síntese, caracterização e ensaio de adesão celular in vitro de
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FATEC – Faculdade de Tecnologia de Sorocaba
Tecnologia em Polímeros
Joelen Osmari da Silva
Relatório Final de Iniciação Científica
Síntese, Caracterização e Ensaio de Adesão Celular in vitro
de filmes de PLLA e Nanocompósito de PLLA com
Nanotubos de Carbono
SOROCABA
2016
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Joelen Osmari da Silva
Relatório Final de Iniciação Científica
Síntese, Caracterização e Ensaio de Adesão Celular in vitro
de filmes de PLLA e Nanocompósito de PLLA com
Nanotubos de Carbono
Relatório final apresentado à Faculdade de Tecnologia
de Sorocaba, como exigência parcial para obtenção do
certificado de Iniciação Científica.
Orientadora: Dra. Elaine Conceição de Oliveira
Coorientadora: Me. Anna Maria Melero
SOROCABA
2016
3
Dedico este trabalho à minha família,
sempre presente e disposta a me apoiar
em todas as dificuldades.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, que permitiu a realização deste trabalho, abrindo portas e caminhos, sem os
quais, este não seria possível.
À minha mãe Rosmeire Osmari Ribeiro e tia Rosmira Osmari Ribeiro por estarem
sempre presentes, me apoiando incondicionalmente ao longo do percurso.
À orientadora Elaine C. Oliveira e coorientadora Anna M. Melero por sua
competência, dedicação e disponibilidade.
Ao professor Doutor Daniel Komatsu e à doutoranda Juliana Almeida Domingues, por
sua colaboração imprescindível para a realização deste trabalho.
A todos os demais colaboradores por suas oportunas e relevantes contribuições.
5
Por vezes sentimos que aquilo que
fazemos não é senão uma gota de água no
mar. Mas o mar seria menor se lhe
faltasse uma gota.
(Madre Teresa de Calcuta)
O cientista não é o homem que fornece as
verdadeiras respostas; é quem faz as
verdadeiras perguntas.
(Claude Lévi-Strauss)
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RESUMO
Atualmente os biomateriais estão sendo utilizados de diversas maneiras, tornando-se
alvo de estudos interdisciplinares, para aplicações como próteses, veículo de liberação de
drogas, curativos cutâneos, pinos cirúrgicos, stents, entre outras. Além disso, tais materiais
têm se mostrado promissores, pois são capazes de substituir temporariamente ou
permanentemente uma função biológica, não causando reações carcinogênicas ou tóxicas.
Dentre os materiais mais utilizados atualmente como biomateriais estão o poli (L-ácido
láctico) (PLLA) e os nanotubos de carbono (NTC), cujo nanocompósito possui propriedades
diferentes dos materiais iniciais. Desta forma, neste trabalho foram sintetizados filmes de
PLLA e PLLA+NTC, utilizando processo de casting, os quais foram caracterizados através
das técnicas de Microscopia Óptica, DMTA, FTIR e DSC, além de realizar ensaio de
citococompatibilidade através da adesão celular com células mesenquimais in vitro. Tais
técnicas foram realizadas com o intuito de comparar os filmes com e sem nanotubos de
carbono e avaliar a possibilidade de futuras aplicações de ambos materiais como biomateriais.
Através das análises de caracterização efetuadas, verificou-se que os filmes de PLLA e
PLLA+NTC são visivelmente diferentes, apresentando também cristalinidades distintas, mas
que ambos possuem bom comportamento mecânico e não apresentam mudança de estado
físico na faixa de temperatura entre 35 a 40°C, temperatura corpórea humana, além de
apresentar bandas características muito próximas. Através das análises de adesão celular in
vitro, pode-se verificar que nas primeiras 24h o filme de PLLA apresentou maior adesão
celular, enquanto após 72h e 120h, o filme de PLLA+NTC apresentou maior adesão. Através
de todas as análises realizadas nos materiais, observou-se que os filmes de PLLA e
PLLA+NTC apresentam características físico-químicas diferentes, mas ambos mostraram-se
promissores para utilização de forma interna e externa ao corpo.
