UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Faculdade de Farmcia

Departamento de Tecnologia FarmacuticaRelatrio de Tecnologia Enzimtica e das Fermentaes

Curvas padro e de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae Alunas: Fernanda Alves Lima

zylla Oliveira de Lucena Isabela Cristina Aguiar de Souza

Rebecca Tavares e SilvaAbril/2014

1- Introduo1.1) Saccharomyces cerevisiae

ASaccharomyces cerevisiae uma levedura facultativa (vive em condio aerbica e anaerbica), da linhagem produtora de lcool. Por ser fcil de cultivar e anter em laboratrio, fcil de manipular geneticamente e no patognica, esta levedura amplamente utilizada como organismo-modelo em Biologia sendo, por isso, um organismo muito estudado. Foi observado que em presena de oxignio, o crescimento desta levedura favorecido. E na ausncia de oxignio e tambm na presena de muito acar, cresce pouco e produz etanol.1Levando em considerao essas informaes, para avaliar o crescimento microbiano da Saccharomyces cerevisiae, o meio deve conter pouco acar e muito oxignio.

1.2) Crescimento Microbiano Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e no ao aumento das dimenses celulares (tamanho da clula). O crescimento populacional definido como o aumento do nmero de clulas ou da massa microbiana.2Existem alguns mtodos utilizados para quantificar o crescimento microbiano (concentrao celular), como:

- Mtodos diretos:

Contagem total de clulas: Esta metodologia envolve a contagem direta das clulas em um microscpio, utilizando-se cmaras de contagem.

Contagem por plaqueamento: Procedimento que estima o nmero de clulas viveis (isto , capazes de se reproduzir) em uma amostra.

Massa de clulas: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso mido de uma cultura. Este tipo de procedimento realizado quando no necessrio determinar o nmero preciso de microrganismos presentes.

O Peso seco muito utilizado na quantificao de fungos filamentosos, onde o miclio retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido secagem. Realizam-se ento sucessivas pesagens, at o momento onde no se observa mais variaes. Este procedimento pode tambm ser realizado centrifugando-se a cultura, secando em estufa por algumas horas e depois pesando o sedimento.

-Mtodo Indireto:

Turbidimetria ou Densidade tica (D.O.) associada ao peso seco: Quantificao em espectrofotmetro ou colormetro, em um determinado comprimento de onda em que a cor parda dos meios de cultura no interferira nos resultados. Tal metodologia requer a confeco de uma curva padro. Embora a anlise turbidimtrica seja menos sensvel, de rpida e fcil execuo, no destruindo a amostra. Entretanto, no permite a determinao de clulas viveis.

Para os organismos unicelulares, os valores de densidade tica (DO) so proporcionais (dentro de certos limites) ao nmero de clulas. A curva padro relaciona medidas diretas de massa de clulas (obtida pelo mtodo do peso seco), com as medidas de turbidez.2,31.3) Perfil da curva de crescimento microbianoQuando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: Lag, exponencial, estacionria e de morte (Figura 1).2

Figura 1. Fases do crescimento microbiano.

Como o mtodo de Densidade tica (D.O.) associada ao peso seco leva em consideraes todas as clulas, viveis e no viveis, a curva de crescimento no apresenta a fase de morte, j que as clulas que morrem continuam sendo contadas.Levando em considerao a fase exponencial do crescimento microbiano, possvel calcular o tempo necessrio para que a massa celular duplique, tempo de gerao (tg) e a taxa especfica de crescimento (). Sabendo esses dois parmetros permite prever como evoluir a concentrao de um microrganismo ao longo do tempo de crescimento exponencial e assim, poder prever em qual meio de cultivo e condies o microrganismo estudado tem um melhor crescimento.2,3Esta prtica tem como objetivos: construir as curvas padro e de crescimento para a levedura Saccharomyces cerevisiae por meio da tcnica de Densidade tica (D.O.) associada ao peso seco; calcular a taxa de crescimento () e o tempo de gerao (tg) da levedura; construir um grfico de pH versus tempo.2- Material e Mtodos

2.1) Curva Padro

O meio de cultivo foi preparado segundo as quantidades descritas abaixo.

