segmentação e reconstrução 3d de tecidos animais em imagens

Segmentação e Reconstrução 3D de Tecidos

Animais em Imagens Histológicas

Monografia

Liliana Sofia Sales Azevedo

Mestrado em Engenharia Biomédica

Porto, Julho de 2012

Segmentação e Reconstrução 3D de Tecidos Animais em Imagens Histológicas


Licenciada em Engenharia Biomédica pela Escola Superior de Estudos Industriais e de Gestão (2011)

Monografia realizada sobre a orientação de:

Orientador:

João Manuel R. S. Tavares Prof. Associado do Departamento de Engenharia Mecânica

Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

Co-orientador:

Augusto Manuel Rodrigues Faustino Prof. Associado do Departamento de Patologia e Imunologia Molecular

Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar

Mestrado em Engenharia Biomédica

Julho de 2011


IV

Agradecimentos

Ao Professor Doutor e Orientador João Manuel Tavares pelo apoio e pelo acompanhamento

no decorrer de todo o trabalho.

Ao Professor Augusto Faustino pela disponibilidade e toda a dedicação.

À Ana pela paciência e toda a ajuda prestada.

Aos meus amigos que sempre me aconselharam e ajudaram nos momentos difíceis.

À minha família, pais e irmão, pela compreensão e carinho demonstrado.

A todos, o meu sincero agradecimento!



V

Resumo

Nos dias de hoje, a histologia é uma ciência que continua a ser considerada o “gold standart”

para aceder a informação anatómica a nível celular. Amostras de tecido são cortadas em

secções muito finas, coradas e observadas ao microscópio por um especialista para fins

patológicos.

A reconstrução a três dimensões da estrutura dos tecidos a partir de uma série de secções

histológicas é, pelo menos em teoria, uma ferramenta valiosa para expandir a dimensão

‘escondida’ da microscopia. Estudar a estrutura dos tecidos, das células e dos componentes

acelulares, bem como a sua interação pode ser útil para a deteção e diagnóstico de

determinadas patologias. Tal fato faz com que seja cada vez mais interessante encontrar novas

técnicas e soluções que auxiliem neste diagnóstico, como é o caso da reconstrução.

Tendo por base o âmbito da Engenharia Biomédica na qual a presente Monografia se encontra

inserida, considerou-se relevante efetuar uma revisão bibliográfica sobre a ciência histológica,

nomeadamente os tipos de tecidos estudados, as técnicas de processamento das secções

histológicas, os instrumentos laboratoriais utilizados bem como, reunir os conceitos básicos

para reconstrução 3D de imagens de calibre celular.

O conhecimento adquirido neste trabalho criou objetivos a alcançar num futuro próximo. Um

estudo aprofundado das técnicas de processamento das imagens histológicas é necessário, de

forma a melhorar a qualidade das imagens para reconstrução. Uma pesquisa aprofundada

sobre técnicas de alinhamento e reconstrução é também necessária.

Palavras-chave: histologia, diagnóstico, alinhamento


VI

Abstract

Nowadays, the histology is a science that is still considered the "gold standard" to access

anatomical information at a cellular level. Tissue samples are cut into very thin sections,

stained, and observed under the microscope by a specialist for pathologic purposes.

The three-dimensional reconstruction of tissues from a variety of histological sections is at

least in theory, a valuable tool to expand the ‘hidden’ dimension of microscopy.

Study the structure of the tissues, cells and acellular components, and their interactions can be

useful for the detection and diagnosis of certain pathologies. This fact makes even more

interesting to find new techniques and solutions to assist this diagnosis, such as the

reconstruction.

Based on the extent of biomedical engineering in which this Monograph is inserted, it was

considered important to perform a bibliographic review of the histological science, including

the types of tissues studied, the processing techniques of the histological sections, laboratory

instruments used as well as meet the basic concepts for 3D reconstruction of cell size images.

The knowledge gained in this work created goals to achieve in the near future. A depth study

of the processing techniques of histological images is necessary to improve the quality of

images for reconstruction. Depth research on techniques for alignment and reconstruction is

also necessary.

Keywords: histology, diagnosis, alignment


VII

Índice

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 15

1.1 Enquadramento................................................................................................................. 15

1.2. Objetivo ............................................................................................................................ 16

1.3. Estrutura ........................................................................................................................... 17

CAPÍTULO II – HISTOLOGIA .......................................................................................................... 21

2.1 Introdução ......................................................................................................................... 21

2.2 Tipos de Tecidos ................................................................................................................ 22

2.2.1 Epitelial ....................................................................................................................... 23

2.2.2 Conjuntivo .................................................................................................................. 24

2.2.3 Muscular ..................................................................................................................... 25

2.2.4 Nervoso ...................................................................................................................... 26

CAPÍTULO III – PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DOS TECIDOS ....................................................... 31

3.1 Introdução ......................................................................................................................... 31

3.2 Fixação ............................................................................................................................... 32

3.3 Inclusão ............................................................................................................................. 33

3.4 Coloração........................................................................................................................... 34

CAPÍTULO IV – INSTRUMENTOS LABORATORIAIS ....................................................................... 39

4.1 Introdução ......................................................................................................................... 39

4.2 Microscópia de Luz ............................................................................................................ 39

3.2.1 Microscopia de Fluorescência ............................................................................. 40

4.2.2 Microscopia Confocal ................................................................................................. 41

4.3 Microscopia Eletrónica ...................................................................................................... 42

4.3.1 Microscopia eletrónica de Transmissão ..................................................................... 42

4.2.2 Microscopia Eletrónica de Varredura......................................................................... 43

4.4 Artefactos e Problemas de interpretação ......................................................................... 44

CAPÍTULO V – HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA .......................................................................... 49

5.1 Introdução ......................................................................................................................... 49

5.2 Imunocitoquímica ............................................................................................................. 51

CAPÍTULO VI – RECONSTRUÇÃO 3D DE TECIDOS ........................................................................ 55

6.1 Introdução ......................................................................................................................... 55

6.2 Metodologia ...................................................................................................................... 55


VIII

6.3 Estado de Arte ................................................................................................................... 58

6.3.1 Reconstrução 3D utilizando alinhamento de imagens histológicas 2D ..................... 58

6.3.2 Reconstrução 3D utilizando referência 3D ................................................................. 59

6.3.3 Reconstrução 3D utilizando regularização ‘cross-slice’ .............................................. 60

6.3.4 Reconstrução 3D guiada por Suavização ................................................................... 61

CAPÍTULO VII – CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................... 65

7.1 Conclusão e Perspetivas Futuras ....................................................................................... 65

Bibliografia .................................................................................................................................. 66


IX

Índice de Figuras

Figura 1: Exemplo da combinação estrutural e funcional de vários tecidos no membro superior

Humano: tecido nervoso (terminações nervosas), tecido epitelial (pele), tecido muscular

(músculos), tecido ósseo, tecido cartilagíneo e sangue (de PBworks, 2012). ............................ 22

Figura 2: Corte histológico da mucosa da vesícula biliar que mostra a formação de pregas

mucosas revestidas por epitélio cilíndrico simples (seta). As células deste tipo epitelial

apresentam núcleos basais e citoplasma abundante (de UCPel, 2009). .................................... 24

Figura 3: Tecido Conjuntivo Denso Modelado (Tendão). A lâmina mostra as fibras de colagénio

ordenadas e paralelas entre si numa única direção. Entre os feixes das fibras encontram-se

fibroblastos e fibrócitos. Visualizados segundo a técnica HE (de UCPel, 2009). ........................ 25

Figura 4: Tecido Muscular Estriado Cardíaco com técnica HE. O corte mostra feixes de fibras

musculares cardíacas anastomosadas irregularmente e dispostas em várias orientações

envolvidas por tecido conjuntivo (de UCPel, 2009). ................................................................... 26

Figura 5: Corte da Medula Espinal. A técnica utilizada para corar este preparado foi o Método

Cajal. É possível identificar a substância cinzenta em forma de "H" no centro e a substância

branca externa. Substância Cinzenta (SC): presença de corpos de neurónios (neurônio motor

multipolar estrelado), contendo evidente núcleo e nucléolo. Evidenciam-se também os núcleos

das células da glia e fibras nervosas. No meio do H medular encontra-se o canal ependimário

revestido por epitélio cilíndrico simples podendo apresentar cílios em algumas regiões.

