similaridade genética entre indivíduos e populações distintas

XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS

IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008

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SIMILARIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS E POPULAÇÕES DISTINTAS DE COPO-DE-LEITE ( Zantedeschia aethiopica (L.) SPRENG) ATRAVÉS DE

MARCADORES RAPD

GABRIELA FERREIRA NOGUEIRA1, LUCIANO VILELA PAIVA 2, GUILHERME ARAÚJO LACERDA3, MICHELE BUENO MOURA PEREIRA4, EVÂNIA GALVÃO

MENDONÇA5, PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA6, RENATO PAIVA7

RESUMO O copo-de-leite (Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) é bastante apreciado pela beleza e versatilidade sendo utilizado tanto como flor de corte na composição de arranjos florais quanto em paisagismo. O objetivo deste trabalho foi o estudo da similaridade genética entre indivíduos e populações de copo-de-leite a partir de três origens de cultivo distintas através de marcadores moleculares RAPD. As três origens abordadas foram: Casa de Vegetação no Setor de Paisagismo do DAG/UFLA, denominada Viveiro (V), Mercado Municipal de Lavras (MM) e Casa de Vegetação do município de Montes Claros (MC). O DNA foi extraído a partir de folhas novas, utilizando-se protocolo CTAB para as reações de PCR-RAPD. Uma matriz fenotípica composta de 0 e 1 foi montada, sendo 0 a ausência de banda e 1 a presença. A representação simplificada das similaridades foi realizada pela construção de dendogramas pelo método de agrupamento UPGMA. Dentre os 32 primers inicialmente testados para as reações de RAPD, 27 primers foram selecionados por apresentarem amplificação de pelo menos um produto com padrão adequado (presença ou ausência). Pode-se observar a ocorrência de um forte agrupamento das plantas do Mercado Municipal de Lavras e Montes Claros. Esta similaridade sugere um parentesco entre estas origens, sendo consideradas plantas de porte alto em relação as plantas do viveiro. O índice de Shannon demonstrou que quanto maior a diversidade genética, menor a similaridade genética de acordo com o agrupamento UPGMA. O polimorfismo RAPD observado em copo-de-leite possibilitou a diferenciação entre 30 plantas provindas de diferentes locais de cultivo. Palavras-chave: Araceae, diversidade genética, agrupamento UPGMA, índice de Shannon. INTRODUÇÃO

O gênero Zantedeschia (Araceae), consiste em oito espécies e duas seções, todas Sul-africanas. A seção Zantedeschia é caracterizada pela presença de um rizoma tuberoso e consiste nas espécies Z. aethiopica e Z. odorata (SINGH et al., 1996). O copo-de-leite (Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) é bastante apreciado pela beleza e versatilidade sendo utilizado tanto como flor de corte na composição de arranjos florais quanto em paisagismo.

A flor é apreciada e considerada como símbolo da pureza desde os tempos mais antigos. A propagação pode ser feita através de sementes, divisão de touceiras ou por cultura

1Universidade Federal de Lavras, Departamento de Agricultura, E-mail: [email protected] 2Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: [email protected] 3Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail: [email protected] 4Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail: [email protected] 5Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail: [email protected] 6 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Agricultura, E-mail: [email protected] 7Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail: [email protected]



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de tecidos. Além das inflorescências, as folhas do copo-de-leite também estão sendo utilizadas em arranjos. (ALMEIDA & PAIVA, 2003).

De acordo com Yao et al. (1994), Zantedeschia aethiopica exibe herança plastidial biparental com base na evidência polimórfica do comprimento de fragmentos de restrição, porém estudos sobre a similaridade genética entre indivíduos de uma mesma variedade são incipientes.

Em um trabalho de suscetibilidade, Z. aethiopica se demonstrou mais resistente que cultivares de seção Aestivae ao patógeno Erwinia carotovora subsp. carotovora (SNIJDER et al., 2004). O que justifica a necessidade de estudos genético-moleculares aprofundados dessa espécie de interesse ornamental.

