiaia, RJ; PSQ=Santa Rita do Passa-Quatro, MG; DMR=Delfim Moreira, MG;
SJBV=São João da Boa Vista, SP; RMG=Reserva de Morro Grande, Ibiúna, SP;
EBB=Estação Biológica de Boracéia, Salesópolis, SP; IGU=Iguape, SP; PIR=Piraquara,
PR; MAQ=Maquiné, RS; MIS=Arroio Cuña Pirú, Misiones, Argentina.
1- UNA
2- EBSL
3- PEPA
4- PNC
5- FER
6- OPR
7- PNI
8- PSQ
9- DMR
10- SJBV
11- RMG
12- EBB
13- IGU
14- PIR
15- MIS
16- MAQ
ES
MG
SP
PR
RJ
BA
RS
AR
18
Análise das Seqüências
O programa MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007) foi utilizado para alinhar as
seqüências de DNA, resultando em 833 pb do início do gene citb alinhados. O alinhamento
das seqüências foi realizado manualmente, concomitante à correção das seqüências. A
análise de similaridade com o gene citb foi realizada no GenBank
(http://ncbi.nclm.nih.gov) utilizando a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool).
Análises intrapopulacionais
As análises da diversidade genética intrapopulacional foram realizadas utilizando
os algoritmos implementados no programa ARLEQUIN versão 3.1 (Excoffier et al. 2005):
número de haplótipos, freqüência dos haplótipos, diversidade haplotípica (h) e diversidade
nucleotídica (dn) dentro de cada população. Para essas análises, foram consideradas
populações as localidades com no mínimo três indivíduos. Os dados foram considerados
significativos quando os valores de P foram inferiores a 0,05 (P<0,05).
A distribuição de mismatch calculada no programa ARLEQUIN 3.1 foi utilizada
para a investigação da história demográfica das populações (Rogers & Harpending 1992,
Harpending et al. 1998). A soma do desvio dos quadrados (SSD) foi utilizada para
verificar o desvio entre as curvas observada e esperada da distribuição de mismatch dentro
do modelo de expansão populacional. Além disso, o tempo relativo desde a expansão
populacional (τ) foi estimado. Foram realizados também os testes de neutralidade D de
Tajima (Tajima 1989) e Fs de Fu (Fu 1997), os quais sugerem ocorrência de expansão
populacional recente quando observados valores negativos de significância (Fu 1997;
Schneider & Excoffier 1999).
Análises interpopulacionais
Todos os cálculos das análises interpopulacionais foram feitos com o programa
ARLEQUIN 3.1. A diferenciação genética entre as populações foi avaliada a partir dos
cálculos de diferença par-a-par entre as seqüências (estatística-Φ), utilizando-se o modelo
de Kimura 2-parâmetros, sem correção de gamma e testada com 10.000 permutações. O
número de migrantes por geração (Nm) para cada par de populações foi estimado
19
assumindo que a taxa de mutação foi insignificante através da formula Nm=(1-Φst)/2Φst,
para genomas haplóides (Slatkin & Maddison 1989). A análise hierárquica da variação
genética entre e dentro dos grupos de populações foi feita a partir da análise de variância
molecular (AMOVA), utilizando-se índices de fixação para se avaliar a proporção de
variação dentro das populações (Φst), entre os grupos (Φct) e entre as populações dentro
dos grupos (Φsc). O teste de Mantel foi realizado para avaliar a correlação entre
divergência genética e distância geográfica.
Relações filogenéticas intraespecíficas
Para estabelecer a relação hierárquica entre os haplótipos observados foi feita uma
rede de haplótipos utilizando o programa NETWORK 4.1 (Rohl 2000; http://www.fluxus-
engineering.com), baseada na implementação do algoritmo median–joining, o qual gera
uma árvore (minimum spanning tree) e adiciona os intermediários ausentes usando o
algoritmo de máxima parcimônia de Farris (Bandelt et al. 1999).
Para a construção das árvores filogenéticas foram utilizadas as análises de Máxima
Parcimônia (MP) a partir do programa PAUP 4.0.b.10 (Swofford 2002), com 1.000
replicações de bootstrap, e Máxima Verossimilhança (MV) utilizando o programa
PHYML (Guindon et al. 2005; http://atgc.lirmm.fr/phyml/) com 500 replicações de
bootstrap. O modelo de substituição nucleotídica apropriado para a análise de MV (TrN +
I + G, com I=0,4738 e G=0,5568) foi determinado utilizando o programa MODELTEST
3.06 (Posada & Crandall 1998). Os grupos externos utilizados foram obtidos do
GENBANK: Akodon orophilus (Aor; número de acesso M35699), Akodon cursor (Acu;
número de acesso EF206814), Necromys lasiurus (Nla; número de acesso AY273912),
Necromys urichi (Nur; número de acesso U03549) e Oxymycterus delator (Ode; número de
acesso AY275125).
20
RESULTADOS
Caracterização genética das populações
A análise dos 833 pb do gene citocromo b de 74 indivíduos do gênero Thaptomys
revelou 71 sítios polimórficos, definindo 46 haplótipos (Tabela 2). A diversidade
haplotípica global foi alta (h=0,9759), sendo a freqüência das bases A: 27,92%, C: 29,54%
G: 13,71% e T: 28,82%. Dos 46 haplótipos, somente cinco foram compartilhados, sendo
dois (H11 e H12) entre as populações do Espírito Santo, um (H13) entre populações do
Espírito Santo, Minas Gerais e Rio de Janeiro, um (H35) entre as populações de São Paulo
e Argentina, e um (H26) entre duas localidades de Minas Gerais (Tabela 3).
