resistÊncia de cafeeiros À mancha- aureolada: aspectos

TESE

RESISTÊNCIA DE CAFEEIROS À MANCHA-

AUREOLADA: aspectos morfoanatômicos,

fitopatológicos, genéticos e moleculares

LUCAS MATEUS RIVERO RODRIGUES

Campinas, SP

2015

INSTITUTO AGRONÔMICO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA

TROPICAL E SUBTROPICAL

RESISTÊNCIA DE CAFEEIROS À MANCHA-

AUREOLADA: aspectos morfoanatômicos,


LUCAS MATEUS RIVERO RODRIGUES

Orientador: Oliveiro Guerreiro Filho

Campinas, SP

Dezembro de 2015

Tese submetida como requisito parcial para

obtenção do grau de Doutor em Agricultura

Tropical e Subtropical, Área de Concentração

em Genética, Melhoramento Vegetal e

Biotecnologia.

ii

FICHA ELABORADA PELA BIBLIOTECÁRIA DO NÚCLEO DE INFORMAÇÃO

E DOCUMENTAÇÃO DO INSTITUTO AGRONÔMICO - IAC

iv

A meus pais Júlio e Sueli,

DEDICO.

v

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Oliveiro Guerreiro Filho, pela oportunidade e orientação para

realização deste estudo, além de transmitir valioso conhecimento sobre o melhoramento

de plantas, principalmente do cafeeiro.

A meu pai Dr. Júlio Rodrigues Neto, pelo grande incentivo e contribuições

dentro e fora do laboratório, que auxiliaram na realização desta tese.

Aos pesquisadores do Instituto Biológico Msc. Irene Maria Gatti da Almeida,

Dr. Luis Otávio Saggion Beriam e Dra. Flávia Rodrigues Alves Patrício, pelos

ensinamentos transmitidos, incentivo às pesquisas e amizade.

Aos pesquisadores do Instituto Agronômico Msc. Masako Toma Braghini e

Dr. Luiz Carlos Fazuoli, pela auxílio na realização desta tese e pelos valiosos

conhecimentos transmitidos.

À Dra. Rachel Benetti Queiroz-Voltan, pelo auxilo nos estudos de

histopatologia.

À Dra. Mirian Perez Maluf, pela orientação nos experimentos de biologia

molecular.

À Pós-graduação do IAC, pela oportunidade de realização do curso de

doutorado.

À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.

À Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano, Curadora da Coleção de Culturas

de Fitobactérias do Instituto Biológico, pelo fornecimento das culturas bacterianas

utilizadas neste estudo.

Ao pesquisador do Laboratório de Ciências de Plantas Daninhas, do Instituto

Biológico, Dr. Marcus B. Matallo, por ceder parte da estufa para realização das

inoculações.

A todos os funcionários do Centro de Café Alcides Carvalho, em especial á D.

Ivone e Vânia, pela auxílio na coleta de sementes e, Anderson, pela amizade e auxílio

em diversos procedimentos da pesquisa.

Aos amigos do curso de Pós-graduação em Agricultura Tropical e Subtropical,

Bárbhara, Juliana, Vinícius, Alex, Gustavo, Cristiane e André pela amizade e

colaborações indiretas à pesquisa.

Às amigas do Laboratório de Bacteriologia Vegetal, Karen, Renata, Lucilene,

Denise e Daniele pela contribuições indiretas ao trabalho.

vi

Às colegas do laboratório de Biologia Molecular Patrícia, Juliana, Paula,

Bruna e Lígia pela amizade e auxílio nos experimentos de expressão gênica.

A meus Irmãos Tatiana e Renê e a minha namorada Mariara, pelo contínuo

incentivo para realização deste trabalho.

Aos professores e funcionários do Curso de Pós-graduação em Agricultura

Tropical e Subtropical (IAC) pela colaboração e ensinamentos;

A todos que contribuíram de alguma forma para a realização desta tese.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... xv

RESUMO ..................................................................................................................... xvii

ABSTRACT .................................................................................................................. xix

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 3

2.1. Trajetória e aspectos socioeconômicos da cultura do café ........................................ 3

2.2. Mancha-aureolada-do-cafeeiro .................................................................................. 5

2.2.1. Origem da mancha-aureolada-do-cafeeio e condições para ocorrência ................. 5

2.2.2. Sintomatologia da mancha-aureolada ..................................................................... 7

2.2.2.1. Mudas de cafeeiro ................................................................................................ 7

2.2.2.2. Plantas adultas de cafeeiro ................................................................................... 7

2.2.2.3. Confusão da mancha-aureolada com outros distúrbios ....................................... 8

2.2.3. Distribuição geográfica da mancha-aureolada do cafeeiro ..................................... 9

2.2.4. Pseudomonas syringae pv. garcae ......................................................................... 9

2.2.5. Controle da mancha-aureolada-do-cafeeiro.......................................................... 12

2.2.6. Resistência genética de cafeeiros a Pseudomonas syringae pv. garcae............... 13

2.2.6.1. Métodos para avaliação da resistência à mancha-aureolada ............................. 14

2.3. Melhoramento genético de Coffea arabica ............................................................. 14

2.3.1. Classificação botânica, origem e características de Coffea arabica ..................... 14

2.3.2. Histórico, métodos e perspectivas ........................................................................ 15

2.4. Mecanismos de resistência de plantas a patógenos ................................................. 18

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 25

3.1. Alterações morfológicas em tecidos foliares de cafeeiros infectados por

Pseudomonas syringae pv. garcae ................................................................................. 25

3.1.1. Material vegetal, inoculação e condições experimentais...................................... 25

3.1.2. Análises histopatológicas ..................................................................................... 26

3.2. Natureza e agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae ......... 26

3.2.1. Isolados bacterianos utilizados no estudo ............................................................. 26

3.2.1.1. Reativação dos isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae ........................ 27

3.2.3. Agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae........................ 28

3.2.4. Produção e sensibilidade as bacteriocinas entre isolados de Pseudomonas

syringae pv. garcae ........................................................................................................ 30

3.3. Metodologia de inoculação de Pseudomonas syringae pv. garcae para seleção de

plantas de cafeeiros resistentes à mancha-aureolada ...................................................... 31

3.4. Identificação de fontes de resistência a Pseudomonas syringae pv. garcae em

Coffea spp. ...................................................................................................................... 35

3.4.1. Obtenção das mudas de cafeeiros ......................................................................... 35

viii

3.4.2. Avaliação da resistência do germoplasma de Coffea spp. a Pseudomonas syringae

pv. garcae ....................................................................................................................... 39

3.5. Análise do efeito pleiotrópico do alelo SH1 na resistência a Pseudomonas syringae

pv. garcae ....................................................................................................................... 40

3.5.1. Material vegetal de cafeeiros ................................................................................ 40

3.5.2. Avaliação quanto à resposta de cafeeiros à infecção por Pseudomonas syringae

pv. garcae e a Hemileia vastatrix ................................................................................... 40

3.6. Análise da expressão diferencial de genes possivelmente ligados à resistência a


3.6.1. Extração de RNA total das folhas de cafeeiro, tratamento com RNase e síntese de

cDNA .............................................................................................................................. 42

3.6.1.1. Extração de RNA total das folhas de cafeeiro ................................................... 42

3.6.1.2. Tratamento dos RNAs com DNase ................................................................... 43

3.6.1.3. Síntese de cDNAs .............................................................................................. 43

3.6.2. Análise da expressão relativa em tempo real de genes ligados á defesa vegetal .. 44

3.6.2.1. Genes normalizadores e/ou endógenos ............................................................. 44

3.6.2.2. Genes alvo ......................................................................................................... 44

3.6.2.3. Reações de qRT-PCR ........................................................................................ 45

3.6.2.4. Análise dos resultados ....................................................................................... 45

4. RESULTADOS .......................................................................................................... 46



4.2. Agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae........................... 51






Coffea spp. ...................................................................................................................... 60


pv. garcae ....................................................................................................................... 73



5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 79



5.2. Agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae........................... 81





ix


Coffea spp. ...................................................................................................................... 88


pv. garcae ....................................................................................................................... 93



6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 98

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 99

8. ANEXOS .................................................................................................................. 114

x

ÍNDICE DE FIGURAS Pag.

Figura 1 - Lesões provocadas por Pseudomonas syringae pv. garcae. Lesões

anasarcadas circundadas por halo clorótico, típicas da mancha-

aureolada (A). Morte de ponteiro provocada pela bactéria (B)

Superbrotamento induzido após a necrose do ápice da muda (C)............ 7

Figura 2 - Modelo da sinalização dos sinais de JOHANSSON (2015) representa o

efeito cascata ocorrido após reconhecimento do patógeno em algumas

possível vias de defesa, iniciado pela ativação dos fluxos de cálcio,

MAPKs e, pela sinalização de espécies reativos de oxigênio (ROS),

fosfolipase, óxido nítrico (ON), etileno, jasmonato (JA) e ácido

salicílico (SA)........................................................................................... 21

Figura 3 - Ilustração dos métodos de inoculação de Pseudomonas syringae pv.

garcae em folhas de cafeeiros. Inoculação por aspersão (A); inoculação

com agulhas múltiplas (B)........................................................................ 32

Figura 4 - Método de inoculação de Pseudomonas syringae pv. garcae, em folhas

de cafeeiro por abrasão. Fricção da lixa contra a superfície abaxial da

folha (A); Ferimentos ocasionados pela inoculação e deposição da

suspensão bacteriana na superfície lesionada (B)..................................... 34

Figura 5 - Cortes paradérmicos mostrando mesofilo de folhas de cafeeiro

inoculadas com solução salina (A); Células adjacentes ao ponto de

inoculação (B); detalhes do parênquima paliçádico (C); parênquima

esponjoso (D); Seta indica o tecido de cicatrização. PI = ponto de

inoculação. (Barra = 25 µm).................................................................... 48

Figura 6 - Cortes paradérmicos de folhas de cafeeiro mostrando mesofilo no local

da inoculação com Pseudomonas syringae pv. garcae, 10 dias após a

inoculação (A); parênquima esponjoso com destruição parcial de

cloroplastos, bem como massas de bactérias no interior das células e

em espaços intercelulares (B); parênquima paliçádico (C); parênquima

esponjoso com massas bacterianas (D); massas bacterianas em células

do feixe vascular (E). Secção transversal da folha com células dos

feixes vasculares bloqueadas por bactérias e células do floema

desestruturadas (F). b = bactérias; PI = ponto de inoculação, PP =

parênquima paliçádico; PE = parênquima esponjoso (Barra = 25 µm).... 49

Figura 7 - Cortes paradérmicos de folhas de cafeeiro mostrando mesofilo no local

da inoculação com Pseudomonas syringae pv. garcae, 20 dias após a

inoculação. Células do mesofilo rompidas em locais distantes do ponto

de inoculação (A); sintomas externos acompanhando as nervuras (B);

destruição dos cloroplastos de células do parênquima esponjoso (C);

secção transversal da folha com hiperplasia no parênquima esponjoso

(D); massa bacteriana presente no espaço intercelular de células do

parênquima esponjoso (E); inclusões presentes em células do

parênquima esponjoso (F). b = bactérias; PI ponto de inoculação, PP =

parênquima paliçádico; PE = parênquima esponjoso. (Barra = 25 µm)...

50

Figura 8 - Insensibilidade bacteriocinogênica dos isolados de Pseudomonas

syringae pv. garcae testados. Isolados candidatos a produção de

bacteriocinas, i – IBSBF 65, ii – IBSBF 75, iii – IBSBF 1197, iv –

IBSBF 248; isolados indicadores de atividade: v – IBSBF 1293, vi –

IBSBF 2840, vii – IBSBF 3024 e viii – IBSBF 3051 (A) Isolados

candidatos a produção de bacteriocinas: i – IBSBF 1293, ii – IBSBF

2840, iii – IBSBF 3024, iv – IBSBF 3051; isolados indicadores de

xi

atividade: v – IBSBF 65, vi – IBSBF 75, vii – IBSBF 1197 e viii –

IBSBF 248 (B)..........................................................................................

54

Figura 9 - Sintoma da mancha-aureolada na cultivar Catuaí Vermelho IAC 144,

aos 14 dias após a inoculação, resultado da inoculação por aspersão...... 57

Figura 10 - Curva da evolução da mancha-aureolada em cafeeiros de espécies de

Coffea spp., avaliados por meio de escala de zero a cinco pontos e da

Área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD).........................

62

Figura 11 - Sintomas observados aos 21 dias após a inoculação com Pseudomonas

syringae pv. garcae, em folhas de espécies de Coffea spp. pelo método

de abrasão. C. arabica cv. IAC 125 RN (A); C. congensis (B); C.

kapakata (C); C. eugenioides (D); C. salvatrix (E); C. stenophylla (F);

C. liberica var. passipagore (G); C. anthonyi (H); C. humilis (I); C.

heterocalyx (J); C. canephora (K); C. arabica cv. Catuaí Vermelho

IAC 81 (L)................................................................................................ 64

Figura 12 - Face abaxial de folha de cafeeiro da cultivar IAC 125 RN de Coffe

arabica, inoculada com Pseudomonas syringae pv. garcae pelo

método de abrasão, presença de colonização dos tecidos foliares

adjacentes aos ferimentos, ocasionados pela inoculação por abrasão...... 65

Figura 13 - Expressão relativa de genes associados à resposta de defesa, avaliados

em amostras foliares das cultivares IAC 125 RN e IPR 102 de Coffea

arabica inoculadas com Pseudomonas syringae pv. garcae e com

solução salina (controle). As barras representam desvios padrão para as

triplicatas independentes. C. arabica cv. IAC 125 RN x Solução salina

( ); C. arabica cv. IAC 125 RN x P. syringae pv. garcae ( ); C.

arabica cv. IPR 102 x Solução salina ( ); C. arabica cv. IPR 102 x

P. syringae pv. garcae ( ).................................................................... 77

xii

ÍNDICE DE TABELAS Pag.

Tabela 1 - Identificação, local de origem, ano de isolamento e planta

hospedeira dos isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae e

relação dos experimentos em que foram utilizados.............................. 27

Tabela 2 - Germoplasma utilizado na comparação dos métodos das agulhas

múltiplas e por abrasão, para inoculação de Pseudomonas syringae

pv. garcae, em cafeeiros....................................................................... 34

Tabela 3 - Relação de espécies, cultivares, variedades, introduções da Etiópia,

híbridos, acessos, formas botânicas e mutações do BAG de cafeeiros

do IAC avaliados para resistência aos isolados de Pseudomonas

syringae pv garcae IBSBF 75 e IBSBF 1197...................................... 36

Tabela 4 - Cafeeiros derivados do cruzamento entre Coffea arabica e C.

eugenioides avaliados em relação à resistência de suas progênies à

mancha-aureolada................................................................................. 39

Tabela 5 - Sequência dos primers utilizados na reação de qRT-PCR................... 44

Tabela 6 - Valores médios das lesões (mm) em folhas do terceiro internódio de

cafeeiro da cultivar Mundo Novo IAC 376-4 causadas por

Pseudomonas syringae pv. garcae, aos 10 e 20 dias após a

inoculação............................................................................................. 46

Tabela 7 - Comprimento médio das lesões em centímetros aos 21 dias após a

inoculação (DAI) nas cultivares Mundo Novo IAC 376-4 e Bourbon

Amarelo IAC J 30 de Coffea arabica, inoculadas por punctura com

diferentes isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae e

combinação de isolados e períodos de incubação (PI) calculados a

partir de sintomas observados em folhas do primeiro internódio em

dias após a inoculação (DAI)............................................................... 52

Tabela 8 - Médias, intervalos de confiança (IC), desvio padrão (DP) e

coeficiente de variação (CV) das variáveis escala de pontos (EP),

área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) e incidência,

provocada por Pseudomonas syringae pv. garcae inoculada pelos

métodos de aspersão e agulhas múltiplas, em diferentes pares de

folhas....................................................................................................

56

Tabela 9 - Média, intervalo de confiança (IC), desvio padrão (DP) e coeficiente

de variação (CV) em porcentagem das variáveis escala de pontos

(EP) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD),

provocadas por Pseudomonas syringae pv. garcae inoculada pelos

métodos de agulhas múltiplas e abrasão, em germoplasma diverso de

Coffea arabica...................................................................................... 58

Tabela 10 - Estimativas das correlações de Spearman entre os valores da

AACPD aos 7, 14, 21, 35 e 42 dias após a inoculação (DAI) de

Pseudomonas syringae pv. garcae em folhas de onze genótipos de

cafeeiros, pelos métodos de agulhas múltiplas e

abrasão..................................................................................................

59

Tabela 11 - Frequência de cafeeiros resistentes (R), moderadamente resistentes

(MR) e suscetíveis (S) segundo escala de 0 a 5 pontos em Coffea

spp. em resposta a infecção por Pseudomonas syringae pv. garcae,

avaliadas no experimento 1..................................................................

60

xiii

Tabela 12 - Frequência de cafeeios resistentes (R), moderadamente resistentes

(MR) e suscetíveis (S) segundo a avaliação pela escala de 0-5

pontos, aos 42 dias após a inoculação com Pseudomonas syringae

pv. garcae, avaliadas no experimento 4...............................................

63

Tabela 13 - Total de cafeeiros inoculados com Pseudomonas syringae pv.

garcae, frequência de plantas resistentes (R), moderadamente

resistentes (MR) e suscetíveis (S) segundo a avaliação pela escala de

0 a 5 pontos, aos 42 dias após a inoculação e severidade média da

mancha-aureolada comparada pela área abaixo da curva de

progresso do doença (AACPD), provocadas pelas inoculações

artificiais em 22 introduções de Coffea arabica oriundas da Etiópia,

avaliadas no experimento dois.............................................................

67

Tabela 14 - Total de cafeeiros inoculados com Pseudomonas syringae pv.

garcae, frequência de plantas resistentes (R), moderadamente

resistentes (MR) e suscetíveis (S) segundo a avaliação pela escala de

0 a 5 pontos, aos 42 dias após a inoculação e severidade média da

mancha-aureolada comparada pela área abaixo da curva de

progresso do doença (AACPD), provocadas pelas inoculações

artificiais em 23 introduções de Coffea arabica oriundas da Etiópia,

avaliadas no experimento três.............................................................. 68

Tabela 15 - Número total de plantas e frequência de plantas resistentes (R),

moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S) de progênies de

híbridos (Coffea eugenioides x C. arabica) segundo a avaliação pela

escala de 0 a 5 pontos aos 42 dias após a inoculação com

Pseudomonas syringae pv. garcae....................................................... 70

Tabela 16 - Número total de cafeeiros inoculados, frequência de plantas

resistentes (R), moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S),

segundo avaliação pela escala de 0-5 pontos aos 42 dias após a

inoculação e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)

do germoplasma avaliado em relação à infecção pela bactéria

Pseudomonas syringae pv. garcae.......................................................

71

Tabela 17 - Número de cafeeiros inoculados, frequência de plantas resistentes

(R), moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S), segundo

avaliação pela escala de 0 a 5 pontos e, reação de seleções de Coffea

arabica inoculadas com Pseudomonas syringae pv. garcae, pela

média da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)...... 72

Tabela 18 - Reação de progênies F2 dos cafeeiros H8089-2 e H8089-7, híbridos

entre a cultivar Catuaí Vermelho IAC 24 e a seleção Geisha IAC

1137-5, à infecção pela bactéria Pseudomonas syringae pv. garcae e

pelos isolados I/2015 (v2, v5) e II/2015 (v1, v2, v5) de Hemileia

vastatrix................................................................................................ 73

Tabela 19 - Número total de cafeeiros F2 de duas progênies do híbrido H8089

resistentes e suscetíveis a Pseudomonas syringae pv. garcae e ao

isolado I/2015 de Hemileia vastatrix....................................................

74

Tabela 20 - Estimativa de parâmetros relacionados à resposta de cafeeiros F2 de

duas progênies do híbrido H8089 à infecção pela bactéria

Pseudomonas syringae pv. garcae e pelo fungo Hemileia

vastatrix................................................................................................ 74

xiv

LISTA DE ANEXOS Pag.

Anexo 1 - Representação da escala de zero a cinco pontos (EP) utilizada como

referência nas avaliações da severidade da mancha-aureolada em

cafeeiros inoculadas com Pseudomonas syringae pv. garcae, pelos

métodos de agulhas múltiplas e abrasão..............................................

114

Anexo 2 - Comprimento médio das lesões (cm) aos 21 dias após a inoculação

(DAI) originados em folhas dos quatro primeiros internódios da

cultivar Bourbon Amarelo IAC J 30 de Coffea arabica, inoculadas

por punctura com diferentes isolados de Pseudomonas syringae pv.

garcae e uma combinação de isolados e períodos de incubação (PI)

calculados a partir da observação dos sintomas inicias da doença,

provocados pelas inoculações em DAI................................................

115

Anexo 3 - Levantamento de dados (1977-1991) referentes a produção de café

cereja no período entre 1977 e 1989, ocorrência/severidade da

ferrugem em 1980, vigor e maturação dos frutos das introduções

oriundas da Etiópia avaliadas para resistência a Pseudomonas

syringae pv. garcae..............................................................................

117

xv

LISTA DE ABREVIATURAS

AACPD = Área abaixo da curva de progresso da doença.

APX = Ascorbato peroxidase.

AS = Ácido salicílico.

BAG = Banco Ativo de Germoplasma.

C = Cova.

CAT = Catalase

Ct = Cycle threshold.

cv. = Cultivar.

CTAB = Cetiltrimetil amônio brometo.

CV = Coeficiente de variação.

DAI = Dias após a inoculação.

ddH2O DEPC = Água bi-destilada, tratada com DEPC.

DEPC = Dicarbonato de dietila (diethylpyrocarbonate).

DP = Desvio padrão (s2).

EDTA = Ácido etilenodiaminotetracético.

ET = Etileto.

GLR = Glutationa redutase

HAI = Horas após a inoculação.

HT = Híbrido de Timor

IAC = Instituto Agronomico de Campinas.

IAPAR = Instituto Agronomico do Paraná.

IC = Intervalo de confiança.

ICL = Isocitrato liase.

JA = Jasmonato.

L = Lote.

ON = Óxido nítrico.

P.A. = Produto Ativo.

POX = Peroxidase.

xvi

PVP = Polivinilpirrolidona.

qRT-PCR = PCR quantitativo em tempo real.

RSA = Resistência sistêmica adquirida.

SOD = Super óxido dismutase.

UFC = Unidades formadoras de colônia.

var. = Variedade.

xvii

Resistência de cafeeiros à mancha-aureolada: aspectos morfoanatômicos,


RESUMO

A mancha-aureolada, causada por Pseudomonas syringae pv. garcae, afeta cafezais dos

principais estados produtores do país, sendo considerada fator limitante do cultivo em

regiões que apresentam condições favoráveis à doença. Como subsídio ao programa de

melhoramento genético (PMG) de cafeeiros do Instituto Agronômico (IAC), objetivou-

se no presente trabalho definir uma estratégia para a seleção de cafeeiros resistentes à

mancha-aureolada. Inicialmente, estudou-se as alterações anatômicas causadas pela

bactéria em folhas de cafeeiro. Posteriormente, foi avaliada a agressividade de isolados

de P. syringae pv. garcae, de forma individual ou em mistura. Em seguida, comparou-

se técnicas de inoculação em mudas, por meio de aspersão, agulhas múltiplas e abrasão,

a fim de se padronizar um método eficiente para reprodução dos sintomas da doença. A

seguir, estudou-se a resistência dos acessos do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de

Coffea spp. à bactéria, incluindo-se espécies do gênero, híbridos inter e intraespecíficos,

introduções, formas botânicas, variedades e mutantes de C. arabica, e, seleções de

gerações avançadas do PMG. O efeito pleiotrópico do alelo SH1, possivelmente ligado a

resistência à bactéria, foi avaliado em germoplasma com resistência a isolados de

Hemileia vastatrix, portadores ou não do alelo v1 de virulência. Finalmente, estudos

sobre a expressão relativa dos genes associados à resistência a fitopatógenos EDS1,

PAD4, ascorbato peroxidase, catalase e superóxido dismutase, peroxidase, β-1,3-

glucanase, isocitrato liase e glutationa redutase foram conduzidos por meio da técnica

de qRT-PCR, utilizando-se genótipos contrastantes para a resistência (IAC 125 RN

suscetível e IPR 102 resistente). Análises histopatológicas mostraram que, no mesofilo

de folhas jovens, os sintomas causados pela bactéria correspondem ao dobro em releção

ao visualizados na epiderme, externamente. Também, a bactéria foi detectada nos feixes

vasculares, colonizando regiões afastadas do ponto de inoculação. Os testes de

patogenicidade revelaram grande variação em agressividade, sendo os isolados IBSBF

65, IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293 e IBSBF 2212 os mais agressivos, e os

isolados IBSBF 248, IBSBF 1372, IBSBF 2996, IBSBF 2999, IBSBF 3005, IBSBF

3019, IBSBF 3051 e IBSBF 3065 caracterizados pela menor agressividade. Análises

xviii

comparativas entre os métodos de inoculação, determinaram que a técnica de inoculação

por abrasão resultou em maior expressão dos sintomas da mancha-aureolada nas

condições testadas, sendo a mais indicada em experimentos para se avaliar a resistência

de cafeeiros à doença. Ainda, avaliações da severidade mostraram que as folhas do

primeiro internódio foram mais propícias para os experimentos. Análises de correlação

revelaram alta similaridade no ranqueamento dos genótipos, nas avaliações realizadas

no 14° dia após a inoculação (DAI), com avaliações aos 42 DAI, validando a

proposição de seleção precoce para a característica de resistência à bactéria. Quanto aos

acessos do BAG de Coffea do IAC, detectou-se resistência nas espécies C. salvatrix, C.

eugenioides C. stenophylla e C. canephora. Dentre as 45 introduções de C. arabica de

origem etíope avaliadas, apenas duas, ETP 3 e ETP 12 apresentaram 80% ou mais de

suas progênies suscetíveis à bactéria. Entretanto, uma única introdução (ETP 22)

apresentou 100% de plantas resistentes, ou seja, homozigota para a característica.

Confirmou-se alta resistência à P. syringae pv. garcae na cultivar IPR 102, e a

variedade Pálido Viridis de C. arabica foi caracterizada como resistente. Nas seleções

do PMG do IAC avaliadas, o genótipo H 13439-8-C1736 L109 foi o mais promissor,

com resistência moderada à bactéria em sua progênie. O estudo sobre o alelo SH1

revelou que este gene não atua na resistência à P. syringae pv. garcae. Finalmente, os

resultados das análises de expressão de genes ligados a defesa sugerem a possibilidade

da via do ácido salicílico ser ativado no processo de defesa. Espécies reativas de

oxigênio parecem ser outro mecanismo com potencial ligação na resposta de defesa da

cultivar IPR 102 a P. syringae pv. garcae, contudo, estudos adicionais deverão ser

realizados para confirmar estas hipóteses.

Palavras chave: melhoramento genético; Pseudomonas syringae pv. garcae; métodos

de inoculação; qRT-PCR.

xix

Resistance to bacterial halo blight on coffee: morphoanatomics, phytopathologic,

genetic and molecular aspects.

ABSTRACT

Bacterial halo blight (Pseudomonas syringae pv. garcae) affect coffee plantations on

the major producing states in Brazil and is considered a limiting factor of cultivation in

areas with favorable conditions to the pathogen. As support to the genetic breeding

program (GBP) of coffee in the Instituto Agronômico (IAC), the aim of this study was

to outline a strategy for the selection of resistant coffee to bacterial halo blight. Initially,

were studied the anatomical changes caused by the bacteria on coffee leaves.

Afterwards, aggressiveness of bacterial strains, inoculated individually or in

combination was evaluated. Subsequently, it was compared inoculation techniques in

plants by sprinkling, multiple needles and abrasion, in order to standardize an efficient

method to reproduce disease symptoms. Later, were studied the resistance of accesses

maintained in the IAC Active Germplasm Bank (AGB) of Coffea spp. to the bacterium,

including species of the genus, hybrids inter and intraspecific, introductions, botanical

forms, varieties and mutants of C. arabica, and selections of advanced GBP

generations. Pleiotropic effect of SH1 allele, possibly linked to resistance to the

pathogen was evaluated in the germplasm with resistance to Hemileia vastatrix strains,

with or without v1 virulence allele. Finally, studies on the expression of associated

genes with resistance to phytopathogens EDS1, PAD4, ascorbate peroxidase, catalase

and superoxide dismutase, peroxidase, β-1,3-glucanase, isocitrate lyase and glutathione

reductase were conducted through of qRT-PCR, using contrasting genotypes for

resistance (IAC 125 RN susceptible and IPR 102 resistant). Histopathological analyzes

showed that, in the mesophyll of young leaves, symptoms caused by the bacteria are

two times higher than the displayed in the epidermis externally. Also, the bacterium was

detected in the vascular bundles, colonizing distant regions from the inoculation site.

Pathogenicity tests revealed great variability of aggressiveness, being strains IBSBF 65,

IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293 and IBSBF 2212 most aggressive, and IBSBF

248, IBSBF 1372, IBSBF 2996, IBSBF 2999, IBSBF 3005, IBSBF 3019, IBSBF 3051 e

IBSBF 3065 strains, characterized by lower aggressiveness. Comparative analysis of

inoculation methods, established that abrasion inoculation technique results in higher

xx

expression of symptoms of bacterial halo blight, in the tested conditions and it is most

appropriated in resistance experiments of coffee to the disease. Also, the severity

evaluations showed that leaves of first internode were more favorable for the

experiments. Correlation analyzes revealed high similarity in genotypes ranking of

evaluations performed at 14th day after inoculation (DAI) with assessments at 42 DAI,

validating the use of early selection for resistance to Pseudomonas syringae pv. garcae.

Regarding Coffea AGB accesses of IAC, it was detected resistance in C. salvatrix, C.

eugenioides, C. stenophylla and C. canephora species. Among the 45 C. arabica

introductions from Ethiopia evaluated, only two, ETP 3 and ETP 12, showed 80% or

more of their progeny susceptible to the pathogen. However, only the introduction ETP

22 showed 100% resistant plants, i.e., homozygous for the resistence to the bacteria. It

was confirmed high resistance to P. syringae pv. garcae in the IPR 102 cultivar and,

Pálido Viridis variety of C. arabica was determined as resistant to bacterial halo bllight.

In the IAC GBP evaluated selections, the H 13439-8-C1736 genotype was the most

promising, with moderate resistance to bacteria in their progeny. Study of SH1 allele

revealed that this gene does not act in resistance to P. syringae pv. garcae. Finally,

results of gene expression analysis of resistance related genes suggested the possibility

of defense process active salicylic acid via. Reactive oxygen species appear to be

another mechanism in connection with potential to defense response of IPR 102 cultivar

to P. syringae pv. garcae, however, additional studies are required to confirm these

hypothesis.

Keywords: genetic breeding; Pseudomonas syringae pv. garcae; inoculation methods;

qRT-PCR.

1

1. INTRODUÇÃO

O café possui alto valor econômico, sendo uma das principais commodities

agrícola do Brasil, ficando atrás apenas do petróleo. É a segunda bebida mais

consumida do mundo e, quase toda sua produção é utilizada para tal fim. Os cafés

consumidos são oriundos principalmente de duas espécies, Coffea arabica e C.

canephora. Partes menores da produção são destinadas às indústrias farmacêutica,

alimentícia e de cosméticos.

O Brasil é o maior produtor mundial, e estima-se que a área cultivada seja de

aproximadamente dois milhões de hectares. No ano de 2014, a produção atingiu 45,3

milhões de sacas de café beneficiado, das quais aproximadamente 36 milhões foram

exportadas (CONAB, 2015).

Atualmente, a produção dos cafezais tem sido afetada principalmente pelo

déficit hídrico, má condução da lavoura, além de outros fatores, com destaque para a

ocorrência de pragas e doenças.

