Microbiologia1. Mtodos baseados na contagem do nmero de clulasCada clula comporta-se como uma partcula slida, individualizada ou em grupo, suspensa no seu meio de cultura pelo que se deve falar em suspenso de clulas e nunca em soluo de clulas. Clula vivel: clula com capacidade para se reproduzir. Clula no vivel: clula que perdeu a potencialidade de se reproduzir.Ex: Biocatalisador.O conjunto de mtodos a que se pode recorrer para quantificar uma populao microbiana no : Universal; Estritamente rigoroso.No entanto, todos eles so mtodos aproximados. Estes mtodos fornecem uma ordem de grandeza do nmero de clulas por unidade de volume de cultura.O conjunto dos mtodos de avaliao mais frequentemente utilizados baseia-se na quantificao do nmero de clulas. Destes, a contagem dos microorganismos pode ser: Direta contagem de clulas totais fornecem uma resposta imediata: Cmaras de contagem; Mtodo de Breed; Contador de Coulter. Indireta clulas viveies. fornecem uma resposta desactualizada j que se refere ao incio do perodo de incubao que estes mtodos obrigatoriamente incluem: Mtodo das placas; Mtodo das diluies sucessivas.

1.1. Cmaras de contagem

A sua contagem direta feita com o auxlio do microscpio. A utilizao das cmaras de contagem fundamenta-se no preenchimento de um espao de capacidade conhecida, com um lquido em que se encontram suspensas as partculas a contar. Derivam dos hemocitmetros, inicialmente conhecidos para contagem de clulas do sangue. Desvantagens: Utilizao deste mtodo para bactrias (devido ao seu pequeno tamanho); Estreita profundidade de campo do microscpio quando usado com ampliaes elevadas (1000x); No uma tcnica adequada para quantificar microorganismos que no sejam constitudos por clulas discretas, tal como fungos filamentosos; Dvidas na contagem, no que se refere a aglomerados de clulas, a clulas em planos de focagem diferentes, a artefactos visuais ou impurezas que, por engano, sejam tomados como clulas e a clulas gemuladas. Apesar desta tcnica ser normalmente usada para avaliao de clulas totais, ela pode tambm servir para distinguir entre clulas vivas e clulas mortas, sendo para tal necessrio usar certos corantes, como o azul de metileno, que apenas cora as clulas mortas, j que as clulas viveis o degradam na sua cadeia metablica.

1.2. Mtodo de Breed

usado em rotina nas indstrias de lacticnios para fazer a anlise bacteriolgica de leites crus, isto , leites que vm directamente da vacaria sem qualquer tratamento trmico. Consiste numa contagem total feita num esfregao de rea e volume conhecidos, depois de convenientemente corado. A fixao e a colorao de clulas to pequenas como as das bactrias facilitam muito a sua contagem, quando comparado com o mtodo da cmara de contagem. Adopta-se o critrio de contar como uma s clula cada cadeia ou aglomerado de organismos clump counting

1.3. Coulter Counter

um aparelho que no s conta clulas como tambm determina o seu tamanho, resultando a anlise numa distribuio de tamanhos celulares. Devido ao entupimento do tubo, por exemplo no caso de aglomerados de clulas, e ao erro devido ao rudo de fundo, no caso de microorganismos muito pequenos, os tubos com uma abertura d s devem ser usados para medirem clulas entre 0,02d e 0,50d (no mximo).

1.4. Mtodo das Placas

No mtodo de contagem em placas plating out , um volume conhecido de uma dada diluio da suspenso inicial de clulas inoculado assepticamente num meio de cultura slido, adequado ao microrganismo em causa, em placa de Petri. Cada clula vivel vai dar origem a uma colnia, macroscopicamente visvel a olho nu, e contanto o nmero de colnias na placa fica a saber-se o nmero de clulas viveis naquele volume de suspenso diluda inoculado. O nmero mximo de colnias que podem aparecer na placa de Petri est compreendido entre 30 e 300. Este ensaio geralmente feito em triplicado para depois se obter um valor mdio para o nmero de colnias. Para aumentar a segurana da anlise, de modo a evitar a necessidade de repetir ensaios, faz-se no s a inoculao da diluio que se previu ser a adequada, mas tambm a inoculao da diluio imediatamente anterior quela, naturalmente uma em cada triplicao. Desvantagens: Desfasamento no tempo com que se obtm a informao e com o facto de o nmero dessas clulas ser sempre maior do que o nmero de colnias contadas nas placas devido sobreposio e aos aglomerados de clulas que do origem a uma nica colnia. Assim, o erro desta determinao ser sempre um erro por defeito, isto , a fraco de clulas viveis calculada ser um minorante da fraco real. Esta tcnica muito mais til para bactrias e leveduras do que para bolores.

