alinhamentos e busca de similaridade · e busca de similaridade ariane machado lima...

Alinhamentos de sequências e

Busca de Similaridade

Ariane Machado [email protected]

Escola de Artes, Ciências e Humanidades - USP

Contexto

http://www.ekac.org/gene.html

http://www.fuzzco.com/news/wp-content/uploads/2007/11/genome.jpg

Contexto

Buscas por sequências (o sentido biológico)

• Busca de identidade:– SABER o que é, onde está, etc.

• Busca de similaridade:– INFERIR o que é

Busca de identidade

• Comparar 2 sequências para saber se:– são iguais– possuem uma subsequência em comum

Exemplo 1

Localização de subsequência

sequência

genoma

Exemplo 1

Localização de subsequência

sequência

genoma

BUSCA POR IDENTIDADE

Exemplo 2 • Como faço para saber que proteína é essa?

MMETERLVLPPPDPLDLPLRAVELGCTGHWELLNLPGAPESSLPHGLPPCAPDLQQEAEQLFLSSPAWLPLHGVEHSARKWQRKTDPWSLLAVLGAPVPSDLQAQRHPTTGQILGYKEVLLENTNLSATTSLSLRRPPGPASQSLWGNPTRYPFWPGGMDEPTITDLNTREEAEEEIDFEKDLLTIPPGFKKGMDFAPKDCPTPAPGLLSLSCLLEPLDLGGGDEDENEAVGQPGGPRGDTVSASPCSAPLARASSLEDLVLKEASTAVSTPEAPEPPSQEQWAIPVDATSPVGDFYRLIPQPAFQWAFEPDVFQKQAILHLERHDSVFVAAHTSAGKTVVAEYAIALAQKHMTRTIYTSPIKALSNQKFRDFRNTFGDVGLLTGDVQLHPEASCLIMTTEILRSMLYSGSDVIRDLEWVIFDEVHYINDVERGVVWEEVLIMLPDHVSIILLSATVPNALEFADWIGRLKRRQIYVISTVTRPVPLEHYLFTGNSSKTQGELFLLLDSRGAFHTKGYYAAVEAKKERMSKHAQTFGAKQPTHQGGPAQDRGVYLSLLASLRTRAQLPVVVFTFSRGRCDEQASGLTSLDLTTSSEKSEIHLFLQRCLARLRGSDRQLPQVLQMSELLNRGLGVHHSGILPILKEIVEMLFSRGLVKVLFATETFAMGVNMPARTVVFDSMRKHDGSTFRDLLPGEYVQMAGRAGRRGLDPTGTVILLCKGRVPEMADLHRMMMGKPSQLQSQFRLTYTMILNLLRVDALRVEDMMKRSFSEFPSRKDSKAHEQALAELTKRLGALEEPDMTGQLVDLPEYYSWGEELTETQHMIQRRIMESVNGLKSLSAGRVVVVKNQEHHNALGVILQVSSNSTSRVFTTLVLCDKPLSQDPQDRGPATAEVPYPDDLVGFKLFLPEGPCDHTVVKLQPGDMAAITTKVLRVNGEKILEDFSKRQQPKFKKDPPLAAVTTAVQELLRLAQAHPAGPPTLDPVNDLQLKDMSVVEGGLRARKLEELIQGAQCVHSPRFPAQYLKLRERMQIQKEMERLRFLLSDQSLLLFPEYHQRVEVLRTLGYVDEAGTVKLAGRVACAMSSHELLLTELMFDNALSTLRPEEIAALLSGLVCQSPGDAGDQLPNTLKQGIERVRAVAKRIGEVQVACGLNQTVEEFVGELNFGLVEVVYEWARGMPFSELAGLSGTPEGLVVRCIQRLAEMCRSLRGAARLVGEPVLGAKMETAATLLRRDIVFAASLYTQ



Posso procurá-la em bancos de proteínas anotadas(procuro por ela, ou seja, por uma sequência idêntica)




BUSCA POR IDENTIDADE




E SE EU NÃO ENCONTRASSE UMA IDÊNTICA, MAS UMA SIMILAR?

Inferência de função a partir de similaridade

Nem sempre funciona...