Substância Branca (SB): consta basicamente de células da glia e abundantes fibras nervosas

mielínicas (de UCPel, 2009). ........................................................................................................ 27

Figura 6: Esquema dos processos laboratoriais de preparação dos tecidos (de He et al., 2009).

..................................................................................................................................................... 31

Figura 7: Exemplo de um micrótomo, instrumento utilizado para seccionar um fragmento

tecidual em cortes finos de forma serem possíveis de analisar por um microscópio (de Carneiro

et al., 2004). ................................................................................................................................ 34

Figura 8: Coloração de azul toluidina com ph = 2,5 para um corte histológico da junção do

joelho (de Histology-World, 2012a). ........................................................................................... 35

Figura 9: Coloração de Mallory para um corte histológico da pele( de Histology-World, 2012b).

..................................................................................................................................................... 35

Figura 10: Composição de um Microscópio Ótico (de Educação, 2010). .................................... 40

Figura 11: Fotomicrografia de células de rim de um hamster em cultura, coradas com

alaranjado de acridina. O DNA (interior dos núcleos) emite luz amarela e o RNA (presente no

citoplasma) apresenta cor avermelhada (de Carneiro et al., 2004). .......................................... 41

Figura 12: Esquema ilustrativo do funcionamento do microscópio confocal (de Carneiro et al.,

2004). .......................................................................................................................................... 42

Figura 13: Microscópio eletrónico de Transmissão (de Microscópio Eletrônico, 2012). ............ 43

Figura 14: Principais componentes do microscópio eletrónico de Varredura (de Carneiro et al.,

2004). .......................................................................................................................................... 44

Figura 15: Como diferentes estruturas tridimensionais são observadas após serem cortadas em

secções delgadas. A) Diferentes secções de uma esfera oca e de um tudo oco. B) Um corte ao

longo de um único tubo enovelado pode ser visto como cortes de vários tubos. C) Cortes


X

através de uma esfera sólida e através de um cilindro sólido podem ser semelhantes (de

Carneiro et al., 2004). .................................................................................................................. 45

Figura 16: Fotomicrografia de um corte de oso tratado por uma técnica histoquímica para

demonstrar iões de cálcio. O precipitado escuro indica a presença de fosfato de cálcio no osso

e na cartilagem calcificada. Tecido cartilaginoso não calcificado (de Carneiro et al., 2004). ..... 49

Figura 17: Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de Gornori para demonstrar a

enzima fosfatase alcalina. Os locais onde esta enzima está presente, estão escuros devido ao

precipitado de sais de chumbo (de Carneiro et al., 2004). ......................................................... 50

Figura 18: O Antigénio Carcinoembriónico é uma proteína presente em vários tumores

malignos, principalmente da mama e do intestino. Esta fotomicrografia é uma demonstração

imunocitoquímica do antigénio numa secção de um adenocarcinoma do intestino grosso. O

anticorpo estava marcado com peroxidade, evidenciada pela cor castanha. Coloração HE (de

Carneiro et al., 2004). .................................................................................................................. 52

Figura 19: Esquema ilustrativo dos processos que vão desde o tecido até à reconstrução 3D e

posterior análise (de Cooper, 2009). ........................................................................................... 56

Figura 20: Os indícios visuais que distinguem tecidos incluem: cor, forma, textura e escala. O

traçado verde indica o limite entre duas camadas de tecido com aparências visuais

semelhantes (de Cooper, 2009). ................................................................................................. 57


XI

Índice de Tabelas

Tabela 1: Classificação do Tecido Epitelial consoante as suas características (adaptado de

Évora, 2012). ............................................................................................................................... 23

Tabela 2: Classificação do tecido conjuntivo e respetiva localização (adaptado de Évora, 2012).

..................................................................................................................................................... 25

Tabela 3: Classificação do Tecido Muscular e respetiva localização (adaptado de Évora, 2012).

..................................................................................................................................................... 26

Tabela 4: Classificação do Tecido Nervoso e respetiva localização (adaptado de Évora, 2012). 27

Tabela 5: Exemplo de proteínas (antigénios) importantes para o diagnóstico e controlo do

tratamento de algumas doenças (adaptado de Carneiro et al., 2004). ...................................... 52


XII

Índice de Abreviaturas

3D – Três dimensões

CT – Tomografia computadorizada

DNA – Ácido desoxirribonucleico

HE - Hematoxilina

MRI – Ressonância Magnética

PET – Tomografia por emissão de Positrões

PH- Potencial de Hidrogénio iónico

RNA – Ácido ribonucleico

SC – Substância cinzenta do Encéfalo

SB – Substância Branca do encéfalo


13

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO

1. Enquadramento

2. Objetivo

3. Estrutura


14

CAPÍTULO I - Introdução

15

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO

1.1 Enquadramento

Hoje em dia, a histologia continua a ser considerada o “gold standart” para aceder a

informação anatómica a nível celular. Amostras de tecido são cortadas em secções muito finas,

coradas e observadas ao microscópio por um especialista, para fins de diagnóstico de

patologias ou presença de formações celulares anormais (Rehorek et al., 2007).

Enquanto a histologia tradicional envolve apenas a análise de algumas amostras ou secções de

um tecido, surge agora uma necessidade crescente de observar os tecidos numa perspetiva

volumétrica, em três dimensões (3D).

A partir de um volume geométrico é possível analisar as micro-estruturas que envolvem uma

determinada amostra tecidual e, desta forma, a reconstrução 3D é um ponto de partida para a

criação de atlas histológicos a nível celular e a validação de técnicas de imagem de alta

resolução, por exemplo, a micro-tomografia computadorizada (Rehorek et al., 2007).

Sem dúvida, a reconstrução 3D é uma ferramenta poderosa e crucial para obter conhecimento

mais preciso sobre as interações celulares ou até moleculares entre os componentes de um

tecido (que visa caracterizar um determinado órgão do Corpo Humano). Além disso permitirá

analisar de que forma estas interações estão relacionadas com a presença de anormalidades

do ponto de vista fisiológico e anatómico.


16

1.2. Objetivo

A presente monografia tem como objetivos principais proporcionar uma introdução ao tema

que clarifique os conceitos base a que este está associado e efetuar uma revisão bibliográfica

que fundamente a importância da combinação da histologia tradicional com a visão espacial

em três dimensões para surgimento de uma nova perspetiva no entendimento, diagnóstico e

evolução de doenças.

CAPÍTULO I - Introdução

17

1.3. Estrutura

De maneira a tornar clara e consistente a Monografia em questão, esta encontra-se dividida

em sete Capítulos.

O capítulo II faz um pequeno sumário do que consiste a histologia e aborda os diferentes tipos

de tecidos fundamentais que existem no corpo humano, caracterizando-os. O capítulo III

descreve os vários processos de preparação que os tecidos devem ser sujeitos para poderem

ser observados por um microscópio. Estes processos incluem a fixação, a inclusão e, por fim, a

coloração. O capítulo seguinte menciona vários tipos de instrumentos laboratoriais utilizados

para observar os tecidos preparados numa lâmina. Os instrumentos são classificados tendo em

conta o seu funcionamento: microscopia de luz ou microscopia eletrónica. Por último, faz-se

referência aos artefactos e problemas de interpretação que surgem na análise das imagens

histológicas. O capítulo V caracteriza duas componentes da histologia, a Histoquímica e a

Citoquímica. Estas vertentes correspondem a métodos que identificam e localizam substâncias

específicas importantes nas amostras de tecido. O capítulo VI introduz o conceito de

reconstrução 3D de tecidos. A reconstrução pode fornecer informações importantes sobre

fenómenos e interações que ocorrem dentro dos tecidos. Primeiramente é descrita a

metodologia necessária aplicar para implementar uma reconstrução e seguidamente é criado

um estado de arte que resume diferentes perspetivas na área.