Das populações (n≥3), os maiores índices de diversidade haplotípica foram obtidos
na população da Bahia (UNA; h=1,0 e n=8), com oito haplótipos e 21 sítios polimórficos,
seguido Minas Gerais (FER; h=1,0 e n=7), com sete haplótipos e nove sítios polimórficos e
Espírito Santo (PNC; h=1,0 e n=5), com cinco haplótipos e 10 sítios polimórficos. No
Espírito Santo, altos índices de diversidade também foram observados em EBSL
(h=0,8352; n=14), com seis haplótipos e 10 sítios polimórficos e PEPA (h=0,8333; n=4)
com três haplótipos e dois sítios polimórficos. Em São Paulo, IGU apresentou baixa
diversidade haplotípica em relação às outras populações (h=0,6786; n=8), com quatro
haplótipos e três sítios polimórficos, enquanto RMG apresentou uma das mais altas taxas
(h=0,9524; n=7), com seis haplótipos e nove sítios polimórficos. No Paraná, a diversidade
de PIR também foi alta (h=0,9333; n=6), com cinco haplótipos e nove sítios polimórficos.
As populações de MAQ no Rio Grande do Sul (h=0,7000; n=5) e MIS na Argentina
(h=0,6667; n=3), apresentaram valores comparativamente menores que as demais
populações, similares à taxa de IGU em São Paulo (Tabela 4).
21
Tabela 2. Posição dos 71 sítios polimórficos em cada haplótipo (H) determinado por 833 pb do gene mitocondrial citocromo b em Thaptomys.
1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8
2 5 6 7 0 0 1 2 6 4 5 8 8 9 9 9 9 0 2 3 4 4 5 6 8 8 9 9 0 1 1 2 3 4 6 7 8 9 0 0 0 1 2 3 5 5 5 6 6 8 8 9 0 0 6 6 9 1 4 5 5 6 9 0 1 1 1 2 2 3
7 8 7 3 2 2 8 6 6 8 3 5 2 4 1 3 4 7 3 7 1 2 5 5 9 4 7 6 9 5 4 5 6 2 4 2 7 1 8 1 4 8 9 9 1 3 5 8 1 7 2 8 4 3 8 3 9 0 7 4 0 9 5 2 7 3 6 9 2 8 2
H01 AC T A AG AC T T T C A T T T CC AT GT CC CT GG TA AT CT TC CG T C CG TC TC AC T T CT GC CT CA CT C A T T AA G T TC T
H02 . . . G . . . . . C . . . . . . . . . . . C . T . . A . . G . . . C CT T . . T . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . G . . . . . C C . .
H03 . . . G . . . . . C . . . . . . . . . . . C . T . . A . . . . . . C CT T . . T . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . G . . . . . . . . .
H04 . . . G . . . . . C . . . . . . . . . . . C . T . . A . . G . . . C CT T . . T . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . G . . . . . . . . .
H05 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T G . . . G A . . . .
H06 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T G . . . G A . . . .
H07 . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C CT T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . T . . G . . . . . . . . .
H08 . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . G A . . . .
H09 . . . . G . . . . C . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . G . . C . C . . . . . . . C . . . . G . A . . T .
H10 . . . . G . . . . C . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . G . . C . C . . . . . . . . . . C . . . A . . T .
H11 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . C . . . A . . T .
H12 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . AA . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . A . . T .
H13 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . A . . T .
H14 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . T G . . . G A . . . .
H15 . . . . G . . . . . C . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . A . . T .
H16 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . T . . A . . . . . . C CT T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . TG . . . G . . . . A . . T .
H17 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . T . . A . . . . . . C CT T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . A . . T .
H18 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . TC . T . . A . . . . . . C C . T . . . . A . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . C . . . A . . T .
H19 . . . . G . . . . . . . . . C . . T . . . C . T . . AA . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . C . . . A . . T .
H20 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H21 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . A . . T A
H22 . . . . G . . . . . C . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . G . . . . . C . C . . . C . . . . . . . . . . AC C T A
H23 . . . . G . . . . . C . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . C . . . . . . . . . . A . . T A
H24 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . AC . T A
H25 . . . . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . AA . . . . . C C . T . C . . . C . . . . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H26 . . C . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . A . T . . . . . . . . C . C . T . . . . . . . . . . . . A . . T .
H27 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . T . . A . C . . . . C CT T . . . . . . . . . . . . C . C . . . . T . . . . . . C . . A . . T .
H28 . T C . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . TA . C C . T . A . T . . . . . . . . C . C . T . . . . . . . . . . . . AC C T A
H29 . . C . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . A . T . . . . . . . . C . C . T . . . . . . . . . C . . AC C T A
H30 . . C . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . A . T . . . . . . T AC T . . T . . . . . . . . . . . . AC C T A
H31 . . C . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . A . T . . . . . . . . C . C . T . . . . . . . . . . . . AC C T A
H32 . . C . GA . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . T . A . T . . . . . . . . C T .
C
. T . . . . . . . . . . . . AC C T A
H33 . . C . G . . . . . . . . . C . . . . . . C . T . . A . . . . . GC C . T . A . T . . . . . . . . C . C . T . . . . . . . . . C . . AC C T A
H24 . . C . G . . . . . . . . C C C . . . . . C . T . . A . . . . . . C C . TT A . T . . . . T . . . C TC . T . . . . . . . . . . . . A . . . .
H35 . . . . GA G . . . . . G . . . . . . . . C T T . . A . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H36 . . . . GA G . . . . . G . . . . . . . . C T T . C A . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H37 . . . . GA G . . . . . . . . . . . . . . C T T . . A . . . . . . C . . T . . . T . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H38 . . . . GA . . . . . . G . . . . . G . . C T T . . A . . . . . . C . . T . . . T . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H39 . . . . GA G . A . . . G . . . . . . . . C T T . . A . C . . . . C . . T . . . . . C . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H40 G . . . GA G . A . . . G . . . . . . . . C T T . . A . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H41 G . . . GA G . A . . . G . . . . . . . . C T . . . A . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H42 . . . . GA G . A . . . G . . . . . . . . C T T T . A . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T A
H43 . . . . GA GT . . . . . . . . . . . C . C T . . . A . . G . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . . C . . .