2 sequências

cacttttaactctctttccaaagtccttttcatctttccttcacagtacttgttcactat cacttttaactctctttccaaagaacttttcatctttccctcacggtacttgtttgctat

Processo evolutivo

Homologia, paralogia e ortologia

• Homologia: 2 sequências são homólogas se elas possuem uma sequência ancestral comum

• Ortologia

• Paralogia

Ortologia: homologia por especiação

Paralogia: homologia por duplicação

Homologia, paralogia e ortologia

Paralogia

Ortologia

Aplicações de busca de similaridade

• Predição de genes

• Predição de estrutura– de proteínas

– de RNA/DNA

• Inferência de árvores filogenéticas

• Busca de polimorfismos / marcadores

• CUIDADO: Se duas (ou mais) sequências são parecidas:– elas podem ser homólogas– elas podem ter funções similares– elas podem ter a mesma estrutura

Identidade, similaridade e homologia

Como encontrar identidade e similaridade?

ALINHAMENTOS!

Como encontrar identidade e similaridade?

Alinhamentos de 2 sequências

• “Deixar 2 sequências o mais parecidas possível”

ROSAVERMELHAAMOROSOVERME

• Ajustando as posições de suas letras, se necessário usando espaços:

Alinhamentos de 2 sequências

• “Deixar 2 sequências o mais parecidas possível”


---ROSAVERMELHAAMOROSOVERME---

• Ajustando as posições de suas letras, se necessário usando espaços:

• Alinhamentos permitem comparações entre as sequências– Identidade– Similaridade


---ROSAVERMELHAAMOROSOVERME---

ROSAVERMELHA | AMOROSOVERME

Identidade: 8% (1/12)

---ROSAVERMELHA ||| ||||| AMOROSOVERME---


Sistema de scores

• Pontos para match (ex: +2)

• Penalidades para mismatch (ex: -1)

• Penalidades para gap– abertura (ex: -3)– extensão (ex: -1)



SCORE: ???



SCORE: ???



SCORE: -9



SCORE: ???



SCORE: -9



SCORE: +3



SCORE: -9



SCORE: +3

Para um dado sistema de score, calculo o alinhamento de maior score(alinhamento ótimo)

PROBLEMA DE OTIMIZAÇÃO

Similaridade entre os aminoácidos

• Matrizes 20x20

• Algumas matrizes:

– PAMs

– BLOSUMs

Matrizes de score(matrizes de substituição de aa)

Reference: Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *A 4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 0 -3 -2 0 -2 -1 0 -4 R -1 5 0 -2 -3 1 0 -2 0 -3 -2 2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1 0 -1 -4 N -2 0 6 1 -3 0 0 0 1 -3 -3 0 -2 -3 -2 1 0 -4 -2 -3 3 0 -1 -4 D -2 -2 1 6 -3 0 2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4 C 0 -3 -3 -3 9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -2 -4 Q -1 1 0 0 -3 5 2 -2 0 -3 -2 1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2 0 3 -1 -4 E -1 0 0 2 -4 2 5 -2 0 -3 -3 1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -1 -4 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 2 -3 0 0 -1 -4 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 2 -3 1 0 -3 -2 -1 -3 -1 3 -3 -3 -1 -4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 -2 2 0 -3 -2 -1 -2 -1 1 -4 -3 -1 -4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 0 1 -1 -4 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 0 -2 -1 -1 -1 -1 1 -3 -1 -1 -4 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 -4 -2 -2 1 3 -1 -3 -3 -1 -4 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -2 -4 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 1 -3 -2 -2 0 0 0 -4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 -2 -2 0 -1 -1 0 -4 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 2 -3 -4 -3 -2 -4 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 -1 -3 -2 -1 -4 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 -3 -2 -1 -4 B -2 -1 3 4 -3 0 1 -1 0 -3 -4 0 -3 -3 -2 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4 Z -1 0 0 1 -3 3 4 -2 0 -3 -3 1 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4 X 0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -2 0 0 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -4 * -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 1

• Matrizes 20x20


– PAMs

– BLOSUMs

Matrizes de score(matrizes de substitição de aa)

Também pode usar matrizes de nucleotídeos....

• Matrizes 20x20


– PAMs

– BLOSUMs

Matrizes de score(matrizes de substitição de aa)

Também pode usar matrizes de nucleotídeos....

Veremos sobre essas matrizes mais adiante....

Identidade, similaridade e homologia

Identidade

Similaridade

Homologia

Tipo de Medida

Quantitativa

Quantitativa

QUALITATIVA

Sentido

quantos idênticos

quantos parecidos

TEM ou NÃO TEM

um ancestral comum

Alinhamentos

• Pairwise: 2 sequências

• Múltiplo: mais de 2 sequências

Tipos de alinhamentos

• Global

• Semi-global

• Local

Alinhamento global

QUERIDA---ROSAVERMELHA|||| ||| ||||| QUEROUMAMOROSOVERME---

Alinhamento global

• Aplicação:– comparar 2 proteínas (ex. para inferir

estrutura secundária)

Estrutura 3D de proteínas

Alinhamento global

• Aplicação:– comparar 2 proteínas (ex. para inferir

estrutura secundária)

Alinhamento múltiplo

Alinhamento pairwise global

• Algoritmo Exato: Needleman-Wunsch (pairwise)

• Programas:– needle (EMBOSS)– stretcher (EMBOSS) (demora mais, mas economiza

memória)

– FASTA– Outros de alinhamento múltiplo

Alinhamento múltiplo (global)

• Ferramentas normalmente usadas NÃO SÃO EXATAS!