1.5. Mtodo das diluies sucessivas diluio extino

mais correntemente referido como determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) de clulas viveis. possvel tratar estatisticamente os resultados e para tal podem ser usadas tabelas como as de McCrady. Este mtodo frequentemente utilizado na anlise bacteriolgica das guas para a determinao de bactrias coliformes, que constituem o indicador mais seguro de poluio fecal e que incluem todos os bastonetes gram negativos aerbios e facultativos anaerbios que no formam esporos e fermentam lactose com produo de cido e gs. Esta ltima caracterstica dos coliformes permite detetar visualmente e depois da incubao, em pequenos tubos invertidos no meio de cultura, se o ensaio positivo (presena de gs naqueles tubos) ou negativo (ausncia de gs).

2. Mtodos baseados na medio da massa celular

Um outro conjunto de mtodos de avaliao quantitativa de populaes microbianas baseia-se no clculo do nmero de organismos presentes pela medida da sua massa celular, uma vez fixadas as condies de observao e conhecida a funo (curva de calibrao) que relaciona essas duas variveis (nmero e massa celular).A avaliao da biomassa microbiana pode ser feita: Diretamente: Peso seco celular, com base na gravimetria; Densidade tica, com base na turbidimetria. Estimada por via indirecta: Reduo de indicadores de oxidao-reduo; Consumo de nutrientes ou formao de produtos; Quantificao de componentes celulares; Medio do ATP.

2.1. Peso seco celular

As amostras, de volume conhecido, do caldo de cultura so recolhidas, centrifugadas, lavadas com tampo ou com gua e depois secas a 80C durante 24 horas ou a 110C durante 8 horas. Se estiverem presentes slidos no celulares como carbonato de clcio, melaos, celulose, corn steep liquor ou soy bean meal, eles no so removidos na lavagem e, como consequncia, contribuem para o peso seco final. Quando o carbonato de clcio o nico material insolvel, possvel usar uma lavagem cida para dissolver o sal e remov-lo das clulas antes da secagem. Quando o meio de cultura contm alguns slidos no celulares, desde que a massa das clulas seja muito maior do que a passa das impurezas, o mtodo do peso seco celular ainda til, embora no seja preciso. difcil fazer pesagens com preciso inferior a 1mg.

2.2. Turbidimetria

Quando um feixe de luz atravessa uma matria no homognea, como uma suspenso de partculas significativamente maiores do que as molculas do meio em que se encontram, sofre uma alterao, mais ou menos intensa, dependente da concentrao, do tamanho e da forma das partculas, da opacidade, cor e ndice de refrao relativo das partculas e do meio e ainda do comprimento de onda da luz incidente. Se for I0 e I, respectivamente, as intensidades da luz incidente e da atenuada pela passagem atravs da suspenso, poder-se- escrever:Densidade tica/ Absorvncia

log10 (I0 / I) = kCConcentrao das partculas em suspenso.Constante de proporcionalidade que resulta da espessura do meio atravessado pela luz e de uma constante turbidimdrica.

Em alternativa frequentemente utilizada a varivel transmitncia (T) relacionada com absorvncia (A) por:

A = - log10 (T(%) / 100)

A sensibilidade e preciso dos mtodos turbidimtricos variam largamente com os tipos de aparelho e as condies de operao. A turbidez de uma suspenso de clulas normalmente medida cm luz de comprimento de onda entre os 600 e 700 nm quando se usa um espectrofotmetro ou com luz atravs de um filtro vermelho quando se usa um calormetro. Quando se usa a turbidimetria como medida da massa celular, importante estar certo que os produtos da fermentao ou os componentes do meio no absorvem luz no comprimento de onda usado. Esta tcnica no adequada se existirem no meio de cultura quantidades substanciais de slidos no celulares. Quando usada para estimar a biomassa de organismos micelares, por vezes necessrio homogeneizar previamente a amostra num misturador.