O mercado de plantas ornamentais está em crescimento tanto no Brasil como no mundo, o que traz a necessidade da melhoria da qualidade de mudas (DONINI et al., 2005). Devido ao fato do copo-de-leite apresentar mudas de várias procedências e variedades, como flores verdes e brancas, tornam-se necessários a sua distinção quanto à origem de seus indivíduos e populações.

O objetivo deste trabalho foi o estudo da similaridade genética entre indivíduos e populações de copo-de-leite a partir de três origens de cultivo distintas através de marcadores moleculares RAPD. MATERIAL E MÉTODOS Material

Foram utilizados neste estudo 10 indivíduos de cada população (origem), sendo estes escolhidos inteiramente ao acaso. As três origens abordadas foram: Casa de Vegetação no Setor de Paisagismo do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras, denominada Viveiro (V), Mercado Municipal de Lavras (MM) e Casa de Vegetação do município de Montes Claros (MC). Métodos Extração e quantificação do DNA

Para análise do DNA o material biológico, folhas jovens foram coletadas, identificadas e acondicionadas em saco plástico com gelo e transportadas ao Laboratório Central de Biologia Molecular – UFLA. O material foi armazenado em freezer a -80 ºC, até o momento da extração. O DNA foi extraído das folhas novas, utilizando-se protocolo CTAB com adaptações descritas por Ferreira & Grattapaglia (1995). Cerca de 1g de folhas jovens foram maceradas com pistilo e almofariz de porcelana contendo N2 líquido, até a obtenção de um pó fino. Em seguida, o pó foi transferido para microtubos resfriados em N2 líquido e adicionou-se 800 µL de tampão de extração CTAB (2% de CTAB, 100 mM de Tris (pH 8,0), 20 mM de EDTA (pH 8,0), 1,4 M de NaCl). Logo em seguida, foi adicionado 2 µL de β-mercaptoetanol a 65ºC em banho-maria por 60 min. A primeira extração dos ácidos nucléicos foi realizada com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), separando-se a fase orgânica da aquosa por centrifugação a 18000 x g por 5 min, e coletando-se o sobrenadante. À fase aquosa no novo tubo foram feitas mais uma extração com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), para a eliminação de impurezas. A precipitação das moléculas de ácidos nucléicos, contidas na solução aquosa recuperada após centrifugação com clorofórmio, foi feita pela adição de acetato de sódio 3M (NaAc pH 4,6): isopropanol frio, previamente mantido em freezer a – 20°C, na proporção 1:10. Os microtubos foram mantidos em geladeira por um período mínimo de 30 min. Após precipitação do DNA centrifugou-se novamente por 3 min a 18000 x g a uma temperatura de 20ºC, descartando o material em seguida. A este precipitado acrescentou-se 300 µL de etanol 70% gelado, e em seguida foi feita uma centrifugação a



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18000 x g por 3 min a temperatura ambiente. O precipitado formado foi seco em câmara de fluxo laminar para secar.

Posteriormente, os ácidos nucléicos foram solubilizados em 100 µL de tampão TE (1 mM de Tris e 0,1 mM EDTA), e quantificados com o auxílio do fluorímetro Hoeffer DQ 200. Para igualar as diferentes concentrações de DNA a 10 ng/mL, foram feitas, para todos os genótipos, diluições em tampão TE de acordo com a expressão: Vol TE em µL = [(volume da amostra * concentração da amostra) – (10* volume da amostra)]/10. A partir de então, as amostras se apresentaram totalmente adequadas para as reações de PCR-RAPD. Amplificação via RAPD

Moléculas de DNA foram isoladas das 30 plantas utilizadas no trabalho, sendo testados diferentes primers RAPD (série Operon) visando à diferenciação molecular entre os indivíduos. O volume final de cada reação de amplificação foi 12 µL contendo 3 µL de DNA (10 ng/µL) , 1,2 µL Tris-HCl pH 8,4 (20 nmol/L), 0,24 µL de dNTPs (10 µmol/L), 1,8 µL do primer RAPD (10 µmol/L) correspondente e 0,6 unidades (U) de enzima Taq DNA polimerase.

