Revista Brasileira de Cincia Avcola Rev. Bras. Cienc. Avic. vol.3 no.2 Campinas May/Aug. 2001 http://dx.doi.org/10.1590/S1516-635X2001000200001

Influenza Aviria: Uma Reviso dos ltimos Dez Anos Avian Influenza: A Review of the Last Ten Years

RESUMO A influenza aviria doena extica no Brasil. O sistema de vigilncia implementado pelo Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) mantm monitorao permanente das aves das principais espcies domsticas, tanto do material gentico importado para a indstria avcola, por exemplo, da espcie das galinhas (Gallus gallus formadomestica), perus (Meleagris gallopavo formadomestica), codornas (Coturnix coturnix japonica), patos (Anas), primrios (elite), bisavs e avs para postura ou corte, como aves de espcies de explorao mais recente, exticas, por exemplo avestruzes (Struthio camelus) ou nativas, por exemplo emas (Rhea americana). Os plantis de reprodutores em produo so tambm acompanhados por amostragens peridicas, conforme previsto no PNSA, alm da monitorao das respostas aos programas de vacinao, por exemplo, contra bronquite infecciosa e doena infecciosa bursal. O PNSA estabelece as normas de atuao para o controle e erradicao da doena de Newcastle (ND) e Influenza Aviria (AI) (Projeto de Vigilncia, 2001), a saber: I - Notificao de focos da doena (e confirmao laboratorial no LARA-Campinas); II - Assistncia a focos; III - Medidas de desinfeco; IV - Sacrifcio sanitrio; V - Vazio sanitrio; VI - Vacinao dos plantis ou esquemas emergenciais; VII - Controle e fiscalizao dos animais susceptveis; VIII - Outras medidas sanitrias; A vigilncia e ateno ao foco exige o diagnstico laboratorial e diferencial de AI e ND, que segue as normas do PNSA, conforme o sumrio abaixo: 1- Interdio e coleta de materiais para exame laboratorial oficial; 2- Registro das aves: espcie(s), categoria(s), nmero(s), manuteno de aves; utenslios e produtos no local; proibio de trnsito de e para a(s) propriedade(s) em um raio de 10 km; controle de todos os animais e materiais possveis fontes de propagao; desinfeco de vias de entradas e sadas (s) propriedade(s); inqurito epidemiolgico. 3- Confirmao laboratorial: isolamento de agente letal hemaglutinante em ovos embrionados de galinhas SPF, no inibido (inibio da hemaglutinao) ou no neutralizado (soroneutralizao) por soro especfico para o vrus da doena de Newcastle; caracterizao do agente como vrus da influenza aviria (AIV) por deteco de antgenos da nucleoprotena e/ou matriciais de AIV e de seu subtipo por ensaios especficos para a caracterizao da hemaglutinina e neuraminidase (imunodifuso, imunoenzimticos ou moleculares). 4- Abate e destruio imediata (cremao) de todas as aves, resduos, carnes e ovos da(s) propriedade(s) atingida(s) e vizinhas (raio de 3 km); limpeza e desinfeco das instalaes; vazio sanitrio (mnimo 21 dias); 5- Permitir o transporte para o abate ou incubao dentro da zona de vigilncia (raio de 10 km). 6- Proibir feiras, exposies, mercados na zona de vigilncia (10 km).

INTRODUOA influenza aviria (AI) inclui amplitude de sndromes que se manifestam desde infeco subclnica, doena suave respiratria das vias superiores ou doena fatal generalizada em aves domsticas. Inmeros diferentes isolados do vrus da influenza aviria (AIV) circulam entre diversas espcies animais ao redor do mundo. Embora AIV possa infectar enorme diversidade de espcies das classes de aves e mamferos, so tidas como reservatrios naturais as aves aquticas, aves habitantes das praias e gaivotas, sendo consideradas aberrantes as infeces em galinhas, perus, sunos, eqinos e humanos (Suarez, 2000). O alto nvel de recombinao gentica, observado especialmente entre integrantes dos AIV do tipo A, conseqncia do genoma segmentado, que permite permutaes de genes, em contraste com integrantes de Paramyxoviridae, por exemplo o vrus da doena de Newcastle, que no apresentam recombinao detectvel por apresentar genoma no segmentado (Kingsbury, 1990.) A baixa incidncia dos AIV nos perodos migratrios subtropicais das aves aquticas (Murphy & Webster, 1996) pode explicar a baixa ou rara ocorrncia no Brasil. As conceituaes e procedimentos do Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) descrevem a AI como doena causada por Orthomyxoviridae Influenza A, com patogenicidade intravenosa em aves de 6 semanas de idade maior que 1,2, ou infeces com AIV dos subtipos H5 ou H7 ou AIV cujas seqncias do stio de clivagem da hemaglutinina contm mltiplos aminocidos bsicos, de acordo com o manual da O.I.E. ((Projeto de Vigilncia, 2001). Influenza como zoonose

A influenza em humanos parece ocorrer desde os primrdios da humanidade, segundo a literatura antiga, que data, por exemplo 2000 a.C., com o registro de doena respiratria aguda com durao de poucos dias ou semanas (Toniolo Neto, 2001). A evoluo de variantes de AIV capazes de apresentar carter zoontico constante e tem sido demonstrada experimentalmente. As etiologias pelo menos das ltimas duas pandemias (1918-1919 e 1968) foram caracterizadas como estirpes hbridas que continham genoma recombinante de AIV de aves e humanos. A ameaa de pandemia por AIV em humanos preocupao permanente dos agentes de sade pblica, uma vez que h evidncias dos vrus H5N1 e H9N2 terem sido transmitidos de aves para humanos nos mercados de aves de Hong Kong (Horimoto & Kawaoka, 2001). Alguns subtipos de AIV tm importncia direta em sade humana. O AIV H5N1, que ocasionou o bito de 6 pessoas em Hong Kong em 1997, foi transmitido diretamente de galinhas para humanos. A adaptao a novo hospedeiro significa principalmente alterao rpida das glicoprotenas da superfcie, especialmente da hemaglutinina (HA), embora o H5N1 tenha apresentado mudanas de aminocidos em outras protenas e no em HA, indicando que sua HA est altamente adaptada s aves, no necessitando mudar e que os outros genes podem advir de outras origens por recombinao gentica, inclusive com seqncias internas de consenso previamente encontradas em humanos, a exemplo de H5N1. As seqncias de aminocidos de origem humana obtidas por recombinao podem ter importncia como determinantes do aspecto zoontico (Zhou et al., 1999b). A recombinao gentica entre influenza de aves, sunos e humanos foi demonstrada, aps episdios de doena respiratria em plantis de sunos na Carolina do Norte (NC), Texas (TX), Minnesota (MN) e Iowa (IO) em 1998. O isolado da NC resultou de recombinao entre H3N2 de humanos com o clssico H1N1 de sunos e os demais de H3N2 humano, H1N1 clssico suno e genes de vrus de aves (AIV). A hemaglutinina dos quatro isolados obtidos derivou-se de H3N2 humano em circulao em 1995 (Zhou et al., 1999a).

Uma estirpe de AIV classificada como A/Hong Kong/156/97 (H5N1) de alta patogenicidade foi descrita em episdio fatal de influenza em criana com faringite, tosse seca e febre, estirpe que apresentava mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA, carter associado alta patogenicidade para galinhas, nas quais resultou na mortalidade de 15/16 aves inoculadas. Em mais 12 casos humanos com estirpes de AIV semelhantes essas foram isoladas, 3 obtidas de casos fatais (Subbarao et al., 1997). Na China, o surgimento de AIV H1N1 em sunos alertou para o papel da espcie como intermediria de todos os oito genes de origem primariamente aviria, funcionando ainda como fonte de genes para a recombinao gentica de subtipos de AIV. Os sunos podem assim representar uma importante espcie na transmisso para humanos na China. (Guan et al., 1996.). Novas estirpes de influenza vrus esto constantemente emergindo na populao humana. Trs pandemias em humanos (1918-19 H1N1 - Espanhola, 1957 H2N2 Asitica e 1968 H3N2 Hong Kong) esto descritas na literatura, nas quais os subtipos cruzaram as barreiras de espcie hospedeira. Da mesma forma, o surto em Hong Kong em 1997 com H5N1 indica para o risco futuro de pandemia, contra a qual no haveria tempo suficiente para estabelecimento de proteo vacinal s populaes humanas. Estirpes de AIV em perodos interpandmicos podem apresentar variao antignica leve (antigenic drift) e podem evoluir para variao antignica forte (antigenic shift) e originar surto de doena. A vigilncia epidemiolgica base para a determinao de atualizaes vacinais e os agentes antivirais anti-neuraminidase devem ser considerados como adjuvantes para vacinas (De Jong et al., 2000). A alta homologia entre os genes internos dos isolados H6N1 indica que esses subtipos so capazes de intercambiar seus genes e so, portanto, fonte potencial de isolados patognicos para humanos, sendo sugerida a vigilncia epidemiolgica para aves aquticas e domsticas, sunos e humanos (Hoffmann et al., 2000). As seqncias dos genes de 18 estirpes de AIV de humanos, que resultaram em bito de seis pacientes, no surto de Hong Kong, em 1997,

evidenciaram que as estirpes desse surto derivaram de influenza vrus de aves e no de humanos (Subbarao & Shaw, 2000). Um estudo dos fatores de risco para AIV em 15 pacientes humanos hospitalizados, relacionado ao isolado H5N1 (Hong Kong), foi conduzido aps a morte de uma criana em Hong Kong, em 1997. Fatores como idade, sexo e vizinhana foram considerados. A exposio s galinhas vivas do mercado de aves de Hong Kong foi considerada significativa, enquanto o consumo ou preparao de produtos, bem como a exposio a humanos com doena respiratria, inclusive influenza, no foi associada doena (Mounts et al., 1999). Impacto econmico O impacto econmico nas espcies domsticas destinadas produo enorme em muitos pases, sem contar o envolvimento das espcies de vida selvagem e preservao, valor individual de estimao e ainda os investimentos em sade humana. Surtos de AI causados pela amostra de baixa patogenicidade H7N2 em poedeiras, frangas em recria (Gallus gallus formadomestica) e perus (Meleagris gallopavo formadomestica), na Pennsylvania (EUA), durante 1997 e 1998, foram analisados economicamente (depopulao e lucros cessantes) e extrapolados para a populao avcola total deste estado, indicando um custo total de US$ 3,5 milhes (Davison et al., 1999). Os episdios em Minnesota nos EUA, entre 1979 e 1981, foram monitorados economicamente e indicaram despesas anuais em torno de 1 milho de dlares (Poss et al., 1982), relacionadas com perdas de produtividade em ganho de peso e produo de ovos. Os custos relacionados s indenizaes, diagnstico, suporte tcnico e comando ttico (Pennsylvania - sacrifcio de mais de 11,2 milhes de aves mais de 7,2 milhes de poedeiras e 3,6 milhes de frangos de corte em 278 propriedades) no programa de erradicao da AI, estabelecido a partir de novembro de 1983 na Pennsylvania e Virginia, foram US $ 30.140.574,00 e 2.328.317, respectivamente (Avian Influenza Task Force, 1984), incluindo isolamento de vrus de aves de vida livre da regio de quarentena (patos pretoAnas anas e Mallard-Anas platyrhynchos, gansos canadenses-Branta canadensis, faises de pescoo

anelado-Phasianus, gaivota de bico anelado-Larus) e sorologia (inibio da hemaglutinao e inibio da neuraminidase) em aves e mamferos (patos-Anas e gansos domsticos-Branta e selvagens, gaivotas marinhas-Larus, corvos-Corvus, estorninhos-Sturnus, pssaros pretos de asa vermelha-Agelaius phoeniceus, pardais-Passer, pombos-Columba, faises-Phasianus, camundongos-Mus e ratos-Rattus) (Avian Influenza Task Force, 1984.), totalizando ao final US $ 60 milhes ao governo e 15 milhes aos proprietrios, que poderiam chegar a US $ 1,5 bilhes aos avicultores e 5 bilhes aos consumidores, caso no houvesse a deciso de erradicao. Os consumidores dispenderam mais de US $ 300 milhes em custos aumentados dos produtos (Lasley, 1987). Os efeitos negativos dos surtos de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) na provncia de Guangdong (China) foram sentidos nos mercados de produtos e aves, repercutindo nos estabelecimentos rurais. Um sistema de informao entre instituies de pesquisa, ensino e indstria de processamento com o manejo animal e mercado foi recomendado para minimizar os prejuzos (Wei-Hua, 1998).