H44 . . . . GA G . . . . . G . . . . . . . . C T . . . A . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . A . . . . . . . . . . . . C . . .
H45 . . . . GA G . . . . . G . . . G . . . . C T T . . A . . G . . . C . . T . . . . . . . . . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . AC C T .
H46 . . . . GA G . . . . T G . . . . . . . . C T T . . A . . . . . AC . . T . . . . . . . G . . . . C . C A . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
Tabela 3. Freqüências relativas (em porcentagem) de cada haplótipo do gene mitocondrial citb de Thaptomys por localidade. No quadrado
sombreado estão localidades distantes entre si a menos de 200 km. Abreviações para as localidades estão na Tabela 1.
Hapl UNA EBSL PEPA PNC FER OPR PNI DMR PSQ SJBV RMG EBB IGU PIR MAQ MIS
H1 1 (12,5)
H2 1 (12,5)
H3 1 (12,5)
H4 1 (12,5)
H5 1 (12,5)
H6 1 (12,5)
H7 1 (12,5)
H8 1 (12,5)
H9 5 (35,7)
H10 1 (7,15)
H11 3 (21,4) 2 (50,0) 1 (16,7)
H12 2 (14,3) 1 (25,0)
H13 2 (14,3) 1 (25,0) 1 (14,3) 2 (100,0)
H14 1 (7,15)
H15 1 (16,7)
H16 1 (16,7)
H17 1 (16,7)
H18 1 (16,7)
H19 1 (14,3)
H20 1 (14,3)
H21 1 (14,3)
H22 1 (14,3)
H23 1 (14,3)
H24 1 (14,3)
H25 1 (100,0)
H26 1 (100,0) 1 (100,0)
H27 1 (100,0)
H28 1 (14,3)
H29 1 (14,3)
H30 1 (14,3)
H31 2 (28,6)
H32 1 (14,3)
H33 1 (14,3)
H34 1 (100,0)
H35 3 (37,5) 2 (66,7)
H36 4 (50,0)
H37 1 (12,5)
H38 1 (16,7)
H39 1 (16,7)
H40 1 (16,7)
H41 1 (16,7)
H42 2 (33,3)
H43 3 (60,0)
H44 1 (20,0)
H45 1 (20,0)
H46 1 (33,3)
Total 8 14 4 6 7 1 2 1 1 1 7 1 8 6 5 3
23
Tabela 4. Número de haplótipos (nH), número de sítios polimórficos por população (nSP), diversidade haplotípica (h), diversidade
nucleotídica (dn), testes de distribuição de freqüências pareadas (SSD e τ) e valores dos testes D de Tajima e Fs de Fu de Thaptomys.
Abreviações para as localidades estão na Tabela 1.
Populações nH nSP h dn SSD* (P-valor) τ* D (P-valor) Fs (P-valor)
UNA 8 21 1,0000 (+/-0,0625) 0,012156 (+/- 0,0071) 0,0226 (0,820) 16.240 1,20196 (0,8890) -2,18251 (0,0730)
EBSL 6 10 0,8352 (+/-0,0704) 0,004007 (+/- 0,0024) 0,0620 (0,070) 4.969 0,21565 (0,6460) 0,36423 (0,6040)
PEPA 3 2 0,8333 (+/-0,2224) 0,001403 (+/- 0,0013) 0,0373 (0,620) 1.510 0,59158 (0,8220) -0,65789 (0,1480)
PNC 5 10 1,0000 (+/-0,1265) 0,005800 (+/- 0,0039) 0,0748 (0,290) 3.027 0,00000 (0,5850) -1,41093 (0,1140)
FER 7 9 1,0000 (+/-0,0764) 0,004365 (+/- 0,0029) 0,0200 (0,620) 3.123 -0,07874 (0,4950) -3,85649 (0,0050)
RMG 6 9 0,9524 (+/-0,0955) 0,003556 (+/- 0,0024) 0,0067 (0,890) 3.148 -1,04329 (0,1770) -2,27552 (0,0440)
IGU 4 3 0,6786 (+/-0,1220) 0,001289 (+/- 0,0011) 0,0208 (0,560) 0.938 -0,30441 (0,3990) 0,32985 (0,5010)
PIR 5 9 0,9333 (+/-0,1217) 0,004100 (+/- 0,0028) 0,0400 (0,400) 3.834 -0,81841 (0,2660) -1,04528 (0,1650)
MAQ 3 10 0,7000 (+/-0,2184) 0,005562 (+/- 0,0038) 0,1681 (0,080) 8.021 -0,29817 (0,4780) 2,14132 (0,8370)
MIS 2 8 0,6667 (+/-0,3143) 0,006448 (+/- 0,0053) 0,4242 (0,030) 9.037 0,00000 (0,7460) 3,10109 (0,8790)
*SSD= Soma do desvio dos quadrados e τ= tempo (em anos) do evento de expansão populacional.
24
Análises Demográficas das populações
O teste da soma do desvio dos quadrados (SSD, Tabela 4) da distribuição de
mismatch foi não-significativo para a maioria das populações, indicando que o modo
pelo qual as populações expandiram segue um padrão uni, bi ou multimodal, segundo a
curva de distribuição de mismatch esperada, e não a observada (Figura 3). Dessa forma,
as populações de PEPA-ES, PNC-ES, FER-MG, RMG-SP, IGU-SP e PIR-PR (Figuras
3c a 3h, respectivamente) apresentaram curva de distribuição esperada unimodal, o que
indica que essas populações estão em expansão populacional. As populações de UNA-
BA e MAQ-RS (Figuras 3a e 3i) apresentaram curva esperada multimodal e a
população de EBSL-ES uma curva bimodal (Figura 3b), e ambas as curvas sugerem
equilíbrio populacional. Apenas a população MIS-AR apresentou desvio significativo
do modelo de expansão esperado, de acordo com o teste da soma dos desvios dos
quadrados (SSD, Tabela 4) da distribuição de mismatch, e a curva observada bimodal
(Figura 3j) indica que esta população encontra-se em equilíbrio demográfico.