Palavras chave: PLLA - poli (ácido láctico), nanotubos de carbono (NTC), caracterização,
adesão celular.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Polímeros sintéticos biorreabsorvíveis...................................................................09
Figura 2 – Tipos de nanotubos de carbono monocamada segundo orientação de suas redes
cristalinas..................................................................................................................................11
Figura 3 – Estruturas dos nanotubos de carbono.....................................................................12
Figura 4 – PLLA e filmes de PLLA confeccionados por Casting...........................................16
Figura 5 – PLLA + NTC e filme confeccionado por Casting..................................................16
Figura 6 – Microscópio Óptico................................................................................................17
Figura 7 – Ilustração do corpo de prova utilizado para a análise DMTA................................18
Figura 8 – FTIR com amostras de PLLA e PLLA+NTC........................................................19
Figura 9 – Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) dos Filmes......................................20
Figura 10 – Filmes sendo preparados para o ensaio de adesão celular: A – Filme de PLLA, B
– Filme de PLLA+NTC, C – Filmes sendo esterilizados em fluxo laminar...............................21
Figura 11 – Fluxo Laminar......................................................................................................21
Figura 12 – Esquema sobre preparo das células para o ensaio de adesão
celular........................................................................................................................................23
Figura 13 – Esquema sobre o cultivo de células-tronco com PLLA e PLLA+ NTC..............23
Figura 14 – Microscopia Óptica dos filmes.............................................................................24
Figura 15 – Corpos de prova do filme de PLLA e PLLA+NTC.............................................25
Figura 16 – Gráfico de tensão/deformação do PLLA..............................................................26
Figura 17 –. Gráfico de tensão/deformação do PLLA+NTC...................................................26
Figura 18 – Corpo de prova deformado após ensaio de DMA.......................................................27
Figura 19 – Espectroscopia do PLLA + NTC do PLLA + NTC..............................................28
Figura 20 – Espectroscopia do PLLA......................................................................................29
Figura 21 – Gráfico com Espectros sobrepostos do PLLA e PLLA + NTC............................29
Figura 22 – Curvas de DSC do PLLA e PLLA + NTC...........................................................31
Figura 23 – Adesão de células-tronco mesenquimais de coelho sobre o PLLA e PLLA + NTC
após 24h....................................................................................................................................32
Figura 24 – Adesão de células-tronco mesenquimais de coelho sobre o PLLA e PLLA + NTC
após 72h....................................................................................................................................33
Figura 25 – Adesão de células-tronco mesenquimais de coelho sobre o PLLA e PLLA + NTC
após 120h..................................................................................................................................34
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………………………………………....……………….09
2. OBJETIVO ………………………………………………………...................................14
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 PLLA.........................................................................................................................15
3.2 Nanotubos de carbono (NTC)...................................................................................15
3.3 Síntese do filme de PLLA.........................................................................................15
3.4 Síntese do filme de PLLA com NTC........................................................................16
3.5 Ensaios de caraterização dos filmes de PLLA e PLLA+NTC
3.5.1 Microscopia Óptica..........................................................................................17
3.5.2 Análise DMTA.................................................................................................17
3.5.3 Análise FTIR....................................................................................................18
3.5.4 DSC..................................................................................................................19
3.6 Ensaio de adesão celular
3.6.1 Cultura de células.............................................................................................20
3.6.2 Preparação dos filmes para ensaio de adesão...................................................20
3.6.3 Adesão celular em PLLA e PLLA+NTC.........................................................21
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Microscopia Óptica...................................................................................................24
4.2 DMTA.......................................................................................................................25
4.3 FTIR..........................................................................................................................38
4.4 DSC...........................................................................................................................30
4.5 Cultura Celular..........................................................................................................31
5. CONCLUSÃO..............................................................................................................36
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS........................................................37
7. REFERÊNCIAS............................................................................................................38
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1. INTRODUÇÃO
A indústria de materiais vem crescendo cada vez mais em diversas aplicações, dentre
elas a dos biomateriais, que hoje, são fundamentais para o desenvolvimento de novos tipos de
próteses, veículo de liberação de drogas e futuramente, engenharia de tecidos e medicina
regenerativa [1].
Para estas aplicações, a biocompatibilidade é essencial, podendo ser definida quando a
aplicação de um determinado material em contato com o organismo não resulta em reações
adversas, carcinogênicas ou tóxicas [2].
Dentre os polímeros sintéticos biodegradáveis e biorreabsorvíveis encontram-se os
poli (α-hidróxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, da
qual fazem parte: poli (ácido glicólico) PGA, poli (ácido láctico) PLA, poli (ácido láctico-co-
ácido glicólico) PLGA, poli (ε-caprolactona) PCL, cujas informações estão ilustrados na
figura 1 [3].
Figura 1: Polímeros sintéticos biorreabsorvíveis.
Fonte: Barbanti, Zavaglia e Duek, 2005.
Atualmente um dos polímeros que tem sido considerado um dos mais promissores
como biomaterial é o poli (L-ácido láctico) (PLLA), pois possui alto desempenho mecânico, é
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semi-cristalino, biocompatível, biorreabsorvível e hidrofóbico. Além disso, sua degradação
ocorre por meio de hidrólise das ligações ésteres, cujo único resíduo é o ácido láctico, o qual
entra no ciclo do ácido tricarboxílico e é excretado na forma de água e dióxido de carbono,
sendo desta forma, atóxico aos organismos vivos [4-5].
No entanto, a tecnologia atual tem buscado o aperfeiçoamento de biomateriais como o
PLLA, com o objetivo de melhorar seu desempenho, aplicabilidade e biocompatibilidade.
Para tanto, outros materiais começaram a ser testados na composição do PLLA como as
nanofibras, nanopartículas de prata, de ouro e de carbono [6].
A nanotecnologia é uma ciência em ascensão, por ser muito ampla e interdisciplinar
além de possuir aplicações nas mais diferentes áreas. O principal atrativo sobre a
incorporação deste tipo de tecnologia é que, materiais em escala nanométrica possuem
propriedades diferentes dos materiais de tamanho normal podendo ser aplicadas nas áreas de
química, física, engenharia e biomédica [7-8]. Caracteristicamente as nanopartículas são
compreendidas em escala entre 0,1 e 100 nm de largura, apresentam propriedades químicas e
físicas diferentes das do seu produto de origem, tem tamanho reduzido, alta resistência
mecânica, grande área de superfície de contato, entre outras características [9]. Este conjunto
faz deste material alvo de um grande número de pesquisadores na última década no campo
biomédico.
Com a ascensão da nanotecnologia e com uma gama cada vez maior de materiais
disponíveis, torna-se necessário ampliar as pesquisas no campo dos nanocompósitos, tendo
em vista que possuirão características e propriedades intermediárias ou muitas vezes, novas
em relação aos materiais puros [10-11].
Uma das nanopartículas mais utilizadas para a síntese de nanocompósitos são os
nanotubos de carbono (NTC) ou carbon nanotubes (CNT) em inglês, que são formas
metaestáveis de carbono resultantes do enrolamento de um plano de átomos de carbono em
hibridização sp² com diâmetro na ordem de 1nm e comprimento na ordem 3-10 μm [12-13]. O
NTC foi descoberto em 1991 por Sumio Iijima [14] e estão entre os materiais em escala nano
que mais tem sido estudado nos diversos ramos das pesquisas tecnológicas e na indústria [15].