ETIOLOGIAA influenza aviria causada por vrus da famlia Orthomyxoviridae. As propriedades fsicas, qumicas e biolgicas dos vrus da influenza aviria (AIV) sero descritas a seguir. Os vrions dos AIV so aproximadamente esfricos de at 200nm de dimetro ou pleomrficos, quando observados os replicados pelos hospedeiros naturais. Estirpes propagadas em ovos tm morfologia mais regular (circular) e em mdia entre 80 e 120nm de dimetro. O envelope contm projees rgidas (spikes) de hemaglutinina e neuraminidase, que formam um halo caracterstico ao redor das partculas em colorao negativa e observadas por microscopia eletrnica (Fig. 1 e 2; Copyright Linda M Stannard, 1995 e Fig. 3 e 4, ISTO 1561/01/09/1999). O genoma viral composto de oito segmentos de RNA de fita simples. A estrutura de RNA-protena (nucleoprotena NP) do cerne no comumente observvel, apenas poucas partculas

ntegras evidenciam o contedo helicoidal interno. Entretanto, partculas rompidas liberam o contedo de NP, que longa e apresenta um aspecto de zper ou espinha de peixe (estrutura helicoidal). Maiores detalhes da estrutura, composio e biologia dos influenza vrus em geral so encontrados nos captulos Orthomyxoviruses (Murphy & Webster, 1996) e Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication (Lamb & Krug, 1996)

Dados da estrutura e composio dos AIV podem ser conferidos na Tabela 1. O cerne dos AIV contm o material gentico formado por RNA dividido em 8 segmentos de fita simples enrolados em si prprios e revestidos por unidades da protena do capsdeo, a nucleoprotena (NP), formando uma hlice. A NP,

embora exera o revestimento do RNA, permite espao entre essas unidades estruturais e o RNA, com exposio das ligaes fosfo-diester do RNA, rapidamente acessveis digesto por ribonucleases (Kingsbury, 1990.). Dez genes esto localizados nos 8 segmentos do RNA. As protenas estruturais compreendem, de acordo com os genes codificadores, como produto do gene 4, a hemaglutinina (HA) e do gene 6 a neuraminidase (NA). Ambas so glicoprotenas que formam as grandes projees superficiais do envelope. O gene 7 codifica a glicoprotena da membrana (M1) ou matriz, a protena menor da membrana (M2) e o polipeptdeo M3, todos estes 3 componentes inseridos na dupla camada lipdica do envelope. O gene 5 codifica a nucleoprotena (NP), as unidades que revestem o RNA, formando o nucleocapsdeo. As 3 enzimas polimerases virais, PA codificada pelo gene 3, PB1 codificada pelo gene 2 e PB2 codificada pelo gene 1 esto todas localizadas na extremidade de cada unidade do nucleocapsdeo. O gene 8 codifica as protenas no estruturais NS1 e NS2, de funo desconhecida. A HA responsvel pela adsoro ao receptor celular. Este receptor composto de glicoprotena silica, contendo o cido N-acetil neuramnico terminal (COOH-C= O-CH2-CH-OH-CH-NH-C= O-CH3-CH-OHCH-OH-CH2-OH), protena que necessita maturao ps traduo para poder intermediar a fuso com a membrana da clula sendo infectada (Kingsbury, 1990.). A HA reconhece receptores com cadeias de acares da srie lacto-sialil tipos I e II (cido silico) nas clulas, determinando a amplitude de hospedeiros (Suzuki, 2000). O stio de conexo da HA ao receptor celular forma uma cavidade em cada uma das trs subunidades do trmero de HA, cujos resduos de aminocidos tirosina 98, triptofnio 153, histidina 183, c. glutmico 190 e leucina 194, inacessveis aos anticorpos, so muito conservados entre os subtipos (Lamb & Krug, 1996). A HA confere tambm capacidade de aglutinao ao muco do sistema respiratrio. Classificao A classificao dos integrantes da famlia Orthomyxoviridae muito precisa. O nome do vrus

compe-se de informaes separadas por barras verticais, que incluem o tipo (A, B ou C)/ espcie animal/ localizao geogrfica/ nmero de referncia do laboratrio/ ano de isolamento/ subtipo de HA/ subtipo de NA. Entretanto, as informaes sobre virulncia no esto includas na nomenclatura. Geral A famlia Orthomyxoviridae contm trs tipos antignicos ou gneros A, B e C de vrus influenza, distingveis pela composio da unidade estrutural protica do nucleocapsdeo (NP) e da protena no glicosilada do envelope (M1). Desses, B e C so principalmente patgenos humanos e A so isolados de muitas espcies animais, incluindo humanos. As glicoprotenas da superfcie das estirpes integrantes do tipo A apresentam muito maior variabilidade antignica se comparadas quelas de integrantes de B e C. Os tipos A e B apresentam maior semelhana morfolgica entre si e so diferentes de representantes do tipo C, que contm as glicoprotenas do envelope dispostas em disposio hexagonal (Kingsbury, 1990.). Todos os AIV de aves so integrantes do tipo A e so divididos em subtipos pela anlise da hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) (Easterday et al., 1997). Atualmente, 15 HA e 9 NA antigenicamente distintas so conhecidas. Subtipos de influenza A avirios As hemaglutininas H1 a H15 e neuraminidases N1 a N9 so reconhecidas (Easterday et al., 1997). Quaisquer combinaes entre HA e NA so possveis na natureza. Alguns exemplos de estirpes de aves classificadas incluem: H5N2 (Pennsylvania e Virginia, EUA, Nov 1983-Jan 1984 alta patogenicidade; H5N1 (Hong Kong, China, A/Environment/Hong Kong/437/99, 1997 alta patogenicidade); H5N1 (Inglaterra, A/turkey/England/91 alta patogenicidade); H7N2 (Pennsylvania, EUA, Jan 1997 Mar 1998 mdia patogenicidade); H8N4 (Wisconsin, EUA, 1968, A/turkey/Wisconsin/1/68 mdia patogenicidade); H5N3 (Hokkaido, Japo A/duck/Hokkaido/4/96 no patognico). A doena causada por AIV nas espcies de aves pode variar grandemente com a estirpe de vrus e a

espcie hospedeira. A infeco produzida pela maioria das estirpes subclnica, embora algumas resultem em doena que envolve o sistema nervoso central com mortalidade alta em uma semana de curso clnico. Essas estirpes esto classificadas principalmente nos subtipos de hemaglutinina H5 e H7, como por exemplo A/fowlplaguevirus/dutch/27 (H7N7-galinha) e A/Tern/SouthAfrica/1/61 (H5N3Chlidonias). Em perus, as infeces resultam em problemas muito importantes (de H1 a H15), pois uma espcie em que as infeces respiratrias crnicas causam srios problemas econmicos. As infeces em perus parecem estar associadas periodicamente pela transmisso de aves migratrias. Doena por AIV ocorre com menos freqncia em Gallus gallus formadomestica (galinha industrial), especialmente pelas caractersticas de manejo, que aplica noes de biossegurana, com afastamento de aves domsticas e selvagens, especialmente Anatidae. Entretanto, episdios importantes em galinhas esto relacionados na literatura. Um exemplo H5N2 na Pennsylvania, Estados Unidos, em 1983, que tornou-se virulento e custou US$ 60 milhes para a erradicao. A infeco em patos (Anatidae), geralmente subclnica, inclui a replicao pulmonar e intestinal. Os AIV mais importantes que ocorrem em humanos (H1N1, H2N2 e H3N2) ocorrem tambm em patos, nos quais produzem infeco respiratria superior e no intestinal (Murphy & Webster, 1996). Os subtipos H5 e H7 comumente esto associados a estirpes de alta patogenicidade para certas aves selvagens e domsticas. A HA dessas estirpes clivada (haste da HA2-glicoprotena da fuso) e infecta diretamente os cultivos em monocamada, no requerendo tratamento enzimtico com proteases exgenas (tripsinas). Essas estirpes contm mltiplos aminocidos bsicos na regio carboxi-terminal de HA1, o que possivelmente est relacionado ao reconhecimento pelas proteases endgenas celulares, permitindo clivagem imediata ps-traduo e infecciosidade in vitro e in vivo, com carter transmissvel (Tabela 2). O seqenciamento dos oito segmentos do genoma de uma estirpe do subtipo H5N1 de humanos, considerado como original de aves e comparado com uma estirpe de galinhas de

alta patogenicidade (H5N1, A/Environment/Hong Kong/437/99 - Hong Kong, China, 1997), revelou 99% de identidade das seqncias, mas ambos no foram relacionados a nenhuma informao gentica de influenza acessvel no GenBank, com quatro clusters relacionados com isolados da Eursia. A anlise filogentica da HA revelou mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA (Tabela 2), fentipo presente em isolados de alta patogenicidade para galinhas (Suarez et al., 1998). A heterogeneidade no gene da hemaglutinina e a emergncia de fentipo de alta virulncia entre estirpes do subgrupo H5N2 foram descritas no Mxico. Estirpes obtidas no surto de AIV no Mxico Central foram comparadas no gene codificador e stios de clivagem da HA, estudo que demonstrou que nenhuma das 18 estirpes apresentou seqncias de aminocidos previstas (predicted) idnticas em HA1, com mudanas no restritas a uma regio. Duas linhagens filogenticas foram estabelecidas com variaes de 10,5% para a seqncia de aminocidos e 6,2% para os nucleotdeos. As estirpes patognicas (HPAIV) que causaram alta mortalidade em galinhas apresentaram a substituio do cido glutmico por lisina na posio 324 da HA e insero de arginina e lisina nas posies 325 e 326, sendo que essa insero pareceu ser uma duplicao da seqncia AAAGAA da posio 965-970 dos nucleotdeos de HA1, possivelmente duplicada pela polimerase (Garcia et al., 1996). Estrutura e Composio Qumica Os vrions completos dos integrantes de Orthomyxoviridae so compostos de 0,8 a 1% de RNA, 70% de protena, 20% de lipdio e 5 a 8% de carboidratos. O envelope derivado da membrana plasmtica da clula hospedeira replicadora. Partculas virais replicadas em hospedeiros naturais humanos ou animais so pleomrficas (morfologia heterognea), principalmente arredondadas, de at 200nm de dimetro, mas incluindo tambm formas longas em basto, enquanto que partculas propagadas em ovos ou cultivos de clulas tm morfologia mais regular (80-120nm). O carter para maior uniformidade morfolgica determinado geneticamente e associado principalmente ao gene de M1 e menos associado aos genes das principais