O teste de neutralidade de Fu foi significativo apenas para as populações de
FER-MG (Fs=-3,85649; P<0,05) e RMG-SP (Fs=-2,27552; P<0,05) (Tabela 4)
reforçando a sugestão de que essas populações estão em expansão demográfica. O
maior valor absoluto de tempo desde a expansão (τ) foi observado na população de
UNA-BA, seguida pelas populações de MIS-AR, MAQ-RS e EBSL-ES.
25
a b
c d
e f
g h
i j
Figura 3. Distribuição das diferenças nucleotídicas par-a-par entre os indivíduos
de cada população (distribuição mismatch) de Thaptomys. As barras indicam as
freqüências observadas, enquanto as linhas indicam a freqüência esperada
baseada no modelo de expansão populacional. Os valores do eixo X indicam o
número de diferenças entre os haplótipos e o eixo Y a freqüência dos haplótipos.
26
Análises Interpopulacionais
Os valores de Φst foram significativos para a maioria das populações e variaram
de Φst=0,19251 a 0,90312 (Tabela 5). A população de PEPA-ES apresentou valores de
Φst não-significativos quando comparada às populações de EBSL-ES, PNC-ES e FER-
MG, sugerindo não diferenciação entre essas populações. O mesmo ocorreu com a
população de MIS-AR, que apresentou valores de Φst não-significativos quando
comparada às populações de IGU-SP e MAQ-RS. O maior valor de Φst encontrado foi
entre as populações de PEPA-ES e IGU-SP (Φst=0,90312), mostrando haver grande
diferenciação entre as duas populações.
Os valores de número de migrantes por geração (Nm) indicam haver fluxo
gênico entre algumas populações, como EBSL-ES e PEPA-ES (Nm=6), EBSL-ES e
PNC-ES (Nm=2), EBSL-ES e FER-ES (Nm=1), PEPA-ES e PNC-ES (Nm=26), PEPA-
ES e FER-MG (Nm=2), PNC-ES e FER-MG (Nm=2), IGU-SP e MIS-AR (Nm=1) e
PIR-PR e MIS-AR (Nm=2) (Tabela 6). O teste de Mantel mostra que a relação de
diferenciação genética entre as populações está relacionada com a distância geográfica
(r=0,40; P<0,01).
Tabela 5. Valores de Φst entre as populações (abaixo) e distância geográfica em
quilômetros (acima) entre as populações.
UNA EBSL PEPA PNC FER RMG IGU PIR MAQ MIS
UNA 533 582 644 698 1235 1367 1523 2020 2096
EBSL 0,55660 50 141 214 772 891 1057 1550 1664
PEPA 0,46866 0,07355 120 191 740 856 1022 1489 1632
PNC 0,37027 0,19277 0,01870 73 632 754 918 1385 1522
FER 0,51486 0,27294 0,16850 0,19251 561 684 848 1322 1450
RMG 0,66888 0,70820 0,75364 0,67385 0,60525 137 289 761 890
IGU 0,70979 0,80789 0,90312 0,80187 0,78021 0,84626 168 637 785
PIR 0,65446 0,77099 0,80612 0,71775 0,70652 0,77868 0,33383 502 613
MAQ 0,54467 0,75008 0,76690 0,67693 0,71499 0,80408 0,68555 0,58283 520
MIS 0,52525 0,71428 0,74891 0,60835 0,63774 0,75929 0,26072 0,20050 0,35787
Em negrito estão os valores significativos, com P<0,05
27
Tabela 6. Número de migrantes por geração (Nm) para cada par de populações.
UNA EBSL PEPA PNC FER RMG IGU PIR MAQ
EBSL 0,4
PEPA 0,6 6,3
PNC 0,9 2,1 26,2
FER 0,5 1,3 2,5 2,1
RMG 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3
IGU 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
PIR 0,3 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 1,0
MAQ 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,2 0,4
MIS 0,5 0,2 0,2 0,3 0,3 0,2 1,4 2,0 0,9
Relações filogenéticas
A rede de haplótipos mostrou a formação de quatro grupos de populações. Um
grupo foi formado pelas amostras da população de UNA-BA, no extremo norte da
distribuição de Thaptomys. Um segundo grupo é formado pelas populações de EBSL-
ES, PEPA-ES, PNC-ES, FER-MG e PNI-RJ, e pelas amostras de OPR-MG e SJBV-SP,
populações localizadas na porção central-norte da distribuição do gênero. Um terceiro
grupo é formado pela população de RMG-SP juntamente com as amostras de PSQ-MG,
DMR-MG e EBB-SP, localizado na porção central-sul da distribuição. Um quarto grupo
é formado pelas populações de IGU-SP, PIR-PR, MAQ-RS e MIS-AR, no extremo sul
da distribuição de Thaptomys (Figura 4).
As árvores filogenéticas de MP e MV (Figura 5) mostraram topologias
congruentes, apresentando Thaptomys como um grupo monofilético, com alto suporte
(99 e 100%, respectivamente). As duas árvores mostraram o grupo norte, formado pela
população de UNA-BA, como um clado monofilético, com suporte baixo (>50%). A
relação hierárquica entre os haplótipos das populações do Espírito Santo e Minas Gerais
(grupo central-norte) não ficou bem esclarecida com os 833 pb do citb, formando uma
politomia basal. O grupo central-sul, formado pelas amostras de RMG-SP, EBB-SP,
DMR-MG e PSQ-MG, aparece como um grupo monofilético nas duas árvores
filogenéticas, com suporte acima de 60%. O grupo sul, formado pelas populações de
IGU-SP, PIR-PR, MAQ-RS e MIS-AR, aparece como um grupo monofilético na árvore
de MP com suporte de 58% (Figura 5a), embora apareça na árvore de MV (Figura 5b)
apenas a população de PIR-PR como um clado monofilético com suporte acima de
50%. O restante dos haplótipos do grupo sul forma uma politomia basal.