As reações de amplificação foram realizadas em termociclador modelo Mastercycler (Eppendorf, Hanburg, Germany), utilizando-se um programa com desnaturação inicial a 95ºC por 1 min, seguido por desnaturação 94 ºC por 10 segundos, anelamento a 36ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos. Os passos da desnaturação, anelamento e extensão foram repetidas 34 vezes e, em seguida, a reação foi finalizada por uma extensão a 72ºC por 7 min. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose 1,2% (m/v), com eletroforese a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L ta pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por um período de 1 a 2 h.

Após a eletroforese o gel foi corado em solução de brometo de etídio (0,5 µg/mL) por 20 min, lavado em água corrente por 10 min, sendo visualizado sob luz ultravioleta e fotografado no equipamento EDAS 290 (Kodak®). Somente foram consideradas as bandas monomórficas e polimórficas que se apresentaram de forma consistente e reproduzível nos géis de agarose. Análise dos dados RAPD

Para determinar a freqüência de banda para cada indivíduo, foi feita uma análise cuidadosa das fotografias dos géis. Através desta foi montado uma matriz fenotípica composta de 0 e 1, sendo 0 a ausência de banda e 1 a presença. Similaridade genética

A representação simplificada das similaridades foi realizada pela construção de dendogramas pelo método de agrupamento UPGMA – Unweighted Pair-Group Method, Arithmetic Average (SNEATH & SOKAL, 1973). Índice de diversidade genética

O índice de Shannon foi obtido com o software PopGene32 (Version 1.31) (YEH et al., 1999). RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dentre os 32 primers inicialmente testados para as reações de RAPD, 27 primers foram selecionados por apresentarem amplificação de pelo menos um produto com padrão adequado (presença ou ausência). Foram obtidas bandas RAPD polimórficos e monomórficas entre os indivíduos avaliados. Das bandas obtidas o polimorfismo foi presente em 62,96% (Figura 1). Os fragmentos amplificados variaram de 1 a 11 locos polimórficos.



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Figura 1. Eletroferograma de gel de agarose 1,2%, corrido a 100 V por 90 min, obtido a partir dos produtos da amplificação por RAPD com o primer OPU 11. A seta indica o padrão de banda considerada no trabalho.

Com o propósito de avaliar o poder de discriminação dos marcadores RAPD, com

base nas similaridades genéticas obtidas, procedeu-se uma análise de agrupamento UPGMA que resultou no dendograma (Figura 2), onde os genótipos estudados foram separados em 24 grupos.

Figura 2. Dendograma UPGMA para representação dos 30 indivíduos de copo-de-leite

(Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) em função de similaridades genéticas entre elas calculadas, a partir de 53 bandas RAPDs. Onde n = número do indivíduo, temos as populações: Viveiro (Vn), Montes Claros (MCn) e Mercado Municipal (MMn).

Pode-se observar a ocorrência de um forte agrupamento das plantas do Mercado

Municipal de Lavras e Montes Claros, sendo que as plantas MM7 e MM8 podem ser consideradas clones já que não há diferença genética entre elas. Esta similaridade sugere um parentesco entre estas origens, sendo consideradas plantas de porte alto em relação às plantas do viveiro.

Para a confirmação da diversidade genética entre as populações estudadas de copo-de-leite avaliou-se o índice de Shannon (SHANNON & WEAVER, 1949) (Tabela 1). Demonstrando assim que, quanto maior a diversidade genética pelo índice, menor a similaridade genética de acordo com o agrupamento UPGMA. Foi possível observar que a



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população do Viveiro apresenta o maior índice de diversidade e que os desvios padrões apresentados para as estimativas de similaridade indicam níveis similares de diversidade genética entre as populações. Os valores de diversidade genética encontrados estão próximos aos encontrados para espécies arbóreas onde, Lacerda et al. (2001) observaram valores de Shannon variando de 0,301 a 0,367 para Plathymenia reticulata. Torezan et al., (2005) obtiveram Índice de Shannon igual a 0,410 para indivíduos adultos de Aspidosperma polyneuron. Tais comparações revelam forte evidência de que existem níveis altos de variabilidade genética intrapopulacional. Tabela 1. Variações na diversidade das populações de copo-de-leite (Zantedeschia aethiopica

(L.) Spreng) relacionando o índice de Shannon a similaridade genética. (*) Desvio padrão.