projees superficiais hemaglutinina e neuraminidase (Lamb & Krug, 1996; Murphy & Webster, 1996). Os vrions de todas as estirpes de AIV no so morfologicamente distingveis de outros vrus influenza dos tipos A e B. As projees do envelope conferem aspecto caracterstico aos vrions dos tipos A e B e distingveis de C (neste dispostas em arranjo hexagonal) (Kingsbury, 1990.) A hemaglutinina (HA), juntamente com a neuraminidase (NA), determina o impressionante aspecto do envelope viral (Figura 1, 2, 3 e 4), caracterizado por aproximadamente 500 projees radiais de HA que se projetam para fora. A proporo HA:NA de 4 a 5 HA para cada NA. A HA codificada pelo segmento 4 do RNA genmico, sendo sintetizada no retculo endoplasmtico rugoso (RER) como um polipeptdeo nico HAo (peso molecular 76.000). O segmento 4 do RNA constitui-se de 1742 a 1778 nucleotdeos e codifica um polipeptdeo de 562 a 566 resduos de aminocidos, sendo a cadeia HA1 de 319 a 326 e HA2 de 221 a 222 resduos de aminocidos. Um peptdeo de sinalizao direciona a cadeia nascente para a membrana do RER, onde clivada por peptidase de sinal que a transforma em protena prottipo tipo 1 HA, integrante da membrana viral (Figura 6). A clivagem pode resultar em perda de um a seis resduos. A HA ps-maturada pela adio de sete cadeias de oligossacardeos, adicionados cadeia principal e trs resduos de palmitato adicionados por ligao tio-ter aos trs carbonos terminais das cisteinas proximais. A anexao de cinco cadeias de carboidratos na estrutura lateral da HA1 e uma na cadeia lateral de HA2 resulta aparentemente na conformao tridimensional adequada da HA. Apenas uma cadeia de acar anexada regio globular de HA1, para estabilizao das associaes dos oligmeros entre as unidades globulares do topo da estrutura. A estrutura ancorada no envelope viral um trmero homogneo de monmeros no ligados covalentemente entre si. A clivagem da HA em duas cadeias ligadas por pontes dissulfdricas, HA1 (~47.000) e HA2 (~29.000), depende da estirpe viral, tipo de clula hospedeira e condies de replicao, necessria para a infecciosidade, determinante da patogenicidade e disseminao da infeco. A HA estende-se por 135

para fora do envelope. Trs molculas de HA2 formam um trmero espiralizado que est ancorado e se projeta do envelope (76 ), na extremidade distal do qual conecta-se a HA1, a subunidade globular mais externa. Uma regio hidrofbica de HA2, que embebida na haste da HA e torna-se exposta em pH cido, forma o peptdeo da fuso (Lamb & Krug, 1996; Wiley & Skehel, 1990). A homologia dos aminocidos da HA entre duas estirpes uma do grupo A e outra do grupo B foi de 24% em HA1 e 39% em HA2, sugerindo relacionamento evolutivo entre os grupos A e B do vrus influenza (Lamb & Krug, 1996).

As trs principais funes ou propriedades da HA so: 1. Ligar-se ao receptor contendo cido silico na superfcie da clula hospedeira, proporcionando a adsoro da partcula viral clula; 2. Responsvel pela penetrao do vrus atravs da membrana citoplasmtica, intermediando a fuso do envelope da partcula endocitada com a membrana endosomal, resultando na liberao dos nucleocapsdeos no citoplasma; 3. o principal antgeno do vrus contra o qual o hospedeiro desenvolve anticorpos neutralizantes e pandemias de influenza esto associadas a mudanas em sua estrutura antignica.

Todos os tipos de hemaglutininas (H1 a H15) reconhecem cadeias de acares da srie sialillactose tipo I e II (cido silico alfa 2-3 (6)Gal beta 1-3 (4) GlcNAc beta 1-) em glicoprotenas e glicolipdeos nas clulas alvo como molculas receptoras. Diferentes cidos silicos nas membranas das clulas resultam em diferentes permissividades replicao de AIV. As estirpes de aves e eqinos ligam preferencialmente ao receptor 2-3Gal (SA23Gal) do cido silico terminal, enquanto as estirpes humanas ligam-se ao receptor SA2-6Gal. A distribuio do cido silico nas membranas celulares das espcies animais influencia o espectro de hospedeiros. As traquias de suinos tm ambos receptores para vrus de aves (SA2-3Gal) e de humanos (SA2-6Gal). HA que reconhecem Neu5Gc23Gal, abundantes nas clulas epiteliais da traquia de eqinos, so capazes de infectar eqinos, enquanto um AIV com HA que reconhece Neu5Ac2-6Gal mas no Neu5Ac2-3Gal incapaz de infectar eqinos. AIV que reconhece Neu5Ac2-3Gal replicado nos intestinos de patos, principalmente nas clulas epiteliais das criptas. Os sunos podem representar, por essa permissividade, hospedeiros para a recombinao de estirpes de aves e humanos (Suzuki, 2000). Uma estirpe humana de AIV do subtipo H3, apesar de origem aviria, no replicada no intestino de patos, para a qual o reconhecimento do glicoconjugado que possui cido Ngliconeuramnico ligado galactose por ligao 2,3 relacionado com a habilidade de replicao no epitlio do colon de patos e o reconhecimento de NeuGcalfa2,3-Gal determina o enterotropismo (Suzuki et al., 2000). Determinantes antignicos comuns podem ser encontrados nas HA de diferentes subtipos. Um estudo com anticorpos monoclonais detectou duas regies conservadas conformacionais na haste da HA, uma em HA1 e outra em HA2, dos subtipos H1, H2, H5 e H6 (Smirnov et al., 1999). Cinco stios antignicos (A, B, C, D e E) esto localizados na regio globular mais externa (HA1) de cada monmero (Figura 5). O stio de ligao ao receptor celular (cido silico) corresponde localizao B e forma uma bolsa em cada subunidade de HA1. As bolsas so inacessveis aos anticorpos e os

aminocidos (tirosina 98, triptofnio 153, histidina 183, cido glutmico 190 e leucina 194) componentes so muito conservados entre as estirpes. As especificidades entre os stios de ligao e os receptores celulares diferem de acordo com os hospedeiros. Por exemplo, humanos, aves e cavalos podem apresentar restries s infeces interespecficas (Lamb & Krug, 1996). Glicoprotena da fuso: Ativao por da HA e relao com patogenicidade As estratgias para a fuso das duplas camadas lipdicas do envelope viral e clula hospedeira incluem: 1. A mudana conformacional da HA deve ocorrer no momento e local certo para evitar que o peptdeo de fuso da HA produza autoaglutinao dos monmeros; 2. O peptdeo de fuso pode intercalar dentro das duas camadas lipdicas; 3. Vrios trmeros de HA devem adsorver para assegurar a formao do poro de fuso competente; 4. A HA requer o stio trans-membrana para a completa fuso. HA de engenharia gentica ancora s membranas, com ncora de fosfatidilinositol glicosil, e promove fuso apenas parcial (hemifuso); Uma regio hidrofbica de HA2 torna-se exposta em pH cido e forma a glicoprotena da fuso. As mudanas conformacionais na HA em pH baixo resultam na exposio de alguns stios e no seqestramento de outros. Por exemplo, os stios de clivagem por tripsina do peptdeo da fuso exposto tornam-se sensveis digesto pela termolisina e a ponte dissulfdrica nica que liga HA1 e HA2 torna-se exposta. Apesar das modificaes, a molcula mantm a estrutura trimrica e os stios de combinao com o receptor mantm os resduos de ligao ao cido silico. As pontes dissulfdricas entre as subunidades HA1 e HA2 protegem a cabea globular da HA de mudana conformacional em pH cido, que impediria a associao ao receptor celular (Lamb & Krug, 1996).

A clivagem da molcula HA em HA1 e HA2 um prrequisito para a mudana conformacional, que ocorre em pH cido e, portanto, uma condio para infecciosidade (Figura 6). As HA que possuem resduo nico do aminocido bsico arginina no peptdeo de conexo entre HA1 e HA2 no so clivadas in vitro, ou seja, no so clivadas por maturao no complexo de Golgi, mas podem ser clivadas pela adio de tripsina exgena (Klenk et al., 1975), enquanto HA com mltiplos resduos de aminocidos bsicos no mesmo peptdeo de conexo so clivadas pela furina, uma protease residente na rede trans-Golgi (Tabela 2). A existncia de motivos reconhecidos e clivados pela furina tem sido relacionada virulncia, aspecto especialmente caracterizado para os influenza de aves (Klenk et al., 1994). A patogenicidade dos AIV est relacionada ativao dos novos vrions pela furina. O stio de clivagem est localizado em seqncia de mltiplos aminocidos bsicos e a clivabilidade mxima foi observada com pelo menos 5 resduos bsicos no stio que contenha carboidratos associados. A substituio da arginina carboxiterminal por lisina em HA1 inibe a clivagem (Walker & Kawaoka, 1993). As proteases de diversas clulas em cultivo in vitro foram comparadas com a furina purificada, confirmando o papel da furina como ativadora da HA para fuso (Walker et al., 1994). Alm da ativao da HA pela furina (endoprotease relacionada a subtilisina; do complexo trans-Golgi) h outras enzimas descritas com papel maturador da HA. A protease PC6, tambm relacionada a subtilisina e muito disseminada, pode tambm ativar AIV virulentos in vitro, indicando que outras enzimas de clivagem da HA podem estar presentes nos animais (Horimoto et al., 1994). Neuraminidase A neuraminidase (NA) uma das glicoprotenas do envelope que qualifica, juntamente com a HA, o subtipo das estirpes dos vrus influenza. A estrutura fsica da NA de uma haste com uma poro globular (cabea) na extremidade, tomando a forma de um cogumelo. A NA um tetrmero homogneo de peso molecular aproximado de 220.000 (protena integrante da membrana da classe II) e pode ser removida do envelope viral com protease, condio

em que aglutinam formando rosetas entre a haste e a cabea. A NA removida enzimaticamente do vrion retm a atividade enzimtica e as propriedades antignicas. um tetrmero em forma de cubo, cada monmero composto de 6 folhas antiparalelas de 4 fitas cada (Bossart-Whitaker et al., 1993). A NA produto do gene 6 do RNA e, para o subtipo A/PR/8/34, por exemplo, o segmento 6 do RNA tem 1413 nucleotdeos e codifica um polipeptdeo de 453 aminocidos. A atividade biolgica da NA est envolvida com a catlise de remoo dos acares de cido silico da HA. A NA (acetil neuramil hidrolase) est, tambm como a HA, sujeita variao antignica e atua na hidrlise da ligao -cetosdica entre o cido silico terminal e uma D-galactose ou D-galactosamina adjacente. Anticorpos especficos contra a NA no so neutralizantes, embora reduzam o tamanho das placas de efeito citoptico (Lamb & Krug, 1996). A atividade enzimtica da NA sobre os stios de cido silico dos receptores celulares mediada por dois stios na superfcie superior (distal) e outro na superfcie inferior (proximal) da cabea globular. Na extremidade globular, 11 stios conservados apresentam ligao ao cido silico. Embora as atividades biolgicas e enzimticas estejam confinadas cabea, mesmo quando removida do vrion, o papel da NA no ciclo biolgico de influenza vrus est ainda obscuro. A remoo do cido silico da HA, NA e superfcie celular permite o transporte do vrus pela camada de mucina, o que permite ao vrus encontrar o seu receptor na membrana celular das clulas da mucosa. Algumas NA (N1 e N9) tm atividade hemaglutinante alm de enzimtica, um receptor que no se conhece o papel (Lamb & Krug, 1996). Todos os subtipos de NA de origem aviria exibem atividade de hemadsoro, embora a ausncia dessa no impea a replicao desses em hospedeiros avirios (patos de Pequim) (Kobasa et al., 1997). Conforme descrito para os subtipos N1 e N9, a regio hidrofbica da NA (resduos 7 a 35 Nterminais) na base da haste tem o papel de direcionar a molcula para a membrana do RER e sua ancoragem estvel no envelope e, tem sua seqncia embebida na membrana citoplasmtica (cauda transmembrana) e conservada (N-Met-Asn-Pro-Asn-Gli-