Por fim, no capítulo VII são retiradas conclusões acerca do trabalho realizado e são

mencionadas algumas perspetivas de desenvolvimento futuro.


18


19

CAPÍTULO II – HISTOLOGIA

1. Introdução

2. Tipos de Tecidos

2.1 Epitelial

2.2 Conjuntivo

2.3 Muscular

2.4 Nervoso


20

CAPÍTULO II - Histologia

21

CAPÍTULO II – HISTOLOGIA

2.1 Introdução

A histologia (do grego hystos=tecido + logos=estudo) é a ciência que se dedica ao estudo da

estrutura e funcionamento dos tecidos orgânicos (animais e plantas) (Infopédia, 2012).

Relativamente ao corpo humano, a histologia é a ciência que estuda os tecidos do corpo e de

como estes tecidos se organizam para constituir órgãos. Existem quatro tipos de tecidos

fundamentais, consoante as suas características fisiológicas e anatómicas: o tecido epitelial, o

tecido conjuntivo, o tecido muscular e o tecido nervoso (Carneiro et al., 2004)

Os tecidos são constituídos por células e uma matriz extracelular. Antigamente estes

componentes eram considerados entidades separadas: a matriz extracelular fornecia apoio

mecânico para as células e seria um meio de transporte de nutrientes às células, mas também

de transporte de metabolitos e produtos de excreção resultantes (Carneiro et al., 2004).

No entanto, nos últimos anos, os grandes progressos da investigação biomédica neste campo,

mostraram que embora as células produzam matriz extracelular, elas são influenciadas e

controladas por moléculas presentes na matriz. Estas moléculas são reconhecidas por

recetores presentes na superfície das células, permitindo a troca de informação entre o

interior das células e o meio exterior. Assim, pode-se considerar que as células e a matriz

extracelular constituem uma entidade contínua que funciona em conjunto e que reage de

acordo com estímulos e inibidores (Carneiro et al., 2004).

Visto que as células e os componentes da matriz são elementos pequenos, na ordem dos

micrómetros (µm), a histologia torna-se dependente do uso de microscópios. Para um

conhecimento adequado da biologia dos tecidos, a interação entre disciplinas como química,

fisiologia, imunologia e patologia é fundamental (Carneiro et al., 2004).


22

2.2 Tipos de Tecidos

Todos os tecidos do corpo humano são constituídos por células e matriz extracelular. A razão

pela qual distinguimos diferentes tipos de tecidos reside nas combinações específicas que

existem entre as células e a matriz. Sabe-se também que a cada tecido corresponde uma

função específica, e daí surge o termo: tecidos especializados (Carneiro et al., 2004).

A maior parte dos órgãos consiste numa combinação organizada de vários tecidos, incluindo os

quatro tipos de tecidos primários (Figura 1). O conhecimento destes tecidos básicos é

Figura 1: Exemplo da combinação estrutural e funcional de vários tecidos no membro superior Humano: tecido

nervoso (terminações nervosas), tecido epitelial (pele), tecido muscular (músculos), tecido ósseo, tecido

cartilagíneo e sangue (de PBworks, 2012).


23

fundamental para o estudo da estrutura e do funcionamento dos diferentes órgãos e dos

sistemas que os integram. É importante referir que é a disposição única destes tecidos que

permite o funcionamento de cada órgão, mas também do organismo como um todo.

2.2.1 Epitelial

O tecido epitelial ou epitélio é o tecido que cobre a superfície do corpo, reveste cavidades ou

canais e toma parte da formação de glândulas. É constituído por células mais ou menos

poliédricas que cujas membranas estão contacto íntimo; isto é, sem que haja aparentemente

algum tipo de substância intersticial ou fundamental entre elas. O tecido epitelial pode ser

subdividido em tecido epitelial de revestimento e tecido epitelial glandular (Évora, 2012).

Neste tipo de tecido as células epiteliais encontram-se organizadas muito próximas umas das

outras, constituindo os epitélios, que participam: do revestimento de superfícies, como pele,

ou do revestimento do intestino e ductos, que separa o meio interno do meio externo (como

unidades funcionais das glândulas). As células de um tecido epitelial são mantidas em contacto

íntimo por uma pequena quantidade de material intercelular e por funções celulares. Quase

todas as células epiteliais estão situadas sobre uma membrana basal, rica em glicoproteínas e

que serve para manter as células epiteliais agarradas ao tecido subjacente. O tecido epitelial é

classificado de acordo com o número de camadas de células e pela forma das células da sua

camada superficial (Tabela 1) (Évora, 2012).

.

Tabela 1: Classificação do Tecido Epitelial consoante as suas características (adaptado de Évora, 2012).

Classificação dos diferentes tipos de Tecido Epitelial

Critério Designação Características

Número de camadas de células

Simples Uma camada de células

Estratificado Várias camadas de células

Pseudoestratificado Aparenta ter duas camadas, uma simples e outra estratificada

Forma das células superficiais

Pavimentosa Células espalmadas; mais largas que do que altas

Cúbica Células são tao altas como largas

Cilíndrica Células mais altas que largas (Figura 2)


24

2.2.2 Conjuntivo

O tecido conjuntivo é composto de células e de uma matriz composta por fibras e outros

elementos não celulares, ao qual se dá o nome de substância intercelular amorfa. O tecido

conjuntivo é caracterizado pela composição da sua matriz, daí que existem diferentes tipos de

tecido conjuntivo. No corpo humano, o tecido conjuntivo penetra em quase todos os tecidos e

órgãos, ligando umas partes a outras, separando grupos de células. Pode ser encontrado como

tecido de enchimento, sob a pele, entre os músculos e ao longo dos nervos e vasos

sanguíneos. Funciona também como depósito de substâncias de reserva, nomeadamente

gordura. O tecido conjuntivo pode ser classificado em tecido conjuntivo propriamente dito ou

em tecido conjuntivo especializado (Tabela 2) (Évora, 2012).

Figura 2: Corte histológico da mucosa da vesícula biliar que mostra a formação de pregas mucosas revestidas por epitélio cilíndrico simples (seta). As células deste tipo epitelial apresentam núcleos basais e citoplasma abundante (de UCPel, 2009).


25

Tabela 2: Classificação do tecido conjuntivo e respetiva localização (adaptado de Évora, 2012).

Classificação dos diferentes tipos de tecido conjun tivo e a sua localização

Geral Laxo Tecido subcutâneo (hipoderme)

Denso Derme, Tendão (Figura 3)

Especializado Cartilagem Discos intervertebrais

Osso Ossos longos

Hematopoiético Medula óssea

Sangue Corrente sanguínea

Linfa Vasos linfáticos

2.2.3 Muscular

O tecido muscular é composto de células que possuem a propriedade da contractilidade

desenvolvida ao mais elevado nível, sendo mesmo exclusiva. As células que constituem o

tecido muscular são longas, designadas mioblastos contêm filamentos citoplasmáticos e estão

relativamente juntas. O tecido muscular está relacionado a uma enorme gama de processos do

corpo humano, nomeadamente funções essenciais como a respiração, a contração do coração,

Figura 3: Tecido Conjuntivo Denso Modelado (Tendão). A lâmina mostra as fibras de colagénio ordenadas e paralelas entre si numa única direção. Entre os feixes das fibras encontram-se fibroblastos e fibrócitos. Visualizados segundo a técnica HE (de UCPel, 2009).


26

movimentos viscerais, movimentos físicos dos membros, entre outros (Tabela 3). (Évora,

2012).

Tabela 3: Classificação do Tecido Muscular e respetiva localização (adaptado de Évora, 2012).

Classificação dos diferentes tipos de Tecido Muscular e sua localização Liso (involuntário) Tubo Digestivo e Vasos Sanguíneos

Estriado (voluntario) Músculo Esquelético

Cardíaco (involuntário estriado) Coração (Figura 4)

2.2.4 Nervoso

O tecido nervoso apresenta dois componentes principais: os neurónios, células geralmente

com longos prolongamentos e vários tipos de células da glia ou neuróglia, que sustentam os

neurónios e participam noutras funções importantes (Tabela 4) (Carneiro et al., 2004).