Populações Índice de Shannon Similaridade Genética

Viveiro 0,5098 (0,2415*) 0,68

Montes Claros 0,4333 (0,2786*) 0,89

Mercado Municipal 0,3650 (0,3096*) 0,90

A obtenção de marcadores associados às plantas ornamentais de interesse é bastante

desejável, uma vez que poucos estudos são feitos no intuito de identificar estas plantas. No entanto, deve ser ressaltado que os estudos realizados neste trabalho visaram apenas à prévia distinção de 30 plantas como clones ou não, estudos mais detalhados com outras espécies do gênero, com um maior número de indivíduos e populações devem ser realizados. Porém as informações a respeito da variabilidade genética disponível deverão facilitar o trabalho de melhoristas de plantas ornamentais. CONCLUSÃO

O índice de Shannon demonstrou que quanto maior a diversidade genética, menor a similaridade genética de acordo com o agrupamento UPGMA. O polimorfismo RAPD observado em copo-de-leite possibilitou a diferenciação entre 30 plantas provindas de diferentes locais de cultivo.

Com estes resultados foi observado que os indivíduos presentes no Viveiro não seriam clones propagados de uma única touceira devido a alta divergência genética entre eles e destes das populações do Mercado Municipal e Montes Claros. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMEIDA, E. F. A.; PAIVA, P. D. O. Floricultura – 2. Cultivo de copo-de-leite. Editora: UFLA. Lavras, MG. 28p. 2003. DONINI, L. P.; FERREIRA-MOURA, I.; GUISSO, A. P.; SOUZA, J. A. de; VIÉGAS, J. Preparo de lâminas foliares de Aráceas ornamentais: desinfestação com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 72, n. 4, p. 517-522, out./dez., 2005. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores RAPD e RFLP em análise genética. Brasília: Embrapa-CENARGEN, 1995. 220p. LACERDA, D. R., ACEDO, M. D. P., LEMOS FILHO, J. P. e LOVATO, M. B. Genetic diversity and struture of natural populations of Plathymenia reticulata (Mimosoideae), a tropical tree from the Brazilian Cerrado. Molecular Ecology, Queensland, v. 10, n. 5, p. 1143-1152, 2001.



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TOREZAN, J. M. D.; SOUZA, R. F.; RUAS, P. M.; RUAS, C. F.; CAMARGO, E. H.; VANZELA, A. L. L. Genetic variabilithy of pré and post-fragmentation cohorts of Aspidosperma polyneuron Muell. Arg. (Apocynaceae). Brazilian Archives of Biology and Technology, Curitiba, v. 48, n. 2, p. 171-180, Apr/June 2005. SHANNON, C. E.; WEAVER, W. The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana, 1949. SNEATH, P. H.; SOKAL, R. R. Numerical Taxonomy: the principles and practice of numerical classification. W. H. Freeman, San Francisco, 1973. SINGH, Y.; BAIJNATH, H.; VAN WYK, A. E. Taxonomic notes on the genus Zantedeschia Spreng. (Araceae) in southern Africa. Southern African Journal Botany, Grahamstown, v. 62, p. 321–324, 1996. YAO, J. L.; COHEN, D.; ROWLAND, R. E. Plastid DNA inheritance and plastome-genome incompatibility in interspecific hybrids of Zantedeschia (Araceae). Theoretical and Applied Genetics, Berlin/Heidelberg, v. 88, p. 255–260, 1994. YEH, F. C.; YANG, R.; BOYLE, T. PopGene VERSION 1.31, 1999. Disponível em: < http://www.cbiot.ufrgs.br/programas/Windows/Biologia_molecular/PopGen32/> Acesso em 03 de set de 2008.

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