Lis). A haste tem grandes variaes em seqncia e nmero de aminocidos (62 a 82), enquanto a cabea pode apresentar homologia entre 42 e 57% entre subtipos de influenza A, com os resduos de cistena conservados e conformao tridimensional semelhante. O stio de combinao com o substrato forma uma grande bolsa em cada um dos quatro monmeros, cada um com a configurao de hlice de avio determinada por seis dobras de quatro fitas proticas cada. Mutaes dos resduos conservados da regio podem resultar em perda da atividade enzimtica. H cinco stios potenciais para incorporao de carboidratos por ligaes nitrogenadas (Lamb & Krug, 1996; Bossart-Whitaker et al., 1993). Mutao antignica em HA e NA: Drift e shift antignico A mutao antignica dos AIV est caracterizada por alteraes leves ou sutis (drift) ou grandes alteraes (shift) na seqncia de aminocidos da HA e NA. A acumulao de mutaes de ponto na HA ou NA resulta em alteraes detectveis como antigenic drift (mudana leve), cuja taxa de acumulao varia com a taxa evolutiva dos AIV, sendo menor entre os AIV que os demais influenza A vrus. As taxas de mutao mais altas so encontradas entre os influenza A humanos, enquanto influenza A de eqinos e sunos so intermedirios. Substituies de aminocidos no foram detectadas em um perodo de 50 anos entre alguns AIV. Os AIV representam, assim, influenza vrus conservados antigenicamente, com acumulaes de mutaes ao acaso, indicando a no participao da seleo imune nas mudanas antignicas leves, em contraste com o que ocorre em humanos. Antigenic drift foi detectado em influenza vrus de eqnos e sunos, mas os resultados podem confundir comparaes com diferentes linhagens filogenticas (Murphy & Webster, 1996). Os caminhos da evoluo de estirpes de H1N1 humanos entre 1997 e 1986 foram determinados pelo mapeamento de oligonucleotdeos e estudos de seqenciamento, que evidenciaram que os influenza A podem evoluir por dois ou mais caminhos evolutivos simultaneamente nos casos estudados, confirmando a mutao mdia de 4 a 6 oligonucleotdeos por ano (Cox et al., 1989). As mutaes que resultam em

mudanas na especificidade do stio da HA de ligao ao receptor celular ocorrem logo aps a transmisso de AIV de aves para sunos ou humanos, sendo altamente associadas capacidade do novo vrus em desencadear epidemias. Os vrus de aves e focas ligaram-se de forma fraca ao polmero sinttico sialilglicopolmero (6'SLN-PAA), uma indicao de pouca afinidade ao receptor celular, enquanto as primeiras estirpes humanas e de sunos detectadas ps-transmisso ligaram-se ao 6'SLN-PAA com grande afinidade (Matrosovich et al., 2000). Nucleoproteina A nucleoprotena (NP) o principal componente estrutural em contato direto com o RNA (Figura 5), revestindo e dando forma estrutura da ribonucleoproteina (RNP). As diferenas na composio antignica da NP permitem a classificao em influenza vrus tipos A, B e C. Todos os AIV esto classificados no tipo A. O segmento 5 de 1565 nucleotdeos do RNA codifica a sntese de um polipeptdeo de 498 aminocidos rico em resduos de arginina. Embora reaja com o fosfato (cido) do RNA, nenhuma seqncia bsica foi reconhecida para a interao, o que sugere mltiplos stios de interao RNA-NP. As NP recm-sintetizadas no citoplasma so transportadas ao ncleo por informaes dos resduos de aminocidos 327 a 345. O RNA do vrion (fita negativa) e o molde (fita positiva) mantm associaes com a NP, enquanto os RNAm no (Lamb & Krug, 1996). A fosforilao da NP ocorre, mas no est claro o seu papel ou funo. Uma proporo das NP recm- sintetizadas fosforilada imediatamente aps a traduo, estando a fosfolizao associada migrao ao ncleo e a quinase envolvida na fosforilao parece ser influenciada pela temperatura de incubao (in vitro) das clulas infectadas (Almond & Felsenreich, 1982). Protenas da Membrana M1 e M2 A protena matriz do envelope viral M1 (Figura 5) o mais abundante polipeptdeo da partcula de AIV, com 3.000 unidades por vrion, localiza-se na face interna da dupla camada lipdica e representa um antgeno tipo ou gnero-especfico (influenza vrus A, B ou C) altamente conservado dentro de cada tipo.

Ao revestir a face interna do envelope, confere a esse rigidez e interage com as caudas citoplasmticas de HA, NA, M2 do envelope e no cerne com a RNP, todas essas interaes, entretanto, sem confirmao experimental. Ao interagir com a RNP, M1 inibe a transcrio e direcionamento ao ncleo celular, enquanto aps sua sntese enviada ao ncleo para permitir a sada da RNP do ncleo (Lamb & Krug, 1996). A M1 contm um motivo (motif) de zinco que promove interao protena-protena (Elster et al., 1994). Purificaes da RNP contm M1, demonstrvel com anticorpos monoclonais anti-M1. A interao entre M1 e a protena no estrutural NS2 foi demonstrada em vrions purificados (Yasuda et al., 1993.). Ambas protenas M1 e M2 so produto da traduo do segmento 7 do RNA, que contm 1027 nucleotdeos os quais codificam para M1 um polipeptdeo de 252 aminocidos (PM 27.801) e, para M2, 97 aminocidos (PM 11.010) (Lamb & Krug, 1996). A protena M2 (Figura 7) est presente em pequeno nmero no vrion (20 a 60 unidades), embora seja muito expressada na membrana plasmtica da clula infectada. Localiza-se atravessando a dupla camada lipdica, formando o canal inico do vrion. (Lamb & Krug, 1996). A protena M2 um tetrmero homogneo que consiste de um par de dmeros ou tetrmeros ligados por pontes dissulfdricas. Um anticorpo monoclonal (14C2) anti-M2 restringe o tamanho das placas de efeito citoptico por interferir nas interaes entre M1 e M2 durante montagem e brotamento. A partir dos estudos do efeito de amantidina, utilizada na profilaxia e tratamento de infeces por influenza A, props-se a funo da protena M2 como canal inico que permite ons Na+ e principalmente H+ entrarem no vrion durante a desnudao e modulao do pH de compartimentos intracelulares, uma vez que est expressa de forma abundante na membrana celular.

Produto do gene PB2 Um AIV recombinante com o gene PB2 derivado do AIV A/Mallard/NY/78 e os demais derivados do influenza humano A/Los Angeles/2/87 apresenta expresso do fentipo de restrio na amplitude hospedeira, que resulta em eficiente replicao em tecidos de aves, mas incapacidade para produzir placas em monocamadas de clulas de mamferos (MDCK), fentipo que est associado capacidade de replicao no trato respiratrio de humanos e esquilos. Entretanto, a substituio de apenas um aminocido na posio 627 do produto do gene PB2 (de Glu para Lis) resulta em restaurao da infecciosidade aos hospedeiros mamferos (Subbarao et al., 1993). A protena um tetrmero homogneo, em que cada cadeia tem 97 aminocidos, com 24 resduos expostos para fora da clula, 19 resduos na regio trans-membrana (poro propriamente dito) e 54 resduos como caudas intracitoplasmticas. A funo do canal ativada por pH baixo e bloqueada por amantadina, uma droga antiviral. A atividade do canal inico essencial para o desnudamento dos influenza vrus nos compartimentos endossomais da clula infectada (Lamb et al., 1985 apud Lamb & Krug, 1996). Replicao

Ilustraes sobre a replicao podem ser observadas nas figuras 8 a e b.

Adsoro, Fuso e Desnudamento

A adsoro, fuso e desnudamento podem ser observadas na Figura 8. Os vrions dos influenza vrus tm afinidade qumica e colam aos receptores celulares que contm cido silico, atividade mediada no vrion pela extremidade mais externa da HA. O stio de combinao entre a HA e o receptor celular uma estrutura tridimensional em forma de bolsa, com diferenas de especificidade varivel com a seqncia de aminocidos do segmento protico, cuja interao com o cido silico mediada pela galactose a2,6 em humanos ou 2,3 em aves (Lamb & Krug, 1996). As glicoprotenas e glicolipdios dos receptores celulares reconhecidos pela HA de todos os subtipos de AIV contm cadeias de acares (cido silico- 23(6)Gal 1-3 Glc NAc 1-) (Suzuki, 2000). Embora a interao qumica seja fraca e de baixa avidez individualmente, uma alta avidez total obtida por mltiplas interaes de baixa afinidade (Lamb & Krug, 1996). A endocitose mediada pelo receptor a denominao atual para penetrao na clula por englobamento (viropexis). A alta capacidade de internalizao mediada por vesculas recobertas por clatrina, a principal protena das vesculas recobertas e mediadora de endocitose, associadas membrana celular. A endocitose envolve receptores de manose, os quais so considerados os principais receptores de endocitose para os influenza vrus, para a internalizao em macrfagos de camundongos (Reading et al., 2000). Uma invaginao forma-se em stios tipo bolsa, recobertos pela clatrina na membrana. Aps a internalizao, o revestimento de catrina removido e a vescula funde com endossomos que formam a srie de organelas celulares de pH cido crescente, cujo ambiente gerado por H+-ATPases, promove o desnudamento das partculas virais. Compostos que alcalinizam o pH dos endossomos (cloreto de amnia; cloroquina) impedem o desnudamento viral dos influenza vrus e outros vrus que utilizam a rota de endocitose, embora no tenham atividade antiviral. O papel da protena M2 como canal inico essencial para o desnudamento dos influenza vrus. A droga amantadina tem atividade antiviral nesse processo inicial da infeco, impedindo a liberao da ribonucleoprotena RNP presa protena M1 e caudas citoplasmticas da HA, a RNP no assim transportada ao ncleo e bloqueia-se a replicao

viral. O pH baixo do endossomo ativa o canal inico de M2 e o fluxo de ons para o interior do vrion rompe as interaes protena-protena entre RNP e M1. O pH neutro da membrana celular permite, ao contrrio, a associao RNP-M1 e montagem do vrion na sada da clula. O canal inico mediado pela protena M2 permite o pH cido correto no interior da partcula viral para permitir a fuso do envelope do vrion com a membrana da clula (Murphy & Webster, 1996; Lamb & Krug, 1996). Transcrio e Replicao do RNA A introduo do RNA no ncleo celular d-se atravs dos poros da membrana nuclear ainda como complexo RNP. O RNA (13.588 nucleotdeos para a estirpe A/PR/8/34) liberado para o ncleo celular composto de 8 segmentos lineares e de fita simples e contm 10 genes. Cada segmento contm uma seqncia conservada de 12 ou 13 nucleotdeos nas extremidades 3' e 5', respectivamente. O RNA viral (RNAv) transcrito em RNA mensageiro (RNAm) por estimulao pelo dinucleotdeo ApG, que complementar extremidade 3' de cada segmento de RNAv (3'-UpCpG-..........5') e incorporado ao novo RNA transcrito na extremidade 5'. A iniciao da sntese do RNAm ocorre por fragmentos 5' capeados derivados de recm-formadas transcries de RNA polimerase II da clula. A cpia efetuada at que resduos de uridina so encontrados, 15-20 bases antes da extremidade 5' do RNAv, quando se encerra a transcrio e adicionada a terminao poli-A (poliadenilada) ao RNAm. A replicao do RNAv ocorre primeiramente com a sntese dos RNA moldes (cpias de tamanho total do RNAv) e cpia desse molde para RNAv. Para ocorrer a replicao, so necessrias cpias de extenso completa do RNAv. Os RNA transcritos ou moldes so copiados sem iniciadores e no so terminados em poli-A durante a sntese do RNAm. A replicao ou cpias a partir desse molde, sem iniciadores, d origem a RNAv, que contm terminaes 5' trifosforiladas. Os trs tipos de RNA que existem durante a replicao (RNAv, RNAmolde e RNAm) so todos sintetizados no ncleo da clula. O processamento celular do RNAm viral utiliza os mesmos mecanismos dos precursores celulares, permitindo a metilao do RNAm em resduos de adenosina e dois segmentos de RNAm

