FAHESA – Faculdade de Ciências Humanas, Econômicas e da Saúde de AraguaínaITPAC – Instituto Tocantinense Presidente Antônio Carlos

Odontologia

Relatórios de Aulas Práticas de Microbiologia

Laís CardosoMainara DefavariLuciana Nogueira

Layza TostaJucimária Lima

Geraldo Pereira

Araguaína/TOJunho/2012

Laís CardosoMainara DefavariLuciana Nogueira

Layza TostaJucimária LimaGeraldo Pereira

Relatórios de Aulas Práticas de Microbiologia

Araguaína/TOJunho/2012

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO____________________________________________________4

2. NORMAS DE BIOSSEGURANÇA PARA AULAS PRÁTICAS EM MICROBIOLOGIA ___________________________________________________5

3. ABUNDÂNCIA E DIVERSIDADE MICROBIANA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS_______________________________________________________10

4. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DA MICROBIOTA HUMANA ______________13

5. COLORAÇÃO DE GRAM___________________________________________19

6. TÉCNICA DE DILUIÇÃO SERIADA E CONTAGEM DE COLÔNIAS _________24

7. ANTIBIOGRAMA _________________________________________________26

8. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE FUNGOS____________________29

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS___________________________________34

Introdução

Este material apresenta a relação de trabalhos e pesquisas em prática

laboratorial de Microbiologia. Correlacionando com a literatura aquilo que foi

praticado em aula.

Desde biossegurança e métodos laboratoriais, a tipos de coloração para

observação microscópica, características morfológicas de fungos e bactérias,

culturas de microrganismos do ser humano, etc.

A pesquisa foi baseada na observação de resultados dos procedimentos

executados pelos alunos, logo, esses resultados podem ser falhos ou incoerentes,

devido à não padronização de métodos práticos ou erros na execução de

procedimentos. No entanto, à apresentação e prática de tais métodos acrescenta

conhecimento ao aluno.

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1. Normas de Biossegurança para aulas práticas em Microbiologia

O laboratório de Microbiologia é um ambiente de estudo e pesquisa onde há o

manuseio de diferentes tipos de microrganismos, sendo estes patogênicos ou não,o

que pode oferecer um grau de risco variável para àqueles que estão trabalhando

nesse ambiente,seja diretamente na pesquisa, ou auxiliando na organização e

higienização.Há relatos de casos de diferentes graus de contaminação a partir do

manuseio de microrganismos patogênicos em laboratório microbiológico, seja por

descuido em lavagem das mãos ou hábitos de levar objetos à boca, ou mesmo pela

falta de EPI (Equipamentos de Proteção Individual) adequado e ocorrência então de

aspiração do patógeno, ou contato com a mucosa da conjuntiva se este tiver

disperso no ambiente.Deve-se ter cuidado com a assepsia, quando se trabalha com

microrganismos para evitar a própria contaminação com algum patógeno, a

contaminação do meio de cultura com microbiota normal,alterando seu resultado na

pesquisa,e o transporte de fômites (carregam microrganismos patógenos) de dentro

do laboratório para outros ambientes.

“A degermação das mãos ou manilúvio (L:mani + luviu) é um procedimento

simples,efetivo e barato que deve ser feito criteriosamente pelo profissional e seus

colaboradores. [...] A degermação das mãos pode incluir a lavagem e, já que é

impossível eliminar todos os microrganismos das mãos, a anti-sepsia imediata para

suprimir a microbiota residual enquanto se usa as luvas. [...] A pele normal é

colonizada por bactérias,tanto na superfície como nos poros profundos e nos ductos

sudoríparos e glândulas sebáceas.” ( JAIRO GUIMARAES JR.,2001 )

Os EPI’s são de extrema importância em ambiente de pesquisa e

manipulação de patógenos, não só como proteção para quem está ali presente,mas

também para não influenciar nos resultados que se deseja obter.O uso de

gorro,luvas,máscara,óculos,é considerado praxe.Assim como a presença de EPC

(Equipamento de Proteção Coletiva) no ambiente laboratorial, como pias,chuveiro,

lava-olhos e extintor de incêndio específico para materiais oxidantes, ou corrosivos.

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Características dos germicidas (anti-sépticos) tópicos usados no manilúvio

Produtos Iodóforos Triclosan Clorexidina

Modo de ação Oxidação Ruptura da

parede celular

Desnaturação de

Proteínas

Bactérias Gram +

Bactérias Gram –

M. tuberculosis

Fungos

Vírus

Rapidez de ação

Atividade residual

Excelente

Boa

Boa

Boa

Boa

Média

Média

Boa

Média

Média

Má

Desconhecida

Média

Excelente

Excelente

Boa

Má

Razoável

Boa

Média

Excelente

Afetado por

matéria orgânica

Mínima Mínima Mínima

Segurança e

toxicidade

Absorção pela

pele: toxicidade

Falta de dados Ototoxicidade e

ceratite

GUIMARAES JR.,Jayro.Biossegurança e controle de Infecção cruzada em Consultórios Odontológicos.São Paulo:Livraria Santos, 2001. 216p.

