CNPqBOLSA PESQUISA - CNPq/UEMUEM

CNPqPROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA - PIBIC/CNPq-FA-UEM

RELATRIO FINAL

UEM

PERODO DE ABRANGNCIA DO PROGRAMA: 1/08/2011 a 31/07/2012

1.BOLSISTA: Cssio Rafael Moreira

2.ORIENTADOR: Marli Aparecida Defani3.DEPARTAMENTO: DCM

4. CO-ORIENTADOR: ngela Maria Pereira Alves5. DEPARTAMENTO: DCM

6. TTULO DO PROJETO: Anlise morfomtrica dos cinos da glndula salivar partida de ratos diabticos suplementados com vitaminas E e C.

7.RELATRIO CONTENDO OS RESULTADOS DA PESQUISA

ESTRUTURA FSICA

Capa

Folha de rosto

Resumo

Texto completo do trabalho

Introduo

Objetivos

Desenvolvimento (Materiais e Mtodos)

Resultados

Discusso

Concluses

Referncias (de acordo com as normas da ABNT)

8. COMPROVANTE DE APRESENTAO DOS RESULTADOS DA PESQUISA EM EVENTOS CIENTFICOS (Se houve premiao, informar o evento, a classificao e anexar comprovante). Obs.: os Certificados do EAIC sero anexados pela PPG.

9. COMPROVANTE DE PUBLICAO, COM A PARTICIPAO DOS BOLSISTAS, EM PERIDICOS INDEXADOS E/OU COM CORPO EDITORIAL.

10. AVALIAO DO ORIENTADOR SOBRE O DESEMPENHO DO BOLSISTA NO PROJETO.

11.AVALIAO DO ORIENTADOR SOBRE O PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA.

12.AVALIAO DO ACADMICO SOBRE O PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA. O programa institucional de bolsas de iniciao cientfica mostrou-se muito organizado e satisfatrio. Alm disso, ofereceu tima oportuminidade de desenvolvimento tcnico, cientfico e pessoal.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA PIBIC/CNPq-Fundao Araucria-UEMDEPARTAMENTO DE CINCIAS MORFOLGICAS ORIENTADOR(A): Profa. Dra. Marli Aparecida DefaniBolsista: Cssio Rafael MoreiraANLISE MORFOMTRICA DOS CINOS DA GLNDULA SALIVAR PARTIDA DE RATOS DIABTICOS SUPLEMENTADOS COM VITAMINAS E & C

Maring, 31 de agosto de 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA PIBIC/CNPq-Fundao Araucria-UEMDEPARTAMENTO DE CINCIAS MORFOLGICAS ORIENTADOR(A): Prof. Dra. Marli Aparecida DefaniBolsista: Cssio Rafael MoreiraANLISE MORFOMTRICA DOS CINOS DA GLNDULA SALIVAR PARTIDA DE RATOS DIABTICOS SUPLEMENTADOS COM VITAMINAS E e C

Relatrio contendo os resultados finais do projeto de iniciao cientfica vinculado ao PIBIC/CNPq-Fundao Araucria-UEM

Maring, 31 de agosto de 2012Resumo

Alteraes morfofuncionais na glndula partida so observadas no diabetes mellitus (DM), sendo o estresse oxidativo, entre outros fatores, implicado na patognese da atrofia glndular. O uso de substncias com ao antioxidante, como as vitaminas E e C, no DM tornou-se alvo de vrios estudos. No presente trabalho, ratos diabticos foram suplementados com vitaminas E e C, e a anlise morfomtrica dos cinos da glndula partida dos animais foi comparada com a de ratos diabticos, normoglicmicos e normoglicmicos suplementados com vitaminas E e C. Observou-se, ao final do experimento, que a suplementao com vitaminas E e C protegeu os cinos da glndula partida de ratos diabticos contra a atrofia.Palavras-chave: glndulas salivares, diabetes melitus, vitaminas E e C.IntroduoDiabetes Mellitus (DM) a mais comum desordem metablica crnica, caracterizada por nveis de glicose suprafisiolgicos devido deficincia na secreo de insulina, no receptor de insulina ou em eventos ps-receptor levando a alteraes no metabolismo de carboidratos, protenas e lipdeos (Baynes, 1991). O DM esta relacionado a comprometimento dos rins, olhos, nervos, vasos sanguneos e corao, alm disso, perodos longos de hiperglicemia podem estar associados com alteraes bucais, como a doena periodontal, considerada a sexta complicao mais prevalente do DM (Souza et al., 2003).

A prevalncia da doena periodontal muito mais elevada entre os diabticos em relao populao em geral (Taylor etl al., 2008). Muitas outras alteraes podem aparecer antes e algumas vezes predispor a doena periodontal, como disfuno das glndulas salivares, que levam a uma reduo do fluxo salivar e mudanas na composio da saliva, alteraes do paladar, maior tendncia infeco bucal, prejuzo no processo cicatricial, cries, lngua saburrosa e halitose (Negrato et al. 2011).