atuarem como precursores, que so processados resultando em fragmentos de RNAm menores. Iniciadores da clula, fragmentos de RNA derivados de transcries de RNA polimerase II especificamente capeadas iniciam a sntese de RNAm no ncleo. Esse mecanismo exige o suprimento continuado de RNA polimerase II celular plenamente funcional e justifica a inibio da sntese de RNAm por actinomicina D e -amantadina. A transcrio do RNAm comandada pelo penltimo resduo de citosina do RNAv e alongada at atingir os 5 a 7 resduos de uridina 1522 nucleotdeos do final 5' do RNAv, quando a cauda poli-A adicionada extremidade 3' do RNAm. Wsta cauda relacionada com a "ala-de-panela" que determinaria o encerramento da transcrio. Esse encerramento tambm poderia ser causado pela prpria RNA polimerase atuando como barreira fsica (Lamb & Krug, 1996). Replicases (complexo enzimtico) podem ser catalizadoras diferentes das transcriptases, envolvidas nas cpias de RNAv e sntese dos moldes. As transcriptases estariam envolvidas na sntese de RNAm. Papel da Protena No Estrutural NS1 A NS1 est envolvida na regulao da exportao de RNAm (viral) clivado do ncleo (e RNAm celulares), inibindo essa exportao e tambm a clivagem do pre-RNAm. Traduo Durante a infeco pelos influenza vrus ocorre uma dramtica mudana de sntese protica, de protenas celulares para protenas virais, comandada por processos nucleares e citoplasmticos. Embora haja no ncleo a degradao das transcries de RNAm celular, esse mecanismo no explica suficientemente a interrupo da traduo de RNAm celular, pois h muitos RNAm celulares funcionais no citoplasma. A interrupo da traduo dos RNAm celulares ocorre em 3 horas aps a infeco de diversos tipos celulares. No ocorre por degradao ou modificao do RNAm celular, mas se deve interrupo da iniciao e alongamento das tradues. A iniciao da traduo seletiva e privilegia RNAm viral por serem muito eficientes os iniciadores desses (Lamb & Krug, 1996).

Brotamento Observaes de clulas infectadas ao microscpio eletrnico permitem a visualizao dos influenza vrus na membrana plasmtica, as quais evidenciam protenas estruturais presentes na membrana celular, independentemente de outros componentes estruturais, estrutura hbrida de membrana celular e protena viral precursora do envelope viral e relacionada ao brotamento dos novos vrions para fora da clula. As protenas da clula hospedeira no so includas na estrutura do envelope viral e, a exemplo de algumas protenas virais no transportadas para a membrana, parecem ser excludas ou seletivamente impedidas (por exemplo, a protena viral M2 est expressa na membrana celular em concentrao 4 vezes menor que a HA). As associaes proticas envolvidas no brotamento viral (Figura 8) incluem contatos entre M1, ligada dupla camada lipdica e a nucleoprotena (NP). atraente a noo de que as caudas citoplasmticas das HA teriam o papel de permitir essas interaes entre o envelope viral e seus componentes internos, embora tenha sido demonstrado que vrions sem as caudas citoplasmticas executam brotamento normal. Os stios citoplasmticos da HA (caudas citoplasmticas), pelo menos em parte, pareceram necessrios para o processo de seleo das protenas a serem montadas no vrion (Naim & Roth, 1993). A liberao dos vrions aps o envelopamento pelas associaes de NP-M1 parece necessitar da ao da neuraminidase (NA), uma vez que vrions com NA defectiva formam agregados e se reduz a liberao (e ttulo) desses em cultura (Lamb & Krug, 1996). Classificao de Isolados Os lquidos alantides (LA) de ovos SPF inoculados com material suspeito via cavidade alantidea aos 10-11 dias de embriognese so testados para atividade hemaglutinante (HA) frente a hemcias de galinhas SPF. LA reagentes para HA devem ser titulados (microteste em diluio dupla seriada), padronizados para 4 e 8 unidades hemaglutinantes e avaliados em provas de inibio da hemaglutinao (HI) com soro monovalente contra o vrus da doena de Newcastle (NDV). LA com HA no neutralizada no HI para NDV deve ser testado para a presena de

antgenos da nucleoprotena (NP) ou protena da matriz do tipo A, para confirmao de AIV. Os testes mais comuns para identificao da NP ou protena da matriz de AIV so imunodifuso dupla ou teste de hemlise simples radial em gel, na qual reagem o AIV sendo identificado e um soro monoespecfico contra AIV. ELISA foram desenvolvidos empregando anticorpo monoclonal especfico para a NP ou protena da matriz e representam ensaios rpidos, sensveis e especficos (Walls et al., 1986.). A subtipificao da HA e NA a seguir obtida em testes com um painel de 15 soros contra as 15 HA e 9 NA diferentes, no podendo haver reao cruzada entre elas, sendo fundamental a identificao prvia do AIV pela deteco de NP ou protena da matriz, por haver possibilidade de reao negativa por surgimento de nova HA. Testes de inibio da neuraminidase, especialmente os microtestes, detectam subtipos de NA, com soros especficos contra cada uma das nove neuraminidases (Easterday et al., 1997). Aves domsticas comercializadas nos mercados de aves vivas em Hong Kong foram monitoradas desde 1997, aps o surto de HPAIV H5N1 em humanos, sendo que foram detectados gansos sorologicamente reagentes ao AIV H5N1 em 1999 e os vrus isolados, denominados coletivamente A/Environment/Hong Kong/437/99, por swabbing das gaiolas. A/Env/HK/437/99 foram caracterizados como uma mistura de quatro isolados, muito relacionados aos isolados A/Goose/Guangdong/1/96 (Cauthern et al., 2000). As seqncias de estirpes de AIV do surto de Hong Kong em 1997 foram examinadas evidenciando que derivaram de influenza vrus de aves e no de humanos (Subbarao & Shaw, 2000). Estudos filogenticos de isolados de AIV contendo H7, obtidos de aves dos mercados de aves vivas do nordeste dos EUA indicaram para mltiplas recombinaes de genes, em que o gene da HA pareceu ter sido o nico gene novo introduzido (Suarez et al., 1999.). As hemaglutininas de isolados de oito surtos de AIV H5N2 de alta patogenicidade no norte da Itlia foram estudadas, sendo os isolados considerados semelhantes ao A/HK/156/97 (H5N1 de Hong Kong 1997), agrupando filogeneticamente com esse, mas distingveis deste. A HA de uma amostra no patognica H5N9 isolada durante o perodo dos

surtos foi considerada semelhante amostra altamente patognica A/turkey/England/91 (H5N1) (Donatelli et al., 2001).

EPIDEMIOLOGIAOcorrncia Somente o tipo A de AIV causa infeco natural em aves, embora todos os 15 subtipos de HA e nove de NA tenham sido isolados de aves, nas quais dois grupos distintos podem ser divididos, considerando a virulncia. Os isolados muito virulentos causam a influenza de alta patogenicidade (HPAIV), com mortalidade que atinge 100% das aves. Os HPAIV apresentam geralmente HA dos subtipos H5 e H7, embora nem todos isolados desses subtipos sejam de alta patogenicidade. Todos os outros subtipos so menos patognicos para aves, resultando em doena respiratria leve, embora possa ser agravada por infeces concomitantes, imunodepresso e/ou condies de ambincia desfavorveis s aves. Surtos primrios de HPAIV tm sido descritos desde 1959, cinco em perus e 12 em galinhas. Subtipos causadores de HPAIV so raramente isolados de aves silvestres. Por exemplo, HPAIV representam 15% dos isolados de patos e gansos e 2% de outras espcies. Em silvestres, entretanto, mais comum o isolamento de amostras de baixa virulncia para aves domsticas. O contato das aves domsticas com aves silvestres determinante para a ocorrncia de surtos nas primeiras. O papel da transmisso mecnica tambm importante, principalmente por trabalhadores e tcnicos ao transferir fezes infectadas para lotes susceptveis (Alexander, 2000). As informaes sanitrias do Office International des Epizooties (http://www.oie.int/esp/info/hebdo/EIS_01.HTM) registram os focos de influenza aviria por HPAIV em janeiro e fevereiro de 2000 na Itlia, em galinhas, perus, codornas e galinhas da Angola e vrias outras espcies nas regies de Fruili, Venezia, Giulia, Lombardia, Sicilia, Trento, Veneto e Piemonte, com maior nmero de focos na provncia de Brescia (65 em janeiro e 33 em fevereiro) e Mantova (28 em

janeiro e 3 em fevereiro) na regio da Lombardia, Verona (65 em janeiro e 21 em fevereiro) e Vicenza (19 em janeiro e 1 em fevereiro) em Veneto, envolvendo um total de 5.932.622 aves em janeiro e 1.777.777 em fevereiro. Na Itlia, HPAIV parecem ser enzoticos desde o sculo 19 e relatos de isolamentos de AIV de baixa patogenicidade de vrios subtipos tm sido publicados (Franciosi et al., 1981; Petek, 1982; Papparella et al., 1994; 1995), isolados de aves domsticas, especialemente perus e aves aquticas selvagens (Capua & Marangon, 2000). De acordo com o relatrio da O.I.E. de 1997 (O.I.E. Bulletin, 1997), formas de alta patogenicidade de AIV ocorreram em Hong Kong (um em abril e dois em maio), na Itlia (3 surtos em novembro e 4 em dezembro) e Austrlia (um surto). AIV foram isolados da gua (onde podem ser preservados durante o congelamento de inverno, aguardando o retorno das aves) e de fezes da margem de lagos que abrigam comunidades de patos selvagens migratrios no Canad. O estudo canadense concluiu que 20% dos patos selvagens jovens esto infectados com muitos subtipos (enzoticos) quando se agrupam para a migrao, embora no apresentando sinais clnicos. Os patos podem excretar AIV por 30 dias, mas infeco persistente no foi demonstrada. A contnua circulao dos AIV nas populaes de aves aquticas migratrias ocorre, entretanto em baixa incidncia nos perodos migratrios subtropicais (Murphy & Webster, 1996), possivelmente explicando a baixa ou no ocorrncia no Brasil. A baixa virulncia dos AIV em patos garante a preservao do vrus na natureza, por adaptao da infeco durante muitos sculos, perpetuando os AIV nesses reservatrios naturais, dos quais disseminam-se mutantes e/ou recombinantes capazes de infectar as diversas espcies animais, incluindo focas, baleias, sunos, cavalos e aves domsticas, especialmente perus (Murphy & Webster, 1996), alm de humanos (Figura 9).

