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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SISTEMAS NANOESTRUTURADOS OBTIDOS A PARTIR DE ÓLEO ESSENCIAL DE Citrus sinensis/ÁGUA

ESTABILIZADOS POR TENSOATIVO: AVALIAÇÃO ESTRUTURAL E POTENCIAL USO NO CONTROLE

LARVICIDA DO Aedes aegypti

SARAH GUERRA FERREIRA

SÃO CRISTÓVÃO/ SE Abril, 2014





Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito final à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

ORIENTADORA: PROFª. DRª. ROGÉRIA DE SOUZA NUNES CO-ORIENTADOR: PROF. DR. VICTOR HUGO V. SARMENTO

SÃO CRISTÓVÃO/ SE 2014

iii

LOMBADA

GUERRA, S.G.




2014

iv

FICHA CATALOGRÁFICA

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

F383s

Ferreira, Sarah Guerra Sistemas nanoestruturados obtidos a partir de óleo essencial

de Cítrus sinensis/água estabilizados por tensoativo : avaliação estrutural e potencial uso no controle larvicida do Aedes aegypti / Sarah Guerra Ferreira ; orientadora Rogéria de Souza Nunes. – São Cristóvão, 2014.

92 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)–Universidade Federal de Sergipe, 2014.

1. Farmacologia. 2. Aedes aegypti. 3. Cítrus sinensis. 4. Essências e óleos essenciais. 5. Emulsões. I. Nunes, Rogéria de Souza, orient. II. Título.

CDU 615.285:582.746.21

v





Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito final à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Aprovada em: 25/04/2014

__________________________________________ Orientadora: Profª Drª Rogéria de Souza Nunes

__________________________________________

1º Examinador: Prof. Dr. Antônio Arnóbio da Silva Júnior

__________________________________________ 2º Examinador: Profª. Drª. Francilene Amaral da Silva

PARECER

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

vi

À minha avó, Maria Arlinda

vii

RESUMO

Precursores de fase líquido-cristalina são sistemas estabilizados por tensoativos que podem conter substancias ativas como o óleo essencial de Citrus sinensis (OECS), apresenta atividade contra as larvas do Aedes aegypti (Ae. aegypti). Esses sistemas podem sofrer transição de fase em contato com meio aquoso e se transformar em agregados mais estruturados. Desse modo, o objetivo do trabalho foi obter e caracterizar sistemas nanoestruturados a partir da utilização de água/óleo estabilizados por tensoativo do tipo álcool graxo etoxilado e propoxilado (procetyl AWS®, PPG-5 CETETH-20) visando obter um sistema que, em contato com fluidos aquosos, se converta numa mesofase líquido-cristalina de alta viscosidade, com potencial aplicação no controle larvicida do Aedes aegypti. Primeiramente, os sistemas foram obtidos através da construção do diagrama de fases composto por água (A), PPG-5 CETETH-20: ácido oléico (AO) nas proporções 1:1 e 2:1 e OECS. Foi realizada a determinação da concentração micelar crítica (CMC) do PPG-5 CETETH-20 e das misturas PPG-5 CETETH-20: AO 1:1 e 2:1. Os sistemas escolhidos foram analisados através das técnicas de microscopia de luz polarizada (MLP), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), análise reológica, e avaliação da concentração letal média (CL50) frente a larvas do Ae. aegypti. O PPG-5 CETETH-20 exibiu CMC= 0,2 g/ L, PPG-5 CETETH-20:AO 1:1 CMC= 0,077 g/ L e 2:1 CMC= 0,0578 g/ L, indicando que existe um sinergismo entre o tensoativo e o cotensoativo para baixar a tensão superficial. Foram observadas quatro regiões distintas no diagrama 2:1, cristal líquido (CL), emulsão, microemulsão (ME) e separação de fases, sendo que no diagrama 1:1 não foi observada região de cristal líquido. Através das micrografias obtidas por MLP, foi possível diferenciar os sistemas isotrópicos, como MEs dos anisotrópicos, como CLs lamelares e hexagonais. As medidas de SAXS confirmaram as estruturas visualizadas por MLP, exibindo picos largos e de baixa intensidade para MEs (todas do diagrama 1:1 e seis amostras no diagrama 2:1), transição de fase e razão entre os picos de CL lamelar de 1:2:3 e 1:√3:√4 para o hexagonal. O estudo das propriedades reológicas demonstrou que os sistemas MEs e transição de fase são newtonianos e os CLs são não-newtonianos e que o aumento da fase aquosa aumenta o componente elástico dos CL. Para a atividade larvicida, as amostras A3 (15% A/ 5% OECS/ 80% PPG-5 CETETH-20: AO) e A4 (20% A/ 5% OECS/ 75% PPG-5 CETETH-20: AO) do diagrama 2:1 demonstraram CL50 6,55 ppm e 5,93 ppm, respectivamente, indicando que a microestrutura presente nesses sistemas corroborou para o aumento da solubilidade do óleo em meio aquoso. Desse modo, pode-se concluir que foram obtidos precursores de fase líquido-cristalina com potencial uso contra as larvas de Ae. aegypti. Palavas-Chave: Ae. aegypti, OECS, microemulsão, cristal líquido, precursor de fase.

viii

ABSTRACT

Liquid crystalline precursors are surfactant systems that can contain active substances as Citrus sinensis essential oil (CSEO) with exhibits biological activity against Aedes aegypti (Ae. aegypti) larvae. These systems can undergo into phase transition in aqueous solution and become more structured aggregates. Thereby, the aim of this work was to obtain and characterize nanostructured systems through water/ oil stabilized by polyoxypropylene (5) polyoxyethylene (20) cetyl ether (procetyl AWS®, PPG-5 CETETH-20) surfactant to obtain a system that in contact with aqueous fluids becomes a high viscosity liquid crystal mesophase with potential application on Ae. aegypti larvicidal control. First, the phase diagram was constructed in order to obtain the systems, composed by water, PPG-5 CETETH-20: oleic acid (OA) 1:1 and 2:1 and CSEO. There was performed critical micelle determination of PPG-5 CETETH-20, PPG-5 CETETH-20: OA 1:1 and 2:1. The systems were evaluated by polarized light microscopy (PLM), small angle X-ray scattering (SAXS), rheology and lethal concentration evaluation against Ae. aegypti larvae. PPG-5 CETETH-20 has shown CMC= 0,2 g/ L, PPG-5 CETETH-20: OA 1:1 CMC= 0,077 g/ L and 2:1 CMC= 0,0578 g/ L, indicating that there is a synergism between the surfactant and cosurfactant for lowering the surface tension. In the phase diagram 2:1, there were observed four regions: liquid crystal (LC), emulsion, microemulsion (ME) and phase separation, however in the 1:1 phase diagram, the LC region wasn’t observed. The microscopy distinguished isotropic systems like MEs from anisotropic as lamellae and hexagonal LCs. SAXS measurements confirmed PLM structures, with broad bands of low intensity for MEs (all samples from 1:1 and six samples from 2:1), phase transition and for lamellar LC structure, the positions of the peaks should obey the relationship 1:2:3 and 1:√3:√4 for hexagonal. The rheological analysis showed that ME and phase transitions ME-LC presents Newtonian behavior, while LC presents non-newtonian behavior and the increase of aqueous phase increases the LC elasticity modulus. The larvicidal activity the samples A3 (15% A/ 5% OECS/ 80% PPG-5 CETETH-20: AO) and A4 (20% A/ 5% OECS/ 75% PPG-5 CETETH-20: AO) of diagram 2:1 exhibited LC50 6,55 ppm and 5,93 pm, respectively, indicating that these systems microstructure has improved the oil solubility in aqueous medium. Thereby, it can be concluded that there were obtained liquid crystalline precursors with a potential use against Ae. aegypti larvae. Keywords: Ae. aegypti, CSEO, microemulsion, liquid crystal, liquid crystal precursor.

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mosquito Ae. aegypti (Fonte: CDC, 2012) ......................................... 21

Figura 2. a) Laranja-pêra e b) Vesícula do Óleo essencial de Citrus sinensis

(OECS) (Svoboda; Greenaway, 2003). ............................................................ 28

Figura 3. Representação química do D-limoneno. ........................................... 28

Figura 4. Representação da estrutura do tensoativo. ....................................... 30

Figura 5. Representação da formação de micelas. .......................................... 32

Figura 6. Representação esquemática das estruturas formadas por tensoativo.

Adaptado de Lawrence; Rees, 2012. ............................................................... 32

Figura 7. Representação das dimensões do tensoativo que influenciam no

Parâmetro de Empacotamento Crítico (PEC) para formar agregados com

determinada geometria. Adaptado de Israelachvili, 1994. ................................ 34

Figura 8. Tipos de geometrias formadas a depender do Parâmetro de

Empacotamento Crítico (PEC) do tensoativo. Adaptado de Israelachvili, 1994.

......................................................................................................................... 34

Figura 9. Representação de um diagrama de fases ternário dos componentes

A, B e C a temperatura constante. O ponto X apresenta 40% de A, 50% de B e

10% de C.......................................................................................................... 36

Figura 10. Representação esquemática de ME O/A, bicontínua e A/O

(Adaptado de Cunha Júnior et al., 2002). ......................................................... 37

Figura 11. Representação esquemática da classificação de Winsor. .............. 37

Figura 12. Tipos de cristal líquido. Adaptado de Lawrence; Rees, 2012; Shah et

al., 2001 ........................................................................................................... 40

Figura 13. Estrutura Química do Ácido oleico. ................................................. 46

Figura 14. Estrutura Química do PPG-5 CETETH-20. ..................................... 46

Figura 15. Tensão Superficial em função da concentração do tensoativo PPG-5

CETETH-20. ..................................................................................................... 54

Figura 16. Tensão Superficial em função da concentração da razão PPG-5

CETETH-20: AO 1:1. ........................................................................................ 55

Figura 17. Tensão Superficial em função da concentração da razão PPG-5

CETETH-20: AO 2:1. ........................................................................................ 55

Figura 18. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS/

Água ................................................................................................................. 57

x

Figura 19. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS/

Água ................................................................................................................. 57

Figura 20. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS

constante/ Água ............................................................................................... 59

Figura 21. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS

constante/ Água ............................................................................................... 59

Figura 22. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A1, A2, A3 e A4.

Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: A1:5%/5%/90%;

A2:10%/5%/85%; A3:15%/5%/80% e A4:20%/5%/75%. .................................. 60

Figura 23. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras B1, B2, B3 e B4.

Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: B1:5%/10%/85%;

B2:10%/10%/80%; B3:15%/10%/75% e B4:20%/10%/70%. ............................ 61

Figura 24. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras C1, C2 e C3.

Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: C1:5%/15%/80%;

C2:10%/15%/75% e C3:15%/15%/70%. .......................................................... 61

Figura 25. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A1, A2, A3 e A4.


A2:10%/5%/85%; A3:15%/5%/80% e A4:20%/5%/75%. .................................. 62

Figura 26. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A5, A6, A7, A8, A9

e A10. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: A5:25%/5%/70%;

A6:30%/5%/65%, A7:35%/5%/60%, A8:40%/5%/55%, A9:45%/5%/50% e A10:

50%/5%/45%. ................................................................................................... 63

Figura 27. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras B1, B2, B3, B4 e

B5. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: B1:5%/10%85%;

B2:10%/10%/80%; B3:15%/10%/75%; B4:20%/10%/70% e B5:25%/10%/65%.

......................................................................................................................... 64

Figura 28. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A3, B3 e C3.


B3:15%/10%/75%; C3:15%/15%/70% e C4:20%/15%/65%............................. 65

Figura 29. Curvas de SAXS das amostras A1, A2, A3 e A4 do diagrama PPG-5

CETETH-20:AO 1:1/ OECS constante/ Água. .................................................. 66

Figura 30. Curvas de SAXS das amostras B1, B2, B3 e B4 do diagrama PPG-5


xi

Figura 31. Curvas de SAXS das amostras C1, C2 e C3 do diagrama PPG-5


Figura 32. Curvas de SAXS das amostras A1 – A10 do diagrama PPG-5

CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água. ................................................. 68

Figura 33. Curvas de SAXS das amostras B1-B5 do diagrama PPG-5 CETETH-

20: AO 2:1/ OECS constante/ Água. ................................................................ 68

Figura 34. Curvas de SAXS das amostras C1-C4 do diagrama PPG-5

CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água. ................................................. 69

Figura 35. Reograma das amostras A1, A2, A3 e A4, curvas ascendentes e

descendentes ................................................................................................... 71

Figura 36. Reograma das amostras A5, A6 e A7, curvas ascendentes e

descendentes ................................................................................................... 72

Figura 37. Módulo elástico (G’) em função da tensão oscilatória das amostras

A5-A10 (1,0 Hz, 25 °C). .................................................................................... 73

Figura 38. Módulo elástico (G’) e de perda (G‖) em função da frequência das

amostras A5-A10 (0,5 Pa, 25 °C). .................................................................... 75

Figura 39. Tan δ em função da frequência das amostras A5-A10 (0,5 Pa, 25

°C). ................................................................................................................... 76

Figura 40. Fotografia do experimento da avaliação da concentração letal média

(CL50) frente a larvas de Ae. aegypti. ............................................................... 77

xii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Valores de EHL e a aplicação segundo Griffin (Holmberg et al.,

2002). ............................................................................................................... 33

Tabela 4. Valores da CMC e tensão superficial mínima (γCMC) para PPG-5

CETETH-20, PPG-5 CETETH-20: AO 1:1 e 2:1. .............................................. 56

Tabela 5. Parâmetros estruturais das formulações do diagrama PPG-5

CETETH-20: AO 1:1/ OECS constante/ Água .................................................. 67


CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água .................................................. 70

Tabela 7. Valores de índice de fluxo (n) e constante de consistência (K) para as

amostras A1-A10 do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 2:1............................ 73

Tabela 8. Valores de fase aquosa, tensão crítica (σ'c) e módulo elástico (G’). 74

