samira nogarol yunes avaliaÇÃo da freqÜÊncia de aberraÇÕes...
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Samira Nogarol Yunes
AVALIAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS
INSTÁVEIS EM GRUPOS DE INDIVÍDUOS RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE
MONTE ALEGRE – PA EXPOSTOS DIFERENCIALMENTE AO RADÔNIO.
Dissertação aprovada para obtenção
do Grau de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Radioproteção e Dosimetria
do Instituto de Radioproteção e Dosimetria
da Comissão Nacional de Energia Nuclear na
área de Biofísica das Radiações.
Orientador: Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida - IRD/CNEN Co-orientadora: Dra. Lene Holanda Sadler Veiga – IRD/CNEN
Rio de Janeiro – Brasil
Instituto de Radioproteção e Dosimetria – Comissão Nacional de Energia Nuclear
Coordenação de Pós-Graduação
2010
ii
Yunes, Samira Nogarol
Avaliação da Freqüência de Aberrações Cromossômicas Instáveis em
grupos de indivíduos residentes no município de Monte Alegre – PA
expostos ao radônio.
Samira Nogarol Yunes [Rio de Janeiro] 2010
Xiv, 68 p. 29,7 cm: fig., tab.
Dissertação (mestrado) - Instituto de Radioproteção e Dosimetria
– Rio de Janeiro, 2010.
1. Radiação Ionizante; 2. Aberração Cromossômica; 3. Monte
Alegre;
I. Instituto de Radioproteção e Dosimetria II. Título
iii
Samira Nogarol Yunes
AVALIAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS INSTÁVEIS EM GRUPOS DE INDIVÍDUOS RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE
MONTE ALEGRE – PA EXPOSTOS DIFERENCIALMENTE AO RADÔNIO.
Rio de Janeiro, 17 de dezembro de 2010.
_________________________________________________________
Dr.– IRD/CNEN
_________________________________________________________ Dr.– IRD/CNEN
________________________________________________________ Dr. – IRD/CNEN
_________________________________________________________ Dr. - UFRJ
iv
O presente trabalho foi desenvolvido no Instituto de Radioproteção e Dosimetria da Comissão Nacional de Energia Nuclear, sob orientação do Prof. Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida e Coorientadora Dra. Lene Holanda Sadler Veiga no Laboratório de Radiobiologia.
v
Este trabalho dedico a meus pais, Jorge e Regina,
que sempre acreditaram em mim, investiram nos meus sonhos.
vi
Agradecimentos
A Deus, acima de tudo, por ser a fonte de todo amor, paz, justiça e alegria da minha
vida.
A meus pais, quem devo honrar para sempre por abdicarem de suas vidas por mim.
Obrigada pelo grande amor, carinho e cuidado com o meu crescimento.
A minha grande e eterna família (Igreja Mananciais), que provam e manifestam de
maneira pratica a cada dia o seu amor incondicional.
A meu orientador, Carlos, que me ensinou a correr atrás daquilo que acredito e enxergar
alem do tubo aparentemente vazio, um exemplo de coragem e determinação.
À amiga Monica, por sua paciência e dedicação em passar suas experiências
profissionais e pessoais, que foram fundamentais para o inicio, meio e fim deste
trabalho.
As minhas amigas eternas, Cristiny e Isabelle, que fizeram do meu trabalho um lugar
inesquecível.
Aos amigos Amanda, Leonardo, Hugo, que sempre me incentivaram e ajudaram a
chegar aqui.
As amigas Claudia e Cris, pelo carinho, amor e amizade, e a todos do DEMIN.
Aos órgãos de apoio financeiro deste trabalho: IRD-CNEN e Fiocruz.
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Resumo
O município de Monte Alegre é uma região que apresenta radiação natural elevada devido à presença do radionuclídeo Urânio (238U) em seu solo, que através de seu decaimento dá origem ao elemento Radônio (226Ra), um gás radioativo (. A radioatividade das rochas passou a constituir um problema para a população de Monte Alegre, a partir do momento em que o material radioativo começou a ser utilizado na construção de casas e pavimentação de ruas. Entre todos os biomarcadores relacionados a exposições ambientais e seus efeitos biológicos, as aberrações cromossômicas são considerados bons biomarcadores como preditores do risco de câncer. Estudos sugerem que a freqüência de aberrações cromossômicas pode estar relacionada com a instabilidade genética individual e/ou exposição à radiação ionizante.Com isto nosso trabalho visou avaliar a freqüência de aberrações cromossômicas em indivíduos na região de alta radioatividade natural em Monte Alegre-PA. Como também correlacionarmos a análise citogenética feita no presente estudo com os resultados da analise da freqüência de polimorfismos de genes de reparo do DNA realizada em outro estudo que resultou em outra dissertação. De acordo com a distribuição dos dados obtidos na caracterização radiológica ambiental e no cálculo de dose, foram escolhidos residentes de domicílios com maior e menor exposição à radiação. As amostras do sangue periférico de 85 indivíduos da população residente da região de Monte Alegre – PA foram coletadas e uma analise previa de duas laminas por individuo foi realizada para verificação da qualidade da amostra. Através dessa avaliação determinamos que 33% do material coletado, ou seja, amostras de 28 indivíduos estavam em condições adequadas para análise quanto a freqüência de aberrações cromossômicas. Após as coletas os linfócitos presentes na amostra foram cultivados de acordo com a metodologia proposta para obtenção de células em metáfase. Foram analisadas 6.177 metáfases dos 28 indivíduos dentre as quais foram encontrados 4 cromossomas dicêntricos e 19 fragmentos. O numero de aberrações cromossômicas não ultrapassou o intervalo dos valores de referencia para a freqüência de dicêntrico basal. Sendo assim a exposição a radiação, produzida pelo decaimento do Urânio (238U) , nas residências de Monte Alegre não é suficiente para aumentar a freqüência de aberrações tipo-cromossômicas instáveis para o grupo de estudo. Não podemos afirmar que a combinação de variações polimórficas encontradas nos indivíduos tiveram influencia no surgimento das aberrações, já que diversos fatores podem estar envolvidos para o aparecimento de aberrações cromossômicas espontâneas. Palavras Chave: Radiação Ionizante, Aberração Cromossômica, Monte Alegre
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Abstract
The municipality of Monte Alegre is a region that presents natural radiation high due to the presence of the radionuclide uranium (238U) in its soil, which through its decay gives rise to element Rn, a gas. The radioactivity of the rocks has become a problem for the population of Monte Alegre, from the moment when the radioactive material began to be used in the construction of houses and paving of streets. Among all biomarkers related to environmental exposures and its biological effects, the chromosomal aberrations are considered good biomarkers as predictors of the risk of cancer. Studies suggest that the frequency of chromosomal aberrations may be related to the genetic instability individual and/or exposure to ionizing radiation. Our work aimed to evaluate the frequency of chromosomal aberrations in individuals in the region of high natural radioactivity in Monte Alegre-PA. As well as to correlate the cytogenetic analysis made in this study with the results of analysis of frequency of polymorphisms of genes of DNA repair carried out in another study that resulted in other dissertation. In accordance with the distribution of the data obtained in characterizing environmental radiological and in the calculation of dose, were chosen residents of homes with more and less exposure to radiation. The samples of peripheral blood of 85 individuals of the resident population of the region of Monte Alegre – PA were collected and examine provided two slides for individual was performed to verify the quality of the sample. Through this evaluation we decide that 33% of the material collected, or is, samples of 28 individuals were in suitable conditions for analysis of the frequency of chromosomal aberrations. After the collections lymphocytes present in the sample were cultivated in accordance with the methodology proposed for obtaining of cells in metaphase. were analyzed 6,177 metaphases of 28 individuals among which were found dicentric chromosomes 4 and 19 fragments. The number of chromosomal aberrations exceeded the interval of the values of reference for the frequency of dicêntrico basal. Thus the exposure to radiation, produced by decay of uranium, in the residences of Monte Alegre is not sufficient to increase the frequency of chromosomal aberrations-type unstable for the study group. We cannot say that the combination of variations polymorphic found in individuals had influences the emergence of aberrations, given that several factors may be involved to the emergence of spontaneous chromosomal aberrations. Key Words: Ionizing Radiation, Chromosomal aberration , Monte Alegre
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Índice
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1
1.1. Fontes de exposição a radiação natural ........................................................... 1
1.2. Estudos em áreas de radioatividade natural elevada no Brasil ........................ 4
1.3. O município de Monte Alegre, PA ................................................................. 6
1.4. Efeitos à saúde decorrentes da exposição `a radiação ionizante ...................... 8
1.5. Aberrações cromossômicas como eventos preditores do risco de câncer ........ 9
2. OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 13
2.1. Objetivo Especifico ......................................................................................... 13
3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ......................................................................... 14
3.1. Linfócitos Humanos ......................................................................................... 14
3.2. Estrutura Cromossômica ................................................................................. 15
3.2.1. Compactação da Cromatina .......................................................................... 15
3.2.2. Cariótipo Humano ........................................................................................ 16
3.2.3. Ciclo Celular ........................................................................................ 19
3.3. Alterações Cromossômicas induzidas por radiação ......................................... 20
3.4. Aberrações Tipo cromossômicas ..................................................................... 22
3.4.1. Aberrações instáveis ................................................................................. 23
3.5. Vias de reparo de DNA de interesse ............................................................ 26
3.5.1. Reparo por excisão de bases (BER) ............................................................ 27
3.5.2. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) ............................................... 29
3.5.3. Recombinação Homologa ............................................... 31
4. METODOLOGIA ......................................................................................... 32
x
4.1. Área de Estudo: Monte Alegre ........................................................................ 32
4.2. Escolha dos indivíduos ........................................................................ 34
4.3. Coleta das amostras ........................................................................ 35
4.4. Cultivo das células ........................................................................ 35
4.4.1 Colheita e fixação das células ........................................................................ 36
4.4.2. Preparo das laminas ........................................................................ 37
4.4.3 Coloração das laminas ........................................................................ 37
4.5. Análise Microscópica ........................................................................ 38
4.6. Purificação do DNA ........................................................................ 38
4.7. Quantificação do DNA ........................................................................ 39
4.8. Amplificação pelo método PCR (Polymerase Chain Reaction) ............... 40
4.9. Polimorfismo no comprimento de fragmentos de Restrição - RFLP ............... 42
5. RESULTADOS ......................................................................................... 44
6. DISCUSSÃO ......................................................................................... 50
7. CONCLUSÃO ......................................................................................... 55
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 56
xi
Lista de Figuras
Figura 1 – Modelo de Compactação da Cromatina ................................................. 17
Figura 2 – Ilustração Esquemática do Cariótipo Humano .................................... 18
Figura 3 – Imagem de dois cromossomos dicêntricos e um anel cêntrico com seus
fragmentos acêntricos associados (coloração Giemsa) .............................................. 25
Figura 4. Mapa da Região norte abrangendo Monte Alegre e cidades próximas ... 33
Figura 5. “Rogue cell” -Metáfase com três dicentricos e dez fragmentos (coloração
Giemsa). .................................................................................................................... 48
xii
Lista de tabelas e quadros
Tabela 1 - Condições físicas dos genes no processo de amplificação das amostras. 41
Tabela 2 - Primers específicos de cada gene para a realização do PCR ............... 41
Tabela 3 - Genes e suas enzimas de restrições correspondentes ............................. 43
Tabela 4 - Tamanho dos fragmentos de interesse após o corte com cada enzima de
restrição .................................................................................................................... 43
Tabela 5 – Freqüência de Aberração Cromossômica em linfócitos dos indivíduos
de Monte Alegre ..................................................................................................... 45
Tabela 6 - Correlação entre os dados obtidos da analise citogenética e analise
molecular dos indivíduos de Monte Alegre. .............................................................. 49
xiii
Lista de Abreviaturas e Siglas
ARNE Área de radioatividade Natural Elevada
CNEN Comissão Nacional de Energia Nuclear
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientifico e Tecnológico
CPRM Companhia de Pesquisas de Recursos Naturais
CPS Contagem por segundo
DNA Ácido desoxirribonucléico
ICRP Comissão Internacional de Proteção Radiológica
INB Indústrias Nucleares Brasileiras
IR Radiação Ionizante
LPH Linfócito Periférico Humano
PCR Reação de polimerase cadeia
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RNF Radiação Natural de Fundo
SMR Razão de Mortalidade Padronizada
UFPA Universidade Federal do Pará
UNSCEAR Comitê Cientifico das Nações Unidas sobre
Efeitos da Radiação Atômica
UV Ultravioleta
xiv
Lista de Símbolo
% Porcentagem
g Gravidade
µL Microlitro
Bq Bequerel
mSv Milisievert
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Fontes de exposição à radiação natural
A radiação natural de fundo (RNF) que tem origem no ambiente terrestre varia
grandemente em todo mundo e também dentro dos países. Os elementos radioativos
primários da crosta terrestre que leva à exposição humana são Potássio (40K), Urânio
(238U), Tório (232Th)e seus produtos radioativos de decaimento (Radio, Radônio, etc)
(EISENBUD, 1997).