Chuveiro e Lava Olhos, para lavagem com água corrente da região

contaminada.

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No ambiente de um laboratório acadêmico, onde há o primeiro contato do

estudante com o laboratório da disciplina, é importante haver a apresentação dos

materiais que serão manuseados com freqüência nos meses seguintes,e atenção

para os protocolos que devem ser seguidos para obtenção de melhores

resultados,para não haver ocorrência de infecções,ou transporte de fômites do

ambiente laboratorial para outros lugares.Medidas estas como a lavagem de mãos

antes e após cada aula, o uso de EPI’s descartáveis, o manuseio de tubos e placas

sempre perto da chama do Bico de Baunsen, e evitar o uso de materiais pessoais

durante às práticas laboratoriais, restringindo-se apenas à caneta ou lápis,que

devem ser desinfetados com álcool após o término da aula.

Lavagem das mãos, e desinfecção com álcool

O Laboratório de Microbiologia ainda conta com todo o aparato de

armazenamento e esterilização de meios de cultura, vidrarias, e outros materiais

usados na prática e pesquisa.Como a Autoclave, que faz esterilização por meio de

calor úmido,causando desnaturação das proteínas que formam a parede do

microrganismo,e gerando perda de líquido intra-celular deste;a Estufa,que faz

esterilização por meio do calor seco,oxidando os microrganismos,e o forno de

Pasteur segue esse mesmo princípio,ambos sendo indicados apenas para materiais

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secos.Logo,os meios de cultura,por serem líquidos,não são indicados à esse tipo de

esterilização.Sendo indicados para a esterilização na autoclave a 121ºC,durante 15

a 20 min.Eles não podem ser esterilizados dentro das placas de Petri,pois haveria

ressecamento do meio ou desnaturação dos nutrientes,e o tornaria inviável.

À esquerda, desinfecção da alça de inoculação na chama do bico de Baunsen, e à

esquerda, medidas de segurança com a presença do extintor de incêndio.

Esses meios de cultura servem para promover crescimento controlado,

bacteriano ou fúngico, em ambiente laboratorial. Dependendo daquilo que objetiva

ser cultivado,varia-se o meio de cultura.Podendo ser sintético,ou natural.Consistindo

numa associação qualitativa e quantitativa de nutrientes específicos para promover

esse crescimento.

O Agar serve de nutriente às bactérias ali cultivadas.Há diversos tipos específicos,a

variação depende do que se deseja obter.Os diferentes tipos de Agar servem como

forma de favorecimento ao microrganismo que deseja-se cultivar,e inibição para os

outros que estiverem dispersos no mesmo meio de cultura.

O Agar está incluso nas categorias de Meios de Cultura para transporte de

conservação e Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento. Alguns tipo de

Agar são:

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Ágar nutriente:usado frequentemente para conversação e manutenção de culturas

a temperatura ambiente;é usado para observação de esporos de bacilos Gram

positivos;é feito a base de proteínas.

Ágar chocolate: produzido a base de sangue de cavalo, podendo ser substituído

por sangue de coelho ou carneiro, que submetido à altas temperaturas para causar

lise nas hemácias,afim de estas liberarem hemina e hematina,compostos

fundamentais para que microrganismos exigentes cresçam.

Ágar Thayer-Martin Chocolate :contém antibióticos em sua forma,para inibir o

crescimento de bactérias específicas,quando as amostras forem coletadas de sítios

contaminados.

Ágar Salmonela-Shigella (SS) : possui componentes que inibem o crescimento de

microrganismos gram positivos,como sais de bile e citrato de sódio

Ágar Mac Conkey: inibe o crescimento de bacilos Gram positivos,em especial

estafilococos e enterococos.

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2. Abundância e diversidade de microbiota em amostras ambientais

A superfície inerte oferece sítio de colonização para diferentes tipos de

microrganismos, seja fungos ou bactérias, em locais como paredes de banheiro,

maçanetas de portas, esponjas de louça, celulares, etc. Ambientes que oferecem

condições para a reprodução desses microrganismos. Microrganismos estes, em

sua maioria, nocivos ao seres humanos.

O ambiente hospitalar, por outro lado, oferece uma maior facilidade na

transmissão de microrganismos patógenos, devido o fato de reunir pessoas doente e

imunossuprimidas no mesmo ambiente, e ter diversas superfície que podem servir

como meio de contaminação, como materiais pérfuro-cortantes e fontes de

ventilação de ar.