Dentre as doenças que afetam o cafeeiro, a mancha-aureolada, moléstia de

etiologia bacteriana, vem sendo comumente detectada em viveiros de mudas e, no

campo, sua maior ocorrência está associada aos períodos chuvosos do ano e/ou em

locais principalmente de altitute elevada com alta umidade e ventos fortes (SERA,

2001).

O patógeno, a bactéria Pseudomonas syringae pv. garcae, apresenta certa

facilidade de seleção para a resistência a produtos fitossanitários, como sais de cobre e

antibióticos (MOHAN, 1977; YAMADA et al., 2014b), portanto, em regiões favoráveis

a sua ocorrência, que apresentam alto potencial de inóculo, medidas culturais de manejo

como formação de quebra ventos e utilização de mudas sadias são necessárias.

A bactéria pode estar presente como epífita no limbo foliar ROBBS (1977;

1978) e/ou confundida com outros distúrbios e não ser detectada no momento do

plantio. Uma vez instalada no cafezal, a doença pode se manifestar nas folhas, causando

lesões necróticas, irregulares, de aspecto encharcado, normalmente circundado por halo

amarelado. Nos ramos novos, infecta a epiderme e provoca seca destes ramos. Há

indícios de que a bactéria coloniza o sistema vascular e causa sintomas de secas de

ramos e eventualmente, a morte das plantas afetadas.

2

Quando instalada no cafezal, a mancha-aureolada representa uma ameaça para

toda a lavoura, pois, é de difícil controle e, em condições favoráveis, causa surtos de

intensa severidade, causando prejuízos ligados diretamente à produção. Devido ao

aumento da ocorrência dessa doença do cafeeiro, há preocupação em incorporar genes

de resistência ao patógeno em cultivares comerciais de café, visando ao aumento da

produção e com características agronômicas e sensoriais de interesse.

A utilização de cultivares resistentes é o método de controle mais indicado por

apresentar diversas vantagens aos produtores, ao consumidor final, além de favorecer o

meio ambiente. Atualmente, apenas a cultivar IPR 102 foi selecionada como resistente a

P. syringae pv. garcae (ITO et al., 2002).

O melhoramento genético de cafeeiros vem sendo aprimorado no sentido de se

aliar alta produtividade, resistência a estresses bióticos e tolerância à abióticos e ainda,

melhores qualidades tecnológicas. Entretanto, carece de longos períodos de seleção até

o lançamento de cultivares com as características desejadas.

Para a seleção de indivíduos resistentes a P. syringae pv. garcae, é indispensável

a utilização de métodos capazes de diferenciar a reação de genótipos à bactéria. Assim,

inoculações artificiais fazem parte da estratégia. Diversas metodologias de inoculação

são rotineiramente utilizadas no melhoramento de plantas a fitobacterioses, tais como

corte com lâmina, punctura por agulhas múltiplas, aspersão, infiltração, entre outros

(COSTA et al., 1957; OLIVEIRA & ROMEIRO, 1990; ITHIRU et al., 2013). Para

tanto, é necessário conhecimento prévio da eficiência dos métodos, uma vez que,

técnicas diferentes podem resultar em reações distintas entre plantas ou genótipos

avaliados.

O banco ativo de germoplasma de Coffea conservado no Instituto (IAC) é uma

das principais reservas genéticas do gênero, reunindo diversos híbridos inter e

intraespecíficos e espécies de interesse para o melhoramento, em especial para a

resistência a doenças. Portanto, cada acesso mantido em bancos de germoplasma bem

como seus híbridos resultantes, são plantas únicas e necessitam do conhecimento de

suas características para serem aproveitadas.

Neste contexto, os objetivos do presente trabalho foram: i) analisar as alterações

anatômicas em folhas de cafeeiros infectadas pela bactéria; ii) identificar diversidade

3

patogênica de isolados de P. syringae pv. garcae; iii) determinar o melhor método de

inoculação de P. syringae pv. garcae em mudas de cafeeiros para seleção de plantas

resistentes; iv) identificar fontes de resistência a P. syringae pv. garcae em cafeeiros do

banco de germoplasma de Coffea do Instituto Agronômico; v) investigar o possível

efeito pleiotrópico do alelo SH1 presente em cafeeiros resistentes à ferrugem (Hemileia

vastatrix) na expressão da resistência à bactéria e, vi) estudar a expressão diferencial de

genes potencialmente envolvidos na interação Coffea spp. - P. syringae pv. garcae.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Trajetória e aspectos socioeconômicos da cultura do café

Do conhecido até o momento, as primeiras observações referidas sobre as

propriedades estimulantes do café são atribuídas ao pastor etíope Kaldi, na região

conhecida como Abissínia, atual Etiópia, quando as cabras de seu rebanho ingeriam as

folhas e bagas da planta apresentavam comportamento “enfeitiçado”. Após a notícia se

espalhar pela região, os próprios etíopes provavelmente experimentaram diferentes

formas de consumo, incluindo a infusão de bagas de café (qishr), hoje conhecido como

kisher (PENDERGRAST, 2010).

Com o passar do tempo, a bebida bem como plantas de café chegaram às

arábias, ficando conhecido como qahwa, palavra árabe que significa vinho (MARTINS,

2008; PENDERGRAST, 2010).

Os primeiros relatos do cultivo datam do século VI, em um monastério

localizado na região do Yêmen, por causa do valor econômico e grande demanda pela

bebida. Logo a bebida comercializada ficou conhecida como “vinho das arábias”, e até

o século XVII era cultivado apenas pelos árabes. Os peregrinos muçulmanos levaram o

café para mundo islâmico, Pérsia, Egito, Turquia e África do Norte, aumentando o valor

comercial do café. Em 1616 foi levado à Holanda, e seu cultivo experimentado pelos

holandeses em 1699 (PENDERGRAST, 2010).

Em meados de 1706, uma planta de café foi levada de Java para o Jardim

Botânico de Amsterdan e posteriormente, uma progênie desta planta foi introduzida em

Paris. Com a expansão do cultivo, sementes e mudas de café foram levadas para as

4

colônias francesas chegando à América em 1718, através do Suriname, e em seguida

São Domingos, Cuba, Porto Rico e Guianas (PENDERGRAST, 2010).

No Brasil, a primeira muda foi conseguida pelo sargento-mor Francisco Mello

Palheta, em visita a Guiana Francesa em 1727, e plantada em Belém do Pará. A partir

daí cafezais foram instalados pelo Maranhão, Bahia, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e

Minas Gerais. Em 1825 a cultura se estabeleceu na região do vale do Paraíba, em São

Paulo, iniciando um novo ciclo econômico para o país (MARTINS, 2008;

PENDERGRAST, 2010).

Atualmente, o Brasil é líder na produção e na exportação de grãos de café, sendo

responsável por aproximadamente um terço da produção mundial. A estimativa de

colheita em 2015 está entre 44,1 e 46,6 milhões de sacas (60kg) de café beneficiado

(CONAB, 2015).

O café é o quinto ítem agrícola mais exportado do País, sendo que na safra de

2014, a produção foi de aproximadamente 45 milhões de sacas, das quais 34,5 milhões

foram exportadas para União Europeia, Estados Unidos e Japão (CONAB, 2015). A

demanda por café no mundo é crescente, e, no período entre os anos 2011 e 2014, o

consumo passou de 139 milhões de sacas para 149 milhões (ICO, 2015).

Para a economia do país, a indústria de café gera mais de oito milhões de

empregos ligados à cadeia produtiva, que, por sua vez, propiciam acesso à educação e à

saúde para os trabalhadores e familiares (MAPA, 2015).

O parque nacional cafeeiro é composto por cultivares do grupo arábica e robusta,

com grande predominância do café arábica. O café robusta ou conilon (C. canephora) é

cultivado principalmente nos estados do Espírito Santo, Rondônia e Bahia,

representando 27% da safra brasileira de café (CONAB, 2014). Este tipo de café possui

menor valor econômico e gera bebida de qualidade típica da espécie mas, inferior à

arábica. No entanto, apresenta boas características para produção de cafés solúveis, e

por isso vem sendo utilizado em mistura com café arábica a fim de reduzir a acidez e

atribuir “corpo” à bebida. Além disso, seu custo de produção é menor em relação ao

café arábica, em virtude da rusticidade da espécie (MATIELLO, 1998).

O cafeeiro arábica (C. arabica) constitui praticamente 70% das plantações de

café do Brasil, sendo cultivado principalmente no Estado de Minas Gerais, cuja a safra

5

em 2014 foi de 22,7 milhões de sacas, seguido pelos estados de São Paulo, Espírito

Santo, Bahia e Paraná com 4,2; 2,8; 1,2 e 0,5 milhões de sacas, respectivamente

(CONAB, 2014).

2.2. Mancha-aureolada-do-cafeeiro

2.2.1. Origem da mancha-aureolada-do-cafeeio e condições para ocorrência

A maioria das doenças em espécies de plantas introduzidas no Brasil tiveram

origem junto ao material vegetal ou, posteriormente, por agentes de disseminação. No

caso da mancha-aureolada, sua origem permanece desconhecida, pois o cafeeiro tem

origem africana e, por ter sido trazido para o Brasil seria presumível que a introdução da

doença teria ocorrido por materiais vegetais oriundos do continente africano. Embora o

patógeno apresente a capacidade de ser disseminado via sementes (BELAN, 2014), os

poucos isolados de origem brasileira e queniana, comparados até hoje, exibiram

diferenças relevantes tanto em aspectos bioquímicos (KAIRU, 1997) quanto em

diversidade genética (MACIEL 2012).

Outra hipótese é que mutantes bacterianos poderiam ter se adaptado à cultura do

café, uma vez que a bactéria P. syringae pv. garcae apresenta similaridade patogênica

com P. savastanoi pv. phaseolicola (sin P. syringae pv. phaseolicola, patogênica às

plantas de feijão), P. syringae pv. tabaci (patogênica ao fumo e inúmeras outras

culturas) COSTA et al. (1957), ou ainda P. syringae pv. coronafaciens e P. syringae pv.

striafaciens, que possuem características morfológicas semelhantes e são patogênicas à

aveia, e que em uma classificação mais atual pertencem ao grupo 4 de genomospécies,

assim como P. syringae pv. garcae (BULL & KOIKE, 2015).

A primeira constatação da doença foi realizada por AMARAL, TEIXEIRA &

PINHEIRO (1956), no final do ano de 1955, em cafezal no município de Garça, Estado

de São Paulo. O patógeno causador foi denominado Pseudomonas garcae (AMARAL

et al., 1956), sendo posteriormente reclassificado para Pseudomonas syringae patovar

garcae (AMARAL et al., 1956; YOUNG et al., 1978), classificação esta que permanece

até os dias de hoje. Seu nome popular está associado a um de seus sintomas, na forma

de halo amarelado presente ao redor das lesões necróticas.

6

Após a confirmação da etiologia da doença, a mesma foi considerada de menor

importância econômica (COSTA et al., 1957) e, por aproximadamente 17 anos, apenas

casos isolados da bacteriose foram constatados (MOHAN, 1976). Nos anos de 1973 e

1975, relatou-se a ocorrência severa da doença no viveiro de mudas do Instituto

Agronômico (IAC). Também, em lavouras do Estado do Paraná, a doença foi observada

em cafezais que se recuperavam da ocorrência de geadas (KIMURA et al., 1973;

MOHAN, 1976).

CARDOSO & MOHAN (1980) relacionaram fatores climáticos com a

incidência da mancha-aureolada no Estado do Paraná. Os autores verificaram que o

aumento da intensidade da doença estava relacionado às baixas temperaturas associadas

com períodos de maior precipitação, assim como à ocorrência de chuvas e ventos.

Resultados de ensaios conduzidos por ROBBS (1979), indicaram a

predisposição de cafeeiros da espécie C. arabica à maior infecção por P. syringae pv.

garcae, quando expostos a temperaturas mais baixas. O autor observou alta severidade

da doença em mudas inoculadas por aspersão e mantidas por 60 minutos em condições

de baixa temperatura (2 a -2° C). Com a evolução da doença, ocorreu necrose de gemas

e seca de ramos. Nos tratamentos controles, mantidos em condições normais de

temperatura, a doença muito pouco se manifestou. Segundo o autor, baixas temperaturas

podem causar macro e micro lesões, que atuam como porta de entrada para o patógeno,

entretanto, a alta severidade desenvolvida pode ser também atribuída a uma

predisposição da planta, induzida por períodos de baixas temperaturas, como notado na

interação P. syringae – pessegueiros, por WEAVER (1978). A atividade de nucleação

de gelo, característica de algumas bactérias do agrupamento P. syringae, e também de

P. syringae pv. garcae (GONÇALVES & MASSAMBANI, 2011), pode estar

relacionada com este efeito, especialmente em plantas de café, cultura sensível aos

efeitos da geada.

Atualmente a mancha-aureolada é considerada fator limitante para o cultivo do

café em regiões de clima ameno e expostas a ventos, tendo alta incidência em lavouras

em formação ou recém-podadas e em viveiros (SERA et al., 2002; SERA et al., 2004;

PATRÍCIO et al., 2010; ZOCCOLI et al., 2011; ALMEIDA et al., 2012a), ou ainda, em

áreas com alto potencial de inóculo. Nessas condições, a doença pode apresentar alta

severidade, ocasionando queda de produtividade.

7

2.2.2. Sintomatologia da mancha-aureolada

2.2.2.1. Mudas de cafeeiro

Em mudas de cafeeiro cultivadas em telados, o adensamento e

consequentemente excesso de umidade nas folhas proporcionam ambiente ideal para o

desenvolvimento da mancha-aureolada. Os sintomas iniciais observados nas folhas se

manifestam sob a forma de pequenas lesões necróticas, irregulares, anasarcadas, de

coloração marrom escuro, que aumentam em tamanho, sendo posteriormente

circundadas por halos amarelados, típicos da doença, e que deram origem à

denominação dessa moléstia bacteriana (Figura 1A)

Com o desenvolvimento das lesões, a bactéria se dissemina pela própria planta e

para mudas adjacentes, podendo colonizar também tecidos do caule e do ápice,

causando necrose das folhas novas e do ponteiro (Figura 1B), também, pode ocasionar

superbrotamento (Figura 1C) e, muitas vezes com morte das mudas.

Embora P. syringae pv. garcae seja a bactéria predominante em viveiros, outras

bacterioses também podem incidir nas mudas de cafeeiro, porém a frequência com que

são detectadas é baixa. Em mudas doentes, a sintomatologia das diferentes bacterioses é

similar, podendo causar dúvida no diagnóstico presuntivo do agente causal da doença.

Figura 1 - Lesões provocadas por Pseudomonas syringae pv. garcae. Lesões

anasarcadas circundadas por halo clorótico, típicas da mancha-aureolada (A). Morte de

ponteiro provocada pela bactéria (B) Superbrotamento induzido após a necrose do ápice

da muda (C).

2.2.2.2. Plantas adultas de cafeeiro

Em condições de campo, a mancha-aureolada incide principalmente em lavouras

de café em formação, na faixa de 3-4 anos de idade e em cafezais reformados com

podas e/ou sujeitos a ventos constantes e frios, especialmente após longos períodos de

A B C

8

umidade elevada. Os sintomas característicos são lesões foliares necróticas, inicialmente

anasarcadas, de coloração marrom escuro, circundadas por halo amarelado, que podem

coalescer formando extensas áreas necrosadas. A doença também ocorre em rosetas,

frutos (frutos novos são mais suscetíveis) e ramos do cafeeiro, causando queda

prematura de folhas e seca das hastes e ramos. Na tentativa de se recuperar, as plantas

emítem novos ramos, originando sintomas de superbrotamento. Ao colonizar as hastes

do cafeeiro, a bactéria interfere no pegamento das flores, o que prejudica a produção das

plantas no ano seguinte. O período chuvoso está associado com o período de expansão

do fruto do café. A infecção que ocorre nesta fase, especialmente com seca dos ramos,

provoca a queda dos frutos, e causa danos na produção (COSTA & SILVA, 1960).

ROBBS (1977; 1978) mostrou que a bactéria pode sobreviver como epífita entre

os períodos favoráveis à ocorrência da mancha-aureolada e que esta é uma das fontes de

inóculo primário para a epidemia.

2.2.2.3. Confusão da mancha-aureolada com outros distúrbios

Sintomas de lesões foliares de coloração parda circundada por halo amarelo

podem ser causados por outros patógenos do cafeeiro, tais como os fungos Cercospora

coffeicola e Phoma tarda, responsáveis pela cercosporiose e mancha de phoma,

respectivamente. Outros sintomas decorrentes da infecção por P. syringae pv. garcae,

como seca de ramos e desfolha, podem também gerar confusão no diagnóstico, uma vez

que P. tarda, ou ainda distúrbios nutricionais e/ou climáticos, podem causar sintomas

semelhantes, sendo que em condições de campo poderá haver ocorrência simultânea

com a bactéria (KIMATI et al., 2005).

É importante ressaltar a ocorrência de outras doenças de etiologia bacteriana em

cafeeiros. As seguintes espécies bacterianas: Pseudomonas cichorii, causadora do

“crestamento-bacteriano-do-cafeeiro”, detectada em viveiros e campo no Estado de

Minas Gerais (ROBBS et al., 1974) e em viveiro no Estado de São Paulo (ALMEIDA et

al., 2012b); Burkholderia andropogonis (sin. P. andropogonis), causadora da “mancha-

escura-bacteriana” (RODRIGUES NETO et al., 1981), constatada em viveiro de mudas

no Estado de Santa Catarina e P. syringae pv. tabaci causadora da “mancha-bacteriana”

(RODRIGUES NETO et al., 2006; DESTÉFANO et al., 2010), detectada em viveiro no

Estado de São Paulo, também ocasionam sintomas de manchas foliares em viveiro e/ou

campo.

9

Pesquisas sugerem a ocorrência de patotipo similar a P. syringae pv. garcae em

condições de campo no Estado do Paraná (PETEK et al., 2006). Isolamentos efetuados

recentemente a partir de folhas com sintomas de mancha-aureolada provenientes do

Paraná parecem indicar a presença de novo patotipo de P. syringae em cultivos naquele

estado (dados não publicados). Este fato implica diretamente nas medidas de manejo do

patógeno, uma vez que não há estudos relativos a esse patossistema.

2.2.3. Distribuição geográfica da mancha-aureolada do cafeeiro

Com exceção do Brasil, não foram encontrados na literatura relatos da

ocorrência de P. syringae pv. garcae em outro país do continente Americano. A

mancha-aureolada foi oficialmente detectada nas regiões produtoras de café dos Estados

de São Paulo (AMARAL et al., 1956), Paraná (KIMURA et al., 1976; MOHAN et al.,

1977) e Minas Gerais (KIMURA et al., 1976) sobretudo nas regiões Sul, Triângulo

Mineiro, Alto do Paranaíba e Cerrados (MOHAN, 1976; SERA et al., 2002; SERA et

al., 2004; PATRÍCIO et al., 2010; ZOCCOLI et al., 2011).

Além do Brasil, a doença foi diagnosticada no Quênia (HAYWARD, 1962;

RAMOS & SHAVDIA, 1976), Etiópia (KOROBKO & WONDIMIGEGNE 1997;

ADUGNA et al., 2013), Uganda (CHEN, 2002) e China (CHEN, 2002; XUEHUI et al.,

2013).

2.2.4. Pseudomonas syringae pv. garcae

Esta espécie pertence ao filo Proteobacteria, classe Gamma Proteobacteria,

ordem Pseudomonadales, família Pseudomonadaceae, gênero Pseudomonas, espécie P.

syringae, patovar garcae. Os isolados produzem discreta quantidade de pigmento

fluorescente em meio de cultura King B (KB) (KING et al., 1954) e, em meios de

cultura como Batata Dextrose Agar (BDA) e Nutriente Ágar (NA), produzem pigmento

marrom (AMARAL et al., 1956), citado por BARTA & WILLIS (2005), como sendo

melanina. KIMURA et al. (1973) descreveram a capacidade de um isolado bacteriano

de sintetizar fluoresceina em meio de Clara.

P. syringae pv. garcae é Gram negativa, com células em forma bastonetes retos

ou levemente curvados, móveis por meio de um a sete flagelos polares e medidas entre

0,5-1,0 x 1,5-4,0 µm. Pertence ao grupo I das bactérias fluorescentes [LOPAT + - - - +

10

(L= produção de Levan, O= atividade de oxidase, P= proctopectinase em discos de

batata, A= utilização de arginina dihidrolase, T= hipersensibilidade em folhas de fumo)]

(Lelliott et al., 1966). Utiliza L-ascorbato, meso-inositol, manitol, D-sorbitol, triacetina

e D-xylose, porém não utiliza L-histidina, DL-homoserina, DL-lactato, α-lecitina,

linolenato, L-malate, D(-) tartarato ou L(+) tartarato (BRADBURY, 1986).

De acordo com COSTA et al. (1957) e BRADBURY (1986), as hospedeiras

naturais são plantas de diversas espécies do gênero Coffea. Sintomas foram obtidos por

meio de inoculação artificial em citrus (Citrus spp.), ligustro (Ligustrum lucidum),

tomateiro (Solanum lycopersicum), oliveira (Olea europea), feijoeiro (Phaseulus

vulgaris), jurubeba (Solanum paniculatum var. acutilobum), batata (Solanum

tuberosum) (BRADBURY, 1986). No entanto, cabe ressaltar os resultados de testes de

patogenicidade obtidos por KIMURA et al. (1973), no qual os autores contestaram a

patogenicidade de P. syringae pv. garcae em diversas hospedeiras, uma vez que os

sintomas por eles observados foram devidos à reação de hipersensibilidade. Por este

motivo, KIMURA et al. (1973) concluíram que a gama de hospedeiros da bactéria é

restrita a cafeeiros.

BARTA & WILLIS (2005), também por meio de inoculações artificiais,

obtiveram sintomas de P. syringae pv. garcae em aveia (Avena sativa). Entretanto, não

se tem registro de infecção natural em todas as espécies de plantas citadas.

RIEMKE et al. (1978) demonstraram que P. syringae pv. garcae é capaz de

utilizar nitrato de sódio, uréia e sulfato de amônio, na presença de sacarose como fonte

de carbono, por isso os autores concluíram que a bactéria possui potencial para provocar

danos ao metabolismo nitrogenado do cafeeiro e que adubações nitrogenadas via foliar

podem servir como substrato para o patógeno, bem como, melhorar as condições de

sobrevivência como epífita nas folhas de cafeeiros, fato demonstrado por ROBBS

(1978).

Com relação às características morfofisiológicas da bactéria, pesquisadores do

Quênia, país onde a doença está presente em muitos cafezais, demonstraram que os

isolados bacterianos lá obtidos diferem do isolado patotipo (brasileiro) em relação a

características bioquímicas, produção de bacteriocinas e quanto à virulência em C.

arabica cv. SL 28, na qual apenas os isolados quenianos foram capazes de produzir

sintomas da doença. Outra diferença importante observada está relacionada à produção

11

de pigmentos em meio de cultura, uma vez que os isolados quenianos produziram maior

quantidade de pigmento amarelo-esverdeado em meio KB quando observados sob luz

ultra violeta, quando comparados com isolados brasileiros, que produzem menores

quantidades de pigmento azulado. No entanto, isolados brasileiros produziram pigmento

marrom difusível em meio de cultura básicos (Amaral et al., 1956; KAIRU, 1997),

indicando a grande diversidade genética e a possibilidade da existência de variabilidade

intraespecíficas entre isolados dos dois países.

Pesquisas realizada por BARTA & WILLIS (2005) revelaram alta similaridade

nos padrões moleculares, obtidos por meio digestão do DNA total com enzima de

restrição, entre linhagens de P. syringae pv. coronafaciens, agente causal da “mancha-

de-halo-amarelo” em aveia (Avena sativa), P. syringae pv. striafaciens, causadora da

“mancha-estriada” aveia e P. syringae pv. garcae. Semelhanças também foram

observadas em testes fisiológicos para utilização de fontes de carbono aplicados as

patovares acima mencionadas e por teste de patogenicidade em aveia observadas por

BARTA & WILLIS (2005). A produção de tabtoxina (BENDER et al., 1999), foi

deficiente para a patovar striafaciens, entretanto devido à proximidades do conjunto de

dados obtidos, os autores propuseram que a taxonomia entre essas patovares seria

redundante, sendo elas um só patovar.

Sobre a infecção pela bactéria, estudos apontaram diferenças na agressividade

entre folhas novas (não expandidas) e velhas (a partir do primeiro par, completamente

expandidas). OLIVEIRA & ROMEIRO (1990) provaram por meio de inoculações

artificiais na cultivar Catuaí, que folhas velhas são menos afetadas pelo patógeno, fato

esse confirmado posteriormente por ZOCOLLI et al. (2011). Ensaios subsequentes de

difusão em gel, realizados por OLIVEIRA & ROMEIRO (1991), demonstraram que

extrato obtido a partir de folhas velhas foram capazes de inibir o crescimento in vitro de

P. syringae pv. garcae. A bactéria se multiplica dez vezes mais em folhas novas, em

comparação com as folhas velhas, na qual a fase lag de crescimento é mais curta

(OLIVEIRA et al., 1991).

Estudos realizados por MACIEL (2013) analisando a diversidade genética de P.

syringae pv. garcae de origem nacional e incluindo alguns isolados quenianos, por meio

da técnica molecular e de rep-PCR, resultou na formação de dois grupos distintos, com

relação à origem dos isolados. O grupo menor foi composto pelos isolados oriundos do

Quênia. Os isolados de origem brasileira formaram um grupo maior, composto por

12

subgrupos que alocaram as linhagens por região de origem, ou seja, São Paulo e Minas

Gerais já que isolados do Estado do Paraná não foram utilizados no estudo.

É importante também, ressaltar a ocorrência de mutantes bacterianos que

apresentaram resistência a produtos fitossanitários. A primeira constatação desse fato

foi realizada por MOHAN (1977). O autor verificou em isolamentos a partir de plantas

com sintomas oriundas de viveiro com aplicações de estreptomicina, colônias capazes

de crescerem na presença de 100 ppm do produto. Testes com concentrações maiores

revelaram alta resistência ao antibiótico, que cresceu em meio de cultura com o produto

na dosagem de 10.000 ppm.

Recentemente YAMADA et al. (2014b) avaliaram a tolerância de 55 isolados de

P. syringae pv. garcae provenientes do sul do Estado de Minas Gerais ao sulfato de

cobre (CuSO4). Cinco isolados bacterianos foram capazes de tolerar a maior

concentração utilizada (0,25 mM), enquanto que menos da metade dos isolados

cresceram na concentração de 0,15 mM e três isolados apresentaram alta sensibilidade

ao sulfato de cobre, desenvolvendo-se apenas na sua ausência. Também, YAMADA et

al. (2014a), por meio de PCR com primers específicos, identificaram no DNA

plasmidial o gene de resistência ao cobre cop A em 53 dos 55 isolados de P. syringae

pv. garcae testados. Estes resultados implicam na estratégia para o manejo da mancha-

aureolada, pois, a facilidade para seleção de genes de resistência ao cobre em

populações do patógeno, resultará na busca de novas formas de controle dessa doença.

2.2.5. Controle da mancha-aureolada-do-cafeeiro

Quando a doença é constatada no cafezal, seu controle torna-se bastante

complexo. Exemplo da dificuldade do manejo está descrito em trabalhos publicados por

COSTA & SILVA (1960). Os autores relataram ligeira recuperação das plantas em

cafezal altamente afetado, onde foram aplicados produtos contendo como princípio

ativo sais de cobre, embora tenham sido necessárias 24 pulverizações com intervalo de

cinco dias.

De acordo com PARADELA et al. (2000), para o controle da mancha-aureolada

em viveiros de mudas, devem ser realizadas aplicações quinzenais de produtos contendo

como o antibiótico cloridrato de casugamicina, na dosagem de 300 mL do produto

comerial com 2% do principio ativo (P.A.), para 100 L de água. As aplicações devem

13

ser intercaladas com oxicloreto de cobre (0,3%), evitando-se a seleção e proliferação de

bactérias resistentes ao antibiótico.

Experimentos conduzidos por PATRICIO et al. (2010), avaliaram o efeito de

tratamentos químicos para o controle da mancha-aureolada em região montanhosa no

município de Caconde, SP. Houve redução da doença nas parcelas pulverizadas com

casugamicina (1,5 L/ha), casugamicina (1,5 L/ha) + hidróxido de cobre (2,5 kg/ha),

entre outros, tendo sido empregados óleos vegetais e minerais, adesivo siliconado e

acibenzolar-S-methyl. No entanto, independentemente dos produtos utilizados, os

autores observaram maior incidência da doença nas parcelas expostas à ação dos ventos,

indicando que a implementação de quebra-ventos é muito importante para o manejo da

doença.

Atualmente os produtos registrados no MAPA para controle da mancha-

aureolada se restringem ao hidróxido de cobre e também ao antibiótico casugamicina, o

qual é indicado para utilização apenas em vieiro de mudas (AGROFIT, 2015).

2.2.6. Resistência genética de cafeeiros a Pseudomonas syringae pv. garcae

Estudos realizados por MORAES et al. (1974; 1975), por meio de inoculações

artificiais com agulhas múltiplas, detectaram resistência a P. syringae pv. garcae nas

variedades exóticas de C. arabica Harar, Dilla & Alghe. S. 12 Kaffa e Geisha.

Posteriormente, MOHAN et al. (1978), em estudo semelhante, além das variedades

Semierecta e Ennarea de C. arabica, também detectaram resistência à doença nas

espécies C. congensis, C. eugenioides, C. stenophylla e C. canephora, pertencentes ao

banco de germoplasma de Coffea spp. do IAPAR (Instituto Agronômico do Paraná). A

pesquisa revelou ainda que dentre 138 introduções de C. arabica provenientes da

Etiópia, 38 apresentaram alto grau de resistência à mancha-aureolada.

Pesquisas realizadas por SERA et al. (1980), CARDOSO & SERA (1983),

PETEK et al. (2001), SERA et al. (2002), PETEK et al. (2006) e ITO et al. (2007;

2008), em cafeeiros expostos à ocorrência natural da doença, resultaram na seleção da

cultivar IPR 102, resistente a P. syringae pv. garcae.

Dentre o germoplasma avaliado por MORAES et al. (1975), as variedades

exóticas de C. arabica de origem etíope, conhecidas como Harar, Dilla & Alghe, S 12

Kaffa e Geisha, apresentaram resistência a P. syringae pv. garcae sendo todas elas

portadoras do alelo SH1.

14

Segundo CARVALHO (1988), a resistência múltipla à ferrugem e à mancha-

aureolada apresentada por essas variedades exóticas, poderia ser explicada por ligação

gênica (linkage) entre alelos de resistência a ambos os patógenos ou pelo efeito

pleiotrópico do alelo SH1. SERA (2001) e FAZUOLI et al. (2009) também atribuíram

ao alelo SH1 presente nas variedades etíopes (BETTENCOURT & CARVALHO, 1968),

avaliadas por MORAES et al. (1975), responsável pela resistência simultânea a algumas

raças de H. vastatrix e a P. syringae pv. garcae.

Segundo BETTENCOURT & CARVALHO (1968), o alelo SH1 é bastante

difundido nas principais zonas cafeeiras da Etiópia. Estudos conduzidos pelos autores

permitiram sua identificação em seleções diversas como Barbuk Sudan, BE-2 Ghembi,

BE-4 Ennarea, BE-5 Wush-Wush, BE-6 Moderalo, BE-7 Boggia, BE-8 Era, BE-14

Loulo, Dilla & Alghe, Geisha, Lejeune's, S 6 Cioiccie, S 9 Arba Gougou, S 12 Kaffa, S

17 Yrgalem, U l Dalecho, ocorrendo tanto isoladamente, como em associação com

outros genes de resistência, como SH4 (SH1 SH4), SH5 (SH1 SH5) e SH4 e SH5 (SH1 SH4

SH5) e que conferem resistência a 16 das 24 raças de H. vastatrix.