Os NTCs se apresentam em duas formas distintas: com parede simples (NTPS) ou
single-wall carbon nanotubes (SWNTs) e com paredes múltiplas (NTPM) ou multi-wall
carbon nanotubes (MWNTs). Os nanotubos com parede simples, são formados por uma única
folha de grafeno enroladas em várias direções em relação aos hexágonos de carbono
(helicidade). Os nanotubos com paredes múltiplas, são formados por três ou mais folhas de
11
grafeno enroladas concentricamente com helicidade aleatória característica de estruturas
tubostáticas [9].
As propriedades dos nanotubos de carbono dependem do seu diâmetro e ângulo quiral
ou helicidade, podendo comportar-se como semicondutor ou como metal. Sua definição
cristalográfica depende de dois índices (n,m), também chamados de Hamada. Os nanotubos
são divididos em três classes: armchair quando m=n, zigzag quando m=0 e quiral em todos os
demais casos, quando n≠m≠0 e estão definidos pelo ângulo de helicidade Ө. Os três tipos de
NTCs estão ilustrados na figura 2 e as demais formas do mesmo, na figura 3 [9].
Figura 2: Tipos de nanotubo de carbono monocamada segundo orientação de suas redes cristalinas: (a)
nanotubos armchair, (b) nanotubos zigzag e (c) nanotubos chiral.
Fonte: Silva et al, 2007.
12
Figura 3: Estruturas dos nanotubos de carbono.
Fonte: Silva et al, 2006.
De acordo com Silva 2007, o nanocompósito de PLA com nanotubos de carbono é
ideal para o crescimento celular sem danos visíveis causados pela presença dos CNTs, ou
seja, verifica-se que tanto o PLA quanto os CNTs não são nocivos às células.
O cultivo de células se iniciou no princípio do século XX utilizando fragmento de
tecido e células isoladas. Esta técnica tem por objetivo estudar o comportamento fisiológico
de células animais fora do organismo, em um ambiente controlado. Até os dias de hoje, esta
técnica ainda se faz uma importante ferramenta para o desenvolvimento de pesquisas em
laboratórios de todo o mundo [16].
O sucesso do cultivo celular está diretamente ligado as condições ideais de nutrição,
pH e temperatura, itens imprescindíveis à sobrevivência e metabolismo celular. Apesar do
cultivo celular in vitro diferir bastante do crescimento celular in vivo, o principal objetivo é
fazer com que a célula cultivada continue preservando as características do seu tecido de
origem. Sendo assim, células que são oriundas de tecidos com interação direta entre elas serão
aderentes in vitro (exemplo: células epiteliais), enquanto aquelas que não necessitam de
interação não serão aderentes (exemplo: células hematopoiéticas) [17].
Células aderentes, como as células-tronco necessitam de uma superfície adequada que
propicie a ancoragem destas células estimulando a produção de proteínas de adesão e
proteoglicanos. Estas proteínas estimulam a formação da matriz que permite a adesão ao
material, estimulando o crescimento e a diferenciação [18]. A manutenção das características
fenotípicas e genotípicas das células funcionará como um marcador de desempenho durante o
13
cultivo celular, fazendo desta metodologia uma importante aliada nas pesquisas farmacêuticas
e biológicas. Ensaios de citotoxicidade e viabilidade celular são os primeiros testes exigidos
para categorizar um determinado material como biocompatível. A mistura de novos
compósitos pode modificar total ou parcialmente as características de um dado material [19-
20-21].
As células-tronco mesenquimais (CTM) ou células estromais mesenquimais são
extraídas de indivíduos adultos, mas que possuem a mesma capacidade de diferenciação e
expansão das demais células-tronco, podendo diferenciar-se em células adiposas,
cartilaginosas e ósseas. Tais células podem ser obtidas em de tecidos mesenquimais presentes
em todos os órgãos do corpo, como: medula óssea, cordão umbilical, tecido adiposo, sangue
menstrual, líquido amniótico, placenta fetal, entre outros [22-23].
As CTMs possuem menor capacidade de diferenciação em relação às células tronco
embrionárias, porém, apresentam também grandes vantagens, como por exemplo, a facilidade
de isolamento, propagação em cultura e não são imunogênicas [18-23].
Dados na literatura tem comprovado a capacidade do PLLA de interagir com os
tecidos vivos sem causar inflamação, bem como a sua capacidade de ser degradado no
organismo. Alguns estudos demonstram que o desenvolvimento de filmes de PLLA com
nanopartículas de carbono, não diminui a sua característica de ser biocompatível e ainda
estimula o crescimento celular [6-20].
Desta forma, a proposta deste estudo foi realizar a síntese e comparar as propriedades
físicas e químicas de filmes de PLLA. Estes filmes foram sintetizados utilizando somente poli
(ácido lático) (PLLA) enquanto o outro teve a adição dos nanotubos de carbono de paredes
múltiplas (PLLA+NTC). Além disso, comparou-se a adesão, viabilidade e crescimento de
células-tronco mesenquimais em contato coma superfície dos filmes de PLLA e PLLA+NTC.
14
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi realizar a síntese de filmes de PLLA e PLLA com
nanotubos de carbono de paredes múltiplas (NTC), com o intuito de avaliar sua viabilidade
para aplicação biológica.
Objetivos específicos
1. Fazer a caracterização dos filmes de PLLA e PLLA com nanotubos de carbono de
paredes múltiplas através de Microscopia Óptica, DMTA, FTIR e DSC.
2. Realizar ensaio de biocompatibilidade através da adesão celular com células
mesenquimais in vitro.
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. PLLA
O PLLA utilizado neste estudo foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Daniel
Kommatsu do Laboratório de Biomateriais da PUC Sorocaba.