“Quase todos os micróbios podem causar infecção hospitalar, embora

infecções por protozoários sejam raras. O perfil das infecções hospitalares

modificou-se com o passar do tempo, refletindo os avanços na medicina e o

desenvolvimento de agentes antimicrobianos. Na era pré-antibiótica, a maioria das

infecções era causada por germes Gram-positivos, particularmente Streptococcus

pyogenes e Sthaplylococcus aureus. Com o advento da penicilina e outros

antibióticos de atividade inibitória para os estafilococos, organismos gram-negativos

como Escherichia coli e Pseudomona aeruginosa emergindo como patógenos

importantes. Mais recentemente, o desenvolvimento de antimicrobianos de amplo

espectro, mais potentes, e o aumento das técnicas médicas invasivas foi

acompanhado de um aumento na incidência: germes Gram-positivos resistentes a

antibióticos [...], germes Gram-negativos multirresistentes, [...], Candida.” (CEDRIC

MIMS,2005)

A infecção hospitalar, também chamada de nosocomial, pode ser dividida em

dois grupos: exógena e endógena. A exógena é causada por microrganismos de

origem externa, como pessoas, ambiente ou fômites. Devido o fluxo de pessoas

doentes, pessoas portadoras não-sintomáticas e o manuseio de equipamentos em

diversos pacientes. Na endógena, a causa são os próprios microrganismos da flora

normal do indivíduo. Microrganismos estes oportunistas, que causam infecção ao

10

indivíduo aproveitando o seu quadro de imunossupressão.

Para controlar esse tipo de situação, medidas comuns devem ser tomadas,

como o uso de EPI’s pelos funcionários, esterilização adequada dos instrumentais,

desinfecção de superfícies comuns à todos, como maçanetas, cadeiras,etc. Trocas

de roupas de cama a cada paciente, desinfecção do chão com detergentes

bactericidas, assim como pás paredes e teto de ambientes cirúrgicos. E medidas de

bom senso, como não deixar circular pelo hospital visitantes que podem carregar

doenças sem apresentar sintomas; separar os pacientes por grau de contaminação

da doença que eles apresentam, etc.

Prática laboratorial

Foram coletadas amostras do ambiente, sendo estas de superfícies inertes e

do solo. Com o auxílio do swab e solução salina estéril amotras de maçanetas,

celulares, etc, foram coletadas e cultivadas em placa de Petri com Ágar nutriente,

que permite o crescimento apenas de bactéria. E, após diluída em solução, a

amostra de solo foi cultivada em placa de Petri contendo Ágar sabourad, meio de

cultura que permite o crescimento tanto de bactérias quanto de fungos. O resultado

foi observado após 3 dias.

Na placa de Solo observou-se o crescimento de colônias de fungos, que são

filamentosas e lembram algodão, e de bactérias, pequenos pontos brilhantes e

circulares.

Nas placas de superfícies observou-se o crescimento de bactérias, algumas

superfícies apresentaram número mais significativo, outras, nem tanto. O resultado

de ambos os cultivos podem ser observados nos gráficos.

11

Placas de solo tiveram variação na quantidade de ufc’s

A quantidade de ufc’s foi expressivamente maior nas placas de maçaneta.

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3. Isolamento de bactérias da microbiota humana

A microbiota normal é aquela que habita a pele e as mucosas do homem.É

encontrada em pessoas sadias e exerce papéis importantes,como competição com

microrganismos patogênicos por sítios e nutrientes,e síntese de vitaminas.Alguns

órgãos são necessariamente estéreis,como cérebro,meninges,coração e fígado.A

placenta também é isenta de microrganismos,porém,algumas horas após o

nascimento,já podem ser encontrados microrganismos na cavidade bucal do bebê,

microrganismos estes oriundos do canal vaginal da mãe, se o parto tiver sido

normal, da amamentação, e do ar ambiente.

“A flora microbiana no interior e na superfície do corpo humano está num

estado contínuo de fluxo determinado por uma variedade de fatores,como idade,

dieta, estado hormonal, saúde e higiene pessoal.[...]A população microbiana

continua a mudar ao longo da vida do ser humano.Alterações na saúde podem

romper drasticamente o delicado equilíbrio que é mantido entre os organismos

heterogênicos que coexistem em nosso interior.’’

(PATRICK R. MURRAY,2010)

A microbiota humana normal é classificada em:

Residente:Microrganismos consideravelmente regulares em algum sítio.De

acordo com sua freqüência é subdividida em Indígenas (quando em relação

ao total de microrganismos,representa mais que 1%) e Suplementares (em

proporção menor que 1%).

Transitória:Microrganismos oriundos do ambiente,como do

ar,mãos,alimentos. Instalam-se apenas quando ocorre imunodepressão do

organismo hospedeiro.Podem ser patogênicos,ou não.

“É provável que os microrganismos que podem ser cultivados em laboratório

representa apenas uma fração na flora microbiana normal ou transitória.[...] O

número de espécies que compõem a flora microbiana provavelmente é muito maior

do que se conhece. Desta forma, a compreensão da flora normal está em transição.”

(JAWETZ, MELNICK E ALDEBERG,2009)

13

OLHO

A conjuntiva é normalmente habitada por difteróides (Corynebacterium

xerosis)e estreptococos não-hemolíticos.O fluxo de lágrimas contêm lizosima

bacteriana,que controla a proliferação de bactérias.