2.2.6.1. Métodos para avaliação da resistência à mancha-aureolada

A inoculação artificial de P. syringae pv. garcae tem sido efetuada a partir de

diferentes métodos como, infiltração, ferimento por agulhas múltiplas, fricção com

carborundum, aspersão (COSTA et al., 1957), corte com tesoura, infiltração,

atomização (OLIVEIRA & ROMEIRO, 1990); deposição de gota do inóculo seguido de

punctura com agulha ou com corte por lâmina e ainda, pela combinação entre eles

(ITHIRU et al., 2013). No entanto, apenas os trabalhos conduzidos por ITHIRU et al.

(2013) visaram a seleção de plantas com resistência a P. syringae pv. garcae. Os

autores verificaram variação nos resultados obtidos entre os métodos testados, embora

ambos possam ser utilizados para este fim.

2.3. Melhoramento genético de Coffea arabica

2.3.1. Classificação botânica, origem e características de Coffea arabica

Os cafeeiros têm como centro de origem a região da Abissínia, atual Etiópia

(CHEVALIER, 1947) e pertencem a família Rubiaceae, gênero Coffea, cuja

15

classificação taxonômica atual admite 124 espécies (DAVIS et al., 2011). Destas,

apenas três possuem importância econômica, C. arabica Linnaeu (café arábica), C.

canephora Pierre ex A. Froehner (café canephora, robusta ou conilon) e C. liberica

Bull. ex Hiern (café libérica ou excelsa) (DAVIS et al., 2006), com imensa

predominância das duas primeiras.

Coffea arabica, a principal espécie em importância econômica, é anfidiploide,

alotetraploide (2n = 4x = 44 cromossomos) resultado da provável hibridação natural

entre as espécies C. canephora e C. eugenioides (LASHERMES et al., 1999). Devido às

divergências genéticas existentes entre as espécies LASHERMES et al. (1999)

sugeriram que a hibridação ocorreu provavelmente na região da África Central. Os

autores demonstraram por meio de hibridação genômica in situ que, o genoma de C.

arabica é composto pela combinação de dois grupos cromossômicos e, ainda, utilizando

sondas específicas de DNA puderam identificar as espécies C. canephora e C.

eugenioides como parentais.

É conhecido que a espécie C. arabica é nativa da região entre o sudeste da

Etiópia, Sudeste do Sudão e Norte do Quênia em altitudes que variam de 1.000 a 3.000

metros (CARVALHO, 1946). Plantas desta espécie desenvolvem-se melhor em regiões

de clima ameno, com temperatura média entre 18,5 e 21,4° C, precipitação entre 1.200 e

2.000 mm e períodos de estiagem entre 3 a 4 meses (NARASIMHASWAMY, 1968).

Plantas de C. arabica são arbustos, com um ramo ortotrópico com até 4 metros

de altura, sendo sua base genética pouco diversificada devido à reprodução por

autofecundação, de modo que, as variedades Típica e Bourbon são genitoras da maioria

das cultivares atualmente utilizadas (ANTHONY et al., 2002). Apesar da baixa taxa de

fecundação cruzada (5-10%), ampla variabilidade morfológica em variedades de C.

arabica é reconhecida devido à ocorrência de hibridações naturais e mutações (KRUG

et al., 1939; CARVALHO, 1969; CARVALHO, 2007).

2.3.2. Histórico, métodos e perspectivas

Os primeiros cafeeiros trazidos para o Brasil são provavelmente originários de

uma única planta matriz, cultivada no Jardim Botânico de Amsterdam, Holanda. Por

este motivo, CARVALHO & FAZUOLI (1993) trataram os primeiros cultivos de café

16

nacionais como uma enorme progênie de apenas um cafeeiro. Essa cultivar ficou

conhecida pelos nomes de Arábica, Nacional, Típica ou Crioulo (CARVALHO, 1997).

No ano de 1870 mutações do cafeeiro Típica foram observadas no município de

Maragogipe, Estado da Bahia, resultaram na seleção da variedade Maragogipe, que

possui grãos maiores em relação à cultivar de Típica (MÔNACO, 1960). No ano

seguinte, outra mutação foi observada em Botucatu, Estado de São Paulo, onde plantas

que produziam frutos de coloração amarela, as quais foram selecionadas e resultaram na

variedade Amarelo de Botucatu. Contudo, essas seleções foram pouco cultivadas, por

apresentarem menor produtividade em relação à cultivar Típica (CARVALHO &

FAZUOLI, 1993).

Em 1930, foi encontrada no município de Pederneiras, Estado de São Paulo,

uma variedade de cafeeiro bastante promissora em produtividade, denominada Bourbon

Amarelo, originada presumivelmente do cruzamento natural entre as variedades

Bourbon Vermelho e Amarelo Botucatu (CARVALHO et al., 1957). Treze anos mais

tarde foi descrita a cultivar Mundo Novo, encontrada no município de Urupês, Estado

de São Paulo, tendo como origem provável, a hibridação natural entre Bourbon

Vermelho e Sumatra (CARVALHO et al., 1952), esta última, introduzida no Brasil no

ano de 1896 (KRUG et al., 1939).

Outras mutações do cafeeiro com elevada importância econômica, designadas de

Caturra Vermelho e Caturra Amarelo, foram originadas no Estado de Minas Gerais,

cujas sementes foram enviadas e cultivadas no Vale do Caparaó (Estado do Espírito

Santo) e, posteriormente em 1937, ao Instituto Agronômico (IAC). Esta mutação

derivou-se a partir da cultivar Bourbon Vermelho, e tem como principal característica a

redução do comprimento dos internódios, levando à redução de porte das plantas. Foi

descoberto por KRUG et al. (1949), que esta característica é governada por um par de

alelos.

O Instituto Agronômico (IAC) foi o pioneiro em estudos envolvendo seleção de

linhagens mais produtivas, e com características agronômicas desejáveis. Em 1931,

instalou-se nessa instituição um experimento com as cultivares em evidência na época,

ou seja, Típica, Amarelo Botucatu, Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Maragogipe

e Sumatra, visando seleção de variedades mais produtivas, além de outras características

como, época de maturação e tamanho de sementes (MENDES, 1951). Em paralelo,

17

diversos estudos foram conduzidos a fim de se elucidar aspectos da biologia da

reprodução, citológicos e genética de características (MENDES & KRUG, 1938;

KRUG, 1939).

Segundo MEDINA FILHO et al. (1984), dentre as estratégias aplicadas ao

melhoramento genético do cafeeiro, faz parte a introdução de plantas, seleção de plantas

individuais e posterior teste de progênies e o avanço das gerações dado pelo método

genealógico, podendo estar associado à retrocruzamentos. Também, por meio de

seleção de plantas individuais, seguida de teste de progênie é possível obter bons

resultados no melhoramento de cafeeiros. Esse método tem como pretexto a existência

de variabilidade genética entre plantas de uma mesma cultivar (BONOMO, 2002).

Em meados dos anos 40, foi instalado no IAC ensaios com a cultivar Mundo

Novo, realizando-se seleções entre e dentro das progênies, as quais foram consideradas

bastante efetivas (FAZUOLI, 1977; CARVALHO 2007), resultando em linhagens

produtivas, vigorosas e adaptadas às diversidades climáticas. Uma delas destacou-se por

apresentar características similares à Mundo Novo, porém com sementes maiores e alta

produtividade de sementes, dando origem à cultivar denominada Acaiá.

No contexto do melhoramento, um grande programa de hibridações inter e intra

específicas foi iniciado na década de 30. Os cruzamentos entre as cultivares de

C. arabica Caturra Amarelo e Mundo Novo, realizados em 1949, seguidas de diversas

seleções, viriam a gerar em 1972 as cultivares Catuaí Vermelho e Catuaí Amarelo, cujas

características incorporam rusticidade, alta produção, porte reduzido e boa qualidade de

bebida (CARVALHO & MÔNACO, 1972; CARVALHO, 2008).

Pesquisas desenvolvidas pelo pesquisador científico Dr. Alcides Carvalho foram

imprescindíveis para garantir a produção brasileira de café. Seleções de progênies do

híbrido entre C. canephora cv. Robusta (tetraploide) e C. arabica cv. Bourbon

Vermelho retrocruzado com C. arabica cv. Mundo Novo deram origem à cultivar Icatu,

que apresenta genes de resistência a algumas raças de H. vastatrix (FAZUOLI, 1991).

Dependendo da distância genética entre as plantas matrizes, deve-se realizar

retrocruzamentos sucessivos a fim de transferir a característica almejada, sem deixar

vestígios indesejáveis na cultivar comercial resultante. Essa estratégia vem sendo

utilizada na seleção de plantas resistentes ao bicho-mineiro (Leucoptera coffeella),

18

onde, híbridos interespecíficos entre C. arabica e C. racemosa estão sendo submetidos a

retrocruzamentos sucessivos com a espécie arábica. Neste caso, a seleção de plantas é

dificultada pela existência de ampla variabilidade genética nas progênies, sendo

necessária a avaliação de um grande número de plantas, para conciliar as características

de resistência ao inseto, à ferrugem, boa produtividade e qualidade de bebida ente outras

características de interesse (GUERREIRO FILHO et al., 1990; GUERREIRO FILHO,

2006; CARVALHO, 2007).

Uma das principais vantagens da utilização de acessos de C. arabica para o

programa de melhoramento genético (PMG) é a sua estreita relação genética com as

cultivares comerciais, característica maior que proporciona facilidade na obtenção de

plantas hibridas e na eliminação de plantas com características indesejáveis.

As introduções de C. arabica provenientes da Etiópia (FAO, 1968) são parte da

reserva genética da espécie, e têm grande importância para o melhoramento de plantas,

bem como, para a conservação do germoplasma da espécie. Na década de 50,

conhecendo a rápida disseminação e a devastação causada pela ferrugem-do-cafeeiro

(H. vastatrix) na Ásia e, o risco à cafeicultura brasileira, foram introduzidos no IAC

sessenta e sete acessos supostamente resistentes ao fungo. Em 1956, uma parceria foi

iniciada entre o IAC e o Centro de Investigações das Ferrugens do Cafeeiro (CIFC) –

Oeiras, Portugal, com a finalidade de manter intercâmbio de informações sobre aquele

patossistema (CARVALHO, 1988).

Essas introduções compõem importante fonte de genes de resistência a P.

syringae pv. garcae, como demostrado por MOHAN et al. (1978).

2.4. Mecanismos de resistência de plantas a patógenos

As plantas desenvolveram durante sua evolução, mecanismos para contornar as

adversidades do ambiente em que vivem, para que perpetuem sua espécie. Mecanismos

de defesa contra herbivoria, poluentes, fatores climáticos, competição com outras

plantas e ataque de patógenos, podem se manifestar de forma diversa como gomas,

espinhos, substâncias tóxicas e/ou detoxificadoras. Os mecanismos de resistência são

classificados como estruturais ou bioquímicos e, em ambas as formas podem estar

presentes antes ou após o reconhecimento do agente agressor (AGRIOS, 2005).

19

A resposta de defesa acontece com a ativação de uma complexa rede de sinais,

os quais, por efeito cascata, desencadeiam diversas vias, interligadas ou não, cujas

combinações determinam ações como restrição do fluxo de água no local da infecção

com consequente morte de células do tecido vegetal, o confinamento e a morte do

patógeno. Essas ações metabólicas podem atuar concomitantemente com a produção e o

acúmulo de compostos tóxicos aos invasores.

Um dos mecanismos de resistência de plantas a patógenos com funções

conhecidas são os genes de resistência (R). De maneira geral, genes de avirulência (avr)

e genes de patogenicidade (P) por parte do patógeno são reconhecidos por receptores

das plantas hospedeiras que dispõem de genes R e de resposta defensiva (PR) para se

defender do ataque do agente patogênico. Os genes R são aqueles relacionados com a

detecção de sinais ou elicitores do patógeno (DIXON & HARRISON, 1990).

Os genes avr e R, evoluiram reconhecidamente seguindo a teoria gene-a-gene,

proposta por Flor (BISHOP et al., 2000), por isso, é associada à resistência a patógenos

específicos. Segundo DANGL & JONES (2001), as vias de defesa desencadeadas pelos

genes R culminam num efeito cascata que resulta em uma rajada oxidativa, que por fim,

ocasionam o acúmulo de óxido nítrico (ON), superóxidos e peróxidos de hidrogênio,

induzindo reação de hipersensibilidade (HR) e/ou associações ligadas à produção de

metabólitos antimicrobianos.

Em contrapartida, os genes PR desencadeiam a expressão de moléculas que

constituem um sistema protetor nas plantas. As formas mais comumente notadas são: os

compostos fenólicos depositados na parede celular das plantas hospedeiras, conhecidos

principalmente pela ação antifúngica e antiviral; a síntese de fitoalexinas, consideradas

como biocidas ou metabólitos secundários tóxicos a fungos, bactérias, nematoides,

plantas e animais, produzidos e acumulados logo após a exposição do hospedeiro ao

patógeno DIXON & HARRISON, 1990; STANGARLIN et al., 2011) e as proteínas

relacionadas à patogênese (proteínas RP), principais compostos induzidos após a

ocorrência de reação de hipersensibilidade dos tecidos vegetais (GIANINAZZI &

MARTIN, 1970). GRAHAM & GRAHAM (1991) salientam que, estas proteínas RP

são constitutivas do tecido vegetal, estando presentes em baixas concentrações. Desta

forma, a síntese ou acúmulo de fitoalexinas e proteínas RP é resultado da indução por

patógenos e/ou agentes eliciadores. De modo geral, após o reconhecimento de elicitores

20

de patógenos, como a proteína flagelina, componente dos flagelos das bactérias, ou

ainda proteínas específicas codificadas por genes de avirulência (MARTIN et al., 2003),

são desencadeadas respostas de defesa que compreendem, entre outros processos, a

síntese de proteínas PR, que estão classificadas em 17 famílias, conforme suas funções

na resistência das plantas aos patógenos (GORJANOVIĆ, 2009).

O reconhecimento da virulência do patógeno por plantas hospedeiras acontece

mediante padrões moleculares associados aos patógenos chamados de PAMPs

(Pathogen Associated Molecular Patterns) ou MAMPs (Microbe Associated Molecular

Patterns) (BOLLER & FELIX, 2009). Proteínas presentes na membrana das células

vegetais atuam como receptoras de reconhecimento de padrões, PRRs (Pattern

Recognized Receptors), sinalizando PAMPs/MAMPs (BOLLER & FELIX, 2009).

Após a ativação do sistema de defesa, uma complexa rede de sinais resultará em

HR, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), síntese de proteínas RP,

compostos como fitoalexinas, suplemento da parede celular como lignificação e caloses

e, por fim, podem resultar em resistência sistêmica adiquirida (SAR) ou induzida.

Resultados obtidos por JOHANSSON (2015) a respeito da sinalização contra P.

syringae, revelaram que entre os eventos ocasionados mais precocemente estão

incluídos o fluxo de íons Ca2+, a resposta por rajada oxidativa, a ativação de proteína-

quinases ativadas por mitógeno (MAPKs), seguida pela expressão de genes que regulam

a síntese de substâncias antagonistas ao patógeno. As respostas mais tardias estão

relacionadas à uma rede complexa de sinalização de fito-hormônios, sendo os principais

o ácido salicílico (AS), o jasmonato (JA) e o etileno (ET) (GIMENEZ-IBANEZ &

RATHJEN, 2010). O modelo idealizado por JOHANSSON (2015) ilustra as respostas

basais de defesa (Figura 2).

21

Figura 2 - Modelo da sinalização dos sinais de JOHANSSON (2015) representando o

efeito cascata ocorrido após o reconhecimento do patógeno em algumas possível vias de

defesa, iniciada pela ativação dos fluxos de cálcio, MAPKs e, pela sinalização de

espécies reativas de oxigênio (ROS), fosfolipase, óxido nítrico (ON), etileno, jasmonato

(JA) e ácido salicílico (SA).

22

Outro mecanismo de imunidade nas plantas é o silenciamento gênico mediado

por pequenas sequências de RNAs, que podem causar degradação dos transcritos

relacionados aos receptores do hormônio auxina sendo que esta redução da auxina

auxilia na restrição do crescimento de P. syringae em Arabdopsis (NAVARRO et al.,

2006).

A determinação da atividade de compostos associados a estresses é uma

ferramenta que auxilia no conhecimento da resposta de tolerância e resistência a fatores

abióticos e bióticos diversos.

GUZZO (2004) investigou o comportamento das enzimas quitinases e β-1,3-

glucanases em plantas de C. arabica cv. Mundo Novo tratadas com acibenzolar-S-metil

(ASM) e sua correlação com a redução da severidade da ferrugem. Os resultados

indicaram que o incremento na atividade dessas enzimas pode estar associado à

resistência local e a resistência sistêmica adquirida (RSA), induzidas pelo ASM.

A RSA é iniciada no local da infecção mas, é observada em tecidos distantes. A

ocorrência da RSA requer o acúmulo de acido salicílico (AS) e ocasiona acúmulo de

proteínas RP. O gene NPR1 (nonexpressor of PR-1) funciona como sinalizador do

acúmulo de AS por meio da interação com outros fatores de transcrição (DURRANT &

DONG, 2004).

Em berinjeleira, ZHOU et al. (2012) estudaram a relação da atividade das

enzimas catalase, polifenoloxidase, peroxidase, fenilalanina amônia-liase e superóxido

dismutase, na severidade da murcha-de-verticilium (Verticillium dahliae), em quatorze

cultivares de berinjela, com diferentes níveis de resistência. Os autores verificaram

correlações significativas entre a atividade das enzimas polifenoloxidase, peroxidase e

fenilalanina amônialiase e a resistência ao patógeno, de modo que, os níveis dessas

enzimas podiam atuar como indicadores da resistência em auxílio a programas de

melhoramento genético.

Outra abordagem sobre o assunto se relaciona ao uso de técnicas de biologia

molecular, às quais deram origem a informações importantes e mais refinadas sobre o

mecanismo de reconhecimento e defesa contra fitopatógenos, bem como, a ativação e

tradução de sinais originados pelos genes de defesa (CRAMER et al., 1993,

SILVESTRINI et al., 2005a).

23

Estudos aplicando a genética molecular em cafeeiros evoluíram rapidamente,

especialmente após inúmeros trabalhos envolvendo sequenciamento, que originaram

uma biblioteca de ESTs (Expressed Sequence Tags), das espécies C. arabica, C.

canephora e C. racemosa (disponível em: http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe). Com

esse estudo, foi possível identificar dentro das ESTs, 33.000 unigenes diferentes. Essa

ferramenta genômica possibilita a condução de estudos relacionados a inúmeros fatores

associados à condições de estresse, as quais os cafeeiros são submetidos constantemente

na natureza (VIEIRA et al., 2006).

Uma das vertentes que o sequenciamento do genoma funcional do cafeeiro

permitiu é que, a partir das sequências dos genes, existe a possibilidade de se

“desenhar” primers específicos e estudar a expressão das ESTs que estão associadas a

processos metabólicos específicos sob diversas condições, como é o caso do estresse

causado pela ofensiva de fitopatógenos.

A técnica de qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real) vem sendo utilizada

com sucesso para análises de expressão de genes que possuem importante papel na

resistência a pragas e doenças. Esse tipo de reação ocorre em termociclador com sistema

ótico, o qual permite decifrar a excitação da fluorescência emitida pelas amostras, e

desse modo, um software específico é capaz de quantificar a expressão gênica. Durante

os ciclos iniciais da reação é formada uma linha de base (baseline), útil para o gráfico

das amplificações e, em seguida, é definido o parâmetro Ct (cycle threshold),

determinando como o ciclo em que a flourescência ultrapassa a linha de base. As

análises de expressão relativa são baseadas nos valores de Ct obtidos no sistema

computacional, sendo por isso possível avaliar a expressão de um mesmo gene em

diferentes tecidos vegetais, e/ou, em situações de estresse causados por fatores bióticos

ou abióticos (APPLIED BYOSISTEMS).

VINECKY et al. (2011) estudaram a expressão gênica de 14 genes candidatos

para a tolerância à seca em quatro genótipos de C. canephora, por meio de qRT-PCR.

Por meio das análises de expressão relativa, os autores verificaram que grande parte dos

genes selecionados apresentaram expressão diferencial na condição de estresse hídrico,

e ainda, ocorreram diferenças no padrão da expressão observados entre os genótipos,

dando suporte à hipótese da existência de outros mecanismos associados à tolerância à

seca.

http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe

24

Alguns estudos demonstraram estreita ligação entre os genes EDS1 e PAD4 em

resposta à infecção contra fitopatógenos. Segundo AARTS et al. (1998), o gene EDS1 é

requerido durante a sinalização pela TIR-NBS-LRR, uma classe de proteína R, que

apresenta um sítio rico em repetições de leucina. Posteriormente, estudos indicaram a

atuação do gene PAD4, em conjunto ao EDS1, na sinalização da via do AS (FEYS et

al., 2005).

Sabe-se que, plantas de Arabidopsis mutadas para deficiência do gene EDS1

mostram aumento na suscetibilidade a Peronospora parasítica, agente causal do míldio

em brássicas (PARKER et al., 1996). Outro estudo demonstrou que os componentes

EDS1 e PAD4 apresentam importante papel na sinalização e morte celular mediada pelo

gene lsd1 (lesions simulating disease resistance response), em Arabidopsis inoculadas

com o fungo P. parasitica (RUSTÉRUCCI et al., 2001). Ainda, os autores

demonstraram diferenças na deposição de superóxido nas margens das lesões nas

plantas mutantes, ausentes do gene lsd1. Estudos mais recentes, desenvolvidos por

WIERMER et al. (2005), evidenciaram a atuação do gene SAG101 (Senescence

Associated Gene 101), em conjunto em EDS1 e PAD4 mediando a resposta de

resistência via AS.

A enzima β-1,3-glucanase possui importante atução na resistência de plantas a

fitopatógenos. ANDRADE et al. (2013), observaram que plantas de tomate tratadas

com ácido jasmônico, etileno ou acibenzolar-S-metil produziram maiores quantidades

das enzimas peroxidase, polifenoloxidase, lipoxigenase e β-1,3-glucanase, resultando

em menor expressão dos sintomas da pinta bacteriana causada por P. syringae pv.

tomato.

Com relação à expressão de genes em resposta à infecção por nematoides da

espécie Meloidogyne exigua, SILVESTRINI et al. (2005a) analisaram a amplificação de

transcritos dos genes ligados a resistência contra fitopatógenos, superóxido dismutase,

WIPK (fator de transcrição WipkA), glucanases e proteínas de resistência ResproB e

5RM1, em plantas de C. arabica cv. Icatu segregantes para resistência ao fitonematoide.

De acordo com os autores, os genes apresentaram expressão basal, mesmo nas plantas

não infectadas, ou seja, os genes testados não apresentaram variações significativas na

expressão.

25

Recentemente, FATOBENE (2014) analisou a expressão relativa de 12 genes em

resposta à infecção por Meloidogyne paranaensis em genótipos de cafeeiros

contrastantes classificados como resistentes e suscetível ao nematoide. Seis dos genes

estudados participam das funções relacionados à resistência de plantas a patógenos, três

ao metabolismo antioxidante e três associados a funções do ciclo celular. Foi relatada

ativação dos genes de defesa EDS1, PAD4, LTP e NPR1 em resposta à infecção, e por

este motivo, a autora concluiu que o mecanismo de defesa do cafeeiro a M. paranaensis

está relacionado com a via do AS, uma vez que os genes citados atuam na referida rota

metabólica.

3. MATERIAL E MÉTODOS


Pseudomonas syringae pv. garcae

3.1.1. Material vegetal, inoculação e condições experimentais

Mudas de cafeeiros da cultivar Mundo Novo IAC 376-4, com aproximadamente

seis meses de idade, tiveram folhas do terceiro internódio inoculadas por meio de

puncturas, com alfinete entomológico #00 previamente mergulhado em suspensão

bacteriana de P. syringae pv. garcae, proveniente do isolado IBSBF 1197, na

concentração de 3x108 UFC.mL-1, em dois pontos de cada lado da nervura central. Um

tratamento controle foi estabelecido com folhas punciondas com os alfinetes

entomológicos, previamente mergulhados em solução salina.

O experimento foi conduzido em modelo inteiramente casualizado com arranjo

fatorial 2x3, sendo o período de desenvolvimento da doença (2) e o tecido infectado (3)

os efeitos procipais do modelo. As parcelas de plantas inoculadas foram representadas

por uma muda em cinco repetições e as parcelas controle, por uma planta em três

repetições.

Avaliou-se a magnitude do dano pela mensuração do maior (L1) e do menor

comprimento (L2) das lesões, externamente, na epiderme e, internamente, nos

parênquimas paliçádico e esponjoso, aos 10 e 20 dias após a inoculação (DAI).

26

3.1.2. Análises histopatológicas

Características histopatológicas da infecção de folhas de C. arabica, por P.

syringae pv. garcae, foram estudadas por meio de análises anatômicas sob microscopia

de luz. Lesões observadas em folhas aos 10 e 20 DAI foram recortadas, fixadas em

solução FAA (formaldeído-ácido acético-álcool etílico 50%) (JOHANSEN, 1940) e

submetidas à vácuo por 48 horas, sendo posteriormente desidratadas em série alcoólica-

etílica e incluídas em parafina. Foram realizadas secções transversais e paradérmicas em

micrótomo rotativo manual a 12 µm com posterior distensão e colagem com adesivo

Haupt (JOHANSEN, 1940). As lâminas foram coradas com safranina, seguido por azul

de alcian, montadas em adesivo “Permount”. As análises foram realizadas utilizando-se

de microscópio óptico Leica, modelo DMLB acoplado a uma câmera de captura de

imagens e posterior análise no programa Motic Image Plus.

Para determinar a extensão do dano provocado pela bactéria nas estruturas do

mesofilo, mensurou-se, a partir dos cortes transversais, o maior (L1) e o menor (L2)

comprimento do tecido afetado, provocado pelas bactérias, nos parênquimas paliçádico

e esponjoso, separadamente. As análises estatísticas dos dados obtidos foram realizadas

com auxílio do software Statistica 7.0. Para comparação das médias do tamanho das

lesões, utilizou-se o teste de Student-Newman-Keuls (STELL & TORRIE, 1980),

adotando-se nível de significância igual a 5%.

3.2. Natureza e agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae

3.2.1. Isolados bacterianos utilizados no estudo

Dezenove isolados bacterianos foram utilizados no estudo. Todos são oriundos

da Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico (IBSBF

http://www.biologico.sp.gov.br/pdf/catalogo_IBSBF.pdf) (Tabela 1) e foram

selecionados pela região geográfica de origem.

http://www.biologico.sp.gov.br/pdf/catalogo_IBSBF.pdf

27

Tabela 1 - Identificação, local de origem, ano de isolamento e planta hospedeira dos

isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae e relação dos experimentos em que foram

utilizados.

Isolado Origem Ano Hospedeira Experimento

IBSBF 65 =NCPPB 3030

Jaú - SP 1976 C. arabica cv.

Catuai 1,2,3

IBSBF 75 Pirajú - SP 1977 1,2,3

IBSBF 248P

=NCPPB 588 Garça - SP 1956 1,2,3

IBSBF 1197 Campinas - SP 1995 1,2,3

IBSBF 1293 Guaxupé - MG 1997 1,2,3

IBSBF 1372 Cristais Paulista - SP 1998 1,2

IBSBF 1664 Serra Negra - SP 2001 1,2

IBSBF 2212 Franca - SP 2005 1,2

IBSBF 2511 Patrocínio - MG 2007 1,2

IBSBF 2840 Caconde - SP 2009 C. arabica cv.

Obatã IAC 1669-20 1,2,3

IBSBF 2996 Monte Santo de Minas - MG 2008 C. arabica cv.

Catucaí 1,2

IBSBF 2999 Carmo de Minas - MG 2008 1,2

IBSBF 3005 Altinópolis - SP 2008 1,2

IBSBF 3015 Garça - SP 2008 C. arabica cv.

Obatã IAC 1669-20 1,2

IBSBF 3019 São Sebastiao da Grama - SP 2008 1,2

IBSBF 3022 Bragança Paulista - SP 2009 1,2

IBSBF 3024 Serra do Salitre - MG 2011 1,2,3

IBSBF 3051 Andradas - MG 2009 C. arabica cv.

Catuaí 1,2,3

IBSBF 3065 Unaí - MG 2010 1,2

IBSBF = Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico, Campinas, SP. P= isolado

patotipo da espécie. (NCPPB National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Food and

Environment Research Agency, Department for Environment, Food and Rural Affairs, Sand

Hutton, York, YO41 1LZ, England).

3.2.1.1. Reativação dos isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae

Os isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae criopreservados em ultra

freezer à -80° C foram reativados em meio de cultura Nutriente Ágar (contendo 0,5% de

peptona, 0,3% de extrato de carne, 0,1% de NaCl e 18g de ágar, por litro de água

destilada e pH ajustado para 7,0). Após o crescimento por 48 h a 28° C, colônias puras

foram multiplicadas para obtenção das suspensões bacterianas utilizadas como inóculo.

Para os ensaios e repicagens de rotina, as culturas bacterianas foram mantidas sob a

forma de suspensão em tubos de ensaio contendo água destilada esterilizada.

28

Para o preparo do inóculo, colônias bacterianas na fase logarítmica de

crescimento (24h) foram suspendidas em solução salina (NaCl 0,85%). A concentração

foi padronizada em espectrofotômetro a 0,3 de absorbância (~600nm), resultando em

inóculo com aproximadamente 3x108 UFC/mL-1 (LELLIOT et al., 1966).

3.2.3. Agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae

A agressividade de isolados bacterianos foi avaliada em três experimentos, a

partir da manifestação dos sintomas, em folhas de diferentes estágios de maturação de

cultivares suscetíveis de C. arabica.

Os experimentos 1 e 2 foram realizados entre os meses de janeiro a março de

2012, sendo que a temperatura média no período das avaliações foi de 23,7° C. o

experimento 3 foi realizado durante o mês de junho de 2012, sendo que a temperatura

média foi de 19° C.

Experimento 1: Reação da cultivar Mundo Novo IAC 376-4 a P. syringae pv. garcae.

Mudas de C. arabica cultivar Mundo Novo IAC 376-4 com cerca de cinco

meses, contendo 4-5 pares de folhas foram inoculadas entre janeiro a março de 2012

com dezenove isolados (Tabela 1). As inoculações foram realizadas por meio de

punctura em dois pontos de cada lado do limbo foliar, nos dois primeiros pares de

folhas, a partir do ápice, utilizando-se alfinete entomológico #00, previamente

mergulhado nas suspensões bacterianas. Após as inoculações, as plantas foram mantidas

em câmara úmida por 48 h e, posteriormente, em casa-de-vegetação com irrigação

controlada e umidade relativa (UR) em torno de 63%.

As parcelas experimentais, representadas por três plantas, foram dispostas em

delineamento de blocos casualizados com quatro repetições, sendo avaliados os efeitos

dos isolados bacterianos em função do dano causado nas plantas aos 21 dias após a

inoculação (DAI), por meio da medição da maior extensão das lesões.

Para análise dos dados experimentais os valores mensurados foram submetidos à

análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de Student Newman Keuls

a 5% de probabilidade, utilizando o software Statistica v. 7.0.

29

Experimento 2: Reação da cultivar Bourbon Amarelo IAC J 30 a isolados de P.

syringae pv. garcae

Folhas dos quatro primeiros internódios das plantas da cultivar de C. arabica

Bourbon Amarelo IAC J 30 com aproximadamente seis meses de idade, foram

inoculadas segundo o mesmo procedimento descrito no experimento 1, com dezenove

isolados (Tabela 1) e também, por uma mistura composta por quatro isolados (mistura I

- IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293, IBSBF 3024) considerados os mais agressivos

no experimento 1 realizado com a cultivar Mundo Novo IAC 376-4. Após as

inoculações, as plantas foram mantidas em câmara úmida por 48 horas e,

posteriormente, em casa-de-vegetação com irrigação controlada e UR em torno de 63%.