2.3. Reduo de indicadores de oxidao-reduo

Usado correntemente em provas colorimtricas de qualificao dos leites. Parte-se da hiptese de que todas as clulas viveis presentes reduzem igualmente os corantes e tm o mesmo tempo de duplicao. A quantificao pode ser feita em funo do grau de reduo do corante em determinado tempo, como acontece na prova de resauzurina, ou pelo tempo necessrio reduo, como na prova do azul de metileno (azul na forma oxidada e incolor na forma reduzida).

2.4. Consumo de nutrientes ou formao de produtos

A interpretao de mtodos indirectos para a medio da massa celular facilitada tendo em conta a estequiometria global do crescimento e da formao de produtos metablicos, que pode ser escrita de uma forma geral por: Fonte de C + Fonte de N + Fosfato + O2 Massa celular + CO2 + H2O + Produto + Calor

2.5. Quantificao de componentes celulares

Quantificao de um componente celular macromolecular como protena, RNA ou DNA. Desvantagens: A proporo destes materiais na clula no constante no tempo, variando com a fase de crescimento, pelo que, no mnimo, preciso cuidado na interpretao dos resultados. Na verdade, s durante a fase exponencial de crescimento que a composio se mantm constante. Outro inconveniente em usar mtodos de doseamento de protena (como o mtodo de Folin ou o da reaco birueto) para acompanhar o crescimento celular, est no facto de os meios de cultura serem muitas vezes ricos em protenas e seus hidrolisados, o que atenua a variao relativa de protena derivada do crescimento, tornando difcil a sua deteco por aqueles mtodos.

2.6. Medio do ATP

A adenosina trifosfato (ATP) um intermedirio comum de energia qumica usado para crescimento e biossntese nos organismos vivos. A anlise do ATP pode ser para qualitativamente detetar clulas vivas e quantitativamente medir a quantidade de massa celular presente.~ O mtodo detetado para detetar ATP baseado na reaco catalisada pela luciferase, na qual a luciferina oxidada custa do oxignio e do ATP, estando envolvido um foto de luz. A luciferase uma enzima que se extrai do pirilampo e das bactrias fosforescentes junto s plpebras dos peixes de profundidade. Neste caso a intensidade do brilho proporcional quantidade de ATP e de microrganismos. Os mtodos de deteco de luz, como por exemplo os fotmetros ou contadores de cintilaes, so muito sensveis e podem detetar abaixo de 10-12g de ATP por litro.

3. Crescimento microbiano

Crescimento: multiplicao do nmero de indivduos.A velocidade com que os microorganismos se multiplicam (reproduzem) depende de: Fatores intrnsecos ao prprio organismo, que tem a ver com a complexidade destes variando numa relao inversa; Fatores externos ao organismo, como a composio do meio de cultura, ou as condies ambientais em que o organismo incubado. Por esta razo no tem significado dizer que a taxa de crescimento de um dado organismo tem um determinado valor, a no ser que sejam devidamente explicitadas todas as caractersticas relevantes do meio de cultura, assim como os parmetros ambientais em que a cultura realizada.Quando se fala em taxa de crescimento, refere-se, normalmente, cultura em meio lquido pois a a velocidade de transporte de nutrientes e de oxignio em direco s paredes celulares muito maior do que em meio slido. A velocidade de crescimento neste meio de cultura significativamente superior que ocorre em meio slido.Incubao: perodo de crescimento celular que comea com a inoculao do meio de cultura e que termina quando a velocidade de crescimento se aproxima de zero. Isto acontece quer por: Exausto dos nutrientes devido ao aumento da densidade populacional (em culturas descontnuas); Alteraes ambientais induzidas por metabolitos sintetizados pelos prprios microrganismos e que sejam inibidores do seu prprio crescimento (produtos txicos, antibiticos, variaes de pH, etc).O crescimento microbiano um processo dinmico, cuja velocidade global um balano entre nascimento e morte de clulas e, quando essa velocidade se aproxima de zero, isso significa que a taxa de morte tende para a taxa de reproduo.A incubao em meio slido realizada numa estufa, designada por incubadora.A incubao em meio lquido pode ser feita simplesmente num balo de Erlenmeyer com rolha de algodo, colocado numa incubadora orbital com controlo de temperatura, ou, mas sofisticadamente, num fermentador, que para alm do controlo da temperatura, permite tambm controlar o pH (com adio de cido ou base), controlar as espumas (com a adio de um anti-espumas qumico, por exemplo, silicone) e permite ainda uma agitao mecnica (mais eficiente do que a agitao orbital) e um arejamento por borbulhamento (tambm mais eficiente do que a simples difuso do ar atravs da rolha de algodo).O crescimento microbiano pode tambm ser definido como o aumento ordenado e proporcional de todos os componentes qumicos e celulares. Este ocorre depois da cultura estar completamente adaptada a um meio que lhe adequado e antes de sofrer fenmenos de exausto dos nutrientes ou alteraes desfavorveis das condies ambientais. Durante esse perodo, a duplicao de biomassa acompanhada pela duplicao de todas as outras propriedades mensurveis da populao (por exemplo: protenas RNA, DNA e gua intracelular), o que significa que a composio qumica da cultura permanece constante. Uma cultura nesta fase de crescimento cineticamente anloga a uma reaco qumica auto-cataltica de primeira ordem, isto , a velocidade de multiplicao das clulas num dado instante de tempo proporcional ao nmero ou massa das clulas presentes nesse instante. , taxa especfica de crescimento ou ou Quantidade de qualquer componente celular/mLMassa de clulas/mLN de clulas/mL