28
Existe uma congruência entre a rede de haplótipos e as árvores filogenéticas,
com a formação de quatro grupos, com estruturação geográfica. Estes quatro grupos
ganham sustentação com as análises interpopulacionais, que mostram valores de Φst
maior entre as populações de grupos diferentes (Tabela 5). Estes quatro filogrupos serão
nomeados considerando a localidade-tipo de cada forma, como se segue: Thaptomys sp1
para o grupo norte, composto pelas amostras de UNA-BA; Thaptomys nigrita para o
grupo central-norte formado pelas amostras de EBSL-ES, PEPA-ES, PNC-ES, FER-
MG, PNI-RJ, OPR-MG e SJBV-SP; Thaptomys sp2 para o grupo central-sul, formado
pelas amostras de RMG-SP, EBB-SP, DMR-MG e PSQ-MG e Thaptomys subterraneus
para o grupo sul formado pelas amostras de IGU-SP, PIR-PR, MAQ-RS e MIS-AR.
Deste modo, nossos dados moleculares propõem a formação de um quinto cenário para
a organização sistemática do gênero Thaptomys, como é representado na Figura 6.
Testando os cenários hipotéticos
O objetivo deste trabalho foi testar a existência de mais de uma unidade
taxonômica para o gênero Thaptomys, avaliando os cenários de divisão do gênero.
Dessa forma, foram feitos agrupamentos de acordo com cada cenário hipotético
apresentado nas Figuras 1 e 6 (Tabela 7) para avaliar a variação molecular (AMOVA)
entre os grupos.
O cenário considerado como sendo o mais provável seria aquele que
apresentasse a maior variação entre os grupos (Φct), mostrando distinção entre eles; e a
menor variação entre as populações dentro dos grupos (Φsc), o que indicaria
homogeneidade dentro do grupo. O cenário menos favorável foi o cenário I, que
apresentou o maior valor para Φsc (65,7), seguido pelos cenários III e IV que
apresentaram valores baixos para Φct (22,65 e 21,50, respectivamente), mostrando
pouca diferença entre os grupos e valores altos para Φsc (48,61 e 48,33,
respectivamente), revelando grande variação dentro dos grupos. O cenário II apresentou
valor alto para Φct (44,56) e valor baixo para Φsc (28,78). Porém, o cenário mais
favorável foi o cenário V, que apresentou o maior valor para Φct (56,93), revelando
distinção entre os grupos e o menor valor para Φsc (13,11), mostrando homogeneidade
em cada grupo, reforçando a proposta de existência de quatro filogrupos para o gênero.
29
Figura 4. Rede de haplótipos representando as relações filogenéticas entre os haplótipos do gene citb. O tamanho dos círculos é
proporcional à freqüência de cada haplótipo na amostra total. Os haplótipos estão designados na Tabela 3.
30
a) b)
Figura 5. Árvores filogenéticas: a) Método de Parcimônia; b) Método de Máxima
Verossimilhança utilizando o modelo TrN + G + I. Valores de bootstrap acima de 50% estão
representados sobre os galhos. Akodon orophilus (Aor), Akodon cursor (Acu), Necromys lasiurus
(Nla), Necromys urichi (Nur) e Oxymycterus delator (Ode) foram utilizados como grupos
externos. Para detalhes, ver Tabela 3.
31
Figura 6. Cenário hipotético da organização sistemática de Thaptomys, baseado em dados de
seqüências de DNA: Thaptomys é subdividido em quatro filogrupos distintos geneticamente.
Thaptomys sp 1
Thaptomys nigrita
Thaptomys sp 2
Thaptomys subterraneus
32
Tabela 7. Análise da variação genética (AMOVA) entre grupos, testando os diferentes cenários da organização taxonômica em
Thaptomys.
Cenário Hipótese Composição dos Grupos
% de Variação
Фct Фsc Фst
I Um único táxon Um grupo:
1. Todas as populações - 65,7 34,93
II
Dois táxons segundo Cabrera (1961)
- T. nigrita nigrita
- T. nigrita subterraneus
Dois grupos:
1. UNA-BA, ESBL-ES, PEPA-ES, PNC-ES, OPR-MG, FER-MG, PSQ-MG,
DMR-MG, PNI-RJ, SJBV-SP, RMG-SP, EBB-SP
2. IGU-SP, PIR-PR, MAQ-RS, MIS-AR
44,56 28,78 26,66
III
Dois táxons segundo Ventura et al. (2004)
- Thaptomys sp (2n=50)
- T. nigrita (2n=52)
Dois grupos:
1. UNA-BA
2. ESBL-ES, PEPA-ES, PNC-ES, OPR-MG, FER-MG, PSQ-MG, DMR-
MG, PNI-RJ, SJBV-SP, RMG-SP, EBB-SP, IGU-SP, PIR-PR, MAQ-RS,
MIS-AR
22,65* 48,61 28,74
IV
Três táxons segundo Moreira (2007)
- Thaptomys sp
- T. nigrita
- T. nigrita (var.)
Três grupos:
1. UNA-BA
2. ESBL-ES, PEPA-ES, PNC-ES, OPR-MG, FER-MG, PSQ-MG, DMR-
MG, PNI-RJ, SJBV-SP, RMG-SP, EBB-SP, IGU-SP, MAQ-RS, MIS-AR
3. PIR-PR
21,50 48,33 30,16
V
Quatro táxons segundo presente estudo
- Thaptomys sp1
- T. nigrita
- Thaptomys sp2
- T. subterraneus
Quatro grupos:
1. UNA-BA
2. ESBL-ES, PEPA-ES, PNC-ES, OPR-MG, FER-MG, PNI-RJ, SJBV-SP
3. PSQ-MG, DMR-MG, RMG-SP, EBB-SP
4. IGU-SP, PIR-PR, MAQ-RS, MIS-AR
56,93 13,11 29,96
* P>0,05. Фct: Variação entre os grupos de populações; Фsc: Variação entre as populações dentro dos grupos; Фst: Variação dentro das populações.