Tabela 9. CL50 das amostras A3 e A4 frente às larvas de Ae. aegypti em L3/ L4,

após 24h de exposição. ................................................................................... 77

xiii

LISTA DE SÍMBOLOS OU NOMENCLATURA

( ) Função de espalhamento de uma partícula isolada

Média do raio de rotação das partículas

Área da cabeça polar do tensoativo

Distância média entre as partículas

Comprimento da cauda hidrofóbica do tensoativo

Vetor de espalhamento no máximo de intensidade de espalhamento

Viscosidade complexa

Densidade eletrônica da matriz

Densidade eletrônica das partículas

A Água

Ae. aegypti Aedes aegypti

C Número de componentes

C18H34O2 Fórmula química do ácido oleico

CLL Cristal Líquido liotrópico

CLs Cristais Líquidos

CLT Cristal líquido termotrópico

CMC Concentração Micelar Crítica

EHL Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo

EMs Emulsões

F Graus de liberdade do sistema

FID Detector de Ionização de chama

G Energia livre de superfície

G’ Módulo de armazenamento

G‖ Módulo de perda

H Entalpia do Sistema

H1 Mesofase hexagonal normal

H2 Mesofase hexagonal reversa

INCI International Nomenclature of Cosmetic Ingredient

L3/ L4 Terceiro a quarto estádio das larvas de Ae. aegypti

xiv

LADEF Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico

LNLS Laboratório Nacional de Luz Sincronton

LTA Laboratório de Tecnologias Alternativas

Lα Mesofase lamelar

MEs Microemulsões

MIs Micelas

MLP Microscopia de Luz Polarizada

MS Ministério da Saúde

O Óleo

OECS Óleo essencial de Citrus sinensis

OEs Óleos Essenciais

OMS Organização Mundial de Saúde

P Número de fases

PEC Parâmetro de Empacotamento Crítico

PPG-5 CETETH-20

Nome INCI do procetyl

RVL Região viscoelástica linear

S Entropia

SAXS Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo

SF Separação de Fases

T Temperatura

UFS Universidade Federal de Sergipe

Taxa de cisalhamento (s-1)

γ Tensão superficial

( ) Intensidade de espalhamento

Constante de consistência

Número de partículas por unidade de volume

( ) Função de estrutura

Volume da partícula

Fator de empacotamento

Índice de fluxo

xv

Vetor de espalhamento

Volume da porção hidrofóbica do tensoativo

Viscosidade em Pa.s

Tensão de cisalhamento (Pa)

Tensão Crítica (Pa)

Tan δ Tangente de δ

P:AO Procetyl: Ácido Oléico

γCMC Tensão superficial mínima

xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................. 18

2. REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................. 20

2.1. Dengue ..................................................................................... 20

2.1.1. Considerações Gerais ............................................................ 20

2.1.2. Epidemiologia ......................................................................... 23

2.1.3. Controle da dengue ................................................................ 25

2.2. Óleos Essenciais ..................................................................... 26

2.2.1. Aspectos Gerais ..................................................................... 26

2.2.2. Óleo Essencial de Citrus sinensis (L) Osbeck ........................ 27

2.3. Sistemas formados por tensoativos ...................................... 29

2.3.1. Tensoativos ............................................................................ 29

2.3.2. Diagramas de Fases .............................................................. 34

2.3.3. Microemulsões ....................................................................... 36

2.3.4. Cristais Líquidos ..................................................................... 39

2.3.5. Precursores de Fase .............................................................. 41

2.3.6. Técnicas de Caracterização ................................................... 41

2.3.6.1. Microscopia de Luz Polarizada ............................................ 41

2.3.6.2. Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo ........................... 42

2.3.6.3. Reologia ............................................................................... 43

2.3.7. Componentes ......................................................................... 45

2.3.7.1. Ácido Oléico ......................................................................... 45

2.3.7.2. Álcool cetílico propoxilado 5 OP etoxilado 20 OE ................ 46

3. OBJETIVOS .................................................................................... 47

3.1. Geral ......................................................................................... 47

3.2. Específicos .............................................................................. 47

4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................... 48

4.1. Materiais ................................................................................... 48

4.1.1. Reagentes e Solventes .......................................................... 48

4.1.2. Equipamentos ........................................................................ 48

xvii

4.2. Determinação da Concentração Micelar Crítica ................... 48

4.3. Obtenção dos sistemas através de diagrama de fases ....... 49

4.4. Caracterização dos sistemas obtidos ................................... 51

4.4.1. Microscopia de luz polarizada ................................................ 51

4.4.2. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo ............................... 52

4.4.3. Análise Reológica .................................................................. 52

4.2. Avaliação da concentração letal média (CL50) dos sistemas

selecionados frente a larvas de Ae. aegypti ............................................. 53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 54

5.1. Determinação da Concentração Micelar Crítica ................... 54

5.2. Obtenção dos Sistemas através do diagrama de fases ....... 56

5.3. Caracterização dos Sistemas ................................................. 60

5.3.1. MLP ........................................................................................ 60

5.3.2. SAXS ..................................................................................... 65

5.3.3. Análise Reológica .................................................................. 71


selecionados frente a larvas de Ae. aegypti ............................................. 76

6. CONCLUSÃO .................................................................................. 79

7. REFERÊNCIAS ............................................................................... 80

18

1. INTRODUÇÃO

A dengue é transmitida através de picadas da fêmea de mosquitos do

gênero Aedes infectada pelo vírus e está presente nas regiões tropicais e

subtropicais de todo o mundo (WHO, 2013). A transmissão tem aumentado

predominantemente em áreas urbanas e semi-urbanas e se tornou um dos

mais graves problemas de saúde pública internacional (WHO, 2013).

O controle do vetor, para prevenção da transmissão da dengue, se

apresenta como a principal opção de modo a reduzir o impacto da dengue na

população. As estratégias de controle incluem a eliminação e prevenção de

formação de criadouros, tratamento químico através da pulverização de

larvicidas, adulticidas, entre outros (Herrero et al., 2013; Vontas et al., 2012).

Diversos inseticidas químicos têm sido utilizados nos últimos anos e

desse modo controlando as populações dos mosquitos Aedes com sucesso

(Vontas et al., 2012). Em decorrência do uso de apenas algumas classes de

inseticidas (carbamatos, organoclorados, organofosforados e piretróides) pelos

órgãos responsáveis desde 1950, os vetores atualmente apresentam

resistência e assim comprometendo o sucesso das intervenções (Lumjuan et

al., 2005; Nkya et al., 2012; Rajatileka et al., 2011; Ranson et al., 2010; Zaim;

Guillet, 2002). Desse modo, diversos estudos têm sido realizados com o

objetivo de buscar novos métodos para controlar o vetor e a incidência da

dengue (Silva et al., 2008).

O uso de produtos naturais apresenta-se como alternativa viável para o

controle da dengue por serem biodegradáveis, seguros, economicamente

viáveis e alvo-específicos (Geris et al., 2012; Cavalcanti et al., 2004; Kumar et

al., 2011; Silva et al., 2008). Dentre os produtos naturais, estudos realizados

apontam os óleos essenciais (OEs) como potenciais candidatos. Espécies

vegetais como Citrus sinensis (Eozenu et al., 2001), Lippia sidoides (Carvalho

et al., 2003), Lippia gracilis (Silva et al., 2008), Mentha piperita (Kumar et al.,

2011), entre outras apresentaram atividade contra as larvas de Ae. aegypti.

O óleo essencial de Citrus sinensis (OECS) é extraído das cascas da

laranja pêra e é composto por uma mistura complexa de compostos naturais,

19

incluindo hidrocarbonetos terpênicos e compostos oxigenados, sendo seu

componente majoritário o D-limoneno, que varia de 68-98% e é responsável,

juntamente com os outros compostos, por suas atividades biológicas (Liu et al.,

2012; Bousbia et al., 2009; Svoboda; Greenaway, 2003).

Assim como a maioria dos OEs, o OECS é volátil e quimicamente instável

na presença de ar, luz, umidade e altas temperaturas, como também insolúvel

em água, dificultando assim seu uso direto (Jun-Xia et al., 2011). Santos (2012)

e Silva (2012) desenvolveram sistemas que apresentaram como objetivo a

proteção do OECS aos agentes externos e o aumento da sua solubilidade na

fase aquosa para ação contra larvas do Ae. aegypti.

Diversos estudos têm focado no uso de sistemas estabilizados por

tensoativos de modo a viabilizar o uso de diversas substâncias e fármacos

(Carvalho et al., 2013; Goddeeris et al., 2010; Hathout et al., 2010; Ren et al.,

2012). A mistura de tensoativo, óleo e água pode formar agregados com

diferentes estruturas como emulsões, micelas, microemulsões, cristais líquidos,

entre outros (Lawrence; Rees, 2012; Guo et al., 2010; Formariz et al., 2007).

Segundo Danielsson e Lindmanm (1981) as microemulsões (MEs) são

dispersões líquidas isotrópicas, transparentes, termodinamicamente estáveis,

usualmente formadas por água, óleo, tensoativo e/ ou cotensoativo. Cristais

líquidos (CLs) constituem uma fase distinta de estruturas condensadas, cujas

características os posicionam entre sólidos e fundidos (Hyde, 2001).

Os CLs são também chamados de mesofases e apresentam estruturas

unidimensionais, bidimensionais ou tridimensionais em escala nanométrica,

organizados em fases que podem variar de lamelar, hexagonal ou cúbica,

respectivamente (Hyde, 2001). Os CLs possuem alta viscosidade, e podem

promover uma liberação retardada das moléculas incorporadas em sua matriz,

sendo assim promissores sistemas de liberação (Mueller-Goymann; Hamann,

1993).

A depender da composição e características dos sistemas formados, é

possível estabelecer sítios lipofílicos e hidrofílicos em dimensões nanométricas.

Os sítios lipofílicos podem incorporar dos óleos essenciais, enquanto as

20

estruturas organizadas em escala nanométrica nas fases líquido-cristalinas

podem ser adequadas para reter os componentes do OE, estabelecendo um

possível controle de liberação. Por outro lado, considerando a composição dos

sistemas citados, a mesma favorece um bom nível de dispersão do OE em

meio aquoso, viabilizando seu uso para o controle das larvas do Ae. aegypti.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. Dengue

2.1.1. Considerações Gerais

A dengue é uma enfermidade causada por um arbovírus da família

Flaviviridae, do gênero Flavivírus. É transmitida por mosquitos do gênero

Aedes, especialmente pelas espécies Ae. aegypti e Ae. albopictus (Wright;

Pritt, 2012). O mosquito Ae. aegypti (Diptera: Culicidae) é o vetor primário da

dengue, como também o mais importante (Ashley, 2011; MS, 2011). Mede

menos de um centímetro, tem aparência inofensiva, cor café ou preta e listras

brancas no corpo e nas pernas.

Em todo o mundo, esse vírus apresenta quatro sorotipos distintos

causadores da dengue (DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4). A infecção por um

dos sorotipos promove imunidade ao mesmo após a recuperação, porém a

imunidade cruzada para os outros sorotipos é parcial e temporária. Infecções

subseqüentes pelos outros sorotipos aumentam o risco de desenvolver a forma

grave da doença (WHO, 2013).

O vírus é transmitido para os humanos através da picada da fêmea

infectada. Desse modo, os humanos infectados são os maiores portadores e

multiplicadores do vírus, servindo como fonte para transmissão do vírus a

mosquitos não-infectados. A transmissão para mosquitos não-infectados pode

ocorrer assim que aparecerem os primeiros sintomas no paciente. Depois de

um período de incubação do vírus de 4-10 dias, o mosquito infectado é capaz

de transmitir o vírus pelo resto de sua vida, o que pode ser alguns dias ou

semanas (CDC, 2012; WHO, 2013).

21

Diferente de outros mosquitos, Ae. aegypti apresenta hábitos diurnos e

noturnos, enquanto outros apresentam apenas hábitos noturnos. A fêmea do

Ae. aegypti pode picar diversas pessoas durante cada período de alimentação

(WHO, 2013). Outra diferença é que esse mosquito prefere desovar em

recipientes de armazenamento de água limpa, do que em lagoas ou valas, o

que leva ao predomínio desse tipo de mosquito em áreas urbanas (Decker,

2012; Gluber, 2001).

Três dias após a alimentação, os mosquitos depositam os ovos em locais

com pequenas quantidades de água limpa, sem a presença de matéria

orgânica em decomposição e sais. Em função disso, a água é ácida.

Normalmente, eles escolhem locais que estejam sombreados e em zonas

residenciais. Seus ovos são muito resistentes e sobrevivem vários meses até

que a chegada de água propicie a incubação, rapidamente se transformam em

larvas, que dão origem às pupas, das quais surge o adulto. O ciclo de vida

aquático pode durar apenas 7-8 dias (CDC, 2012; WHO, 2013).

Figura 1. Mosquito Ae. aegypti (Fonte: CDC, 2012)

A dengue é uma doença grave, semelhante à gripe, que afeta crianças,

jovens e adultos e raramente causa morte (WHO, 2013). Pode se apresentar

de quatro formas diferentes: infecção inaparente/ assintomática, dengue

clássica, dengue hemorrágica e síndrome de choque da dengue. Entre essas

formas, as mais comuns são a Dengue Clássico e a Hemorrágica (Ashley,

2011).

22

A OMS criou uma classificação para cada uma das infecções sintomáticas

relacionadas a dengue, apesar da classificação anterior ainda ser utilizada

(WHO, 2009):

Dengue provável: Esse tipo ocorre em pessoas que vivem ou viajaram

para locais onde a doença é endêmica. Os pacientes apresentam febre e

mais dois sintomas, como náuseas e vômitos, erupções cutâneas, dor e

desconforto, prova do laço positivo, leucopenia e algum dos sinais de

alarme;

Dengue sem sinais de alarme (dengue clássica): Deve ser feita a

confirmação através de testes laboratoriais, quando não há sinal de

extravasamento do plasma;

Dengue com sinais de alarme: Requer observação rigorosa e

intervenções médicas. Sinais: dor abdominal intensa e contínua, vômitos

persistentes, acúmulo de líquidos, hemorragias importantes (hematêmese

e/ou melena, sonolência e/ou irritabilidade, hepatomegalia e os exames

laboratoriais indicam o aumento repentino do hematócrito e queda

abrupta de plaquetas;

Dengue severa (Síndrome do choque da dengue): Choque, acúmulo de

líquido com desconforto respiratório, hemorragia severa, que deve ser

avaliada por um clínico, falência ou dano severo aos órgãos (coração, rins

e fígado, com aumento das enzimas alanina transaminase e aspartato

transaminase maior ou igual a 1000 U/L) e pode também comprometer a

consciência do paciente.