Integrando qualquer uma testas equaes, temos:ln X ln X0 = (t t0) ln (X / X0) = (t t0) X / X0 = exp [ (t t0) X = X0 exp [ (t t0)]Quando a densidade populacional X duplicar (isto , X = 2X0), o tempo de cultura correspondente (t t0 = tD) designa-se por tempo de duplicao e vem dado por:ln 2 = tD tD = ln 2 / O perodo do crescimento celular, traduzido pelas equaes anteriores que prevem uma relao exponencial entre a concentrao de biomassa (ou equivalente) e o tempo, designa-se por fase exponencial do crescimento. Fase de adaptao: ser curta se o inculo estiver em crescimento exponencial e se no houver choques trmicos. Fase exponencial: altura em que o crescimento efectivo parou. A fase exponencial nunca longa e a transio entre a fase exponencial e a fase estacionria envolve um perodo de crescimento celular no equilibrado ( varia desde um valor mximo na fase exponencial at zero). Fase estacionria: as clulas na fase estacionria tm uma composio qumica diferente da das clulas na fase exponencial. H mesmo alguns metabolitos, designados por secundrios que s so sintetizados na proximidade e durante a fase estacionria (por exemplo, antibiticos, alcalides, hormonas), em posio aos metabolitos primrios que so produzidos durante a fase de crescimento exponencial. Fase de morte: o nmero de clulas viveis diminui, tambm exponencialmente, no tempo.

Curva de crescimento de uma cultura microbiana

O mtodo a que mais vulgarmente se recorre para acompanhar o crescimento de microrganismos unicelulares o mtodo ptico, baseado na determinao da quantidade de luz dispersa por uma suspenso de clulas. Os aparelhos normalmente utilizados so o: Espectrofotmetro: mede a intensidade da luz que atravessa a amostra segundo a direco da radiao incidente; Nefelmetro: mede a luz dispersa segundo um ngulo de 90 relativamente direco da luz incidente (e em relao intensidade desta radiao que feita a comparao em ambos os casos).

4. Catlise enzimtica na ausncia e na presena de inibidoresAs enzimas so biomolculas que em termos: Estruturais: pertencem ao grupo das protenas; Funcionais: constituem catalisadores das reaces biolgicas. Estes biocatalisadores aumentam a velocidade das reaces bioqumicas devido ao abaixamento da energia de activao, de tal modo que a variao da energia livre padro da reaco respeitado.