33
DISCUSSÃO
Estudos moleculares foram importantes para validar o gênero Thaptomys e
compreender sua relação com os outros gêneros da tribo Akodontini (Smith & Patton
1999). Os dados moleculares representam um passo promissor para a melhor
compreensão sistemática do gênero com a análise de 74 exemplares de 16 localidades,
distribuídas ao longo da distribuição de Thaptomys.
Seis das dez populações de Thaptomys, localizadas nos estados do Espírito
Santo, Minas Gerais, São Paulo e Paraná (EBSL, PEPA, FER, RMG, IGU e PIR),
apresentaram diversidade haplotípica alta (h>0,5) e diversidade nucleotídica baixa
(dn<0,005). Por outro lado, quatro populações, localizadas na Bahia, Espírito Santo,
Rio Grande do Sul e Argentina (UNA, PNC, MAQ, MIS), apresentaram valores altos
tanto para a diversidade haplotípica (h>0,5) quanto para a diversidade nucleotídica
(dn>0,005).
A estrutura genética das populações pode revelar possíveis processos
demográficos de gargalo populacional e crescimento (ou expansão) populacional pelos
quais tenham sofrido. Segundo Grant e Bowel (1998), populações com altos valores de
diversidade haplotípica (h>0,5) e com baixos valores de diversidade nucleotídica
(dn<0,005) passaram por processo de gargalo populacional seguido de rápido
crescimento demográfico e acúmulo de mutações; enquanto que populações com
valores altos tanto para diversidade haplotípica quanto nucleotídica podem ser
populações com grande estabilidade populacional e longa história evolutiva ou podem
ter tido contado secundário entre linhagens diferentes.
Sendo assim, as populações de Thaptomys na margem norte e sul de sua
distribuição têm indícios de estabilidade populacional e longa história evolutiva,
enquanto que as populações da região central da distribuição mostram indícios de terem
sofrido gargalo populacional seguido de rápido crescimento demográfico. As análises
da distribuição de mismatch das populações de Thaptomys corroboraram com estes
dados, mostrando que as populações de PEPA, FER, RMG, IGU e PIR podem estar
sofrendo crescimento demográfico, enquanto as populações de UNA, MAQ e MIS
parecem estar em equilíbrio populacional. Os dados para a população de EBSL mostram
expansão pelos dados de diversidade haplotípica e nucleotídica e estabilidade pelos
34
dados de distribuição de mismatch, o que provavelmente reflete um possível contado
secundário entre linhagens alopátricas diferentes (Grant & Bowel 1998). Da mesma
forma, a população de PNC parece estar em expansão segundo dados de distribuição de
mismatch, mas ter sofrido contato secundário entre linhagens diferentes pelos dados de
diversidade haplotípica e nucleotídica.
A partir desses dados, observamos um padrão interessante, no qual as
populações dos extremos da distribuição do gênero (UNA: extremidade norte; MAQ e
MIS: extremidade sul) parecem estar em equilíbrio populacional, e as populações
intermediárias da distribuição parecem ter sofrido gargalo populacional com posterior
expansão. Os dados do tempo decorrido desde a expansão indicam que a populações de
UNA, EBSL e FER sofreram expansão a aproximadamente 16.240, 4.969 e 3.123 anos
atrás, respectivamente (Tabela 4), sugerindo um padrão de ocupação/expansão do norte
para o sul, ao longo do tempo. Contrariamente, as populações do extremo sul de
Thaptomys (MIS, MAQ, PIR e IGU) mostram expansão populacional a 9.037, 8.021,
3.834 e 938 anos atrás, respectivamente (Tabela 4) sugerindo um padrão de expansão do
sul para o norte ao longo do tempo.
O período de expansão da maioria das populações de Thaptomys (exceto UNA,
Bahia) data de menos de 10 mil anos, período após a última glaciação (Behling &
Lichte 1997). Durante esse período de glaciação houve contração da floresta, com a
formação de pastagens na região central do Brasil (Behling & Lichte 1998), o que
provavelmente impediu a migração dos indivíduos desse gênero, uma vez que estes são
registrados em florestas úmidas, composta por vegetação sempre verde e árvores entre
1,5 e 4,0 metros de altura (Bonvicino et al. 1997), geralmente em lugares pouco
perturbados e em regiões de mata madura da Mata Atlântica (Pardini & Umetsu 2006).
Com o final da glaciação e mudanças nas condições climáticas, as florestas voltaram a
se expandir (Behling & Lichte 1998), possibilitando a expansão demográfica das
populações. Populações que experimentam uma rápida expansão após um gargalo
populacional apresentam uma baixa diversidade nucleotídica, ocasionada pela perda de
alelos e grandes efeitos da deriva genética e fixação de mutações novas, associado com
grande expansão populacional pelo fato da competição ser baixa e permitir explorar
diferentes nichos (Ridley 2006). Essa hipótese pode explicar porque populações muito
distantes como UNA e MIS (distância geográfica de 2.096 km) apresentaram distância
35
genética menor (Φst=0,52525) do que populações mais próximas como IGU e PEPA
(distância geográfica de 856 km), que apresentaram a maior distância genética par-a-par
(Φst=0,90312).
Segundo nossa proposta, dois grupos de populações coexistiam num período
com distribuição geográfica disjunta, um grupo sul, ocupando a região nordeste da
Argentina e sul do Brasil, e um grupo norte, ocupando a região sul da Bahia. Após um
período de grandes expansões populacionais, pequenos grupos fundaram novas
populações da direção sul-norte e norte-sul (efeito do fundador, Mayr 1963). Dessa
forma podemos sugerir que as populações se expandiram após um gargalo populacional
caracterizado pelo efeito de fundador, o que resultou em populações mais recentes com
uma diversidade genética menor em relação à sua população de origem (Hewitt 1996).