Figura 4: Tecido Muscular Estriado Cardíaco com técnica HE. O corte mostra feixes de fibras musculares cardíacas anastomosadas irregularmente e dispostas em várias orientações envolvidas por tecido conjuntivo (de UCPel, 2009).


27

Considera-se o sistema nervoso como constituído por uma parte central: o cérebro e espinal

medula, e outra periférica, que abrange nervos periféricos, terminações nervosas e parte dos

órgãos dos sentidos. (Évora, 2012).

Tabela 4: Classificação do Tecido Nervoso e respetiva localização (adaptado de Évora, 2012).

Classificação do Tecido nervoso e sua Localização Sistema Nervoso central (SNC)

Substância cinzenta Encéfalo, Espinal Medula (Figura 5)

Substância Branca Encéfalo, Espinal Medula

Sistema Nervoso Periférico Nervos Nervos periféricos

Gânglios nervosos Sensitivos, autónomos

Terminações nervosas Livres

Recetores Especiais Olho, Ouvido, Nariz

Figura 5: Corte da Medula Espinal. A técnica utilizada para corar este preparado foi o Método Cajal. É possível identificar a substância cinzenta em forma de "H" no centro e a substância branca externa. Substância Cinzenta (SC): presença de corpos de neurónios (neurônio motor multipolar estrelado), contendo evidente núcleo e nucléolo. Evidenciam-se também os núcleos das células da glia e fibras nervosas.No meio do H medular encontra-se o canal ependimário revestido por epitélio cilíndrico simples podendo apresentar cílios em algumas regiões.Substância Branca (SB): consta basicamente de células da glia e abundantes fibras nervosas mielínicas (de UCPel, 2009).


28


29

CAPÍTULO III – PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DOS TECIDOS

1. Introdução

2. Fixação

3. Inclusão

4. Coloração


30

CAPÍTULO III - Processos de Preparação dos Tecidos

31

CAPÍTULO III – PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DOS TECIDOS

3.1 Introdução

Para o estudo de tecidos, o procedimento mais usado é a preparação de cortes histológicos

para a observação no microscópico. No microscópio ótico, também chamado de microscópico

de luz, a imagem pode ser examinada quando um feixe de luz é transmitido através do corte.

Na medida em que os tecidos e órgãos são muito espessos para permitir a passagem de um

feixe de luz, eles devem ser seccionados para se obterem secções de reduzida espessura.

Assim, na maioria dos casos, os tecidos e órgãos são fatiados em secções ou cortes histológicos

finos que são colocados em lâminas de vidro antes de serem examinados. Estas secções

obtidas necessitam de passar por uma série de tratamentos prévios para então poderem ser

fatiados por meio de instrumentos de grande precisão chamados de micrótomos (Carneiro et

al., 2004).

Idealmente, um preparado microscópico deveria preservar de tal forma a sua estrutura e

composição molecular, de modo a assemelhar-se às condições aquando foi retirado do

organismo. No entanto, na prática a situação é mais complicada. Distorções e perdas de

componentes são fenómenos que quase sempre estão presentes, ao qual se dão o nome de

artefactos (Carneiro et al., 2004).

A Figura 6 apresenta os procedimentos empregados aos tecidos, desde o estado original

(fragmento) até ao corte histológico final para observação no microscópio. Estes processos são

Figura 6: Esquema dos processos laboratoriais de preparação dos tecidos (de He et al., 2009).


32

explicados nos subcapítulos seguintes.

3.2 Fixação

Com o objetivo de a preservar a estrutura e evitar a digestão dos tecidos por enzimas

presentes no interior das células (autólise) ou por bactérias, os fragmentos de tecidos devem

ser tratados o mais rapidamente possível depois da sua remoção. Este tratamento é chamado

de fixação. Este processo pode ser realizado recorrendo a substâncias químicas ou por

métodos físicos (menos comum) (Bioaula, 2007; Carneiro et al., 2004).

Na fixação química, os tecidos são imersos em soluções com agentes desnaturantes ou

agentes que possibilitem a estabilização das moléculas formando pontes com moléculas

vizinhas. Estas soluções são denominadas de fixadores. Como a difusão do fixador para o

interior dos tecidos exige tempo, os fragmentos de tecido são normalmente cortados em

fragmentos mais pequenos antes de serem mergulhados no agente fixador, para facilitar

penetração do agente nos tecidos e, assim, permitir uma boa conservação da estrutura. Uma

outra alternativa consiste em fazer uma perfusão intravascular do fixador que, através dos

vasos sanguíneos, alcança as zonas mais internas do tecido, resultando numa melhor fixação

(Bioaula, 2007; Carneiro et al., 2004).

Um dos melhores fixadores habitualmente utilizado é uma solução de aldeído fórmico ou

formaldeído, chamada de formol. O formaldeído é um composto que reage com grupos amina

(NH2) das proteínas dos tecidos (Carneiro et al., 2004).

Após a fixação dos fragmentos com o formol, as amostras passam por uma série crescente de

soluções compostas por álcool (a variar dos 75 a 100%), da menos concentrada para a mais

concentrada, de forma a desidratar os tecidos (Carneiro et al., 2004).


33

3.3 Inclusão

Para obter secções delgadas das estruturas com o micrótomo, é necessário que estas sejam

colocadas num meio ou substância que lhes confira uma certa consistência rígida. De todas as

substâncias que possuem estas propriedades, a parafina e algumas resinas de plástico são as

mais utilizadas (Bioaula, 2007; Carneiro et al., 2004).

O processo técnico de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição e

é normalmente precedido por duas etapas: a desidratação e o clareamento. Na primeira fase,

a água é extraída à medida que os fragmentos passam por diversos banhos compostos por

soluções com concentrações crescentes de etanol em água (normalmente de etanol de 70 a

100%). Após a desidratação, o etanol presente nos fragmentos é substituído por uma solução

intermediária (geralmente um solvente orgânico) que é miscível tanto em etanol como no

meio de inclusão (parafina ou resinas) (Bioaula, 2007; Carneiro et al., 2004).

Para a inclusão em parafina, o xilol é a substância intermediária mais utilizada. Este solvente

tem como objetivo retirar o álcool do interior dos tecidos, já que o álcool não é miscível com o

meio de inclusão, a parafina. Após este procedimento, os tecido ficam com um aspeto

transparente e/ou translúcido (Bioaula, 2007; Carneiro et al., 2004).

O passo seguinte consiste em colocar os fragmentos em moldes, que serão preenchidos com

parafina previamente derretida, normalmente de 58 a 60 ºC. O calor causa a evaporação do

solvente e os espaços vazios dentro dos tecidos são preenchidos com a parafina. No final, os

tecidos embebidos na parafina tornam-se rígidos depois de serem retirados da estufa (Bioaula,

2007; Carneiro et al., 2004).

Os blocos rígidos que contêm os tecidos são então levados a um micrótomo (Figura 7), onde

são seccionados por uma lâmina de aço ou de vidro, de modo a oferecer cortes de 1 a 10 µm

de espessura. Após serem seccionadas, as fatias são colocadas a flutuar sobre uma superfície

de água aquecida. Aqui as fatias são recolhidas por lâminas de vidro, onde vão aderir (Carneiro

et al., 2004).


34

Um modo completamente diferente de preparar secções de tecidos pode ser feito

submetendo os tecidos a um congelamento rápido. O congelamento rápido deixa os tecidos

rígidos, prontos para serem seccionados, sem ser necessário uma fase de desidratação e

inclusão. O micrómetro utilizado denomina-se criostato e foi desenvolvido para produção de

tecidos congelados (Carneiro et al., 2004).

Este método é muito útil para o estudo histoquímico de enzimas muito sensíveis pois o

congelamento, ao contrário da fixação química, não inativa a maioria das enzimas e mantém

as pequenas moléculas nos seus locais originais. Também é um processo adequado para o

estudo de lípidos presentes nos tecidos, visto que a imersão de tecidos em solventes como o

xilol dissolve substâncias lipídicas (Carneiro et al., 2004).