• Necessita alguma edição manual

• Parece não haver um consistentemente melhor que todos

Alinhamento múltiplo (global)

• Algumas ferramentas:– ClustalW / ClustalX– T-Coffee– Muscle

ClustalX

• Alinhar helicases_humanas.fasta

• Alinhar dicers.fasta

Alinhamento global

• Outras aplicações

– Identificação de SNPs (single nucleotide polimorphism) e outros polimorfismos

– Identificação de domínios proteicos mais conservados

– Identificação de isoformas

– Construção de árvores filogenéticas

Helicases humanas (SNPs)

Várias helicases (domínios)

Identificação de isoformas

Outra aplicação

• Criação de modelos e identificação de RNAs não codificantes (ou outros elementos) com estrutura secundária

• Ex: microRNAs

Alinhamento estrutural

Alinhamento semi-global



• Aplicação: montagem de genomas!

Sequenciamento shot-gun


• Aplicação: montagem de genomas!

Alinhamento local

QUERIDA---ROSAVERMELHA|||| ||| ||||| QUEROUMAMOROSOVERME---

QUER|||| QUER

ROSAVERME||| ||||| ROSOVERME

Alinhamento local

• Aplicações:

– Encontrar um gene em um genoma

sequência

genoma

Alinhamento local

• Aplicações:

– Identificar possíveis homólogos em um banco de dados


Alinhamento Local

• Algoritmo Smith-Waterman (exato)

• Programas– BLAST (NCBI / WU)– BLAT (mais preciso – bom para localização)– water (EMBOSS - exato)– matcher (demora mais, mas economiza memória -

exato)– cross_match (swat) – bom para mascaramento– FASTA

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

• NCBI BLAST ou WU-BLAST

• Heurísticas

“Palavras” do BLAST (W)

MLILII

MLIIKRDELVISWASHERE sequência query

IIKIKRKRDRDEDELELVLVIVISISWSWAWASASHSHEHERERE

todas as palavras de tamanho 3 com sobreposição

“Palavras” do BLAST (W)

• Valores default para aminoácidos e para nucleotídeos

• CUIDADO!!!!! Veja se isso não é muito para o seu caso!

Exercício

• Primeiro usar ClustalX (alinhamento global) para alinhar mouse_hemoglobinas.fasta (uma sequência genômica e um transcrito)

• Depois usar bl2seq (Blast) para alinhar as mesmas sequências

• Qual a diferença?

Exercício

• Localizar onde está (no genoma do camundongo) o gene da hemoglobina– Qual programa blast usar?– Qual sequência usar? (gene todo ou

transcrito?)

Exercício

• Encontrar hemoglobinas parecidas– Quais programas blast usar?– Qual sequência usar? (gene todo ou

transcrito?)

Formato FASTA

>Identificador da sequência

GCCCCCGGCCCCGCCCCGGCCCCGCCCCCGGCCCCGCCCCGCAAGGGTC

ACAGGTCACGGGGCGGGGCCGAGGCGGAAGCGCCCGCAGCCCGGTACCG

GCTCCTCCTGGGCTCCCTCTAGCGCCTTCCCCCCGGCCCGACTCCGCTG

GTCAGCGCCAAGTGACTTACGCCCCCGACCTCTGAGCCCGGACCGCTAG

Significância de scores

• E-value (s): número de hits com score tão bom ou melhor que s puramente por chance em um banco de dados aleatório, do mesmo tamanho e com a mesma composição de bases

• Quanto menor...



• Quanto menor... ... melhor!!!!


• P-value (s): probabilidade de obter um score tão bom ou melhor que s puramente por chance em um banco de dados aleatório, do mesmo tamanho e com a mesma composição de bases



• E-value é um número real não negativo

• Quanto menor... ... melhor!!!!

• E-value depende de...

E(S) = Kmne-λS

... por isso não existe número mágico

Programas standalone• Programas como Blast, BLAT e muuuuitos

outros:– via web server– standalone (linha de comando) – Perl

scripts!!!!