A hiptese atual considera as aves aquticas, especialmente da ordem Anseriformes, incluindo patos, marrecos e gansos como reservatrios principais de influenza A na natureza. Dessas espcies haveria a transmisso para todas as demais espcies de aves, por exemplo aquticas da ordem das procelrias (Procellariidae, Puffinus sp.; Diomedeidae; Hydrobatidae; Pelecanoididae) e gaivotas (Laridae, Larus sp.), passeriformes e mamferos. A transmisso de AIV foi demonstrada entre sunos e humanos (linhas slidas). H inmeras evidncias da transmisso entre patos e outras espcies com base nas informaes de anlises filogenticas do gene da nucleoprotena de grande nmero de estirpes de influenza vrus dos cinco diferentes grupos de hospedeiros. O intercmbio de AIV entre sunos e humanos tem sido demonstrado (seta em negrito). Alta homologia entre os genes internos foi detectada nos isolados H9N1, H6N1 e H5N1 indicando que esses subtipos so capazes de fazer intercmbio de genes e, portanto, figurar como fonte potencial de isolados patognicos para humanos, sendo necessria a vigilncia epidemiolgica para esses em aves aquticas e domsticas, sunos e humanos (Hoffmann et al., 2000). As etiologias das pandemias humanas de 1957 e 1968 foram caracterizadas como estirpes hbridas que continham genoma recombinante de AIV de aves e humanos (Horimoto & Kawaoka, 2001). O pool

gentico de AIV em aves aquticas migratrias e de praia sugere que uma transmisso de baixo nvel ocorre entre essas aves por todo o ano, caracterizando dois grupos reservatrios com interseco geogrfica em todo o globo. Todos os subtipos de HA e NA ocorrem nessas aves. Embora tenham sido detectadas evidentes tendncias dos isolados serem geograficamente restritos e hospedeiros especficos, caracterizados pela protena NP, por exemplo de eqinos, sunos, gaivotas e outras espcies de aves e isolados de humanos, outros genes apresentam extensiva tendncia recombinao gentica. Todas as linhagens de AIV de mamferos foram originadas do pool gentico das aves (possvel inclusive para influenza B). As anlises dos segmentos do RNA que codificam as protenas das espculas (HA, NA e M2) e protenas internas (RNA transcriptases A, B1 e B2; NP, M e S) de uma grande variedade de hospedeiros e de regies geogrficas distintas permitiram essas concluses. O compartilhamento gentico de AIV entre essas espcies ocasiona surtos e pandemia, indicando a possibilidade de sunos servir como hospedeiros intermedirios para intercmbio gentico entre AIV de aves reservatrio e humanos (Webster et al., 1992). O ltimo surto de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) em galinhas nos Estados Unidos foi causado por representantes do subtipo H5N2 na Pennsylvania e New Jersey, em 1983-1984, que foi controlado pelo esforo federal de erradicao (Avian Influenza Task Force, 1984.). Entretanto, vrios AIV H5N2 foram isolados entre 1986 e 1989 em aves de mercados de aves vivas nos Estados Unidos. Para avaliar as relaes epidemiolgicas entre as estirpes, as seqncias dos genes que codificam a subunidade HA1 da HA e do gene que codifica a protena no estrutural (NS) foram determinadas para 11 estirpes e comparadas com as seqncias de estirpes conhecidas. As estirpes de 1986-1989 foram todas relacionadas s estirpes de 1983-1984 da Pennsylvania, pela seqncia de bases e de aminocidos de ambos os genes e protenas, provando que a linhagem Pennsylvania/83 (Penn/83) no foi completamente erradicada. Outra informao interessante sobre a linhagem Penn/83 que ela

apresentou substituies de aminocidos exclusivas, no detectadas em outras linhagens de AIV, indicando que Penn/83 pode estar circulando de forma inaparente nas aves antes dos surtos clnicos, representando outro exemplo de manuteno e evoluo de longo termo de AIV (Suarez & Senne, 2000). Oito surtos de influenza aviria subtipo H5N2 de alta patogenicidade, com ndices de patogenicidade de 2,98 a 3,00, caracterizados por inoculao intravenosa em galinhas de 6 semanas de idade, foram diagnosticados nas regies de Veneto e FruiliVenezia Giulia, no nordeste da Itlia, entre outubro de 1997 e janeiro de 1998. Em todos os surtos, os riscos caracterizados incluram movimentao de aves, criaes de mltiplas espcies e contato com aves aquticas migratrias. As medidas de controle previstas pela Comunidade Europia, na lei 92/40/EEC, foram aplicadas e impediram a disseminao para a avicultura industrial (Capua et al., 1999). Surtos de AIV foram diagnosticados em galinhas poedeiras, frangos e reprodutoras da regio metropolitana de Islamabad, Murree e Abbatt Abad (Paquisto), entre 1994 e 1995, resultando em mortalidade de mais de 85% das aves. Vrus hemaglutinante de eritrcitos (galinha, ovelha, coelho, cobaio, bovino, papagaio, pombo, codorna e pardal) foi isolado em embries SPF, ocasionando a morte embrionria 36 horas p.i., no sendo inibido por anticorpos contra o vrus da doena de Newcastle ou bronquite infecciosa. A estirpe foi caracterizada como integrante do subtipo H7 de AIV (Muhammad et al., 1997). Um surto de doena caracterizada por queda sbita na produo de ovos, de 70% para 5%, edema das faces, fraqueza e morte de 2 a 3% ao dia, ocorrido em 1998, tambm no Paquisto, foi descrito em reprodutores de diferentes idades, principalmente em lotes de 45 semanas, do qual se isolou A/chicken/Pakistan/3/99 (H9N2) (Naeem et al., 1999). Em humanos, h evidncias sorolgicas que houve pandemias em 1889-1890 causadas por vrus semelhante ao subtipo "asitico" (H2N2), em 1900 (H3N8), 1918 (H1N1 - Espanhola), 1957 (H2N2

Asitica), 1968 (H3N2 Hong Kong), 1977 (H1N1 Russa). A pandemia de 1918 matou entre 20-40 milhes de pessoas e mudou o curso da histria, por debilitao do exrcito alemo. A mortalidade por influenza entre as tropas dos EUA atingiu 80% do efetivo na 1 Guerra Mundial (Murphy & Webster, 1996). Crianas humanas so a principal fonte de transmisso de vrus influenza A na comunidade, visto que as escolas e salas de aulas fornecem as condies de proximidade e aglomerao que favorecem a disseminao, especialmente por aerossol. Os influenza A resistem nos aerossis por um inverno inteiro no ambiente de baixa umidade dentro de casa nos climas temperados (dezembrojaneiro a abril-maio nos EUA), contribuindo para a ocorrncia estacional de influenza no inverno. A deteco de mutantes de hemaglutinina ao final da primavera tem sido considerada indicao de risco de surto para o prximo inverno (Moriuchi et al., 1991 citados por Murphy & Webster, 1996). Em humanos, embora a morbidade mais alta esteja em pessoas com 20 anos ou menos, a taxa de mortalidade mais alta ocorre entre pessoas com 65 anos ou mais. A mortalidade mdia de humanos por influenza em adultos de 65 anos de idade ou mais velhos a cada ano de 1:2200. A pandemia de 1918 ocasionou alta mortalidade em jovens adultos e naqueles acima de 65 anos, caracterstica que no se repetiu em pandemias subseqntes. Nos anos de epidemia de 1957 e 1958, 70.000 pessoas morreram e 1 em cada 300 adultos com 65 anos de idade ou mais morreu. Embora a mortalidade humana seja mais alta no primeiro ano de surto com novo subtipo, a mortalidade acumulada nos anos seguintes interpandemia significativamente mais alta que a do primeiro ano (Murphy & Webster, 1996). Nenhum ttulo de anticorpos circulantes especficos contra AIV foi detectado em 100 pombos (Columba livia) urbanos da cidade de Santiago do Chile avaliados durante 12 meses (maro 1996-maro 1997). Ttulos muito baixos (1 a 3 log2) para PMV-1 (doena de Newcastle) e nenhum ttulo para PMV-7 foram detectados (Toro et al., 1999). Na China, vinte espcies (no citadas) de aves raras em 4 fazendas foram avaliadas sorologicamente para diversos agentes de doena para as aves industriais.

Anticorpos para Mycoplasma gallisepticum (Mg), Salmonella pullorum (SP), clamidiose aviria (CA), doena de Newcastle (ND), laringotraqueite infecciosa (LI), doena de Marek (DM), bronquite infecciosa (BI), sndrome da queda da postura (EDS), bouba aviria (FP), leucose aviria, artrite viral e clera aviria foram detectados em 13 espcies, com Mg ocorrendo como o mais alto ndice (25%), seguido de SP (21.5%), CA (16.67%) e ND (15.31%). Anticorpos para doena infecciosa bursal (Gumboro), coriza infecciosa, adenovrus avirios do grupo I e influenza aviria no foram encontrados e testes intradrmicos de tuberculina foram negativos (Zhang et al., 1996). Outro estudo foi desenvolvido em outras 13 granjas de aves industriais e um de aves exticas, nas quais todas as aves industriais foram negativas para AIV, e 39/50 das amostras de soros das aves exticas foram positivas para AIV pelo teste de AGP. As aves exticas tinham histrico de doena clinicamente semelhante clera aviria, no resolvida com vacinao contra a clera aviria e doena de Newcastle ou soroterapia contra a doena infecciosa bursal. A doena causou a mortalidade de 10.000 faises e o controle de novos episdios foi obtido com a destruio dos faises sobreviventes e de outras espcies de aves, alm da aplicao de limpeza e desinfeco rigorosas (Zhu et al., 1996). Um estudo epidemiolgico desenvolvido na Itlia investigou a presena de AIV em faises criados para esporte em fazendas de caa. As amostras de swab cloacal de 200 indivduos no resultaram em isolamento de agente hemaglutinante (Piccirillo et al., 1999). Outro estudo italiano caracterizou estirpes de alta patogenicidade de AIV (HPAIV) do subtipo H5N2 isolados da avicultura do norte da Itlia. As estirpes italianas, embora distingveis de A/Hong Kong/156/97 (H5N1), foram consideradas antigenicamente semelhantes. A anlise filogentica da HA das estirpes italianas agrupou essas com as estirpes de Hong Kong, embora as anlises de HA, NS e NP das estirpes de H5N1 em circulao em Hong Kong e H5 italianas indicarem origens de ancestrais diversos. Na Itlia, nenhuma evidncia de transmisso de aves para humanos foi detectada para H5N2 (Donatelli et al., 2001), em contraste com as estirpes H5N1 de Hong Kong. Entretanto, estudos

anteriores de composio e seqenciamento da HA de A/duck/Ukraine/1/63 (H7) indicaram que as HA1 e HA2 dessa estirpe esto intimamente relacionadas com o subtipo H3 de Hong Kong (Ward et al., 1981). Influenza aviria no Brasil H ainda pouqussimos estudos na literatura cientfica nacional e internacional sobre a ocorrncia de AIV nas aves selvagens e ornamentais da fauna brasileira. Os trabalhos descrevem avaliaes de fauna local, com amostragem de algumas espcies. Um estudo da fauna de aves do Rio de Janeiro descreveu a ocorrncia e caracterizou estirpes de AIV natural em espcies ornamentais nesse estado (Couceiro et al., 1982). Um estudo sorolgico em espcies de aves silvestres foi desenvolvido no Estado de So Paulo por Anraku et al. (1971), estudando anticorpos por gel precipitao. Em avaliaes sorolgicas de plantis industriais conduzidas em Minas Gerais, em frangos de corte (Resende et al., 1990), no foram detectados anticorpos para AIV. Aps os surtos de 1983-1984 nos EUA, os pesquisadores investigaram anticorpos para AIV H5N2 em frangos de corte, com vistas a determinar o status sanitrio especfico desses. Para os ensaios laboratoriais, foi utilizada a gel precipitao em gar, no sendo detectadas quaisquer reaes especficas para AIV. Soros de 2000 frangos, entre 49 e 60 dias de idade, de 175 lotes em 96 granjas comerciais das regies do Alto So Francisco e Metalrgica de Minas Gerais, colhidos entre 1985 e 1986, foram avaliados. Os resultados indicaram que as estratgias de biossegurana implementadas pelo Ministrio da Agricultura, proibindo a importao de aves e ovos frteis dos EUA no perodo crtico, foram eficientes. Atualmente, o Ministrio da Agricultura mantm monitorao permanente das aves importadas nas portas de entrada do pas. O Projeto de Vigilncia Ativa (Projeto de Vigilncia, 2001) do PNSA, coordenado pelo Ministrio da Agricultura, em colaborao com instituies pblicas (universidades, Secretarias da Agricultura, institutos de pesquisa etc) e privadas (indstria, laboratrios de produo de vacinas e diagnstico etc) prev tambm a