Uma área com RNF alta é definida como área ou um complexo de residências
onde a soma de radiação cósmica e a radioatividade natural do solo, água, alimento, etc
levam a situação de exposição crônica por exposições interna ou externa que resulta em
uma dose efetiva anual ao publico acima de um nível definido (CARDIS, 2005). A taxa
da dose efetiva anual está classificada em quatro níveis: baixo, que significa = 5
mSv/ano (ou aproximadamente o dobro da media global de 2,4 mSv/ano); médio (5 - 20
mSv/ano); alto (20 – 50 mSv/ano); e muito alto (> 50 mSv/ano). As áreas mais
estudadas com altos níveis de radiação terrestres estão no Brasil, China, Índia, Iran
(SOHRABI, 1998, UNSCEAR, 1994).
2
A maior parte da radioatividade da atmosfera ao nível do mar se atribui à dois
isótopos de Radônio (222Rn e 220Rn) e os seus filhos. O 222Rn faz parte da serie de
decaimento de Urânio (U238). O 222Rn é um gás nobre emissor alfa que prontamente
difunde através de rochas e emana continuamente pelas paredes, o chão e teto de minas
(KATHREN, 1998). As doses decorrentes da inalação de radônio e da exposição à
radiação gama terrestre contribuem com a maior fração de exposição à radiação natural em
seres humanos, sendo juntas cerca de 70% da dose total recebida anualmente pelo
homem devido a fontes naturais. Geralmente, um aumento da exposição à
radioatividade natural está relacionado a uma maior exposição ao radônio e à exposição
à radiação gama terrestre (NRC, 1988, GREENLEE, 2001).
A exposição à radiação natural pode ser fortemente influenciada por atividades
humanas e hábitos de vida. Isto é particularmente importante para a exposição ao
radônio e seus filhos de meia-vida reduzida, onde ela é fortemente dependente do local
onde um determinado grupo populacional está situado, do tipo de construção que
caracteriza sua moradia, o tipo de material utilizado na construção e da ventilação destas
construções (NRC, 1988).
Os principais efeitos na saúde humana causadas pela intoxicação aguda por
Urânio (238U) são falência renal, problemas de desenvolvimento, crescimento retardado
dos ossos, e danos no DNA (BRUGGE, 2005). O Radônio e seus produtos de
decaimento já foram reconhecidos como carcinógenos pulmonares. Porem, as doses
para outros órgãos e tecidos provenientes da inalação do radônio e seus produtos de
3
decaimento são baixas, pelo menos são de uma ordem de magnitude inferior às do
pulmão. Estudos epidemiológicos disponíveis até o momento apontam risco de
mortalidade por câncer de pulmão maior do que por quaisquer outras causas
(UNSCEAR, 2008). A energia das partículas alfa liberada pelos produtos de decaimento
do Po218 e do Po214 são depositadas nas células do epitélio respiratório, sendo
consideradas as causadoras do câncer de pulmão associado à exposição ao radônio.
(KREWSKI, 2005)
Vários estudos em trabalhadores de minas subterrâneas expostos a radônio e
seus produtos de decaimento têm demonstrado um aumento no risco de câncer de
pulmão, quando comparado com um grupo não exposto (NRC, 1988). A exposição ao
radônio é universalmente reconhecida como a segunda causa de câncer de pulmão
depois do fumo. No entanto, o risco deste tipo de câncer para o público em geral ainda
era obtido através da extrapolação dos dados obtidos nos estudos em trabalhadores
mineiros, uma vez que os estudos epidemiológicos de radônio em residências não foram
capazes de demonstrar este risco. Somente recentemente, obtiveram-se evidências
diretas deste risco através da análise combinada de diversos estudos conduzidos na
Europa, América do Norte e China (DARBY, 2005, KREWSKI, 2005, LUBIN, 2004)
4
1.2. Estudos em áreas de radiatividade natural elevada no Brasil
Diversos trabalhos foram realizados no Brasil em áreas ditas como de
radioatividade natural elevada, devido à ocorrência de Urânio (238U) e tório em
depósitos geológicos, como areias monazíticas e intrusões vulcânicas alcalinas. Como
exemplo de algumas destas áreas temos o planalto de Poços de Caldas, a cidade de
Guarapari, Meaípe, e Araxá. (CULLEN, 1997, PENNA FRANCA, 1965, AMARAL,
1992)
VEIGA & KOIFMAN (2005), após três décadas, avaliaram o padrão de
mortalidade por câncer de algumas regiões brasileiras ditas de radioatividade natural
elevada, como Poços de Caldas, Araxá e Guarapari. Os resultados mostram que, para
Poços de Caldas e Guarapari, a mortalidade por câncer é maior do que esperada, tendo
como base uma população de referência. Para Poços de Caldas, observou-se um
aumento significativo na mortalidade por câncer de estômago, pulmão, mama e
leucemia. Em relação a Guarapari, um aumento significativo na mortalidade foi
observado para câncer de esôfago, estômago, pulmão e próstata, enquanto que para
Araxá, nenhum excesso de óbito por câncer foi observado. Os autores ressaltam que
estes resultados são importantes, uma vez que se desconhecia até então o padrão de
mortalidade por câncer destas regiões. Com estes dados, não se pode negar a existência
de um aumento na mortalidade por câncer em Poços de Caldas. No entanto, não se pode
associar este aumento com a exposição a radioatividade natural, uma vez que deve-se
levar em consideração os vários fatores de risco associados ao câncer. Araxá, que é
5
reconhecidamente uma área de radiatividade natural elevada, não apresentou excesso de
óbitos.
O principal objetivo destes estudos foi caracterizar a região do ponto de vista da
estimativa da exposição externa e contaminação interna, através da ingestão de
alimentos cultivados no local, e inalação de radônio, torônio e seus filhos. O único
estudo que teve como objetivo avaliar possíveis efeitos á saúde decorrentes da
exposição crônica à radiação ionizante foi um estudo realizado na década de 70, que
realizou uma avaliação citogenética na população residente em Guarapari. Este estudo
revelou que a freqüência de aberrações tipo cromossômicas (0.11) (dicêntricos e anéis
acêntricos) na população investigada aumentou significativamente quando comparada a
um grupo controle (0.06) (BRANDOM et al., 1978, BARCINSKI et al., 1975).
Embora a radiatividade natural em algumas destas regiões apresentasse valores
mais elevados, as exposições aí verificadas não eram representativas da exposição
média de toda a população que vive nestes locais, uma vez que os níveis de
radiatividade mais elevados, geralmente, restringem-se às áreas próximas às anomalias
geológicas. Estudos questionam a classificação das Áreas Brasileiras de Radioatividade
Natural Elevada, tendo em vista que este tipo equivocado de classificação pode levar a
um sentimento de radiofobia na população e a uma associação equivocada com casos de
câncer, má-formação congênita e outros agravos à saúde (VEIGA, 2007)
6
1.3. O município de Monte Alegre, PA
O município de Monte Alegre, localizado no Estado do Pará, é um dos mais
antigos povoamentos da Amazônia. Possui uma população estimada de cerca de 68.000
pessoas numa área de aproximadamente 21.703 km2.
Desde 1977, levantamentos radiométricos e caracterizações geológicas
realizadas pela Companhia de Pesquisas de Recursos Naturais (CPRM), órgão do
Ministério das Minas e Energia, revelaram ocorrências de Urânio (238U) na área do
Domo de Monte Alegre (PASTANA, 1999).
Trabalhos desenvolvidos pela extinta Nuclebrás, atual Indústrias Nucleares
Brasileiras (INB), em Monte Alegre revelaram anomalias de Urânio (U3O8) no membro
Barreirinha e em sedimentos de corrente na área do Domo. A presença dessa ocorrência
uranífera foi investigada pela INB com o objetivo de avaliar a viabilidade econômica
para exploração desse depósito. No entanto, a radioatividade das rochas passou a
constituir um problema para a população de Monte Alegre, principalmente na vila
Inglês de Souza, a partir do momento em que o material radiativo começou a ser
utilizado, indevidamente, na construção civil, no revestimento interno de residências,
pavimentação de calçadas e ruas.
7
Em 1995, equipes de geólogos e geofísicos da Universidade Federal do Pará
(UFPA) iniciaram um projeto para investigar os níveis de radioatividade natural na
cidade. Medidas cintilométricas (medições da radioatividade com aparelho denominado
cintilômetro) foram realizadas em cerca de 1.600 residências e instituições públicas da
cidade de Monte Alegre. Os valores reportados (300 a 2.000 cps) superaram o valor
médio de background (100 a 200 cps).
No mesmo ano da realização destas medidas, a equipe da UFPA solicitou a
colaboração da CNEN para investigar um possível aumento da exposição à
radioatividade natural da população de Monte Alegre. Um grupo de técnicos da CNEN
realizou amplo levantamento dos níveis de exposição ao radônio, nas residências de
Monte Alegre e de Inglês de Souza. Os resultados deste estudo mostraram que das 33
residências monitoradas na cidade de Monte Alegre, a concentração média de radônio
no ar foi de 75 Bq/m3, variando de 22 a 188 Bq/m3. Na região de Inglês de Souza, a
média de concentração de atividade de radônio nas 19 residências monitoradas foi de
116 Bq/m3, variando de 40 a 338 Bq/m3 (MELO, 1992).
Embora a radioatividade natural em Monte Alegre (média de 227 Bq/m3 nas
residências) seja compatível com os níveis encontrados em outras cidades do Brasil e do
mundo, não havia nenhum estudo que tivesse avaliado a incidência de câncer na região,
apenas rumores que refletiam o sentimento da população, mantendo a idéia de que os
habitantes vêm sendo vítimas fatais da radiação.
8
1.4. Efeitos à saúde decorrentes da exposição à radiação ionizante
O câncer é um efeito importante associado à exposição á radiação, tendo em
vista os resultados dos estudos provenientes dos sobreviventes da bomba atômica,
exposições médicas e exposições resultantes de acidentes e testes nucleares. Estes
estudos têm demonstrado claramente uma forte associação da exposição à radiação
ionizante em altas doses bem como altas taxas de dose com o desenvolvimento de
vários tipos de câncer. RON (1999) classificou os diferentes tipos de câncer, de acordo
com o nível de associação com a exposição à radiação, em definitivo, provável, possível
e apresentando poucas evidências.
Os tipos de câncer que apresentam um nível de associação definitivo com a
radiação são: câncer de tiróide, pulmão, mama feminina e leucemias mielocíticas. Os
que apresentam prováveis evidências são: glândulas salivares, estômago, cólon, bexiga,
ovário, pele; aqueles com possível nível de associação: câncer de fígado esôfago,
mieloma múltiplo, linfoma não-Hodgkin; e finalmente, aqueles que possuem poucas
evidências de associação com a radiação são: leucemia linfocítica crônica, pâncreas,
doença de Hodgkin, câncer de próstrata, testículo e colo uterino.
9
1.5. Aberrações cromossômicas como eventos preditores do risco de câncer
Entre todos os biomarcadores relacionados a exposições ambientais e seus
efeitos biológicos, as aberrações cromossômicas são considerados bons biomarcadores
como preditores do risco de câncer (PERERA, 2000, BONASSI, 2008). A análise
combinada dos dados de duas coortes prospectivas (nórdica e italiana), envolvendo
3541 pessoas encontrou uma associação significativa entre a freqüência de aberrações
cromossômicas e o risco de câncer. Na coorte Nórdica, a razão de mortalidade
padronizada por idade (SMR) para câncer entre os membros da coorte com maior
freqüência de aberrações cromossômicas, foi de 1,53 (95% CI=1,13-2,05), comparado
com um valor de SMR de 2,01 (95% CI=1,35-2,89) na coorte italiana (HAGMAR
1998).
Na coorte italiana, o risco de câncer dos sujeitos com alta freqüência de
aberrações cromossômicas foi maior para os cânceres hematológicos do que para todos
os outros cânceres: um valor de SMR de 5.49 (95% CI=1,49-140,5) foi calculado para
cânceres linfáticos e hematológicos.