-Sacarose: 10 g/L

-Sulfato de amnio: 5g/L

-Sulfato de dicido de potssio: 1,5 g/L

-Extrato de lvedo: 5 g/L

-Sulfato de magnsio heptahidratado: 0,5 g/L

-gua destilada: quantidade suficiente para 1000 ml

-pH: 6,5

Fez-se o cultivo do fermento biolgico em 100 mL do meio de cultivo, durante 18-20 h no shaker oscilatrio em banho-maria com temperatura controlada de 37 C.

Para o preparo da suspenso-me centrifugou-se durante 10 minutos (3500 RPM) um volume da suspenso preparada conforme descrito anteriormente e lavou-se as clulas duas vezes por suspenso e agitao com gua destilada seguida de centrifugao. Aps este procedimento, transferiu-se a suspenso para um balo de 50 ml e avolumou-o com gua destilada. Preparou-se uma diluio de 1:10 desta amostra inicial. Transferiu-se 5 ml da amostra diluda para dois pesa-filtros previamente secos e tarados, colocando-os na estufa a 80 C .Aps 24h, esfriou-se os pesa-filtros em dessecador e depois pesou-os, obtendo-se o peso seco celular por diferena.Transferiu-se para bales volumtricos alquotas de suspenso-me preparando-se diluies de 1:10; 1:25; 1:33; 1:50; 1:100 e 1:200, e realizou-se em duplicata a leitura da densidade tica utilizando-se um aparelho de espectrofotmetro em um = 540 nm. 2.2) Curva de Crescimento

O inculo foi preparado em um erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml do meio, crescido por 72 h em shaker a 27 C e 120 RPM.

Em um balo de fundo chato de 2000 ml contendo 1000 ml do meio de cultivo estril, com um filtro, um compressor de ar e um tubo de exausto adaptados a ele, foram adicionados 100 ml do inculo previamente crescido.

Em intervalos de tempo regulares, foram retirados aproximadamente 5 ml em duplicata dessa suspenso pelo tubo de coleta atravs da obstruo do tubo de exausto.

Aps a coleta, o volume foi marcado e centrifugou-se a amostra durante 10 minutos a 3500 RPM e, posteriormente, lavou-a duas vezes com gua destilada, centrifugando-a novamente. Ressuspendeu-se a amostra para o mesmo volume e em seguida, fez-se a leitura da densidade ptica com o auxlio do Espectrofotmetro em um = 540 nm.

Foram realizadas diluies, quando necessrio, para a leitura da densidade ptica.

3- Resultados

Para os clculos de quantidade de massa seca da clula, aps o procedimento de secagem em cpsulas, utiliza-se da seguinte frmula:Massa seca das clulas = ([Massa da cpsula + clulas] massa cpsula)

Com esse valor, possvel calcular a concentrao da suspenso me de clulas a partir desta frmula:

Concentrao da Suspenso-Me (Csm) = Massa seca das clulas/Volume da SM

Para o restante dos clculos da curva padro, utiliza-se um valor nico de concentrao da Suspenso-Me, tirando-se a mdia dos valores com a seguinte frmula:Concentrao da Suspenso-Me (Csm) mdia = Csm/ndadosTodos os valores observados nos procedimentos experimentais e calculados neste item, como a massa das cpsulas vazias, com clulas, das clulas, as concentraes esto apresentados na tabela abaixo:

CpsulaMassa das cpsulas + clulas (g)Massa das cpsulas (g)Massa das clulas (g)Concentrao da SM (g/L)