3.2. Nanotubos de carbono (NTC)
Os nanotubos utilizados neste estudo são os de paredes múltiplas, adquiridos da
empresa HELIX Material Solutions (Texas, USA). A caracterização fornecida pela empresa
trás as seguintes informações sobre as nanopartículas:
Diâmetro: de 10 a 30nm;
Comprimento: de 0,5 a 40 µm;
Grau de pureza: >95%
Os nanotubos de carbono foram gentilmente cedidos pela Profa. Dra. Leonilda M. B.
Santos do Laboratório de Neuroimunologia do Instituto de Biologia da Unicamp.
3.3. Síntese do filme de PLLA
Para a confecção do filme, 5% de PLLA foi pesado em balança analítica e solubilizado
em 25ml de clorofórmio (Merck, Darmstadt, Alemanha). Este procedimento foi realizado
dentro da capela de exaustão do Laboratório de Bioquímica da Fatec-Sorocaba, devido a
emissão de vapores pelo clorofórmio. A mistura permaneceu sob agitação manual até a
completa dissolução do PLLA. A solução com PLLA dissolvida foi vertida em uma placa de
Petri que permaneceu em estufa a temperatura ambiente por 24h para síntese e formação do
filme. Foram sintetizados dois filmes utilizando o processo de casting, ou evaporação de
solvente, a partir da dissolução do PLLA em clorofórmio. As imagens do PLLA e dos filmes
sintetizados encontram-se na figura 4.
16
Figura 4: PLLA e filmes de PLLA confeccionados por Casting
Fonte: O autor 2016
3.4. Síntese do filme de PLLA com NTC
A síntese deste filme foi realizada como descrito no item 3.3. A mesma quantidade de
PLLA foi pesada, porém antes da sua dissolução foi acrescido à mistura 0,16% de NTC. A
mistura de PLLA e NTC foi solubilizada em clorofórmio e mantida sob agitação até a sua
total dissolução. Assim que o PLLA e os nanotubos se dissolveram completamente, a solução
foi vertida em uma placa de Petri que permaneceu por 24h em estufa a temperatura ambiente
para síntese e formação do filme. Ambos os filmes, PLLA e PLLA+NTC foram utilizados
para caracterização e ensaio de adesão celular. As imagens do PLLA e nanotubos de carbono
prontos para serem solubilizados e do filme obtido após a síntese encontram-se na figura 5.
Importante ressaltar que os pontos pretos que podem ser observados no filme são os grumos
de nanotubos de carbono.
Figura 5: PLLA + NTC e filme confeccionado por Casting
Fonte: O autor 2016
17
3.5. Ensaios de caraterização dos filmes de PLLA e PLLA+NTC
3.5.1. Microscopia Óptica
A caracterização morfológica do material foi realizada utilizando-se Microscópio de
Imunofluorescência (Olympus Modelo BX41) situado no Laboratório de Microscopia da
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba. As fotos foram tiradas em objetiva de 10x e 20x.
Figura 6: Microscópio Óptico
Fonte: O autor 2016
3.5.2. Análise DMTA
A análise térmica dinâmico-mecânica ou dynamic-mechanical termal analysis
(DMTA), é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização de polímeros através da
detecção de processos de relaxação, tanto molecular quanto macroscópico, além de fornecer
informações importantes como módulo de dissipação viscosa, módulo elástico, temperatura
de transição vítrea, temperatura de fusão cristalina, amortecimento mecânico ou atrito interno
do material, em caso de solicitação mecânica [24].
Através desta técnica, pode-se analisar diversas propriedades, tais como tenacidade,
envelhecimento, resistência ao impacto, tempo de vida sob fadiga, rigidez, resistência à
propagação de trincas, entre outras [24].
18
O ensaio de tensão deformação foi realizado no Laboratório de Materiais da UFSCar
Sorocaba, com o equipamento DMA Q800 da TA Instruments e garra de tensão para filme.
Os Parâmetros utilizados para a análise foram:
- Força de pré-carga: 0.0010N
- Temperatura isotérmica: 50°C
- Taxa de rampa de força: 3.000N/min a 18.000N
O corpo de prova utilizado para o ensaio de tensão/deformação foi retangular,
medindo:
Figura 7: Ilustração do corpo de prova utilizado para a análise DMTA
13.5700 mm
6.3800 mm
0.1400 mm
Fonte: O autor 2016
3.5.3. Análise FTIR
A espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier ou Fourier
Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) faz parte das espectroscopias vibracionais e permite
a identificação e determinação de grupos funcionais, conformação e estrutura de
macromoléculas, além de fornecer o espectro vibracional completo de uma molécula [24].
Sua aplicação pode ser desde para análise de pequenas moléculas até sistemas
complexos como células e tecidos, podendo analisar diversos tipos e estados de materiais, tais
como soluções aquosas, solventes orgânicos, membranas, pastilhas e filmes [25].
Para a análise de FTIR foi utilizado equipamento PerkinElmer Spectrum 400 FT-IR
Modelo Spectrum 400FT Mid-IR, no laboratório de biomateriais da PUC Sorocaba, onde as
amostras de PLLA e do nanocompósito foram analisadas para verificar os grupos funcionais
característicos dos materiais.
19
Figura 8: FTIR com amostras de PLLA e PLLA+NTC
Fonte: O autor 2016
3.5.4. DSC
A calorimetria exploratória diferencial (DSC) tem como principal objetivo
acompanhar o processo de fusão da amostra, que permite analisar diversos fenômenos ligados
a estrutura e às propriedades do material, tais como: grau de cristalinidade, temperatura de
fusão, cristalização e transição vítrea (TG), identificação de misturas, copolimerização,
presença de ramificações e aditivos, entre outras [24].
A análise de DSC foi feita com equipamento Differential Scanning Calorimeter (DSC)
da TA Instruments, modelo DSC-2910, no laboratório de biomateriais da PUC Sorocaba, com
o intuito de verificar a curva de transição vítrea das amostras de PLLA e do nanocompósito de
PLLA com nanotubos de carbono, pois para poder ser utilizadas como biomateriais, não
poderiam apresentar alterações significativas entre as temperaturas 35 a 40°C, que se
aproximam a valores de temperatura do corpo humano.