A contagem do número de aberrações cromossômicas instáveis (dicêntricos,
anéis, acêntricos) é utilizada para a reconstrução da dose em indivíduos expostos a uma
dose aguda de radiação ionizante de baixa transferência linear de energia
(BAUCHINGER 1998) . Entretanto, a utilização da análise citogenética para estimativa
da dose não é vista como um método confiável para casos de doses fracionadas,
10
principalmente em situações de exposição de corpo não-uniforme que é o caso da
exposição radônio. Por outro lado, é fato estabelecido que populações
ocupacionalmente expostas ao radônio apresentam uma alta freqüência de aberrações
cromossômica instáveis que grupos controle (POHL-RULING & FISCHER 1979;
BRANDOM 1978, BILBAN 1998, SRAM 1993, BRANDOM 1972). Dados sobre
efeitos a longo prazo do aumento de aberrações cromossômicas em indivíduos expostos
ao radônio são escassos. BRANDON et al, (1978) e POPP et al, (2000), mencionam
que em grupos de mineiros com uma alta freqüência de aberrações cromossômicas,
alguns biomarcadores de efeito precoce para câncer de pulmão tendem a estar
aumentados. SMERHOVSKY et al, (2002) testaram a associação entre freqüência de
aberrações cromossômicas e subseqüente risco de câncer em uma coorte retrospectiva
de mineiros com conhecida exposição ao radônio e conhecido resultado de análise
citogenética. Os resultados do estudo apontaram, através do modelo de regressão de
Cox que levou em consideração a idade na época da análise citogenética, a exposição ao
radônio e o fumo, para uma forte associação estatisticamente significativa entre a
incidência de câncer e a freqüência de aberrações cromossômicas.
Os resultados dos estudos citogenéticos nas áreas de radioatividade natural
elevada são contraditórios. HAYATA et al (2004) analisaram a freqüência de
aberrações cromossômicas de residentes de uma área de radioatividade natural elevada
(ARNE) em Guangdong, China e comparou com os resultados obtidos em residentes de
uma área controle. Uma média de 2600 células por individuo foram analisadas. 27
adultos e 6 crianças na ARNE e 25 adultos e 8 crianças na área controle. Os autores
relataram um aumento na freqüência de dicêntricos e anéis em residentes da ARNE,
onde o nível de radiação natural é 3 a 5 vezes maior que na área controle, mas não
11
encontraram um aumento na freqüência de translocações na ARNE, estando dentro da
faixa de variação individual dos controles.
Por outro lado, estudos citogenéticos realizados em Ramsar no Irã, conhecida
como uma área de radiação natural elevada onde se observa a maior dose de radiação
natural (maior que 100 mSv ano-1), não mostraram diferenças significativas entre
residentes da ARNE comparado com residentes de áreas normais. Ensaios in vitro onde
uma dose aguda de 1,5 Gy de radiação gama foi realizada nos linfócitos dos residentes
das ARNE e da área controle. A freqüência de aberrações cromossômicas induzida foi
significativamente menor nos residentes da ARNE quando comparada com a área
controle. Especificamente, os habitantes da ARNE tiveram cerca de 56% do número
médio de aberrações cromossômicas induzidas dos habitantes da área de radiação
normal após e exposição à dose aguda. Os autores sugerem que a menor freqüência de
aberrações induzidas pela dose aguda de radiação nos residentes de ARNE possa ser
uma resposta adaptativa provocada pela exposição crônica a radiação ionizante
(GHIASSE-NEJAD 2002).
Devido aos problemas econômicos e sociais causados ao município de Monte
Alegre, a respeito dos riscos da exposição `a radiação ionizante, amplamente explorados
pela imprensa local e nacional, o Ministério da Saúde através do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) fomentou o desenvolvimento de
investigações na região. Os objetivos de tais investigações contemplam realizar uma
ampla caracterização radiológica nas áreas urbanas e rurais, assim como uma avaliação
12
epidemiológica, incluindo o estudo de biomarcadores genéticos em residentes do
Município de Monte Alegre.
Com isso o presente estudo contribuirá para traçar um perfil epidemiológico da
região de Monte Alegre e responder de forma empírica, questionamentos que são
apenas sugestivos aos possíveis efeitos `a saúde decorrentes desta exposição.
13
2. OBJETIVO GERAL
Caracterização genotípica e avaliação da freqüência dos indivíduos da população
de Monte Alegre quanto a instabilidade cromossômica.
2.1. Objetivo específico
Avaliar a freqüência de aberração cromossômica de um grupo populacional com
maior exposição ao Radônio em relação a um grupo controle com menor exposição,
residentes em Monte Alegre – PA.
Avaliar a relação entre a freqüência de aberrações tipo cromossômicas e a
presença de polimorfismos em genes de reparo de DNA no mesmo grupo de estudo.
14
3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
3.1. Linfócitos Humanos
As células mais prontamente e acessíveis para fazer uma análise cromossômica
em grande escala, que são capazes de crescer e se dividir rapidamente em cultura, são os
linfócitos periféricos humanos (LPHs), especificamente os linfócitos T.
Os LPHs representam uma população de células que estão predominantemente
na fase pré-sintética do DNA do ciclo celular (fase Go). Somente 0.2% ou menos dos
LPHs estão inseridos no ciclo celular, estes provavelmente provem do grupo de células
linfóides grandes que representam linfócitos estimulados ou células plasmas maduras.
As células deste grupo podem resultar numa mitose rara ocasionalmente encontrada no
sangue periférico.
A estimativa do numero total de linfócitos em jovens é de aproximadamente 500
x 109 . Somente 2% ( 10 x109 ) destes estão presentes no sangue periférico e os outros
geralmente estão distribuídos nos outros tecidos, com concentrações particulares no
timu, linfonodos, tonsinas, tecido linfático do intestino, baço e na medula óssea. O
tempo de vida dos linfócitos varia e a definição deste tempo pode significar que a célula
morre ou se divide (AIRES, 1999).
15
Para interpretar as aberrações cromossômicas induzidas in vivo em humanos, é
de extrema importância que a maior parte dos linfócitos periféricos pertençam ao
“grupo de redistribuição”. Ou seja, os linfócitos devem ter deixado o sangue periférico,
passado pelo baço, os linfonodos e outros tecidos, e voltar para circulação. A media de
tempo que um linfócito do grupo de redistribuição fica no sangue periférico é mais ou
menos 30 minutos. É estimado que aproximadamente 80%, ou seja, 400 x 109 linfócitos,
pertencem ao grupo de redistribuição e que o tempo geral de circulação é de 12 horas.
Isto significa que os linfócitos com aberrações cromossômicas que foram induzidos a
qualquer parte do corpo estão presentes no sangue periférico. Assim, com a análise de
linfócitos, não só as aberrações cromossômicas que foram induzidas nos linfócitos do
sangue periférico podem ser detectadas, como também aquelas que foram induzidas nos
linfócitos distribuídos pelo corpo em órgãos diferentes (BOGEN, 1993).
3.2. Estrutura cromossômica
3.2.1. Compactação da Cromatina
Todos os organismos eucarióticos apresentam formas elaboradas de compactar
seu DNA em cromossomos. Este feito notável de compactação é realizado por proteínas
que enrolam e dobram o DNA em níveis cada vez mais altos de organização. Estas
proteínas são divididas em duas classes gerais: as histonas e as proteínas cromossômicas
não-histonas que não são tão bem caracterizadas, mas que parecem ser cruciais para o
estabelecimento de um ambiente apropriado para garantir o comportamento normal dos
16
cromossomos e a expressão apropriada dos genes. O envolvimento de tais estruturas
internas na formação das aberrações cromossômicas ainda não foram elucidadas.O
complexo das duas classes de proteínas com o DNA nuclear é chamado de um
nucleossomo, que é a unidade estrutural básica da cromatina. A associação do DNA e
histonas formando o nucleossomo já foi demonstrada com detalhes significativos,
embora a associação das proteínas não-histonicas com o nucleossomo ainda não tenha
sido compreendida completamente. As estruturas internas também podem ser
identificadas, como regiões coradas pela prata, sob luz do microscópio, quando o
cromossomo está em diferentes estágios mitóticos (PAULSON 1977, CREMER 1996).
Um modelo simples da organização do cromossomo em metáfase está representado na
figura 1 .
3.2.2. Cariótipo Humano
Com exceção das células da linhagem germinativa, todas as células que
contribuem para o nosso corpo são chamadas de células somáticas. Os 46 cromossomos
das células somáticas humanas constituem 23 pares. Destes 23 pares, 22 são similares
em homens e mulheres e são chamados de autossomos, numerados em ordem
decrescente do maior (cromossomo 1) até o menor (cromossomo 21 e 22). O par
restante constitui os cromossomos sexuais (NUSSBAUM 2002). O Cariótipo do homem
está ilustrado na figura 2.
17
Figura 1. Modelo de compactação da cromatina. Esta ilustração esquemática mostra algumas das muitas ordens de compactação da cromatina, postuladas para explicar a estrutura altamente condensada do cromossomo mitótico.
18
.
Figura 2. Ilustração esquemática do cariótipo humano.
19
3.2.3. Ciclo Celular
As informações importantes sobre os efeitos clastogenicos dos agentes químicos
e físicos nas células interfásicas podem ser obtidos através da análise de cromossomos
no momento da divisão celular (chamada mitose para células somáticas). As células
somáticas de interesse para a dosimetria Biológica são os linfócitos periféricos. Essa
divisão possui fases que podem ser identificadas pela aparência e função. Durante a
mitose, fases como prófase, metáfase, anáfase e telófase são distinguidas. Na interfase,
o material cromossômico duplica (isto é, DNA e proteína associada). Isto é chamado a
fase `S` (síntese) e é precedida pela fase G1 (intervalo pré-sintético) e é seguida pela G2
(intervalo pós-sintetico) inserida na interfase. Nas células que não estão participando do
ciclo, por exemplo linfócitos periféricos, a célula permanece Go (fase estacionária)
(NUSSBAUM 2002).
A interfase é metabolicamente a fase mais ativa do ciclo celular, e a maioria das
reações no núcleo que requerem energia acontecem nesta fase. A duração de cada fase
da célula varia de acordo com tipo celular e as condições de crescimento. Nos linfócitos,
o primeiro ciclo celular depois da estimulação é quase sincronizado e estas células são
convenientes principalmente nos estudos radiobiológicos. Células em cultura de
mamíferos, não são sincronizadas, porem podem ser levadas a sincronia por técnicas
variadas. A sensibilidade das diferentes fases do ciclo celular variam na resposta `a ação
de agentes químicos ou radiológicos, e os tipos de aberrações cromossômicas
produzidas variam dependendo da fase em que foram tratadas. Assim, em estudos como
20
estes é importante analisar uma população de células sincronizada (no mesmo estagio,
ex. metáfase), ou no mínimo ter uma estimativa das proporções das células nas
diferentes fases presentes no tempo de tratamento (CARRANO 1975).
3.3. Alterações cromossômicas induzidas pela radiação
Nos anos 30, quando a organização cromossômica asssim como a importância
do DNA na estrutura cromossômica ainda não era compreendida, Sax em 1940, propôs
a teoria geral para produção de aberração cromossômica pela radiação ionizante, que
foi nomeada a teoria `breakage first`. Esta indicou que a radiação ionizante induz
quebras nos cromossomos das quais a maioria são restituídas (reparadas), porem
algumas permanecem abertas (não reparadas) e algumas voltam a juntar-se com outra
quebra (erro de reparo). Essa teoria é amplamente aceita até hoje, sendo que a
frequência desses eventos pode variar de acordo com outros fatores, como pré-
disposição genética, hábitos de vida e fatores ambientais. Uma teoria alternativa ,
chamada teoria `contact first` presume que as trocas das cromátides ocorrem em
regiões pré determinadas que estão próximas no tempo de radiação, e uma falha na
formação da troca aumenta os fragmentos (SAX 1941, REVELL 1955). Em 1960 foi
demonstrado que os cromossomos se duplicam durante a interfase e o ciclo celular
pode ser dividido em G1, S, G2 e M. A radiação ionizante induz aberrações tipo
cromossômicas em G1, as aberrações tipo cromatidicas em G2 e uma mistura destes
dois tipos na fase S. A maioria dos mutagênicos químicos e UVC induzem aberrações
21
tipo cromatidicas em todos os estágios do ciclo celular (inclusive na próxima divisão)
indicando que as lesões induzidas por estes agentes requerem a intervenção da fase S
para gerar aberrações (EVANS 1963). Baseado nessas informações, os agentes de
quebra cromossômicas (clastogenicos) podem ser amplamente classificados como S
independente (radiação ionizante) e S dependente (UVC, agentes oxidantes) (
referencia). BENDER et al. 1974, propôs um modelo geral para explicar a formação de
aberração cromossômica por todos os tipos de agentes, que sugere que toda aberração
cromossômica surge pelo erro de reparo da quebra de fita dupla, e que esta quebra é
induzida direta (radiação ionizante) ou indiretamente (UVC, agentes oxidantes) pelo
processo de reparo enzimático (que pode converter lesões de fita simples por quebra de
fita dupla). NATARAJAN et al. 2008 , produziram evidencias experimentais para
conversão das lesões de fita simples para quebra de fita dupla levando `as aberrações
cromossômicas.