As parcelas experimentais, representadas por três plantas, foram dispostas em

arranjo fatorial, em delineamento de blocos casualizados com quatro repetições, sendo

avaliados os efeitos dos isolados bacterianos e da idade da folha em função do dano

causado nas plantas aos 21 dias após a inoculação (DAI), por meio da medição da maior

extensão das lesões.

Para análise dos dados experimentais, os valores mensurados foram submetidos

à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de Student Newman

Keuls a 5% de probabilidade, utilizando o software Statistica v. 7.0.

Adicionalmente, a partir das inoculações foram realizadas observações diárias

das puncturas, anotando-se o início do aparecimento dos sintomas, a fim de se calcular

o período de incubação do patógeno, sendo considerado como período de incubação o

tempo médio para aparecimento dos primeiros sintomas em todas as puncturas.

Experimento 3: Reação da cultivar Mundo Novo IAC 376-4 às misturas de isolados

bacterianos.

A agressividade dos quatro isolados IBSBF 65, IBSBF 75, IBSBF 1197 e IBSBF

1293, que constituíram a mistura I, considerados como os mais agressivos nos

experimentos anteriores, foi novamente avaliada de forma individual ou em

combinações de isolados (Mistura II: 65 e 75, Mistura III: 65 e 1197, Mistura IV: 65 e

1293, Mistura V: 75 e 1197, Mistura VI: 75 e 1293, Mistura VII: 1197 e 1293 e Mistura

VIII: 65, 75, 1197 e 1293) a partir de inoculações realizadas em folhas dos dois

primeiros internódios de mudas da cultivar Mundo Novo IAC 376-4 de C. arabica.

Quatro outros isolados foram também incluídos no estudo, sendo IBSBF 248, isolados

30

patotipo da espécie, IBSBF 2840 e 3024, pelo comportamento agressivo e IBSBF 3051

pela baixa agressividade apresentada nos experimentos anteriores.

Como nos experimentos anteriores, após as inoculações, as plantas foram

mantidas em câmara úmida por 48 horas, e posteriormente em casa-de-vegetação, com

irrigação controlada e UR em torno de 63%.

O delineamento experimental adotado foi o de blocos ao acaso com quatro

repetições e parcelas representadas por três plantas, avaliados os efeitos das

combinações entre os isolados bacterianos em função do dano causado nas plantas,

avaliado aos 21 dias após a inoculação (DAI) por meio da medição da maior extensão

das lesões, mensuradas em centímetros.

Os dados referentas aos valores mensurados foram submetidos à análise de

variância sendo as médias comparadas pelo teste de Student Newman Keuls a 5% de

probabilidade, utilizando o software Statistica v. 7.0.


syringae pv. garcae

A compatibilidade dos isolados IBSBF 65, IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293

e IBSBF 3024 utilizados de forma combinada (Experimentos 2 e 3) foi investigada por

meio de testes in vitro relacionados à produção e sensibilidade à bacteriocinas de acordo

com o método proposto por BIAGI & AZEVEDO (1992) e ROMEIRO (2001).

Além dos isolados utilizados nas inoculações de cafeeiros, avaliou-se também a

atividade em ralação à bacteriocinas dos isolados IBSBF 248, patotipo da espécie e dos

isolados IBSBF 2840 e IBSBF 3051, caracterizados pela baixa e alta agressividade,

respectivamente, apresentada nos experimentos anteriores.

Os ensaios foram realizados em triplicata, repicando-se os isolados, potenciais

produtores de bacteriocinas, por meio de estrias paralelas e equidistantes, uns aos outros

nas placas de Petri contendo meio de cultura 523 de KADO & HESKETT (1970),

contendo 1% sacarose, 0,8% caseína hidrolisada, 0,4% extrato de levedo, 0,2% fosfato

de potássio (K2HPO4), 0,03% sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) e 1,5% ágar e, pH

ajustado para 7,0. Após 72 h a 28° C, procedeu-se a inativação dos isolados, por meio

da adição de 5 mL de clorofórmio na superfície interna das tampas das placas de Petri,

mantidas invertidas por 20 minutos. Em seguida, os resíduos de clorofórmio foram

eliminados e uma camada de aproximadamente 1 mm do meio de cultura 523 foi vertida

31

sobre os isolados. Após a solidificação do meio, procedeu-se o semeio dos isolados

indicadores, por meio de estrias paralelas entre elas e, perpendiculares aos isolados

produtores. As placas foram novamente incubadas a 28° C por 72 h, sendo as leituras

realizadas a partir da análise de descontinuidade do crescimento dos isolados semeados

na sobre camada, em relação aos isolados produtores de bacteriocina, indicativo da

atividade bacteriocinogênica.

3.3. Metodologia de inoculação de Pseudomonas syringae pv. garcae para seleção

de plantas de cafeeiros resistentes à mancha-aureolada

O método mais adequado para a inoculação de P. syringae pv. garcae em

plantas de cafeeiro foi definido a partir da realização de dois experimentos, sendo no

primeiro, comparado os métodos de aspersão e das agulhas múltiplas e, no segundo, os

métodos das agulhas múltiplas e da inoculação por abrasão. Nos dois experimentos, o

inóculo foi proveniente da mistura dos isolados IBSBF 75 e IBSBF 1197, sendo as

suspensões preparadas de acordo com o procedimento descrito em 3.2.2.2.

Experimento 1: Comparação entre os métodos de inoculação por aspersão e agulhas

múltiplas

O material vegetal utilizado foi constituído de cultivares de C. arabica com

níveis variáveis de resistência (MOHAN et al., 1978; ITO et al., 2002), sendo Mundo

Novo IAC 376-4 e Catuaí Vermelho IAC 144 suscetíveis, IAPAR-59 classificada como

moderadamente resistente e IPR-102 como resistente.

Método de Aspersão: As inoculações por aspersão foram realizadas pulverizando-se a

suspensão bacteriana, direcionada para a face abaxial das folhas, até o ponto de

escorrimento (Figura 3A).

As avaliações da severidade da doença foram realizadas utilizando-se escala de 0

a 5 pontos, adaptada de PARADELA et al. (2000), sendo: 0 = ausência de sintomas; 1 =

início do aparecimento dos sintomas, com até 0,4% da área foliar com sintoma

característico da doença; 2 = 0,5 a 1,3% da área foliar com sintomas da doença; 3 = 1,4

a 4,0% da área foliar com sintomas; 4 = 4,1 a 12,5% da área foliar com sintomas

causados pela bactéria; 5 = 13 a 32% da área foliar apresentando sintomas da doença.

Método das Agulhas múltiplas: As inoculações foram realizadas com auxílio de um

anteparo redondo (Ø1,5 cm) contendo sete alfinetes entomológicos #00, fixados

equidistantemente a 0,4 cm, sendo seis ao redor do anteparo e um ao centro. Os

32

ferimentos foram efetuados transpassando as folhas dos cafeeiros, apoiadas em algodão

embebido com suspensão bacteriana, deixando depositado no local dos ferimentos uma

gotícula do inóculo (Figura 3B).

As avaliações da severidade da doença foram realizadas utilizando-se escala de 0

a 5 (ANEXO 1, página 114) pontos, de PARADELA FILHO et al. (1974), onde: 0 =

ausência de clorose e/ou anasarca, ou ainda, reação de hipersensibilidade ao redor das

lesões; 1 = início de amarelecimento ao redor das puncturas , até 10% de área foliar

apresentando sintomas da doença; 2 = 11-25% da área inoculada apresentando

anasarcas, podendo ou não estar circundadas por halo amarelado; 3 = 26-50% da área

inoculada anasarcada, halo amarelado pronunciado ao redor das puncturas; 4 = 51-75%

da área necrosada, halo amarelado por toda área inoculada; 5 = 100% da área inoculada

necrosada.

Figura 3 - Ilustração dos métodos de inoculação de Pseudomonas syringae pv. garcae

em folhas de cafeeiros. Inoculação por aspersão (A); inoculação com agulhas múltiplas

(B).

As plantas foram acondicionadas em câmara úmida 24 h antes e 48 h após as

inoculações, sendo transferidas em seguida para casa-de-vegetação com irrigação

controlada e UR em torno de 63%.

O experimento foi conduzido durante o mês de agosto de 2012, sendo que a

temperatura média durante o período experimental foi de 20,4° C. Adotou-se

delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial com doze repetições e

parcelas de uma planta. As avalições foram realizadas aos 7, 14 e 21 DAI nos quatro

primeiros pares de folhas.

Os dados relativos à severidade da doença, obtidos por meio das escala de

pontos (EP) foram utilizados para o cálculo da área abaixo da curva de progresso da

A B

33

doença (AACPD) (CAMPBELL & MADDEN, 1990; SIMKO & PIEPHO, 2012), pela

seguinte fórmula:

∑(𝑦𝑖 + 𝑦𝑖+1

2

𝑛−1

𝑖=1

) ∗ (𝑡𝑖+1 − 𝑡𝑖)

Onde: n é o número total de observações; yi e yi+1 são os valores das escalas de

pontos relativos à severidade da doença na i-ésima observação; (ti+1 - ti) é o intervalo

entre as avaliações.

As médias dos tratamentos, relativos à EP e AACPD, foram comparadas através

do intervalo de confiança (IC), sendo a precisão dos métodos analisada pelos

respectivos desvios padrão (DP) e coeficiente de variação (CV).

Os valores de incidência foram calculados através da divisão do número folhas

inoculadas que desenvolveram qualquer sintoma da doença pelo número total de folhas

inoculadas e o valor obtido multiplicado por 100.

Experimento 2: Comparação entre os métodos de inoculação por agulhas múltiplas e

Abrasão

Em conformidade com o experimento 1, e com a finalidade de aprimorar a

eficácia do método de inoculação, uma nova técnica, por abrasão com o inóculo foi

desenvolvida. Deste modo, o métodos das agulhas múltiplas e o método abrasivo foram

comparados a partir de análises realizadas com as cultivares SL 28 considerada

resistente, K7 e Bourbon Vermelho com reação desconhecida, IAC 125 RN suscetível e

também progênies do híbrido 6839 (Catuaí Vermelho IAC 46 x BA 10 IAC 1110-8) e

4309 (Catuaí Vermelho IAC 81 x genitor desconhecido) (Tabela 2), obtidas de

polinização aberta de matrizes selecionadas pela baixa incidência da mancha-aureolada

em um campo experimental localizado em Pirajú, SP, onde a doença encontra-se

disseminada.

34

Tabela 2 - Germoplasma utilizado na comparação dos métodos das agulhas múltiplas e

por abrasão, para inoculação de Pseudomonas syringae pv. garcae, em cafeeiros.

Germoplama Acesso Natureza País

SL 28 IAC 1153-1 Col. 5 Cultivar Quênia

K7 IAC 1151-4 Col. 5 Cultivar Quênia

Bourbon Vermelho IAC 662 Col. 5 Cultivar Brasil

Icatu Vermelho IAC 5383 Material em seleção Brasil

IAC Catuaí SH3 H6839-5-7-6-4-10-8-4 Cultivar Brasil



IAC 4309 EP 575 C 34 Material em seleção Brasil



IAC 125 RN IAC 1669-13 Cultivar Brasil

H = híbrido; EP = Ensaio de Progênie; Col. = Coleção; C = Cova.

Métodos das Agulhas múltiplas: O procedimento de inoculação pelo método das

agulhas múltiplas encontra-se descrito em 3.3.

Técnica da Abrasão: A técnica desenvolvida nessa pesquisa consiste na fricção de uma

lixa média disposta em área circular (Ø1,5 cm) previamente embebida em suspensão

bacteriana, contra a superfície abaxial das folhas, causando ferimentos que não

transpassam as folhas, depositando-se suspensão bacteriana na superfície da área

inoculada (Figura 4).

Figura 4 - Método de inoculação de Pseudomonas syringae pv. garcae, em folhas de

cafeeiro por abrasão. Fricção da lixa contra a superfície abaxial da folha (A);

Ferimentos ocasionados pela inoculação e deposição da suspensão bacteriana na

superfície lesionada (B).

Para ambos os métodos utilizou-se a escala de notas descrita no anexo 1 (Página

114).

A B

35

O experimento foi conduzido durante os meses de janeiro a março de 2013,

sendo que a temperatura média durante o período experimental foi de 23,9 ° C.

O modelo experimental adotado foi o delineamento inteiramente casualizado,

com números diferentes de repetições por tratamento e, parcela de uma planta. Após as

inoculações as plantas foram mantidas em condições de câmara úmida durante 48 horas,

sendo transferidas posteriormente para casa-de-vegetação com irrigação controlada.

Durante o período experimental a umidade relativa média na casa-de-vegetação foi de

63% e a temperatura média de 23,5°C.

As avalições foram realizadas aos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 DAI.

Os dados relativos à severidade da doença (EP) foram utilizados para o cálculo

da AACPD (CAMPBELL & MADDEN, 1990; SIMKO & PIEPHO, 2012) e os dados

relativos a EP e AACPD foram comparados através do IC, E a precisão dos métodos foi

analisada pelos DP e CV apresentados nos experimentos.

Com base na AACPD obtida nesse experimento, foram estimadas as correlações

classificatórias de Spearman (ρ) (STEEL et al., 1997) entre os períodos de avaliação

para cada método de inoculação, visando-se determinar o período de avaliação ideal

para a seleção de plantas resistentes à bactéria, similarmente ao descrito por PEREIRA

et al. (2008).


Coffea spp.

3.4.1. Obtenção das mudas de cafeeiros

Sementes do germoplasma, listado nas tabelas 3 e 4, foram germinadas em

caixas de areia e após aproximadamente 40 dias, no estádio de palito de fósforo, foram

transplantadas para tubetes de 180 cm3 contendo substrato vegetal, adicionado de 30g/L

de basacote® (16% N; 8 % P2O5; 12% K2O; 2% MgO; 5% S; 0,4% Fe; 0,02% B; 0,02%

Zn; 0,06% Cu; 0,06% Mn; 0,015% Mo). As plantas foram mantidas em casa-de-

vegetação com irrigação controlada, sendo selecionada as plantas ausentes de doenças e

insetos praga para as inoculações. As mudas foram inoculadas com aproximadamente

seis meses de idade, entre 5 e 7 pares de folhas.

36

Tabela 3 - Relação de espécies, cultivares, variedades, introduções da Etiópia, híbridos,

acessos, formas botânicas e mutações do BAG de cafeeiros do IAC avaliados para

resistência aos isolados de Pseudomonas syringae pv garcae IBSBF 75 e IBSBF 1197.

Continua.

Espécie Acesso IAC OBS

Experimento 11

C. arabica cv. Catuaí Vermelho

IAC-81 - Mistura de plantas

C. arabica cv. Mundo Novo IAC

376-4 - Mistura de plantas

C. anthonyi 4345 Col. 1

C. humilis 4348 Col. 1

C. heterocalyx 2980 Mistura de plantas

C. liberica var. passipagore 4079 Mistura de plantas

C. canephora 801 Col. 10

C. kapakata 4511 Mistura de plantas

C. congensis 4349 Col. 12

C. eugenioides 1140 + 2252 + 1098 Mistura de plantas

C. stenophylla 1090 Col. 1

C. salvatrix 1288 Mistura de plantas

Experimento 21

C. congensis 4349 Col. 12

C. canephora x C. congensis 4350

C. kapakata 4511

C. liberica var. dewevrei - Uganda 780 Col. 11

C. liberica var. liberica - Abeokutae 1008 Col. 6

C. eugenioides 1140 + 2252 + 1098 Mistura de plantas

C. stenophylla 1070 Col. 2

C. salvatrix 1288

C. humilis 4348

C. congensis var. bangelan Mistura Col. 2, Col. 4 e Col. 14

Experimento 32

C. arabica Coleção Etiópia ETP 1 FAO (1968)













(Continua)

37

Tabela 3 - Continuação...











Experimento 42
























Experimento 53

C. arabica Catuaí Vermelho x Erecta H 7337

C. arabica São Bernardo x Mundo

Novo H7366

C. arabica cv. Ibaaré

C. arabica cv. Iarana Col. 5

C. arabica cv. IPR 102

C. arabica cv. Pacas 1467

C. arabica cv. São Bernardo 1039

C. arabica cv. Villa Lobos

C. arabica cv. Villa Sarchi 1291

(Continua)

38

Tabela 3 - Continuação


C. arabica var. Abssínica Col. 8

C. arabica var. Crassinérvia

C. arabica var. Dilla & Alghe 1156-3 Col. 5

C. arabica var. Gláucia Col. 8

C. arabica var. Mokka Col. 5

C. arabica var. Pacas

C. arabica var. Palido viridis Col. 1

C. arabica var. Pêndula 81/25 Col. 2

Experimento 64

C. arabica Icatu Ct Ct 4553 EP 536 C 456

C. arabica Catuaí Vermelho IAC 81

x Geisha IAC 1137-5 H 7316 L 109 C 648 (F6)

C. arabica Catuaí Vermelho IAC 81

x Geisha IAC 1137-5 H 7316 L 109 C 1036 (F6)

C. arabica

Catuaí Vermelho x

(Catuaí Vermelho x HT

32/1)

H 13439-8 L 109 C 1736 (F6RC1)

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3 EP565 P 89 PL5

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3 EP565 P 99 PL 5

C. arabica cv. Mundo Novo LC EP568 P 32 PL 7

C. arabica cv. Icatu Amarelo 2944-6 EP567 P 46 PL 1

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3 L 108 C 1621

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3 L 108 C 1611

C. arabica cv. IAC Ourama Mococa Pl 13

C. arabica cv. IAC Ourama Mococa Pl 51 1Espécies do gênero Coffea; 2Acessos de cafeeiros oriundos da Etiópia (Coleção FAO 1968); 3Variedades, cultivares exóticas e híbridos intervarietais de C. arabica; 4Cultivares de C.

arabica.

Nos experimentos 3 e 4, avaliou-se o desempenho de 45 introduções

provenientes da Etiópia frente à infecção pela bactéria, sendo as introduções

previamente identificadas como resistentes em trabalho desenvolvido por MOHAN et

al. (1978), no Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), utilizando cafeeiros da coleção

de germoplasma de Coffea do IAC, recebidos do CATIE (Centro Agronómico Tropical

de Investigación y Enseñanza), Turrialba, Costa Rica.

Progênies de cafeeiros pertencentes a gerações diversas, oriundas de cruzamento

entre as espécies C. arabica e C. eugenioides, foram avaliadas em um sétimo

experimento, em relação à resistência à mancha-aureolada neste estudo, encontradas

listadas não tabela 4.

39

Tabela 4 – Cafeeiros derivados do cruzamento entre Coffea arabica e C. eugenioides

avaliados em relação à resistência de suas progênies à mancha-aureolada.

Cafeeiro Geração Genealogia

H3497-14 F1 C. arabica var. típica (10 ex. 4) x C. eugenioides (1098–6)

H3423-1 F1 C. arabica cv. Laurina (1097–18) x C. eugenioides (1098–5)

H5999-1 F1 C. eugenioides duplicado (1140-16 Dp.) x C. arabica cv Mundo

Novo IAC 376-4

H14772-1 F1 C. arabica cv. Catuaí Vermelho IAC 81 (Coleção 5) x

C. eugenioides duplicado (1140-16 Dp.)

H14503-1 RC1 C. arabica cv. Catuaí Vermelho IAC 81 (Coleção 5) x H5999-1

H = Híbrido. Dp = planta com número de cromossomos duplicado; cv. = cultivar.

3.4.2. Avaliação da resistência do germoplasma de Coffea spp. a Pseudomonas

syringae pv. garcae

O inóculo foi preparado como descrito no ítem 3.1.1. Em conformidade aos

experimentos realizados anteriormente, o inóculo selecionado para os ensaios de

resistência foi composto pelos isolados mistura V (IBSBF 75 e IBSBF 1197).

As inoculações foram realizadas pelo método de abrasão com lixa embebida no

inóculo, técnica que proporcinou os melhores resultados nos experimentos anteriores,

constituído pela mistura V (IBSBF 75 e IBSBF 1197).

Nove experimentos foram efetuados para a avaliação da resistência do

germoplasma, sendo a divisão dos experimentos realizada conforme a similaridade e

disponibilidade dos genótipos.

Os experimentos foram modelados em delineamento inteiramente casualizado,

com número variável de repetições por tratamento e parcelas de uma planta. Durante 48

h após as inoculações, as plantas foram mantidas em codição de camaa úmida. A

cultivar IAC 125 RN de C. arabica foi utilizada como padrão de suscetibilidade, em

todos os experimentos.

As avalições foram realizadas aos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 DAI, atribuindo-se

pontos entre zero e cinco conforme escala ilustrada no anexo 1, página 114.

Os dados relativos à severidade da doença (EP) foram utilizados para o cálculo

da AACPD (Campbell & Madden, 1990; Simko & Piepho, 2012), sendo as médias da

40

variável submetidas à análise de variância não paramétrica pelo teste de Kruskal-Wallis

ao nível de 5% de probabilidade.

3.5. Análise do efeito pleiotrópico do alelo SH1 na resistência a Pseudomonas

syringae pv. garcae

Nas hipóteses de o alelo SH1 apresentar efeito pleiotrópico ou de haver ligação

gênica entre alelos que conferem resistência a H. vastatrix e a P. syringae pv. garcae,

como reportado na literatura científica por CARVALHO (1988), cafeeiros portadores

do alelo SH1 deveriam ser resistentes a ambos os patógenos.

3.5.1. Material vegetal de cafeeiros

Foi avaliada a resposta de cafeeiros quanto a infecção por P. syringae pv. garcae

e o fungo H. vastatrix, patógeno causador da ferrugem do cafeeiro.

Foram utilizadas progênies de plantas do hibrido H8089, derivados de

cruzamento entre a cultivar Catuaí Vermelho IAC 24 e o cafeeiro IAC 1137-5 da

seleção Geisha, proveniente da Etiópia e introduzida na coleção de cafeeiros do Instituto

Agronômico (IAC) em 1953, oriunda do Departamento de Agricultura dos Estados

Unidos sob o registro PI 205.928

O material avaliado foi composto pelas progênies na geração F2, dos cafeeiros

H8089-2 e H8089-7, representadas por 34 e 29 plantas respectivamente.

3.5.2. Avaliação quanto à resposta de cafeeiros à infecção por Pseudomonas

syringae pv. garcae e a Hemileia vastatrix

As progênies na geração F2, dos cafeeiros H8089-2 e H8089-7 foram inoculadas

com mistura dos isolados IBSBF 75 e IBSBF 1197 de P. syringae pv. garcae, em

concentração aproximada de 108 UFC / mL-1, pelo método de abrasão, conforme

descrito no ítem 3.3.2.2.

As avaliações foram realizadas atribuindo-se de zero e cinco pontos (descita no

item 3.3.). A escala utilizada encontra-se Ilustrada no anexo 1, página 114.

Para confirmação da presença do alelo dominante SH1, as 63 progenies doas

cafeeiros foram inoculadas com dois isolados de H. vastatrix selecionados a partir de

testes em plantas diferenciadoras, mantidas pelo Centro de Café Alcides Carvalho, do

41

IAC, sendo o isolado I/2015, portador dos alelos V2 e V5 e o isolado II/2015, portador

dos alelos de virulência V1, V2 e V5.

Discos obtidos a partir de folhas jovens dos mesmos cafeeiros foram inoculados

com suspensão de uredosporos dos isolados de H. vastarix, em concentração de 1 mg.mL-1

(1,5 x 105 uredosporos) dos isolados I/2015 e II/2015, sendo posteriormente mantidos em

câmaras úmidas, segundo método de ESKES & TOMA-BRAGHINI (1981). Avaliou-se a

densidade de lesões, através de escala de 0 a 9 pontos, sendo 0, atribuído às plantas

resistentes, sem sintomas e 9 pontos, às plantas com alta incidência de lesões grandes,

regulares e esporulação intensa. O tipo de reação das lesões foi avaliado por escala de 0 a 4

pontos, onde 0 foi atribuído às plantas imunes, sem lesões e 4 pontos, àquelas suscetíveis,

com esporulação intensa.

O possível efeito pleiotrópico do alelo SH1 para resistência simultânea a P.

syringae pv. garcae e H. vastatrix, ou a eventual ligação gênica entre alelos de

resistência aos patógenos foi investigado por meio das respostas das plantas à infecção

por P. syringae pv. garcae e H. vastatrix isolado I/2015, sendo a concordância entre os

métodos avaliada por meio dos seguintes parâmetros:

Exatidão do método (EM) = (a+d)/n: calculada a partir do somatório de plantas

resistentes à ferrugem (a) e suscetíveis à mancha-aureolada (d), dividido pelo número

total (n) de plantas.

Taxa de falso positivo (TFP) = b/(b+d): calculada pela divisão do número de plantas

resistentes à ferrugem, mas suscetíveis à mancha-aureolada (b) pelo total de plantas

suscetíveis à mancha-aureolada (b+d).

Taxa de falso negativo (TFN) = c/(a+c): calculada pela divisão do número de plantas

suscetíveis à ferrugem, mas resistentes à mancha-aureolada (c) pelo total de plantas

resistentes à mancha-aureolada (a+c).

Taxa total de erro (TE) = (b+c)/n: calculada pelo somatório do número de plantas

resistentes à ferrugem, mas suscetíveis à mancha-aureolada (b) e do número de plantas

suscetíveis à ferrugem, mas resistentes à mancha-aureolada (c), dividido pelo número

total (n) de plantas.

Qui-quadrado de McNemar com a correção de continuidade de Yates (2 McNemar) = (b-

c-0,5)2/b+c: utilizado para estimar a significância entre as duas avaliações.

42

P valor = medida quantitativa da robustez da significância calculada no teste de 2

McNemar.

Coeficiente de associação de Yule (Q): medida do grau de associação entre as classes

determinadas nas avaliações das plantas em relação à resistência à ferrugem e à

mancha-aureolada.



A análise de expressão diferencial foi realizada avaliando-se a tendência de

expressão dos genes alvo, na cultivar IPR 102 (resistente) e IAC 125 RN (suscetível).

Folhas de cafeeiro do primeiro internódio, completamente expandidas, foram

inoculadas por suspensão bacteriana a partir da mistura dos isolados IBSBF 75 e IBSBF

1197 de P. syringae pv. garcae, em concentração aproximada de 108 UFC / mL-1, pelo

método de abrasão, conforme descrito no ítem 3.3.2.2. Utilizou-se como controle as

folhas inoculadas com solução salina. Após as inoculações, as plantas foram mantidas

em condições de câmara úmida até o momento das coletas. Amostras foliares foram

coletadas, antes das inoculações (T0), 15 minutos após as inoculações, 3, 6, 12 e 24

horas após as inoculações. Assim que coletadas as folhas foram imersas em nitrogênio

líquido e, em seguida, armazenadas em ultra-freezer (-80° C).

3.6.1. Extração de RNA total das folhas de cafeeiro, tratamento com RNase e

síntese de cDNA

3.6.1.1. Extração de RNA total das folhas de cafeeiro

O material utilizado em todo o processo de manipulação de RNA foi tratado com

DEPC (0,05%) para inativar RNases.

Procedeu-se a extração dos RNAs com base no protocolo determinado por

CHANG et al. (1993). As amostras foliares foram maceradas em nitrogênio líquido,

adicionadas de

7 mL de tampão de extração, contendo: CTAB 2%, PVP (K10) 2%, Tris HCl pH 8,0

10%, EDTA 5%, NaCl 40% e ddH2O DEPC 41% e, em seguida, incubadas em banho-

maria a 67° C, por 30 minutos.

43

Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 10

minutos a 10° C, recuperando-se 1.000 µL do sobrenadante em novos microtubos,

seguido pela adição de clorofórmio (1:0,80 v/v%), homogeneização e centrifugação, a

10.000 rpm por 10 minutos (10° C).

Cuidadosamente, 600 µL da fase aquosa foram recolhidos em novos microtubos,

acrescentados de 1.000 µL de TRIzol, homogeneizados e mantidos no gelo por 5

minutos. Adicionou-se 200 µL de clorofórmio e, a mistura foi centrifugada 10.800 rpm

por 15 minutos a 10° C.

O sobrenadante foi recuperado, tendo sido adicionado isoprapanol gelado (1:1),

homogeneizado por inversão durante 10 minutos e deixados durante a noite em freezer a

-20° C. Posteriormente, procedeu-se à centrifugação a 10.800 rpm por 10 minutos (10°

C). Nesta etapa o precipitado (“pellet”) formado foi lavado de duas a três vezes com

1.000 µL etanol (75%), seguido de centrifugação a 7.000 rpm por 6 minutos. Após a

lavagem, o etanol foi removido e as amostras mantidas em baixa temperatura até a

completa secagem. Finalmente, o precipitado foi eluído em 20 µL de ddH2O DEPC.

3.6.1.2. Tratamento dos RNAs com DNase

Após as extrações, as amostras foram quantificadas em espectrofotômetro

NanoDrop L-Quant 2® (Loccus Biotecnologia) e a integridade dos RNAs totais foi

verificada atravéz de eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio

e visualizado sob luz ultravioleta. Posteriormente, os RNAs foram tratados com o kit

RQ1 RNase-Free DNase (Promega©), seguindo-se as recomendações do fabricante e,

em seguida, realizou-se nova quantificação como descrito anteriormente.

3.6.1.3. Síntese de cDNAs

A partir dos RNAs tratados, a síntese da primeira fita de cDNA foi através do kit

ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega), seguindo as especificações do

fabricante. Em seguida, as amostras de cDNA foram quantificadas em

espectrofotômetro L-Quant 2® (Loccus Biotecnologia).

44

3.6.2. Análise da expressão relativa em tempo real de genes ligados á defesa vegetal

3.6.2.1. Genes normalizadores e/ou endógenos

Para a seleção dos genes utilizados como normalizadores nas análises de qRT-

PCR, foram avaliados sete genes frequentemente empregados como controles

endógenos em estudos de microarranjos realizados no Laboratório de Biologia

Molecular do Centro de Café Alcides Carvalho do IAC. Os genes testados foram:

Actina (Act), ADH, GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) 12323, GAPDH

7234, GAPDH 2, Poli Ubiquitina A (PolyA) e 1089 ribossomal (40S). Os genes foram

ranqueados e, aqueles selecionados, foram testados em todas as amostras

separadamente. O consenso das análises definiu o gene GAPDH.2 como normalizador

para as análises subsequentes de expressão gênica dos genes alvo. A eficiência da

reação também foi analisada, sendo todos os testes realizados em triplicata utilizando-se

amostras de cDNA . Definiu-se 500ng como a quantidade mínima de cDNA inicial a ser

utilizada nas reações de PCR quantitativas em tempo real (qRT-PCR).

3.6.2.2. Genes alvo

Avaliou-se no estudo a expressão dos genes de defesa “enhanced disease

susceptibility 1” (EDS-1), “phytoalexin deficiente 4” (PAD4), ascorbato peroxidase

(APX), catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX), β-glucanase,

(PR-2), isocitrato liase (2669-ICL) e glutationa redutase (Glut R). As sequências e

descrições dos primers utilizados estão apresentadas na tabela 5.

Tabela 5 - Sequência dos primers utilizados na reação de qRT-PCR.

Gene Sequência do primer (5’ 3’) no. Nucleotídeos

GAPDH.2 F- TTG GGC GGT GCA AA 17

R- AAC ATG GGT GCA TCC TTG CT 20

EDS1 F- TGA AGT GCG CAA GGT AGG T 19

R- AGG TTC AAC CAA CCG CCT A 19

PAD4 F- GCC TCA ACA GTG CCA ATC TG 20

R- CCT GGC AAG CTT ATG CCT AT 20

(Continua)

45

Tabela 5 – Continuação...