No ser humano, o vírus da dengue apresenta um período de incubação

de 4-7 dias após a picada do mosquito infectado. Deve ser suspeitado em

qualquer paciente com febre alta durante 2 semanas (Ashley, 2011). Além da

febre, os sintomas típicos são dor de cabeça, dor muscular, dor nas

articulações e nos olhos, glândulas inchadas, manchas vermelhas no corpo e

pode aparecer náusea e vômitos. A duração dos sintomas é de 10 dias (WHO,

2013; Wright; Pritt 2012).

23

Uma parte dos pacientes portadores dos sintomas da dengue clássica

pode progredir para a dengue hemorrágica do 3º-5º dia da doença. A forma

hemorrágica é caracterizada por hemorragias em virtude do sangramento de

pequenos vasos na pele e nos órgãos internos. Pode provocar hemorragias

nasais, gengivais, urinárias, gastrointestinais ou uterinas. Assim que os

sintomas de febre acabam, a pressão arterial do doente cai, o que pode gerar

tontura, queda e choque. Se a doença não for tratada com rapidez, pode levar

à morte (Ashley, 2011; Guzman, et al., 2010; Wright; Pritt 2012).

2.1.2. Epidemiologia

Os quatro tipos de vírus da dengue foram oriundos de macacos e assim

passaram para os humanos na África ou sudeste da Ásia de 100 a 800 anos

atrás. Até o século 20, era uma doença geograficamente restrita, porém após a

2ª Guerra Mundial os mosquitos Aedes foram transportados para todo o mundo

(CDC, 2012).

A dengue possui um padrão sazonal bem marcado no Brasil, com uma

maior circulação do vírus ocorrendo entre os meses de janeiro e julho, devido

ao regime pluviométrico observado nesse período (MS, 2010). Existem relatos

de casos de dengue no Brasil desde o ano de 1846 (Braga; Valle, 2007) e a

primeira epidemia documentada clínica e laboratorialmente ocorreu nos anos

de 1981 e 1982, em Boa Vista (RR), causada pelos sorotipos 1 e 4. A segunda

epidemia ocorreu no ano de 1986, atingindo o Rio de Janeiro e algumas

capitais da região nordeste. Desde então, a dengue vêm ocorrendo no Brasil

de forma continuada, intercalando-se com a ocorrência de epidemias,

geralmente associadas com a introdução de novos sorotipos na área e/ ou

alteração dos sorotipos predominantes (MS, 2009).

De 1986 até 1990, as epidemias de dengue eram restritas a alguns

estados das regiões Sudeste (Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais) e

Nordeste (Pernambuco, Alagoas, Ceará e Bahia). Inicialmente, foi identificado

o sorotipo DENV1 e, em 1990 o DENV2 foi introduzido e com ele deu-se início

24

à segunda grande epidemia, e assim os dois sorotipos passaram ambos a

circular intensa e simultaneamente no país (FUNASA, 1999).

A terceira epidemia apresentou seu pico em 1998, quando foram

registrados mais de 570 mil casos (FUNASA, 2001). No final do ano de 2000,

foi identificada pela primeira vez a circulação o sorotipo DENV3 no Rio de

Janeiro e, posteriormente, no Estado de Roraima, em novembro de 2001. Em

2002, ocorreu uma nova epidemia, refletindo a introdução do sorotipo, onde

foram confirmados cerca de 697.000 casos. Essa epidemia levou a uma rápida

dispersão do sorotipo DENV3 para outros estados, sendo que, em 2004, 23

dos 27 estados do país já apresentavam a circulação simultânea dos sorotipos

DENV1, DENV2 e DENV3 do vírus da dengue (MS, 2009).

O ano de 2008 foi marcado por um dos piores cenário da doença no

Brasil em relação ao total de internações e óbitos até o momento,

apresentando 585.769 casos notificados e novas epidemias causadas pelo

sorotipo DENV2 em diversos estados do país (MS, 2009). Apenas no Estado

do Rio de Janeiro, foram 158.000 casos notificados, cerca de 9.000 admissões

hospitalares e 230 mortes entre janeiro e abril (Barreto; Teixeira, 2008). Nesse

mesmo ano, no Estado de Sergipe, foram registrados 34.803 casos suspeitos

de dengue com 25.703 confirmações (CVE/SES, 2008).

No ano de 2009, o Estado de Sergipe apresentou 3.628 casos suspeitos

de dengue, com 595 casos confirmados (CVE/SES, 2009). Em 2010, foram

mais de 1.200.000 casos notificados no Brasil, como também houve um

aumento no número de casos mais graves que demandam internação

hospitalar (CONASS, 2011). O Estado de Sergipe registrou 1.440 casos

suspeitos de dengue, com 313 casos confirmados nesse mesmo ano

(CVE/SES, 2010).

O ano de 2011 houve uma diminuição quando comparado ao ano anterior

no Brasil, com cerca de 800.000 casos notificados, enquanto no estado de

Sergipe foram cerca de 4.000 casos (MS, 2013a). Em 2012, a dengue foi

classificada como a mais importante doença viral transmitida por mosquitos no

25

mundo (WHO, 2012b). Nesse ano, o Brasil apresentou cerca de 600.000 casos

notificados e o Estado de Sergipe registrou cerca de 5.000 casos (MS, 2013a).

No ano de 2013, foram registrados mais de 1,4 milhões casos da dengue

no país. A Região Sudeste foi responsável por 63,4% das notificações, o que

corresponde a 936.500 pessoas infectadas (MS, 2014a). No estado de Sergipe,

até o nono mês desse ano, foram notificados 1.845 casos e 357 confirmados

(MS, 2014a). No primeiro bimestre de 2014 foram registrados cerca de 87 mil

casos, uma redução de quase 80% quando comparado ao mesmo período no

ano de 2013 (MS, 2014b).

2.1.3. Controle da dengue

O controle do Ae. aegypti é alcançado basicamente através da eliminação

dos recipientes que são locais favoráveis a proliferação do mosquito, os quais

permitem o desenvolvimento da fase aquática do vetor (WHO, 2009).

Entretanto, alguns criadouros são pequenos, dispersos e difíceis de achar e

assim outras técnicas devem ser utilizadas para alcançar esses locais (Vontas

et al., 2012).

O controle químico consiste no uso de substâncias químicas (inseticidas)

nas fases larvária e adulta (MS, 2009). Esses inseticidas devem ser seguros,

custo-efetivos para uso na saúde pública e deve-se levar em consideração o

meio ambiente e as implicações do uso em ampla escala. Desse modo, as

intervenções químicas só devem ser consideradas quando necessário (WHO,

2006).

A maior parte dos programas de controle de vetores se baseia no uso de

inseticidas químicos através da pulverização de inseticidas de ação residual no

ambiente, aplicação de larvicidas químicos em caixas d’água e outros locais de

armazenamento de água limpa parada, bem como o uso de mosquiteiros

impregnados com inseticidas de longa duração (MS, 2009; Nkya et al., 2012;

Vontas et al., 2012).

Quatro classes de inseticidas ainda são amplamente utilizadas, os

organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides, porém o uso

26

dessas classes está ameaçado com a eminente resistência dos vetores (Nkya

et al., 2012; Ranson et al., 2010). Entre eles, estão o temefós

(organofosforado) edeltamertrina e permetrina (piretróides). O organoclorado

dicloro-difenil-tricloroetano (DDT) foi utilizado durante várias décadas para

controlar os vetores Aedes, porém atualmente é raramente utilizado (Vontas et

al., 2012).

Com o aumento da resistência aos inseticidas químicos, o controle

biológico vem sendo utilizado como alternativa. O uso de Bacillus thuringiensis

israelensis (Bti) e B. sphaericus vêm aumentado devido à demanda de

compostos seguros e específicos aos vetores (WHO, 2006). O Bti tem elevada

propriedade larvicida e seu mecanismo de atuação baseia-se na produção de

endotoxinas proteicas provocam a morte das larvas após sua ingestão (MS,

2009).

Devido à necessidade de descobrir novos métodos eficazes, seguros e de

baixo custo, estudos têm focado no uso de produtos naturais para uso no

controle do vetor da dengue. Esses produtos são derivados de plantas, sendo

eles os extratos, óleos essenciais, entre outros (Pitasawat et al., 2007; Santos

et al., 2012; Silva et al., 2008).

2.2. Óleos Essenciais

2.2.1. Aspectos Gerais

Os óleos essenciais (OEs) são misturas complexas de compostos

naturais e voláteis (Bakkali et al., 2007). Apresentam um papel importante na

proteção das plantas que os produzem, como antibacterianos, antivirais,

antifúngicos, inseticidas e inibem o apetite de herbívoros, como também atraem

alguns insetos para favorecer a polinização (Bakkali et al., 2008).

São extraídos de diversas plantas aromáticas, geralmente localizadas em

países onde o clima é temperado ou quente, onde representam um papel

importante na farmacopéia tradicional. São líquidos, voláteis, límpidos e

raramente coloridos, solúveis em lipídeos e solventes orgânicos, e de

densidade inferior que a da água. Podem ser sintetizados por todos os órgãos

27

das plantas, e são armazenados em células secretoras, cavidades, canais,

células epidérmicas ou tricomas glandulares (Bakkali et al., 2008).

Sua composição envolve uma mistura de 20 a 60 componentes em

diferentes concentrações. Apresentam de 1 a 3 componentes majoritários, com

concentrações variando de 20 a 70% do total do óleo, e os outros componentes

apresentando em quantidades relativamente baixas. Geralmente, os

componentes majoritários determinam suas propriedades biológicas (Bakkali et

al., 2008). Em sua composição química, apresentam substâncias terpênicas e

eventualmente fenilpropanóides, acrescidos de moléculas menores, como

álcoois, ésteres, aldeídos e cetonas de cadeia curta (Siani et al., 2000;

Sunburg; Panten, 2006).

Existem diversos métodos de extração de OEs, como prensagem a frio,

enfleurage, hidrodestilação, destilação a vapor, fluidos supercríticos, solventes,

turbodestilação, microondas, entre outros (Wenqiang et al., 2007). Contudo,

existe uma certa variação na composição dos OE a depender do método

utilizado (Okoh et al., 2010). Para obter OEs com composição constante,

devem ser extraídos nas mesmas condições, com mesma parte da planta, no

mesmo clima e estação do ano, pois podem haver variações na qualidade e

quantidade do produto obtido (Masotti et al., 2003; Angioni et al., 2006; Bakkali

et al., 2008).

São conhecidos aproximadamente 3000 óleos essenciais, os quais

podem apresentar diversas atividades biológicas, como antimicrobiana, anti-

neoplásica, antiviral, antiinflamatória, analgésica, antioxidante, inseticida e

larvicida (Buchbauer, 2010; Cavalcanti et al., 2004). Destes, 300 são utilizados

nas indústrias de medicamentos, alimentos, produtos de limpeza, perfumes e

cosméticos (Bakkali et al., 2007).

2.2.2. Óleo Essencial de Citrus sinensis (L) Osbeck

O Brasil é o maior produtor mundial de laranja, com 26% do mercado,

maior produtor de suco de laranja (53% do total) e maior exportador do suco

(85% do comércio internacional) (CITRUS BR, 2013). No Brasil, o estado de

São Paulo é o maior produtor e juntamente com o Triângulo Mineiro,

28

representam 80% da produção do país. Os demais produtores são Bahia,

Sergipe, Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina (Neves et al., 2010).

OECS é extraído da laranja-pêra através da hidrodestilação, extração por

fluido supercrítico, prensagem a frio, entre outros e está presente em vesículas

ou glândulas na casca dessa fruta (Bousbia et al., 2009; Liu et al., 2012). Os

principais componentes voláteis presentes nesse OE são compostos

terpênicos. Hidrocarbonetos mono e sesquiterpênicos juntamente com diversos

derivados oxigenados, como alcoóis, aldeídos, cetonas, ésteres e epóxidos são

os principais compostos (Jackson et al., 2002).

Figura 2. a) Laranja-pêra e b) Vesícula do Óleo essencial de Citrus sinensis (OECS) (Svoboda; Greenaway, 2003).

Seu componente majoritário é o D-limoneno, que varia de 68-98% e é

responsável, juntamente com os outros compostos de menor quantidade como

linalol, mirceno, α-pineno, entre outros, por suas atividades biológicas (Liu et

al., 2012; Sharma; Tripathi, 2008; Svoboda; Greenaway, 2003).É um

monoterpeno monocíclico, com odor semelhante a limão (Sun, 2007). Dentre

as propriedades biológicas, destacam-se a flavorizante, aromatizante,

inseticida e repelente (Hebeish et al., 2008).

Figura 3. Representação química do D-limoneno.

a

)

b

)

29

O OECS é utilizado como flavorizante em diversos produtos alimentícios,

incluindo bebidas alcoólicas ou não alcoólicas, balas, gelatinas, como também

na indústria farmacêutica, de modo a mascarar sabores desagradáveis de

certos fármacos. Na indústria de cosméticos e perfumaria, é utilizado em

diversas preparações (Bousbia et al., 2008). Também é utilizado em produtos

de limpeza e em pesticidas (Ezeonu et al., 2001; Sharma; Tripathi, 2008).