TRATO RESPIRATÓRIO

O nariz é habitado por estreptococos,estafilococos,como S. aureus e S.

epidermidis, e corinebactérias.Na faringe encontra-se estreptococus não

hemolíticos, estafilocos, difteróides e pneumococos Mycoplasma e Prevotella.Estes

também podem ser encontrados nos brônquios.Geralmente os bronquíolos e os

alvéolos são estéreis.

BOCA

A cavidade bucal oferece sítios diversos aos microrganismos, como a

superfície dental, o sulco gengival, o dorso da língua e as amígdalas. Geralmente

encontra-se espécies de Actinomyces nas amígdalas e gengivas, e Streptococcus

mutans associados a cárie dental.

TRATO GASTROINTESTINAL

O esôfago é habitado por algumas microrganismos comuns a orofaringe, mas

acredita-se que a maioria presente nele sejam transitórias que não se

estabeleçam.O estômago tem pH ácido,logo as bactérias lá encontradas são ácido

tolerantes (Lactobacillus e Streptococcus).A população microbiana deste órgão pode

estar alterada em pacientes que estejam utilizando medicamento que reduzam o pH

gástrico.

“O número de bactérias da flora intestinal é 10 vezes maior que o número de

células que formam os nossos órgãos e tecidos, isto é, 1014 bactérias para 1013

células humanas.’’(LUIZ RACHID TRABULSI,2005)

O intestino humano é dividido em dois grandes sítios, o intestino delgado e o

intestino grosso,estes subdivididos em sítios menores.O intestino delgado é formado

por 3 porções:o duodeno, que é uma extensão do estômago,é habitado por

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diferentes bactérias, fungos e parasitas, em sua maioria anaeróbios, alguns

responsáveis por doenças gástricas, como Peptostreptococcus, Porphynomas e

Prevotella; jejuno,a maior porção, é colonizado em suas maioria por espécies

aeróbias de estreptococcos, estafilococos e lactobacilos; o íleo,que liga-se ao

intestino grosso, apresenta uma diversidade maior de microrganismos, pois passa a

incluir coliformes e bacteróides, fusobactérias e clostrídeos, que são bactérias

anaeróbias. “O baixo potencial de oxirredução no íleo explica a presença da flora

anaeróbia nessa região”. (LUIZ RACHID TRABULSI,2005).

O intestino grosso é o sítio do corpo humano mais habitado por

microrganismos. É dividido em colo ascendente, transverso e descendente. “No

intestino grosso, as bactérias anaeróbias superam as demais (facultativas e

aeróbias) por um fator de 102-104. Predominam os bacteróides,bifidobactérias e

fusobactérias. Os lactobacilos, estreptococos, clostrídeos e enterobactérias são

também bastante freqüentes. Calcula-se que a flora intestinal compreenda em torno

de 500 espécies pertencentes a 200 gêneros, mas desses somente em torno de 20

são representados de maneira significativa.” (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). As

bactérias mais freqüentes incluem Bifidobacterium, Eucabacterium, Bacteroides,

Enterococcus, Clotridium, Pseudomonas, Streptococcus, Lactobacillus,

Fusobacterium, e Staphylococcus. A flora intestinal é importante na para a absorção

de nutrientes, síntese de vitamina K (que é um fator de coagulação sanguínea) e

conversão de ácidos biliares. A ingestão de antimicrobianos, no tratamento de

doenças, altera a oferta de bactérias, podendo causar diarréia antibiótico-induzida e

dificuldade na absorção e redistribuição de medicamentos, como no caso dos

contraceptivos orais, que podem perder o efeito se associado ao uso de antibióticos.

TRATO GENITAL

No sistema genital feminino,a uretra anterior e a vagina são normalmente

colonizadas por microrganismos.A flora de ambos é formada por uma variedade de

lactobacilos, estreptococos e estafilococos. As variações de pH controlam a

diversidade desses sítios. “Em pH ácido (+/- 5) há predominância de Lactobacillus e

em pH neutro predominam as outras bactérias. A variação de pH, por sua vez, está

relacionada com a quantidade de glicogênio na vagina. A fermentação deste

15

polímero pelos lactobacilos abaixa o pH, criando um ambiente desfavorável ao

crescimento das bactérias que proliferam em pH neutro.” (LUIZ RACHID

TRABULSI,2005). A bexiga urinária pode ser colonizada transitoriamente por

bactérias da uretra,mas a ação bactericida de células uroepiteliais e o jato de urina

eliminam os microrganismos de lá.O útero, e demais órgãos relacionado ao sistema

genitourinário devem ser estéreis.O controle microbiano também ocorre pela ação

do muco cervical que contém lisozima,uma enzima com atividade antibacteriana.

A uretra masculina é normalmente colonizada pelos mesmos microrganismos

da uretra feminina.