Gene Sequência do primer (5’ 3’) no. Nucleotídeos

APX F- TTC CGA ATA GAA CCG TTT GG 20

R- GGA TGC GGA GTA CCT GAA AG 20

CAT F- GCC GGT TGG TAT TGA ACA AC 20

R- CAG TAG AGG GGA TGG GAT GC 20

SOD F- AGG ATG TCA GTC GGG TTT TG 20

R- CTG TGA TGT CTG GGA ACA CG 20

POX F- CTC CTT CTT TGC CTT CTC TGC 21

R- GTG TTC TTG TGG CGC TTG TA 20

PR-2 F- TAA GTG GGC GAA GAT GGT G 19

R- GCT GAG AGG CTA CGC AAA T 19

2669 - ICL F- GGC CAG GAG CAA CAG ACA TT 20

R- ATT CTC TCA CAA TCT TGA CTT TGC A 25

GLUT R. F- CAA GCG GCT ACT GTC AAA TG 20

R- GCT CAC AAA CTA CAC GAA CCC TA 23

F: sequência forward do primer; R: sequência reverse do primer.

3.6.2.3. Reações de qRT-PCR

Os ensaios de expressão em tempo real de genes relacionados com a resposta de

defesa foram efetuados em sistema de detecção mediada pelo marcador SYBR Green®.

As reações foram realizadas para o volume final de 15 µL. A mistura de reação foi

composta por 500ng de cDNA, 0,45 µL de cada primer (10 nM) e 7,5 µL de SYBR

Green®. Todas as reações foram realizadas em triplicata em placas de 96 poços e, em

sistema de detecção de sequências ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems).

O programa padrão de amplificação das amostras consistiu de um ciclo a 50

°C/2min e um ciclo 95 °C/10min; seguidos de 40 ciclos 95 °C/15 seg; 60 °C/1min.

Curvas de dissociação foram geradas após o último ciclo de amplificação.

3.6.2.4. Análise dos resultados

Os resultados das reações de qRT-PCR referentes à expressão dos genes alvo,

foram analisados utilizando-se a quantificação relativa, calculada a partir do valor do

ciclo de detecção Ct (“Cycle Threshold”), onde a fluorescência é detectável, e seu valor

46

é inversamente proporcional ao logaritmo do número inicial de cópias. A expressão

relativa dos genes transcritos foi determinada pelo calculo do 2−∆∆𝐶𝑡, com base na

seguinte fórmula:

2−[(𝐶𝑡 𝑎𝑙𝑣𝑜−𝐶𝑡 𝑒𝑛𝑑ó𝑔𝑒𝑛𝑜)𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎−(𝐶𝑡 𝑎𝑙𝑣𝑜−𝐶𝑡 𝑎𝑙𝑣𝑜)𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟] = 2−∆∆𝐶𝑡

Onde: Gene alvo = gene de interesse; Gene endógeno = GAPHD2. Utilizou-se

como calibrador nos cálculos da a expressão do gene alvo na cultivar IAC 125 RN sem

contato com a bactéria.

Ajustes na concentração do “RNA template” foram realizados a fim de se

detectar alguns genes, com expressões de menor magnitude.

4. RESULTADOS



Observou-se rápido desenvolvimento dos sintomas da mancha-aureolada em

folhas do terceiro internódio de C. arabica cv. Mundo Novo IAC 376-4. A análise de

variância dos valores mensurados nas lesões da epiderme das folhas (Tabela 6) mostrou

diferença significativa (F = 8,57; P = 0,0021) entre o dano médio observado nas folhas

aos 10 e aos 20 DAI. Lesões aos 20 DAI (12,89 milímetros) foram caracterizadas por

uma grande área de tecido necrótico com aproximadamente, o dobro do tamanho das

lesões aos 10 DAI (6,75 mm). Aos 20 DAI as lesões apresentavam-se circundadas por

um halo amarelo pronunciado, consequência da clorose do tecido foliar.

47

Tabela 6 - Valores médios das lesões (mm) em folhas do terceiro internódio de cafeeiro

da cultivar Mundo Novo IAC 376-4 causadas por Pseudomonas syringae pv. garcae,

aos 10 e 20 dias após a inoculação.

Tecido danificado Dias após a inoculação

10 20 Média

--------------------------------------------------mm--------------------------------------------------

Epiderme 5,36 7,93 6,64 a

Parenquima paliçádico 7,28 14,68 10,98 b

Parenquima esponjoso 7,60 16,06 11,83 b

Média 6,75 a 12,89 b

CV (%)

30,62 * Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Student Newman-Keuls a

5% de probabilidade.

A magnitude dos danos nas folhas inoculadas também foi diferente entre os

tecidos analisados. Lesões na epiderme (6,64 mm) foram menores do que aquelas

originadas nos parênquimas paliçádico (10,98 mm) e esponjoso (11,83 mm).

A presença de tecido cicatricial em torno do ponto de inoculação foi observado apenas

no mesofilo de plantas inoculadas com solução salina (Figuras 5A e B). Próximo deste

tecido, células epidérmicas e do mesofilo não apresentaram anormalidades anatômicas.

Os cloroplastos estavam intactos, as células do parênquima paliçádico permaneceram

compactamente reunidas em conjunto e as células do parênquima esponjoso

encontravam-se dispostas em uma rede tridimensional, intercalada com espaço

intercelular (Figuras 5C e D).

48

Figura 5 - Cortes paradérmicos mostrando mesofilo de folhas de cafeeiro inoculadas

com solução salina (A); Células adjacentes ao ponto de inoculação (B); detalhes do

parênquima paliçádico (C); parênquima esponjoso (D); Seta indica o tecido de

cicatrização. PI = ponto de inoculação. (Barra = 25 µm).

Em plantas inoculadas com a bactéria, aos 10 DAI alterações celulares, tais

como lise das células epidérmicas e do mesofilo (Figura 6A), com forte coloração de

seus conteúdos celulares, indicando tecido doente, foram observadas ao redor do ponto

de inoculação. Observou-se a presença de conteúdo granular em células epidérmicas, e

de espaços intercelulares no parênquima paliçádico, além de hipertrofia de algumas

células (Figura 6C). No parênquima esponjoso houve destruição parcial de cloroplastos,

e massas de bactérias foram identificadas no interior das células e nos espaços

D B

A

C

PI

49

intercelulares de mesofilo (Figuras 6B e 6D). A região do mesofilo com cloroplastos

parcialmente destruídos corresponde à característica externa da amarelecimento ao

redor da lesão.

As bactérias colonizaram não apenas os espaços intercelulares, mas também o

interior das células do mesofilo e do parênquima adjacente aos feixes vasculares

secundários e as células dos feixes vasculares (Figura 6E). Células bacterianas também

foram observadas nos vasos do xilema e floema indicando que podem causar o bloqueio

do fluxo vascular (Figura 6F).

Figura 6 - Cortes paradérmicos de folhas de cafeeiro mostrando mesofilo no local da

inoculação com Pseudomonas syringae pv. garcae, 10 dias após a inoculação (A);

parênquima esponjoso com destruição parcial de cloroplastos, bem como massas de

bactérias no interior das células e em espaços intercelulares (B); parênquima paliçádico

(C); parênquima esponjoso com massas bacterianas (D); massas bacterianas em células

do feixe vascular (E). Secção transversal da folha com células dos feixes vasculares

bloqueadas por bactérias e células do floema desestruturadas (F). b = bactérias; PI =

ponto de inoculação, PP = parênquima paliçádico; PE = parênquima esponjoso (Barra =

25 µm).

b

B

b b

C D

E F

A

P E

P P

P I

50

Aos 20 DAI, muitas células do mesofilo foram totalmente danificadas, não

apenas próximo do ponto de inoculação mas também em áreas distantes (Figura 7A).

Sintomas externos seguindo as nervuras revelam a presença de bactérias nos feixes

vasculares (Figura 7B).

Figura 7 - Cortes paradérmicos de folhas de cafeeiro mostrando mesofilo no local da

inoculação com Pseudomonas syringae pv. garcae, 20 dias após a inoculação. Células

do mesofilo rompidas em locais distantes do ponto de inoculação (A); sintomas

externos acompanhando as nervuras (B); destruição dos cloroplastos de células do

parênquima esponjoso (C); secção transversal da folha com hiperplasia no parênquima

esponjoso (D); massa bacteriana presente no espaço intercelular de células do

parênquima esponjoso (E); inclusões presentes em células do parênquima esponjoso (F).

b = bactérias; PI ponto de inoculação, PP = parênquima paliçádico; PE = parênquima

esponjoso. (Barra = 25 µm).

C

A

P E

P P

P I

B

F

D

b

E

51

Em seções transversais da lâmina foliar, a destruição dos cloroplastos no

mesofilo aos 20 DAI foi intensa, com presença de células apresentando hipertrofia e

hiperplasia, principalmente no parênquima esponjoso, que, por sua vez apresentou

decréscimo nos espaços intercelulares (Figuras 7C e D) e intensa quantidade de massa

bacteriana (Figura 7E). Inclusões também foram observados em ambos os lados da

epiderme e no mesofilo (Figura 7F).

4.2. Agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae

Aos 21 DAI, os sintomas nas plantas induzidos pelos isolados variaram de

pequenas áreas anasarcadas a lesões com 1,2 cm de comprimento na cultivar Mundo

Novo IAC 376-4, e até 1,0 cm na cultivar Bourbon Amarelo IAC J 30. Os resultados

dos ensaios revelaram ampla diversidade patogênica entre os dezenove isolados testados

individualmente ou de forma combinada nos três experimentos.

Os dados referentes ao comprimento médio das lesões encontram-se listados na

tabela 7.

No primeiro experimento (1) os isolados mais agressivos foram: IBSBF 65,

IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293, IBSBF 2212, IBSBF 1664, IBSBF 2511, IBSBF

2840 e IBSBF 3024. O isolado IBSBF 3005 foi caracterizado com agressividade

intermediária, enquanto que os isolados IBSBF 248, IBSBF 1372, IBSBF 2996, IBSBF

2999, IBSBF 3015, IBSBF 3019, IBSBF 3051 e IBSBF 3065 revelaram-se menos

agressivos, em relação à cultivar Mundo Novo IAC 376-4.

Os resultados do segundo experimento (2) evidenciaram a alta agressividade dos

isolados IBSBF 3024, IBSBF 65, IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293, IBSBF 1664 e

IBSBF 2840. A mistura I, composta pelos isolados IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF

1293 e IBSBF 3024 caracterizados como agressivos, também foi classificada como

agressiva, por este motivo, outras diferentes misturas foram estudadas no terceiro

experimento em relação à agressividade (Experimento 3) e também à atividade

bactericinogênica dos isolados envolvidos (Item 4.2.1.). Os isolados que se revelaram

menos agressivos em relação a cultivar Bourbon Amarelo IAC J 30 no experimento 2

foram: IBSBF 248, IBSBF 1372, IBSBF 2511, IBSBF 3015, IBSBF 3022 e IBSBF

2212, IBSBF 2996, IBSBF 2999, IBSBF 3005, IBSBF 3019 e IBSBF 3051.

52

Tabela 7 - Comprimento médio das lesões em centímetros aos 21 dias após a

inoculação (DAI) nas cultivares Mundo Novo IAC 376-4 e Bourbon Amarelo IAC J 30

de Coffea arabica, inoculadas por punctura com diferentes isolados de Pseudomonas

syringae pv. garcae e combinação de isolados e períodos de incubação (PI) calculados a

partir de sintomas observados em folhas do primeiro internódio em dias após a

inoculação (DAI).

Isolado Experimento1

cv. Mundo novo

IAC 376-4

Experimento 2**

cv. Bourbon Amarelo

IAC J 30

Experimento 3 cv. Mundo novo

IAC 376-4

---cm--- ---cm--- ---PI (DAI)-- ---cm---

IBSBF 65 0,61 a* 0,50 ab 5,87 0,57 c

IBSBF 75 0,64 a 0,44 ab 5,76 0,55 c

IBSBF 248P 0,04 d 0,20 bc 12,45 0,49 c

IBSBF 1197 0,42 ab 0,51 ab 7,54 1,02 a

IBSBF 1293 0,55 a 0,63 ab 5,64 0,71 b

IBSBF 1372 0,06 d 0,217 bc 7,47 na -

IBSBF 1664 0,46 ab 0,49 ab 7,68 na -

IBSBF 2212 0,51 a 0,31 abc 7,18 na -

IBSBF 2511 0,40 ab 0,34 abc 11,78 na -

IBSBF 2840 0,39 ab 0,46 ab 5,79 0,73 b

IBSBF 2996 0,08 d 0,17 c 8,10 na -

IBSBF 2999 0,05 d 0,17 c 11,00 na -

IBSBF 3005 0,21 bcd 0,11 c 7,00 na -

IBSBF 3015 0,03 d 0,26 abc 6,04 na -

IBSBF 3019 0,06 d 0,14 c 6,71 na -

IBSBF 3022 0,10 cd 0,28 abc 6,25 na -

IBSBF 3024 0,37 abc 0,69 a 5,92 0,51 c

IBSBF 3051 0,05 d 0,17 c 8,22 0,48 c

IBSBF 3065 0,06 d 0,17 c 16,14 na -

Mistura I na*** - 0,63 ab 9,06 na -

Mistura II na - na - - 0,5 c

Mistura III na - na - - 0,98 ab

Mistura IV na - na - - 0,56 c

Mistura V na - na - - 0,99 ab

Mistura VI na - na - - 0,53 c

Mistura VII na - na - - 0,62 c

Mistura VIII na - na - - 0,76 b

CV (%) 34,37

32,26 14,66 * = Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si pelo teste de Studant Newman -

Keuls a 5% de probabilidade; ** = analisado pela média da extensão das lesões nos dois primeiros pares de

folhas. *** = Não avaliado. P = Isolado patotipo. PI = período de incubação, corresponde ao tempo médio

para aparecimento dos primeiros sintomas da doença. Mistura I = 75, 1197, 1293 e 3024; Mistura II = 65

e 75; Mistura III = 65 e 1197; Mistura IV = 65 e 1293; Mistura V = 75 e 1197; Mistura VI = 75 e 1293,

Mistura VII = 1197 e 1293 e Mistura VIII = 65, 75, 1197 e 1293.

53

Durante o experimento 2 foram realizadas observações diárias dos ferimentos

causados pelas puncturas. Os sintomas iniciais da colonização pela bactéria, foram

observados até o 17° DAI, tendo sido iniciado a partir do segundo DAI. A partir dessas

observações, puderam ser calculados o período médio de incubação de P. syringae pv.

garcae nas folhas mais afetadas, ou seja, as folhas jovens, que variou entre 5,64 e 7,68

DAI (Anexo 2, página 115) pelos isolados mais agressivos, e o período de latência

calculado entre 5 e 7 DAI (Tabela 7). Em média, as folhas jovens do primeiro

internódio apresentaram os sintomas iniciais da doença aos sete DAI, e, esse período foi

crescente conforme a idade das folhas, sendo o dobro nas folhas do quarto intenódio, a

tabela completa dos resultados é apresentados no anexo 2, página 115. Não se constatou

relação entre a agressividade dos isolados (Tabela 7) com a região de origem e/ou o ano

de isolamento das culturas bacterianas (Tabela 1) nas duas cultivares avaliadas.

No terceiro experimento, os tratamentos formados por misturas de isolados se

comportaram como medianamente agressivos, com exceção das misturas III (IBSBF 65

e IBSBF 1197) e V (IBSBF 75 e IBSBF 1197), cuja agressividade semelhante foi

aquele apresentado pelo isolado considerado agressivo IBSBF 1197 (Tabela 7). Neste

experimento, os isolados IBSBF 65, IBSBF 75, IBSBF 3024, anteriormente

classificados como agressivos, revelaram-se pouco agressivos, próximos ao isolado

IBSBF 3051.

Em geral, os isolados que se confirmaram como mais agressivos nos três

experimentos e foram: IBSBF 65, IBSBF 75, IBSBF 1197, IBSBF 1293, IBSBF 1664,

IBSBF 2212, IBSBF 2511, IBSBF 2840 e IBSBF 3024, uma vez que esses isolados

desenvolveram sintomas da doença entre 80-100% dos ferimentos provocados pela

inoculação por punctura e resultaram nas maiores lesões observadas nos experimentos.

Os isolados IBSBF 3015 e 3022 apresentaram comportamento diferencial entre os

experimentos, sendo mais agressivos à cultivar Bourbon Amarelo IAC J 30. Os isolados

IBSBF 248, IBSBF 1372, IBSBF 2996, IBSBF 2999, IBSBF 3005, IBSBF 3019,

IBSBF 3051 e IBSBF 3065 foram classificados como menos agressivos.


syringae pv. garcae

Com relação à produção e sensibilidade às bacteriocinas, não foi constatada

atividade bacteriocinogênica pelos isolados confrontados nos testes in vitro, com base

na metodologia descrita por BIAGI & AZEVEDO (1992) e ROMEIRO (2001) (Figura

54

8). Testes in vitro, também foram relizados empregando-se a metodologia proposta por

MARINGONI & KUROZAWA (2002) mas tambem não foram observados halos de

inibição em qualquer dos isolados confrontados.

Figura 8 - Insensibilidade bacteriocinogênica dos isolados de Pseudomonas syringae

pv. garcae testados. Isolados candidatos a produção de bacteriocinas, i – IBSBF 65, ii –

IBSBF 75, iii – IBSBF 1197, iv – IBSBF 248; isolados indicadores de atividade: v –

IBSBF 1293, vi – IBSBF 2840, vii – IBSBF 3024 e viii – IBSBF 3051 (A) Isolados

candidatos a produção de bacteriocinas: i – IBSBF 1293, ii – IBSBF 2840, iii – IBSBF

3024, iv – IBSBF 3051; isolados indicadores de atividade: v – IBSBF 65, vi – IBSBF

75, vii – IBSBF 1197 e viii – IBSBF 248 (B).



Em um primeiro experimento realizado para se definir o método mais adequado

de inoculação das plantas e avaliação de sintomas foram comparados os métodos de

inoculação por aspersão e por agulhas múltiplas.

Os sintomas iniciais de colonização dos tecidos foliares pelas bactérias, surgiram

em plantas inoculadas por ambos os métodos entre três e quatro DAI.

O conhecimento prévio da reação das cultivares suscetíveis Mundo Novo IAC

376-4 e Catuaí Vermelho IAC 144, IAPAR-59 com resistência moderada e IPR-102

resistete a P. syringae pv. garcae foi corroborado pelos dois métodos de inoculação.

i

ii

iii

iv

v vi vii

viii

i

ii

iii

iv

v vi vii

viii

B A

55

No entanto, os danos avaliados pelas variáveis EP e AACPD, foram maiores em

plantas inoculadas pelo métodos de agulhas múltiplas e em folhas jovens do primeiro

internódio, em ambos os métodos de inoculação (Tabela 8).

Os valores de IC gerados pelo método de inculação por de aspersão foram

menores nas folhas do primeiro internódio e nos pares de folhas subsequentes obteve

variação menor, mas de amplitude similar entre eles. Já os valores de IC resultates das

plantas inoculadas por agulhas múltiplas foi maior nas folhas do primeiro internódio,

em relação aos demais.

Independente do par de folhas analisado, o método de aspersão obteve os

menores valores de IC. No entanto, a severidade da doença ocasionada por este método

representada pelas notas da EP foram menores em relação a técnica de agulhas

múltiplas.

Os valores de DP apresentaram tendência semelhante aos valores de IC, no

entanto, houve variação menor entre os métodos, sendo em alguns casos menor nas

folhas inoculadas por agulhas múltiplas.

As plantas inoculadas por agulhas múltiplas resultaram em maiores CV em

quase todos os materiais e pares de folhas testados, a variável AACPD resultou em

menores valores de CV, independente da técnica de inoculação empregada.

56

Tabela 8 – Médias, intervalos de confiança (IC), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das variáveis escala de pontos (EP), área abaixo da curva de progresso da

doença (AACPD) e incidência, provocada por Pseudomonas syringae pv. garcae inoculada pelos métodos de aspersão e agulhas múltiplas, em diferentes pares de folhas.

Aspersão

Cultivar Variável 1° Par de Folhas

2° Par de Folhas

3° Par de Folhas

4° Par de Folhas

Média

IC DP CV

Média

IC DP CV

Média

IC DP CV

Média

IC DP CV

(%) (%) (%) (%)

Mundo Novo IAC 376-4

EP 2,33 b 0,68 0,49 21,11

2,00 b 0,68 0,60 30,20

2,00 b 0,84 0,60 30,21

1,83 a 0,80 0,57 31,5

AACPD 44,92 b 3,07 9,70 21,52

42 b 1,7 6,33 15,07

43,17 b 2,74 8,6 19,96

42,6 b 2,54 8,7 20,38

Incidência* 100%

100%

100%

100%

Catuaí Vermelho IAC 144

EP 2,25 b 1,04 0,75 33,50

1,58 ab 0,71 0,51 32,50

1,75 ab 0,63 0,45 25,80

2,00 a 1,87 0,95 47,70

AACPD 46,67 b 3,20 11,10 23,78

35,00 ab 1,77 5,60 15,96

38,50 b 2,68 8,44 21,92

40,83 ab 5,76 14,4 35,31

Incidência 70,83%

100%

91,67%

100%

IAPAR 59

EP 1,92 ab 0,73 0,51 26,80

1,58 ab 0,71 0,51 32,52

1,75 ab 0,63 0,45 25,80

1,67 a 0,90 0,65 39,08

AACPD 41,42 b 2,76 8,68 20,96

39,08 ab 2,53 8,68 22,21

39,08 b 2,22 7,58 19,41

38,5 ab 2,46 8,44 21,93

Incidência 100%

83,33%

83,33%

66,67%

IPR 102

EP 1,17 a 1,03 0,80 71,20

1,33 a 1,27 0,65 48,80

1,17 a 1,13 0,57 49,48

1,42 a 1,01 0,51 36,34

AACPD 29,75 a 4,71 13,39 45,01

32,66 a 5,46 11,49 35,20

29,16 a 4,20 10,48 35,90

33,25 a 5,52 11,60 34,90

Incidência 25,00%

20,83%

33,33%

17,40%

Agulhas Múltiplas

1° Par de Folhas

2° Par de Folhas

3° Par de Folhas

4° Par de Folhas

Mundo Novo IAC 376-4

EP 3,58 b 1,20 1,41 38,50

1,92 b 0,76 0,66 34,80

1,50 b 0,72 0,50 34,82

1,75 a 0,63 0,45 25,80

AACPD 68,63 c 4,20 19,20 27,87 42,00 b 2,22 8,17 19,46 37,90 a 2,20 7,58 20,0 43,20 b 1,87 6,89 15,97

Incidência 100% 100% 100% 100%

Catuaí Vermelho IAC 144

EP 2,67 ab 1,80 1,33 48,85

1,67 ab 0,90 0,65 39,08

1,67 b 0,68 0,49 29,54

1,5 a 0,68 0,49 34,80

AACPD 56,37 c 3,31 14,87 27,71

39,66 b 2,48 7,80 19,67

39,67 a 1,90 6,56 16,54

40,60 b 1,48 4,68 13,15

Incidência 100% 50,00% 33,33% 41,66%

IAPAR 59

EP 2,17 ab 1,26 1,11 51,54

1,67 ab 0,96 0,49 29,50

1,75 b 0,70 0,62 35,50

1,42 a 1,01 0,51 36,35

AACPD 49,41 b 3,99 15,64 32,30

39,08 ab 2,45 6,97 17,84

39,08 a 1,84 6,30 16,13

36,76 ab 2,63 7,38 20,10

Incidência 100% 83,33% 100% 100%

IPR 102

EP 1,58 a 2,28 1,16 73,57

1,42 a 1,31 0,66 47,19

1,47 a 1,34 0,88 53,26

1,33 a 0,97 0,49 36,90

AACPD 39,08 a 5,70 16,02 41,45

35,16 a 2,64 7,50 20,77

38,08 a 3,40 9,65 24,70

35,50 a 2,45 6,97 19,59

Incidência 41,60% 66,67% 66,67% 66,67%

Médias de cada variável seguidas por uma letra igual não diferem entre si, pelo intervalo de confiança ao nível de 5% de probabilidade. * = incidência calculada a partir da

razão do número de plantas resistentes (nota zero pela EP) pelo total de folhas inoculadas, multiplicado por 100.

57

Os sintomas da mancha-aureolada observados nas plantas inoculadas por

aspersão em muitos os casos tiveram inicio somente a partir dos bordos foliares (Figura

9), local onde ocorreu o acúmulo de água.

Figura 9 – Sintoma da mancha-aureolada na cultivar Catuaí Vermelho IAC 144, aos 14

dias após a inoculação, resultado da inoculação por aspersão.

A incidência da doença foi baixa em cafeeiros da cultivar resistente IPR 102,

inoculados por aspersão, com valores médios variando entre 17,40% e 33,33% em

folhas dos quarto primeiros internódios. Quando inoculadas pelo método de agulhas

múltiplas, a incidência da mancha-aureolada na mesma cultivar variou entre 41,60% e

66,67% (Tabela 8).

Em geral, os valores de CV foram considerados baixos. Embora os valores

gerados por ambas as técnicas de inoculção tenham sido similares, o método de

inoculação de aspersão resultou em menores porcentagens de CV. A mesma tendência

também ocorreu para a variável DP, sendo mais acentuada em cafeeiros inoculados por

agulhas múltiplas.

Em um segundo experimento, o método de inoculação por agulhas múltiplas foi

comparado ao método de inoculação por abrasão, sendo os resultados apresentados na

tabela 9.

Os dois métodos de inoculação resultaram em 100% de incidência da doença em

folhas de germoplasma diverso da espécie C. arabica. Apenas a cultivar SL 28,

resistente à bactéria, apresentou folhas com nota zero da EP, em 50% da progênie

avaliada. Sem exceção , as médias das variáveis EP e AACPD das cultivares inoculadas

pelo métodos de abrasão foram superiores àquelas do mesmo germoplasma inoculado

pelo método de agulhas múltiplas (Tabela 9).

58

Tabela 9 - Média, intervalo de confiança (IC), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) em porcentagem das variáveis escala de pontos

(EP) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), provocadas por Pseudomonas syringae pv. garcae inoculada pelos métodos de

agulhas múltiplas e abrasão, em germoplasma diverso de Coffea arabica.

Germoplasma

Escala de pontos Área abaixo da curva de progresso da doença

Agulhas Múltiplas

Abrasão Agulhas Múltiplas Abrasão

Média

IC DP CV

Média

IC DP CV Média IC DP CV Média IC DP CV

(%) (%) (%) (%)

SL 28 1,75 a 0,98 0,71 40,41

2,00 a 1,27 1,12 55,90 62,22 a 3,71 15,03 24,16 70,78 a 5,62 26,30 37,15

K 7 2,43 abc 1,10 0,98 40,18

3,67 ab 1,01 1,03 28,17 86,33 bc 7,17 37,47 43,41 135,33 bc 9,08 49,03 36,23

Bourbon Vermelho 2,25 abc 0,64 0,46 20,57

3,38 ab 0,84 0,74 22,05 89,25 bc 3,32 14,84 16,64 128,63 bc 3,53 19,05 14,82

Icatu Vermelho 2,59 abc 0,90 0,80 30,74

2,86 ab 0,97 0,99 34,58 83,36 b 4,00 20,93 25,11 96,73 b 4,58 28,38 29,34

H6839-4 1,65 a 0,83 0,73 44,45

2,00 a 1,05 0,93 46,29 68,89 ab 3,35 15,69 22,79 77,64 ab 4,34 21,91 22,90

H6839-84 2,61 abc 0,82 0,72 27,69

2,70 ab 0,93 0,82 30,50 81,57 b 2,96 14,41 17,67 95,26 b 4,50 21,90 23,90

H6839-101 2,38 abc 0,76 0,67 28,10

2,86 ab 0,90 0,79 27,75 80,67 b 2,76 14,45 17,91 102,00 b 4,17 21,06 20,65

IAC 4309-34 2,72 abc 0,76 0,67 24,58

2,95 ab 0,89 0,91 30,92 79,72 b 2,67 12,50 15,69 95,05 b 4,16 21,04 22,16

IAC 4309-65 3,08 c 0,33 0,29 9,36

3,38 abc 0,85 0,87 25,70 91,58 bc 2,16 10,53 11,50 107,15 b 4,72 26,25 24,50

IAC 4309-110 2,64 abc 0,82 0,73 27,57

3,09 ab 1,13 1,15 37,24 87,82 bc 4,22 19,77 22,51 106,91 bc 6,05 33,69 31,51

IAC 125 RN 2,83 bc 0,54 0,48 17,00

4,08 b 0,76 0,78 18,99 93,21 c 2,12 11,11 10,98 136,83 c 4,5 27,97 20,15

Médias seguidas por uma letra igual não diferem entre si, pelo intervalo de confiança ao nível de 5% de probabilidade. H = híbrido.

59

Os valores de IC obtidos nos tratamentos cujas plantas foram inoculadas por

agulhas múltiplas, foram menores em relação às plantas por abrasão, independente da

variável analisada.

Como no primeiro experimento, os níveis variáveis de resistência à mancha-

aureolada do germoplasma avaliado foi corroborado pelos dois métodos de inoculação

das plantas.

O CV das variáveis EP e AACPD do germoplasma avaliado no segundo

experimento variaram entre 9,36% e 40,41%, sendo inferiores àqueles observados no

primeiro experimento, com variação entre 13,5% e 73,7%.

Já para o DP, a técnica de inoculação por abrasão resultou em menores valores,

especialmente nas análises por meio da AACPD, sendo esses valores similares entre os

dois métodos de inoculação avaliados.

A variável AACPD foi calculada segundo a equação descrita no item 3.3, com

base em dados da escala de pontos utilizada para avaliação da severidade da doença aos

7, 14, 21, 28, 35 e 42 DAI. Dessa forma, além da AACPD total, aos 42 DAI, também

foram obtidos valores parciais da variável AACPD (14 a 35 DAI) correspondentes aos

períodos de avaliação da EP, os quais submetidos a uma análise de correlação geraram

os resultados apresentados na tabela 10.

Os resultados indicaram que a correlação da AACPD total, ou seja calculada a

partir na somatória de todos os períodos de avaliação, com as AACPD parciais são

sempre maiores em cafeeiros inoculados pelo método de abrasão. Neste método a

correlação da ACPD aos 42 DAI com os valores parciais obtidos aos 7, 14, 21, 28 e 35

foi igual ou superior a 0,90.

Tabela 10 - Estimativas das correlações de Spearman entre os valores da AACPD aos

7, 14, 21, 35 e 42 dias após a inoculação (DAI) de Pseudomonas syringae pv. garcae

em folhas de onze genótipos de cafeeiros, pelos métodos de agulhas múltiplas e abrasão.

DAI Agulhas Múltiplas (DAI) Abrasão (DAI)

14 21 28 35 42 14 21 28 35 42

7 0,96* 0,93* 0,93* 0,87* 0,77* 0,98* 0,97* 0,93* 0,95* 0,91*

14

0,98* 0,98* 0,92* 0,80*

0,96* 0,93* 0,93* 0,90*

21

1,00* 0,96* 0,88*

0,97* 0,96* 0,92*

28

0,96* 0,88*

0,99* 0,97*

35

0,95*

0,98*

* = significativo a 5% de probabilidade.

60


Coffea spp.

Os resultados relacionados à identificação de fontes de resistência a P. syringae

pv. garcae em Coffea spp. estão apresentados na tabela 11. No experimento 1, foi

constatada segregação para resistência a P. syringae pv. garcae em praticamente todas

as espécies alógamas. Todos os indivíduos de C. kapakata avaliados foram classificados

como suscetíveis, mesmo padrão observado nas espécies autógamas C. anthonyi, C.

arabica e C. heterocalyx. Cafeeiros resistentes foram observados nas espécies C.

salvatrix, C. stenophylla, C. eugenioides e C. canephora. As espécies C. liberica var.

passipagore, C. humilis e C. congensis apresentaram 8,4%, 30% e 62,5% dos

indivíduos com resistência moderada à bactéria.