Apesar de ser amplamente utilizado em uma variedade de produtos,

apresenta limitações, como instabilidade a aquecimento, ar, umidade e luz e é

insolúvel em água (Liu et al., 2012). Estudos demonstram o uso de formulações

e sistemas de liberação para viabilizar o uso de OEs, como complexos de

inclusão com ciclodextrinas (Hădărugă et al., 2012; Liang et al., 2012),

lipossomas (Sinico et al., 2005; Wen et al., 2010), microencapsulação

(Banerjee et al., 2013; Jun-Xia et al., 2011), nanogel/ nanopartículas de

chitosana (Abreu et al., 2012; Hosseini et al., 2013), sistemas estabilizados por

tensoativos (Feitosa et al., 2009; Kim et al., 2009), entre outros.

Os sistemas estabilizados por tensoativos são bons candidatos para

veicular óleos voláteis, devido à propriedade de solubilização do óleo na fase

aquosa pelo filme interfacial do tensoativo e assim o OE estaria presente em

gotículas, microestruturas ou nanoestruturas, estando protegido dos agentes

externos que causam sua instabilidade (Kim et al., 2009; Zheng et al., 2011)

2.3. Sistemas formados por tensoativos

2.3.1. Tensoativos

Os tensoativos são substâncias constituídas por grupos lipofílicos (apolar)

e grupos hidrofílicos (polar), apresentando assim uma estrutura anfifílica,

representada na Figura 4 (Rosen, 2004). O grupo polar contém heteroátomos

como oxigênio, enxofre, nitrogênio e fósforo (O, S, N, P), como parte de um

grupo funcional como carboxilato, sulfonato, sulfato, amônio, fosfato, etc.

Grupos polares não-iônicos como hidroxila (-OH) ou éter (-O-) não são muito

polares e assim devem ocorrer diversas vezes para formar um grupo polar

adequado, como poliálcool ou poliéter. O grupo apolar é um hidrocarboneto do

30

tipo alquila ou alquila-arila, com 12 a 20 átomos de carbono (Oliveira, 2004;

Salager, 1994).

Figura 4. Representação da estrutura do tensoativo.

Os tensoativos podem ser classificados em iônicos (aniônicos e

catiônicos), não-iônicos ou zwiteriônicos (Rossi et al., 2006):

Tensoativos iônicos: Apresentam cargas elétricas na parte hidrofílica; ao

se dissociarem em água, formam íons carregados negativamente

(tensoativos aniônicos) ou positivamente (tensoativos catiônicos).

Tensoativos não-iônicos: Não apresentam íons quando em solução

aquosa e sua solubilidade em água se deve à presença de grupos

funcionais em suas moléculas que apresentam forte afinidade pela água.

Tensoativos zwiteriônicos: Em condições normais, apresentam tanto

carga aniônica como catiônica e às vezes são chamados de tensoativos

anfóteros (a depender do pH podem ser catiônicos, aniônicos ou

zwiteriônicos).

As substâncias tensoativas, em presença de água e óleo, adsorvem-se

nas interfaces orientando-se de maneira que o grupo polar fique voltado para a

fase aquosa e o grupo apolar para a fase oleosa, formando um filme molecular

ordenado nas interfaces, que reduz as tensões interfacial e superficial

(Lawrence; Rees, 2012; Prosser; Frances, 2001; Hunter, 1992; Atwood;

Florence, 1985). O termo interface indica a fronteira entre duas fases imiscíveis

quaisquer, já o termo superfície denota uma interface onde uma fase é um gás,

geralmente ar (Rosen, 2004).

A medida quantitativa da tendência à redução de superfície é a tensão

superficial, ou interfacial. A energia livre interfacial é a força mínima necessária

para criar a interface. A energia livre interfacial por unidade de área é o que se

31

mede na determinação da tensão interfacial entre duas fases, e é definida

como a força mínima necessária para criar unidades de área da interface ou

para expandir por unidade de área. A tensão interfacial também é a medida da

diferença da natureza de duas fases que se encontram na interface (Rosen,

2004).

A energia livre de superfície é uma função termodinâmica criada a fim de

auxiliar o estudo de sistemas submetidos a condições de temperatura e

pressão constantes. É a energia requerida (variação de energia) para trazer

moléculas do interior de uma fase para a interface, por unidade de área (Bastos

et al., 2011). A energia livre de superfície (G) é calculada pela diferença entre

a energia total associada ao sistema - sua entalpia - e a parcela de energia

indisponível à realização de trabalho dada sua associação com a entropia do

sistema:

Equação 1

Onde é a entalpia do sistema (É uma função de estado de um sistema

que reflete a capacidade de troca de calor do sistema com a vizinhança,

durante mudança de estado a pressão constante.), a temperatura e a

entropia (É uma função de estado que relaciona a capacidade de um sistema

de trocar calor por unidade de temperatura) (Bastos et al., 2011). Desse modo,

os tensoativos têm o papel de estabilizar sistemas compostos por água e óleo,

ao diminuir a tensão interfacial, reduzindo assim a energia livre de superfície

(Oliveira et al., 2004).

A concentração micelar crítica (CMC) é a característica mais importante

de um tensoativo, e significa a concentração mínima na qual o tensoativo em

solução aquosa ou oleosa começa a formar agregados esféricos, ou seja,

micelas (MI) (Figura 5) (Holmberg et al., 2002; Salager, 1994). Acima dessa

concentração, a solução aquosa fica saturada de moléculas de tensoativo e

estas formam grandes agregados moleculares de dimensões coloidais

(Moraes; Rezende, 2004).

32

Figura 5. Representação da formação de micelas.

Esse efeito pode ser observado pela redução da tensão superficial. A

tensão superficial é reduzida com o aumento da concentração de tensoativo

até o ponto da CMC, onde a tensão superficial se torna praticamente constante

(Holmberg et al., 2002). Essa diminuição da tensão se dá através da adsorção

das moléculas de tensoativo na interface até a saturação da solução, onde as

moléculas de tensoativo passam a ficar agregadas (micelização) (Salager,

1994).

Diversas estruturas de auto-associação podem ser formadas a partir da

mistura de tensoativo com água (A), óleo (O) ou ambos, as quais podem ser

estruturadas em escala micro ou macroscópica (Lawrence; Rees, 2012). Entre

elas estão micelas, microemulsões, emulsões (EMs), fase hexagonal (micelas

cilíndricas formando um hexágono), lamelar (bicamadas de moléculas de

tensoativos), normais (onde as cabeças polares do tensoativo estão voltadas

para a fase externa e as caudas para fase interna) ou reversas (cabeças

polares do tensoativo voltadas para fase interna e caudas para fase externa)

(Figura 6).

Figura 6. Representação esquemática das estruturas formadas por tensoativo. Adaptado de Lawrence; Rees, 2012.

33

Para formação dessas estruturas, dois parâmetros relativos aos

tensoativos devem ser levados em conta, o Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) e

o Parâmetro de Empacotamento Crítico (PEC). O conceito de EHL foi proposto

por Griffin em 1950, e leva em consideração a contribuição relativa das porções

hidrofílica e lipofílica da molécula de tensoativo (Holmberg et al., 2002;

Lawrence; Rees, 2012). Desse modo, conhecendo os valores de EHL dos

tensoativos é possível selecioná-los para determinada aplicação (Holmberg et

al., 2002). Na Tabela 1 é possível visualizar os valores de EHL e a aplicação.

Tabela 1. Valores de EHL e a aplicação segundo Griffin (Holmberg et al.,

2002).

Faixa de EHL Aplicação

3 – 6 Emulsificante A/ O

7 – 9 Umectante

8 – 14 Emulsificante O/ A

9 – 13 Detergente

10 – 13 Solubilizante

12 – 17 Dispersante

Em contrapartida, o PEC relaciona a habilidade dos tensoativos a formar

determinados agregados com a geometria molécula do tensoativo. É a medida

da geometria preferencialmente adotada pelo tensoativo, como conseqüência é

uma previsão dos tipos de agregados nos quais ele pode se organizar

(Lawrence; Rees, 2012; Damasceno et al., 2010). Pode ser calculado através

da seguinte equação:

Equação 2

Onde é o volume da porção hidrofóbica do tensoativo, é área da

cabeça polar do tensoativo e é comprimento da cauda hidrofóbica do

tensoativo (Figura 7) (Manohar; Narayanan, 2012).

34

Figura 7. Representação das dimensões do tensoativo que influenciam no Parâmetro de Empacotamento Crítico (PEC) para formar agregados com determinada geometria. Adaptado de Israelachvili, 1994.

A geometria dos agregados formados depende de determinados fatores

como natureza da molécula anfifílica e condições da solução (concentração,

temperatura, pH, salinidade, entre outras) (Brandão, 1999). Tensoativos de

cadeia simples com grandes áreas de cabeça polares formam micelas

esféricas (PEC < 1/3). Tensoativos de cadeia simples comáreas de cabeça

polar intermediárias (1/3 < PEC < 1/2) formam micelas cilíndricas. Tensoativos

de cadeias duplas com áreas de cabeça polar grandes formam bicamadas

flexíveis ou vesículas (1/2 < PEC < 1). Tensoativos de cadeias duplas

comáreas de cabeça polar pequenas formam bicamadas planares (PEC = 1).

Tensoativos de cadeias duplas com áreas de cabeça polar pequenas (PEC >

1) formam micelas inversas (Figura 8) (Brandão, 1999; Holmberg et al., 2002).

Figura 8. Tipos de geometrias formadas a depender do Parâmetro de Empacotamento Crítico (PEC) do tensoativo. Adaptado de Israelachvili, 1994.

2.3.2. Diagramas de Fases

Os diagramas de fases são representações gráficas das fases presentes

em um sistema em função da temperatura, pressão e composição. Em sua

maioria são obtidos em condições de equilíbrio e são usados para entender e

35

prever o comportamento dos materiais (Caram-Júnior, 2000). Podem ser de

substâncias puras, binários, ternários ou pseudo-ternários (Holmberg et al.,

2002; Rosen, 2004).

Gibbs em 1876 elaborou a regra das fases, a equação que determina o

número de variáveis independentes do sistema (Equação 3). Essa regra

estabelece o aspecto geral do diagrama de fases e expressa a relação

genérica entre os graus de liberdade (F) de um sistema, o número de fases (P)

e o número de componentes (C) no equilíbrio para qualquer sistema. Grau de

liberdade (F) é o número de variáveis de estado intensivas que podem ser

variadas independentemente, sem perturbar o número de fases em equilíbrio

(Bastos et al., 2011; Holmberg et al., 2002).

Equação 3

Quando se trabalha a temperatura constante, é comum representar o

comportamento de fase em triângulos de Gibbs, representado na figura 9

(Holmberg et al., 2002). Para os sistemas estabilizados por tensoativos, é

possível descrever as mudanças que se produzirão a partir das variações nas

concentrações dos componentes utilizando diagramas de fases ternários,

composto por três componentes em cada vértice do triângulo (água, óleo e

tensoativo) e pseudo-ternários quando quatro componentes ocupam os três

vértices do triângulo (água, óleo, tensoativo e cotensoativo) (Oliveira et al.,

2004).

Num diagrama pseudo-ternário, é possível delimitar as regiões de CL,

EM, ME, separação de fases, e sistemas afins (Rosen, 2004). Cada vértice do

triângulo representa 100% do componente (água, óleo, tensoativo/

cotensoativo) (Oliveira et al., 2004).

36

Figura 9. Representação de um diagrama de fases ternário dos componentes A, B e C a temperatura constante. O ponto X apresenta 40% de A, 50% de B e 10% de C.

2.3.3. Microemulsões

Microemulsões são sistemas translúcidos compostos por dois líquidos

imiscíveis estabilizados por um filme interfacial de tensoativo ou mistura de

tensoativos, frequentemente combinado com cotensoativo (Fanun, 2012). São

termodinamicamente estáveis e possuem natureza isotrópica (Hathout;

Woodman, 2012). Apresentam grande potencial como sistemas de liberação de

substâncias bioativas, pelas propriedades de solubilizar substâncias hidrofílicas

em meio lipofílico ou lipofílica em meio aquoso e anfifílico na interface óleo/

água (Oliveira et al., 2004).

Esses sistemas podem ser classificados em água/ óleo (A/O), bicontínua

ou óleo/ água (O/A) (figura 10), a depender da microestrutura, a qual é

influenciada pelas suas propriedades físico-químicas e proporção dos

componentes (Fanun, 2009). As gotículas são geralmente representadas como

esféricas, mas podem ter formato assimétrico, frequentemente assumindo o

formato de elipsóide. A presença de gotículas A/ O geralmente ocorre em ME

onde a fração da fase oleosa é baixa, enquanto O/ A geralmente quando a

fração da fase aquosa é baixa. Nas MEs bicontínuas, as fases oleosa e aquosa

37

formam uma estrutura contínua, na presença de uma interface estabilizada por

tensoativo (Lawrence; Rees, 2012).

Figura 10. Representação esquemática de ME O/A, bicontínua e A/O (Adaptado de Cunha Júnior et al., 2002).

Em 1948, Winsor propôs uma classificação que define os equilíbrios

existentes entre a fase microemulsionada e as fases aquosa e oleosa (Figura

11). São eles: 1) Winsor I, representado pelo equilíbrio entre a fase

emulsionada e excesso da fase oleosa, que posiciona-se acima da emulsão

por possuir densidade menor que a emulsão; 2) Winsor II, representando o

equilíbrio entre a fase emulsionada e fase aquosa em excesso, que posiciona-

se abaixo da fase emulsionada; 3) Winsor III, onde existem três fases em

equilíbrio, óleo na fase superior, emulsão na intermediária e água na inferior; 4)

Winsor IV, onde apenas existe a fase microemulsionada, um sistema

homogêneo e monofásico (Formariz et al., 2005).

Figura 11. Representação esquemática da classificação de Winsor.