3.4 Coloração

Para os cortes histológicos serem estudados no microscópio, estes devem ser corados visto

que a maioria dos tecidos ficam incolores como resultado dos processos anteriores (Carneiro

et al., 2004).

Foram desenvolvidos métodos de coloração que tornam evidentes os vários componentes dos

tecidos como também facilitam a distinção entre eles. Os corantes comportam-se como

compostos ácidos ou básicos e tendem a formar ligações electroestáticas (salinas) com radicais

ionizados dos tecidos (Carneiro et al., 2004).

Figura 7: Exemplo de um micrótomo, instrumento utilizado para seccionar um fragmento tecidual em cortes finos de forma serem possíveis de analisar por um microscópio (de Carneiro et al., 2004).


35

O azul de toluidina (Figura 8) e o azul de metileno são dois exemplos de corantes básicos. A

hematoxilina comporta-se como um corante básico, ligando-se às estruturas basófilas dos

tecidos. Os principais componentes que ionizam e reagem com corantes básicos são os que

possuem na sua composição ácidos, por exemplo ácidos nucleicos, glicosaminoglicanas e

glicoproteínas ácidas. (Carneiro et al., 2004).

Os corantes ácidos como Orange G, Eosina, Fucsina Ácida coram principalmente os

componentes acidófilos dos tecidos como as mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas

citoplasmáticas e colagénio (Carneiro et al., 2004).

De todos os corantes, a combinação

Hematoxilina e Eosina (HE) é a mais utilizada. A

hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo

das células e outras estruturas ácidas como

porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz

da cartilagem hialina. Por outro lado, a eosina

cora o citoplasma e o colagénio em cor-de-rosa.

Os corantes de Mallory (Figura 9) e Masson são

corantes do tipo tricrómicos que facilitam a

observação do núcleo e do citoplasma e ajudam

a diferenciar o colagénio do músculo liso

(Carneiro et al., 2004).

Figura 8: Coloração de azul toluidina com ph = 2,5 para um corte histológico da junção do joelho (de Histology-World, 2012a).

Figura 9: Coloração de Mallory para um corte histológico da pele( de Histology-World, 2012b).


36

Embora a maioria dos corantes seja útil para visualizar os vários componentes dos tecidos, eles

oferecem pouca informação sobre a natureza química dos componentes que compoem os

tecidos. Assim, em muitos procedimentos, recorre-se à imunohistoquímica para obter mais

informação sobre um dado fragmento tecidual (Carneiro et al., 2004).

O procedimento inteiro, desde a fixação até à observação de um tecido pode variar entre 12h

a 2,5 dias. O tamanho do fragmento, o tipo de fixador e o meio de inclusão são parâmetros

que influenciam o tempo de todo o processo (Carneiro et al., 2004).


37

CAPÍTULO IV – INSTRUMENTOS LABORATORIAIS

1. Introdução

2. Microscópia de Luz

3. Microscópia Eletrónica

4. Artefactos e Problemas de Interpretação


38

CAPÍTULO IV – Instrumentos Laboratoriais

39

CAPÍTULO IV – INSTRUMENTOS LABORATORIAIS

4.1 Introdução

Após o processamento dos tecidos são utilizados microscópios óticos ou eletrónicos,

combinados com uma variedade de tecnologias de imagem, para obter imagens digitais das

secções coradas com vista a analisá-las e estudá-las. A escolha do microscópio adequado é

feita de acordo com o tipo de tecido ou o tipo de organelos ou componentes celulares que se

quer estudar.

4.2 Microscópia de Luz

O microscópio ótico ou microscópio de luz é o instrumento mais comummente utilizado para

ampliar as estruturas de um tecido e produzir uma imagem histológica de alta resolução (He et

al., 2009). É constituído por uma componente mecânica e uma componente ótica (Carneiro et

al., 2004).

A parte ótica é composta por três elementos: o condensador, a(s) objetiva(s) e a ocular. O

condensador concentra a luz e projeta um feixe luminoso. A objetiva produz uma imagem

aumentada da amostra em direção à ocular, que por sua vez amplia novamente a imagem e

projeta-a na retina (Figura 10) (Carneiro et al., 2004).


40

Estas imagens possuem uma ampliação igual ao produto do valor da objetiva pelo valor da

ocular (Carneiro et al., 2004).

Existem quatro grandes grupos de instrumentos que utilizam a microscopia de luz:

Microscopia Confucal, de Fluorescência, Hiperespetral e Multiespetral (He et al., 2009).

3.2.1 Microscopia de Fluorescência

Quando um substrato é irradiado por luz com determinado comprimento de onda, ele emitirá

luz com um comprimento de onda mais longo. Este fenómeno é denominado fluorescência

(Carneiro et al., 2004).

Na microscópia de fluorescência, as secções são irradiadas com luz ultravioleta intensa e, por

sua vez, emitem luz na porção visível do espetro, o que faz com que a amostra fluorescente

apareça brilhante sobre um fundo escuro. Os microscópios de fluorescência controlam quer a

intensidade da luz emitida, quer da luz irrradiada pelo tecido (Carneiro et al., 2004).

Como a maioria dos tecidos não fluorescem por si só, uma molecula fluorescente é necessária

para marcar os objetos de interesse, que podem ser moléculas ou componentes subcelulares.

(He et al., 2009).Por exemplo, o corante alaranjado de acridina pode ser combinado com o

Figura 10: Composição de um Microscópio Ótico (de Educação, 2010).


41

DNA ou RNA. Quando observado pelo microscópio de fluorescência, o complexo DNA-

alaranjado de acridina emite fluorescência de cor verde-amarelada e o complexo RNA-

alaranjado de acridina emite fluorescência vermelho-alaranjado. Desta forma, é possivel

identificar e localizar dois tipos de acidos nucleicos nas células (Figura 11) ; um processo

impossível de conseguir apenas recorrendo a observação a olho nu.

4.2.2 Microscopia Confocal

Como a profundidade de foco de um microscópio ótico é relativamente longo, a imagem

observada corresponde à totalidade de planos de foco possíveis de obter a partir de uma

amostra com determinada espessura. Considerando a secção de tecido como um objeto

tridimensional, o microscópio confocal torna possível focalizar apenas determinado plano. O

princípio básico deste tipo de microscópio começa por incidir um feixe laser sobre a amostra

seccionada. Um pequeno orifício permite selecionar apenas a imagem do plano focalizado.

Essa imagem chega ao detetor e é ampliada para observação (Figura 12) (Carneiro et al., 2004;

He et al., 2009).

Figura 11: Fotomicrografia de células de rim de um hamster em cultura, coradas com alaranjado de acridina. O DNA (interior dos núcleos) emite luz amarela e o RNA (presente no citoplasma) apresenta cor avermelhada (de Carneiro et al., 2004).


42

4.3 Microscopia Eletrónica

Devido à difração e à existência aberrações do sistema ótico, nem sempre a imagem oferecida

por um microscópio de luz é exatamente idêntica à original. Além disso, o comprimento de

onda da luz visível limita a resolução (até 200nm), o que permite diferenciar as células mas

dificulta a observação de pequenos detalhes dos organelos celulares (He et al., 2009).

Esta tecnologia denominada Microscopia eletrónica aplica um feixe de eletrões para “iluminar”

o tecido, cujo comprimento de onda é menor (cerca de 1nm). O uso deste tipo de

microscópios exige que os tecidos sejam fixados num meio rígido, como a parafina, e

observados numa câmara de vácuo (He et al., 2009).

4.3.1 Microscopia eletrónica de Transmissão

O microscópio eletrónico de transmissão é um sistema que permite obter imagens com grande

resolução, ao nível dos 3nm. Os eletrões são libertados pelo aquecimento de um filamento

metálico (normalmente de tungsténio) em vácuo. Estes eletrões são submetidos a uma

Figura 12: Esquema ilustrativo do funcionamento do microscópio confocal (de Carneiro et al., 2004).