A quebra de fita dupla é uma lesão no DNA potencialmente perigosa, pois não
há uma fita molde intacta para o reparo. Se essas lesões não forem corrigidas ou tiver
um erro de reparo, rapidamente resultam em degradação dos cromossomos em
fragmentos menores, que poderá resultar num rearranjo estrutural, formando uma
aberração cromossômica (NATARAJAN, 2008). Estudos comprovam que a radiação
ionizante aumenta a instabilidade genomica em humanos, potencializando o
desenvolvimento de câncer (STREFFER, 2010).
22
3.4. Aberrações tipo cromossômicas
Como foi visto anteriormente, os rearranjos estruturais resultam de quebra
cromossômica, seguida de reconstituição em uma combinação anormal. A troca
cromossômica ocorre espontaneamente em uma frequência baixa e também pode ser
induzida por agentes quebradores (clastogênicos), tais como radiação ionizante,
algumas infecções virais e muitos agentes químicos (AWA, 1986). A população de
linfocito periférico (célula utilizada no presente estudo) que é estimulado
mitogenicamente normalmente se encontra na fase Go (fase estacionária em G1) do
ciclo celular. Consequentemente as aberrações cromossomicas induzidas pela radiação
serão do tipo cromossomico, ou seja, envolvem ambas cromatides do cromossomo. Já
se sabe que a radiação ionizante é um clastógeno S independente, diferente da radiação
UV e agentes químicos que são S dependentes. Então, com a radiação ionizante, as
aberrações tipo cromossomicas e cromatidicas são induzidas nas células Go/G1 e G2/S
respectivamente. No entanto, UV e agentes químicos induzem somente as aberrações
tipo cromatidicas em todas as fases do ciclo celular. Se as aberrações tipo cromatidicas
forem observadas em células G0/g1 que foram expostas a radiação ionizante, pode se
presumir que estas não foram induzidas pela radiação ou já passaram por um segundo
ciclo celular in vitro. Algumas aberrações cromossomicas são estáveis, capazes de
passar inalteradas por divisões celulares mitóticas e meióticas, enquanto outros são
instáveis. Para ser estável, um cromossomo rearranjado deve ter elementos estruturais
normais, incluindo um centrômero funcional e dois telômeros. (NATARAJAN, 2002;
ROMM, 2009)
23
3.4.1. Aberrações instáveis
Dicêntrico
O Dicêntrico (figura 3) é a aberração principal usada para biodosimetria. É uma
troca entre as peças centroméricas de dois cromossomos quebrados, a qual em sua
forma completa é acompanhada por um fragmento composto das peças acêntricas destes
cromossomos. Particularmente após doses altas, configurações multicentricas podem
formar-se. Tricentricos são acompanhados por dois fragamentos, quadricentricos por
três fragmentos, etc. Existem algumas vantagens para utilizar a análise de dicentrico
como indicador de radiação ionizante, estas são: baixo nível background; especifico
para radiação ionizante; rápida avaliação para dose estimada; boa reprodutibilidade e etc
(ROMM 2009).
Anéis cêntricos
Em linfócitos humanos, os anéis cêntricos são muito mais raros que os
dicêntricos. Alguns pesquisadores os combinam com os dicêntricos enquanto outros
escolhem por ignora-los para estimativa de dose. O anel cromossômico é uma troca
24
entre duas quebras em braços separados do mesmo cromossomo também é
acompanhado de um fragmento acêntrico (figura 3).
Acêntricos
Aberrações acêntricas podem ser formadas independentemente das trocas
descritas acima e normalmente se refere a elas acêntricos excesso. Elas podem ser
terminais, ou deleções intersticial de vários tamanhos mas não é sempre possível
determinar sua origem e, então, são combinadas (figura 3) (NUSSBAUM, 2002).
25
Figura 3. Dois cromossomos dicêntricos e um anel cêntrico com seus fragmentos acêntricos associados (coloração Giemsa).
26
3.5.Vias de reparo de DNA de interesse
As vias de reparo de DNA são necessárias para manter a estabilidade genômica e
garantir a sobrevivência do organismo, frente aos efeitos deletérios causados por fatores
endógenos e exógenos (LIMA, et al 2001). As quebras duplas e simples das fitas
podem ser formadas direta e/ou indiretamente em resposta à ação de agentes endógenos
e exógenos, tais como radiação ionizante (DRISCOLL e JEGGO, 2006). Uma vez que o
dano seja localizado, moléculas específicas de reparo de DNA são enviadas ao local e se
ligam à região ou nas proximidades do local do dano, incluindo outras moléculas para
ligar e formar um complexo que habilita o reparo a agir no local. Se a taxa de danos no
DNA exceder a capacidade da célula em repará-los, o acúmulo de erros pode subjugar a
célula e resultar em senescência, apoptose ou câncer (VODICKA et al, 2004).
A presença de polimorfismos genéticos em genes relacionados a manutenção da
estabilidade do genoma pode influenciar na variação individual da capacidade de reparo
do material genético. Desta forma, a presença de polimorfismos pode estar associado a
um maior risco de desenvolver o câncer (BERWICK, 2000, MOCELLIN, 2009,
ZIENOLDINNY, 2006).
Os principais mecanismos de reparo podem ser divididos em : MMR (MisMatch
Repair), BER (Base excision repair), NER (Nucleotide excision repair), Reparo por
Recombinação Homóloga além do NHEJ (Non-Homologous End-Joining ) que são
geralmente conhecidos como união terminal não-homóloga (HOEIJIMAKERS, 2001).
27
3.5.1. Reparo por excisão de bases (BER)
O reparo BER (Base Excision Repair ou reparo de excisão de bases) lida com
danos em bases individuais realizando o reparo de lesões geralmente ocasionadas por
processos oxidativos. Esse tipo de reparo tem início com a ação de DNA glicosilases
que reconhecem e removem bases lesadas da cadeia do DNA pela quebra da ligação N-
glicosil, a qual mantém a base nitrogenada associada com o esqueleto de açúcar-fosfato
(FRIEDBERG et al., 1995). A maioria das DNA glicosilases reconhecem lesões
específicas como a adenina metilada na posição 3 (STEINUM & SEEBERG, 1986) ou a
8-hidroxiguanina (BOITEAUX et al.,1992).
.
Após a retirada da base lesada gera-se no DNA um sítio apurínico ou
apirimidínico (AP) que será reparado por AP endonucleases (DOETSCH &
CUNNINGHAM, 1990). Os sítios AP também podem ser gerados por hidrólise natural
do DNA. As AP endonucleases geralmente são conhecidas por realizarem a quebra do
esqueleto açúcar-fosfato na região 5’ deste. O resultado dessa quebra gera duas
terminações: uma 3’-OH e outra 5’-fosfato-desoxirribose. Essa etapa é realizada pela
enzima DNA desoxirribo-fosfodiesterase (dRpase), para que uma DNA polimerase
possa reconhecer e complementar a lacuna gerada pela retirada do nucleotídeo
(FRIEDBERGE et al.,1995).
O gene hOGG1 é chamado de 8-oxoguanine DNA glycosylase (Homo sapiens).
Seu produto (DNA glicosilase/AP liase) catalisa a excisão da base modificada do DNA,
28
8-hidroxiguanina (8-oxoG), durante o processo de reparação por excisão de bases
(BOITEUX e RADICELLA, 2000). Essa lesão surge como resultado da exposição do
DNA a espécies reativas de oxigênio (ERO) e à radiação ionizante. Trata-se de uma
lesão extremamente mutagênica levando a transversões GC--TA (SHINMURA e
YOKODA, 2001).
A enzima hOGG1 relacionada ao reparo por excisão de uma base, é uma peça
fundamental no sistema de prevenção de danos oxidativos e o gene hOGG1 tem sido
alvo de estudos já que é possível admitir que células sem o alelo funcional desse gene
mostraram um fenótipo distinto, podendo, a partir desse, iniciar ou acelerar o processo
carcinogênico (SHINMURA e YOKODA, 2001).
O gene XRCC1 (X-ray repair cross complementing group 1) é um dos mais de
20 genes que participam da via de reparo por excisão de bases (BER). Ele codifica uma
proteína cuja função é auxiliar na reparação de quebras de fita dupla, que são as lesões
de DNA mais comuns (THOMPSON,2000). Evidências biológicas e bioquímicas
indicam que XRCC1 interage com um complexo de proteínas de reparo de DNA,
incluindo a poli(ADP-ribose) polimerase (Parp), a DNA ligase-3 e a DNA polimerase-β
(CALDENOTT, 1995). Há aproximadamente oito diferentes Polimorfismos de
Nucleotídeo Único (em inglês, SNP) em XRCC1, três dos quais são comuns e levam à
substituição de aminoácidos nos códons 194 (exon 6, base C para T, aminoácido Arg
para Trp), 280 (exon 9, base G para A, aminoácido Arg para His) e 399 (exon 10, base
G para A, aminoácido Arg para Gln) (http://egp.gs.washington.edu). Por ser localizado
em uma região dentro do domínio de interação com a poli (ADP-ribose) polimerase, o
29
polimorfismo Arg399Gln tem sido intensamente investigado, tanto por sua função como
por sua associação com o risco de câncer. A presença do alelo variante Gln399 mostrou
estar associado a uma reduzida capacidade de reparo de DNA, sendo avaliada pela
persistência de adutos no DNA, elevados níveis de troca de cromátides irmãs, mutações
em p53 e atraso prolongado do ciclo celular (SHEN, 1998).
3.5.2. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
Muitas vezes, o reparo por excisão de bases (BER) é insuficiente para lidar com
certos tipos de danos de DNA, dessa forma, o reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
age como uma via alternativa para o reparo. NER tem sido um dos sistemas de reparo
mais estudados em humanos, o qual reconhece os danos baseando-se na estrutura
anormal da dupla hélice, assim como da estrutura química (LIEBERLING, 2006).
Este reparo consiste em um múltiplo processo, no qual as lesões de DNA são
reconhecidas e demarcadas através do desenovelamento da dupla hélice. Em seguida,
um trecho de aproximadamente 28 pares de base (pb) de DNA contendo o
oligonucleotídeo danificado é retirado. A lacuna formada é preenchida usando-se como
molde o DNA não danificado da outra fita (HASHIMOTO, 2009). As consequências de
um NER defeituoso são demonstradas por três síndromes recessivas e autossômicas:
xeroderma pigmentosum D (XPD), Síndrome de Cockayne (SC) e tricotiodistrofia
(TTD). Os pacientes com XPD demonstram uma severa sensibilidade ao sol,
30
apresentando sardas e câncer de pele ainda durante a infância. Pacientes com SC
também apresentam sensibilidade ao sol, severas anormalidades neurológicas e
nanismo. Indivíduos com TTD apresentam deficiência de enxofre nos cabelos e nas
unhas, o que resulta em seu estado quebradiço. Além disso, esses pacientes apresentam
atraso no crescimento e retardo mental, assim como fotossensibilidade cutânea, embora
sem predisposição ao câncer (STARY, 2002).
A proteína XPD, também chamada ERCC2 (Excision Repair Cross-
complementing Group 2), é um componente chave da maquinaria responsável por NER
e pelo reparo acoplado à transcrição (RAT) de DNAs danificados (BECK, 2008). XPD
é uma helicase que funciona como uma subunidade do complexo de transcrição TFIH.
Ela promove a formação de uma bolha no sitio de DNA onde se encontra o dano,
gerando o desnovelamento do DNA como preparação para os passos subseqüentes
(WU, 2009). Para isto, XPD assume uma conformação apropriada para interagir com o
DNA e com outros componentes do complexo TFIH. O domínio C-terminal de XPD é o
sítio de interação com a proteína ativadora do complexo TFIH (LEHMANN, 2008). É
neste domínio onde ocorre um dos mais comuns SNPs, o qual resulta na substituição do
aminoácido Glutamina (Gln) pela Lisina (Lys) no resíduo 751(BENHAMOU, 2005).