O prejuzo no metabolismo causado pelo DM leva a progresso e agravamento do estresse oxidativo atravs de vrios mecanismos, como a autoxidao da glicose, glicao protica e a formao de produtos finais da glicao avanada (AGEs) (Baynes et al., 1999). Espcies reativas de oxignio (EROs) so produzidas pelas glndulas salivares em situaes fisiolgicas, de infeco microbiana e como resposta a hiperglicemia causada pelo DM (Turner et al., 2011).

Dentre as complicaes, mudanas na morfologia e funo das glndulas partidas de ratos diabticos induzidos por estreptozootocina j foram relatadas por Anderson (1987). Estudos mais recentes sugerem a baixa sensibilidade de receptores muscarnicos (Watanabe et al., 2001), mudanas no fluxo sanguneo da glndula (Whitcher et al., 2010), aumento da atividade autofgica e lisossomal, endocitose de protenas secretadas pelas clulas ductais e acmulo de material na membrana basal (Mednieks et al., 2009) como possveis causas dessas alteraes.O estresse oxidativo, induzido pelo estado hiperglicmico, caracterizado pelo aumento de EROs dentro da clula, e tem papel importante na patognese das complicaes do DM (Sivakumar et al., 2010). Na glndula partida, foi demonstrado alteraes em enzimas antioxidantes, como a catalase e a glutationa peroxidase (Leite et al, 1999). Substncias que reduzem o estresse oxidativo, podem ter um papel relevante no tratamento das complicaes do diabetes. As vitaminas E e C so algumas dessas substncias e tem sido estudadas no tratamento das complicaes crnicas dessa patologia. A atividade dos EROs pode ser anulada quando o radical livre encontra-se e reage com uma molcula antioxidante, como a vitaminas E e C, levando neutralizao ou diminuio da reatividade (Harrison et al., 2012).

A vitamina E (-tocoferol) um potente antioxidante lipoflico, que neutraliza os radicais livres produzidos durante o metabolismo celular normal, protegendo as membranas celulares e lipoprotenas dos danos oxidativos (Debier et al., 2005). Alm das propriedades antioxidantes, essa vitamina reduz a citotoxicidade, minimiza o efeito de lipoprotenas oxidadas, suprime a proliferao das clulas musculares lisas, reduz a adeso e agregao plaquetria e melhora a funo endotelial.

A vitamina C (cido ascrbico), tem um papel importante na proteo contra os danos celulares induzidos por radicais livres. Estudos prvios tem demonstrado uma diminuio no nvel basal de vitamina C no DM. (Fadupin et al., 2007). A molcula dessa vitamina estruturalmente similar glicose, e pode substitu-la em muitas reaes qumicas, portanto efetiva na preveno da glicolisao no enzimtica de protenas (Ardekani et al., 2007).

ObjetivosO propsito deste trabalho foi investigar o efeito da suplementao oral dessas vitaminas sobre os parmetros morfomtricos dos cinos da glndula partida de ratos diabticos induzidos por estreptozootocina.Materiais e MtodoPara o presente estudo foram utilizados 20 ratos machos Wistar (Rattus norvegicus), com 90 dias de idade, pesando em mdia de 313g, provenientes do Biotrio Central da Universidade Estadual Maring. A pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica em Experimentao Animal da Universidade Estadual de Maring (UEM). As tcnicas utilizadas esto de acordo com princpios ticos adotados pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA).Os ratos foram divididos em quatro grupos: N (normoglicmicos); NEC (ratos normoglicmicos suplementados com vitaminas E e C); D (ratos diabticos) e DEC (ratos diabticos suplementados com vitaminas E e C).

Os animais dos grupos NEC e DEC receberam suplementao com vitaminas C e E por 120 dias. A vitamina C (Sigma, ST. Louis, MO, USA) foi adicionada gua (1 g.L-1 diariamente preparado) e a vitamina E (Zhejiang NHU, China) foi incorporada na rao Nuvital (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil) (1% preparado a cada semana).

Aps 120 dias de experimento os ratos foram mortos, sendo previamente pesados e anestesiados com uma dose de 40 mg.kg-1 de peso corporal de tiopental (Laboratrios Abbott, Chicago, IL, EUA) intraperitoneal. O sangue foi coletado por puno cardaca para avaliao da glicemia de jejum. Realizou-se laparotomia para a coleta da gordura visceral (abdominal e epididimal). As gorduras foram pesadas e calculadas proporo para cada 100 gramas de peso corporal.