As enzimas possuem caractersticas prprias: Tm uma elevada especificidade relativamente aos reagentes que transformam, designados agora substratos. Sofrem saturao com o(s) substrato(s), quando a concentrao deste(s) elevada; Necessitam, em geral, da presena de co-factores (substncias de natureza no proteica), de tal modo que o conjunto do co-factor com o apoenzima (parte proteica do catalisador) que constitui a haloenzima ou enzima biologicamente activo. Os co-factores dividem-se em dois grupos principais: Ies metlicos; Co-enzimas: molculas orgnicas que constituem substratos particulares, em geral transportadores de determinados radicais, e que so caracterizveis por se encontrarem transformados aps a aco sobre elas exercidas por uma enzima. So exemplos de co-enzimas: NAD (NADH quando reduzido); NADP (NADPH quando reduzido); FAD; CoA (co-enzima A). Sofrem desactivao mais facilmente que os catalisadores qumicos, quer por simples armazenamento, quer devido s condies operatrias. A actividade cataltica das enzimas est dependente das foras intramoleculares que so fracas e facilmente anulveis, ocorrendo ento a desnaturao da protena que pode resultar da ao de diversos agentes como por exemplo: Calor; cidos; lcalis; Solues salinas concentradas; Solventes orgnicos; Detergentes; Radiaes.A velocidade enzimtica a actividade cataltica de uma enzima por unidade de tempo, ou seja, a quantidade (concentrao) de produto formado na unidade de tempo.A actividade cintica global das enzimas est relacionada linearmente com a concentrao de enzima [E] e hiperbolicamente com a concentrao de substrato [S]. Verifica-se ainda o seguinte: A velocidade de reaco enzimtica diminui no tempo, devido ao facto dos produtos da reaco inibirem a enzima devido lei de aco das massas, ou ao facto de a enzima sofrer um processo de inactivao como consequncia das condies operatrias (temperatura, ph). Se a concentrao de substrato elevada, a velocidade da reaco independente dela e a reaco de ordem zero. Se a concentrao de substrato baixa, a velocidade da reaco proporcional a essa concentrao e a reaco de primeira ordem. Qualquer que seja a concentrao de substrato, a velocidade da reaco proporcional concentrao inicial de enzima [E0].

Michaelis e Menten propuseram um modelo para a cintica de uma reaco enzimtica com um substrato, um produto e um complexo intermedirio (ou complexo de transio):K+1K+2

E +S ES E + PK+2

Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um complexo enzima-substrato (ES). Este pode separar-se novamente en enzima e substrato livre ou transformar o substrato em produto (P). O primeiro passo uma reaco reversvel que leva formao muito rpida do composto intermedirio (ES), e o segundo passo uma reaco reversvel que leva formao muito rpida do composto intermedirio, e o segundo passo uma reaco essencialmente irreversvel e que limitante para a velocidade global da reaco.A decomposio do complexo ES em P e E nem sempre to simples e directa, envolvendo, por vezes, mltiplos passos em srie cujas constantes so geralmente condensadas num nico parmetro kcatque, na situao mais simples, justamente a constante k2, (oturnover number nmero de molculas de substrato que por unidade de tempo so convertidas em produto no stio activo quando o enzima est completamente saturado de substrato)Este modelo tem inmeras aplicaes prticas, como: Descrever a catlise enzimtica de isomerases; Biotransformaes importaes importantes na indstria de esterides (ou na indstria farmacutica em geral); Quando o segundo substrato est em excesso relativamente ao primeiro.

precisamente no instante inicial da reaco que as condies experimentais so conhecidas com exactido (sem terem ainda sofrido alteraes), sendo perfeitamente admissvel tomar a concentrao do(s) produto(s) aproximadamente nula.

As duas hipteses restritivas apresentadas a seguir podem ser usadas em alternativa. Uma delas considera que o primeiro passo da reaco traduzida pelo modelo de Michaelis-Menten um qumico, sendo a constante de equilbrio (Keq) definida por:Keq = Sendo Ks a constante de dissociao do complexo intermedirio ES e designada por constante de substrato. Na verdade, a concentrao do composto intermedirio ES pequena mas no desprezvel.A estratgia global para obter a expresso da velocidade de uma reaco enzimtica : Estabelecer o modelo da reaco enzimtica; no caso em estudo seja o modelo de Michaelis Menten. Exprimir a velocidade da reaco em termos do passo limitante; neste caso v = k+2 [ES]. Escrever o balano referente conservao da enzima total, independentemente da forma em que ele esteja (livre ou ligada); neste caso fica [E0] = [E] + [ES]. Estabelecer as hipteses restritivas; para alm do uso de velocidades iniciais pode usar-se a hiptese de equilbrio ou a hiptese de estado estacionrio. Escrever a equao para a velocidade mxima da reaco; neste caso seria quando a enzima interveniente na reaco estivesse sob a forma de complexo de transio, isto , vmx = k+2 [E0].A deduo da equao da velocidade para o modelo de Michaelis-Menten de acordo com: A hiptese de equilbrio :

Em que :

OndeKs igual ao inverso da constante de equilbrio para o primeiro passo da reaco; Ks = k-1/k+1 = 1/Keq. Os dois parmetros cinticos para descrever uma reaco traduzida por aquele modelo, de acordo com a hiptese de equilbrio, so pois Vmax e Ks. A hiptese de estado estacionrio :