PELE

“Em virtude de sua constante exposição e contato com o meio ambiente, a

pele mostra-se particularmente propensa a abrigar microrganismos transitórios.

Entretanto, existe uma flora residente constante e bem-definida, modificada em

diferentes áreas anatômicas por secreções, uso habitual de roupas ou proximidade

de mucosas (boca, nariz e área perineal).” (JAWETZ, MELNICK E ALDEBERG,

2009)

Os microrganismos mais comuns à pele são bacilos difteróides aeróbios e

anaeróbios (Corynebacterium, Propionibacterium) e estafilococos aeróbios e

anaeróbios não-hemolíticos,como o Staphylococcus epidermidis. Há presença,em

menor quantidade, de Enterococcus.

O pH baixo, os ácidos graxos e a presença de lisozima são condições que

resultam na eliminação de microrganismos não-residentes da pele. No entanto, nem

a lavagem e banho, nem a sudorese são capazes de alterar significativamente a

flora residente.

Prática Laboratorial

Com o objetivo de cultivar microrganismos na flora humana normal, que é

importante na competição com os patogênicos por sítios e nutrientes,foi realizada a

coleta de amostras de diferentes locais.O procedimento de coleta foi feito com o

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swab,em áreas como a boca e unha, umedecido em solução salina estéril,e feito

então um esfregaço em zigue-zague na Placa de Petri contendo Ágar nutriente. Os

microrganismos nas áreas coletadas são abundantes, e a presença deles é normal,

não estando relacionada com o estado de doença. As placas foram incubadas a 37º

por 24 horas e após 3 dias os resultados foram observados.

Macroscopicamente, as colônias tinham aparência diferentes, pois não eram

dos mesmos locais anatômicos e, portanto, apresentavam flora normal distinta. A

placa da boca apresentava colônias médias, de cor amarelada, circulares com

bordas lisas e elevação côncava. A da unha,no entanto, tinha colônias pequenas, de

cor branca, forma circular, elevação ondulada e estavam bem agrupadas.

Placa de Petri da aula: O sítio de cima é o da boca, pode ser observada a

coloração amarela das colônias, o sítio de baixo representa a unha, e a cor branca é

evidente. Conclui-se então que são microrganismos de espécies diferentes.

17

Para a visualização microscópica das UFC’s da placa montada,foi realizada a

montagem de lâminas de esfregaço com coloração com o azul de metileno. E

levando a lâmina ao aquecimento rápido no Bico de Baunsen.

O azul de metileno é um sal, Cloreto de azul de metileno, consiste num cátion de

azul de metileno e num ânion de cloreto. Colore as células a partir da associação do

cátion com estas. Ele reage com as células à uma taxa lenta de 30-60 segundos.

Na visualização microscópica observou-se na lâmina de boca a presença

predominante de estafilococos,e também estreptococos e diplococos,na lâmina se

unha observou-se a presença de cocos livres e muitas tétrades.

Boca

Unha

4.Coloração de Gram

18

4. Coloração de Gram

O método de Coloração de Gram tem como objetivo facilitar a diferenciação

das bactérias baseado na constituição de suas camadas,podendo ser Gram

Positivas ou Gram negativas.A coloração facilita ainda a observação da morfologia

das células,se estas são cocos ou bacilos,e seus arranjos em grupos. O método

tradicional da coloração foi desenvolvido por Hans Christian Gram,mas existem

inúmeras variações baseadas neste,como de Hucker, e de Kopeloff.Os princípios

são os mesmo,varia-se apenas os corantes,ou a sequência destes.

O princípio geral deste método é o de fixação,coloração e desidratação das

células,que dependendo da constituição de suas paredes,perde ou mantém a

coloração.Este será descrito adiante.

Quanto a estrutura e composição das células: “O principal componente

estrutural da parede celular é um peptidoglicano (mucopeptídeo ou mureína), um

polímero misto de açúcares hexoses (N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico)

e aminoácidos.Nas bactérias gram-positivas,o peptidoglicano forma uma camada

espessa (20-80 nm) externa à membrana celular e pode conter outras

macromoléculas.Nas espécies gram-negativas, a camada de peptidoglicano é fina

(5-10 nm) e recoberta por uma membrana externa ancorada às moléculas de

lipoproteínas na camada de peptideoglicano. As moléculas principais da membrana

externa são lipopolissacarídeos e lipoproteínas.Os polissacarídeos e os aminoácidos

carregados na camada de peptidoglicano a tornam altamente polar, promovendo a

bactéria com uma superfície hidrofílica espessa.Essa propriedade permite que os

organismos gram-positivos resistam à atividade da bile. Por outro lado, a camada é

digerida pela lisozima, uma enzima presente nas secreções do corpo, a qual

consequentemente apresenta propriedade bactericidas.A síntese do peptidoglicano

é interrompida pelos antibióticos penicilina e cefalosporinas.Nas bactérias gram-