Composição sistemática de Thaptomys
Tanto as análises interpopulacionais (Φct, Φsc, Φst, Tabela 7) quanto as análises
filogenéticas (rede de haplótipos, Figura 4) sugeriram a separação de Thaptomys em
mais de um grupo. Primeiramente, cada clado identificado neste estudo foi considerado
como “grupo”, seguindo a terminologia utilizada por Merriam (1895) e Davis (1940).
As análises de AMOVA evidenciaram a existência de quatro grupos com estruturação
geográfica, corroborado com as análises filogenéticas.
O grupo denominado Thaptomys sp1 apareceu como um clado monofilético
tanto nas árvores filogenéticas de MP e MV (embora com baixo suporte) quanto na rede
de haplótipos. Este grupo, composto pela amostras de UNA, apresentou valores altos de
Φst, revelando grande diferenciação desta população com as demais (Excoffier et al.
1992). Nossos dados reforçam a hipótese de que as amostras provenientes do município
de Una, sul da Bahia, com 2n=50, sejam de uma espécie distinta de Thaptomys, ainda
não nominada. Ventura et al (2004) propuseram que uma barreira reprodutiva causada
por uma fusão cromossômica tenha sido o evento suficiente para separar este grupo da
espécie Thaptomys nigrita, levando em consideração o conceito biológico de espécie,
segundo Mayr (1963), no qual espécies são grupos de populações naturais que
intercruzam e estão reprodutivamente isoladas de outros grupos desse tipo. Moreira
(2007) também encontrou nos dados morfológicos indícios que os indivíduos de Una
36
fossem de uma unidade taxonômica evolutivamente significativa, uma vez que
encontrou um padrão diferenciado de modificação de tamanho e forma multivariados do
crânio com relação aos outros grupos de populações. Neste sentido, baseado no conceito
fenético ou morfológico de espécie, o qual define espécie como conjunto de indivíduos
que são feneticamente semelhantes e diferentes dos outros conjuntos de indivíduos
(Sneath & Sokal 1973), esse grupo também se mostrou distinto dos demais. Nossos
dados indicam grande distância genética entre esta população com as demais e
obtivemos a formação de um clado monofilético. Sendo assim, baseando-se no conceito
filogenético de espécie (Cracraft 1989), no qual uma espécie é qualquer grupo que
forma um ramo independente em uma filogenia e que, para serem consideradas
diferentes espécies nesse conceito, as populações devem ter passado um período
evolutivo suficientemente longo para que os caracteres diagnósticos tenham aparecido,
também indicamos a população da Bahia como uma unidade evolutivamente
significante, distinta de Thaptomys nigrita.
O grupo chamado Thaptomys nigrita engloba populações do Espírito Santo,
Minas Gerais e Rio de Janeiro, e ganhou este nome por incluir o Rio de Janeiro,
localidade-tipo de Mus nigrita (Lichtenstein 1829). Os valores de Φst entre as
populações deste grupo foram baixos (0,01870<Φst<0,27294) quando comparados com
os valores de Φst das populações deste grupo com as demais (0,60525<Φst<0,90312),
indicando que a distância genética interpopulacional dentro deste grupo é baixa (Tabela
5). A pouca variabilidade entre as populações também é apresentada pelo alto número
de migrantes entre elas (Nm>1, Tabela 6), o que confere homogeneização genética
dentro do grupo. Este grupo apresenta os menores valores de tempos desde a expansão,
indicando que as populações começaram a expandir recentemente (τ<5 mil anos, Tabela
4). No entanto, os dados moleculares não foram suficientes para mostrar relação entre
os haplótipos nas árvores filogenéticas (Figura 5). Essa falta de esclarecimento pode ser
explicada pelo fato de árvores filogenéticas não conseguirem revelar as relações entre
grupos quando há ausência de haplótipos intermediários na amostragem (Bandelt et al.
1999). Esses haplótipos intermediários são mostrados como nós na rede de haplótipos
(Figura 4), mostrando forte relação entre as populações do grupo Thaptomys nigrita.
O grupo Thaptomys sp2 é formado por amostras do leste e centro de São Paulo e
por uma pequena porção do sul de Minas Gerais. Os dados na literatura não indicam a
37
separação desse grupo de Thaptomys nigrita, sendo as características morfológicas
(Geise 1995, Hershkovitz 1998, Moreira 2007) e cariotípicas (Yonenaga 1975; Souza
1981; Fagundes 1993; Moreira 2007) semelhantes às de Thaptomys nigrita. No entanto,
este grupo revelou-se como um clado monofilético tanto na árvore de MP, com suporte
de 63%, quanto na árvore de MV, com suporte de 64% (Figura 5), assim como na rede
de haplótipos (Figura 4), com forte relação entre os haplótipos. A análise de AMOVA
também mostra estruturação para este grupo (Tabela 7). A população de RMG-SP,
única população deste grupo presente nas análises populacionais, apresentou índices
altos de distância genética em relação às outras populações (Φst>0,60), e ausência de
fluxo gênico desta população com as demais, indicando grande diferenciação deste
grupo (Nm<1, Tabela 6). Apesar da falta de populações adequadamente amostradas
para este grupo e a ausência de dados na literatura dificultarem a inferência sobre a
posição sistemática do grupo Thaptomys sp2, os dados moleculares apontam para uma
nova forma de Thaptomys, distinta de Thaptomys nigrita. Estudos adicionais com novas
amostragens nessa área serão fundamentais para esclarecer esse aspecto.
O grupo denominado Thaptomys subterraneus inclui espécimes do Sul de São
Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul e Misiones na Argentina, e ganhou este nome por
abranger o Rio Grande do Sul, localidade-tipo de Hesperomys subterraneus. Este grupo
aparece como um clado basal aos outros grupos nas árvores filogenéticas, sendo
monofilético na árvore de MP com suporte de 58%, e mostram grande relação entre os
haplótipos do grupo na rede de haplótipos. Possui populações com tempos de expansão
antigos (τ=9.037 anos para MIS) e recentes (τ=938 anos para IGU). De acordo com os
dados das análises interpopulacionais, este grupo parece estar expandindo do sul para o
norte, sendo que a população da extremidade norte da distribuição deste grupo (IGU)
apresenta altos valores de distância genética com as populações dos outros grupos.