Aproximadamente 10 mg da amostras foram aquecidas de 25 a 45°C com um rampa
de aquecimento de 5°C/min e em seguida resfriadas a 30 °C/min até –100 °C, com segundo
aquecimento até 60 °C, sob purga de N2.
As imagens do equipamento Differential Scanning Calorimeter, utilizado para a
análise de DSC encontram-se na figura 8.
20
Figura 9: Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) dos Filmes
Fonte: O autor 2016
3.6. Ensaio de adesão celular
3.6.1. Cultura de células
Para a cultura, foram utilizadas células-tronco mesenquimais da medula de
coelho gentilmente cedidas pela MS. Juliana Almeida Domingues, doutoranda no Instituto de
Biologia da Unicamp e Laboratório de Biomateriais da PUC Sorocaba.
As células foram cultivadas em garrafas para cultivo celular em meio RPMI 1640
(Sigma, USA) suplementado com 10% soro fetal bovino (Cutilab), 1% de L-glutamina
(Gibco- ThermoFisher Scientific, USA) e antibiótico penicilina-estreptoavidina (Pen Strep-
Penicillin Streptomycin (Gibco- ThermoFisher Scientific, USA).
3.6.2. Preparação dos filmes para ensaio de adesão
Os filmes de PLLA e PLLA+NTC foram cortados em círculos, mostrados na figura
10, para serem utilizados no ensaio de adesão celular.
Os filmes foram esterilizados durante uma hora em um fluxo laminar, ilustrado na
figura 11, sendo trinta minutos para cada lado, através da exposição à uma lâmpada UV (ultra
violeta), assim como as demais ferramentas utilizadas para a cultura. Cada lado da membrana
permaneceu exposto à luz ultra violeta por 30 minutos. Após a esterilização este material foi
utilizado para a cultura celular.
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Figura 10: Filmes sendo preparados para o ensaio de adesão celular: A – Filme de PLLA, B – Filme de
PLLA+NTC, C – Filmes sendo esterilizados em fluxo laminar.
Fonte: O autor 2016
Figura 11: Fluxo Laminar
Fonte: O autor 2016
3.6.3. Adesão celular em PLLA e PLLA+NTC
O ensaio de adesão celular com CTM foi realizado no laboratório de Neuroimunologia
do Instituto de Biologia da Unicamp.
O ensaio de adesão celular foi realizado em triplicata utilizando em uma placa de 24
poços (Nunc, Thermo Scientific). Os filmes foram depositados um em cada poço da placa de
24 poços e lavados com 1mL de solução balanceada de Hanks (Sigma-Aldrish, USA).
Posteriormente os filmes permaneceram em estufa por 60 minutos em imersão com Hanks
para saturar o filme.
Após, os filmes foram lavados com PBS estéril (tampão salino fosfato) para a
completa retirada do Hanks.
22
Posteriormente, foi acrescentado aos poços o meio RPMI 1640 completo contendo:
10% de soro fetal bovino estéril inativado da Cultilab Materiais para Cultura de Células
LTDA (Campinas – SP), 1% de antibiótico Pen Strep da Life Tecnologies Corporation
(USA), glutamina Gibco by Life Tecnologies Brasil, RPMI 1640 medium da Sigma Aldrich
(USA).
O meio de cultura da garrafa, na qual as células estavam em cultura foi retirado com o
auxílio de uma pipeta, lavada com Hanks e tripsinisada por 5 minutos em uma estufa de CO2,
utilizando tripsina (2500 g/L) com EDTA (250 mg/L) da Cultilab Brasil.
A reação da tripsina foi bloqueada com meio de cultura contendo 10% de soro fetal
bovino, o qual em solução com as células mesenquimais, foi transferido para um tubo de
ensaios Falcon de 50 mL, cuja centrifugação foi efetuada durante 10 minutos a 1200 rpm.
O pelet foi ressuspendido em meio completo e a viabilidade celular foi testada por
Azul de Tripan. A contagem de células viáveis foi feita em uma Câmara de New Bauer, cujo
fator é 104, obtendo 25 células vivas divididas entre os 4 quadrantes, ou seja, 6.25 células por
quadrante.
O fator de diluição das células foi de 1:10, ou seja, 10 μl de células para 90 μl de meio,
logo, a concentração final foi de 62,5 x 104 por ml. Para o plaqueamento foi utilizado 1 x 10
5
células/ml em cada poço com os filmes de PLLA e PLLA+NTC. Com o objetivo de verificar
se as células-tronco permaneciam viáveis, em cada placa de cultura os três primeiros poços
eram de células cultivadas sem o filme, em condições normais (figura: 12).
O crescimento e adesão celular foram avaliados após 24 horas (1 dia), 72 horas (3
dias) e 120 horas (5 dias) pelo leitor de placas Cytation 5. O Cytation™ 5 (BioTek- Imaging
& Microspopy) é um leitor de placas multi-modo, com sistema configurável que combina
microscopia digital automatizada com leitor de microplacas convencional que fornece
informação fenotípica da célula baseado em dados quantitativos. O módulo de microscopia
fornece ampliação na fluorescência de 10x e 40x, campo claro, campo claro colorido e
contraste de fase. Possibilita ainda a incubação controlada que pode variar de 25 °C a 65 °C
em atmosfera de CO2 com agitação.
No final de cada tempo estipulados, o meio de cultura foi retirado e as células foram
imortalizadas com 200 μl de paraformaldeído 4% por 5 minutos. Posteriormente o fixador foi
retirado e os poços lavados com PBS, para a retirada do excesso de fixador. Cada poço
recebeu 100 μl de DAPI (4’6’-diamidino-2-fenilindol) que é um corante que se associa a
dupla-fita de DNA.