Existem três tipos de abordagens que têm sido utilizadas para explicar o

processo de formação e estabilidade das MEs: a teoria da solubilização, teoria

da tensão interfacial e a teoria termodinâmica (Lawrence; Rees, 2012;

38

Damasceno et al., 2011). Considera-se que a energia livre de formação de ME

depende de quanto o tensoativo reduz a tensão interfacial O/A e a variação na

entropia do sistema. Uma energia livre de formação é alcançada quando

grandes reduções na tensão superficial são acompanhadas por variação

favorável na entropia. Nesses casos, o processo de microemulsificação é

espontâneo e a dispersão resultante é termodinamicamente estável (Lawrence;

Rees, 2012).

Um único tensoativo geralmente não é suficiente para formar uma ME, e

se faz necessário a combinação com um cotensoativo, que altera a capacidade

do tensoativo para formação de ME (Djekic et al., 2011). A adição do

cotensoativo reduz a energia livre na interface e tensão através da penetração

no filme de tensoativo, como também alteram o valor do EHL para um valor

ótimo e adequado para formação de MEs (Damasceno et al., 2011; Formariz et

al., 2005).

O EHL leva em consideração a contribuição relativa da fração hidrofílica e

hidrofóbica da molécula do tensoativo (Damasceno et al., 2011). Tensoativos

com baixo EHL (3-6) favorecem a formação de MEs A/O, enquanto os que

possuem alto EHL (8-18) favorecem a formação de MEs O/A. Tensoativos com

EHL maior que 20 geralmente necessitam da presença de cotensoativos para

diminuir o valor do EHL na faixa exigida para formação de ME (Lawrence;

Rees, 2012).

Os sistemas microemulsionados são capazes de solubilizar fármacos ou

substâncias ativas nas gotículas da fase interna, onde os compostos lipofílicos

podem ser incorporados em ME O/A, enquanto os hidrofílicos em ME A/O

(Formariz et al., 2005). Desse modo, esses sistemas melhoram a solubilização

dos fármacos e substâncias ativas em meio hidrofílico ou lipofílico, como

também os protegem de hidrólise enzimática, além de aumentar a absorção

devido à presença do tensoativo na formulação (D’Cruz; Uckun, 2001).

Como vantagens, os sistemas de ME apresentam estabilidade

termodinâmica, facilidade de preparação, baixa viscosidade, alta capacidade

de incorporação de fármacos ou substâncias ativas, pequeno tamanho de

39

gotícula e apresentam liberação modificada (El Maghraby, 2008). Esses

sistemas usualmente estão sujeitos a sofrer transição de fase com diluição da

fase aquosa ou evaporação de algum constituinte volátil. Esse efeito pode

modificar o comportamento de fase dos sistemas, assim como gerar sistemas

com diferentes viscosidades (Alany et al., 2001; El Maghraby, 2010).

2.3.4. Cristais Líquidos

Cristais Líquidos (CLs) são sistemas que apresentam estrutura cristalina

que combina as propriedades dos estados líquido e sólido (Zheng et al., 2011).

Desse modo, são também chamados de mesofases, por apresentar essa

característica de fase intermediária (Hyde, 2001).

Os CLs podem ser classificados em Liotrópicos (CLL) e Termotrópicos

(CLT), enquanto os materiais que demonstram ambas as propriedades

apresentam mesomorfismo (Hyde, 2001). CLT são mesofases em que sua

estrutura está em função da temperatura. Acontece nos casos em que um

material quimicamente puro derrete em uma faixa de temperatura, e durante a

fusão ocorre a formação de CLs (Hyde, 2001).

CL liotrópicos são mesofases compostas por pelo menos duas moléculas,

uma anfifílica e um solvente (Guo et al., 2010). Um solvente hidrofílico como a

água, hidrata as cabeças polares da molécula de tensoativo através de

ligações de hidrogênio, enquanto as caudas apolares se agregam em regiões

hidrofóbicas, através das interações de Van der Waals (Libster et al., 2011).

Sua estrutura interna é caracterizada por regiões hidrofílicas e hidrofóbias,

onde podem ser incorporadas substâncias hidrofílicas e lipofílicas (Zheng et al.,

2011). Ao contrário dos CLT, possuem um grau de liberdade de concentração,

que os permite formar uma variedade de estruturas (Zheng et al., 2011). Os

CLLs podem ser classificados em mesofases lamelares, cúbicas e hexagonais

(Figura 12). As mesofases lamelares e hexagonais são anisotrópicas, enquanto

as cúbicas são isotrópicas (Guo et al., 2010; Zheng et al., 2011).

40

Figura 12. Tipos de cristal líquido. Adaptado de Lawrence; Rees, 2012; Shah et al., 2001.

As mesofases lamelares (Lα) são as mais comuns de se encontrar, e sua

estrutura ideal consiste em bicamadas paralelas e planares de moléculas de

tensoativo, separadas por camadas de solvente, formando uma estrutura

unidimensional. Quando submetidas à luz polarizada, apresentam cruzes de

malta, cordões ou uma textura semelhante a um mosaico. Os padrões de

Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) são caracterizados pela

razão 1:2:3 entre os picos de espalhamento, característicos de bicamadas

(Hyde, 2001).

Já as mesofases hexagonais consistem em um denso empacotamento de

micelas cilíndricas, arranjadas em uma estrutura bidimensional. São

geralmente identificadas pela textura tipo leque observada através da luz

polarizada. Pode apresentar-se como hexagonal direta (H1), as moléculas do

tensoativo se agrupam em micelas cilíndricas circulares, com água

preenchendo o volume entre os cilindros, enquanto na fase hexagonal indireta

(H2), os cilindros contém canais de água circundados pelas cabeças polares do

tensoativo e a porção oleosa localizada ao redor dos cilindros. Os picos de

espalhamento apresentam a razão 1:√3:√4, através das análises de SAXS

(Hyde, 2001; Ezrahi et al., 1999).

As mesofases cúbicas exibem a organização espacial mais complexa dos

CLLs (Amar-Yuli et al., 2009). São caracterizadas por uma bicamada lipídica

bicontínua, por onde passam canais aquosos em escala nanométrica,

formando estruturas tridimensionais (Guo et al., 2010). Não apresentam textura

óptica, quando submetidos à luz polarizada apresentam-se como isotrópicos

(Amar-Yuli et al., 2009).

41

2.3.5. Precursores de Fase

Mueller-Goymann; Hamann (1993) abordaram pela primeira vez o

conceito de transição de fase in situ, e em seu estudo observaram que

soluções micelares reversas como veículo para o fármaco lidocaína sofreram

transição de fase para um sistema de CL após entrar em contato com água,

que demonstrou uma taxa de liberação sustentada.

Os precursores de fase são sistemas sensíveis a estímulo, que

apresentam transição de fase em resposta a algum estímulo físico ou químico,

como alterações na temperatura, pH, força iônica, conteúdo aquoso, etc (Wei

et al., 2002). Esses sistemas são utilizados quando a fase que é almejada

apresenta alguma limitação quanto ao seu uso convencional, como dificuldade

de aplicação (Carvalho et al., 2013; El Maghraby, 2010; Ren et al., 2012).

2.3.6. Técnicas de Caracterização

2.3.6.1. Microscopia de Luz Polarizada

A técnica de Microscopia de Luz Polarizada (MLP) é utilizada para

determinar a isotropia óptica dos sistemas e mesofases (Hyde, 2001). Fornece

imagens da estrutura interna de cristais, permitindo a determinação das

propriedades cristalográficas do cristal (Carlton, 2011). É baseada na

birrefringência de materiais, a medida da diferença nos índices de refração.

Sistemas isotrópicos, como micelas, MEs e CLs de fase cúbica, são sistemas

que o índice de refração é igual em todas as direções, independente da luz

incidente. Desse modo, não interagem com a luz polarizada, demonstrando um

campo escuro (Carlton, 2011; Hyde, 2001).

Por outro lado, sistemas anisotrópicos, como CLs lamelares e

hexagonais, apresentam eixos cristalográficos distintos, e interagem com a luz

de maneira que é dependente da orientação da luz incidente (Carlton, 2011).

Apresentam mais de um índice de refração, que permitem a transmissão de

parte da luz polarizada incidente (Hyde, 2001).

Com a transmissão de luz, imagens com diferentes texturas

birrefringentes são formadas, e é possível diferenciar os CLs Lα dos CLs H1. A

42

textura de Lα geralmente se apresenta como cordões ou tipo mosaico, mas

também pode apresentar cruzes de malta (Hyde, 2001). Já os H1 apresentam

textura tipo leque ou estriada (Zheng et al., 2011).

2.3.6.2. Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo

A técnica de Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) é uma das

ferramentas experimentais mais utilizada para caracterização estrutural

detalhada de sistemas de matéria condensada desordenada (Diat et al., 1998;

Pedersen, 1999). É baseada na interação da radiação (raios-X) com a matéria

e é dependente da densidade eletrônica do material a ser estudado (Craievich,

2002). Com essa técnica pode-se determinar a estrutura e tamanho dos

agregados assim como as interações que ocorrem entre eles (Pedersen, 1999).

A intensidade de espalhamento de raios-X é experimentalmente

determinada como uma função do vetor de espalhamento . Sistemas

isotrópicos produzem uma intensidade de espalhamento que depende apenas

do módulo de . A intensidade pode ser calculada pela seguinte equação

(Craievich, 2002):

( ) ( ) ( ) Equação 4

Onde ( ) é a função de espalhamento de uma partícula isolada e ( ) é

a função de estrutura. Para sistemas compostos de tensoativo, água e óleo, em

concentrações abaixo da CMC do tensoativo a intensidade do SAXS é

semelhante ao observado para partículas diluídas e monodispersas (Craievich,

2002; Formariz et al., 2007).

No caso de partículas quase homogêneas, o formato do pico de ( )

corresponde á função de estrutura ( ). A análise semi-quantitativa dos dados

de espalhamento resulta no parâmetro estrutural, , que corresponde à

distância média entre as partículas, sejam elas micelas esféricas, cilíndricas ou

lamelas (Equação 5) (Craievich, 2002; Zheng et al., 2011).

43

Equação 5

Onde é o valor de de maior intensidade de espalhamento.

Para partículas de ME ou MI, as curvas de SAXS se apresentam como

um amplo pico associado a baixa correlação espacial 3D. Para esses casos,

uma função de estrutura é proposta como modelo da intensidade de

espalhamento produzida por um denso conjunto de partículas esféricas

(Formariz et al., 2007).

Em concentrações de tensoativo de média a alta, os sistemas são mais

estruturados que os de baixa concentração. As moléculas de tensoativo se

agregam e formam pequenos domínios cristalinos orientados aleatoriamente,

com correlação espacial 1D, 2D ou 3D, com valores específicos de picos de

Bragg (Formariz et al., 2007). Para CL lamelares, a razão entre os picos é de

1:2:3 e assim por diante, enquanto para os hexagonais, a razão é de 1:√3:√4

(Hyde, 2001).

2.3.6.3. Reologia

O conceito de reologia foi proposto por Bingham em 1929, é o estudo das

propriedades de deformação e escoamento da matéria, ou seja, a reologia

analisa as respostas de um material quando submetido a tensões e

deformações (Tanner; Walters, 1998). Viscosidade ( ) é a medida da

resistência de um fluido quando submetida a uma tensão. Quanto mais viscoso

um determinado material, mais difícil de escoar e assim maior o seu coeficiente

de viscosidade (Mcdonagh, 2010).

Equação 6

Onde é a viscosidade em Pa.s, corresponde à tensão de cisalhamento

(Pa) e taxa de cisalhamento (s-1).

A correlação entre tensão de cisalhamento e taxa de cisalhamento define

o comportamento reológico de um fluido. Podem ser encontrados materiais

44

com comportamento newtoniano ou não newtoniano. Nos fluidos newtonianos,

seguem a lei de Newton, expressa na Equação 7. Esses fluidos apresentam

uma relação de proporcionalidade entre a taxa e tensão de cisalhamento e

assim apresentam viscosidade constante (Pedro, 2009).

Equação 7

Já nos fluidos não-newtonianos, não existe essa relação de

proporcionalidade e a viscosidade é alterada em função da taxa de

cisalhamento (Equação 8). Fluidos não newtonianos podem ser dependentes

ou não do tempo. Os independentes do tempo são pseudoplásticos (diminui a

viscosidade com a taxa de cisalhamento), dilatantes (aumenta viscosidade com

a taxa de cisalhamento) e plásticos (diminui a viscosidade com a taxa de

cisalhamento após atingir uma tensão mínima para o cisalhamento). Os

dependentes do tempo são os tixotrópicos e reopéticos (Lahoud; Campos,

2010).

Equação 8

Onde é a constante de consistência ou viscosidade aparente e índice

de fluxo. Se =1, o sistema é newtoniano, <1, pseudoplástico, >1, dilatante.

Para sistemas plásticos, existe um modelo apropriado, de Herschell Buckley,

que leva em consideração a tensão mínima crítica de escoamento ( ).

Análises reológicas são as técnicas mais utilizadas para caracterização

de estruturas a nível macroscópico (Gosenca et al., 2013). No caso de MEs e

CLs, as propriedades reológicas dependem no tipo, forma e quantidades de

agregados presentes, assim como as interações entre esses agregados

(Acharya; Hartley, 2012).

Sistemas isotrópicos, como ME e micelas apresentam uma baixa

viscosidade e comportamento geralmente newtoniano, devido ao pequeno

tamanho de gotícula e baixa interação entre as gotículas (Santana et al., 2012).

Alterações estruturais e transições de fase nas MEs refletem na reologia. MEs

45

bicontínuas exibem o comportamento newtoniano em baixas a médias taxas de

cisalhamento, enquanto MEs descontínuas apresentam em taxas de

cisalhamento mais altas. Contudo, a diferenciação não é possível apenas com

as análises reológicas e outras técnicas são utilizadas em associação

(Acharya; Hartley, 2012).

Sistemas de CL apresentam alta viscosidade e comportamento não

newtoniano (Chorilli et al., 2011). Por serem sistemas viscoelásticos, que

apresentam características de sólidos elásticos e fluidos viscosos, esses

sistemas são submetidos à varredura de freqüência. Desse modo, a região

viscoelástica linear (RVL) pode ser definida, como também as curvas de

freqüência com os parâmetros viscoelásticos, módulo de armazenamento (G’),

módulo de perda (G‖) e viscosidade complexa ( ) (Gosenca et al., 2013).