amostragem para a avaliao permanente dos plantis comerciais nacionais, que inclui a simultnea avaliao para vrus, assim como anticorpos, para a doena de Newcastle e influenza aviria. Em humanos, a ocorrncia de influenza tem sido regularmente acompanhada. Um estudo de 12 meses aps a implementao do programa de vacinao voluntria indicou que a vacinao no foi suficiente para a reduo dos episdios clnicos e faltas ao trabalho em relao aos indivduos no vacinados (Ramadan et al., 2001). Estudos sobre a ocorrncia de esquizofrenia em humanos adultos no Brasil e sua relao com a estao de chuvas indicaram a infecco por influenza vrus durante a gestao como base para esta relao (Messias et al., 2001). Em outro estudo, soros de humanos foram avaliados em Belm do Par para anticorpos contra influenza A e B, nos anos de 1992 e 1993, por inibio da hemaglutinao para anticorpos contra A/Taiwan/1/86 (H1N1), A/Beijing/353/89 (H3N2) e B/Yamagata/16/88. Anticorpos para ambas estirpes de influenza A foram detectados em 84% (H3N2) e 56% (H1N1) dos soros e nveis mais baixos para o tipo B. Um aumento na incidncia de ttulos para H3N2 e tipo B foi detectado em 1993. (Santos et al., 1997). Anticorpos para H3N2 A/Hong Kong/1/68 e A/Bangkok/1/79 e A/Brazil/11/78 (H1N1) foram tambm investigados em nativos americanos da tribo Kren-Akorore (Parque Indgena do Xingu), tribo contactada pela primeira vez apenas em 1973, para os quais nenhum ttulo de anticorpos foi detectado, indicando a ausncia de transmisso por contato prvio e o isolamento dessa populao (Nascimento et al., 1985). Evoluo dos AIV Os estudos da ecologia dos influenza vrus tm confirmado a hiptese que as estirpes de mamferos evoluem de estirpes de aves. Cinco linhagens filogenticas foram estabelecidas com base nos estudos da NP: uma eqina antiga (no detectada h 15 anos), uma linhagem eqina recente, uma linhagem de gaivotas, uma de sunos e outra de humanos formam os ramos principais de evoluo. Os grupos de sunos e humanos so relacionados, ambos possivelmente originrios de influenza A

avirio (AIV) comum. Linhagens separadas de AIV, baseadas em estudos da NP e outros genes, foram determinadas para estirpes das Amricas e Europa/Asia (Webster et al., 1992), distino que estaria associada migrao de aves aquticas, principalmente no sentido norte-sul (latitude) nesses continentes, e no leste-oeste (longitude). Aves que migram no sentido da longitude teriam importante papel na continuidade da evoluo de influenza. Os modelos atuais de evoluo para os vrus influenza A so baseados em estudos de estirpes humanas, nas quais a taxa de evoluo muito alta em HA, em contraste com as protenas internas (RNA transcriptases A, B1 e B2; NP, M1 e NS). As velocidades de evoluo de M1 e M2 tm ndices diferentes e esto adequadas ao critrio protena externa e protena interna, a M2 localizada externamente com taxa muito mais alta que M1 interna e uma grande proporo das mutaes no gene de M2 no so silenciosas, enquanto que as mudanas em M1 no afetaram a codificao em um perodo de 55 anos (Ito et al., 1991). Em contraste aos influenza A de humanos, os AIV de aves aquticas tm ndices de evoluo baixos, com indicaes de que no h evoluo lquida nos ltimos 60 anos. As mudanas de nucleotdeos nos AIV so silenciosas e no representam trocas de aminocidos, significando que os AIV das aves aquticas funcionam como reservatrio natural de genes sem ou com poucas mudanas (Murphy & Webster, 1996), entre eles os vrus que forneceram os segmentos genticos envolvidos nas pandemias de 1918 (gripe Espanhola), 1957 e 1968 (sia). A evoluo molecular dos influenza A nas populaes de aves e humanas apresenta diferentes padres. Em aves co-circulam um grande nmero de segmentos genmicos de hemaglutininas diferentes. A modificao simultnea da HA e NA foi sugerida como necessria para a adaptao de influenza A de aves aquticas selvagens para galinhas domsticas, embora a modificao da HA para Sia2-3Gal parea no restringir a transmisso inicial de aves para humanos. Os AIV H5N1 de aves apresentam deleo de 19 aminocidos na haste da NA e um carboidrato na cabea globular da HA. A deleo reduz a liberao do AIV das clulas e a presena do carboidrato reduz a afinidade viral para os receptores

celulares. A NA encurtada e HA adicionalmente glicosilada so caractersticas dos subtipos H5 e H7 de galinhas (Matrosovich et al, 1999). A taxa de evoluo dos AIV nas espcies hospedeiras naturais (aves aquticas, aves de praia e gaivotas) considerada baixa, enquanto que em mamferos alta. Outras espcies como galinhas, perus, sunos, eqinos e humanos so consideradas como hospedeiros aberrantes. A distino entre espcies hospedeiras normais e aberrantes importante, pois permite a verificao de taxas de mutao diferenciadas nesses dois grupos. A presso seletiva para adaptao nas espcies aberrantes, por exemplo espcies da classe dos mamferos, determina alta mutabilidade de AIV presentes nesses. As seqncias de nucleotdeos dos genes precursores da hemaglutinina (HA) e componentes no estruturais (NS) foram comparadas entre seqncias de consenso e seqncias genticas de AIV de surtos em galinhas e perus, indicando que as taxas de evoluo foram semelhantes quelas de mamferos, evidenciando a adaptao de AIV nessas espcies de aves (Suarez, 2000). Informaes genticas entre AIV de humanos, sunos e aves foram demonstradas na HA do subtipo H1, aps a deteco de semelhanas empregando anticorpos monoclonais contra A/duck/Alberta/35/76 (Austin & Webster, 1986). Analisando a evoluo molecular dos vrus influenza, Marakova et al. (1998) produziram um dendograma com dois grupos distintos, no primeiro com relao linear entre o ano do isolamento e a distncia evolucionria, incluindo os vrus humanos, mas no linear no segundo grupo, composto predominantemente por AIV (de aves), concluindo que a recombinao gentica no atuou de forma considervel neste processo, os subtipos modernos de HA possivelmente formados antes da introduo de AIV na espcie humana. As relaes filogenticas entre amostras de AIV do subtipo H5 isoladas na Amrica do Norte foram avaliadas por anlise dos genes da HA e NS, indicando a manuteno de mltiplas divises e sublinhagens em aves aquticas migratrias, sendo que, das quatro seqncias de HA1 conhecidas, trs esto presentes em aves aquticas migratrias. A anlise filogentica do gene

NS em populaes de patos evidenciou a existncia de sublinhagens mltiplas e re-arranjo deste gene em dois alelos. Das sublinhagens, as mais instveis geneticamente foram aquelas isoladas dos surtos recentes no Mxico central (Garcia et al., 1997), presentes em plantis de galinhas durante 16 meses. As seqncias de aminocidos deduzidas de HA na regio associada com a adsoro ao receptor celular revelaram que isolados de aves aquticas, galinhas vivas de mercado popular e perus no possuam glicosilao no aminocido 236, embora essa ocorra em isolados de galinhas industriais (Garcia et al., 1997). O papel dos sunos como fonte de vrus para humanos e aves e vice-versa (Figura 9) tem sido relatado. O isolamento de AIV do subgrupo H4N6 de sunos com pneumonia de uma fazenda comercial, descrito no Canad, permitiu a demonstrao da infeco natural inter-espcie de aves para sunos. A anlise filogentica dos 8 segmentos do RNA demonstrou ser essa estirpe representante da linhagem norte americana de AIV (Karasin et al., 2000). Um isolado de AIV H1N1 em sunos foi descrito como capaz de cruzar a barreira especfica entre aves e sunos, indicando evoluo e mutao independentes do isolado aps a transmisso para sunos (Stech et al., 1999). Os genes da hemaglutinina de quatro isolados de AIV de sunos da Carolina do Norte, Texas, Minnesota e Iowa foram todos derivados do isolado humano H3N2 que circulou em 1995 (Zhou et al., 1999). A seqncia de nucleotdeos do gene da HA1 da estirpe A/turkey/Germany/2482/90, isolada de aves mantidas em fazenda de sunos, foi comparada com o gene da HA1 de estirpes isoladas dos surtos recentes de influenza em aves e sunos. As seqncias do gene da HA de uma estirpe H1 de perus proporcionaram evidncias adicionais de transmisso originria de sunos (Wood et al., 1997). A coinfeco de sunos com influenza vrus suno e avirio defectivo gerou recombinantes que apresentavam HA de origem aviria e que puderam ser replicados em sunos. Essas evidncias indicam que infeces mltiplas de influenza vrus contribuem para a gerao de variantes por recombinao (Kida et al., 1994). De fato, recombinaes genticas mltiplas

foram demonstradas entre AIV e influenza humanos em co-infeces em sunos, gerando novo gentipo de H1N2, a partir de co-infeco de H1N1 tipo humano e H3N2 tipo suno seguido de infeco por H1N1 tipo avirio (Brown et al., 1998). Os seqenciamentos parciais dos genes codificadores da neuraminidade e de componentes estruturais internos de AIV foram obtidos de um isolado 268/96 de um humano (mulher) com conjuntivite, apresentando homologia de 98,2% estirpe AIV H7N7 de perus isolada na Irlanda do Norte, em 1995. O relato descreve e caracteriza pela primeira vez a infeco de humanos por AIV diretamente de aves (Banks et al., 1998).

TRANSMISSOA transmisso de AIV da ave infectada para a ave susceptvel ocorre principalmente a partir de secrees respiratrias e digestrias, direta ou indiretamente, essa ltima especialmente por equipamentos contaminados com fezes (insetos, veculos de transporte, bebedouros, gua, comedouros, rao, gaiolas, pessoal por roupas, calados e botas etc). As aves de vida livre podem transmitir diretamente a infeco ao inadvertidamente compartilharem o ambiente de criao. Quatro categorias de fontes de transmisso para a avicultura industrial foram hierarquizadas (Alexander, 1982), em ordem de importncia, sendo: a 1 outras espcies de aves domsticas (por exemplo, patos para galinhas), a 2 aves de companhia exticas (no ainda descrito na literatura apesar do potencial terico), a 3 aves selvagens (fonte comum de transmisso para a avicultura industrial, por exemplo a partir de aves aquticas migratrias) e a 4 outras espcies animais (por exemplo, de sunos para perus). A transmisso de AIV H2 da Eursia para aves de praia da Amrica do Norte foi determinada. A HA da linhagem Eursica foi detectada em isolados americanos que, considerando a importncia da pandemia de 1957 pelo subtipo H2, refora a

necessidade de vigilncia epidemiolgica continuada (Marakova et al., 1999). A importncia da via fecal-oral de transmisso de aves migratrias para outras espcies foi demonstrada em estudo em que isolados de AIV, assim como do vrus da doena de Newcastle, foram obtidos de patos migratrios abatidos em Mississipi (EUA), sendo a neuraminidase (NA) de um AIV no reconhecida por nenhum dos soros de referncia, embora relacionada com a NA de A/duck/GDR/72 (patos - Alemanha), A/turkey/Ontario/7732/66 (perus - Canada), A/duck/Ukraine/1/60 (patos Ucrnia) e A/turkey/Wisconsin/68 (perus EUA). Um dos isolados A/duck/Memphis/546/74 produziu conjuntivite e descarga ocular em 1/5 dos patos inoculados experimentalmente e eliminao nas fezes por 10 dias (Webster et al., 1976). Aves aquticas, consideradas reservatrios de AIV e vrus da doena de Newcastle (NDV), tm sido amostradas para virologia. Aves aquticas selvagens de 14 espcies da frica do Sul (262 aves) que habitavam as proximidades de criatrio intensivo de avestruzes (Struthio camelus), onde ocorreram casos de influenza, foram avaliadas, sendo que oito continham a estirpe H10N9. Todas as estirpes foram apatognicas para galinhas com ndice de patogenicidade intravenoso 0,00 (Pfitzer et al., 2000). A circulao continuada de vrus de alta virulncia entre aves domsticas e humanos foi detectada em Hong Kong, relacionada com os isolados H5N1 de 1997 (A/HK/156//97), compartilhando H5 com idnticos stios de clivagem, indicando que pelo menos um dos genes das estirpes H5N1 de Hong Kong de 1997 continua a circular pela China continental (Cauthen et al., 2000). Entretanto, a transmisso de AIV de galinhas para uma criana parece ter ocorrido em um episdio sem o papel de espcie intermediria (por exemplo, sunos) como "recipiente de mistura" para recombinao (Claas et al., 1998). Ao contrrio, em estudos para a caracterizao de isolados de H5N2 da avicultura italiana, no foram encontradas evidncias de transmisso de ave para humanos (Donatelli et al., 2001).