Embora os dados ainda sejam inconsistentes, evidências epidemiológicas e
experimentais sugerem que o polimorfismo em XPD pode alterar a capacidade de
reparo de DNA e o risco de câncer. Dessa forma, é teoricamente possível que esse
polimorfismo seja responsável por alterar a estrutura do domínio C-terminal e
31
conseqüentemente a função da proteína XPD, perturbando a interações proteína-
proteína e seu papel no reparo de DNA.
3.5.3. Recombinação Homóloga
Esse tipo de reparo consiste em um processo de rearranjo físico que ocorre entre
duas cadeias de DNA. É considerada como um tipo de recombinação genética que
envolve o alinhamento de sequências similares, formação de uma junção de Holliday
(junção móvel de quatro cadeias de DNA) além de quebra e reparo, conhecido como
resposta do DNA para produzir troca de material entre cadeias. A recombinação
homóloga constitui uma das vias de reparo de fitas de quebra dupla causadas pela RI,
assim como por inibidores de topoizomerase II, na qual são utilizadas como molde as
sequências homólogas das cromátides irmãs (OLIVEIRA, 2006).
O gene X-Ray Repair Cross Complementing 3 (XRCC3) codifica uma proteína
que está relacionada à via de reparo por recombinação homologa. A proteína XRCC3
interage com RAD-51 formando um filamento de nucleoproteína que permitirá o
alinhamento de regiões homólogas de DNA para o reparo (HOEIJMAKERS, 2001;
CHRISTMANN et al., 2003).
32
4. METODOLOGIA
O projeto da pesquisa foi elaborado segundo as normas dispostas na Resolução
196/96 do Conselho Nacional de Ética em Pesquisa, tendo sido submetido e aprovado
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola Nacional de Saúde Pública, Fiocruz. Este
projeto teve suporte financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq através do edital MCT-CNPq/MS-SCTIE-DECIT/CT-Saúde – Nº
24/2006 e da Comissão Nacional de Energia Nuclear - CNEN através da concessão de
bolsa de Mestrado.
4.1. Área de Estudo: Monte Alegre
O município de Monte Alegre apresenta as seguintes coordenadas geográficas:
02º 00' 15"S e 54º 04' 45"W Gr (figura 4). Possui uma população de 63.543 pessoas
numa área de aproximadamente 21.703 km2 (IBGE, 2008).
33
Figura 4. Mapa da Região norte abrangendo Monte Alegre e cidades próximas
34
4.2. Escolha dos indivíduos
De acordo com a distribuição dos dados obtidos na caracterização radiológica
ambiental e no cálculo de dose, foram utilizados os valores dos tercis desta distribuição
para comparar os residentes de domicílios com maior (3o tercil) e menor (1o tercil)
exposição à radiação.
De acordo com o numero de domicílios em cada tercil, foi selecionado o maior
número possível de residentes para a avaliação de freqüências de aberrações
cromossômicas. Os critérios de inclusão no estudo citogenético serão: a) ter mais de 14
anos; b) não ter diagnóstico de câncer; c) estar residindo no mesmo local por pelo
menos 5 anos; d) Não ter sido exposto exames radiológicos nos últimos 3 meses. Cada
participante elegível assinará um termo de consentimento para a pesquisa e responderá
a um questionário onde serão obtidas informações pessoais, tempo de residência,
hábitos de fumo e, consumo de álcool, uso de medicamentos).
35
4.3. Coleta das amostras
Para o presente estudo, foram coletados 10 ml de sangue venoso, em tubo
“vacutainer” estéril contendo o anticoagulante heparina, de 85 indivíduos distribuídos
pela população de Monte Alegre. As coletas foram realizadas em agosto de 2008, sendo
39 amostras de homens entre 15 e 78 anos e 46 amostras de mulheres entre 15 e 72 anos
de idade no domicilio de cada individuo.
4.4. Cultivo das células
A amostra de sangue de cada individuo foi cultivada em garrafas de cultura de 75
ml (previamente identificada com o código da amostra), onde foram adicionados 2 ml
de sangue periférico em 20 ml de meio para cariótipo (RPMI 1640, HEPES, Soro fetal
bovino e Fitohemaglutinina) (Cultilab). A cultura foi incubada por 47 horas a 37ºC em
estufa umidificada e atmosfera de 5% de CO2.
36
4.5. Colheita e fixação das células
As células foram interrompidas na mitose na fase de metáfase com a adição de
400 µl da solução de colchicina (0,16mg/ml) em seguida a cultura foi incubada a 370C
por mais 3 horas. Posteriormente a cultura foi transferida para um tubo de centrifuga de
50 ml (identificado com o código da amostra) e centrifugada a 200 xg por 10 minutos `a
temperatura ambiente. Descartado o sobrenadante, foi adicionado a solução hipotônica
(KCl 0,075M) previamente aquecida a 37ºC, até o volume de 32 ml, sob agitação
mecânica. Em seguida o tubo foi incubado a 37ºC por 20 minutos em banho Maria e
centrifugado a 200 xg por 10 minutos `a temperatura ambiente. Após ter descartado o
sobrenadante, foi adicionado o fixador (3:1-metanol/ácido acético) gelado, sob agitação
mecânica, gota a gota até completar 8 ml e depois completar rapidamente até o volume
de 32 ml. Os tubos foram mantidos em refrigeração a 4 ºC por 24 horas e centrifugados
a 600 xg por 3 minutos. Descartado o sobrenadante, foi adicionado o fixador até o
volume de 20 ml e os tubos foram centrifugados novamente a 600 xg por 3 minutos.
Após repetir a lavagem, foi adicionado o fixador até o volume de 8 ml e os tubos
centifugados a 600 xg por 3 minutos. Em seguida foi descartado o sobrenadante e o
volume foi completado até 2 ml de fixador. Os tubos foram guardados a – 20 ºC por 48
horas.
37
4.6. Preparo das laminas
As laminas foram previamente lavadas com extran 5% e mergulhadas no coplin
contendo uma solução de etanol absoluto/acido clorídrico (4:1). Após 1 h, as laminas
foram lavadas e colocadas a – 20 ºC por 10 minutos. Durante esse período, a suspensão
de células foram descongeladas e concentradas para 1 ml de solução em um tubo de
centrifuga de 2 ml. Em seguida com auxilio da pipeta Pasteur foram pingadas de 2 a 3
gotas da amostra em cada lamina previamente mantida a 4 ºC. Após secarem, as laminas
foram identificadas com o código da amostra e guardadas na geladeira para análise
posterior.
4.7. Coloração das laminas
As laminas escolhidas para análise microscópica foram mergulhadas em coplin
pequeno contendo 50 ml de tampão fosfato (8,9 g de Na2HPO4.2H2O em 500 ml de
água destilada + 6,9 g de NaH2PO4.H2O em 500 ml de água destilada) e 1,5 ml de
solução Giemsa, por 5 minutos. Em seguida, as laminas foram lavadas com água
corrente.
38
4.8. Análise microscópica
A varredura das laminas foi realizada pelo Microscópio semi – automatizado
Zeiss Axioplan – 2 e com auxilio do programa Zeiss Metafer, as imagens das metáfases
foram capturadas com localizador automático. Uma vez que as metáfases foram
encontradas, cada uma foi analisada individualmente e manualmente. Para cada
indivíduo 200 metáfases foram contadas a fim de verificar a presença de aberrações
instáveis tipo-cromossômicas (i.e. dicêntricos, anéis cêntricos, e fragmentos acêntricos)(
LLOYD 1981).
4.9. Purificação do DNA para RFLP
Foi coletada saliva dos mesmos indivíduos estudados na analise citogenetica
para analise molecular. A coleta foi realizada através do Kit Oragene DNA Self-
Collection Kit da DNAGenotek®. Foi realizada a coleta, preservação, transporte e
purificação do DNA.
Cada amostra de saliva contendo o material genético foi incubada por 1 hora a
50ºC, para a desnaturação das proteínas. Subsequentemente foram adicionados 20µL do
39
purificador Oragene a 500µL da amostra de saliva em um tubo Eppendorf utilizou-se o
vortex por cerca de 10 segundos para garantir a mistura da amostra com o purificador.
Em seguida essa mistura foi incubada no gelo por 10 min, para melhor eliminação das
impurezas. Após o esfriamento, centrifugou-se 5 minutos a 13.000 rpm x g, onde o
sobrenadante foi usado enquanto que o pellet contendo impurezas foi descartado.
Adicionou-se 500µL de etanol a 95% ao tubo para a precipitação do DNA, com duração
de 10 minutos para a visualização da “nuvem” de DNA. Para a finalização do processo,
as amostras foram centrifugadas por 2 min a 13.000 rpm e logo após foi removido o
sobrenadante de cada amostra e adicionados 100µL de água milli-Q em cada tubo de
eppendorf ao pellet contendo o material de interesse para análise molecular.
4.9.1. Quantificação de DNA
Neste processo foi determinada a quantidade de DNA baseada na absorção de
energia radiante (luz) utilizando-se o espectrofotômetro ThermoSpectronic Genesys 10
UV. As medições foram realizadas em 260nm, 280nm, pois no comprimento de onda de
260nm o DNA absorve luz e no de 280nm as proteínas absorvem. Para cada amostra
analisada foram diluídos 10µL de DNA purificado para 90µL de água milli-Q em uma
cubeta. A concentração de DNA em ηg /µL foi determinada através do cálculo A260 x 10
(fator de diluição) x 50 (fator de conversão). Nesse sentido, a relação absorbância de
260nm/280nm fornece um parâmetro de qualidade do DNA, chamado de pureza. A
razão entre 1,8 e 2,2 é considerada ideal. Valores inferiores a 1,8 indicam excesso de
40
proteínas e valores superiores, excesso de solventes orgânicos. As amostras
apresentaram uma média de 1,7 para a razão de pureza, estando este valor próximo do
ideal para a análise e uma média de DNA igual a 120ηg/µL, também considerada
adequada, já que a quantidade ideal é em torno de 100ηg/µL (QUIAGEN, 2008).
4.9.2. Amplificação PCR
As reações para a amplificação foram preparadas através do kit PCR Mastermix
da Promega® contendo 50 unidades por mL de Taq Dna polimerase, 400µM de: dATP,
dGTP, dCTP, dTTP e 3mM de MgCl2,. Adicionou-se a 12,5µL (1X) do Kit, 2,5µL de
primer R a concentração de 10µM e 2,5 de primer F também a 10µM, mais a
quantidade de DNA e H2O de acordo com a quantidade encontrada de DNA em cada
amostra, totalizando, 25µL de reação para a amplificação. Após esse processo, cada
amostra foi colocada em condições físicas específicas no total de 25 e 35 ciclos de
acordo com cada gene (Tabela 1). Os primers correspondentes a cada gene foram
selecionados de acordo com a região de interesse onde ocorrem os polimorfismos
(Tabela 2).
41
Tabela 1 - Condições físicas dos genes no processo de amplificação das amostras
Genes
Desnaturação
Inicial
Desnaturação
Anelamento
Extensão
Extensão
Final
Ciclos
XRCC1 94 oC / 4’ 94 oC/ 1’ 58oC/ 50’’ 72oC/45” 72oC/5’ 35
XPD 94 oC / 4’ 94 oC/ 1’ 65 oC/30’’ 72oC/45” 72oC/5’ 35
hOGG1 94 oC / 4’ 94 oC/ 30’’ 60 oC/30’’ 72oC/1’30” 72 oC/5’ 25
P53 95 oC/ 5’ 95 oC/30” 65 oC/1’ 72 oC/1’ 72 oC/5’ 35
XRCC3 94 oC / 4’ 94 oC/ 30’’ 60 oC/30’’ 72 oC/ 30” 72 oC/5’ 25
Tabela 2 - Primers específicos de cada gene para a realização do PCR
Locus Forward Primer Reverse Primer
XRCC1
5’-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3’
5’-TCCTCCAGCCTTTTCTGATA-3’
XPD
5’-CCCCTCTCCCTTTCCCTCTGTT-3’
5’-GCTGCCTTCTCCTGCGATTA-3’
p53
5`TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA
5`TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC 3’
XRCC3 5`GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCG 5`AAGAGCACAGTCCAGGTCAGCTG-3’
hOGG1 5`CCCAACCCCAGTGGATTCTCATTGC 5`GGTGCCCCATCTAGCCTTGCGGCCCTT-3’
42
4.9.3. Polimorfismo no comprimento de fragmentos de Restrição - RFLP
O RFLP é entendido por polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos
por corte da fita dupla de DNA, que é evidenciado pela fragmentação do DNA através
do uso de enzimas de restrição. Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário
que as sequências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivíduos
comparados sejam distintas. A técnica baseia-se na hidrólise do DNA com enzimas de
restrição e posterior separação, por eletroforese, dos fragmentos gerados, que
correspondem a padrões de restrição específicos. Além disso, a técnica de RFLP vem
sendo utilizada para rastreamento epidemiológico (NAVEDA, 2001).