G’ é a habilidade do material de armazenar energia, enquanto G‖ é a

habilidade do material de dissipar energia. Se G‖>G’, o material apresenta

comportamento de um líquido viscoso, tal como sóis e outras dispersões. Se

G’>G‖, o sistema apresenta comportamento de um sólido elástico, tal com um

gel. Em contrapartida, se G‖=G’ o material está na transição (Cruz et al., 2008).

A tensão crítica (σc) marca a transição de comportamento gel para sol, é a

tensão máxima que o material suporta ainda no regime elástico de deformação,

se houver algum acréscimo de tensão o material começa a sofrer deformação

plástica (Duffy, 2012).

2.3.7. Componentes do sistema

2.3.7.1. Ácido Oléico

É o componente majoritário de diversos óleos presentes em sementes de

plantas. É o ácido graxo insaturado mais abundante na natureza e é utilizado

comercialmente na preparação de oleatos e loções, como um solvente

farmacêutico (Soto-Guzman et al., 2013). É um líquido incolor ou levemente

amarelado, de fórmula química C18H34O2, massa molecular 282.5 g/ mol,

densidade 0.891 g/ mL. É insolúvel em água e facilmente oxidável. Seu EHL

calculado segundo a fórmula de Davies é 1,025 (Holmberg et al., 2002).

46

Figura 13. Estrutura Química do Ácido oleico.

2.3.7.2. Álcool cetílico propoxilado 5 OP etoxilado 20 OE

Conhecido comercialmente por Procetyl AWS® é um tensoativo não

iônico amplamente utilizado, um derivado alcoxilado cetílico (Croda, 2010). Seu

nome químico é álcool cetílico propoxilado 5 OP etoxilado 20 OE e seu nome

INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredient) é PPG-5 CETETH-20

(BPI LABS, 2013). É um líquido incolor, solúvel em água e etanol, EHL = 16,

densidade relativa 1,050 g/ mL (Croda, 2010). A concentração usual de uso é

de 0,5-5%, é um não irritante primário e não sensibilizante (Croda, 2010;

Mapric, 2007). Possui excelente propriedade emoliente, é utilizado em

cosméticos como emulsionante, agente molhante, solubilizante e plasticizante

(Croda, 2010).

Figura 14. Estrutura Química do PPG-5 CETETH-20.

47

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Obter e caracterizar sistemas nanoestruturados a partir da utilização de

água/óleo estabilizados por tensoativo do tipo álcool graxo etoxilado e

propoxilado visando obtenção de um sistema que, em contato com fluidos

aquosos, se converta em uma mesofase líquido-cristalina de alta viscosidade,

com potencial aplicação no controle larvicida do Ae. aegypti.

3.2. Específicos

Estabelecer a capacidade de solubilização da água pela mistura de

tensoativo/ cotensoativo;

Obter as microemulsões e as mesofases contendo óleo essencial de

Citrus sinensis (L.) Osbeck;

Verificar a característica óptica dos sistemas;

Avaliar o efeito do conteúdo aquoso na estrutura dos sistemas;

Caracterizar a estrutura dos sistemas obtidos;

Avaliar a concentração letal média (CL50) frente a larvas de Ae. aegypti.

48

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Materiais

4.1.1. Reagentes e Solventes

Ácido Oléico Sigma como cotensoativo;

Água purificada obtida a partir de sistema Milli-Q®;

Água Mineral;

Óleo essencial de Citrus sinensis (OECS), extraído no Laboratório de

Desenvolvimento Farmacotécnico (LADEF);

PPG-5 CETETH-20 (Procetyl AWS®) como tensoativo;

4.1.2. Equipamentos

Agitador Magnético;

Clevenger modificado;

Estufa com circulação e renovação de ar MARCONI®

Microscópio Olympus BX-51;

Moinho de Facas SOLAB®;

Reômetro AR2000ex TA Instruments;

Tensiômetro Attension modelo Sigma 700.

4.2. Determinação da Concentração Micelar Crítica

O experimento de determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC)

foi realizado pelo método da placa de Wilhelmy, utilizando um tensiômetro

Attension modelo Sigma 700, no Laboratório de Biotecnologia Ambiental do

Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de Sergipe.

Para realização do experimento, a água foi usada como padrão, e sua tensão

49

superficial foi previamente medida (γ = 72,00 mN/m). Em seguida, preparou-se

uma solução aquosa inicial de 0,5 g/L para o tensoativo PPG-5 CETETH-20 e

para as misturas PPG-5 CETETH-20: ácido oleico 1:1 e 2:1 e a partir destas

foram realizadas diluições em água e foram submetidas a leitura no

equipamento. O experimento foi realizado em triplicata para cada ponto de

diluição. Os valores de tensão superficial (mN/m) foram determinados em

função das concentrações de tensoativo (g/L).

4.3. Obtenção dos sistemas através de diagrama de fases

Os diagramas de fase pseudo-ternários foram constituídos por: PPG-5

CETETH-20, ácido oleico (AO), OECS e água. Dois diagramas foram

construídos, variando a razão entre o PPG-5 CETETH-20 (tensoativo) e o AO

(cotensoativo), sendo 1:1 e 2:1. Inicialmente, o PPG-5 CETETH-20 e o AO nas

razões de 1:1 e 2:1 foram misturados sob agitação magnética durante 1h até

completa homogeneização.

Para construção do diagrama de fase, proporções específicas de PPG-5

CETETH-20: AO e OECS foram adicionadas a um béquer, misturadas por

agitação magnética, a temperatura ambiente. Após um período de 20 min, a

fase aquosa foi adicionada às misturas ainda sob agitação, de acordo com as

proporções determinadas, também a temperatura ambiente. Após completa

homogeneização, foi observado o aspecto visual das amostras.

Após um período de 5 dias (estabilização dos sistemas), foi observado e

registrado o aspecto visual de cada amostra com a finalidade de construir o

diagrama de fases utilizando o programa SigmaPlot v. 11 e delimitar as regiões

encontradas no diagrama. Os sistemas foram classificados como microemulsão

(ME), para os sistemas líquidos, opticamente transparentes ou translúcidos,

cristal líquido (CL) para sistemas viscosos e opticamente transparentes,

emulsão (EM) para sistemas opacos líquidos ou viscosos e separação de fases

(SF). Para confirmação da natureza das fases dos sistemas obtidos, foram

utilizadas as técnicas de microscopia de luz polarizada (MLP) e Espalhamento

de Raios-X a baixo ângulo (SAXS).

50

Tabela 2. Composição centesimal das amostras selecionadas do diagrama 1:1

PPG-5 CETETH-20: AO

Amostra Água (%) Óleo (%) T/(Cot (%)

A1 5 5 90

A2 10 5 85

A3 15 5 80

A4 20 5 75

B1 5 10 85

B2 10 10 80

B3 15 10 75

B4 20 10 70

C1 5 15 80

C2 10 15 75

C3 15 15 70

Para cada diagrama, foram selecionadas três linhas de diluição

denominadas A, B e C de modo a observar possíveis transições de fase em

cada linha de diluição. As amostras dentro de uma mesma linha de diluição

apresentaram concentração constante de óleo com a finalidade de verificar o

efeito da fase aquosa e da mistura de tensoativo/ cotensoativo nos sistemas. A

composição centesimal das amostras selecionadas para o diagrama 1:1 e 2:1

PPG-5 CETETH-20: AO estão representadas nas tabelas 2 e 3,

respectivamente.

51

Tabela 3. Composição centesimal das amostras selecionadas do diagrama 2:1

PPG-5 CETETH-20:AO

Amostra Água (%) Óleo (%) T/(Cot (%)

A1 5 5 90

A2 10 5 85

A3 15 5 80

A4 20 5 75

A5 25 5 70

A6 30 5 65

A7 35 5 60

A8 40 5 55

A9 45 5 50

A10 50 5 45

B1 5 10 85

B2 10 10 80

B3 15 10 75

B4 20 10 70

B5 25 10 65

C1 5 15 80

C2 10 15 75

C3 15 15 70

C4 20 15 65

4.4. Caracterização dos sistemas obtidos

4.4.1. Microscopia de luz polarizada

A identificação das propriedades ópticas, tais como isotropia ou

anisotropia dos sistemas obtidos a partir do diagrama de fase pseudo-ternário

foi realizada por Microscopia de Luz Polarizada (MLP), utilizando um

microscópio Olympus BX-51 equipado com câmera digital LC Color Evolution

(PL-A662) e Software analisador de Imagem PixeLINK. Para as medidas, uma

gota de cada amostra foi transferida para uma lamina de vidro, coberta por uma

lamínula e analisada sobre luz polarizada. A medida foi realizada após o tempo

52

mínimo de 5 dias para o equilíbrio dos sistemas, no Laboratório Multiusuário

do Departamento de Física da Universidade Federal de Sergipe.

4.4.2. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo

As amostras selecionadas foram analisadas por espalhamento de raios-X

à baixo ângulo (SAXS) a temperatura ambiente. As medidas foram realizadas

na linha D11A do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS, Campinas,

Brasil). Esta linha é equipada com um monocromador de silício (111)

produzindo feixe de raios-X incidente (λ = 1,55 Å) colimado e detectado em um

Dectris Pilatus 300k. A distância amostra-detector foi de 814 nm, permitindo um

intervalo de medida do vetor de espalhamento, q (q= (4π/λ) sin θ; 2θ = ângulo

de espalhamento) de 0,15 para 5,7 nm-1. O espalhamento parasita do ar e das

fendas foi subtraído da intensidade total espalhada. As curvas resultantes

foram normalizadas levando em consideração os efeitos do decaimento

natural, da intensidade da fonte de luz síncrotron, da sensibilidade do detector

e da transmitância.

4.4.3. Análise Reológica

O ensaio de escoamento foi realizado variando a velocidade de

cisalhamento de 0 a 200 s-1. O reômetro utilizado foi o AR2000ex da TA

Instruments. As formulações foram testadas à temperatura controlada de 25 ºC

± 0,2 ºC. Cada amostra foi cuidadosamente aplicada à placa inferior ou dentro

do estator do reômetro, assegurando o mínimo cisalhamento e permitindo um

tempo de repouso (relaxamento da tensão induzida antes da análise) de 1

minuto antes de cada determinação. Cada corrida teve a duração de 4 minutos.

A geometria utilizada para as análises foi de placas paralelas de 40 e 60 mm

de diâmetro, separadas por uma distância fixa de 0,2 mm. As medidas foram

realizadas tanto para as curvas ascendentes como as descentes. Os dados

foram ajustados com o modelo da lei da potência através do software OriginPro

v.8.

Para os ensaios oscilatórios, também foi utilizado o reômetro AR2000ex

da TA Instruments a 25 ºC ± 0,2 ºC, com geometria de placas paralelas de 40

mm de diâmetro, separadas por uma distância fixa de 0,2 mm. Inicialmente foi

53

realizada a varredura dinâmica de tensão oscilatória (0,1 a 100 Pa) a 1 Hz para

determinar a região viscoelástica linear e depois de determinada foi realizada a

varredura de freqüência de 0,01 a 100 Hz a uma tensão de amplitude

oscilatória fixa (0,5 Pa) de modo a avaliar a evolução dos módulos de

armazenamento (G’) e de perda (G‖). As amostras foram cuidadosamente

aplicadas à placa inferior, assegurando o mínimo cisalhamento e permitindo um

tempo de repouso de 1 minutos antes de cada determinação. Os dados foram

tratados no software OriginPro v.8.


selecionados frente a larvas de Ae. aegypti

As larvas Rockfeller do Ae. aegypti foram adquiridas no insetário do

Laboratório de Parasitologia do Departamento de Morfologia da UFS. Os ovos

de Ae. aegypti foram produzidos no insetário e mantidos secos, aderidos em

tiras de papel até o uso, utilizando amostras de campo e Rockfeller do Ae.

aegypti. Ovos desta espécie podem ser mantidos assim no laboratório por

aproximadamente quatro meses, sem perda da viabilidade. Para utilização nos

ensaios, tiras de papel contendo os ovos foram colocadas em um recipiente

retangular com água e aproximadamente 200 mg de ração de rato. O recipiente

foi mantido no insetário, com temperatura controlada (26-28°C) de modo a

permitir a eclosão e o desenvolvimento das larvas, por quatro dias, quando as

larvas estão de terceiro a quarto estádio (L3/ L4).

Para determinação da atividade larvicida das formulações selecionadas,

foram preparadas soluções aquosas de 100 mL, variando a concentração do

OECS de 5 a 70 ppm. A estas soluções foram submetidas 20 larvas Rockfeller

L3/ L4. O controle foi realizado com a formulação inerte (sem OECS). Os

ensaios foram realizados em triplicata e após 24 h, foi verificado o número de

larvas mortas, sendo considerada morta a larva que não apresentava

movimentos.

A análise estatística foi realizada a partir da determinação da

concentração letal capaz de reduzir 50% das larvas (CL50) e o intervalo de

54

confiança para cada composto foi calculado. Os dados foram submetidos à

análise probítica de acordo com Finney (1971).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Determinação da Concentração Micelar Crítica

A Concentração Micelar Crítica (CMC) é a propriedade mais importante

dos tensoativos, pois estabelece a sua capacidade em solubilizar solutos de

diferentes características (Moraes; Rezende, 2004). As Figuras 15, 16 e 17

apresentam os gráficos de tensão superficial em função da concentração do

tensoativo PPG-5 CETETH-20, e das razões de PPG-5 CETETH-20: ácido

oléico (AO) 1:1 e 2:1, respectivamente.

A tensão superficial dessas amostras foi medida em diversas

concentrações. A partir das figuras, podemos observar o decréscimo linear nos

valores de tensão até o valor de CMC de cada amostra. Após esse valor não

ocorreram grandes variações nos valores de tensão superficial e assim a CMC

foi calculada pela interseção das duas regiões lineares do gráfico. A tabela 4

mostra os valores de CMC obtidos e os valores de tensão superficial mínima.