negativas, a membrana externa e também hidrofílica, porém os componentes

lipídicos das moléculas constituintes lhe conferem também propriedades

hidrofóbicas. A entrada de moléculas hidrofílicas como açúcares e aminoácidos é

necessária para a nutrição e é conseguida pelos canais ou poros formados por

19

proteínas chamadas ‘porinas’.O lipopolissacarídeo (LPS) na membrana confere

ambas as propriedades: antigênica (os antígenos ‘O’ das cadeias de carboidrato) e

tóxica (a ‘endotoxina’ do lipídeo A).Nas micobactérias gram-positivas, a camada

peptidoglicano apresenta uma base química diferente para a ligação cruzada à

camada de lipoproteínas, e o envelope esterno contém uma variedade de lipídios

complexos (ácidos micólicos). Isto cria uma camada serosa,à qual altera as

propriedades de coloração desses organismos (as chamadas bactérias ácido-

resistentes) e lhes dá considerável resistência ao ressecamento e utros fatores

ambientais. Os componentes da parede celular das micobactérias também

apresentam uma atividade adjuvante pronunciada (i.e promovem resposta

imunológica). No lado externo da parede celular,pode haver uma cápsula adicional

de polissacarídeos de alto peso molecular (ou aminoácidos no bacilo do antraz) que

confere uma superfície viscosa. A cápsula fornece proteção contra fagocitose pelas

células do hospedeiro e é um importante determinante de virulência.” (CEDRIC

MIMS,2005).

Gram-positiva

20

Gram-negativa

O material para coloração foi obtido a partir de uma amostra de mucosa oral

colocado em um meio de A.N. cerca de 7 dias antes. Com o auxílio da alça de

rubro,esta já submetida à chama do bico de Bausen,coletamos uma pequena

quantidade de uma UFC da placa de Petri ,e ,sobre uma lâmina com uma gota de

álcool,espalhamos suavemente a amostra coletada.Em seguida,para fixar o material,

e evitar a remoção das bactérias no momento da coloração,por 3 vezes flambamos

a lâmina rapidamente.Deixar esfriar.

O esfregaço agora deve ser coberto por uma camada do principal corante,o

Cristal Violeta, e reservar por 1 minuto.Este corante entra no citoplasma das

células,sejam estas Gram+ ou Gram -, corando ambas.Despejar o excesso. Fazer

uma nova camada sobre a lâmina com Lugol,um fixador que irá reagir com o Cristal

Violeta,formando cristais grandes o bastante para não saírem da celular,formando

um complexo chamado de violeta-iodo,violeta-lugol ou iodo-pararosanilina.Lavar a

lâmina com água corrente.Em seguida,lavar a lâmina com álcool por 15 segundos.

“A aplicação de álcool desidrata a peptideoglicana das células gram-positivas para

torná-lo mais impermeável ao cristal violeta-iodo. O efeito nas células gram-

negativas é bem diferente: o álcool dissolve a membrana externa das células gram-

negativas,deixando também pequenos buracos na fina camada de

peptiodeoglicanos pelos quais o cristal violeta-iodo se espalha.Como as bactérias

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gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, a adição de safranina

(contracorante) torna as células cor-de-rosa.” (GERARD J. TORTORA,2005)

Ilustração do procedimento: lâmina e lamínula

A composição básica das soluções utilizadas na técnica estão descritas a seguir:

CRISTAL VIOLETA

Cristal violeta

Ácido fênico

Álcool absoluto

Água destilada

LUGOL

Iodo

Iodeto de potássio

Água destilada

22

FUCSINA

Fucsina

Álcool etílico

Água destilada

Desenho das bactérias visualizadas por microscopia óptica na aula prática. A

visualização foi aumentada 400x,colocando sobre a lâmina o óleo de emersão.

Gram-positiva:

Gram-negativa:

23

5. Técnica de diluição seriadas e contagem de colônias

Cada mililitro de uma suspensão de células bacterianas deve conter milhões

de células, porém, nem todas são viáveis. O nome dado ás células viáveis é

Unidade formadora de colônia (UFC). A técnica de diluição seriada tem como

objetivo facilitar o isolamento de microrganismo e principalmente permitir a

contagem dessas UFC’s a partir de uma proporção de diluição. O método baseia-se

no princípio de que cada uma dessas unidades formadas é oriunda de uma única

célula bacteriana viável.

A quantificação das unidades envolve alguns cuidados, como assepsia, para

não contaminar o preparo, e o meio de cultivo que deve ser pobre em carboidratos,

pois este pode estimular a produção de cápsula, gerando uma aderência das células

umas às outras, e assim dificultando a contagem. A diluição sofre outras diluições

em alíquotas, para assim encontrar um número menor e contável, baseado em uma

proporção.

Prática laboratorial

A partir de uma amostra em solução com concentração de 10-1 em 1ml fazer

sucessivas diluições em amostras salinas estéreis também na quantidade de 1ml,

até a proporção de 10-7. Escolher 3 proporções para o cultivo em placa.