23
Todos os resultados, apresentados através de fotos retiradas pelo Cytation 5 revelam o
citoplasma das CTM através do contraste de fase, o núcleo marcado com DAPI (azul), que
teve a sua máxima absorção no comprimento de onda de 377,7 nm. Temos também a
sobreposição das duas fotos, contraste de fazer e núcleo. Os ensaios foram realizados em
triplicatas, segundo o esquema apresentado nas figuras 12 e 13.
Figura 12: Esquema sobre preparo das células para o ensaio de adesão celular
Fonte: O autor 2016
Figura 13: Esquema sobre o cultivo de céluas-tronco com PLLA e PLLA+ NTC
Fonte: O autor 2016
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Microscopia Óptica
Através da Microscopia Óptica, efetuada ampliando-se as imagens em 10 e 20 vezes,
pode-se verificar diferenças entre as superfícies dos filmes de PLLA e PLLA+NTC conforme
figura 14.
Figura 14: Microscopia Óptica dos filmes
As imagens realizadas através da microscopia óptica comum, apresentaram
características da superfície dos materiais PLLA e nanocompósito de PLLA+NTC, que
embora não tenham a qualidade de uma análise realizada em microscópio eletrônico de
25
varredura, foram importantes para verificar a superfície do material, ainda que em baixo
aumento.
Na figura 14A, é possível observar a presença de pontos de tensão, causados pela
formação de bolhas durante a síntese do PLLA, porém, na figura 14B, não é possível
encontrar nenhum tipo de ponto de tensão, apenas estruturas escuras identificadas como
grupamentos de NTC no material. Ambos materiais foram sintetizados a partir da mesma
metodologia e com a mesma concentração, o que não justificaria formação de pontos de
tensão, como também são observados em maior aumento, como na figura 14C, que se
apresentam maiores e bem definidos, enquanto que na figura 14D, não foi identificado
nenhum ponto de tensão no nanocompósito. Outro fato importante é que o início da síntese de
PLLA ocorreu em aproximadamente 40 minutos em agitação para ocorrer total dissolução do
polímero, enquanto que na síntese do nanocompósito foram apenas 8 minutos para a
dissolução total do PLLA com o NTC, fato este que não pode ser encontrado em literatura
para correlação, portanto estudos posteriores serão desenvolvidos por este grupo de pesquisa.
4.2. DMTA
O ensaio de tensão/deformação do PLLA e do nanocompósito teve a função de avaliar
se houve melhora na resistência mecânica do material, como pode ser observado em alguns
compósitos reforçados com nanofibras [26]. Como podem ser vistos na figura 15, os materiais
são visualmente diferentes, embora tenham a mesma base de PLLA, sendo o filme mais claro
o de PLLA e o mais transparente o de PLLA+NTC, provavelmente resultante da diferença de
cristalinidade entre os filmes.
Figura 15: Corpos de prova do filme de PLLA e PLLA+NTC
26
A partir da análise DMTA obteve-se os gráficos de figuras 16 e 17, que demonstram o
comportamento dos filmes quando submetidos à tensão/deformação.
Figura 16: Gráfico de tensão/deformação do PLLA
Figura 17: Gráfico de tensão/deformação do PLLA+NTC
27
Os resultados mostraram que o nanocompósito estudado neste trabalho não foi capaz
de melhorar a resistência do material, como pode ser visto em trabalho de Armentano et al.
2013 [26].
Sendo assim, o PLLA apresentou maior resistência ao ensaio de tensão/deformação,
conforme figura 16, apresentando 90,24% de deformação e tensão de 12.69 MPa, enquanto
que na figura 17, o nanocompósito de PLLA+NTC apresentou 57, 57% de deformação e
6.373 MPa de tensão.
Essa análise foi importante para conhecer o comportamento do material com relação às
faixas de temperatura próximas as temperaturas corpóreas, que no caso deste trabalho foi
estipulada entre 35 e 40°C e também com relação ao seu comportamento mecânico, pois caso
o material seja utilizado como um curativo ou dispositivo cutâneo de liberação controlada de
fármaco será necessário conhecer esses parâmetros.
A utilização do DMA já deixou de ser utilizada somente para caracterização de
polímeros e outros materiais, e pode ser observada na caracterização de tecidos biológicos,
como é o caso do trabalho dos autores Abdel-Wahab e colaboradores (2010) [27] que
utilizaram o equipamento para obter magnitudes de armazenamento e perda de módulos para
diferentes frequências, onde pode ser analisado o comportamento elástico-plástico de tecido
ósseo cortical de bovino.
Conforme figura 18, pode ser observado que após o ensaio de DMA, os corpos de
prova não foram rompidos, apenas sofreram deformação, confirmando os valores de
tensão/deformação.
Figura 18: Corpo de prova deformado após ensaio de DMA
28
4.3. FTIR
No ensaio de FTIR, que teve como principal função verificar os grupos funcionais
presentes nas amostras, assim como as diferenças entre os espectros do PLLA e PLLA+NTC
como por exemplo nos picos característicos de compostos com carbono, devido à presença
dos nanotubos. Os gráficos estão representados nas figuras 19 e 20.
Figura 19: Espectroscopia do PLLA + NTC
29
Figura 20: Espectroscopia do PLLA
Na figura 21, estão ilustradas as bandas características sobrepostas das amostras de
PLLA e PLLA+NTC, para facilitar a análise e comparação, pois a partir da sobreposição,
pode-se verificar que as bandas características dos dois filmes são muito parecidas.