N742,848042,81880,02925,84

2743,686343,65800,02835,66

A concentrao mdia da Suspenso-Me , portanto, 5,75 g/L. Considerando os valores de densidade ptica observados, associados absorvncia medidos a 540nm no espectrofotmetro, possvel plotar uma curva padro para a levedura junto a concentrao mdia da SM, apresentada aps a tabela. Para que os valores se acomodem no intervalo de confiana, realizaram-se diluies descritas na tabela a seguir:Conc. Final (Csm/fator de diluo)DO (Abs. a 540nm)Diluio

0,028750,0851 : 200

0,05750,1661:100

0,1150,3271 : 50

0,17250,473 : 100

0,230,6261 : 25

Nesta reta, excluiu-se o segundo ponto para melhorar os resultados do R. Pode-se associar a densidade tica concentrao atravs do coeficiente angular (a) da reta y = 2,7461x, sendo y a DO, x a concentrao e 2,7461 o coeficiente angular. Portanto, a concentrao X igual DO dividida por a.

O segundo procedimento experimental, que observa o crescimento da levedura, ocorreu em um intervalo de aproximadamente seis horas e meia e contou com a observao constante de parmetros como pH e densidade tica. Esta densidade determinada pelo espectrofotmetro possui uma relao com a concentrao da amostra analisada, levando-se em considerao a curva padro apresentada anteriormente. Logo, Xd = DO/a, sendo Xd a concentrao diluda da amostra analisada.

Para determinar as concentraes reais da amostra, desconsiderando as diluies realizadas, multiplica-se a concentrao diluda pelo fator de diluio da seguinte forma X = Xd*fdil.

Todos os valores observados durante a prtica e calculados com as frmulas descritas anteriormente esto apresentados na prxima tabela.Horrio da amostragemTempo de cultivo (h)pHDiluioDO (Abs a 540nm)Concentrao (g/L)

ABMdiaXdX

12h2506,20-0,3740,3700,3720,1360,136

13h0,586,20-0,4230,3890,4060,1480,148

14h1,586,101 : 20,3030,2980,30050,1090,218

15h2,585,881 : 40,2260,2530,23950,0870,348

16h153,835,051 : 50,3390,3280,33350,1210,605

17h054,674,721 : 100,2870,2460,26650,0970,970

18h155,834,592 : 250,3020,3210,31150,1131,412

19h6,584,541 : 250,1440,1470,14550,0531,325

Com estes dados de concentrao total da amostra e o tempo de cultivo, plota-se a seguinte curva:

Para o clculo da taxa especfica de crescimento e o tempo de gerao, lineariza-se a equao da curva exponencial de crescimento para facilitao dos clculos. Logo X = Xo*et lnX = lnXo + t, onde a taxa especfica de crescimento e, no caso, o coeficiente angular da reta e t o tempo de gerao.Com estes dados apresentados na tabela, transforma-se a concentrao, calculando o logaritmo neperiano de cada um e plota-se o grfico do logaritmo neperiano de X contra o tempo de cultivo.Tempo de cultivo (h)ln X (g/L)

0-1,995

0,58-1,910

1,58-1,523

2,58-1,055

3,83-0,502

4,67-0,030

5,830,345

6,580,281

De acordo com estes dados, a regresso linear realizada no software apresenta a equao da reta y = 0,4244x - 2,1089, com R = 0,9933, com pontos apresentados no grfico abaixo:

Eliminou-se o ltimo ponto da curva de crescimento porque este no corresponde a fase exponencial do crecimento. Com isso, tem-se que o valor da taxa especfica de crescimento (), que o coeficiente angular da reta, 0,4244h-1. Utilizando essa informao, possvel calcular o tempo de gerao (tg) da levedura com a frmula: tg = ln2/. Portanto, tg = 1,633h.

Plotou-se tambm o grfico do pH contra o tempo para observar a mudana em seu comportamento durante o crescimento celular.

4- Discusso dos resultados Ao analisarmos os primeiros resultados apresentados no item anterior, referentes curva padro da levedura, observou-se uma linearidade satisfatria na curva, com R = 0,9991, construda a partir das concentraes da suspenso-me contra a densidade tica observada..