As proporções escolhidas foram 10-3,10-5 e 10-7. As soluções foram cultivadas em

diferentes placas de Petri e o resultado foi observado após 3 dias.

A contagem de ufc’s foi possível nas três placas. A concentração de bactérias

seguiu decrescentemente as proporções: 10-3,10-7 e 10-5. Diferentes unidades foram

observadas: amarelas e brancas, com bordas circulares e uniformes, circulares e

irregulares, com superfícies convexas e onduladas.

24

Representação de diluição.

25

6. Antibiograma

O antibiograma é um teste laboratorial que consiste em verificar qual a

resistência de um determinado microrganismo a um agente bactericida, que

interrompe sua atividade, ou bacteriostático, que o mata. Assim é possível ter uma

especificidade sobre qual agente antimicrobiano utilizar em um tratamento. Logo, é

recomendado para grupos de bactérias que adquiram resistência facilmente. Além

disso, é um teste útil para teste com novos antibióticos e pesquisas epidemiológicas.

“O antibiograma é indicado para qualquer microrganismos estreitamente

relacionado ao processo infeccioso, cuja sensibilidade a drogas normalmente

empregadas na terapia não seja previsível. É o caso das enterobactérias, S. aureus,

bacilos Gram-negativos não fermentadores etc. Estas bactérias sofrem forte pressão

seletiva, já que pela ação das drogas há o extermínio das bactérias sensíveis e

crescimento das bactérias resistentes, que estavam misturadas na população

bacteriana.” (MARIANGELA CAGNONI RIBEIRO,2000)

Há inúmeros procedimentos para testar a eficácia de antimicrobianos, como

testes quantitativos, com um ponto final específico conhecido como Concentração

Inibitória Mínima (CIM) e testes qualitativos, como o método de difusão em disco,

onde as bactérias isoladas podem ser classificadas em resistente,intermediária ou

sensível. Mas pode ser resumida em duas principais: resistente e sensível. A

resistência encontrada em alguns tipos de bactérias pode ser explicada pela

composição das suas paredes.

“[Concentração Mínima Bactericida] É a mais baixa concentração do

antibiótico capaz de eliminar completamente o microrganismo. O procedimento é

semelhante ao realizado para a medida da CMI. A diluição do antibiótico que for

capaz de eliminar totalmente os microrganismo e impedir que o microrganismo

cresça no meio sem o antimicrobiano é considerada a concentração mínima

bactericida (CMB). A CMB é mais utilizada para pacientes imunossuprimidos ou em

pacientes acometidos por endocardites.”

(ALANE BEATRIZ VERMELHO,2006)

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Prática laboratorial

O método escolhido foi o de difusão em disco, e, ao invés de antimicrobianos,

três enxaguantes bucais foram escolhidos para ter sua eficácia testada. O método é

o de Kirby-Bauer, aceito como método-padrão para a realização de antibiogramas.

Em uma placa com Agar nutriente, espalhar uma solução com bactérias sobre

ela de maneira uniforme, e, com o auxílio de uma pinça, umedecer um par de

discos, um sobre o outro, nos líquidos a serem testados. Repetir isso em todos os

líquidos os enxaguantes a serem testados. Os escolhidos foram Oral B, Listerine,e

Perio Plark. Com a placa marcada com pincel, colocar os discos sobre a marca e

incubá-los.

O resultado observados após três dias foi a eficiência do Perio Plark, pois na

sua composição há clorexidina, um anti-séptico de amplo espectro no controle de

bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos, que não agride as mucosas. O

Listerine teve menor eficácia, mas ainda assim presente, devido o álcool na sua

composição, que também tem ação anti-séptica. E o Oral B não teve eficiência

expressa.

Halos de inibição (média)

Perio Plak Listerine Oral B

1,5 mm 0,5 mm 0,1mm

Perio Plak: Microrganismo sensível

Listerine: Microrganismo com sensibilidade intermediária baixa.

Oral B: Microrganismo resistente

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Houve variação em alguns resultados quanto o Oral B e Listerine, talvez

devido à erros no procedimento, porém, o Pério Plak foi eficiente em todos os casos.

Os resultados podem ser observados no gráfico

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7. Características morfológicas de fungos

Os fungos são seres eucariotos, anaeróbios ou aeróbios, quimio-

heterotróficos, necessitando de componentes orgânicos para energia e carbono,

multicelulares ou unicelulares, no caso das leveduras, e se reproduzem de forma

sexuada e assexuada.

“Os fungos normalmente crescem melhor em ambiente em que o pH é

próximo a 5, que é muito ácido para o crescimento da maioria das bactérias comuns.