Figura 21: Bandas características das amostras de PLLA e PLLA+NTC sobrepostas
30
Espectros FTIR do PLA podem ser observados como são três fortes bandas devidas a
vibrações do grupo C-CO-O-C. Ou seja, a banda devida ao estiramento do C=0 em 1751 cm-1
,
a banda devida ao estiramento assimétrico do C-O em 1195 cm-1
e em 1110 cm-1
ao
estiramento simétrico C-O-C.
A ausência de uma banda intensa na região 3500-3000 cm-1
(estiramento do
grupamento 0-H) é um indicativo de ausência de subprodutos de hidrólise do PLA [28].
No nanocompósito de PLLA+NTC pode ser observadas bandas características nas
regiões de Vibrações da ligação C=O em 1747 cm-1
, outras bandas características do PLLA,
que podem ser relacionadas às vibrações do grupo éster: a banda em 1210 e 1180 cm-1
à
deformação axial assimétrica do C-O-C e em 1130 e 1042 cm-1
atribuídas à deformação axial
simétrica da ligação C-O-C.
Outras características foram observadas, como deformação axial do C-O do O-CH em
1130 cm-1
e em 1382 cm-1
, e em 1455 cm-1
a deformação angular CH2. A ausência de uma
banda intensa na região 3500-3000 cm-1
estão relacionadas a deformação do grupamento O-H,
o que indica que há ausência de subprodutos de hidrólise do PLLA.
4.4. DSC
A DSC foi efetuada com o intuito de identificar as temperaturas de Transição Vítrea
(Tg) e de fusão (Tm), cujo resultado seria de suma importância para verificar a possibilidade
de aplicação dos filmes como biomaterial. Para que o filme fosse viável, esperava-se que tais
variações de estado físico não ocorressem em temperaturas próximas às corpóreas, ou seja,
entre 35 e 40 ºC.
A análise de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) não apresentou nenhuma
alteração durante o primeiro aquecimento do material, já que não sofreu resfriamento de -
100ºC e posteriormente foi aquecido até 60ºC.
No segundo aquecimento como mostra a figura 22, houve uma pequena alteração na
curva de temperatura, sendo assim foi possível observar o valor da temperatura de transição
vítrea (Tg) do material, representado pelo pico endotérmico na região de 61ºC. Esse valor
representa a mobilidade das cadeias poliméricas durante a fase amorfa do PLLA e do
nanocompósito de PLLA+NTC, passando de um estado mais ordenado ou mais rígido, para
um estado menos ordenado, ou seja, com mais flexibilidade. Também é possível observar os
valores de temperatura de fusão (Tm), em torno de 178°C.
31
A partir deste gráfico, pode-se perceber que não houve alteração de estado
físico de ambas amostras dentro da temperatura corpórea, entre 35 e 40 °C, dado fundamental
para possibilitar a aplicação de tais materiais como biomateriais.
Figura 22: Curvas de DSC do PLLA e PLLA + NTC
4.5. Ensaio de adesão celular e viabilidade in vitro
O objetivo deste ensaio foi comparar a adesão e proliferação de células-tronco
mesenquimais (CTM) em contato com o PLLA e PLLA+NTC. A necessidade da interação
polímero-célula é dependente de características físico-químicas que permitam a identificação
da célula com a matriz extracelular, a interação ideal permitirá a célula aderir ao substrato e se
desenvolver. Por isso, a ciência dos materiais buscam incessantemente desenvolver e
aperfeiçoar materiais poliméricos que ofereçam melhor interação com os diversos tipos
celulares para o emprego na área de engenharia tecidual.
Com o objetivo de verificar se a adição do NTC ao PLLA modificaria suas
características de interação com as células, realizamos a cultura das CTM sobre este material
e comparamos com o PLLA puro. Os filmes sintetizados como descrito na metodologia foram
colocados em placa de 24 poços e o crescimento e aspecto das CTM foram avaliados em três
diferentes tempos (24h, 72h e 120h) em leitor de placas Cytation 5.
32
A figura 23 mostra que nas primeiras 24h o filme de PLLA apresenta um número
maior de células aderidas quando comparado ao PLLA+NTC (figuras 23E e 23H). Um fato
importante observado é que o filme de PLLA apresenta grande porosidade que possivelmente
permitiu uma melhor ancoragem e adesão das CTM ao substrato (figuras 23D e 23F),
diferente do observado no filme contendo o nanotubos (figuras 23G e 23I). Consideramos
importante manter em cada ensaio as CTM cultivadas em um poço que oferecesse condições
ótimas para o desenvolvimento celular, as figuras 23A, 23B e 23C demonstram a integridade
e capacidade de diferenciação das células que estavam sobre os filmes. Consideramos o DAPI
como o nosso marcador de viabilidade celular, pois ao se ligar a dupla fita de DNA nos
permite inferir sobre a sobrevivência da célula. Outro item que nos permite acreditar que as
células estão vivas é o espalhamento do citoplasma celular sobre o substrato (espraiamento),
isto só acontece após a adesão da célula que dá início ao seu desenvolvimento [16,18].
Figura 23: Adesão de células-tronco mesenquimais de coelho sobre o PLLA e PLLA+NTC após 24 horas.
Imagens de células viáveis presentes nos materiais pela marcação com DAPI (B, E e H). Contraste de fase nas
figuras A, D e G, demonstra a integridade e a forma da célula aderida ao meio. As figuras C, F e I demonstram
as imagens do DAPI e contraste de fase em sobreposição. As imagens foram geradas no leitor de placas Cytation
5 utilizando o comprimento de ondas de 377,7 nm para o DAPI.
33
Na sequência avaliamos as CTM após 72h de contato com os substratos,
supreendentemente ambos os materiais permitiram o crescimento das CTM. No entanto,
observamos uma diferença do crescimento sobre o PLLA, onde se encontra a maioria das
células crescendo dentro dos poros (24E). Esta porosidade foi observada também através de
microscopia óptica, onde são destacados espaços designados de pontos de tensão na amostra.