Figura 15. Tensão Superficial em função da concentração do tensoativo PPG-5 CETETH-20.

55

Figura 16. Tensão Superficial em função da concentração da razão PPG-5 CETETH-20: AO 1:1.

Figura 17. Tensão Superficial em função da concentração da razão PPG-5 CETETH-20: AO 2:1.

A partir dos resultados, é possível observar que a CMC do tensoativo

PPG-5 CETETH-20 puro foi de 0,2 g/ L, valor semelhante ao encontrado por

Vogel (2011). A presença do AO reduziu o valor da CMC para 0,077 e 0,0575

g/ L para as proporções de 1:1 e 2:1, respectivamente, como também reduziu o

valor de tensão superficial mínima. Estes resultados sugerem que o AO age

como cotensoativo e contribui juntamente com o tensoativo na diminuição da

tensão superficial (Wang et. al, 2006) Quando uma mistura de tensoativo e

cotensoativo é utilizada para formação de micelas e ocorre uma redução na

CMC, significa que houve um sinergismo. Caso contrário, seria um

antagonismo (Rosen, 2004).

56

Tabela 4. Valores da CMC e tensão superficial mínima (γCMC) para PPG-5

CETETH-20, PPG-5 CETETH-20: AO 1:1 e 2:1.

Amostra CMC (g/ L) γCMC (mN/m)

PPG-5 CETETH-20 0,2 34,37

PPG-5 CETETH-20: AO1:1 0,077 29,54

PPG-5 CETETH-20: AO 2:1 0,0575 30,29

Silva e colaboradores (2011) e Javadian e colaboradores (2008)

observaram que a baixas concentrações de cotensoativo, o valor da CMC é

inferior quando comparado à altas concentrações de cotensoativo. No presente

trabalho, quando a proporção de AO está maior (PPG-5 CETETH-20: AO 1:1),

o valor da CMC é maior, e quando ocorre uma redução na proporção (PPG-5

CETETH-20: AO 2:1), o valor da CMC também reduz.

5.2. Obtenção dos Sistemas através do diagrama de fases

Os diagramas de fase foram utilizados para observar as possíveis regiões

formadas, assim como os equilíbrios observados entre fases distintas

(Holmberg et al., 2002). Dois diagramas foram obtidos, a partir de duas razões

PPG-5 CETETH-20: AO 1:1 e 2:1.

O diagrama de fases PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS/ Água está

representado na Figura 18. Esse diagrama apresentou apenas 3 regiões

distintas, caracterizadas por ME em até 25% de fase aquosa, 45% de fase

oleosa e em concentrações acima de 45% de PPG-5 CETETH-20: AO 1:1,

separação de fase (SF) e emulsão (EM), não apresentando formação de região

de cristal líquido (CL). Durante a obtenção do diagrama, foram observadas

algumas amostras de CL, porém estas não se apresentaram estáveis e após

algum tempo sofreram separação de fases. Desse modo não foram

consideradas como região de CL como também para caracterização.

57

Figura 18. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS/ Água

Figura 19. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS/ Água

Na Figura 19, pode-se observar o diagrama de fases obtido a partir de

PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS/ Água. Com o aumento da proporção PPG-

5 CETETH-20: AO obteve-se 4 regiões distintas, caracterizadas por ME, CL,

EM e SF. Apesar desse diagrama ter apresentado uma região adicional, a área

da região de ME manteve-se constante, apenas modificando a área das

demais regiões. A região de CL apresentou-se entre 25 a 55% de fase aquosa,

58

até 20% de fase oleosa e em concentrações de P: AO acima de 40%. Santana

e colaboradores (2012) estudaram o efeito da razão tensoativo/ cotensoativo

na formação dos sistemas por diagrama de fases, e observaram que a região

de CL foi maior na ausência do cotensoativo, e quando foi aumentada a

proporção do cotensoativo, a região foi diminuindo, com o aumento da região

de ME A/ O e surgimento da região ME O/ A.

O tensoativo PPG-5 CETETH-20 tem a característica de formar MEs em

baixas concentrações de água, o que pode ser observado em ambos

diagramas (Carvalho et al., 2008). Com o aumento da fase aquosa nos

sistemas, ocorreu um aumento na viscosidade e com isso, foram formados

sistemas mais organizados. Carvalho e colaboradores (2013) estudaram um

sistema semelhante, composto por água, PPG-5 CETETH-20 como tensoativo

e AO como fase oleosa, e obtiveram uma região maior de ME, com MEs O/A e

A/O como também a região de CL obtida foi superior. Em relação à área, a

região de ME está consideravelmente maior que a de CL.

Para verificar o efeito do aumento do conteúdo aquoso em relação à

proporção tensoativo/ cotensoativo, foram delimitados novos pontos onde o

conteúdo da fase oleosa permaneceu constante na taxa de 5% (Figuras 20 e

21).

Com essa delimitação, foi obtida uma quantidade maior de pontos tanto

na região de ME, como na de CL. Desse modo, esses diagramas foram

escolhidos para serem realizadas as caracterizações estruturais dos sistemas.

59

Figura 20. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS constante/ Água

Figura 21. Diagrama Pseudo-Ternário PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água

60

5.3. Caracterização dos Sistemas

5.3.1. MLP

Nas Figuras 22, 23, 24 estão representadas as fotomicrografias das

amostras do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS constante/ Água

após serem submetidas à luz polarizada. É possível observar que todas as

amostras apresentaram campo escuro quando observadas ao microscópio.

Sistemas isotrópicos, como as ME apresentam um único índice de refração, e

suas propriedades ópticas são independentes da direção. Desse modo, ME

não são birrefringentes e geram um campo escuro quando submetidas à luz

polarizada (HYDE, 2001).

Figura 22. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A1, A2, A3 e A4. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: A1:5%/5%/90%; A2:10%/5%/85%; A3:15%/5%/80% e A4:20%/5%/75%.

A1 A2

A3 A4

61

Figura 23. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras B1, B2, B3 e B4. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: B1:5%/10%/85%; B2:10%/10%/80%; B3:15%/10%/75% e B4:20%/10%/70%.

Figura 24. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras C1, C2 e C3. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: C1:5%/15%/80%; C2:10%/15%/75% e C3:15%/15%/70%.

B2 B1

C3

C1 C2

B3 B4

62

As micrografias das amostras do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/

OECS constante/ Água estão representadas nas figuras 25, 26, 27 e 28. As

amostras A1-A3, B1-B2 e C1-C2 apresentam campo escuro, característico de

ME. As amostras A4, B3, B4 e C3 apresentam além do campo escuro, certa

birrefringência, sem textura característica, indicando que são possivelmente

sistemas de transição ME-CL. Já as amostras da região de CL, A5-A10 e B5,

se apresentaram como sistemas anisotrópicos, demonstrando texturas de cruz

de malta e cordões, característico de CL lamelar (Hyde, 2001). A amostra C4

possui uma textura tipo leque, semelhante à encontrada por Li e colaboradores

(2009), característico de CL hexagonal. Sistemas anisotrópicos apresentam

eixos cristalográficos distintos, e interagem com a luz de maneira que são

dependentes da orientação da rede cristalina em relação à luz incidente e

assim apresentam birrefringência (Abramowitz; Davidson, 2012).

Figura 25. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A1, A2, A3 e A4. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: A1:5%/5%/90%; A2:10%/5%/85%; A3:15%/5%/80% e A4:20%/5%/75%.

A1 A2

A3 A4

63

Figura 26. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A5, A6, A7, A8, A9 e A10. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: A5:25%/5%/70%; A6:30%/5%/65%, A7:35%/5%/60%, A8:40%/5%/55%, A9:45%/5%/50% e A10: 50%/5%/45%.

A5 A6

A7 A8

A9 A10

64

Figura 27. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras B1, B2, B3, B4 e B5. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: B1:5%/10%85%; B2:10%/10%/80%; B3:15%/10%/75%; B4:20%/10%/70% e B5:25%/10%/65%.

B2 B1

B3 B4

B5

65

Figura 28. Fotomicrografias tiradas a 20.000x das amostras A3, B3 e C3. Composição das amostras água/ OECS/ T/Cot: A3:15%/5%/80%; B3:15%/10%/75%; C3:15%/15%/70% e C4:20%/15%/65%.

5.3.2. SAXS

Para aprofundar a investigação sobre as estruturas dos sistemas

formados, foram realizadas medidas de SAXS, uma das técnicas mais

utilizadas para caracterização detalhada de amostras com agregados

moleculares (Pedersen, 1999). Foram analisadas as amostras com a taxa de

óleo constante, para verificar o efeito do aumento da fase aquosa na estrutura

dos sistemas. Essa propriedade interfere no seu uso direto em caixas d’águas

para sua ação larvicida. As Figuras 29, 30 e 31 mostram as curvas das

intensidades de espalhamento em função do vetor de espalhamento q para as

amostras do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS constante/ Água.

C1 C2

C3 C4

66

Figura 29. Curvas de SAXS das amostras A1, A2, A3 e A4 do diagrama PPG-5 CETETH-20:AO 1:1/ OECS constante/ Água.

Figura 30. Curvas de SAXS das amostras B1, B2, B3 e B4 do diagrama PPG-5 CETETH-20:AO 1:1/ OECS constante/ Água.

Figura 31. Curvas de SAXS das amostras C1, C2 e C3 do diagrama PPG-5 CETETH-20:AO 1:1/ OECS constante/ Água.

A partir das curvas apresentadas nas Figuras 29 – 31 é possível observar

que as amostras apresentam um único pico, amplo e de baixa intensidade,

característicos de sistemas micelares, confirmando o que foi observado pela

MLP (Formariz et al., 2007). Com o aumento da fase aquosa, os sistemas

apresentaram picos com maior intensidade, mais estreitos e com a presença

67

de ―ombros‖, indicativo de transição de fase ME-CL para as amostras A3-A4,

B3-B4 e C3 (Carvalho et al., 2010).

Em ME, as medidas de SAXS servem para determinar a forma e o

tamanho das gotículas, e é baseada na diferença da capacidade das fases

aquosa e oleosa em espalhar raios-X (Acharya; Hartley, 2012). Utilizando a

Equação 5, foi possível calcular os valores de ds. Os valores de espalhamento

qmax e ds estão descritos na Tabela 5.


CETETH-20: AO 1:1/ OECS constante/ Água

Amostras qmáx1 ds (Å) Estrutura

A1 0,147 42,70 ME

A2 0,095 66,10 ME

A3 0,079 79,50 ME

A4 0,073 86,00 ME

B1 0,130 48,30 ME

B2 0,085 73,90 ME

B3 0,076 82,60 ME

B4 0,067 93,70 ME

C1 0,128 49,10 ME

C2 0,081 77,50 ME

C3 0,069 91,00 ME

A partir dos resultados da tabela, pode ser verificado que com o aumento

da fase aquosa nos sistemas, houve um aumento em ds, observado nos

gráficos pelo deslocamento dos picos para valores de q mais baixos. Para a

linha de diluição A, com o aumento da fase aquosa, os valore de ds passaram

de 42,70 para 86,00 Å. Na linha de diluição B, os valores variaram de 48,30 até

93,70 Å. Já na linha de diluição C, a variação foi de 49,10 até 91,00 Å. Desse

modo, foi observado então um aumento no diâmetro das gotículas ou distancia

entre as gotículas com o aumento do conteúdo aquoso. Esses resultados estão

68

de acordo com os encontrados por Fanun (2010), que estudou uma linha de

diluição dentro da região de microemulsão.

Figura 32. Curvas de SAXS das amostras A1 – A10 do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água.

Figura 33. Curvas de SAXS das amostras B1-B5 do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água.

Com as Figuras 32, 33 e 34 e a Tabela 6 é possível confirmar os

resultados obtidos pela MLP. Os gráficos de CL são caracterizados por picos

alongados, bem definidos de grande intensidade de espalhamento, assim como

uma razão de periodicidade entre os picos de Braggs, que para CL lamelares é

de 1:2:3 e para CL hexagonais 1:√3:2 (Hyde, 2001).

69

Figura 34. Curvas de SAXS das amostras C1-C4 do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água.

As amostras de A1-A3, B1-B3, C1-C3 apresentaram-se como sistemas

microemulsionados, com valores de qmáx variando de 0,14 a 0,079. Assim como

o observado nas amostras do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 1:1/ OECS

constante/ Água, com o aumento da fase aquosa, os picos amplos e de baixa

intensidade passam a se tornar mais estreitos, com maior intensidade e com a

presença de ―ombros‖, indicativo de um maior grau de estruturação.

Já as amostras A4 e B4 demonstraram uma mudança de fase, com o

estreitamento no pico e o surgimento de um segundo pico não muito bem

definido, entretanto, os picos apresentaram razão de 1:2, caracterizando uma

transição ME+Lα. As amostras A5 e B5 demonstram dois tipos de espaçamento

lamelar, com razão entre os picos de 1:2.

As amostras A6-A10 apresentaram de 3 a 4 picos bem definidos, com

periodicidade dos picos na razão 1:2:3, indicando que esses sistemas são CL

lamelares, e os valores de qmáx variaram de 0,082 a 0,058. A amostra C4

apresentou razão entre os picos de 1:√3:2, característico de CL hexagonal,

confirmando o observado pela MLP. Com o aumento da fase aquosa, os picos

também se deslocaram para menores valores de q, indicando um aumento na

distância entre os objetos espalhadores.

Goddeeris e colaboradores (2010) observaram o efeito da diluição de

precursores de fase líquido-cristalina através de análises de SAXS, onde foi

observado o aumento da estruturação dos sistemas com o aumento da fase

aquosa. Desse modo, sistemas presentes no diagrama PPG-5 CETETH-20:

AO 2:1/ OECS constante/ Água podem ser utilizados como precursores de fase

70

líquido-cristalina, que estão sujeitos a transição de fase quando em contato

com soluções aquosas. A linha de diluição A (amostras A1-A10) desse

diagrama foi selecionada para a análise reológica e determinação da

concentração letal média (CL50) frente a larvas de Ae. aegypti.