Tabela 11 - Frequência de cafeeiros resistentes (R), moderadamente resistentes (MR) e

suscetíveis (S) segundo escala de 0 a 5 pontos em Coffea spp. em resposta a infecção

por Pseudomonas syringae pv. garcae, avaliadas no experimento 1.

* R = resistente, nota 0 na escala de pontos.; MR = moderadamente resistente, nota 1 na escala

de pontos; S = suscetível, com 2 a 5 pontos na escala de notas.

Espécie Plantas Nível de resistência*

R MR S

n° n° % n° % n° %

C. arabica cv. IAC 125 RN 12 0 0,0 0 0,0 12 100,0

C. arabica cv. IAC 376-4 8 0 0,0 0 0,0 8 100,0

C. arabica cv. IAC 81 8 0 0,0 0 0,0 8 100,0

C. anthonyi 3 0 0,0 0 0,0 3 100,0

C. heterocalyx 4 0 0,0 0 0,0 4 100,0

C. kapakata 12 0 0,0 0 0,0 12 100,0

C. humilis 12 0 0,0 1 8,4 11 91,6

C. liberica var. passipagore 10 0 0,0 3 30,0 7 70,0

C. congensis IAC 4349 8 0 0,0 5 62,5 3 37,5

C. canephora 7 3 42,9 1 14,2 3 42,9

C. eugenioides 11 2 18,2 6 54,5 3 27,3

C. stenophylla 6 1 16,6 4 66,8 1 16,6

C. salvatrix 11 4 36,4 4 36,4 3 27,2

61

A variabilidade intra-específica presente em algumas espécies do gênero Coffea,

representada pela curva de evolução da doença e pela AACPD em plantas individuais, é

ilustrada na figura 10.

Cafeeiros das cultivares Catuaí Vermelho IAC 81 e IAC 125 RN de C. arabica

apresentaram um mesmo padrão de resposta, com evolução continuada no crescimento

das lesões do 7° ao 42 DAI do patógeno (Figura 10K e L).

Embora as espécies diploides autógamas C. heterocalyx e C. anthonyi tenham se

revelado suscetíveis em relação a todos os indivíduos avaliados, as curvas de evolução

da doença em plantas individuais se revelaram distintas umas das outras. Em C.

anthonyi, o cafeeiro 1 apresentou, aos 14 DAI, lesões correspondentes a 3 pontos na

escala de avaliação de danos, enquanto que dos outros indivíduos da espécies foram

atribuídas apenas 1 ponto, no mesmo período (Figura 10A). Situação semelhante foi

observada entre cafeeiros da espécie C. heterocalyx (Figura 10E).

Entre as espécies diploides alógamas (C. canephora, C. eugenioides, C.

stenophylla e C. salvatrix), nos segregantes para a resistência à doença, observou-se as

mesmas variações descritas para as espécies diploides autógamas.

Em C. canephora, os cafeeiros 3 e 5 (Figura 10B), ambos suscetíveis à mancha-

aureolada, foram classificados com 5 pontos, na escala de danos, aos 42 DAI. No

entanto, esta marca na escala foi alcançada pelo cafeeiro 5, apenas aos 35 DAI enquanto

o mesmo nível de danos se manifestou duas semanas antes no cafeeiro 3.

Diferenças na evolução da doença em cafeeiros altamente suscetíveis,

classificados com 5 pontos aos 42 DAI, foram também observadas em outras espécies

diploides, como C. kapakata (Figura 10G). Aos 28 DAI, o cafeeiro 11 apresentava

sintomas equivalentes a 2 pontos na escala utilizada para avaliação do dano causado

pela bactéria, enquanto que no cafeeiro 3, os danos eram de grande magnitude,

correspondentes a 5 pontos na mesma escala.

62

Figura 10 - Curva da evolução da mancha-aureolada em cafeeiros de espécies de

Coffea spp., avaliados por meio de escala de zero a cinco pontos e da Área abaixo da

curva de progresso da doença (AACPD). (Continua).

0

1

2

3

4

5

Po

nto

s

C. anthonyi

1(161,00) 2 (98,00)

3 (119,00)

C. canephora

1 (56,00) 2 (161,00) 3 (189,00)

4 (154,00) 5 (154,00) 6 (21,00)

7 (21,00)

0

1

2

3

4

5

Po

nto

s

C. congensis

1 (56,00) 2 (84,00)

3 (63,00) 4 (35,00)

5 (112,00) 6 (35,00)

7 (84,00) 8 (63,00)

C. eugenioides

1 (70,00) 2 (28,00)

3 (63,00) 4 (98,00)

5 (63,00) 6 (56,00)

7 (105,00) 8 (28,00)

9 (84,00) 10 (56,00)

11 (91,00) 12 (21,00)

0

1

2

3

4

5

7 14 21 28 35 42

Po

nto

s

DAI

C. heterocalyx

1 (84,00) 2 (140,00)

3 (84,00) 4 (84,00)

7 14 21 28 35 42DAI

C. humilis

1 (84,00) 2 (63,00)3 (63,00) 4 (126,00)5 (119,00) 6 (84,00)7 (63,00) 8 (91,00)9 (77,00) 10 (105,00)

(1)

(3)

(2, 3, 5)

(4)

(1)

(6, 7)

(2)

(5)

(2, 7 )

(1, 3, 4, 6, 8)

(3)

(1, 5, 7, 9, 11)

(2, 4, 6, 8, 10)

(12)

(1, 2)

(3,4)

(4, 5, 10)

(6, 8, 9, 12)

(9, 11)

(1, 2, 3, 7)

A

B

C

D

E

F

63

Figura 10 – (Continuação) Curva da evolução da mancha-aureolada em cafeeiros de

espécies de Coffea spp., avaliados por meio de escala de zero a cinco pontos e da Área

abaixo da curva de progresso da doença (AACPD).

0

1

2

3

4

5

Po

nto

s

C. kapakata

1 (113,00) 2 (126,00)3 (189,00) 4 (140,00)5 (140,00) 6 (126,00)7 (133,00) 8 (119,00)9 (119,00) 10 (133,00)11 (119,00) 12 (119,00)

C. liberica var. passipagore

1 (70,00) 2 (56,00) 3 (84,00)

4 (98,00) 5 (98,00) 6 (91,00)

7 (56,00) 8 (28,00) 9 (147,00)

10 (49,00)

0

1

2

3

4

5

Po

nto

s

C. salvatrix

1 (21,00) 2 (56,00)

3 (28,00) 4 (28,00)

5 (21,00) 6 (70,00)

7 (28,00) 8 (21,00)

9 (21,00) 10 (84,00)

11 (63,00)

C. stenophylla

1 (63,00) 2 (35,00) 3 (84,00)

4 (28,00) 5 (21,00) 6 (49,00)

0

1

2

3

4

5

7 14 21 28 35 42

Po

nto

s

DAI

C. arabica cv. Catuaí Vermelho

IAC 81

1 (105,00) 2 (112,00)

3 (91,00) 4 (84,00)

5 (98,00) 6 (112,00)

7 (112,00) 8 (112,00)

7 14 21 28 35 42DAI

C. arabica cv. IAC 125 RN

1 (126,00) 2 (91,00) 3 (91,00)

4 (133,00) 5 (91,00) 6 (105,00)

7 (126,00) 8 (112,00) 9 (147,00)

10 (105,00) 11 (147,00) 12 (91,00)

(6)

(2,3)

(9)

(1, 4, 5, 7,8, 10)

(1 - 12)

(2, 3, 4, 7)

(3)

(6)

(10,11)

(1, 2, 4, 6)

(5)

(3, 4)

(1, 4, 9, 11)

(6, 7, 8, 10)

(2, 3, 5, 12)

(1, 5, 8, 9)

(1)

G

(2, 5, 6, 7, 8)

H

I

J

A

K

L

64

Sintomas de natureza variável foram observados em folhas das espécies de

Coffea spp., inoculadas com P. syringae pv. garcae pelo método de abrasão, conforme

ilustrado na figura 11.

Figura 11 - Sintomas observados aos 21 dias após a inoculação com Pseudomonas

syringae pv. garcae, em folhas de espécies de Coffea spp. pelo método de abrasão. C.

arabica cv. IAC 125 RN (A); C. congensis (B); C. kapakata (C); C. eugenioides (D); C.

salvatrix (E); C. stenophylla (F); C. liberica var. passipagore (G); C. anthonyi (H); C.

humilis (I); C. heterocalyx (J); C. canephora (K); C. arabica cv. Catuaí Vermelho

IAC 81 (L).

Cafeeiros das espécies C. salvatrix (Figura 11E), C. canephora (Figura 11K) e

C. congensis (Figura 11B), considerados resistentes à doença, exibiram lesões com

aspecto seco, sem alterações visíveis ao redor dos ferimentos causados pela inoculação.

Em plantas resistentes das espécies C. eugenioides e C. stenophylla, observou-se

escurecimento ao redor dos pontos de inoculação e, em alguns ferimentos, notou-se a

presença de halo amarelado, indicação provável de danos ocasionados pela tabtoxina

B A D C

F E H G

J I L K

65

sintetizada pela bactéria (BENDER et al., 1999). No entanto, não foram observados

sinais visuais da colonização, como exemplificado na figura 12, e o exames de

exsudação em gota, visto ao microscópio foram negativos.

Figura 12 - Face abaxial de folha de cafeeiro da cultivar IAC 125 RN de Coffe arabica,

inoculada com Pseudomonas syringae pv. garcae pelo método de abrasão, presença de

colonização dos tecidos foliares adjacentes aos ferimentos, ocasionados pela inoculação

por abrasão.

Reação distinta foi observada em C. kapakata (Figura 11C). Aos sete DAI, os

sintomas desenvolvidos pela bactéria ultrapassavam a nota três da escala de pontos e,

aos 14 DAI, praticamente todas as plantas já apresentavam nota cinco. Entre o sétimo e

o vigésimo primeiro DAI, praticamente todas as folhas inoculadas sofreram abscisão e,

em alguns os casos, a bactéria foi capaz de colonizar outras partes das mudas.

Em um segundo experimento, realizado em 2014 com espécies de Coffea spp.,

observou-se a variabilidade similar à descrita no germoplasma avaliado no ano anterior

(Tabela 12). A maior porcentagem de cafeeiros resistentes (42,1%) foi encontrada em

progênies da espécie C. eugenioides, sendo que, aproximadamente 52,6% dos

indivíduos das outras espécies, revelaram-se suscetíveis ao patógeno.

As espécies C kapakata (21), C. humilis (2) e C. congensis Bangelan

apresentaram 100% de cafeeiros suscetíveis, assim como, a cultivar IAC 125 RN de C.

arabica.

As demais espécies segregaram em proporção variável em relação ao nível de

resistência a P. syringae pv. garcae.

66

Tabela 12 - Frequência de cafeeios resistentes (R), moderadamente resistentes (MR) e

suscetíveis (S) segundo a avaliação pela escala de 0-5 pontos, aos 42 dias após a

inoculação com Pseudomonas syringae pv. garcae, avaliadas no experimento 4.

Germoplasma Plantas Nível de resistência*

R MR S

n° n° % n° % n° %

C. arabica cv. IAC 125 RN 17 0 0,0 0 0,0 17 100,0

C. congensis Bangelan 23 0 0,0 0 0,0 23 100,0

C. humilis 2 0 0,0 0 0,0 2 100,0

C. kapakata 21 0 0,0 0 0,0 21 100,0

C. liberica var. dewevrei - Uganda 19 2 10,5 0 0,0 17 89,5

C congensis IAC 4349 16 3 18,8 2 12,4 11 68,8

C. liberica var. liberica - Abeokutae 16 1 6,3 5 31,2 10 62,5

C. eugenioides 19 8 42,1 1 5,3 10 52,6

C. congensis x C. canephora IAC 4350 20 8 40,0 3 15,0 9 45,0

* R = resistente, nota 0 na escala de pontos MR = moderadamente resistente, nota 1 na escala de

pontos; S = suscetível, com 2 a 5 pontos na escala de notas.

Os resultados obtidos em dois experimentos com a avaliação de cafeeiros

silvestres da espécie C. arabica, oriundos de uma prospecção realizada pela FAO, na

Etiópia em 1968, são apresentados nas tabelas 13 e 14.

67

Tabela 13 - Total de cafeeiros inoculados com Pseudomonas syringae pv. garcae,

frequência de plantas resistentes (R), moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S)

segundo a avaliação pela escala de 0 a 5 pontos, aos 42 dias após a inoculação e

severidade média da mancha-aureolada comparada pela área abaixo da curva de

progresso do doença (AACPD), provocadas pelas inoculações artificiais em 22

introduções de Coffea arabica oriundas da Etiópia, avaliadas no experimento dois.

Acesso Plantas Nível de resistência*

AACPD** R MR S

n° n° % n° % n° %

C. arabica cv. IAC 125 RN 17 0 0,0 0 0,0 17 100,0 135,30 a

ETP 3 17 0 0,0 1 5,9 16 94,1 118,40 ab

ETP 12 10 0 0,0 6 60 4 40 87,45 bc

ETP 15 16 3 18,7 6 37,5 7 43,8 73,92 cd

ETP 14 10 0 0,0 2 20,0 8 80,0 73,30 cde

ETP 5 15 1 6,7 8 53,3 6 40,0 73,15 cde

ETP 19 21 1 4,8 14 66,6 6 28,6 54,01 def

ETP 4 17 0 0,0 16 94,1 1 5,9 50,82 def

ETP 13 17 4 23,5 12 70,6 1 5,9 48,18 def

ETP 6 20 2 10,0 18 90,0 0 0,0 47,85 def

ETP 16 10 3 30,0 4 40,0 3 30,0 47,30 defg

ETP 21 18 3 16,67 13 72,2 2 11,1 45,54 efg

ETP 7 19 2 10,5 17 89,5 0 0,0 45,76 efg

ETP 18 17 1 5,9 14 82,4 2 11,7 43,67 efg

ETP 2 13 2 15,4 11 84,6 0 0 42,30 efg

ETP 17 19 4 21,1 15 78,9 0 0 41,69 efg

ETP 8 17 4 23,5 13 76,5 0 0 41,85 efg

ETP 9 19 6 31,5 12 63,2 1 5,3 38,50 fg

ETP 11 14 5 35,7 7 50,0 2 14,3 38,12 fg

ETP 10 18 7 36,9 11 61,1 0 0 36,96 fg

ETP 1 17 2 11,8 15 88,2 0 0 36,58 fg

ETP 20 18 9 50,0 9 50,0 0 0 28,11 fg

ETP 22 20 20 100,0 0 0,0 0 0 18,15 g


de pontos; S = suscetível, com 2 a 5 pontos na escala de notas. ** Médias seguidas por uma

mesma letra não diferem entre si, pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ao nível de 5%

de probabilidade.

68

Tabela 14 - Total de cafeeiros inoculados com Pseudomonas syringae pv. garcae,

frequência de plantas resistentes (R), moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S)

segundo a avaliação pela escala de 0 a 5 pontos, aos 42 dias após a inoculação e

severidade média da mancha-aureolada comparada pela área abaixo da curva de

progresso do doença (AACPD), provocadas pelas inoculações artificiais em 23

introduções de Coffea arabica oriundas da Etiópia, avaliadas no experimento três.

Acesso Plantas Nível de resistência*

AACPD** R MR S

n° n° % n° % n° %

C. arabica cv. IAC 125 RN 17 0 0,0 0 0,0 17 100,0 96,75 a

ETP 29 11 0 0,0 5 45,5 6 54,5 80,19 ab

ETP 40 21 3 14,3 7 33,3 11 52,4 68,09 bc

ETP 44 15 1 6,6 7 46,7 7 46,7 63,80 bcd

ETP 30 18 3 16,6 10 55,6 5 27,8 57,75 bcde

ETP 34 15 1 6,7 12 80,0 2 13,3 50,60 cdef

ETP 45 18 0 0,0 18 100,0 0 0,0 48,57 cdef

ETP 35 22 6 27,3 14 63,6 2 9,1 44,77 cdef

ETP 31 13 1 7,7 12 92,3 0 0,0 44,72 cdef

ETP 41 16 5 31,2 6 37,5 5 31,3 44,44 cdef

ETP 32 25 2 8,0 23 92,0 0 0,0 43,78 def

ETP 39 20 6 30,0 14 70,0 0 0,0 41,25 def

ETP 26 21 3 14,3 18 85,7 0 0,0 41,14 def

ETP 33 22 4 18,2 18 81,8 0 0,0 40,98 def

ETP 42 18 4 22,2 13 72,2 1 5,6 40,04 def

ETP 27 21 7 33,3 14 66,7 0 0,0 39,88 def

ETP 36 13 6 46,2 5 38,4 2 15,4 39,66 def

ETP 24 22 5 22,7 17 77,3 0 0,0 38,01 ef

ETP 28 14 5 35,7 9 64,3 0 0,0 34,98 ef

ETP 25 13 6 46,2 7 53,8 0 0,0 34,71 ef

ETP 43 21 4 19,0 17 81,0 0 0,0 34,49 ef

ETP 38 16 6 37,5 10 62,5 0 0,0 31,30 f

ETP 37 21 12 57,1 9 42,9 0 0,0 28,88 f

ETP 23 15 9 60,0 6 40,0 0 0,0 27,89 f




de probabilidade.

69

A cultivar IAC 125 RN, suscetível à mancha-aureolada apresentou os maiores

valores da AACPD nos dois experimentos com acesss Etíopes.

No primeiro experimento (Tabela 13) realizado com 22 acessos oriundos de

região de origem e diversificação da espécia C. arabica, a progênies ETP 22 apresentou

100% de seus cafeeiros resistentes à mancha-aureolada. As progênies ETP 1, ETP 2,

ETP 6, ETP 7, ETP 8, ETP 10, ETP 17, e ETP 20) apresentaram 100% de plantas de

suas progênies consideradas resistentes e moderadamente resistentes à doença. Apenas

duas progênies (ETP 3 e ETP 12) foram consideradas, em média, suscetíveis a P.

syringae pv. garcae, em função da elevada frequência de cafeeiros com notas de dano

igual ou superior a cinco. Apenas o acesso ETP 3 apresentou AACPD de mesma

magnitude que a cultivar testemunha IAC 125 RN.

No segundo experimento (Tabela 14), dos 23 acessos avaliados, 14 acessos

apresentaram 100% de plantas resistentes a moderadamente resistentes em suas

progênies e apenas três acessos, ETP 44, ETP 40 e ETP 29 apresentaram entre 46,7 e

54,5% de plantas suscetíveis nas progênies. A AACPD do controle suscetível, IAC 125

RN, foi semelhante apenas àquela observada no aceso ETP 29. As maiores porcentagens

de cafeeiros resistentes à doença foram encontradas nos acessos ETP 23 (60,0%) e ETP

37 (57,1%) que também apresentaram as menores médias de AACPD, 27,89 e 28,88,

respectivamente.

Em algumas progênies (ETP 5, ETP 8, ETP 9, ETP 13, ETP 17 e ETP 30) dos

dois experimentos o patógeno foi capaz de infectar tecidos foliares no local das

inoculações e, posteriormente, as lesões foram caracterizadas como reação de

hipersensibilidade localizada, com ocorrência de abscisão do tecido, semelhantes às

lesões do tipo “shot-hole”.

A resistência de progênies de quatro cafeeiros oriundos da hibridação entre C.

eugenioides (resistente), e C. arabica (suscetível) foi avaliada em dois experimentos,

sendo o primeiro constituído por progênies de polinização aberta e o segundo por

progênies de autofecundação. Os resultados relacionados à severidade da mancha-

aureolada são apresentados na tabela 15.

70

Tabela 15 – Número total de plantas e frequência de plantas resistentes (R),

moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S) de progênies de híbridos (Coffea

eugenioides x C. arabica) segundo a avaliação pela escala de 0 a 5 pontos aos 42 dias

após a inoculação com Pseudomonas syringae pv. garcae.

Híbridos Geração Plantas Nível de resistência*

R MR S n° n° % n° % n° %

H 5999-1-2PA F1 3 1 33,3 0 0,0 2 66,7

H 14772-1PA F1 23 2 8,7 7 30,4 14 60,9

H 3497-1PA F1 11 0 0,0 1 9,0 10 91,0

H 14503-1PA RC1 15 0 0,0 1 6,67 14 93,3

C. arabica cv. IAC 125 RN - 12 0 0,0 0 0,0 12 100,0

H 5999-1-2A F1 5 3 60,0 2 40,0 0 0,0

H 14503-1A RC1 5 0 0,0 0 0,0 5 100,0

C. arabica cv. IAC 125 RN - 12 0 0,0 0 0,0 12 100,0 A = Progênies obtidas por autofecundação; PA = Progênies obtidas popr polinização aberta; * R

= resistente, nota 0 na escala de pontos, MR = moderadamente resistente, nota 1 na escala de

pontos e S = suscetível, com 2 a 5 pontos na escala de notas.

A natureza híbrida do material dificultou a obtenção de mudas para as

avaliações. As progênies de polinização aberta apresentaram entre 60,9% a 93,3% de

plantas suscetíveis. As mudas obtidas por autofecundação do híbrido H 5999-1-2 foram

classificadas como resistentes (3) ou moderadamente resistentes (2) a P. syringae pv.

garcae. Por outro lado, a mesma progênie H 5999-1-2, segregou na proporção 1R:2S

quando não autofecundada. Na progênie do híbrido 14503-1 todas as plantas avaliadas

revelaram-se suscetíveis e, portanto, esse híbrido não carrega genes de resistência

oriundos de C. eugenioides.

Progênies F2RC1 obtidas por autofecundação ou por polinização aberta do

cafeeiro RC1 H 14503-1 apresentaram 100,0% e 93,3% de plantas suscetíveis em suas

progênies.

Os resultados da avaliação de germoplasma exótico de C. arabica em relação à

reação à infecção por P. syringae pv. garcae encontram-se na tabela 16.

71

Tabela 16 – Número total de cafeeiros inoculados, frequência de plantas resistentes (R),

moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S), segundo avaliação pela escala de 0-5

pontos aos 42 dias após a inoculação e área abaixo da curva de progresso da doença

(AACPD) do germoplasma avaliado em relação à infecção pela bactéria Pseudomonas

syringae pv. garcae.

Germoplasma Plantas Nível de resistência*

AACPD** R MR S

n° n° % n° % n° %

C. arabica cv. IAC 125 RN 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 138,70 b

C. arabica cv. Villa Lobos 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 153,90 b

São Bernardo x Mundo Novo 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 151,05 b

C. arabica var. Pacas 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 150,10 b

C. arabica var. Abissínica 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 149,15 b

C. arabica var. Crassinérvia 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 149,15 b

C. arabica var. Pêndula 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 149,15 b

C. arabica cv. Ibaaré 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 145,92 b

C. arabica var. Gláucia 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 144,40 b

Catuaí Vermelho x Erecta 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 142,50 b

C. arabica cv. Iarana 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 142,50 b

C. arabica cv. Mokka 6 0 0,0 0 0,0 6 100,0 142,50 b

C. arabica cv. Villa Sarchí 6 2 33,3 0 0,0 4 66,7 90,25 ab

C. arabica var. Dilla & Alghe 6 2 33,3 1 16,7 3 50,0 84,55 ab

C. arabica cv. São Bernardo 5 2 40,0 0 0,0 3 60,0 82,65 ab

C. arabica cv. IPR 102 6 6 100,0 0 0,0 0 0,0 11,40 a

C. arabica var. Pálido Viridis 6 6 100,0 0 0,0 0 0,0 11,40 a




de probabilidade.

Praticamente todas as variedades, formas botânicas, mutantes e híbridos foram

suscetíveis ao patógeno, com exceção do mutante Pálido Viridis, que se revelou

altamente resistente, como a cultivar IPR 102. As cultivares Villa Sarchí e São Bernardo

e a variedade Dilla & Algue apresentaram comportamento intermediário, com

segregação para a característica.

72

Genótipos selecionados em campo, em ensaios de progênies em gerações avançadas, no

PMG do IAC foram avaliados em relação a resposta à infecção por P. syringae pv.

garcae no oitavo experimento. Os resultados são apresentados na tabela 17. Constatou-

se que progênies dos cafeeiros H 13439-8-C1736 e Catuaí SH3-C1621 apresentaram

segregação com presença de plantas com resistência moderada e suscetíveis. A progênie

H 13439-8-C1736 apresentou 61,1% de cafeeiros com tipo de reação moderadamente

resistentes e a menor média de AACPD (51,51).

Tabela 17 - Número de cafeeiros inoculados, frequência de plantas resistentes (R),

moderadamente resistentes (MR) e suscetíveis (S), segundo avaliação pela escala de 0 a

5 pontos e, reação de seleções de Coffea arabica inoculadas com Pseudomonas

syringae pv. garcae, pela média da área abaixo da curva de progresso da doença

(AACPD).

Seleções de C. arabica Plantas Nível de resistência*

AACPD** R MR S

n° n° % n° % n° %

C. arabica cv. IAC 125 RN 10 0 0,0 0 0,0 10 100,0 117,00 c

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3-1611 15 0 0,0 0 0,0 15 100,0 117,00 c

C. arabica cv. Mundo Novo LC 25 0 0,0 0 0,0 25 100,0 116,40 c

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3 P99-5 19 0 0,0 0 0,0 19 100,0 115,83 c

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3 P89-5 18 0 0,0 0 0,0 18 100,0 115,74 bc

C. arabica cv. Icatu Amarelo

IAC 2944-6 16 0 0,0 0 0,0 16 100,0 115,59 bc

H 7316-C1036 17 0 0,0 0 0,0 17 100,0 115,41 bc

C. arabica cv. IAC Ourama C51 25 0 0,0 0 0,0 25 100,0 115,38 bc

C. arabica cv. IAC Catuaí SH3-C1621 5 0 0,0 2 40 3 60 79,20 ab

IAC 4553 10 0 0,0 0 0,0 10 100,0 115,20 bc

C. arabica cv. IAC Ourama C13 22 0 0,0 0 0,0 22 100,0 115,17 bc

H 7316-C648 24 0 0,0 0 0,0 24 100,0 115,14 bc

H 13439-8-C1736 18 0 0,0 11 61,1 7 38,8 51,51 a

*R = resistente, nota 0 na escala de pontos.; MR = moderadamente resistente, nota 1 na escala

de pontos; S = suscetível, com 2 a 5 pontos na escala de notas. **Médias seguidas por uma


de probabilidade.

73


syringae pv. garcae

Os resultados relacionados à expressão da resistência em progênies F2 dos

cafeeiros H8089-2 e H8089-7 a P. syringae pv. garcae e aos isolados I/2015 e II/2015

de H. vastatrix, encontram-se na tabela 18.

Tabela 18 - Reação de progênies F2 dos cafeeiros H8089-2 e H8089-7, híbridos entre a

cultivar Catuaí Vermelho IAC 24 e a seleção Geisha IAC 1137-5, à infecção pela

bactéria Pseudomonas syringae pv. garcae e pelos isolados I/2015 (v2, v5) e II/2015 (v1,

v2, v5) de Hemileia vastatrix.

Parâmetro H8089-2 H8089-7 Total

Plantas (n°) 34 29 63

PHV I I/20151

(R:S) 6:28 10:19 16:47

PHV I II/20152

(R:S) 0:34 0:29 0:63

PPSG3

(R:S) 0:34 15:14 15:48 1Proporção (P) de plantas resistentes (R) e suscetíveis (S) ao isolado I/2015 de Hemileia

vastatrix.2 Proporção de plantas resistentes (R) e suscetíveis (S) ao Isolado II/2015 de Hemileia

vastatrix. 3 Proporção de plantas resistentes (R) e suscetíveis (S) a Pseudomonas syringae pv.

garcae.

De acordo com os resultados obtidos, as progênies F2 segregaram para a

resistência ao isolado I/2015 de H. vastatrix, mas revelaram-se suscetíveis ao isolado

II/2015 do fungo. Por outro lado, as 34 plantas da progênie H8089-2 se mostraram

suscetíveis à mancha-aureolada, enquanto a progênie H8089-7 segregou na proporção

aproximada de 1R:1S (Tabela 18).

Em resposta à infecção pelo isolado I/2015 de H. vastatrix, do total de progênies

analisadas, 16 plantas apresentaram reação de resistência e 47, de suscetibilidade. Para

P. syringae pv. garcae, foram identificadas 15 plantas com reação de resistência

enquanto que as 48 restantes apresentaram reação de suscetibilidade (Tabela 18).

Na tabela 19, encontram-se os dados referentes à análise comparativa da reação

das progênies F2 em relação à infecção por P. syringae pv. garcae e ao isolado I/2015

de H. vastatrix.

74

Tabela 19 - Número total de cafeeiros F2 de duas progênies do híbrido H8089

resistentes e suscetíveis a Pseudomonas syringae pv. garcae e ao isolado I/2015 de

Hemileia vastatrix.

Hemileia vastatrix

Isolado I/2015

Pseudomonas syringae pv. garcae Total

Resistente Suscetível

---------------------------------------------n°--------------------------------------------------

Resistente 6a 10b 16a+b

Suscetível 9c 38d 47c+d

Total 15a+c 48b+d 63n

Dos 63 cafeeiros F2 avaliados, 44 se revelaram simultaneamente resistentes (6) e

suscetíveis (38) ao isolado I/2015 de H. vastarix e à mancha-aureolada. Dezenove

plantas apresentaram reação oposta aos agentes bióticos, sendo dez, resistentes à

ferrugem e suscetíveis à bactéria e nove, resistentes à bactéria e suscetíveis à ferrugem

(Tabela 19).

Os resultados das análises estatísticas realizadas com os dados experimentais

obtidos encontram-se na tabela 20.

Tabela 20 - Estimativa de parâmetros relacionados à resposta de cafeeiros F2 de duas

progênies do híbrido H8089 à infecção pela bactéria Pseudomonas syringae pv. garcae

e pelo fungo Hemileia vastatrix.

Parâmetro H8089-2 H8089-7 Total

Exatidão do método (EM) (%) 82,35 55,17 69,84

Taxa de falso positivo (TFP) (%) 17,64 13,79 15,87

Taxa de falso negativo (TFN) (%) 0,0 31,03 14,29

Taxa total de erro (TTE) (%) 17,64 44,82 30,16

2 McNemar 4,17* 1,23ns 0,56ns

P value 0,04 0,27 0,45

Coeficiente de associação de Yule (Q) - 0,25 0,43

Desvio padrão de Q (sQ) - 0,37 0,32

Intervalo de confiança 95% de Q (ICQ95%) - 0,47 – 0,98 0,40 – 1,06

(-) Valores não calculados, uma vez que a taxa de falso negativo é zero; *significativo

ao nível de 5% de probabilidade; nsnão significativo.

A exatidão do método (EM) calculada com os dados da análise comparativa da

reação de cafeeiros à infecção por P. syringae pv. garcae e pelo isolado I/2015 de H.

75

vastatrix foi de 69,84% quando se considerou o total de plantas em F2, sendo no mesmo

grupo de plantas a taxa total de erro (TTE) igual a 30,16%.

O teste de 2 McNemar revelou-se significativo na progênie H8089-2 (4,17; p =

0,04) e não significativo na progênie H8089-7 (1,23; p = 0,27) e no grupo total de

plantas (0,56; p = 0,45). O coeficiente de associação de Yule foi igual a 0,25 para a

progênie H8089-7 e 0,43 no grupo total de plantas, não tendo sido calculado para a

progênie H8089-2, uma vez que a taxa de falso negativo, ou seja, de plantas suscetíveis

ao isolado I/2015 de H. vastatrix, mas resistentes a P. syringae pv. garcae foi igual a

zero.



Os resultados das análises de expressão gênica estão apresentados na figura 13.

A expressão do gene EDS1 foi crescente até três horas após a inoculação (HAI) na

cultivar IPR 102, tanto em plantas inoculadas com a bactéria como em plantas controle,

tratadas com solução salina. Na cultivar IAC 125 RN houve também aumento da

expressão nas plantas inoculadas com P. syringae pv. garcae até a terceira HAI,

enquanto que, nas plantas controle houve queda na expressão aos 15 minutos após a

inoculação, seguida por pequeno aumento as três HAI. Entre três e 12 HAI, houve

queda acentuada do nível da expressão em todos os tratamentos mas, valor maior da

magnitude foram observados 24 HAI em todas as amostras.