Esta hiptese foi feita por Briggs e Haldane; no entanto, a constante KM = (k-1 + k+2)/k+1 conhecida por constante de Michaelis-Menten. Km e Vmax so agora os parmetros cinticos que descrevem o mesmo modelo mas de acordo com a hiptese de estado estacionrio para o complexo intermedirio.A hiptese de equilbrio (devido a Michaelis e Menten) mais restritiva do que a hiptese de estado estacionrio (devida a Briggs e Haldane). A hiptese de estado estacionrio implica que k-1 + k+2 >> k+1, para que a concentrao do complexo intermedirio ES seja pequena; a hiptese de equilbrio para alm de k-1 + k+2 >> k+1, tambm k-1 >> k+2. Quando [S] = Km, quer dizer que metade da enzimaest no estado livre e outra metade est na forma combinada. Logo v = Vmax. Quando [S] > Km a maior parte da enzima est na forma combinada com o substrato. Quando [S] < Km a maior parte da enzima est na forma livre.Km representa o inverso da afinidade da enzima para com o substrato, indicando a eficincia com que a enzima converte o substrato: Valor pequeno de Km significa que, para igual concentrao do substrato, a enzima catalisa a transformao do substrato a uma maior velocidade do que quando o valor de Km elevado.

Quando no modelo apresentado, k-1 >> k+2, isto , quando vlida a hiptese de equilbrio, ento Km coincide com Ks.Km no um valor constante para uma dada enzima, sendo independente da concentrao inicial de enzima [E0], varia no entanto com a estrutura do substrato, com o pH e com a temperatura. Assim, se uma enzima tiver vrios substratos, a cada um deles corresponde um valor de Km.O valor de Vmax (Vmax = k+2 [E0]) para uma dada enzima depende da concentrao inicial deste, para de depender tambm da estrutura do substrato, do pH e da temperatura.A equao de cintica do modelo de Michaelis-Menten, que traduz a variao da velocidade de reaco enzimtica com a concentrao do substrato, representada graficamente por uma hiprbole que tende assimptoticamente para as retas V = Vmax e [S] = - Km.A equao de Michaelis-menten pode ser transformada de modo a convert-la numa equao linear. A linearizao mais comum a devida a Lineweaver e Burk:

Nesta representao, os pontos correspondentes a elevados valores de [S] podem vir influenciados pela inibio do substrato, e os pontos correspondentes a baixos valores de [S] vm com certeza afectados de maiores erros relativos na determinao das respectivas velocidades. Por estas razes, o clculo dos parmetros cinticos por regresso linear no necessariamente mais rigoroso do que a sua determinao a partir da melhor recta traada mo.A velocidade das reaces enzimticas muitas vezes afetada pela presena de agentes qumicos que: Activam (activadores) a actividade enzimtica: Inibem (inibidores) a actividade enzimtica: so compostos que se combinam com as enzimas e que bloqueiam de um modo reversvel ou irreversvel a sua actividade cataltica. Podem ser: Produtos da reaco; Substratos; Outros compostos: drogas, antibiticos, venenos, etc.A inibio irreversvel ocorre quando certos compostos se ligam covalentemente ao stio activo da enzima, bloqueando um aminocido responsvel pela catlise. Assim, na presena destes inibidores a velocidade da reaco tende rapidamente para zero.E + S ES E + P + I EIMais importante, do ponto de vista cintico, do que a inibio total a inibio parcial, que acontece quando o inibidor e liga reversivelmente enzima:E + I EIOnde KI a constante de dissociao do complexo enzima-inibidor. Neste caso, a velocidade da reaco enzimtica reduzida, mas no anulada, mesmo para concentraes elevadas de inibidor.Inibies na ausncia de substncias estranhas reaco podem ocorrer com o substrato ou com o produto da prpria reaco bioqumica: Inibio por substrato acontece quando, para elevadas concentraes do substrato, este atua como inibidor, fazendo associar uma segunda molcula de substrato ao complexo intermedirio ES, provocando a formao de uma espcie de (ESS) cataliticamente inactiva, isto , que no da origem ao produto da reaco Inibio por produto fcil de compreender porque sendo este o substrato da reaco inversa, a sua presena diminui a velocidade da reaco direta. Para evitar este tipo de inibio, os estudos cinticos devem ser feitos com velocidades iniciais.Existem vrios tipos de inibio: Competitiva: quando o inibidor uma substncia estranha reaco bioqumica, pode acontecer que ele se ligue ao mesmo stio activo da enzima a que se liga o substrato, competindo directamente com este para ocupar o mesmo centro cataltico na protena enzimtica. No-competitiva: quando o inibidor se liga a um stio activo diferente do stio activo a que se liga o substrato, mas que por impedimentos estreos seja dificultado o acesso do substrato ao seu prprio stio activo na molcula da enzima, ou seja, o substrato e inibidor no competem entre si pelo mesmo stio activo na enzima. Incompetitiva: quando o inibidor se liga apenas ao complexo intermedirio, dando origem a um composto que no se converte em produto.