43

diferença de voltagem, onde são acelerados. Ao atravessarem um pequeno orifício, forma-se

um feixe de eletrões que percorre o tubo do microscópio. No interior do tubo, os eletrões

passam por bobines elétricas chamadas lentes eletromagnéticas, que desviam os eletrões de

maneira análoga. A configuração do microscópio é semelhante à do microscópio ótico, no

entanto o trajeto dos eletrões é de cima para baixo (Figura 13) (Carneiro et al., 2004).

Como a retina humana não é sensível aos eletrões, para se observar uma imagem os eletrões

necessitam de ser projetados sobre um detetor; por exemplo uma placa fluorescente. Como a

imagem produzida pelo microscópio resulta do balanço de eletrões que atingem o detetor em

relação aos eletrões retidos no tubo, a imagem resultante é binária (Carneiro et al., 2004).

Figura 13: Microscópio eletrónico de Transmissão (de Microscópio Eletrônico, 2012).

4.2.2 Microscopia Eletrónica de Varredura

A microscopia eletrónica de varredura fornece imagens pseudo-tridimensionais das superfícies

de células, tecidos e órgãos. Neste microscópio um feixe de eletrões esquadrinha

sequencialmente a superfície da secção. Em oposição ao microscópio de transmissão, os

eletrões não atravessam a amostra; eles interagem com uma camada de metal muito fina

aplicada à amostra de tecido e são refletidos pelos átomos metálicos. Estes eletrões são

capturados por um detetor, que os transmitirá a amplificadores e a outros dispositivos que se

encarregarão de projetar o sinal num monitor (Figura 14). A imagem resultante também é

binária (Carneiro et al., 2004).


44

4.4 Artefactos e Problemas de interpretação

Ao estudar e interpretar cortes de tecidos é importante ter em conta que o aspeto final da

lâmina é o resultado de um conjunto de processos aplicados ao tecido, que iniciam-se com a

fixação e terminam com a coloração do corte. As várias etapas deste procedimento podem

distorcer tecidos, daí que a imagem resultante pode não ser totalmente igual ao aspeto do

tecido vivo original (Carneiro et al., 2004).

Figura 14: Principais componentes do microscópio eletrónico de Varredura (de Carneiro et al., 2004).


45

Uma causa comum de distorção é a retração do

tecido devida ao fixador, pelo etanol e pelo calor da

parafina usada para inclusão. Estes espaços

artificiais e outras distorções causadas pela

preparação dos cortes são chamados artefactos de

técnica. Outros artefactos podem incluir pregas no

corte, que podem ser facilmente confundidos com

capilares sanguíneos, precipitados de corantes ou

até mesmo sujidade, que pode ser confundida com

grânulos citoplasmáticos (Carneiro et al., 2004).

Por outro lado, quando uma estrutura

tridimensional é cortada em secções, o resultado

final são fatias com apenas duas dimensões

(comprimento e altura). Este fator pode induzir em

erros de interpretação. Por exemplo, uma forma

esférica pode apresentar secções similares a um

círculo, assim como as secções retiradas de um

tubo (por exemplo um capilar) podem ter um

aspeto circular (Figura 15). De forma a

compreender e formular um modelo 3D de um

fragmento original, ao analisar um determinado

corte é preciso ter em conta a (s) secção (ões) a

priori e a posteriori. Para entender a arquitetura de

um órgão é necessário estudar, assim, todas as

secções obtidas do fragmento e inclusive, em diferentes planos (Carneiro et al., 2004).

Figura 15: Como diferentes estruturas tridimensionais são observadas após serem cortadas em secções delgadas. A) Diferentes secções de uma esfera oca e de um tudo oco. B) Um corte ao longo de um único tubo enovelado pode ser visto como cortes de vários tubos. C) Cortes através de uma esfera sólida e através de um cilindro sólido podem ser semelhantes (de Carneiro et al., 2004).


46


47

CAPÍTULO V – HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

1. Introdução

2. Imunocitoquímica


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CAPÍTULO V – Histoquímica e Citoquímica

49

CAPÍTULO V – HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

5.1 Introdução

As designações histoquímica e citoquímica são usualmente utilizadas para indicar métodos que

identificam e localizam substâncias, quer em cortes histologicos (histologia) como em células

cultivadas (citologia). Os vários procedimentos especificos utilizados são baseados em reações

quimicas específicas ou interações de grande afinidade entre moléculas. Destes processos

resultam compostos insoluvéis coloridos que permitem a localização de átomos/moléculas

através do microscópio óptico ou do microscópio eletrónico (Carneiro et al., 2004).

Através destes métodos é possível identificar determinados iões em tecidos, assim como

ácidos nucleicos e também proteínas. Por exemplo, é possível localizar vários iões como cálcio,

ferro, fosfato nos tecidos, usando reacções quimicas que produzem compostos escuros ou

coloridos (Figura 16) (Carneiro et al., 2004).

Figura 16: Fotomicrografia de um corte de oso tratado por uma técnica histoquímica para demonstrar iões de cálcio. O precipitado escuro indica a presença de fosfato de cálcio no osso e na cartilagem calcificada. Tecido cartilaginoso não calcificado (de Carneiro et al., 2004).


50

O DNA pode ser identificado e quantificado nos núcleos das células por meio de uma reação

de Feulgen, que produz cor vermelha na presença de ácido desoxirribonucleico. Existem vários

métodos histoquímicos que revelam com maior ou menor especificidade um grupo de

proteinas denominadas enzimas. As fosfatases, desidrogenases e as peroxidases são algumas

enzimas possíveis de detetar (Figura 17) (Carneiro et al., 2004).

A metodologia adotada pela histoquímica consiste em três passos: no primeiro, as secções de

tecidos são imersas numa solução que contém o substracto da enzima cuja presença se quer

identificar. Seguidamente, o corte é colocado em contacto com uma substância marcadora

que reage com o resultado da transformação do substrato e, por fim, o produto final da reação

precipita sobre o local que contem a enzima, denunciando-a (Carneiro et al., 2004).

Vários procedimentos histoquímicos são usados em diagnóstico laboratorial. A reação de Perls

para ferro, as reações de PAS-amilase para glicogénio e Alcian blue para glicosaminoglicanas

são habitualmente aplicadas a biópsias de tecidos de pacientes cujo objetivo é diagnosticar

doenças em que acumulam-se nos tecidos quantidades elevadas de ferro, por exemplo,

hemacromatose (hemossiderose), glicogénio (glicogenoses), glicosaminoglicanas

(mucopolissacaridoses) e esfingolídios (esfingolipidoses) (Carneiro et al., 2004).

Figura 17: Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de Gornori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. Os locais onde esta enzima está presente, estão escuros devido ao precipitado de sais de chumbo (de Carneiro et al., 2004).

CAPÍTULO V – Histoquímica e Citoquímica

51

5.2 Imunocitoquímica

A imunocitoquímica é um método que baseia-se na interação altamente específica entre

moléculas como a interação entre um antigénio e o respetivo anticorpo. O organismo possui

células capazes de distinguir as suas próprias moléculas de moléculas estranhas ao ocorpo.

Quando exposto a moléculas estranhas, chamadas antigénios, o organismo desencadeia uma

resposta produzindo proteínas – anticorpos – que se vão ligar especificamente ao antigénio

responsável neutralizando-o, a fim de eliminar a molécula estranha. Os anticorpos são

proteinas que fazem parte de uma grande família denominada imunoglobulinas (Carneiro et

al., 2004).

Para obter uma reação imunocitoquímica, um tecido com uma dada proteína deve ser

incubado com uma solução composta pelo correspondente anticorpo. O anticorpo, com um

marcador previamente acoplado, liga-se especificamente à proteina e a sua localização é

detetada por um microscópio optico ou um microscópio eletrónico (Carneiro et al., 2004).

Esta técnica contribuiu significativamente para a investigação e melhoria dos diagnósticos

médicos, (Figura 18). A tabela 5 indica algumas aplicações da imunocitoquímica na prática

clinica (Carneiro et al., 2004).