O gene PAD4 apresentou expressão relativa semelhante ao gene EDS1. O pico

de atividade deste gene deu-se no tempo três HAI. Contudo, seis HAI todos os

tratamentos apresentaram redução da expressão, com tendência à estabilização. No

período seguinte, ou seja, 12 HAI a expressão gênica em plantas da cultivar IPR 102 foi

maior do que aquela observada na cultivar IAC 125 RN, independentemente do tipo de

inóculo das plantas. A expressão do gene PAD4 em, 24 HAI foi maior na cultivar IPR

102 inoculada com a bactéria P. syringae pv. garcae e menor nos demais tratamentos.

A expressão do gene APX esteve mais elevada aos 15 minutos após a inoculação

na cultivar IAC 125 RN inoculada com solução salina. No período entre três e seis HAI

detectou-se uma queda nível de expressão gênica que voltou a aumentar até 24 HAI,

76

especialmente em folhas da cultivar IAC 125 inoculadas com a bactéria ou mesmo com

solução salina.

O gene que codifica a enzima CAT, apresentou tendência de aumento da

expressão logo após a inoculação, seguida por queda, em todos os tratamentos até seis

HAI. A expressão voltou crescer após 12 HAI, estabilizando-se até 24 HAI, nos

tratamentos inoculados com solução salina, mas reduzindo os níveis de expressão nas

cultivares inoculadas com a bactéria.

A expressão do gene que codifica a SOD foi diferencial entre os genótipos. A

cultivar IPR 102 oscilou entre picos e queda acentuada nos níveis de expressão durante

o período de colonização avaliado. A cultivar IAC 125 RN apresentou expressão mais

estável para esta enzima, mantendo-se próximos aos níveis de expressão das plantas

tratadas com solução salina. Seis HAI, os níveis de expressão da SOD foram maiores

em cafeeiros da cultivar IPR 102, independentemente do inóculo utilizado, sendo

àquelas inoculadas com a batéria P. syringae pv. garcae mais elevada em relação

àquelas inoculadas com solução salina. Ainda, as 12 HAI a expressão mostrou-se mais

elevada nas plantas da cultivar IPR 102 inoculada com solução salina.

O gene que codifica a enzima POX apresentou expressão diferencial entre o

genótipo suscetível e resistente. Plantas da cultivar suscetível IAC 125 RN inoculada

com solução salina tiveram maior da expressão em 15 minutos após a inoculação e nos

demais períodos avaliados houve pequena variação sendo similar às plantas inoculadas

com o patógeno. Já as plantas da cultivar resistente IPR 102 apresentaram maior

expressão antes da exposição ao patógeno. Após as inoculações em ambos os

tratamentos houve queda acentuada na taxa de expressão até o tempo seis HAI, e 12

HAI ocorreu aumento na expressão sendo que as 24 HAI observou-se nova tendência de

redução da expressão.

A expressão do gene que codifica a enzima β-1,3-glucanase (PR-2) apresentou

padrão de expressão semelhante em todos os tratamentos estudados. No período que

corresponde até 15 minutos após a inoculação plantas da cultivar IAC 125 RN

inoculadas com solução salina tiveram queda no nível de expressão, sendo

discretamente menor que a tendência apresentada pelos demais tratamentos no mesmo

período analisado. Nos períodos subsequentes até 12 HAI houve decréscimo no nível de

expressão, obtendo expressão relativa similar ao período que antecedeu as inoculações.

77

A expressão do gene que codifica a enzima ICL também teve um perfil de

expressão semelhante nos tratamentos até o tempo de 12 HAI. Plantas da cultivar IPR

102 inoculadas com a bactéria apresentaram aumento significativo de expressão em

relação aos demais tratamentos a partir de 12 HAI, sendo mais evidente no tempo

24 HAI.

A expressão do gene que codifica a enzima GLR apresentou baixa variação entre

os tratamentos. Expressão diferencial foi observada em plantas da cultivar IAC 125 RN

inoculadas com a bactéria e tratadas com solução salina que apresentaram aumento

acentuado da expressão relativa do gene. As plantas da cultivar IPR 102 também

apresentaram aumento da expressão do gene, no entanto em menor magnitude.

Figura 13 - Expressão relativa de genes associados à resposta de defesa, avaliados em

amostras foliares das cultivares IAC 125 RN e IPR 102 de Coffea arabica inoculadas

com Pseudomonas syringae pv. garcae e com solução salina (controle). As barras

representam desvios padrão para as triplicatas independentes. C. arabica cv. IAC 125

RN x Solução salina ( ); C. arabica cv. IAC 125 RN x P. syringae pv. garcae ( );

C. arabica cv. IPR 102 x Solução salina ( ); C. arabica cv. IPR 102 x P. syringae pv.

garcae ( ). Continua.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00 EDS1

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00 PAD4

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00 Ascorbato Peroxidase (APX)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00Superóxido Dismutase (SOD)

78

Figura 13 - (Continuação) Expressão relativa de genes associados à resposta de defesa,

avaliados em amostras foliares das cultivares IAC 125 RN e IPR 102 de Coffea arabica

inoculadas com Pseudomonas syringae pv. garcae e com solução salina (controle). As

barras representam desvios padrão para as triplicatas independentes. C. arabica cv. IAC

125 RN x Solução salina ( ); C. arabica cv. IAC 125 RN x P. syringae pv. garcae

( ); C. arabica cv. IPR 102 x Solução salina ( ); C. arabica cv. IPR 102 x P.

syringae pv. garcae ( ).

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00Catalase (CAT)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

Peroxidase (POX)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40β-1,3-glucanase (PR-2)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

Isocitrato liase (ICL)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00Glutationa redutase (GLR)

79

5. DISCUSSÃO



Os resultados obtidos podem ser úteis, tanto na compreensão do modo de

colonização por P. syringae pv. garcae no tecido foliar, bem como, da interação

bactéria-cafeeiro. Além disso, podem se transformar em importante ferramenta para

auxiliar programas de melhoramento genético de cafeeiro, visando resistência à

mancha-aureolada, principalmente na interpretação dos sintomas da doença.

Esse estudo possibilitou elucidar as alterações morfológicas e mecanismos de

infecção/colonização em folhas do terceiro internódio de café, infectadas pela bactéria

P. syringae pv. garcae. As alterações anatômicas observadas são semelhantes aos danos

induzidos por tabtoxina, com degradação da membrana tilacoide e cloroplastos,

favorecendo a colonização dos tecidos e sua utilização como substrato.

As alterações descritas por BENDER et al. (1999) foram claramente

identificadas neste estudo. Foi demonstrado que, o amarelecimento nos tecidos internos

do mesofilo, corresponde a aproximadamente o dobro dos danos que são observados

externamente na epiderme das folhas. Alterações como plasmólise do conteúdo celular

no mesofilo, bem como a hipertrofia e hiperplasia foram observadas nas folhas de

cafeeiro 20 DAI. Alterações similares foram observadas por Palmer & Bender (1995),

provocadas pela toxina coronatina em tomateiros inoculados com P. syringae pv.

tomato, como citado por BENDER et al. (1999) em revisão de literatura.

Na natureza, folhas de café são infectadas por bactérias fitopatogênicas através

de estômatos ou por ferimentos, causados principalmente por partículas de areia levadas

pelo vento (COSTA et al., 1957). Após a penetração no tecido foliar, as bactérias

ocupam os espaços inter e intracelulares, como observado na figura 6, sendo que as

bactérias são capazes de invadir o sistema vascular e de colonizar rapidamente os

tecidos, dando origem a extensas lesões, ocasionalmente em regiões mais distantes do

local de inoculação (Figura 6A).

Obstrução dos feixes vasculares foram observadas em nervuras, que estavam em

contato com a margem de colonização do tecido mesofílico colonizado, em folhas de

80

cafeiro da cultivar Mundo Novo IAC 376-4 de C. arabica (Figura 6F). Esta estratégia é

conhecida em algumas fitobactérias.

Os resultados aqui observados foram semelhantes àqueles obtidos por ROOS &

HATTINGH (1987). Os autores demostraram que P. syringae pv. morsprumorum, ao

colonizar folhas da cerejeira (Prunus avium), podia ser detectada a 3 cm, ou mais, do

ponto de inoculação, aos 10 DAI. Na interação entre P. syringae pv. syringae - tabaco

(Nicotiana benthamiana), MISAS-VILLAMIL et al. (2011) também demonstraram

forma similar de colonização de tecidos distantes do ponto de inoculação por meio de

vasos do xilema para movimentação, sendo esta uma propriedade importante desses

fitopatógenos.

ROOS & HATTINGH (1987) e HATTINGH et al. (1989) sugerem que P.

syringae pv. morsprumorum e P. syringae pv. syringae têm o mesmo comportamento

de penetração no hospedeiro, ou seja, infectam as folhas através dos estômatos, e

limitam-se inicialmente aos espaços intercelulares do mesofilo, próximos ao ponto de

inoculação, depois penetram em células do parênquima da bainha e vão para o sistema

vascular, movendo-se a partir daí para a nervura central, migrando para outras regiões

mais distantes. Esta estratégia aumenta a chance de sobrevivência, a longo prazo, do

agente patogênico, até que condições climáticas ideais proporcionem condições para

novos surtos. Os resultados do presente trabalho suportam esta hipótese, pois, a partir

de inoculações próximas ao feixe vascular, P. syringae pv. garcae colonizou outros

tecidos internos distantes do ponto de inoculação (Figuras 6E, 6F, 7A e 7B). Com base

nestas informações parece razoável supor que no cafeeiro, a morte do ápice em mudas

de café freqüentemente observadas em viveiros, causada por P. syringae pv. garcae,

pode ser potencializada pela colonização e eventual facilidade no transporte da bactéria

nos vasos do xilema e floema.

A presença de bactérias em feixes vasculares também confirma a hipótese de

movimentação e/ou de transporte para regiões distantes do local de colonização pelo

patógeno, ou seja, P. syringae pv. garcae causa a morte de folhas e ramos de cafeeiros,

movimentando-se mais rapidamente em direção ao ápice, através do xilema. Além

disso, as folhas e ramos situados abaixo do ponto de colonização também podem ser

infectados através do floema e também do xilema, podendo resultar na morte de folhas,

ramos e de plantas doentes.

81

5.2. Agressividade de isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae

De fato, o melhoramento genético de plantas perenes visando obter plantas

resistentes às bacterioses necessita de métodos eficientes, e com boa repetibilidade para

a avaliação do germoplasma a ser pesquisado. Uma vez que é necessário testar grande

quantidade de plantas, o que requer disponibilidade de espaço e recursos. É

recomendado que a seleção para resistência a bacterioses seja realizada por meio de

inoculações artificiais, utilizando-se isolados sabidamente agressivos, para aumentar o

rigor da seleção e, com isso, reduzir a possibilidade de quebra da resistência pelo

patógeno.

Os testes de patogenicidade efetuados, evidenciaram ampla diversidade

patogênica entre os isolados de P. syringae pv. garcae oriundos dos estados de São

Paulo e Minas Gerais. Fatores como a produção de polissacarídeo extracelular,

expressão de genes de virulência (como avr) e produção de toxinas e fito-hormonios,

normalmente estão associados às diferenças em agressividade por bactérias

(PRASANNATH, 2013).

Em conjunto com outros mecanismos, esses fatores podem justificar a reação

diferencial em relação à agressividade dos isolados, quando inoculados em diferentes

genótipos, como observado por PARADELA et al. (1974). Neste caso as diferenças em

agressividade podem ser explicadas pela capacidade do patógeno em responder as vias

de defesa da planta hospedeira.

Nesse contexto, a estreita ligação dos resultados deste trabalho com fatores

observados por PARADELA et al. (1974), KAIRU (1997) e por ITHIRU et al. (2013)

indicam a possibilidade da ocorrência de variabilidade intraespecífica do patógeno,

como conhecida em outras patovares, com a ocorrência de biótipos e raças distinguíveis

da espécie P. syringae, como por exemplo os patovares P. syringae pv. phaseolicola

(patogênica ao feijoeiro), P. syringae pv. tomato (patogênica ao tomateiro), P. syringae

pv. glycinea (patogênica à soja), P. syringae pv. pisi (patogênica à ervilha) e também

em outras espécies de fitobactérias como Xanthomonas oryzae pv. oryzae (patogênica

ao arroz), X. vesicatoria (patogênica ao tomateiro), X. campestris pv. malvacearum

(patogênica ao algodoeiro), X. axonopodis pv. manihotis (patogênica à mandioca),

Ralstonia solanacearum (patogênica a diversas culturas), entre outras, como citado por

JANSE (2005).

82

Os resultados obtidos nos experimentos deste trabalho são corroborados pelas

análises de patogenicidade de isolados realizados por MACIEL (2012). O autor

caracterizou a agressividade de isolados de P. syringae pv. garcae em relação à cultivar

Mundo Novo de C. arabica, onde obteve resultados semelhantes em termos de

diversidade, sendo os isolados IBSBF 65, IBSBF 75 e IBSBF 3024 os mais agressivos e

os isolados IBSBF 248, IBSBF 2999, IBSBF 3005 e IBSBF 3065 os menos agressivos.

Além da relação entre agressividade de isolados bacterianos em genótipos de

cafeeiros, descrita por ITHIRU et al. (2013), outro aspecto relevante é a possibilidade

de interação entre isolados e a temperatura durante o período de avaliação dos sintomas.

Variação na agressividade dos isolados IBSBF 65, IBSBF 75 e IBSBF 3024 foi

observada no experimento 3, em relação ao experimento 1, onde, utilizou-se

concentração de inóculo análoga, método de inoculação e condições de umidade relativa

em casa-de-vegetação semelhantes, os isolados foram menos agressivos no experimento

3. As menores temperaturas no período de realização do terceiro experimento estão

provavelmente associadas a essas observações, demonstrando a importância de se

utilizar mais de um isolado na seleção de plantas resistentes. De fato, a severidade de

doenças bacterianas pode ser influenciada pela temperatura.

Estudos realizados por JONES et al. (1984) em outro patossistema

demonstraram que P. cichorii desenvolvem lesões de tamanho crescente em gerânio e

crisântemo, em temperaturas entre 16 a 28 °C, com forte redução do tamanho das lesões

em temperaturas mais elevadas. Estudos sobre a agressividade de diferentes isolados de

uma mesma espécie bacteriana, sob diferentes temperaturas, são escassos na literatura.

As variações em agressividade dos isolados IBSBF 65, IBSBF 75 e IBSBF

3024, nos experimentos 1 e 3, indicam que estes isolados poderão causar diferentes

reações nas plantas, dependendo das condições locais de temperatura por ocasião dos

experimentos. Além deste fator, a origem da cultivar também pode estar correlacionada

com a agressividade. Experimentos futuros poderão confirmar estas hipóteses e ainda,

estabelecer com mais rigor, os isolados que devem ser prioritariamente utilizados nas

inoculações para a seleção de plantas resistentes.

Quanto à resposta de folhas de diferentes internódios em relação à agressividade

dos isolados, demonstrou-se que folhas já expandidas do primeiro par são mais

suscetíveis, uma vez que esta tendência de reação foi detectada em praticamente todos

os dezenove isolados testados (Anexo 2, página 115).

83

Estes dados corroboram os obtidos por OLIVEIRA et al. (1991) e ZOCCOLI et

al. (2011). Ambos já haviam observados que folhas jovens são mais suscetíveis à

mancha-aureolada. Embora as diferenças médias para o aparecimento dos sintomas

iniciais tenha sido de apenas quatro DAI, a severidade da doença foi similar em folhas

do segundo, terceiro e quarto internódios.

Segundo OLIVEIRA & ROMEIRO (1990), os compostos fenólicos presentes

em folhas velhas, sadias ou produzidos após as inoculações, são capazes de inibir

desenvolvimento da doença.

Em contrapartida, folhas inoculadas do quarto internódio resultaram nos maiores

PI, sendo similares às folhas do segunda e terceiro internódio, em média 12 DAI

(Anexo 2, página 115). Isso demonstra que os compostos fenólicos são produzidos em

diferentes quantidades nas folhas com diferentes estágios de maturação, e

provavelmente diferem quanto ao tipo de composto produzido. Também, os compostos

atrasam o desevolvimento da bactéria, mas não são capazes de inibi-la. Tal efeito foi

enfatizado pelo isolado IBSBF 1372, no experimento 2, sendo mais agressivo nas folhas

do quarto internódio em relação as demais folhas inoculadas (Anexo 2, página 115).


syringae pv. garcae

Um dos fatores de importância fundamental para o sucesso do PMG é a

avaliação do germoplasma contra mais de um isolado bacteriano. No entanto, devido às

dificuldades a respeito do melhoramento de plantas perenes, a utilização de isolados de

forma combinada nas inoculações pode reduzir o tempo e os recursos empregados.

Contudo, é recomendado ter conhecimento sobre a atividade bacteriocinogênica dos

isolados (MARINGONI & KUROZAWA, 2002).

Os resultados aqui relatados são contrastantes em relação àqueles obtidos por

KAIRU (1997), que demonstrou que isolados brasileiros de P. syringae pv. garcae

produzem bacteriocinas capazes de inibir o crescimento de linhagens bacterianas do

Quênia, e também, em alguns casos, de isolados brasileiros, incluindo-se os isolados

IBSBF 65 e IBSBF 248 que apresentaram atividade inibitória entre si.

KAIRU (1997) utilizou isolados (possivelmente produtores de bateriocinas)

crescidos em meio NA líquido, contra os isolados desenvolvidos em meio NA

adicionado de sacarose, para a tipificação quanto à sensibilidade a bacteriocinas. O

84

desenvolvimento dos isolados em meio líquido pode ter resultado em maior taxa de

multiplicação das células bacterianas e, consequentemente, em maior quantidade de

compostos antimicrobianos sintetizados pelos isolados bacterianos, resultando na

inibição de diversos isolados do patógeno.

Segundo VIDAVIER (1983) a produção de bacteriocinas pode ser afetada por

fatores como, meio de cultura empregado no teste, temperatura de incubação e também

pela fase de crescimento da bactéria. Portanto, as divergências dos resultados

observadas nos experimentos desta tese, em relação aos resultados obtidos por KAIRU

(1997), devem ser relacionados a esses fatores, uma vez que foram utilizados meios de

cultura bem como temperatura de incubação diferentes. Cabe ressaltar os resultados

obtidos por BIAGI & AZEVEDO (1992) que demonstraram que o meio de cultura 523

(KADO & HESKETT, 1970), utilizado neste estudo, resulta em melhores condições de

análise para este tipo de ensaio in vitro.

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os isolados utilizados em

mistura não possuem atividade antagônica entre si (Figura 8). Experimentos adicionais

in vitro relacionados à análise da produção e da sensibilidade à bacteriocinas,

conduzidos de acordo com metodologia utilizada por MARINGONI & KUROZAWA

(2002), reforçaram a não existência de atividade bacterinogênica entre isolados de P.

syringae pv. garcae.

A ausência de evidências sobre a produção/sensibilidade à bacteriocinas indica

não haver restrições quanto ao uso de misturas para inoculações. No entanto, a

combinação contento quatro isolados resultaram em menor expressão de sintomas,

devendo ser evitada. Todavia, inoculações com mistura de dois isolados foi realizada

com sucesso em ensaios de controle químico da mancha-aureolada do cafeeiro

(PATRÍCIO et al., 2008). O mesmo foi observado em outros patossistemas, por

exemplo, testes de resistência em pessegueiros (Prunus persica) e damasco (P.

armeniaca) a Xanthomonas arboricola pv. pruni, realizados por SOCQUET-

JUGLARD et al. (2012).

A inoculação com mistura de isolados pode reduzir ou anular o efeito de reação

diferencial de plantas de um mesmo genótipo, quando inoculados por isolados distintos,

conforme mencionado por PARADELA FILHO et al. (1974) e ITHIRU et al. (2013).

Experimentos comparando-se a inoculação de isolados de forma individual ou

combinada, em genótipos contrastantes para resistência à bactéria poderão validar ou

não esta hipótese.

85



No primeiro experimento, onde foram confrontados os métodos por aspersão e

agulhas múltiplas, os sintomas iniciais de colonização bacteriana surgiram entre três e

quatro dias após a inoculação, em ambos os métodos.

As plantas inoculadas por aspersão resultaram em baixa expressão dos sintomas

e apenas nas folhas jovens, ainda tenras, nas quais foi verificada maior severidade, em

geral, com lesões se desenvolvendo a partir dos bordos foliares. No entanto, este

método proporcionou as menores amplitudes de IC, resultado da baixa severidade da

doença e por consequência notas próximas da EP.

Considerando-se apenas os dados do primeiro par de folhas, a eficiência do

método por aspersão foi razoável na identificação de cafeeiros resistentes e suscetíveis a

P. syringae pv. garcae, entretanto, sua utilização requer atenção especial uma vez que

este método permitiu a ocorrência de escapes, resultado de incidências menores em

relação ao método de agulhas múltiplas, que proporcionou incidência de 100% nas

cultivares suscetíveis. Também inoculações por aspersão necessitam do preparo de

maiores quantidades de inóculo e a manutenção das plantas em câmara úmida por 24

horas antes das inoculações.

A cultivar resistente IPR 102 apresentou incidência considerada alta, até 66%

das folhas inoculadas. No entanto, para o cálculo desta variável foram considerados

como suscetível folhas com 1 ponto na escala, caso essa classe de plantas fossem

consideradas como resistentes a incidência passa a ser de apenas 17%, sendo esse

aspecto normal para uma cultivar nas fases finais de seleção. Nas avaliações realizadas

em experimento subsequentes com a mesma cultivar, mas com sementes oriundas de

geração mais avançada e plantas inoculadas por abrasão, 100% das plantas avaliadas

foram classificadas como resistentes (Tabela 16).

Compostos fenólicos estão envolvidos na resistência das plantas, e sua produção

pode variar devido a diversos fatores, entre eles a idade das folhas (OLIVEIRA &

ROMEIRO, 1990; OLIVEIRA et al., 1991; SALGADO et al., 2008). Deste modo, a

produção de fenóis em folhas do segundo e terceiro internódios pode estar associada às

diferenças na categorização dos genótipos. No entanto, os resultados obtidos em folhas

do quarto internódio sugerem queda na taxa de produção desses compostos, uma vez

86

que, as notas atribuídas à severidade da doença foram, em geral, similares ou maiores,

que aquelas conferidas às folhas dos segundo e especialmente do terceiro internódio.

A classificação dos genótipos pela AACPD, calculada pela evolução da doença

em folhas do quarto internódio mostrou-se ser eficiente. Contudo, seu uso apresenta

certa dificuldade operacional em relação às folhas do primeiro internódio, que se

mostraram mais indicadas para testes de resistência genética pela facilidade do

manuseio das mudas e também pela maior intensidade de danos observados nos tecidos

jovens.

Em geral o IC e CV foram semelhantes entre os dois métodos, já o DP foi mais

acentuado nos tratamentos inoculados por agulhas múltiplas. Estes resultados podem ser

atribuídos às maiores severidades ocasionadas pelo método, que resulta em maior

evidência das diferenças de suscetibilidade/resistência dentro dos tratamentos.

Os métodos testados no primeiro experimento resultaram em baixa severidade

da doença, avaliada pela escala de 0 a 5 pontos, que pode ser atribuído à baixa umidade

relativa verificada na casa-de-vegetação, onde os experimentos foram conduzidos.

Também, no segundo experimento, o método de agulhas múltiplas ocasionou baixa

severidade, mesmo com período maior de avaliação, reforçando a hipótese de

necessidade de alta umidade em experimentos que utilizam este método.

Uma vez que P. syringae pv. garcae necessita de condições de alta umidade

relativa para seu desenvolvimento, as condições de casa-de-vegetação com umidade

relativa em torno de 63% foi considerada baixa para os ensaios, fator minimizado

através das inoculações por abrasão. Esta técnica possibilitou a obtenção de resultados

promissores nos experimentos.

Uma variação dessa metodologia, utilizando fricção com carborundum, foi

testada por COSTA et al. (1957). No entanto, os autores observaram baixa taxa de

infecção, sugerindo que o estabelecimento do patógeno se dá principalmente, por

ferimentos. Possivelmente, a abrasão com carborundum resulta em maior oxidação dos

tecidos vegetais, que atrapalha a colonização da bactéria, resultando em baixa taxa de

infecção.

Deste modo, a metodologia por abrasão oferece condições ideais para a

penetração e infecção pela bactéria, devido ao maior número de ferimentos no tecido

foliar, e ainda que, devido aos ferimentos não transpassarem as folhas, aparentemente as

células bacterianas ficam protegidas da dessecação durante o processo de infecção. Um

método semelhante com bons resultados, é utilizado em inoculações com P. syringae

87

pv. tomato, para seleção de tomateiros resistentes a pinta-bacteriana, pela fricção com

gaze embebida em suspensão bacterianas (KOZIK & SOBICZEWSKI, 2007).

Com relação às respostas obtidas através das análises das variáveis EP e

AACPD, o IC foi, em geral, mais elevadas em folhas inoculadas por meio de agulhas

múltiplas em relação ao método de aspersão.

Nas respostas de folhas de diferentes internódios, o primeiro par de folhas

resultou em maiores valores do IC, em relação aos demais pares de folhas inoculados

por aspersão, enquanto que, as folhas inoculadas pela técnica de agulhas múltiplas essa

diferença foi mais pronunciada, sendo o IC maior nas folhas do primeiro internódio, no

entanto, as diferenças observadas foram de baixa magnitude.

Os valores de DP seguiram a mesma tendência do observado para os valores do

IC, sendo que, a similaridade dos resultados entre folhas de diferentes idades e ainda

menor magnitude desses parâmetros nas folhas do primeiro internódio, demonstrando

que as inoculações realizadas no primeiro par de folhas são suficientes para a

caracterização do germoplasma disponível. Estes resultados são corroborados por

valores de CV, que foram menores para as inoculações em folhas do primeiro

internódio. Em todos os casos o CV foi menor quando a análise foi realizada por meio

da variável AACPD, indicando maior confiabilidade dos resultados nos dados

transformados para essa variável.

Folhas inoculadas pela técnica das agulhas múltiplas apresentaram maior

amplitude nos valores das variáveis analisadas, por resultarem em maiores índices de

severidade, especialmente para a cultivar IPR 102, que demonstrou segregação para a

característica de resistência à mancha-aureolada.

O germoplasma avaliado por meio de inoculações por agulhas múltiplas e por

abrasão resultaram em valores de IC e DP similares, para ambas técnicas. Novamente,

os valores de CV foram menores nas análises resultantes da variável AACPD,

corroborando a eficiência dessa transformação de dados para a análise do germoplasma

disponível. Ainda, a técnica de inoculação por abrasão possibilitou os menores valores

de CV em relação às inoculações mediadas por agulhas múltiplas.

Portanto, testes de média a partir de valores da AACPD mostraram ser mais

confiáveis em relação às médias de EP, por resultar em valores de CV menores. Outra

88

observação interessante é que os valores do IC, DP e CV dos genótipos em fase de

seleção foram maiores em relação aos das cultivares, indicando possível seleção dentro

dos genótipos mais promissores, que apresentaram resistência parcial ao patógeno.

O melhoramento para resistência de plantas a bacterioses depende de

procedimentos eficazes, para avaliação de plantas mantidas em bancos de germoplasma,

sendo que inoculações artificiais fazem parte da estratégia (JANSE 2005). Os métodos

de inoculação que proporcionam fácil reprodução dos sintomas, boa repetitividade, além

de rapidez nos resultados, são considerados mais eficientes (ZAITER & COYNE,

1984), além disso, devem ser preferencialmente realizados com isolados agressivos do

patógeno, individualmente ou em misturas. Neste caso, deve-se conhecer a

compatibilidade das linhagens utilizadas por meio de testes in vitro e in vivo.

Os experimentos realizados para comparação dos métodos de inoculação,

mostraram que a técnica de abrasão desenvolvida nesta pesquisa, foi a mais consistente,

devendo ser empregada prioritariamente na seleção de genótipos de cafeeiros resistentes

a P. syringae pv. garcae.


Coffea spp.

Os resultados obtidos no presente trabalho, corroboram à resistência a P.

syringae pv. garcae em genótipos estudados por MORAES et al. (1974; 1975),

MOHAN et al. (1978) e KAIRU (1997), em indivíduos presentes no BAG de Coffea do

Instituto Agronômico (IAC). Também, foram descritas novas fontes de resistência no

BAG do IAC, cujas informações poderão fornecer subsídios para programas diversos de

melhoramento, visando incorporar a resistência a P. syringae pv. garcae em cultivares

que estão sendo plantadas em larga escala no Brasil, suscetíveis ao patógeno. Fontes de

resistência foram identificadas em 53 acessos de cafeeiros do BAG de Coffea que

representam 50,5% dos genótipos avaliados.

Alguns genótipos merecem atenção especial pois, além de conter genes de

resistência à bacteriose, apresentam diversas características desejáveis para o programa

de melhoramento, tais como, tolerância à seca e resistência a pragas e outras doenças.

Dentre as espécies avaliadas, C. salvatrix apresentou os menores níveis de

doença. De acordo com a literatura, esta espécie apresenta resistência ao bicho mineiro

89

(GUERREIRO-FILHO et al. 1991), contém baixos teores de cafeína nas sementes

(0,72%) e, segundo MAZZAFERA & CARVALHO (1992) e MAZZAFERA et al.

(1998), possui alta quantidade de óleo (29%) no endosperma. Somadas, estas

características valorizam o potencial da espécie no desenvolvimento de novas cultivares

por meio de hibridações interespecífica.

Dos híbridos interespecíficos entre C. arabica e C. salvatrix, encontrados no

BAG de Coffea do IAC, duas plantas híbridas, na geração F1RC1 obtidas por

retrocruzamento para a espécie C. arabica ((C. arabica IAC 376-4 X C. salvatrix IAC

1288) x C. arabica IAC 376-4) são as mais promissoras. Essas plantas deverão ser

clonadas para a avaliação da resistência a P. syringae pv. garcae e demais

características, para melhor aproveitamento no PMG de cafeeiros do IAC, e também

retrocruzadas novamente para obtenção de características próximas às do café arábica.

Outra espécie com potencial para utilização em programas de melhoramento é

C. eugenioides. Esta espécie possui diversas características agronômicas de interesse,

sendo as principais, a resistência à broca-do-café, Hypothenemus hampei (SERA et al.,

2010) e ao bicho-mineiro, Leucoptera coffeella (GUERREIRO-FILHO et al. 1991).

Plantas desta espécie apresentam baixos teores de cafeína segundo MAZZAFERA &

CARVALHO (1992).

Seleções visando redução do teor de cafeína em C. arabica e C. canephora, a

partir de hibridações com C. eugenioides, vêm sendo realizadas por NAGAI et al.

(2008). Os autores já identificaram plantas com qualidade de bebida superior e com

menores teores de cafeína.

A respeito de C. stenophylla, outra espécie com alta resistência à bactéria, a

literatura dispõe de poucas informações sobre suas características. Sabe-se que

exemplares desta espécie são resistentes ao bicho-mineiro GUERREIRO-FILHO et al.

(1991) e apresentam teores de cafeína mais elevados, em relação à C. arabica

MAZZAFERA & CARVALHO (1992). Cafeeiros desta espécie apresentam maturação

tardia, com frutos de cor púrpura e a bebida originada de seus grãos com qualidade

sensorial bastante inferior à espécie C. arabica.

A espécie C. canephora apresenta alta resistência a P. syringae pv. garcae, e sua

utilização em programas de melhoramento é muito valiosa. Inúmeros híbridos entre C.