As partidas extradas foram lavadas em soluo salina (NaCl 0,9%) para retirada de resduos de sangue, e imediatamente transferidas para soluo de formalina 10% por um perodo de 12 horas, promovendo a ntegra fixao dos tecidos glandulares. Sequencialmente, as mesmas foram lavadas em gua corrente para serem armazenados em lcool 70%. Utilizando-se uma srie crescente de concentraes de alcois, os tecidos foram desidratados, diafanizados em xilol, includos em parafina e seccionados em micrtomo com 6(m espessura. Posteriormente, os cortes foram submetidos colorao em hematoxilina-eosina (HE).Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais com fotoperodo (12 horas de claro/escuro) e temperatura ambiente (24C 2) controlados. A quantidade de alimento ingerido e a gua consumida foram avaliadas durante a ltima semana de cada ms.

As imagens dos cinos foram capturadas por cmara de alta resoluo acoplada ao microscpio Olympus BX20, e transmitidas para microcomputador e gravadas em compact disc. Por meio do programa computadorizado de anlise de imagens Image-Pro-Plus, foi mensurada a rea ((m2) do perfil de 100 cinos por lmina, perfazendo o total de 500 cinos em cada grupo estudado, expressando-se os resultados em mdia das reas do cinos por grupo.

Os dados coletados foram submetidos a testes estatsticos apropriados, como anlise de varincia e teste de Tukey para comparao dos aspectos morfomtricos dos cinos glandulares entre os grupos. O nvel de significncia foi de 5%.

Resultados e DiscussoOs animais diabticos induzidos por estreptozootocina (grupos D e DEC) apresentaram um quadro com caractersticas tpicas do DM: poliria, polidpsia, polifagia, hiperglicemia, perda de gordura visceral e reduzido ganho de peso ou at mesmo perda de peso corporal. Essas alteraes devem-se ao estado de insuficincia e/ou ausncia insulnica e hiperglicemia (Furlan et al., 2004).

Os dados fisiolgicos como peso corporal inicial com 90 dias de idade (PIC) , peso corporal final com 210 dias de idade (PCF) , gordura visceral (gordura abdominal e epididimal) por 100 g de peso corporal (GV) , ingesto de gua por 100g de peso corporal (IA) , ingesto de rao por 100g de peso corporal (IR) , glicemia inicial (GI) e glicemia final (GF) dos grupos N, NEC, D e DEC so expressos na Tabela 1.Tabela 1 - Peso corporal inicial com 90 dias de idade (PCI), peso corporal final com 210 dias de idade (PCF), gordura visceral (gordura abdominal e epididimal) por 100 g de peso corporal (GV), ingesto de gua por 100g de peso corporal (IA), ingesto de rao por 100g de peso corporal (IR), glicemia inicial (GI) e glicemia final (GF) nos animais dos grupos normoglicmico (N), normoglicmico suplementado com vitamina C e E (NEC), diabtico (D) e diabtico suplementado com vitamina C e E (DEC).ParmetrosGrupos

NNECDDEC

PCI (g)304 16,97 a325,9 29,3 a316,6 21,03 a307,2 18,73 a

PCF (g)460,7 56,95 a455,4 45,39 a341,8 26 b298,6 56,75 b

GV (g)2,42 0,54 a2,98 0,28 a0,46 0,10 b0,9 0,51 b

IA (ml)10,81 2,5 a9,17 1,28 a50,08 14,47 b47,22 10,45 b

IR (g)6,55 0,69 a7,3 1,72 a15,24 2 b13,25 2,3 b

Gl (mg dl-1)180,7 17,32 a167,2 14,47 a408 13,4 b406,6 6,61 b

GF (mg dl-1)179,8 19,29 a166,2 17,06 a420,1 8,22 b413,6 49,8 b

Mdias seguidas por letras diferentes na mesma linha so estatisticamente diferentes de acordo com o teste de Tukey (p < 0,05).O PCI entre os grupos experimentais no mostrou valores significativamente diferentes. No entanto, o grupo D teve um PCF 25,8% menor em relao ao grupo N; j a anlise do valor do PCF entre os grupos D e DEC no teve diferena singnificativa. Os valores da mdia da GV nos grupos N e NEC no tiveram significncia estatstica, todavia, a mdia encontrada no grupo D e DEC foi menor que a encontrada nos demais grupos. As mdias da IR e IA dos grupos D e DEC no diferiram entre si, entretanto foram significativamente maiores que as verificadas para os grupos N e NEC. Esses dados demonstraram que os animais diabticos tiveram sua capacidade de converter elementos nutricionais em massa corporal amplamente reduzida. A depleo insulnica acarreta a ativao do catabolismo de substncias de reserva energtica como os lipdeos, fato que corrobora com a diminuio da gordura visceral dos animais diabticos induzidos por estreptozootocina (Genuth, 2000). A GI dos grupos N e NEC foram significamente menores quando comparada GI dos grupos D e DC, sendo que esse resultado tambm foi observado em relao GF.A anlise da rea dos cinos glandulares demonstrou diminuio (p < 0,05) nos ratos dos grupos D (1368,2 26,99 m2) e DEC (1708,6 32,68 m2) em relao a do grupo N (2133,4 40,01 m2). Entretanto, no foi verificada diferena significativa entre os grupos N e NEC (2097,06 38,04 m2) (Figuras 1 e 2 ).