4.1. Inibio competitivaO inibidor provoca um consumo adicional de enzima, deslocando o equilbrio da reaco enzimtica para a esquerda e aumentando a constante de dissociao do complexo intermedirio ES.

No estado quasi-estacionrio pode deduzir-se que a velocidade da reaco dada por:

Onde:

Linearizando a equao, obtm-se:

Km inclui dois parmetros: Km, j obtido na ausncia de inibidor, e KI que a constante de dissociao do complexo enzima-inibidor.A aco dos inibidores competitivos eliminada para concentraes elevadas no substrato, no afectando o valor de Vmax. No entanto, a afinidade da enzima para com o substrato reduzida (Km > Km).Na representao de Lineweaver-Burk, ao aumentar a concentrao do inibidor competitivo aumenta o declive mas a ordenada na origem permanece inalterada.4.2. Inibio no competitivaOs inibidores no-competitivos ligam-se enzima num local diferente do stio activo a que se liga o substrato. Assim, a afinidade da enzima para com o substrato no alterada mas o valor de Vmax vai ser reduzido, seja por modificao da configurao cataltica da enzima, seja por impedimentos da configurao cataltica da enzima, seja por impedimentos estreos que dificultam o acesso do substrato ao centro cataltico da enzima, O certo que o cimplexo EIS estril, isto , no d origem a qualquer produto. Assim, a ligao do substrato enzima faz-se de um modo equivalente quer este esteja na forma livre ou ligado j ao inibidor. Isto significa que as constante de dissociao dos complexos ES e EIS (EIS EI + S) so idnticas,

Supondo que I tem idntica afinidade para E e para ES (mas podem essas afinidades ser diferentes):

Onde:

Linearizando a equao, obtm-se:

A constante de Michaelis-Menten (Km) permanece inalterada mas a velocidade mxima (Vmax), dita agora aparente, reduzida.Na representao de Lineweaver-Burk, ao aumentar a concentrao do inibidor no-competitivo, aumenta quer o declive quer a ordenada na origem.4.3. Inibio incompetitivaNeste tipo de inibio o inibidor no se liga com a enzima livre mas apenas com o complexo intermedirio ES. Ambas as constantes cinticas, Km e Vmax, so neste caso afectadas.

A expresso para a velocidade com a aproximao do estado quasi-estacionrio :

Isto :Linearizando a equao, obtm-se:

Na representao de Lineweaver-Burk, ao aumemtar a concentrao do inibidor competitivo, aumenta a ordenada na origem mas o declive permanece constante, originando rectas paralelas para diferentes concentraes.

4.4. Inibio pelo substrato

ES +S ESSPode deduzir-se que a velocidade da reaco dada por:V = k+2 [ES][E0] = [E] + [ES] + [ESS]Km = Kss = Kss = [ESS] = Vmax = k+2 [E0]Substituindo [E] e [ESS] na equao do balano enzima, obtm-se:[E0] = [ES] Daqui tira-se [ES] que se substitui na equao da velocidade:V = com Kss = Km + /KSS > KmPara baixas concentraes de substrato o termo [S]/(KssVmax) desprezvel, o mesmo acontecendo com o termo Km/(Vmax[S]) para concentraes elevadas de substrato.

Esquema global de WebbK+2Ks

E ES E + P2KIKI

EI EIS E + P +I1 Ks k+2

Em que Ks, KI, 1Ks e 2KI so as seguintes constantes de dissociao: Ks = [E][S] / [ES] KI = [E][I] / [EI] 1Ks = [EI][S] / [EIS] 2KI = [ES][I] / [EIS]

Em geral, 1 = 2 = e quando: = 1 e = 0: inibio no competitiva pura = 1 e 0 < < 1: inibio no-competitiva parcial = 1: no h qualquer inibioSe 1 ocorre uma inibio no-competitiva mais geral (ou mais complexa) ou, eventualmente, uma inibio mista.