Os genes de interesse foram escolhidos segundo sua importância para reparo de
danos no DNA (bases oxidadas, quebras simples e duplas de DNA) resultantes da
exposição às radiações ionizantes. Os fragmentos dos genes amplificados foram
digeridos com as enzimas de restrição especificas de cada gene. Para o gene hOGG1
utilizamos a enzima SatI (Fnu4HI – Fermentas-Brasil), que tem como região de corte a
seguinte sequência: 5'-GC NGC-3'. Para o gene p53 a enzima Bsh1236I (BstUI-
Fermentas-Brasil) com a sequência para corte 5'-CGC G-3' e a enzima Hin1I(Hsp92II–
Fermentas-Brasil) para o gene XRCC3 cortando em 5´CATG 3´. Cada enzima de
restrição é específica para cada região de corte dos genes estudados (Tabela 3). Os
tamanhos diferentes dos fragmentos determinam o genótipo do indivíduo (Tabela 4).
43
Tabela 3 - Genes e suas enzimas de restrições correspondentes
Gene alvo Tipo de polimorfismo Enzima utilizada
XRCC1 Arg399Gln PCR-RFLP (MspI)
XPD Lys751Gln PCR-RFLP (PstI)
p53 Arg72Pro PCR-RFLP(BstUI)
XRCC3 Thr241Met PCR-RFLP(Hsp92II)
hOGG1 Ser326Cys PCR-RFLP(Fnu4HI)
Tabela 4 - Tamanho dos fragmentos de interesse após o corte com cada enzima de
restrição
Genes alvos
RFLP Genótipo
XRCC1 615pb Gln-Gln
fdsf
221 e 374pb Arg-Arg
221,374 e 615pb Gln-Arg
XPD 272pb Lys-Lys
86 e 186pb Gln-Gln
86, 186 e 272pb Lys-Gln
p53 199bp Pro-Pro
113bp, 86bp Arg-Arg
199, 113 e 86bp Arg-Pro
XRCC3 335bp Thr-Thr
233, 102bp Met-Met
335, 233 e 102bp Thr-Met
hOGG1 213bp Ser-Ser
164 e 49bp Cys-Cys
213, 164 e 49bp Ser-Cys
44
5. RESULTADOS
As amostras foram classificadas de acordo com a média da dose (mSv/ano)
encontrada. O tercil com menor média foi classificado como tercil 1 e a maior média de
dose como tercil 3. As médias das doses foram de 2,0151 e 4,1827 (mSv.year-1)
calculadas pela equipe da Fiocruz e IRD.
Uma análise prévia de 2 lâminas por individuo foi feita para os 85 indivíduos,
para verificação a qualidade da amostra. Através dessa avaliação determinamos que
33% do material coletado, ou seja, amostras de 28 indivíduos estavam em condições
adequadas para análise quanto a freqüência de aberrações cromossômicas. Podemos
sugerir que essa deficiência nas amostras está associada ao processamento das mesmas,
a coleta, ao transporte, devido ao difícil acesso ao local das residências e as causas
inerentes dos indivíduos (ex. leucopenia).
Foram analisadas 6.177 metáfases dos 28 indivíduos dentre as quais foram
encontrados 4 cromossomos dicêntricos e 19 fragmentos acêntricos.
A tabela 5 apresenta os dados por indivíduo com o número de metáfases
analisadas e de aberrações cromossômicas instáveis encontradas no grupo mais exposto
à radiação (tercil 3) e no grupo menos exposto (tercil 1).
45
Tabela 5 . Metáfases – numero de células analisadas por individuo; Dic – dicêntrico; AC – anel cêntrico; A – fragmento acêntrico; Tercil – 1- área de exposição `a menor dose de radiação na região; 2- área de exposição `a maior dose de radiação na região.
46
A freqüência de aberração cromossômica encontrada por individuo e do grupo
estudado está dentro do intervalo dos valores de referencia para o background da
freqüência de dicentrico reportados, variando estes entre 0.09 e 2.99 por 1000 células
(ROMM 2009). Apesar do individuo 55 ter apresentado 3 dicêntricos e 10 fragmentos
acêntricos em uma célula (figura 5), nomeada pela literatura “rogue cells”, estudos
afirmam que esta ocorrência não esta relacionada com radiação ionizante e ocorre
esporadicamente em humanos por diferentes fatores como uma infecção viral (AWA
1986). Embora outros trabalhos com rogue cells sugiram que a exposição crônica a
baixo nível de radiação pode aumentar a susceptibilidade genética para efeito
clastogênico de algumas viroses (NÉEL,1998; ROZGAJ et al.,2002). No individuo 83
foi encontrado um dicêntrico porem não podemos correlacionar esse evento somente
com a exposição a radiação, já que é sabido na literatura que o valor mínimo de dose
equivalente, para ser detectado por aberrações tipo cromossômicas é 0,1 Sv (LLOYD
1981). Não podemos determinar a origem dos fragmentos acêntricos quando isolados,
ou seja, não combinados a outra aberrações, como observado no individuo 38.
Podemos observar também que não houve correlação entre os indivíduos
fumantes (87 e 93) com o aumento da freqüência de aberrações cromossômicas.
A tabela 6 apresenta os dados obtidos por indivíduo com numero de aberração
cromossômica e a presença ou não de polimorfismos nos alelos dos genes estudados.
Ao ser encontrado polimorfismo em um alelo, classificou-se esse grupo de pessoas
como sendo heterozigotos (Hetero). Quando há polimorfismo nos dois alelos, nomeou-
se homozigotos variantes (Homo var). No caso em que os dois alelos são normais (não
47
polimorficos), os indivíduos foram classificados como Homo wt (homozigotos tipo
selvagem -wild type). O “x” representa amostras que não amplificaram pelo método
PCR.
48
Figura 5. “Rogue cell” - Metáfase com três dicentricos e dez fragmentos (coloração Giemsa).
49
No. coleta Tercil Ab.
Cromo. XRCC1 HOGG1 XRCC3 P53 XPD
1 1 - hetero x x x homo wt 11 1 - hetero homo wt homo wt hetero hetero 12 1 - hetero homo wt homo wt hetero homo wt 14 1 - homo wt homo wt hetero homo wt homo wt 16 1 - homo wt homo wt homo wt homo wt hetero 20 1 - homo wt x x x homo wt 22 1 - homo var homo wt homo wt hetero hetero 35 1 - hetero x x x homo wt 36 1 - homo var homo wt homo wt hetero hetero 38 3 9 frag. homo var homo wt hetero homo wt homo wt 47 3 - hetero homo wt homo wt hetero hetero 48 3 - homo var homo wt homo wt homo wt hetero 49 1 - hetero homo wt homo wt homo wt homo wt 50 1 - homo var homo wt homo wt homo var hetero 51 1 - homo var homo wt homo wt homo var hetero 54 1 - homo var homo wt homo wt homo var hetero
55 1 3 dic.+ 10 frag. hetero homo var homo wt homo wt hetero
58 1 - hetero homo wt homo wt homo var hetero 75 3 - homo wt homo wt homo wt homo wt homo var 77 3 - hetero homo wt homo wt homo wt homo wt 82 3 - hetero homo wt homo wt homo var homo wt 83 3 1 dic. homo var homo wt homo wt hetero homo wt 84 3 - hetero x x x homo wt 85 3 - hetero x x x homo wt 87 3 - x hetero homo wt homo wt x 88 3 - x homo wt homo wt hetero homo wt 93 3 - homo wt hetero homo wt homo wt hetero 95 3 - homo wt homo wt homo wt homo var hetero
Tabela 6. Correlação entre os dados obtidos da analise citogenética e analise molecular dos indivíduos de Monte Alegre (HOZUMI 2009, DUARTE 2010). Dic representa o numero de dicentrico e frag. o numero de fragmento encontrado por individuo.
50
6. DISCUSSÃO
O Radônio (222Rn) é um gás radioativo da série de decaimento do urânio, o qual é
encontrado difuso em rochas. Em Monte Alegre, a maioria das casas são construídas por
rochas removidas da crosta terrestre nas florestas onde há reservas de urânio. A
concentração do 222Rn dentro dessas casas varia entre 88 ± 80 a 338 ± 19 Bq m-3
(concentração média 116 ± 84 Bq m-3). Em outras áreas na Amazônia a concentração de
radônio encontrada dentro das casas foi consideravelmente mais baixa (28 ± 3 Bq m-3;
MELO 1999).
A exposição doméstica ao urânio e aos seus produtos de decaimento é uma via
importante de contaminação humana. Estudos anteriores indicaram a possível
associação entre casos de leucemia linfocítica aguda e exposição à radiação gama em
indivíduos que residiam em casas construídas com concreto contendo urânio na Suécia
(AXELSON 2002). Análise de aberrações cromossômicas instáveis em linfócitos
periféricos de moradores das casas com elevadas concentrações de 222Rn (>200 Bq m-3),
revelou um aumento estatisticamente significativo de aberrações tipo cromossômicas
(dicêntricos) quando comparado aos indivíduos controle (não expostos)
(BAUCHINGER et al. 1994; OESTREICHER et al. 2004). Estudos revelam que a
freqüência de aberrações cromossômicas instáveis em linfócitos periféricos tem sido
aplicada como biomarcadores preditores da carcinogenese (NORPPA et al. 2004).
51
A ICRP 65 sugere que o nível de intervenção para reduzir os níveis de radônio nas
residências só se justificará com concentrações superiores a 600 Bq.m-3 ou doses anuais
de 10 mSv. As doses encontradas em Monte Alegre variaram entre a menor dose de 3
mSv a maior dose de 8 mSv, sendo assim os valores medidos em Monte Alegre não
apresentariam riscos `a saúde da população pelo ponto de vista da proteção radiológica,
segundo a ICRP. Porém, os efeitos citogenéticos da exposição crônica `a baixos níveis
de radiação até hoje não estão claros (CHANG 1999, MILLER 2005). A exposição `a
dose de baixo nível de radiação não influencia a saúde humana diretamente; porém a
predisposição genética encontrada em alguns indivíduos contribui para o aumento da
radiossensiblidade dos mesmos, conseqüentemente colabora com a instabilidade
genética, e assim contribuindo para o desenvolvimento do câncer (MILACIC, 2004,
STREFFER, 2010).
Uma vez que áreas com radiação natural de fundo alta, como apresentou
algumas residências em Monte Alegre – PA, tem a probabilidade da incidência de
câncer, a utilização de biomarcadores de efeitos assim como de exposição (aberrações
cromossômicas instáveis) se torna uma importante ferramenta para avaliação
epidemiológica.
Apesar de não encontrarmos um aumento na freqüência de aberrações
cromossômicas instáveis no grupo estudado, os resultados dos estudos citogenéticos
nas áreas de radioatividade natural elevada são contraditórios. Estudos afirmam que
populações ocupacionalmente expostas ao radônio apresentam uma freqüência de
aberrações cromossômicas instáveis significativamente maior que em grupos controle
52
(POHL-RULING & FISCHER, 1979, BRANDOM et al, 1978, BILBAN et al, 1998,
SRAM et al, 1993, BRANDOM et al, 1972). Por outro lado, estudos relataram que a
freqüência de aberrações cromossômicas induzidas pela radiação foi menor do que `as
encontradas nas áreas de controle (GHIASSE-NEJAD et at, 2002).
Com isso precisamos levar em consideração outros fatores que influenciam o
aumento da freqüência de aberração cromossômica instáveis como a variabilidade
genética individual, como também a correlação da mesma com a exposição às radiações
ionizantes. Estudos afirmam que a predisposição genética para efeitos clastogênicos
aumenta a suscetibilidade individual do desenvolvimento do câncer (GOODE et al,
2002). No caso especifico de Monte Alegre, por exemplo, a combinação entre variantes
polimórficas ocorridas em genes relacionados com a manutenção da estabilidade do
genoma poderia conferir maior risco ao câncer de pulmão em pessoas expostas a altos
níveis de radônio.