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Tabela 5: Exemplo de proteínas (antigénios) importantes para o diagnóstico e controlo do tratamento de algumas doenças (adaptado de Carneiro et al., 2004).

Antigénios Diagnóstico Pretendido Proteínas de filamentos intermediários

Citoqueratinas Tumores de origem epitelial

Proteina fibrilar ácida glial Tumores de certas células da neuróglia

Vimentina Tumores do tecido conjuntivo

Desmina Tumores do tecido muscular

Outras proteínas

Hormonas proteícas ou polipeptídicos

Tumores produtores de hormonas proteícas ou polipeptídicos

Antigénio carcinoembriónico (CEA)

Tumores de glândulas, principalmente as do tubo digestivo e das glândulas mamárias

Receptores de hormonas esteróides

Tumores das células dos ductos das glândulas mamárias

Antigénios de vírus Infeções virais

Figura 18: O Antigénio Carcinoembriónico é uma proteína presente em vários tumores malignos, principalmente da mama e do intestino. Esta fotomicrografia é uma demonstração imunocitoquímica do antigénio numa secção de um adenocarcinoma do intestino grosso. O anticorpo estava marcado com peroxidade, evidenciada pela cor castanha. Coloração HE (de Carneiro et al., 2004).


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CAPÍTULO VI – Reconstrução 3D de Tecidos

1. Introdução

2. Metodologia

3. Estado de Arte


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CAPÍTULO VI – RECONSTRUÇÃO 3D DE TECIDOS

6.1 Introdução

A imagiologia está cada vez mais a desempenhar um papel central na resposta aos desafios

que surgem na Biologia. A Era pós-genómica chegou e com o genoma humano sequenciado, o

foco prende-se agora em entender o papel dos genes e descobrir as estruturas moleculares

que eles regulam (Cooper, 2009).

Uma imagem realista de um fenómeno como o cancro exige mais do que a observação do

comportamento molecular sobre os tecidos envolventes. Informação obtida a uma escala

celular é bastante útil para compreender mecanismos biológicos como a regulação intracelular

bem como a interação intercelular (Cooper, 2009). Desta forma, a bioimagiologia, como por

exemplo a reconstrução 3D, torna-se uma ferramenta valiosa e uma mais-valia para a

compreensão dos fenómenos.

No entanto, a implementação das técnicas de imagem à histologia nem sempre foi fácil. As

imagens histológicas em determinados casos são consideradas ‘ruidosas’ por serem

constituídas por estruturas indistinguíveis e muito repetidas, como as células. A aparência

geral texturada dificulta o alinhamento e a segmentação das imagens. O grande tamanho das

imagens microscópicas apresenta também um grande desafio em termos de computação

(Cooper, 2009). Além disso, os artefactos produzidos no processamento das imagens são

fatores a ter em consideração.

Os cada vez mais desafios propostos pela biologia e as recentes tecnologias disponíveis tornam

os dias de hoje favoráveis para o desenvolvimento de novos sistemas de análise e

reconstrução de imagem.

6.2 Metodologia

Um dos problemas da análise de imagens microscópicas, mais propriamente histológicas, é o

facto de oferecer apenas informação num plano (2D), o que impossibilita a compreensão dos

fenómenos e da relação estrutural que os diferentes constituintes do tecido têm com o

exterior.


56

A análise manual das imagens histológicas quando em massa é cansativa para um único

indivíduo e ocupa bastante tempo. Outra desvantagem reside no facto da interpretação de

uma mesma imagem histológica poder variar de indivíduo para indivíduo. (Cooper, 2009).

Uma abordagem para obter informação 3D é a reconstrução dos tecidos a partir de uma série

de imagens consecutivas através de “image registration (alinhamento de imagem)”. Um

determinado fragmento ou espécimen passa por um conjunto de processos (já descritos no

Capítulo III) até obterem-se lâminas com as imagens histológicas. A sequência de imagens é

digitalizada por ordem e seguidamente as imagens são alinhadas para gerar um dataset

volumétrico do tecido original (Figura 19) (Cooper, 2009).

Esta técnica permite a reconstrução 3D de um tecido sem limitações de profundidade, contudo

existem obstáculos que precisam de ser contornados. Estas técnicas de alinhamento têm que

ter em conta os seguintes processos:

a. Para tornar o tecido rígido, o espécimen é mergulhado em parafina quente. A

parafina depois solidifica para se obter um pequeno bloco, pronto para ser

seccionado. Estas diferenças de temperatura levam à distensão e à contração

do tecido.

b. Durante o corte do bloco de parafina, forças de tensão podem introduzir

pequenas distorções não rígidas ao tecido.

c. As pequenas fatias são colocadas num banho quente, onde vão ser recolhidas

pelas lâminas e posteriormente coradas. Os componenentes das secções

Figura 19: Esquema ilustrativo dos processos que vão desde o tecido até à reconstrução 3D e posterior análise (de Cooper, 2009).


57

podem sofrer dilatação diferencial durante o banho. O fator influencia o

tamanho da dilatação (Dauguet et al., 2007).

É necessário ter à partida conhecimento absoluto sobre os processos de deformação que o

tecido original sofre durante o seu preparamento. Desta forma, evitam-se erros na

reconstrução provocados por uma má escolha dos modelos de transformação no alinhamento.

Um fator chave na análise de tecidos consiste em identificar os seus limites. Este processo

pode ajudar a definir a morfologia das camadas de um tecido específico, calcular áreas mas

também distinguir regiões diferentes quando um tecido aparenta ser homogéneo e sem

características salientes. Tal fator pode ser solucionado com uma abordagem denominada de

segmentação (Cooper, 2009). Este método pode basear-se em pistas como: cor, forma e

textura (Figura 20). A sua dificuldade aumenta com a especificidade dada ao algoritmo (M.

Muthu Rama Krishnan et al., 2011)

Figura 20: Os indícios visuais que distinguem tecidos incluem: cor, forma, textura e escala. O traçado verde indica o limite

entre duas camadas de tecido com aparências visuais semelhantes (de Cooper, 2009).


58

6.3 Estado de Arte

A reconstrução a tridimensional (3D) da estrutura dos tecidos a partir de uma série de secções

sempre foi, pelo menos em teoria, uma ferramenta valiosa para expandir a dimensão

‘escondida’ da microscopia a fim de estudar a estrutura dos tecidos, das células e os

componentes subcelulares. (Xu et al., 2004)

Originalmente, as secções histológicas eram examinadas visualmente e eram criados

diagramas desenhados à mão. Confiava-se assim na capacidade artista do investigador ou do

biólogo treinado. Posteriormente, técnicas mais recentes na preparação de micrografias e de

imagens digitalizadas, introduziram um nível mais técnico e preciso na ciência da reconstrução

3D (Rehorek et al., 2007).

Em 1988 é relatado o primeiro trabalho na área da reconstrução 3D a partir de técnicas

histológicas. O objetivo consistia em reconstruir em 3D o cérebro através de imagens obtidas

por autoradiografia (Hibbard et al.,1988).

A reconstrução de imagens histológicas é hoje utilizada para um melhor entendimento dos

padrões de estrutura e crescimento usualmente associados a patologias. (Bussolati et al.,

2005)

6.3.1 Reconstrução 3D utilizando alinhamento de imagens histológicas 2D

O alinhamento de pares consecutivos de slices (imagens 2D) de uma pilha de imagens

histológicas permite criar geometricamente um alinhamento 3D coerente, com vista à

reconstrução. Uma abordagem comum consiste em alinhar pares de slices consecutivos de

acordo com um slice de referência, normalmente escolhido de um dataset original. (Malandain

et al., 2004; Ourselin et al., 2001b).

Várias técnicas de alinhamento aplicadas a imagens histológicas 2D foram propostas na

literatura. As técnicas manuais ou alinhamento manual contavam com o conhecimento

anatómico dos investigadores para alinhar as imagens manualmente. Estas técnicas possuíam

a desvantagem de serem demorosas, dependentes do operador e de baixa precisão (Deverell

et al., 1993; Rydmark et al., 1992).