Quase todos os fungos são aeróbicos. A maioria das levedura é anaeróbica

facultativa. A maioria do fungos é mais resistente à presão osmótica que as

bactérias; muitos consequentemente, podem crescer em concentrações

relativamente altas de açúcar ou sal. Os fungos podem crescer sobre substâncias

com baixo grau de umidade, geralmente tão baixo que impede o crescimento de

bactérias. Os fungos necessitam de menos nitrogênio para o crescimento

equivalente ao das bactérias. Os fungos são frequentemente capaz de metabolizar

carboidratos complexos, tais como lignina (um dos componentes da madeira), que

as bactérias não podem utilizar como nutriente.Essas características permitem que

os fungos se desenvolvam em substratos diversos como parede de banheiro, couro

de sapatos, e jornais velhos”. (GERARD J. TORTORA, 2005)

Na observação de características macroscópicas, aspectos importantes a

serem observados são: tamanho, que varia bastante, de acordo com a qualidade e

quantidade de substrato ofertado;bordas, podendo estar ter várias formas, sendo

bem delimitadas ou irregulares, lembrando franjas; textura, esta é talvez a mais

importante característica de uma colônia fúngica, essas colônias podem ser colônias

algodonosas (com aspecto de algodão), furfuráceas (lembram substância farinácea

espalhada numa superfície), penugentas (lembram fragmentos de penas de aves),

arenosas (com aspecto de areia), veludosas (assemelha-se a tecido aveludado),

glabrosas (aspecto de cera ou manteiga,sendo observada em leveduras,que se

assemelham à colônias bacterianas); quanto o relevo a colônia fúngica pode ser

cerebriforme (com ondulações que lembram um cérebro), rugosas (com ondulações

menos evidentes), apiculadas (saliência no ponto central lembra um cume), e

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crateriformes (lembram cratera devido à uma depressão central); e a pigmentação,

que pode estar presente só na superfície da colônia, no seu reverso, em ambos, e

ser ou não difusível ao meio.

“A caracterização de uma colônia, visando auxiliar a identificação de

determinada espécie fúngica, nada mais é do que um conjunto de características

subjetivas, de expressão fenotípica, encontradas em determinada espécie. As

alterações fenotípicas, por sua vez, nada mais são do que uma tentativa de

adaptação do fungo ao meio biótico e abiótico ao qual a colônia está submetida. Não

raro, as características clássicas deixam de se manifestar e apontam em direção a

uma outra espécie fúngica, não correlacionada aos achados”. (JOSÉ JÚLIO COSTA

SIDRIM,2004)

Os elementos gerais de um fungo, além da colônia, são micélios e o talo. O

micélio é um filamento semelhante a um tecido, formado por um conjunto de hifas,é

fácil de confundi-lo com a cultura no cultivo, tem função de elemento de sustentação

e absorção de nutrientes. As subdivisões dos micélios são feitas de acordo com sua

situação (se é aéreo ou profundo) ,sua septação (contínua ou septada), sua função

(vegetativo ou reprodutivo) e pela disposição das suas hifas (podem ser em anéis,

rizomorfas, haustórios,etc).E o talo é o corpo do fungo, pode ser unicelular ou

miceliano (filamentoso);ele é formado por células agrupadas ou separadas, sem

uma ligação muito rígida, sendo comum às leveduras.

Microscopicamente, as estruturas responsáveis pela diferenciação da

espécies de fungos filamentosos são conhecidas por nomes de estruturas de

frutificação e de ornamentação. Essas estruturas de frutificação são células

pertencentes às hifas que sofrem modificações, dependendo da condição biológica,

para originar dois tipos primários de células: as esporogênicas e as conidiogênicas.

O que as diferencia é o fato de que a primeira vai originar esporos, que ficam dentro

de uma bolsa conhecida como esporângio, enquanto na segunda não se observa

estrutura de envolvimento externo. Ambas as células tem função final de reprodução

assexuada, mas no caso dos conídios de fungos filamentosos, estes estão livres

para se destacar da hifa e dar origem a um novo fungo. Outras estrutura,

denominadas de ornamentação, que não se conhece sua função específica, também

auxiliam na diferenciação de espécie dos fungos.

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Procedimento Laboratorial

Com o auxílio de um palito, foram coletadas amostras dos gêneros

Penicillium, Aspergillus e Candida para serem observadas em microscopia ótica.

Durante a preparação das lâminas as amostras receberam a coloração do azul de

metileno para auxílio na observação. Procurar coletas amostras do centro da cultura,

pois estas já esporularam.

Penicillium macroscopicamente, com coloração esverdeada em verso, bordas

brancas, superfície rugosa e veludosa.

Microscopicamente, pode ser visualizada as hifas septadas com fiálides e conídios

nas extremidades, sem a presença de vesículas.

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Aspergillus: superfície cebriforme e algodonosa, com coloração no verso.

Microscopicamente, pode ser observada uma vesícula na extremidade de um

conidióforo, e essa vesícula cercada por conídios.

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Candida, com aparência de colônias de bactérias, sendo globosas, brilhantes

e com superfície côncava

Microscopicamente, são observados brotos, ou pseudohifas, brotos que não

se separaram.

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