CETETH-20: AO 2:1/ OECS constante/ Água

Amostras qmáx1 qmáx2 qmáx3 qmáx4 d1/d2 d1/d3 Estrutura

A1 0,140 – – – – – ME

A2 0,106 – – – – – ME

A3 0,092 – – – – – ME

A4 0,092 0,185 – – 2,0 – ME+Lα

A5 0,082 0,164 0,088 0,175 2 – Lα

A6 0,082 0,164 – – 2 – Lα

A7 0,076 0,150 0,227 – 2,0 3,0 Lα

A8 0,070 0,141 0,211 – 2,0 3,0 Lα

A9 0,063 0,126 0,19 – 2,0 3,0 Lα

A10 0,058 0,116 0,174 0,233 2,0 3,0 Lα

B1 0,14 – – – – – ME

B2 0,102 – – – – – ME

B3 0,084 – – – – – ME

B4 0,085 0,171 – – 2,0 – ME+Lα

B5 0,073 0,146 0,079 0,157 2,0 – Lα

C1 0,125 – – – – – ME

C2 0,089 – – – – – ME

C3 0,079 – – – – – ME

C4 0,072 0,126 0,146 – 1,75 2,0 H1

71

5.3.3. Análise Reológica

As Figuras 35 e 36 representam as propriedades de escoamento das

amostras A1-A7. Tem-se por definição que fluidos newtonianos apresentam

uma relação linear entre tensão de cisalhamento e taxa de deformação,

enquanto que os não-newtonianos apresentam uma relação não-linear (Chorilli

et al., 2011).

É possível observar que as amostras A1, A2, A3 e A4 apresentaram

comportamento newtoniano, não apresentando tixotropia, característica de

fluidos não newtonianos. Desse modo, as curvas ascendentes e descendentes

se sobrepõem. A Tabela 7 mostra os valores dos parâmetros reológicos obtidos

para cada amostra, através do ajuste do modelo Lei da Potência (Equação 8).

Figura 35. Reograma das amostras A1, A2, A3 e A4, curvas ascendentes e descendentes

De acordo com os parâmetros reológicos, as amostras A1, A2, A3 e A4

apresentaram comportamento newtoniano, apresentando valores de R2>0,98,

indicando uma boa correlação entre os dados experimentais e teóricos, e n

igual a 1, o que é esperado para sistemas microemulsionados e transições de

fase ME-CL (Santana et al., 2012). É possível observar também que com o

aumento da fase aquosa nos sistemas, houve um aumento na viscosidade de

0,12 para 0,45 Pa.s. Esses sistemas apresentam esse tipo de comportamento

devido ao pequeno tamanho de gotícula e baixa interação entre as mesmas

(Polizelli et al., 2006).

72

Para as amostras A5-A7, estas demonstraram comportamento não

newtoniano pseudoplástico, por apresentarem em seus reogramas uma

diminuição na viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento. Esse perfil

pode ser explicado pela orientação das gotículas de óleo em direção ao fluxo

ou pela quebra dos agregados causada pelo cisalhamento do sistema

(Formariz et al., 2008). Essa propriedade pseudoplástica é desejada para

diversas aplicações, pois a redução na viscosidade facilita a preparação e a

aplicação do produto obtido (Formariz et al., 2010). A amostra A7 apresentou

um comportamento anômalo, não seguindo o comportamento apresentado

pelas amostras anteriores (A5 e A6). Essa amostra apresentou o valor da

constante de consistência de 0,30 e índice de fluxo de 0,87, enquanto as

amostras A5 e A6 apresentaram os valores de 3,90 e 6,10 para constante de

consistência e 0,47 e 0,54 para índice de consistência, Desse modo, serão

realizadas novas medidas para confirmar suas propriedades de escoamento.

Figura 36. Reograma das amostras A5, A6 e A7, curvas ascendentes e descendentes

Para as amostras A8-A10 não foram realizados ensaios de escoamento

devido a estas apresentarem viscosidade bem superior o que limita a medição

pelo equipamento. Dessa forma, foram realizadas análises oscilatórias para as

amostras de CL A5-A10, com a finalidade de obter maiores informações sobre

suas propriedades viscoelásticas.

73

Tabela 7. Valores de índice de fluxo (n) e constante de consistência (K) para as

amostras A1-A7 do diagrama PPG-5 CETETH-20: AO 2:1.

Amostra K [P.sn] n R2

A1 0,12 1,00 1

A2 0,15 1,00 1

A3 0,25 1,00 1

A4 0,45 1,00 1

A5 3,90 0,47 0,994

A6 6,10 0,54 0,998

A7 0,30 0,87 0,999

As análises de varredura de tensão dinâmica e de frequência oscilatória

conferem muita informação sobre a estrutura das fases líquido-cristalinas. Os

parâmetros que podem ser obtidos são módulo elástico (G’), módulo de perda

(G‖), módulo complexo (G*) e viscosidade complexa (ƞ*) (Zheng et al., 2011). A

figura 37 apresenta a varredura dinâmica de tensão oscilatória a 1 Hz. O

estudo de G’ em função da tensão oscilatória possibilitou a determinação da

região viscoelástica linear (RVL).

Figura 37. Módulo elástico (G’) em função da tensão oscilatória das amostras A5-A10 (1,0 Hz, 25 °C).

É possível observar que G’ apresentou valores mais baixos para a

amostra A5 que apresenta 25% de fase aquosa, e foi aumentando conforme o

aumento do conteúdo aquoso das amostras de A5 para A10 (50% de fase

aquosa). A Tabela 8 relaciona os valores de fase aquosa com a tensão crítica

74

(σ'c) e módulo elástico (G’). É possível verificar que com o aumento da fase

aquosa, houve um aumento nos valores de tensão crítica e do módulo elástico,

indicando que com o aumento do conteúdo aquoso, as amostras estão se

tornando mais elásticas, e assim apresentam uma maior estruturação e

consequentemente maior resistência a tensão aplicada, corroborando com os

resultados de MLP e SAXS (Gonsenca et al., 2013).

Tabela 8. Valores de fase aquosa, tensão crítica (σ'c) e módulo elástico (G’).

Amostra Fase aquosa (%) σ'c (Pa) G’ (Pa)

A5 25 2,42 84,46

A6 30 6,53 367,18

A7 35 16,94 913,95

A8 40 23,12 1101,42

A9 45 23,91 1264,86

A10 50 28,78 1703,44

Após ser determinada a RVL para as amostras, foi selecionado o valor

adequado de tensão (0,5 Pa) determinado experimentalmente para realizar a

varredura oscilatória de frequência, representada na Figura 38. É possível

observar que a amostra A5 apresenta valores de G’>G‖ a baixas frequências e

G‖>G’ a altas frequências. Desse modo, sugere-se que as propriedades

elásticas dessa amostra são mais evidentes que as viscosas (Zhao et al.,

2006).

Em termos reológicos, gel é definido como um sistema no qual G’ e o G‖

são independentes da frequência e a tangente do ângulo de fase δ (tan δ =

G‖/G’) é baixo em todos os valores de frequência, ou seja apresenta valores de

tan δ<1 (Wei et al., 2002).

De acordo com diversos estudos, CL lamelares apresentam escoamento

semelhante aos sistemas de estrutura tipo gel, onde G’>G‖ é independente da

frequência (Gonsenca et al., 2013; Zheng et al., 2011). Esse fenômeno foi

verificado nas amostras A6-A10, conforme aumenta a quantidade de fase

aquosa, a independência de G’ e G‖ com a da frequência também se acentua e

G’ é superior a G‖, confirmando a estrutura organizada desses sistemas.

75

Figura 38. Módulo elástico (G’) e de perda (G‖) em função da frequência das amostras A5-A10 (0,5 Pa, 25 °C).

A Figura 39 exibe os valores de tan δ em função da frequência na faixa de

0,1 a 50 Hz. É possível observar que todas as amostras demonstraram valores

de tan δ inferiores a 1, demonstrando que são sistemas tipo gel. Quando menor

o valor de tan δ, maior a componente elástica da amostra. Desse modo, com o

aumento do conteúdo aquoso, as amostras se tornam cada vez mais

estruturadas, apresentando valores de tan δ na faixa de 0,6 para a amostra A5

e 0,18 para a amostra A10.

76

Figura 39. Tan δ em função da frequência das amostras A5-A10 (0,5 Pa, 25 °C).

Todos os resultados dos estudos das propriedades reológicas corroboram

com os obtidos por SAXS, confirmando que os sistemas líquido-cristalinos

lamelares apresentam uma estrutura bem organizada. Com o aumento da fase

aquosa, ocorre um maior grau de estruturação, indicado nas curvas de SAXS

pelo aumento do número de lamelas, e pelas propriedades reológicas onde as

amostras demonstraram um aumento na componente elástica e consequente

estruturação dos sistemas.


selecionados frente a larvas de Ae. aegypti

As amostras A3 e A4 foram escolhidas para a avaliação da concentração

letal média (CL50), por se tratarem de sistemas que se encontram no limite

entre ME e CL e assim possíveis precursores de fase líquido-cristalina. Desse

modo, foram realizadas as determinações da CL50 para as amostras A3 e A4,

que podem ser observadas na Tabela 9. A Figura 40 representa o experimento

da avaliação da CL50 realizada com uma das amostras.

77

Figura 40. Fotografia do experimento da avaliação da concentração letal média (CL50) frente a larvas de Ae. aegypti.

Silva (2012) obteve em seu trabalho o valor de CL50 21,5 ppm para o

OECS e CL50 26,8 ppm para o D-limoneno, seu componente majoritário. Com

esse resultado, é possível observar que as amostras A3 e A4 exibiram valores

cerca de três vezes menores que os encontrados para o óleo puro, indicando

que o sistema proposto conseguiu solubilizar mais OECS no meio aquoso,

exibindo um efeito superior na mortalidade das larvas.

Tabela 9. CL50 das amostras A3 e A4 frente às larvas de Ae. aegypti em L3/ L4,

após 24h de exposição.

Amostra CL50 (95% IC) ppm

A3 6,55 (6,33 – 6,77)

A4 5,93 (5,70 – 6,16)

95% IC - intervalo de confiança com probabilidade de 95%. CL50 - concentração letal necessária para matar 50% da população exposta ppm - partes por milhão

Esse fato se dá pela formação de um sistema estruturado, em escala

nanométrica, com alta capacidade de solubilização de substâncias ativas,

como o OECS. Ao gotejar os precursores de fase no meio aquoso, ocorre uma

transição de fase para sistemas mais estruturados, formando sistemas que

apresentam uma matriz rígida para liberação do OECS. É possível visualizar na

Figura 40 que a amostra que se apresentava como líquida, ao ser gotejada na

78

água, passou a se apresentar como gel, indicando que o sistema precursor de

fase líquido-cristalino sofreu transição de fase para um sistema mais

organizado (CL).

Com isso, esses sistemas podem promover uma liberação prolongada

das substâncias ativas incorporadas. As amostras A3 e A4, por possuírem uma

estrutura nanométrica, dispersaram o OECS na água onde as larvas estavam

presentes e promoveram a redução da CL50 pra valores mais próximos do valor

utilizado do organofosfato temefós, cerca de 1 ppm (WHO, 2011).

Costa e colaboradores (2004) obtiveram CL50 para três tipos de óleos

essenciais S. aromaticum, L. sidoides e H. martiusii de 21,4; 19,5 e 18,5 ppm,

respectivamente. Já Silva e colaboradores (2008) em seu trabalho o melhor

resultado dos óleos testados foi de L. gracilis, com CL50 de 98 ppm, e obteve

CL50 37 ppm para o R-limoneno. Esses estudos demonstram como o resultado

obtido para as amostras A3 e A4 foi superior aos encontrados na literatura para

óleos essenciais e que a formulação é um potencial candidato para veicular o

OECS ou até mesmo outros óleos essenciais.

Temephos, o organofosforado comumente utilizado para o controle do

vetor pelos órgãos públicos, apresenta uma dose diagnóstica de 0,012 – 1 ppm

(Braga; Valle, 2007; Luna et al., 2004). Bti (Bacillus thuringiensis israelensis) é

uma bactéria utilizada como alternativa ao controle da dengue, devido à

resistência exibida pelo Ae. aegypti (WHO, 2006). Entretanto, o vetor também

vem demonstrando resistência ao Bti. Esses dois produtos apresentam

limitação na dose de aplicação em água potável, assim como demonstram

persistência no meio ambiente (WHO, 2009, Braga; Valle, 2007).

Outros experimentos larvicidas devem ser realizados para verificar se há

um efeito residual das formulações, com a liberação prolongada do OECS,

demonstrando mortalidade das larvas em tempo superior a 24h. Todavia, é

possível observar que os sistemas selecionados são alternativas viáveis ao

controle da dengue, por se apresentarem como recursos sustentáveis, onde o

OECS é um produto natural, de baixa toxicidade e baixo custo.

79

6. CONCLUSÃO

A mistura de PPG-5 CETETH-20 e ácido oleico na proporção 2:1

apresentou-se com maior capacidade de solubilização de fase aquosa, atuando

em sinergismo para redução da tensão superficial. Foram obtidos sistemas

nanoestruturados contendo OECS, PPG-5 CETETH-20, ácido oléico e água.

No diagrama 1:1 apenas foram obtidos sistemas microemulsionados, enquanto

no 2:1 foram obtidos sistemas microemulsionados e líquido cristalinos. Esses

sistemas que apresentaram um maior nível de estruturação com o aumento da

fase aquosa, o que foi comprovado pela caracterização através das técnicas de

MLP, SAXS e reologia. O ensaio larvicida demonstrou que com o uso de

sistemas em escala nanométrica foi possível reduzir a CL50 do OECS, sendo

assim potenciais candidatos para o controle do Ae. aegypti.

80

7. REFERÊNCIAS

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