Figura 1 Mdia da rea acinar da partida dos grupos: normoglicmicos (N), normoglicmicos suplementados com vitaminas E e C (NEC), dibticos (D) e diabticos suplementados com vitaminas E e C (DEC).

Figura 2 Fotomicrografias de cortes histolgicos das glndulas partidas corados com Hematoxilina e Eosina dos grupos N (normoglicmicos), NEC (normoglicmicos suplementados com vitaminas E e C), D (diabticos) e DEC (diabticos suplementados com vitaminas E e C) obtidas com microscpio ptico Olympus e objetiva de 20X.Em ratos com DM induzido por estreptozootocina, os cinos da glndula partida denotam mudanas degenerativas que podem se manifestar como atrofia acinar a qual tambm foi verificada em nosso experimento. A atrofia acinar encontrada nos animais do grupo D pode estar relacionada com a depleo crnica de sdio nas clulas acinares, levando a uma desidratao dessas clulas; ou ainda reduo e/ou modificao no contedo e sntese de protenas (Mednieks et al., 2009), bem como perturbaes no metabolismo de carboidratos.Alm dos aspectos anteriormente citados, outros fatores elencados na concorrncia para a reduo das reas acinares das glndulas partidas dos animais diabticos de nosso estudo, estariam: reduo da resposta secretria da partida s estimulaes simptica e parassimptica devido a anormalidades neuroaxonais tpicas da neuropatia diabtica (Anderson et al, 2004); falta de insulina, uma vez que a manuteno da estrutura e funo normal da glndula pode, em parte, ser dependente deste hormnio e o aumento do estresse oxidativo.A suplementao com as vitaminas E e C nos animais diabticos mostrou-se benfica na preveno da atrofia acinar, uma vez que o grupo DEC obteve menor diminuio da rea acinar (p < 0,05) se comparado com o grupo D. A vitamina E um potente antioxidante lipoflico, que neutraliza os radicais livres produzidos durante o metabolismo celular normal. Tambm, a vitamina C tem um importante papel nas funes imunes e em vrios processos oxidativos e inflamatrios, como eliminao de espcies reativas de oxignio e nitrognio (Miranda-Neto et al, 2001). Aventa-se, portanto, que tais aes antioxidantes dessas vitaminas estejam implicadas na proteo da atrofia acinar no grupo DEC.ConclusoA suplementao com vitaminas E e C protegeu os cinos da glndula partida de ratos diabticos contra a atrofia.RefernciasANDERSON, L. C. Parotid gland function in streptozotocin - diabetic rats. J DentRes, v. 66, n. 2, p. 425429, 1987.ANDERSON, L.C.; GARRETT, J.R. Neural regulation of submandibular gland blood flow in the streptozotocin-diabetic rat: evidence for impaired endothelium-dependent vasodilation. Arch Oral Biol, v. 49, n. 3, p. 183191, 2004ARDEKANI, M. A.; ARDEKANI, A. S. Effect of vitamin C on blood glucose, serumlipids & serum insulin in type II diabetes patients. Indian Journal of Medical Research, v. 126, n. 5, p. 471474, 2007.BAYNES, J. W., Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes, v. 40, n. 4, p. 405-412, 1991.BAYNES, J. W.; THORPE, S. R. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes, v. 48, n. 1, p. 1- 9, 1999.DEBIER, C.; LARONDELLE, Y. Vitamins A and B: metabolism, roles and transfer to offspring. Br. J. Nutr., v. 93, p. 153-174, 2005.FADUPIN, G. T.; AKPOGHOR, A. U.; OKUNADE, K. A. A comparative study of serum ascorbic acid level in people with and without type 2 diabetes in Ibadan, Nigeria. African Journal of Medicine and Medical Sciences, v. 36, n. 4, p. 335 339, 2007.FURLAN, M. M.D. P., MOLINARI, S. L., MIRANDA-NETO, M. H. Resposta dos neurnios mioentricos do duodeno de ratos ao diabetes de curto prazo. Arq Cinc Sade Unipar 2004; 8: 95-9.GENUTH S. Hormnios das ilhotas pancreticas. In: Berne RM, Levy MN, eds, Fisiologia, Rio de Janeiro Guanabara Koogan, 2000: 774-97.

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