• NCBI x WU BLAST

• netblast: linha de comando, mas executa remotamente

BLAT – Blast Like Alignment Tool

• Mais rápido e mais preciso (para sequências altamente similares)

• Aplicação: mapeamento de sequências (ex: transcritos)

• Mantém um índice de todo o banco em memória (non-overlapping k-mers)

SIM4 e outros

• Para alinhar regiões sequências em

nucleotídeos de regiões codificantes

(alinhamento de códons)

Cuidado com anotações erradas!!!

• Cuidado com bancos não “curados”

Voltando ao sistema de score...

• Match/mismatch pode ser substituído por

– uma matriz 4x4 (nucleotídeos)

– uma matriz 20x20 (aminoácidos)

Similaridade entre os aminoácidos

Matrizes de score(matrizes de substituição)

Reference: Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.



• qij: probabilidade do aminoácido i ser

substituído pelo aminoácido j• pi: probabilidade do aminoácido i

mij = log (qij / pi pj) = mij


• qij: probabilidade do aminoácido i ser

substituído pelo aminoácido j• pi: probabilidade do aminoácido i

mij = 1/λ log (qij / pi pj) = mij

• Como achar qij, pi e pj?


– PAMs

– BLOSUMs

Matrizes de score(matrizes de substitição)

Matrizes PAM de aminoácidos – Point Accepted Mutation

• Dayhoff, 1978• Processo:

– Alinhamento de conjuntos de sequências relacionadas (85% id)

– Construção de árvores filogenéticas

– Cálculo da frequência de substituição de cada par de aminoácido

– Normalização das frequências: 1% de mudança ~ 50 milhões de anos (PAM1)

Matrizes PAM de aminoácidos – Point Accepted Mutation

• Em um período de 2 PAMs, pode ter havido A → ?, e então ? → D

• Extrapolação: PAM2 = PAM1 x PAM1

PAMy = PAM1 x PAM1 x .... x PAM1

• PAM120: 40% de identidade

• PAM250: 20% de identidade

PAM250Diagonal Hidrofóbicos

Hidrofílicos

Problemas das PAMs

• Inferida por um conjunto restrito de proteínas

• Extrapolação

• Muitas novas proteínas foram sequenciadas desde 78...

Matrizes BLOSUM de aminoácidos

• Henikoff & Henikoff, 1992

• Alinhamentos de blocos de vários grupos de proteínas relacionadas (banco de dados BLOCKS)

• Cálculo de frequência de substituição de cada par de aminoácido

• BLOSUMx: blocos de sequências com no máximo x% de identidade

• Ex: BLOSUM62 e BLOSUM85

BLOSUM62Reference: Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.


PAMs e BLOSUMs

• Para encontrar alinhamentos mais curtos e com maior similaridade:

– PAMs

– BLOSUMs

• Para encontrar alinhamentos mais longos e com menor similaridade:

– PAMs

– BLOSUMs

PAMs e BLOSUMs


– PAMs

– BLOSUMs


– PAMs

– BLOSUMs

mais baixas

mais altas

PAMs e BLOSUMs


– PAMs

– BLOSUMs


– PAMs

– BLOSUMs

mais baixas

mais baixas

mais altas

mais altas

Papel dos gaps

• Inserções / deleções

GLOBAL LOCALMUITO ALTAS

Inibir trechos de gap → alinhamentos ruins (muitos mismatches)

Inibir trechos de gap → maior número de blocos

MUITO BAIXAS

Muitos gaps espalhados pelo alinhamento (alinhamento ruim)

Muitos gaps espalhados pelo alinhamento (alinhamento ruim e possivelmente maior do que deveria)

Exercícios

Ex: Identidade e similaridade

• Qual é o melhor alinhamento?

a) 100% (10/10)b) 91% (95/104)c) 74% (80/108)d) 53% (59/111)

Ex - Matrizes BLOSUM

• Usando a matriz de escore default BLOSUM62, você encontrou duas proteínas que divergiram bem recentemente.

Se você quiser refinar seu alinhamento, que matriz você deveria usar (com número mais alto ou mais baixo)?

Ex - Sequências de proteína x DNA

• Sequências de DNA são menos conservadas que sequências de aminoácidos, que por sua vez são menos conservadas que a estrutura de uma proteína

• Se você quer inferir função, qual das duas usar?

• Se você quer detalhes mais finos (ex: distância evolutiva), qual usar?

Referências

Caprichado (geral):Mount - http://www.bioinformaticsonline.org/

Básico:O'Reilly - http://www.oreilly.com/catalog/bioskills/

BLAST:http://www.oreilly.com/catalog/blast/

Durbin R, Eddy S, Krogh A, Mitchison G. (1998). Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998.

alinhamentos e busca de similaridade · e busca de similaridade ariane machado lima...

Documents