Em nosso laboratório também foi determinada a presença de polimorfismos para
os mesmos indivíduos em estudo (HOZUMI 2009, DUARTE 2010). O polimorfismo
genético é uma variação natural no gene e está presente num valor superior a 1 % da
população e essa mutação pode influenciar no fenótipo de algumas células interferindo
no seu funcionamento normal (GENE TESTS, 2009). Quando este polimorfismo está
presente em genes responsáveis pelo reparo do DNA a célula está mais vulnerável aos
efeitos clastogenicos sejam estes endógenos ou exógenos como a radiação ionizante
(MOCELLIN, 2009). O reparo errôneo do DNA pode causar o aumento da freqüência
de aberração cromossômica e esse efeito deve ser avaliado como um aumento do risco
53
de câncer (NATARAJAN 2008). KIURU et al. (2005) revelou em seu estudo com
polimorfismos de genes de reparo em residentes expostos ao radônio na Finlândia, o
aumento significativo em duas vezes a taxa de dicentricos em indivíduos portadores do
gene polimórfico XRCC1. Muito embora não haja descrição do aumento de dicêntricos
em indivíduos polimórficos para os outros quatro genes, eles participam de vias
metabólicas relacionadas a reparo de lesões induzidas pelas radiações ionizantes. Logo é
de grande importância correlacionarmos os resultados dos trabalhos feitos em nosso
laboratório no grupo de indivíduos de Monte Alegre exposto e não exposto a radiação.
Os genes polimórficos envolvidos nesse estudo estão relacionados em regular a
progressão do ciclo celular (p53) e em reparar o DNA. Os genes XRCC1 e HOGG1 são
responsáveis pelo processo de reparação por excisão de bases. Onde o produto do
hOGG1 é responsável por remover o dano no DNA, e o produto do gene XRCC1
participa do complexo de proteínas de reparo. O gene XPD está relacionado ao reparo
por excisão de nucleotídeos. O gene XRCC3 está relacionado ao reparo por
Recombinação homologa. Como cada um tem um papel especifico no sistema de
reparo, a associação desses genes polimórficos em um individuo e à exposição a agentes
genotóxicos pode potencializar o comprometimento do mecanismo celular de responder
às lesões no DNA. Assim é de grande valia avaliarmos separadamente a resposta
individual do grupo do presente estudo.
O individuo 55 apresentou três variações polimórficas, incluindo XRCC1 e
hOGG1, e a presença de aberrações cromossômicas. O individuo 38 apresentou duas
54
variações polimórficas, XRCC1 e XRCC3, e a presença de aberração cromossômica.
Estudo com trabalhadores expostos a agentes genotoxicos que apresentavam variantes
de XRCC3 apresentaram um aumento significativo de fragmentos acêntricos
(MATEUCA et al., 2005). O individuo 83 apresentou duas variações polimórficas,
XRCC1 e p53, e a presença de aberração cromossômica. Podemos observar que a
variação polimórfica do gene XRCC1 está presente nos três indivíduos que
apresentaram aberração cromossômica, porem não podemos afirmar esta correlação, já
que existem outros fatores como infecção viral, alimentação e até a técnica utilizada que
interferem na produção espontânea de aberrações cromossômicas instáveis.
55
7. CONCLUSÃO
Nossos estudos sugerem que a exposição a radiação, produzida pelo decaimento
do Urânio, nas residências de Monte Alegre não é suficiente para aumentar a freqüência
de aberrações tipo-cromossômicas instáveis para o grupo de estudo.
A combinação dos alelos polimórficos dos genes estudados não influenciou na
produção de dicêntricos nos indivíduos analisados.
Os dados obtidos no presente estudo colaboram para o acervo de estudos
epidemiológicos em áreas de radioatividade natural elevadas e para uma resposta a
população de Monte Alegre, aos questionamentos levantados em relação `a
radioatividade natural, reiterando que a mesma não está ocorrendo um aumento da
freqüência de aberrações tipo-cromossômicas instáveis na sua população.
56
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AIRES M.M. Fisiologia. 2a. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
AMABILE JC, LEURAUD K, VACQUIER B, CAËR-LORHO S, ACKER A,
LAURIER D. 2009. Multifactorial study of the risk of lung cancer among
French uranium miners: radon, smoking and silicosis. Health Phys.
Dec;97(6):613-21.
AMARAL, E.C.S., 1992. Modificação da Exposição à Radiação Natural devido a
Atividades Agrícolas e Industriais numa Área de Radioatividade Natural
Elevada no Brasil. Tese de Doutorado. Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho. Universidade Federal do Rio de Janeiro.
AWA A.A. & NEEL J.V. 1986. Cytogenetic “rogue” cells: What is their frequency,
origin and evolutionary significance? Proc. Natl. Acad. Sci. v. 83, pp. 1021-
1025.
AXELSON O, FREDRIKSON M, AKERBLOM G, HARDELL L. Leukemia in
childhood and adolescence and exposure to ionizing radiation in homes built
from uranium-containing alum shale concrete. Epidemiology. 2002
Mar;13(2):146-50.
BARCINSKI MA, DO CÉU ABREU M, DE ALMEIDA JC, NAYA JM, FONSECA
LG, CASTRO LE. 1975. Cytogenetic investigation in a Brazilian population
living in an area of high natural radioactivity. Am J Hum Genet. Nov;27(6):802-
6.
57
BAUCHINGER M, SCHMID E, BRASELMANN H, KULKA U. Chromosome
aberrations in peripheral lymphocytes from occupants of houses with elevated
indoor radon concentrations. Mutat Res. 1994;310:135–42.
BAUCHINGER, M. AND SCHMID, E., 1998. LET dependence of yeld ratios of
radiation-induced intra- and interchromosomal aberrations in humam
lymphocytes. Int. J. Radiat. Biol, 74, 17-25.
BECK, B. et al. XPB and XPD between transcription and DNA repair. Adv Exp Med
Biol [S.I.], v. 637, p. 39-46, 2008.
BEM H, BOU-RABEE F. 2004. Environmental and health consequecences of depleted
uranium use in the 1991 Gulf War. Environ Int; 30: 123-34.
BENDER M.A., GRIGGS H.G., BEDFORD J.S., 1974 Mechanisms of chromosomal
aberration production. III. Chemicals and ionizing radiation. Mutat. Res. 23
137-149.
BENHAMOU, S.; SARASIN, A. ERCC2 /XPD gene polymorphisms and lung cancer:
a HuGE review. Am J Epidemiol [S.I.], v. 161, n. 1, p. 1-14, Jan 2005.
BERWICK M AND VINEIS P, 2000 “Markers of DNA repair and susceptibility in
humans: an epidemiological review.” J Na Câncer Inst 91: 874-897.
BILBAN, M., 1998. Influence of the work environment in a Pb-Zn mine on the
incidence of cytogenetic damage in miners. Am.J.Ind. Med, 34, 455-463.
BOGEN, K.T., 1993 Reassessment of human peripheral T-lymphocyte life span
deduced from cytogenetic and cytotoxic effects of radiation, Int. J. Radiat. Biol.
64 195–204.
58
BOITEAUX, S. AND RADICELLA, J.P., 2000 “The human OGG1 gene: structure,
functions and its implication in the process of carcinogenesis.” Arch. Biochem.
Biophys. 377:1-8.
BOITEUX, S.; GAJEWSKI, E.; LAVAL, J.; DIZDAROGLU, M., 1992 “ Substrate
Specificity of The Escherichia coli FPG protein (Formamidopyrimidine-DNA
glycosilase): Excision of purine lesions in DNA produced by ionizing radiation
or photosensitization.” Biochemistry, Washington, v. 31, p. 106-111.
BRANDOM, W.F., SACCOMANNO, G., ARCHER, V.E., ARCHER, P.G., BLOOM,
A.D., 1978. Chromosome aberrations as a biological dose-response indicator of
radiation exposure in uranium miners. Radiat Res, 76:159-171.
BRANDOM, W.F., SACCOMANNO, G., ARCHER, V.E., ARCHER, P.G., COORS,
M.E, 1972. Chromosome aberrations in uranium miners occupationally exposed
to 222 radon. Radiat Res, 52:204-215.
BRUGGE D, DE LEMOS JL, OLDMIXON B 2005. Exposure pathways and health
effects associated with chemical and radiological toxicity of natural Uranium: a
review. Rev Environ Healt, 20: 177-93.
CARDIS E. 2005 “Commentary on information that can be drawn from studies of areas
with high levels of natural radiation.” In Proc. of 6th International Conference
on High Levels of Natural Radiation and Radon Areas. Kinki University,
Osaka, Japan. International Congress Series 1276:118-123.
CALDECOTT KEITH W, 2008. “Single-strand break repair and genetic disease.”
Nature Reviews Genetics (9), 619-631.
59
CARRANO, A.V., 1975 Induction of chromosomal aberrations in human lymphocytes
by X- rays and fission neutrons: Dependence on cell cycle stage, Radiat. Res. 63
403–421.
CHANG WP, HSICH WA, CHEN DP, LIN YP, HWANG JS, HWANG JJ, et al.
Change in centromeric and acentromeric micronucleus frequencies in human
populations after chronic radiation exposure. Mutagenesis. 1999;14:427–32.
CHEN D, WEI L. 1991. Chromosome aberration, cancer mortality and hormetic
phenomena among inhabitants in areas of high background radiation in China. J
Radiat Res. Dec;32 Suppl 2:46-53.
CREMER, C., et al., 1996 Nuclear architecture and the induction of chromosomal
aberrations, Mutat. Res. 366 97–116.
CHRISTMANN, M., TOMICIC, M., ROOS, W.P. AND KAINA, B., 2003
“Mechamisn of human DNA repair genes: an update.” Toxicology 193:3-34.
CULLEN, T.L., 1977. Review of the Brazilian investigations in areas of high natural
radioactivity, Part I: radiometric and dosimetric studies. In Proceedings of the
International Symposium on High Natural Radioactivity, Poços de Caldas,
Brazil, 20 junho 1975, eds. T.L.
DARBY S, HILL D, DEO H, AUVIEN A, BARROS-DIOS JM, BAYSSON H,
BOCHICCHIO F. 2005 Radon in homes and risk of lung cancer: collaborative
analysis of individual data from 13 European case-control studies. BMJ; 330
(7485-8223).
DOETSCH, P. W. & CUNNINGHAM, R. P.,1990, “The enzymology of
apurinic/apyrimidinic endonucleases. Mutat Res. 1990 Sep–Nov;236(2-3):173–
201.
60
DRISCOLL, V MARK O’ AND PENNY A. JEGGO ,2006 “The role of double-strand
break repairinsights from human genetics.” Nature Reviews Genetics (7), 45-54.
DUARTE, I. M., 2010.Avaliação da Frequência de Polimorfismos nos genes XRCC1
(Arg399gln) e XPD (Lys751gln) relacionados à manutenção da estabilidade do
genoma em indivíduos da população residente do Município de Monte Alegre,
PA. Tese de M. Sc. IRD/CNEN, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
EISENBUD M, GESELL T. 1997 Environmental Radioactivity from Natural,
Industrial, and Military Sources (San Diego, CA : Academic) capitulo 6.
Natural Radoactivity.
EVANS, H.J., 1962 Chromosome aberrations induced by ionizing radiations, Int. Rev.
Cytol.13 221–32.
FORD, B.N., RUTTAN, C.C., KYLE, V.L., BRACKLEY, M.E. AND GLICKMAN,
B.W. 2002. Identification of single nucleotide polymorphism in human DNA
repair genes. Carcinogenesis 21(11):1977-1981.
FRIEDBERG, E. C., WALKER, G. C., AND SIEDE, W. (eds.).1995, “DNA Repair
and Mutagenesis.” Washington: ASM Press.
GENE TEST: Medical Genetics Information Resource (database online). Copyright,
University of Washington, Seattle. 1993-2010. Available at
http://www.genetests.org. Date of access: 10/2009.
GHIASSI-NEJAD M, MORTAZAVI SM, CAMERON JR, NIRRMAND-RAD A,
KARAM, P.A., 2002. Very high background radiation areas of Ramsar, Iran:
preliminary biological studies. Health Physics, 82(1):87-93.
61
GOODE, E.L., ULRICH, C.M. AND POTTER, J.D. 2002 “ Polymorphisms in DNA
repair genes and associations with câncer.” Câncer Epidemiology, Biomarkers
& Prevention 11:1513-1530.
GREENLEE RT, HILL-HARMON MB, MURRAY T, THUN M. Cancer statistics,
2001. CA Cancer J Clin; 51: 15–36.
GREENLEE RT, HILL-HARMON MB, MURRAY T, THUN M. Cancer statistics,
2001. CA Cancer J Clin; 51: 15–36.
HAGMAR L, BONASSI S.,STROMBERG U., BROGGER A, KNUDSEN L.E.,
NORPPA H. et al, 1998. Chromossomal aberrations in lymphocytes predict
human cancer: a report from the European Study Group on Citogenetic
Biomarkers and Health (ESCH). Cancer Research, 58:4117-21.