A avaliação do PLLA+NTC nos surpreendeu, pois demonstrou um grande aumento no
crescimento das CTM aderidas ao filme (24H), quando comparado ao crescimento em 24h.
Observando a figura 24A, 24B e 24C, aparentemente o contato com os dois substratos não
apresentou a mesma velocidade de crescimento observada no poço de controle de viabilidade
(mesenquimal), porém as células sobre os materiais apresentam a morfologia fibroblastóide
esperada.
Figura 24: Adesão de células-tronco mesenquimais de coelho sobre o PLLA e PLLA+NTC após 72 horas.
Imagens de células viáveis presentes nos materiais pela marcação com DAPI (B, E e H). Contraste de fase nas
figuras A, D e G, demonstra a integridade e a forma da célula aderida ao meio. As figuras C, F e I demonstram
as imagens do DAPI e contraste de fase em sobreposição. As imagens foram geradas no leitor de placas Cytation
5 utilizando o comprimento de ondas de 377,7 nm para o DAPI.
34
Após 120 horas, as culturas demonstraram células bem adaptadas ao substrato e com
grande capacidade de desenvolvimento (figuras 25E e 25H). A presença dos nanotubos na
composição do PLLA parece permitir uma melhor adesão e crescimento das CTM quando
comparamos ao material puro de PLLA. Praticamente em toda a extensão do filme de
PLLA+NTC analisado, foram encontrados um grande número de células aderidas ao material
com aspecto alongado. Nesta avaliação tivemos dificuldade em focalizar os núcleos marcados
com DAPI pelo leitor de placas Cytation 5, dificultando a obtenção de fotos mais nítidas das
células aderidas, possivelmente pelas células penetrarem em espaços nos filmes. Nesta fase,
as fotos ficariam mais nítidas se os materiais fossem avaliados por microscopia confocal,
onde fotos de cortes sequenciais do material permitiriam identificar as células em maior
profundidade.
Figura 25: Adesão de células-tronco mesenquimais de coelho sobre o PLLA e PLLA+NTC após 120 horas.
Imagens de células viáveis presentes nos materiais pela marcação com DAPI (B, E e H). Contraste de fase nas
figuras A, D e G, demonstra a integridade e a forma da célula aderida ao meio. As figuras C, F e I demonstram
as imagens do DAPI e contraste de fase em sobreposição. As imagens foram geradas no leitor de placas Cytation
5 utilizando o comprimento de ondas de 377,7 nm para o DAPI.
35
Cada vez mais, um grande número de pesquisadores tem buscado produzir materiais
poliméricos que apresentem características físico-químicas, mecânicas, dureza, elasticidade,
cargas elétricas e resistência, que propiciem um ambiente adequado para o desenvolvimento
celular ou mesmo para serem implantados nos organismos vivos. O balanço entre
hidrofobicidade e hidrofilidade são fatores importantes que podem influir diretamente na
interação célula-substrato, superfície hidrofílica tende suportar uma melhor interação com as
células [16, 19].
Os resultados demonstraram que o PLLA+NTC apresentou melhor adesão e
crescimento das CTM em cultura após 72h horas. Estes dados estão em concordância com
achados recentes publicados. Segundo Leal e colaboradores (2016) [21-29] os NTCs
melhoraram as características físico-químicas do PLLA, quando comparado ao material puro,
observaram também uma melhor adesão, citocompatibilidade, crescimento e diferenciação de
osteoblastos in vitro.
Em relação a este estudo, mais testes poderiam comprovar que a produção deste tipo
de nanocompósitos poderia melhorar ainda mais as perspectivas de estudos na área de cultura
celular, regeneração e engenharia tecidual.
36
5. CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos durante o desenvolvimento desse projeto, pode-se
confirmar que o material possui grande potencial para ser utilizado como biomaterial, pois os
ensaios biológicos foram satisfatórios, demonstrando afinidade das células com o material. Os
ensaios de caracterização confirmaram que o material possui estrutura resistente, capaz de ser
utilizado de forma interna ou externa ao corpo, no entanto, o nanocompósito apresentou
valores de resistência mecânica inferiores ao PLLA puro, sendo necessário mais ensaios de
caracterizações e possível aplicação desse material. Para avaliar a taxa de degradação do
nanocompósito e se será ou não absorvido pelo organismo necessita-se de mais análises.
37
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Seria interessante, como sugestão para trabalhos futuros, efetuar uma análise de
liberação controlada de drogas, pois um material com esta propriedade seria de grande
interesse para a medicina.
Poderiam ser feitas análises para avaliar o motivo pelo qual a dissolução do PLLA
ocorreu mais rapidamente quando adicionados nanotubos de carbono à solução, sendo que o
tempo de dissolução foi de 40 minutos para a solução de PLLA e de 8 minutos para a solução
contendo PLLA+NTC.
A adesão das células nos filmes poderia ser analisada através de Microscopia Confocal
com marcação para citoesqueleto e núcleo para uma melhor contagem e visualização das
células aderidas dentro do filme, nos poros do mesmo, pois as imagens efetuadas através do
Cytation 5 ficaram pouco nítidas.
Poderia ser feito ângulo de contato para determinar a hidrofilicidade dos filmes,
importante para complementar a análise de proliferação celular.
Poderia ser feito um ensaio de degradação do polímero, após análises MEV, DSC e
TGA das amostras para verificar se as células menos nítidas estão dentro dos filmes, ou se
estão menos visíveis devido ao aumento da opacidade do material, acarretada pela degradação
do mesmo.
Para garantir que não houve mortalidade ou mutação celular poderia ser feita uma
análise de genotoxicidade.
38
7. REFERÊNCIAS
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Cultivo celular- Capítulo 5 do livro: Conceitos e Métodos para Formação de Profissionais
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