A transmisso inter-espcies de AIV, tendo em vista os surtos de H5N1 em Hong Kong, foi abortada parcialmente, impedindo pandemia. A estratgia foi de erradicao por sacrifcio de aves nos mercados de aves vivas e outras aves na regio dos surtos, e chamou a ateno para aves como fonte de vrus para humanos (Shordridge et al., 2000). Portadores e Reservatrios Naturais A co-infeco de AIV de diferentes subgrupos em espcies de aves considerada importante estratgia de gerao de diversidade entre os gentipos de AIV. Surtos em perus tm sido descritos nos EUA, nos estados produtores de perus, mantidos em rotas de migrao de aves aquticas migratrias, especialmente da ordem Anseriformes. Os perus tm sido desafiados nas estaes de migrao por estirpes patognicas (Alexander, 2000). O papel dos patos na introduo de AIV com hemaglutinina (HA) H3 para sunos no sul da China foi considerado no surgimento da estirpe A/Hong Kong/68 (H3N2), em que a HA entre vrus isolado de pato domstico apresentou semelhana de 98,7 e 99,5%, respectivamente, para HA de suno e pato selvagem (Yasuda et al., 1991). A transmisso de HPAIV AIV (H7) de propriedades vizinhas com galinhas e patos para uma granja de matrizes de frangos de corte de 24 semanas de idade foi registrada na Austrlia. Aves acometidas no surto apresentaram edema subcutneo, congesto da cabea e palidez do msculo do peito. AIV foi detectado nas aves industriais em impresses pancreticas coradas por imunofluorescncia e as aves das propriedades vizinhas apresentaram ttulos de anticorpos para H7 (Selleck et al., 1997). Embora algumas espcies exticas possam representar risco de transmisso de doenas para a avicultura industrial, uma estirpe de AIV H10N7 isolada de emu (Dromaius novaehollandiae) que apresentava sinais clnicos respiratrios e conjuntivite, foi caracterizada como no patognica para galinhas (Woolcock et al., 2000).

Diferenas de adaptao de diferentes AIV para diferentes espcies de aves foi descrita. Sharp et al. (1997) propem que os subtipos de AIV so diferentemente adaptados aos hospedeiros, nos quais a infeco natural no ocorre ao acaso. Os subtipos de AIV mais raros s aves poderiam ser adaptados por co-infeco com AIV mais comuns. De acordo com esses autores, os subgrupos de AIV predominantes nas espcies so relativamente espcie-especficos, enquanto os AIV de outros subgrupos presentes em eventos de co-infeco no o so (Sharp et al., 1997). Soros de falces das pradarias (Falco mexicanus) foram negativos para anticorpos contra AIV, assim como negativos para o vrus da doena de Newcastle (Morishita et al., 1998). Aves aquticas selvagens foram consideradas reservatrios de AIV e vrus da doena de Newcastle (NDV). Amostras para virologia de 14 espcies aquticas selvagens da frica do Sul, que habitavam as proximidades de criatrio intensivo de avestruzes (Struthio camelus) onde ocorreram casos de influenza, foram examinadas para AIV. Das 262 aves avaliadas, oito amostras continham a estirpe H10N9 e todas as estirpes foram apatognicas para galinhas (ndice de patogenicidade intravenoso 0,00). Em contraste, os soros de 33 aves continham anticorpos contra AIV H10 e apenas uma ave com anticorpos para H6, esse ltimo sendo isolado de avestruzes durante um surto de influenza na rea. As aves aquticas foram tambm avaliadas para o NDV, no sendo nenhuma estirpe isolada, embora anticorpos tenham sido detectados em 34 de 46 soros examinados (Pfitzer et al., 2000).

PERODO DE INCUBAOO perodo de incubao de AIV para o aparecimento dos sinais clnicos em aves varivel com a espcie de ave, estirpe de vrus, dose de desafio e via de aplicao ou exposio, variando entre poucas horas e 3 dias (Easterday et al., 1997).

SINAIS CLNICOS

A infeco por AIV em aves resulta em quadro clnico muito varivel, dependendo da espcie, idade e sexo da ave, estirpe e dose de vrus e infeces oportunistas ou concomitantes. Os sinais clnicos so conseqncias de alteraes geralmente dos sistemas respiratrio, digestrio, nervoso e reprodutivo, com decrscimo do consumo de alimento e produtividade (ganho de peso e produo de ovos), emagrecimento, quadro respiratrio de leve a grave, com lacrimejamento, edema da face e cabea, cianose, alteraes nervosas e diarria (Easterday & Hinshaw, 1991; Easterday et al., 1997). A doena pode ser superaguda e resultar em mortes fulminantes sem quadro clnico prvio. As diferenas de susceptibilidade entre as espcies de aves ocasionam ampla variao nas conseqncias clnicas da infeco, em que uma estirpe patognica para uma espcie e no para outra. Os perus parecem ser muito sensveis a estirpes que ocorrem de forma assintomtica em patos (Murphy, 1987).

LESESA caracterizao da patogenicidade dos AIV foi por algum tempo relacionada com a presena de HA do subtipo H7 e no permitia a elucidao dos episdios de doena em que estirpes no virulentas do mesmo subtipo eram isoladas de aves normais. A terminologia de peste aviria (fowl plague), associada a H7, foi sendo abandonada e em substituio adotaram-se critrios de classificao dos AIV de alta virulncia (HPAIV), conforme as seguintes recomendaes: 1 - Qualquer vrus de influenza letal a 6, 7 ou 8 de 8 galinhas com 4-6 semanas de idade em um perodo 10 dias, inoculadas via intravenosa com 0,2 ml de lquido alantide a 1:10 sem bactrias; 2 - Qualquer vrus da influenza dos subtipos H5 e H7 que no atinja o critrio acima, mas apresente seqncia de aminocidos no stio de clivagem da HA compatvel com as estirpes de alta virulncia (mltiplos aminocidos bsicos);

3 - Qualquer vrus da influenza no integrante dos subtipos H5 e H7, que cause a morte de 1 a 5 das galinhas de 4 a 6 semanas de idade via intravenosa (item 1), em 10 dias e seja replicado em monocamadas celulares na ausncia de tripsina (Proceedings, 1994). As leses resultantes de infeco por AIV (Easterday et al., 1997; Easterday & Hinshaw, 1991) so amplamente variveis, dependendo da estirpe de AIV, quanto patogenicidade, espcie de ave, dose de infeco, status imune do hospedeiro e infeco(es) concomitante(s). Em infeces por HPAIV, a morte pode ocorrer antes que leses proeminentes sejam observveis. Em termos gerais nenhuma leso considerada caracterstica de influenza. As leses do sistema respiratrio, por exemplo, nos seios paranasais (secreo fibrinosa, mucopurulenta ou catarral), traquia (edema e secreo de intensidade varivel na mucosa), sacos areos espessados e com exsudato seroso, fibrinoso ou fibrinopurulento. Peritonite por ovo ectpico e por contigidade dos sacos areos pode ser observada. Poedeiras podem tambm sofrer salpingite com acumulao de exsudatos no oviduto. Enterite hemorrgica, fibrinosa (graves) ou catarral (leve) pode ser observada e mais comum em perus (intestino delgado e cecos). Estirpes de subtipos de AIV que causam doena sistmica apresentam HA clivada (ativao que permite a penetrao na clula) por todas as proteases presentes em quaisquer clulas do hospedeiro sensvel, enquanto AIV no patognicos ou de baixa patogenicidade tm clivagem, e ativao da HA, somente nos intestinos das aves. Os mamferos podem ativar a HA com enzimas principalmente do sistema respiratrio, onde causam maior patogenia, embora as complicaes sistmicas possam envolver produtos de outros genes, como NA (Zambon, 1999). A presena de mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA (Tabela 2) considerada fentipo caracterstico de estirpes de alta patogenicidade para galinhas (Suarez et al., 1998).

Uma estipe de AIV A/mandarin duck/Singapore/805/F-72/7/93 (H10) de alta patogenicidade (HPAIV) para galinhas e isolado de patos, embora de subtipo no comumente associado s estirpes de HPAIV (H5 e H7), no apresentou seqncia de mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA e no foi replicado no encfalo de galinhas inoculadas via intravenosa. Os autores concluram que a patogenicidade estaria associada replicao renal (Wood et al., 1996). As estirpes de HPAIV esto relacionadas na lista A de doenas do Office International des Epizooties (OIE), so altamente contagiosas e produzem doena em mltiplos sistemas das aves, levando alta mortalidade algumas estirpes integrantes dos subtipos H5 e H7. A maior parte dos AIV isolados so, entretanto, de baixa patogenicidade e resultam em infeco subclnica ou respiratria e/ou reprodutiva em grande variedade de espcies de aves domsticas e selvagens e no constam da lista da OIE. Desde 1955, 18 surtos foram documentados de HPAIV. No so consideradas as aves aquticas selvagens como reservatrio de HPAIV, embora sejam portadoras de AIV de baixa patogenicidade, que periodicamente cruzam as barreiras especficas de hospedeiros, ocasionando doena leve em aves domsticas. AIV suaves podem evoluir para HPAIV por mutaes ou recombinao da HA. As estirpes de HPAIV de surtos em aves domsticas so comumente isoladas de aves selvagens durante o surto. Mtodos de controle que contam com a ocorrncia de infeco baixa nos plantis no so, por isto, aceitveis por gerao de oportunidade de mutao e recombinao (Swayne & Suarez, 2000). AIV de baixa patogenicidade A/emu/TX/39924/93 (H5N2) isolado de ratitas foi submetido a cultivos que selecionaram mutante de HPAIV. O mutante apresentou alteraes na HA com a adio de 6 nucleotdeos na posio 970-975 codificadora da HA1, resultando na insero de arginina e lisina prxima do stio de clivagem (glicoprotena da fuso). O restante da seqncia da HA diferiu apenas em 7 aminocidos e o stio de clivagem foi imediatamente clivado durante a replicao. A estirpe causou leses compatveis com estirpes de HPAIV em galinhas. Uma PCR dirigida para a deteco do stio de mutao (6

nucleotdeos) detectou apenas a estirpe mutante e no a original, podendo significar que a mutao foi rpida ou no detectada no vrus precursor (Perdue et al., 1996). A virulncia dos AIV foi associada duplicao da seqncia de clivagem da HA. Estirpes de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) isoladas dos surtos de 1994-1995 no Mxico tinham a insero de dois aminocidos bsicos (arginina e lisina) no stio de clivagem da H. Uma das estirpes (A/Ck/Queretaro/7653-20/95) tinha informao gentica adicional para quatro aminocidos (arg-lysarg-lys) no mesmo stio e a anlise da seqncia do gene de HA sugere que ela derivou de estirpe no patognica isolada um ms antes. A insero dos quatro aminocidos produto da duplicao direta de parte da regio rica em purina que precede o cdon da arginina no gene do stio de clivagem (Perdue et al., 1997). Uma estirpe de H5N2 altamente disseminada no Mxico e associada apenas a quadros clnicos e leses leves foi associada evoluo de estirpe de HPAIV para a avicultura industrial dos Estados Unidos. O seqenciamento do segmento do gene codificador da regio de clivagem da HA das estirpes detectou apenas seqncias caractersticas de estirpes no patognicas na estirpe original e seqncias de estirpes de alta virulncia na estirpe variante, a estirpe HPAIV com clivabilidade em cultivos de fibroblastos sem tripsina (Horimoto et al., 1995). Os linfc