HARMS, C., SALAMA, S.A., SIERRA-TORRES, C.H., CAJÁS-SALAZAR, N. AND
AU, W.W. 2004. Polymorphisms in DNA repair genes, chromossome
aberratoins and lung cancer. Environmental and Molecular Mutagenesis
44(1):74-78.
HASHIMOTO, S.; EGLY, J. Trichothiodystrophy view from the molecular basis of
DNA repair/transcription factor TFIIH. Hum Mol Genet [S.I.], v. 18, n. R2, p. R224-
30, Oct 2009.
HAYATA, I., WANG, C., ZHANG, W., CHEN D., MINAMIHISAMATSU M.,
MORSHIMA, H., WEI L. SUGAHARA T., 2004. Effect of high level natural
radiation on chromossomes of residents in southern China. Cytogenetic Genome
Research:104(1-4):237-9.
62
HOEIJMAKERS, J.H.J. 2001, “Genome maintenance mechanisms for preventing
câncer.” Nature 411: 366-374.
HOZUMI C. G., 2009, Determinação da Freqüência de Polimorfismos em Genes
relacionados à Manutenção da Estabilidade do Genoma na População Residente
dos Municípios de Monte Alegre, PA. Tese de M. Sc. IRD/CNEN. Rio de
Janeiro, RJ, Brasil.
IBGE, 2008. “Divisão Territorial do Brasil e Limites Territoriais”. Instituto Brasileiro
de Geografia e Estatística.
ICRP. Protection Against Radon-222 at Home and at Work. ICRP publication 65.
Pergamon press, Oxford (1993).
KATHREN RL. 1998 NORM sources and their origins. Appl Radiot Isot. v.49 p. 149-
68.
KISH, L., 1965. Survey sampling. New York: John Wiley & Sons.
KIURU A., LINDHOLM C., HEILIMO L., et al. Influence of DNA Repair Gene
polymorphisms on the yield of chromosomal aberrations. Environmental and
Molecular Mutagenesis. 46 198 – 205, 2005.
KREWSKI D, LUBIN JH, ZIELINSKI JM, ALAVANJA M, CATALAN VS,
WILLIAM FR. 2005 Residential Radon and Risk of Lung Câncer: a Combined
Analysis of 7 North American Case-Control Studies. Epidemiology. 16(2):137-
45.
LIMA, W.C.; MEDINA-SILVA, R.; GALHARDO, R.S. and MENCK, C.F.M.. 2001
“Distribution of DNA repair-related ESTs in sugarcane.” Genet. Mol. Biol.
vol.24, n.1-4, pp. 141-146. ISSN 1415-4757
63
LEHMANN, A. The xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene: one gene, two
functions, three diseases. Genes Dev [S.I.], v. 15, n. 1, p. 15-23, Jan 2001.
LLOYD D.C. & PURROT R.J. Chromosome aberration analysis in radiological
protection dosimetry. Radiation Protection Dosimetry. V. 1 p. 19-28. 1981.
LUBIN JH,. WANG ZY, BOICE JD,. BLOT WJ, WANG LD, KLEINERMAN RA.
2004 Risk of lung cancer and residential radon in China: pooled results of two
studies. Int. J. Cancer; 109:132–137.
MATEUCA, R., AKA, P.V., DE BOECK, M., HAUSPIE, R., KIRSCH-VOLDERS,
M. AND LISON, D., 2005 “ Influence of hOGG1, XRCC1 and XRCC3
genotypes on biomarkers of genotoxicity in workers exposed to cobalt or hard
metal dusts. Toxicology Letters 156:277-288.
MELO, V.1999 – Avaliação da concentração do 222Rn nos ambientes internos e
externos das residências do município de Monte Alegre, PA - Tese de mestrado.
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
MILACIC S, PETROVI D, JOVICI D, KOVACEVI R, SIMI J. Examination of the
health status of populations from depleted-uranium-contaminated regions.
Environ Res. 2004;95:2–10.
MILLER AC, BELTRAN D, RIVAS R, STEWART M, MERLOT RJ, LISON PB.
Radiation- and depleted uranium-induced carcinogenesis studies:
characterization of the carcinogenic process and development of medical
countermeasures. NATO RTG-099. 2005.
64
MOCELLIN, S. et al. DNA repair gene polymorphisms and risk of cutaneous
melanoma: a systematic review and meta-analysis. Carcinogenesis [S.I.], v. 30,
n. 10, p. 1735-43, Oct 2009.
NATARAJAN A.T. 2002 Chromosome aberrations: past, present and future review.
Mutation Research. 504 3-16.
NATARAJAN A.T., PALITTI F., 2008 DNA repair and chromosomal alterations.
Mutat. Res. 657 3-7.
NAVEDA, L. A. B. ; MOREIRA, E. C.; VELOSO, I. F.; ZANINI, M. S, 2001
“Padronização da técnica de RFLP para estudos em epidemiologia molecular.”
NEEL, J. V. An Association, in adult Japonese, between the occurrence of rogue cells
among cultered lymphocytes (JC virus activity) and the frequency of ‘simple’
chromosomal damage among the lymphocytes of persons exhibiting these rogue
cells. Am. J. Hum. Genet., 63 489-497.
NORPPA, H., 2004. Cytogenetic biomarkers and genetic polymorphisms. Toxicology
Letters. 149 309-334.
NRC. National Research Council. Committee on the Biological Effects of Ionizing
Radiations. Health Risks of Radon and other Internally Deposited Alpha-
Emitters. BEIR IV- Whashington, D.C.: National Academy Press. 1988, p. 602.
NUSSBAUM, R. L.; McINNES, R. R.; HUNTINGTON, F. W. 2002 Thompson &
Thompson Genética Médica. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.
OESTREICHER U, BRASELMANN H, STEPHAN G. Cytogenetic analyses in
peripheral lymphocytes of persons living in houses with increased levels of
indoor radon concentrations. Cytogenet Genome Res. 2004;104:232–6.
65
OLIVEIRA, MELLO S.S.M FACHIN, AL., HOJO E.T.S, 2006 “Respostas celulares
ao antitumoral VP16 (ETOPOSIDE), avaliadas pela análise de expressão gênica
(reparo do dna), cinética do ciclo celular e trocas entre cromátides irmãs.”
Resumo publicado.
PASTANA, S. M. N. 1999. Síntese geológica e favorabilidade para tipos de jazimentos
minerais do Município de Monte Alegre-PA. Belém, CPRM/PRIMAZ. 34p.
PAULSON, J.R., LAEMMLI, U.K., 1977 The structure of histone-depleted metaphase
chromosomes, Cell 12 817–828.
PENNA FRANCA, E., ALMEIDA, J.C. BECKER, J., EMMERICH, M., ROSER,
F.X., KEGEL, GUNTER, HAINSBERGER, L., CULLEN, T.L, PETROW, H.
DREW, R. AND EISENBUD, M. 1965. Status of Investigations In The
Brazilian Areas of High Natural Radioactivity. Health Physics, 11, 699-712.
PERERA, F.P., 2000. Molecular epidemiology: On the path to prevention? Journal of
the National Cancer Institute,92 (8):602-612.
POHL-RULING, J., AND FISCHER, P., 1979. The dose-effect relationship of
chromosome aberrations to alpha and gamma irradiation in a population
subjected to an increase burden of natural radioactivity. Radiat Res, 80:61-81.
POPP, W., PLAPPERT, U., MULLER, W.U., REHN, J., SCHNEIDER, J, BRAUN, A.
ET AL., 2000. Biomarkers of genetic damage and inflammation in blood and
bronchoalveolar lavage fluid among former German uranium miners: a pilot
study. Radiat. Environm. Byophys, 39:275-282.
QUIAGEN 2008 “Archive-quality DNA purified from human whole blood using the
Gentra Puregene Blood Kit”.Protocol.
66
RERICHA V, KULICH M, RERICHA R, SHORE DL, SANDLER DP. 2006.
Incidence of leukemia, lymphoma, and multiple myeloma in Czech uranium
miners: a case-cohort study. Environ Health Perspect. Jun;114(6):818-22.
REVELL, S.H., “A new hypothesis for chromatid exchanges”, Radiobiology (Proc.
Symp. Liège, 1954), Butterworths, London (1955) 243–253.
ROMM H., OESTREICHER U., KULKA U. 2009 Cytogenetic damage analysed by
the dicentric assay. Ann. Ist. Super Sanita. Vol. 45. No. 3: 251-259.
RON E. 1998. Ionizing radiation and cancer risk: evidence from epidemiology. Radiat
Res. Nov;150(5 Suppl):S30-41.
ROZGAJ R., KASUBA V., SIMIC D., The frequency of dicentrics and acentrics and
the incidence of rogue cells in radiation workers. Mutagenesis. V. 17. pp. 135-
139, 2002.
SALGUEIRO, NATÁLIA BOAVENTURA, 2002 “Identificação de Mutações no Gene
da Dthidropirimidina Desidrogenase em Doentes com Carcinoma Colo-Rectal
Implicações no Tratamento Com 5-Fluorouracil”. Dissertação de Mestrado.Porto
2002.
SAX, K., Types and frequencies of chromosomal aberrations induced by X-rays, Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 9 (1941) 93–103.
SHEN H., Y. XU, Y. QIAN, R. YU, Y. QIN, L. ZHOU, X. WANG, M.R. SPITZ AND
Q. WEI, 2000 “ Polymorphisms of the DNA repair gene XRCC1 and risk of
gastric câncer in a Chinese population, Int. J. Câncer Volume 88 Issue 4, Pages
601 – 606.
STARY, A.; SARASIN, A. The genetics of the hereditary xeroderma pigmentosum
syndrome. Biochimie [S.I.], v. 84, n. 1, p. 49-60, Jan 2002.
67
SMERHOVSKY, Z., LNADA, K., ROSSNER, P. BRABEC, M., ZUDOVA, Z. ET
AL, 2002. Risk of cancer in an ocuppationally-exposed cohort with increased
level of chromossomal aberrations. Environ. Health Perspect., 109:41-45.
SOHRABI M 1998 The state-of-the-art on worldwide studies in some environments
with elevated naturally occurring radioactive materials (NORM). Appl. Radiot.
Isot; v. 49. p. 169-88.
SRAM, R.J., BINKOVA, B., DOBIAS, L., ROSSNER, P., TOPINKA, J., VESELA,
D., VESELY, D, STEJSKALOVA, J, BAVOROVA, H., RERICHA, V., 1993.
Monitoring genotoxic exposure in uranium miners, Environ. Health Perspect,
99, 303-305.
STEINUM, A.L., E. SEEBERG 1986. “Nucleotide sequence of the tag gene from
Escherichia coli.” Nucleic Acids Res. 14:3763-3772.
STREFFER C. Strong association between cancer and genomic instability review.
Radiat. Environ. Biophys. 49: 125-131. 2010.
UNSCEAR. United Nations Scientific Commitee on the Effects of Atomic Radiation.
1994. Sources and Effects of Ionizing Radiation. Report to the General
Assembly, with scientific annex. New York, United Nations sales publication
E.88.IX.7.
VEIGA LH, MELO VP, AMARAL EC, KOIFMAN S. 2007. Feasibility study for a
long-term follow-up in a historical cohort of Brazilian coal miners. J Radiol
Prot. Sep;27(3):349-60.
68
VEIGA LHS, KOIFMAN S. 2005. Pattern of cancer mortality in some Brazilian
HBRAs. In Proc. Of 6th International Conference on High Levels of Natural
Radiation and Radon Areas. Kinki University, Osaka, Japan. International
Congress Series 1276;, 110-113.
VODICKA, P.,KUMAR, R., STETINA, R., SANYAL, S., SOUCEK, P., HAUFROID,
V. 2004 “Genetic polymorphisms in DNA repair genes and possible links with
DNA repair rates, chromosomal aberrations and single-strand breaks in DNA.
Carcinogenesis 25(5):757-63.
WU, Y. et al. Welcome the family of FANCJ-like helicases to the block of genome
stability maintenance proteins. Cell Mol Life Sci [S.I.], v. 66, n. 7, p. 1209-22,
Apr 2009.
ZIENOLDDINY S, CAMPA D, LIND H, RYBERG D, SKAUG V STANGELAND
L, PHILLIPS DH, CANZIAN F AND HAUGEN A , 2006 “Polymorphisms of
DNA repair genes and risk of non-small cell lung câncer. Carcinogenesis 27:
560-567.