As técnicas fiduciais, como o nome indica, utilizam marcadores fiduciais para aumentar a

performance do alinhamento (Ford-Holevinski et al., 1991; Goldszal et al., 1996; Goldszal et al.,

1995; Humm et al., 1995). O procedimento mais comum utiliza marcadores extrínsecos


59

(agulhas rígidas) no tecido para alinhar as fatias. Estas agulhas são colocadas antes do processo

de seccionamento para criar orifícios e o alinhamento consiste na sobreposição destas marcas

com vista à criação de um volume. No entanto, esta técnica é um processo invasivo que pode

danificar o espécimen e está sujeita a complicações. Se as agulhas não forem colocadas

corretamente de forma perpendicular ao corte ou se os orifícios colapsarem, a reconstrução

3D é comprometida (Simonetti et al., 2006; Streicher et al., 1997).

Em contraste às técnicas fiduciais, os métodos baseados em características ou métodos

geométricos são não invasivos e consistem em extrair características como pontos (Guest et

al., 2001; Rangarajan et al., 1997), vértices (Kay et al., 1996; Kim et al.,1995) ou contornos

(Cohen et al., 1998; Zhao et al., 1993) respetivos aos slices para efetuar o alinhamento. Aqui a

eficácia do alinhamento depende da qualidade da etapa de extração de características.

Os métodos icónicos ou baseados em intensidade tornaram-se e ainda são bastante populares

pela sua precisão. Por exemplo, Ourselin et al. (2001a) utiliza um algoritmo ‘block-matching’

robusto e Kim et al. (1997) propõe uma técnica que otimiza informação mútua.

Existem também os métodos de alinhamento baseados nos eixos principais das imagens, no

entanto estes tornaram-se obsoletos porque não eram capazes de lidar com os artefactos

resultantes do processamento histológico (Hibbard et al., 1988; Schormann et al., 1997).

6.3.2 Reconstrução 3D utilizando referência 3D

Apesar dos vários métodos para efetuar o alinhamento par a par dos slices histológicos, notou-

se que o resultado do volume obtido por vezes estava longe de assemelhar-se ao volume real

anatómico. A conformação 3D do órgão ou estrutura é perdida depois do processo de

seccionamento do tecido e o típico algoritmo de alinhamento acumulava erros. Visualmente, o

volume reconstruido exibia um padrão de ondas ao longo dos eixos de corte, denominado por

“the banana problem” (Malandain et al., 2004) ou “z-shift effect ” (Yushkevich et al., 2006).

Para resolver esse problema, determinados métodos recorreram a informação externa das

estruturas em 3D. Esta informação morfológica pode ser proveniente de modalidades de

imagem como MRI, PET, ou CT (Mega et al., 1997; Ourselin et al., 2001a; Pitiot et al., 2007;

Thompson and Toga, 1996) ou imagens fotográficas do espécimen retiradas durante o

processo de seccionamento, chamadas ‘block-face’ (Bardinet et al., 2002; Dauguet et al., 2007;

Kim et al., 1997).


60

Estes métodos visam reconstruir um modelo 3D coerente do tecido através de um

alinhamento par a par. Seguidamente, o volume construído é co-alinhado com a modalidade

escolhida (por exemplo, MRI).

Pitiot et al. (2007) propõe um sistema que toma vantagem dos detalhes microscópios da

histologia e da forma anatómica revelada pelo MRI para descrever as diferenças morfológicas

a nível macroscópico, relacionadas com possíveis alterações genéticas. Dauget et al. (2007)

criou um volume geométrico a partir das imagens fotográficas ‘block-face’. A reconstrução foi

obtida alinhando as imagens histológicas, tomando como referência o volume obtido anterior.

6.3.3 Reconstrução 3D utilizando regularização ‘cross-slice’

Em determinados casos uma referência externa anatómica não está disponível. Vários

métodos são propostos na literatura para aliviar as limitações da reconstrução par a par. O

alargamento do alinhamento par a par para uma vizinhança maior (Yushkevich et al., 2006) ou

para todo o conjunto de imagens (Guest and Baldock, 1995; Tan et al., 2007; Wirtz et al., 2004)

são duas opções viáveis.

Por exemplo, Yushkevich et al. (2006) propõe uma técnica teórica onde cada slice é alinhado

rigidamente com vários slices da vizinhança, em vez de apenas ser alinhado com o slide

anterior ou posterior. Isto define um gráfico de alinhamento cujos pesos são uma medida de

qualidade para os alinhamentos individuais. O volume pode ser reconstruído ao seguir

‘optimal local paths’ no gráfico.

Métodos mais recentes manipulam todo o conjunto de slices, como é o caso de Wirtz et al.

(2004). Os investigadores utilizam o somatório das diferenças ao quadrado como medida de

similaridade dentro do Framework presente no sistema parcial diferencial Navier-Lame para

otimizar globalmente o conjunto de transformadas elásticas. Tan et al. (2007) com vista a

melhorar uma reconstrução global inicial, estima transformações afins para os três vetores de

deslocamento calculados a partir de pontos de grande curvatura extraídos de cada slide. Estes

pontos correspondem a características do contorno dos tecidos e servem como marcadores

fiduciais. Em Guest et al. (1995) as fatias histológicas são modeladas como ‘thin plates’

elásticas com uma suave reconstrução que corresponde ao estado de equilíbrio de um método

de elementos finitos, que por sua vez otimizará uma medida de distância calculada em relação

aos pontos coincidentes entre os slides consecutivos.


61

6.3.4 Reconstrução 3D guiada por Suavização

Em determinados casos, a qualidade da reconstrução 3D é usualmente avaliada tendo em

conta a suavidade das estruturas de interesse reconstruídas na direção do eixo de corte (Guest

et al.,1995; Ju et al., 2006; Laissue et al., 2008; Tan et al., 2007; Wirtz et al., 2004).

Em Wirtz et al. (2004) um especialista examinou visualmente a suavização das bordas que

delimitavam as estruturas anatómicas de um volume histológico representativo do cérebro de

um rato e quantificou as estruturas reconhecíveis, como zonas subcorticais e ventrículos.

Guest et al. (1995) quantificou o grau de suavização da reconstrução baseando-se no

prossuposto que os pontos correspondentes em cada slice estão localizados próximos uns dos

outros, devido à baixa espessura das fatias histológicas e à morfologia da estrutura anatómica

estudada. Ju et al. (2006) propõe uma medida de suavização similar onde os pontos

correspondentes são determinados pela qualidade do emparelhamento 2D par a par.

Recentemente, Laissue et al. (2008) avaliou os erros de co-alinhamento entre MRI e um

volume histológico reconstruído, utilizando uma medida de distância entre ‘crest-lines’ dos

ventrículos laterais identificados nos dois cérebros.


62


63

CAPÍTULO VII – CONSIDERAÇÕES FINAIS

1. Conclusão e Perspetivas Futuras


64

CAPÍTULO VII – Considerações Finais

65

CAPÍTULO VII – CONSIDERAÇÕES FINAIS

7.1 Conclusão e Perspetivas Futuras

A realização desta monografia permitiu reter bastantes conceitos sobre a ciência histológica,

necessários para introduzir a reconstrução 3D de tecidos. Possuir conhecimentos sobre os

tipos de tecidos e os seus componentes torna mais fácil, à partida, a interpretação dos

resultados provenientes de um volume tridimensional. Caracterizar os diferentes processos de

preparação dos tecidos, torna-se fundamental para entender os pequenos artefactos que

possam surgir nas imagens histológicas.

Futuramente sugere-se a realização de um estudo a nível de procedimentos laboratoriais para

reduzir o número de artefactos que as secções histológicas finais possam conter, de forma a

minimizar o erro de reconstrução.

Por outro lado, torna-se necessário fazer um estudo sobre técnicas de reconstrução 3D mais

adequadas para este tipo particular de imagens, começando por encontrar a melhor solução

para melhorar e alinhar as imagens originais.

Em suma, o presente trabalho permitiu assim desenvolver um background essencial para o

desenvolvimento de trabalhos futuros na área da reconstrução histológica.


66

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