Dentro do grupo, a população de MAQ parece ser a mais divergente, baseado nos dados
de Φst par-a-par, embora as análises de Φst indiquem ausência de divergência desta
população com a população de MIS. O grupo de PIR aparece como um clado
monofilético nas árvores de MP e MV (Figura 5). Esse dado é congruente com os dados
de morfologia obtidos por Moreira (2007), que mostram uma variação nas amostras de
Piraquara em relação às outras populações. A designação de Thaptomys subterraneus
distinta de T. nigrita corrobora com a divisão proposta por Cabrera (1961) para
38
Thaptomys nigrita subterraneus e para Hesperomys subterraneus (Hensel 1873), um
táxon que foi subjugado pela ciência nos últimos 40 anos. Dessa forma, propomos que
Thaptomys subterraneus seja considerada uma unidade taxonômica significante.
Destacamos que análises adicionais são necessárias, principalmente relacionadas à
espécie-tipo, descrita como Hesperomys nigrita e que foi excluída da literatura sem
maiores explicações.
Sendo assim, baseados em dados moleculares, propomos a existência de quatro
unidades taxonômicas para o gênero Thaptomys: Thaptomys sp, com 2n=50 para o sul
da Bahia, Thaptomys nigrita para Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e norte
de São Paulo, Thaptomys sp2 para o centro e leste de São Paulo e Thaptomys
subterraneus para sul de São Paulo até o Rio Grande do Sul, incluindo o nordeste da
Argentina.
39
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APÊNDICE
Espécimes utilizados na análise da seqüência do gene citocromo b:
PAÍS - ESTADO: Município (coordenada geográfica): localidade: número de
identificação do exemplar (haplótipo).
Siglas referentes às coleções ou coletores: AC: Alexandre Christoff, LGA: Laboratório
de Genética Animal, UFES; MN: Museu Nacional, UFRJ; UFMG: Coleção de
Mamíferos do Departamento de Zoologia, Instituto de Ciências Biológicas,
ICB/UFMG; HGB: Helena de Godoy Bergallo; JAO: João Alves Oliveira; RP: Renata
Pardini; UP: Ulyses Pardinãs.
BRASIL – BAHIA: Una (15º18’S; 39º04’W): Fazenda Jueirana: UFMG 2017 (H3),
UFMG 2018 (H4), UFMG 2180 (H1), UFMG 2181 (H2); Reserva Biológica de
Una: UFMG 2019 (H5), RP 57 (H7), RP 65 (H8); Fazenda Bolandeira: UFMG
2020 (H6). ESPÍRITO SANTO: Santa Tereza (19º55'S, 40º36'W): Estação
Biológica de Santa Lúcia: LGA 77 (H9), LGA 81 (H9), LGA 83 (H9), LGA 93
(H10), LGA 94 (H9), LGA 98 (H11), LGA 102 (H12), LGA 105 (H11), LGA 111
(H9), LGA 116 (H11), LGA 117 (H13), LGA 127 (H14), LGA 703 (H12), LGA
997 (H13); Domingos Martins (20º22'S, 40º40'W): Parque Estadual Pedra Azul:
LGA 958 (H13), LGA 959 (H11), LGA 974 (H12), LGA 977 (H11); Dores do
Rio Preto (20º28’S, 41º49’W): Parque Nacional do Caparaó: LGA 1376 (H15),
LGA 1632 (H16), LGA 1635 (H11), LGA 1652 (H17), LGA 1678 (H18). MINAS
GERAIS: Delfim Moreira (22º30’S, 45º17’W): Fazenda da Onça: UFMG 1839
(H26); Passa Quatro (22º24'S, 44º59'W): Fazenda do Itaguaré: UFMG 1838
(H26); Ouro Preto (20º18’S, 43º31’W): UFMG 1851 (H25); Fervedouro
(20º43’S, 42º28’W): Fazenda Neblina: UFMG 1841 (H19), UFMG 1843 (H13),
UFMG 1846 (H20), UFMG 1847 (H21), UFMG 1848 (H22), UFMG 1849 (H24),
UFMG 1850 (H23). RIO DE JANEIRO: Itatiaia (22°23’S, 44°43’W): Parque
Nacional de Itatiaia: MN 48074 (H13), HGB 385 (H13). SÃO PAULO: São João
da Boa Vista (21°58´S, 46°47´W): Fazenda Santa Tereza: HGB DB 05 (H27);
Ibiúna (23º37’S, 46º56’W): Reserva de Morro Grande: Animal 54 (H29), Animal
45
66 (H28), Animal 155 (H30), Animal 162 (H31), Animal 167 (H32), Animal 169
(H31), Animal 193 (H33); Iguape (24º43’S, 47º33’W): CIT 204 (H35), CIT 260
(H36), CIT 261 (H35), CIT 320 (H37), CIT 324 (H35), CIT 325 (H36), CIT 330
(H36), CIT 332 (H36). PARANÁ: Piraquara (25º21’S, 49º04’W): Mananciais da
Serra: JAO 1020 (H38), JAO 1021 (H39), JAO 1024 (H40), JAO 1563 (H41),
JAO 1573 (H42), JAO 1575 (H42). RIO GRANDE DO SUL: Maquiné
(29°40’S, 50°34’W): AC 666 (H43), AC 667 (H44), AC 675 (H43), AC 679
(H43), LGA 323 (H45)
ARGENTINA – MISIONES: Valle del Arroyo Cunã Pirú (27°05’S, 54°57’W):
Reserva Privada de la UNLP: UP 149 (H46), UP 735 (H35), UP 736 (H35)