5. Cintica enzimtica

Na indstria cervejeira usam-se leveduras do gnero Saccharomyces para converter acares mais simples em etanol e dixido de carbono. Esses acares so unidades de glucose e/ou maltose resultantes da hidrlise do amido proveniente da cevada. Essa hidrlise catalisada enzimaticamente por um conjunto de enzimas designados por amilolticos e obtido durante a operao de maltagem.O amido um polmero natural constitudo por dois componentes: a amilose, com uma estrutura linear e a amilopectina, com uma estrutura ramificada.Os principais amilolticos so: -milase: corta a cadeia polimrica ainda em grandes seces designadas por dextrinas; -amilase: liberta duas unidades de glucose, isto , o dissacardeo maltose; amiloglucosidase: liberta unidades de glucose simples (um acar redutor) e ainda uma enzima hidroltica desramificante que, como o prprio nome nome indica, corta ligaes ramificadas.A enzima amiloglucosidase , pois, uma das principais enzimas utilizadas industrialmente na produo da glucose a partir do amido. tambm usado para a produo de cerveja com um contedo reduzido de hidratos de carbono. A enzima hidrolisa as ligaes -1,4 e tambm as ligaes -1,6 do aido, sendo a velocidade de hidrlise das ligaes -1,4 cerca de 15 a 30 vezes mais elevada do que as ligaes -1,6.Para uma actividade e estabilidade ptimas durante longos tempos de reaco (40 a 100 horas), que so usados na indstria para a produo de xaropes de glucose (em grandes tanques de sacarificao), o pH ptimo cerca de 4,5 e a temperatura ptima 60C.6. AminocidosAs protenas so biomolculas polimricas constitudas por cadeias de diversos aminocidos, ligados uns aos outros por meio de ligaes peptdicas, estabelecidas entre o grupo carboxilo de um aminocido e o grupo amina do aminocido seguinte,As protenas, consoante a funo que desempenham, podem dividir-se em trs grupos principais, a saber: Funo estrutural: existem nos msculos, na pele, nos ossos, nos rgos internos, nas membranas celulares, e apresentam geralmente uma estrutura fibrosa. Fisiologicamente activas: enzimas, hormonas e as protenas do sangue e do plasma; estas ltimas transportam oxignio, defendem o organismo contra infeces, participam na coagulao, transportam e armazenam substncias nutritivas. Nutritivas.

As protenas dos serres vivos so constitudas essencialmente por 20 aminocidos diferentes, ditos fundamentais e determinados pelo cdigo gentico.

De acordo com a estrutura do grupo R, podem dividir-se aqueles 20 aminocidos em 7 grupos, por facilidade de sistematizao: Grupo I: Glicina: este o nico aminocido que no possui um carbono assimtrico, como tal no forma dois enantimeros como os restantes aminocidos. Alanina Valina (e) Leucina (e) Isoleucina (e): este aminocido possui, para alm de um carbono assimtrico, um carbono tambm assimtrico, dando origem a 4 enantimeros. Grupo II: Serina Treonina (e): este aminocido tambm possui um carbono assimtrico, semelhana da isoleucina. Grupo III: Cistena Metionina (e) Grupo IV: cido asprtico Asparagina cido glutmico Glutamina Grupo V: Lisina (e) Arginina (e) Histidina (e): este aminocido caracterizado pelo grupo imidasol Grupo VI: Fenilalanina (e) Tirosina Triptofano (e): este aminocido caracterizado pelo grupo indol. Grupo VII: Prolina: possui um grupo amina secundrio.

Os aminicidos anotados com (e) designam-se essncias, querendo com isto dizer que eles tm de estar presentes na alimentao dos animais, por impossibilidade de estes os sintetizarem a partir de outras substncias existentes nos alimentos.

7. Aldoses e Cetoses

Os monossacardeos so os hidratos de carbono mais simples e, consoante possuem um grupo aldedo ou um grupo cetnico, assim se designam por aldoses ou cetoses. Os monossacardeos mais abundantes na Natureza so pentoses e hexoses, aldoses com, respectivamente, cinco e seis tomos de carbono.