90

arabica e C. canephora comportaram-se como resistentes nas avaliações realizadas por

MOHAN et al. (1978), incluindo-se alguns híbridos obtidos a partir de cruzamentos

entre C. arabica e Híbrido de Timor (HT), grupo de cafeeiro que apresentam resistência

à ferrugem (H. vastatrix) e ao “Coffee Berry Disease” (CBD) (Colletotrichum

kahawae), doença não presente no Brasil, e ainda ao nematoide das galhas Meloidogyne

exigua (FAZUOLI & LORDELLO, 1978; RODRIGUES JUNIOR et al., 2004).

Híbridos entre C. arabica cv. Villa Sarchí (971/10) e HT (832/2) resultaram na seleção

da cultivar IAPAR 59, que exibe porte reduzido e resistência moderada à mancha-

aureolada (PETEK et al., 2001). Além disso, alguns genótipos de C. canephora

mostram maior tolerância à seca.

As espécies que apresentaram nível intermediário em relação à severidade da

mancha-aureolada, C. congensis e C. liberica, possuem especial utilização no

melhoramento de cafeeiros, uma vez que esses genótipos apresentam resistência ao

agente causal da ferrugem (BETTENCOURT & CARVALHO, 1968), bem como,

possuem rusticidade e certa tolerância à seca, a exemplo de C. canephora. O híbrido

natural entre C. canephora e C. congensis (IAC 4350) compreende importante

germoplasma para estudos futuros, pois carregam genes favoráveis para resistência à

mancha-aureolada e possuem potencial para aliar também a resistência à ferrugem e

tolerância à seca.

Com base nas relações e viabilidade entre cruzamentos interespecíficos em

Coffea spp., apresentadas por CARVALHO et al. (1985), pode-se deduzir que os genes

de resistência a P. syringae pv. garcae, presentes nas espécies silvestres, apresentam

maior dificuldade de serem aproveitados, sendo necessários diversos retrocruzamentos

com C. arabica a fim de serem selecionadas características agronômicas desejáveis.

Do ponto de vista aplicado, a transferecia de genes de resistência à mancha-

aureolada é facilitada pela utilização de germoplasa mais próximos geneticamente a C.

arabica. Por esse motivo, foram avaliadas diversas introduções da Etiópia, formas

botânicas, variedades e mutantes de C. arabica.

Das introduções da Etiópia avaliadas, apenas duas foram consideradas sucetíveis

ao patógeno, uma vez que, apresentaram 80% ou mais das progênies com notas entre

dois e cinco da EP. Portanto, grande parte do material avaliado mostrou comportamento

semelhante ao descrito por MOHAN et al. (1978).

91

Entretanto, o germoplasma silvestre de C. arabica provavelmente está

constituído por genes em condições heterozigóticas, pois praticamente quase todos os

acessos segregaram para a característica. Na prática, esse fator implica na necessidade

de um número maior de cruzamentos, a fim de se obter maior quantidade de plantas

com alelos favoráveis à resistência. Cem por cento das progênies avaliadas do acesso

ETP 22 comportaram-se como resistentes à mancha-aureolada, portanto a planta matriz

provavelmente encontra-se em homozigoze para esta característica. Essa condição

permitirá estudos exploratórios da heterose de híbridos F1 utilizando ETP 22 como

parental, uma vez que a característica de homozigose é um aspecto fundamental para tal

finalidade (VAN DER VOSSEN et al., 2015).

O aproveitamento da heterose em híbridos F1 tem sido utilizada de forma

associada à resistência à mancha-aureolada, (ITO et al., 2011; ANDREAZI et al.,

2015), bem como, à resistência múltipla à ferrugem, bicho-mineiro e à nematoides

(SERA et al., 2005).

Segundo SERA e colaboradores (2005), o processo de exploração do vigor

híbrido possibilita reduzir o tempo para obtenção de uma cultivar para

aproximadamente 12 anos. Além das características de resistência a fatores bióticos, é

possível a obtenção de cultivares mais produtivas em relação aos genitores, como

observado por ITO et al. (2011).

Além disso, as introduções de origem etíope compreendem importante reserva

genética da espécie, uma vez que esse germoplasma contém indivíduos com inúmeras

características de interesse. No anexo 3 (página 117), está apresentado um levantamento

dos dados de produção (1977 a 1989), ocorrência/severidade da ferrugem (1980), vigor

e tipo de maturação dos frutos (1977 a 1991) do referido germoplasma, de modo que,

esses dados poderão auxiliar na escolha dos parentais a serem utilizados nos

cruzamentos, a fim de se introduzir a resistência a P. syringae pv. garcae em cultivares

comerciais.

Além das variedades já identificadas como resistentes Villa Sarchí, Dilla &

Alghe (MORAES et al. 1975) e da cutivar IPR 102 (ITO et al., 2002), foi observado no

germoplasma de C. arabica avaliado, que compreendeu variedades, cultivares, formas

botânicas e mutantes (Tabela 16), resistência na variedade Palido Viridis (100% da

progênie) e na cultivar São Bernardo (33,3% da progênie).

92

Segundo CARVALHO et al. (1991) a cultivar São Bernardo é originaria da

Guatemala, possui porte menor e internódios mais curtos em relação ao Caturra, sendo a

característica de porte reduzido atribuída a um par de alelos dominates denominados

SbSb. Sendo assim, a utilização dessa cultivar em hibridações poderá resultar plantas de

pequeno porte e com resistência a P. syringae pv. garcae. No entanto, será necessário

elevado número de cruzamentos para obtenção de numerosas plantas híbridas, uma vez

que este material encontra-se em condições hererozigóticas, para a resistência à

mancha-aureolada que resultará na segregação para a característica. Por este motivo, a

falta de seleção para esta característica em plantas do híbrido IAC 7366 (São Bernardo x

Mundo Novo) resultou em 100% da progênie suscetíveis ao patógeno. Esta seleção

deverá ser realizada na geração F1.

A identificação de fontes de resistência no BAG do IAC possibilitou a busca por

genótipos em fase avançada de seleção, e que possuem em sua genealogia parentais

resistentes a P. syringae pv. garcae. Dessa forma, é possível realizar uma triagem

prévia do germoplasma e avaliar número maior de progênies na busca de plantas

resistentes. Essa estratégia poderá resultar na seleção de genótipos promissores, que em

poucos ciclos de seleção poderão originar uma cultivar resistente a P. syringae pv.

garcae.

O germoplasma que compreende plantas com o gene SH3 apresentam grande

valor para o melhoramento genético de Coffea, uma vez que este gene confere

resistência a diversas raças de H. vastatrix (BETTENCOURT & CARVALHO, 1968) e,

até o presente, não teve sua resistência quebrada por novas raças daquele patógeno

(BRAGHINI et al., 2014).

Dentre as seleções testadas, o material mais promissor ao PMG de cafeeiros do

IAC são os descendentes do híbrido H 13439-8-C1736, que possuem resistência

moderada à mancha-aureolada e carregam genes de resistência a diversas raças de H.

vastatrix. Esta seleção que vem sendo desenvolvida no IAC apresenta características de

porte reduzido e alta produtividade, altamente desejáveis.

93


syringae pv. garcae

Os resultados obtidos a partir da inoculação das progênies F2 dos cafeeiros

H8089-2 e H8089-7 com os isolados I/2015 (v2 v5) e II/2015 (v1 v2 v5) de H. vastatrix

evidenciaram a natureza heterozigota (SH1 sH1) das matrizes F1, sendo que, conforme já

salientado por BETTENCOURT & CARVALHO (1968), os parentais, a cultivar Catuaí

Vermelho IAC 24 e a seleção Geisha IAC 1137-5, são respectivamente homozigotos

para os alelos sH1 e SH1. Ainda, de acordo com os resultados, foi confirmada a presença

do alelo dominante SH1 em um terço das plantas, sendo seis cafeeiros da progênie

H8089-2 e dez cafeeiros da progênie H8089-7. De acordo com a teoria gene-a-gene

(FLOR, 1971) estes cafeeiros, portadores de, ao menos, um alelo dominante SH1,

tiveram a resistência quebrada quando inoculados com o isolado II/2015 portador do

alelo v1 (Tabela 18).

Como reportado por CARVALHO (1988), se o alelo SH1 apresentasse efeito

pleiotrópico ou ocorrência de ligação gênica entre alelos que conferem resistência a H.

vastatrix e a P. syringae pv. garcae, cafeeiros portadores do alelo SH1 deveriam ser

resistentes a ambos os patógenos.

Assim, as progênies F2, segregantes, quando inoculadas com o isolado I/2015 de

H. vastatrix, deveriam apresentar a mesma reação quando expostas a P. syringae pv.

garcae.

No entanto, o valor significativo do teste de 2 McNemar calculado na progênie

H8089-2 revela a discordância entre as duas classificações; o número de cafeeiros

resistentes ao isolado I/2015 de H. vastatrix (6) não é o mesmo número de cafeeiros

resistentes a P. syringae pv. garcae (zero).

Por outro lado, embora o valor do 2 McNemar não tenha sido significativo, na

análise do total de plantas avaliadas, a resistência aos agentes bióticos não se revelou

simultânea, uma vez que, dez plantas resistentes ao isolado I/2015 de H. vastatrix,

portadoras do alelo SH1, revelaram-se suscetíveis à mancha-aureolada e, nove plantas

resistentes à mancha-aureolada revelaram-se suscetíveis ao isolado I/2015 de H.

vastatrix, sendo as taxas de falso positivo no primeiro e no segundo caso iguais a

15,87% e 14,29%, respectivamente, e a taxa total de erro igual a 30,16%.

94

A magnitude do coeficiente de Yule, que varia entre zero e ± 1, observado na

progênie H8089-7, individualmente, e na população F2, como um todo (H8089-2 e

H8089-7), corrobora a ausência de associação entre as classes R e S determinadas nas

avaliações das plantas em relação à resistência à ferrugem e à mancha-aureolada.

Portanto, de acordo com os dados obtidos fica evidente que não há efeito

pleiotrópico do gene SH1 ou ligação gênica entre genes que conferem resistência a

isolados homozigotos para o alelo V1 de H. vastatrix e a P. syringae pv. garcae. Por este

motivo, a busca por fontes de resistência à mancha-aureolada, para uso em programas

de melhoramento, visando ao desenvolvimento de cultivares com resistência simultânea

aos agentes bióticos, não deve ser restrita ao germoplasma de Coffea portadoras do gene

SH1.



Do conhecido até o momento, o presente experimento relata os primeiros

estudos sobre a expressão de genes ligados à defesa de plantas, com foco nos períodos

iniciais da infecção (até 24 horas após a inoculação) e potencialmente envolvidos na

interação entre Pseudomonas syringae pv. garcae e cafeeiros. Cabe lembrar que, a

cultivar IPR 102 utilizada neste estudo tem origem a partir da hibridação artificial entre

C. canephora tetraploide e C. arabica cv. Bourbon Vermelho, realizada no IAC em

1950, e identificada como H 2460 (CARVALHO et al., 1983). Ou seja, a resistência da

cultivar IPR 102 é resultado na manifestação de genes introgredidos da espécie C.

canephora.

A respeito dos genes alvo analisados no presente estudo, na literatura

encontram-se numerosos trabalhos sobre os possíveis mecanismos de resistência

associados a diversos fatores bióticos e abióticos, incluindo-se respostas de defesa a

bactérias do agrupamento P. syringae.

Em um estudo semelhante, efetuado também por meio da expressão relativa de

diversos genes, comparou-se a atividade dos genes EDS1 e PAD4, em cafeeiros

resistente e suscetível ao nematoide M. paranaensis. Os resultados revelaram maior

expressão desses genes na cultivar resistente, sugerindo a possibilidade da ocorrência de

RSA (FATOBENE, 2014), outro mecanismo de defesa interferido pelo AS.

95

Os resultados obtidos neste trabalho evidenciaram maior expressão do gene

PAD4 24 HAI na cultivar IPR 102, mas não permitem associar a resposta de proteção

da planta a este gene, que pode desencadear a síntese de AS, como mencionado

anteriormente.

Durante a infecção por patógenos, a enzima SOD pode se associar com a CAT,

protegendo as células do dano oxidativo, mantendo os níveis de H2O2 regulados durante

a infecção (SAKAMOTO et al., 1995). NOWOGÓRSKA & PATYKOWSKI (2015)

demonstraram que SOD é crucial na resposta de defesa em feijão (P. vulgaris) cultivar

Korona a P. syringae pv. phaseolicola, uma vez que essa enzima apresentou maior

atividade nas plantas resistentes ao patógeno às 12 e 24 HAI. A indução de HR pelo

estresse oxidativo ligado a SOD, ocorre em plantas de soja (Glycine max) cultivar

Williams 82, resistente ao crestamento bacteriano (P. syringae pv. glycinea),

aproximadamente oito horas após a inoculação com o patógeno (ZOU et al., 2005).

Segundo VAN CAMP et al. (1997) e DESIKAN et al. (1996), citados por VAN

BREUSEGEM et al. (2001), durante a resposta via espécies reativas de oxigênio

(ERO), a enzima SOD é fundamental para o sistema antioxidante que regula a

concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2), tóxico a fitopatógenos. As enzimas

CAT e POX, são os principais componentes na realocação do H2O2, atuando em

estresse oxidativo, por isso são relacionadas às respostas de defesa mediadas pela

sinalização de EROs e/ou de óxido nítrico (ON) (TRAPET et al., 2014). O efeito

causado pelo aumento da atividade de CAT, POX, bem como a APX às moléculas de

H2O2 resultam na morte celular programada no sitio de infecção (LEVINE et al., 1994;

ZOU et al., 2005).

No mesmo sentido, a inibição da enzima CAT levará ao acumulo de H2O2 que

por sua vez funcionará como sinalizador de genes PR (CHEN et al., 1993). Alguns

estudos demonstraram a ligação entre H2O2 e EROs que representa um um sistema de

defesa contra fitopatógenos (CLARK et al., 2000). Uma estreita ligação entre EROs e

AS foi sugerida por CHEN et al. (1993) e também por estudos posteriores, onde AS

reduziu a atividade de CAT e APX.

Cabe ressaltar que moléculas de AS podem desencadear o processo de RSA, em

resposta à infecção por fitopatógenos em diversas interações patógeno – hospedeiro, e

também atuam como sinalizador de efetores, que resultam na resistência local

96

(FERNADES et al., 2009). SONG & GOODMAN (2001), demonstraram que o ON é

necessário para que a RSA ocorra em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) cultivar

Xanthi nc, em resposta à infecção pelo vírus do mosaico do tabaco (Tobacco mosaic

virus).

Os genes associados ao estresse oxidativo por ON analisado neste trabalho, APX

e GLR, apresentaram comportamento similar nos genótipos resistente e suscetível à

bactéria. Segundo CLARK et al. (2000) ON pode atuar inibindo, de forma reversível, a

atividade da enzima APX, bem como CAT, em plantas de tabaco. Coincidentemente, a

expressão relativa destes genes neste estudo foram iguais ou menores em relação aos

tratamentos controle, mas não permitem inferir sobre o envolvimento do ON na resposta

de defesa, a participação deste composto estimula o acúmulo de AS (CHEN et al., 1993;

CLARK et al., 2000).

A enzima POX em conjunto com a enzima CAT atuam no mecanismo de defesa,

contribuindo para detoxificação do H2O2 das células, oxidação de compostos fenólicos

precursores da síntese de lignina, suberização, entre outras funções (MARGIS-

PINHEIRO et al., 1993; ALVAREZ et al., 1998). A expressão relativa do gene que

codifica a POX foi maior na cultivar resistente IPR 102 às 12 HAI, no entanto, os

resultados deste trabalho não permitem inferir a respeito da atuação desta enzima no

processo de defesa. Sabe-se que, para o acúmulo de EROs em Arabidopsis selvagem

contra P. syringae é necessária a ativação do complexo EDS1 – PAD4, o fator de

transcrição bZIP10 e também de POX e CAT da parade celular (LI et al. 2013).

A enzima β-1,3-glucanase (PR-2) possui importante papel na defesa contra

agentes fitopatogênicos, como demsntrado por ANDRADE et al. (2013) no

patossistema P. syringae pv. tomato - tomateiro. No entanto, a expressão relativa do

gene que codifica a PR-2 foi similar em todos os tratamento, portanto, essa enzima

parece não atuar na resposta de defesa contra P. syringae pv. garcae, durante o período

de ifecção avaliado.

A enzima ICL participa do ciclo do glioxilato. Segundo KUNZE et al. (2006),

esse metabolismo resulta em moléculas de carbono que podem ser reutilizadas no ciclo

de Krebs, dessa forma provendo precursores na biossíntese de carbohidratos e

aminoácidos. Portanto, pode-se pressupor que a tendência de aumento 24 HAI na

expressão relativa do gene que codifica a ICL, na cultivar resistente IPR 102, deve-se à

97

necessidade de produção de energia, para produção dos metabólitos envolvidos no

processo de defesa contra o patógeno.

Enfim, os resultados deste trabalho sugerem a possibilidade do mecanismo de

defesa a P. syringae pv. garcae ser intermediado via AS, uma vez que, a combinação

dos resultados sendo, maior expressão do gene PAD4 e do gene que codifica a SOD nas

plantas resistentes inoculadas com a bactéria e também baixa expressão dos genes que

codificam as enzimas APX, CAT e POX relacionados ao referido mecanismo de defesa,

corroboram esta hipótese.

Diversos trabalhos demonstram a biossíntese de etileno em tecidos

mecanicamente feridos (COLEMAN & HODGES, 1987). Segundo ISHIGUE et al.

(1993), as peroxidases representam um grupo de compostos associado a biossíntese de

etileno. Desse ponto de vista, as injurias causadas na inoculação da bactéria pelo

método abrasivo podem afetar diretamente a expressão de genes de defesa. em geral, a

resposta de expressão relativa das genes estudados, resultaram em tendências similares

de comportamento entre os tratamentos inoculados com P. syringae pv. garcae ou

solução salina. Vinte e quatro horas após as inoculações, houve diferenças na tendência

de expressão somente nos genes PAD4, CAT e ICL em relação ao tipo de inóculo.

Períodos mais extensos de coleta e um tratamento adicional com plantas sadias (não

inocladas) seriam úteis para demostrar os efeitos ocasionados por ocasião das

inoculações.

A enzima POX, que poderia indicar a resposta de defesa via etileno ou ácido

jasmônico, apresentou tendência de expressão similar entre os tratamentos estudados,

não sendo possível determinar sua relação na resposta de defesa.

Também o estresse oxidativo relacionado com a enzima SOD pode estar atuando

simultaneamente ao mecanismo de defesa da planta. Essa resposta pode desencadear a

deposição de compostos fenólicos, ligações proteicas ou morte celular localizada.

Estudos deverão ser elaborados utilizando períodos maiores e mais avançados de coletas

para elucidar a resposta final da resistência.

98

6. CONCLUSÕES

Pseudomonas syringae pv. garcae coloniza tecidos distantes do ponto de inoculação

em folhas de cafeeiro, por se movimentar mais facilmente nos vasos condutores;

Os isolados de P. syringae pv. garcae, oriundos de diferentes localidades dos

estados de São Paulo e Minas Gerais, apresentam diversidade em relação à

patogenicidade em cafeeiros da espécie C. arabica, sendo que, aparentemente, não

há relação entre o local de origem e/ou ano de isolamento com a agressividade dos

isolados;

O método de inoculação pela técnica de abrasão com lixa embebida em suspensão

bacteriana, é eficiente nas condições testadas e foi utilizado com sucesso na

caracterização de acessos do BAG de Coffea do IAC, bem como, na seleção de

plantas resistentes a P. syringae pv. garcae, permitindo a seleção de plantas de

cafeeiro em um curto período de tempo após as inoculações;

Fontes de resistência a P. syringae pv. garcae estão presentas em germoplasma

diverso de Coffea spp.. As seleções H6839-4, H13439-8 C1736 e IAC Catuaí SH3

C1621 do PMG do IAC apresentam potencial para o desenvolvimento de cultivares

que poderão aliar resistência moderada a P. syringae pv. garcae e resistência às

raças de Hemileia vastatrix com alta produtividade;

As introduções ETP 10, ETP 20, ETP 22, ETP 23, ETP 37 e ETP 38 apresentaram

os maiores índices de resistência, mas somente ETP 22 revelou-se homozigota para

a resistência a P. syringae pv. garcae;

O gene SH1 não confere resistência a P. syringae pv. garcae e também não possui

ligação com os genes de resistênciaa H. vastatrix na seleção Geisha (IAC 1137-5);

Os resultados da expressão relativa dos genes sugerem que o mecanismo de

resistência apresentado pela cultivar IPR 102, herdado de C. canephora,

desencadeia rotas metabólicas da via do AS e/ou biossíntense de EROs.

99

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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114

8. ANEXOS

Anexo 1 – Representação da escala de zero a cinco pontos (EP) utilizada como referência nas avaliações da severidade da mancha-aureolada em

cafeeiros inoculadas com Pseudomonas syringae pv. garcae, pelos métodos de agulhas múltiplas e abrasão.

EP Agulhas múltiplas Abrasão

0

1

2

EP Agulhas múltiplas Abrasão

3

4

5

115

Anexo 2 - Comprimento médio das lesões (cm) aos 21 dias após a inoculação (DAI) originados em folhas dos quatro primeiros internódios da

cultivar Bourbon Amarelo IAC J 30 de Coffea arabica, inoculadas por punctura com diferentes isolados de Pseudomonas syringae pv. garcae e

uma combinação de isolados e períodos de incubação (PI) calculados a partir da observação dos sintomas inicias da doença, provocados pelas

inoculações em DAI.

Isolado 1° par de folhas 2° par de folhas 3° par de folhas 4° par de folhas

Sintoma PI Sintoma PI Sintoma PI Sintoma PI

---(cm)--- ---(DAI)--- ---(cm)--- ---(DAI)--- ---(cm)--- ---(DAI)--- ---(cm)--- ---(DAI)---

IBSBF 65 0,35 5,87 0,15 11,30 0,24 10,80 0,32 14,83

IBSBF 75 0,38 5,76 0,10 13,17 0,10 13,00 0,22 13,60

IBSBF 248P 0,10 12,45 0,10 16,50 0,10 17,67 0,03 17,00

IBSBF 1197 0,29 7,54 0,22 9,71 0,24 10,07 0,27 14,00

IBSBF 1293 0,43 5,63 0,20 10,27 0,23 10,19 0,19 14,00

IBSBF 1372 0,10 7,47 0,11 9,31 0,30 16,88 0,43 17,00

IBSBF 1664 0,28 7,68 0,21 9,84 0,33 12,33 0,20 15,22

IBSBF 2212 0,20 9,18 0,11 11,19 0,12 14,07 0,03 14,60

IBSBF 2511 0,23 11,78 0,12 15,69 0,10 14,45 0,15 17,00

(Continua)

116

Anexo 2 – Continuação...

IBSBF 2840 0,28 5,79 0,18 7,79 0,14 11,56 0,14 17,22

IBSBF 2996 0,07 8,10 0,10 12,57 0,03 12,80 0,00 -

IBSBF 2999 0,10 11,00 0,07 11,91 0,07 13,75 0,03 17,00

IBSBF 3005 0,04 7,00 0,07 13,56 0,07 13,75 0,00 -

IBSBF 3015 0,16 6,04 0,10 12,72 0,10 15,85 0,03 24,00

IBSBF 3019 0,11 6,71 0,03 14,00 0,07 13,00 0,03 17,00

IBSBF 3022 0,18 6,25 0,11 13,29 0,10 11,58 0,07 13,75

IBSBF 3024 0,44 5,92 0,25 6,39 0,25 8,78 0,19 15,50

IBSBF 3051 0,10 8,22 0,07 13,88 0,00 13,67 0,00 -

IBSBF 3065 0,10 16,14 0,07 14,43 0,00 - 0,03 17,00

Mistura I 0,26 9,06 0,37 15,67 0,02 10,00 0,00 -

Média 0,21 8,18 0,14 12,16 0,13 12,21 0,20 12,94

IBSBF = Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico. PI = período de incubação, corresponde ao tempo médio para aparecimento

dos primeiros sintomas da doença. PL = período de latência, corresponde ao o tempo médio para o aparecimento dos sintomas da doença em

50% da parcela experimental.

117

Anexo 3 - Levantamento de dados (1977-1991) referentes a produção de café cereja no período entre 1977 e 1989, ocorrência/severidade da

ferrugem em 1980, vigor e maturação dos frutos das introduções oriundas da Etiópia avaliadas para resistência a Pseudomonas syringae

pv. garcae.

1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1985 1986 1987 1988 1989 1991 1977-1989 1980

Acesso

V M V M V M V M V M V M V M V M V M V M V M V M V M Produção

média (Kg)

Severidade

Ferrugem

ETP 1 1 T 8 T 8 T 4 T 9 T 6 N 8 T 1 N 5 T 6 T 5 N 5 P 6 - 2,99 4

ETP 2 5 - 4 N 3 T 4 P 5 P 5 - 6 N 5 P - - 4 N 4 N 4 P 5 - 0,93 1

ETP 3 5 - 3 N 4 T 4 N 5 N 5 P 6 N 6 N - - 5 N 5 N 5 P 8 N 1,30 1

ETP 4 5 P 4 N 3 T 3 N 5 P 5 P 5 N 7 N - - 6 N 5 P 5 P 5 P 0,96 3

ETP 5 3 - 1 T 2 T 2 T 4 T 5 P 5 N 5 T - - 4 T 5 T 5 N 6 - 0,70 1

ETP 6 6 - 4 T 6 T 4 T 6 N 5 - 5 N 7 N - - 5 N 5 N 4 P 3 - 1,38 1

ETP 7 5 - 6 T - T 5 P 5 N 4 - 5 N 6 N - - 5 N 5 P 4 N 2 - 1,89 1

ETP 8 6 - 6 T 7 N 5 N 5 N 6 N 8 T 10 P - - 6 N 6 N 5 N 8 P 2,90 3

ETP 9 6 N 4 N 3 N 5 P 5 P 5 P 5 N 6 N - - 5 N 5 P 5 P 6 - 0,30 1

ETP 10 - - 6 T 6 N 6 T 5 T 7 N 6 T 9 T - - 5 T 5 T 5 P 6 - 2,32 3

ETP 11 5 - 5 T 3 - 4 N 4 N 5 P 6 N 5 P 7 N 5 N 6 N 5 P 6 P 1,33 1

ETP 12 8 N 7 T 5 P 5 N 5 P 5 P 7 P 6 P 6 P 6 P 4 - 4 P 6 N 1,72 4

ETP 13 6 - 6 T 6 P 3 P 5 P 5 P 6 N 5 N 5 - 5 P 5 P 4 P - T 0,83 4

ETP 14 6 T 5 T 5 P 5 P 5 P 5 P 5 - 5 P 4 - 4 P 4 P 3 P 5 P 1,35 2

ETP 15 5 N 3 N 3 P 3 P 5 P 4 P 5 P 5 P 5 P 7 P 5 P 5 N 8 P 1,02 3

ETP 16 5 - 3 N 3 T 6 N 5 P 5 N 8 P 7 P 5 P 6 P 5 N 5 N 7 - 1,52 1

(Continua)

118

Anexo 3 - Continuação...

ETP 17 - - 3 T 4 T 4 N 4 P 5 N 5 N 6 T 6 P 6 N 5 N 5 P 6 - 1,06 4

ETP 18 - - 6 T 5 T 6 N 5 N 5 P 8 N 6 N 6 N 5 N 5 P 5 P 6 P 2,85 4

ETP 19 1 - 6 N 5 T 4 P 6 P 5 P 7 N 9 N 5 P 5 P 5 N 5 P 8 N 1,95 2

ETP 20 - - 4 N 5 N 5 N 3 P 5 N 5 N 5 N 5 P 4 P 4 P 5 N 5 T 0,86 3

ETP 21 1 - 1 - 1 - 2 N 3 N 4 - 5 N 4 N 7 P 4 T 5 P 5 N 7 N 0,37 1

ETP 22 - - 6 T 8 T 4 T 7 T 5 N 6 T 8 N - - 6 P 6 N 5 P 7 N 3,72 3

ETP 23 7 T 5 T 6 T 4 T 5 T 6 P 8 N 6 T - - 5 N 5 P 4 P 8 P 1,97 5

ETP 24 5 - 3 T 4 N 3 T 5 P 6 P 5 N 7 P - - 5 P 5 N 5 P 7 P 1,45 3

ETP 25 5 - 3 T 5 N 3 T 6 T 5 P 6 N 8 T - - 5 N 5 N 5 P 7 N 1,41 2

ETP 26 5 - 3 T 3 T 4 T 4 T 5 - 5 N 6 T - - 5 N 5 N 4 P 6 - 0,52 2

ETP 27 5 - 6 T 6 N 4 T 5 T 5 P 6 N 6 T - - 4 N 5 N 4 P 6 - 1,01 2

ETP 28 5 - 6 T 5 T 5 N 5 P 5 P 7 N 9 P - - 6 P 5 N 5 P 5 P 1,88 3

ETP 29 5 - 4 N 5 P 3 N 6 N 5 P 6 N 10 N - - 5 N 5 P 5 P 5 P 1,28 1

ETP 30 5 - 4 T 4 N 3 T 6 T 5 - 7 N 6 N - - 5 P 5 P 4 P 4 - 1,21 2

ETP 31 6 - 6 T 5 T 7 T 7 T 6 N 7 T 9 T - - 6 N 6 N 5 P 7 N 2,72 3

ETP 32 10 T 9 T 6 T 6 T 6 T 5 - 6 T 6 N - - 5 T 5 T 5 N 7 P 2,27 3

ETP 33 8 T 9 T 6 P 4 N 6 T 5 P 7 N 7 P - - 4

4 T 4 N 7 P 2,73 2

ETP 34 5 - 5 T 6 T 4 P 6 T 5 P 5 N 5 N - - 4 N 5 P 4 P 5 - 0,70 4

ETP 35 5 - 5 T 5 P 5 T 6 T 5 - 4 T 7 N 6 N 6 N 5 N 5 P 8 - 2,33 2

ETP 36 4 - 2 T 4 T 5 N 6 N 6 N 7 T 6 T 7 N 4 T 6 N 5 P 8 - 2,21 1

ETP 37 4 - 6 T 4 N 3 P 4 P 6 N 5 N 6 P 4 - 5 N 4 P 4 P 4 N 1,05 2

ETP 38 7 P 5 T 6 P 5 P 4 P 4 N 5 N 4 T 4 N 4 N 4 T 4 N 4 N 1,03 2

Continua...

119

Anexo 3 - Continuação...

ETP 39 5 - 4 N 5 N 4 N 5 N 5 P 8 N 7 P 7 N 5 P 5 P 5 P - T 2,21 0

ETP 40 7 P 5 N 4 T 5 N 4 P 5 P 6 P 4 N 5 P 5 N 5 P 5 P 4 - 1,31 2

ETP 41 - - 4 T 4 N 6 T 5 N 5 P 6 P 6 N 5 P 6 P 5 N 6 P 8 - 2,05 3

ETP 42 7 N 6 N 6 N 5 N 4 P 5 P 7 T 8 N 5 P 5 P 4 P 6 P 7 - 2,07 3

ETP 43 5 - 6 T 5 P 4 N 5 N 5 - 6 T 6 N 6 N 5 N 5 N 5 N 6 - 0,20 3

ETP 44 5 N 5 T 5 T 5 T 7 T 5 P 4 N 8 T 5 P 6 N 5 N 5 P 8 P 2,86 1

ETP 45 6 - 5 T 5 P 5 T 4 T 6 N 7 N 4 N 5 P 5 P 4 N 5 P - T 1,73 1

V = vigor, avaliado por escala de 1 a 10 pontos. M = maturação: P - precoce; N - normal; T - tardia . Severidade da ferrugem (Hemileia vastatrix) foi avaliada por escala de 1 a 10 pontos sendo,

1 plantas sem a presença da doença e, 10, planta altamente afetada pelo fungo.

resistÊncia de cafeeiros À mancha- aureolada: aspectos

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