Quanto curva de crescimento de um inculo da Saccharomyces cerevisiae, de uma forma qualitativa, o grfico apresentou muitas fases conhecidas ao crescimento das leveduras e possvel observar com certa facilidade a fase de acelerao do crescimento, a fase exponencial do crescimento e a fase de desacelerao do crescimento. Supem-se que a curva apresentaria as demais fases se a observao fosse realizada por um perodo maior de tempo.Quando se realizou a linearizao desta curva exponencial, retirou-se o ltimo ponto, aparentemente da fase estacionria de crescimento, visto que o objeto de estudo deste grfico a fase exponencial. Observou-se uma linearidade satisfatria, com R = 0,9933 e determinou-se o valor de , a taxa especfica de crescimento, como 0,4244h-1.

Com esse valor, calculou-se o tempo de gerao, que o tempo necessrio para que a concentrao celular dobre em massa por volume, determinando esse tempo em 1,633h, ou seja, 1h38min aproximadamente.

Questionrio1- Qual a finalidade de construir curvas padro e de crescimento de uma espcie microbiana?A curva padro construda com a finalidade de calcular a concentrao de uma amostra desconhecida (Suspenso-me) do microrganismo em questo e a curva de crescimento construda para determinar a taxa de crescimento () e o tempo de gerao (tg) deste mesmo microrganismo.

2- Calcule a concentrao celular do inculo empregado no experimento executado objetivando a coleta de dados usados para construir a curva de crescimento.

Para calcular a concentrao do inculo, realiza-se uma relao com a concentrao da amostra no tempo t igual a zero, onde a concentrao de X igual a concentrao de Xo, do tempo inicial.

De acordo com a tabela apresentada na pgina 7, a concentrao em t0 0,136, sendo que o volume total da amostra era de 1000mL. Se Cinculo x Vinculo = Camostra x Vamostra, sabendo-se que o volume do inculo era de 100mL, logo Cinculo = 0,136 x 1000/100 = 1,36g/L.3- A curva de crescimento resultante do trabalho corresponde a uma curva de crescimento tpica, com todas as suas fases? Justifique a sua resposta.

As fases de uma curva tpica de crescimento microbiano so:

Fase LAG Quando h pouca ou ausncia de diviso celular; Fase de acelerao do crescimento Quando observa-se o incio do crescimento celular (inclinao da curva); Fase exponencial do crescimento Incio do processo de diviso celular (perodo de crescimento ou aumento logaritmo); Fase de desacelerao do crescimento Quando observa-se que o crescimento comea a no ocorrer na mesma taxa constante; Fase estacionria quando a velocidade de crescimento se mantm estacionria;

Fase de morte celular Quando o n de clulas mortas excede o de clulas novas.

Dessa forma, a curva de crescimento obtida neste trabalho no contm a fase lag, havendo crescimento desde o incio do processo. No possvel observar as fases estacionria e de morte porque a durao da anlise foi pequena, encerrando-se antes de observ-las.4- Explique a importncia do inculo ser constitudo de clulas em fase de crescimento exponencial?

A fase de fase de crescimento exponencial importante pois sem ela no daria para construir a curva de crescimento que d subsdios para a determinao da taxa de crescimento () e do tempo de gerao (tg). Apenas nessa fase, a taxa de crescimento microbiano constante e dessa forma pode-se linearizar a equao e calcular e tg.5- O uso da curva de peso seco versus turbidez no indicada para a determinao de clulas viveis. Como poderamos construir uma curva padro que relacionasse a densidade tica concentrao de clulas viveis de um microrganismo?

Uma opo de curva padro que relacione a densidade tica com a concentrao de clulas construindo uma curva que analise a variao com o tempo de cultivo.6- Variaes, como mudana de microrganismo, alterao de equipamentos (por exemplo, espectrofotmetro) e alteraes drsticas no meio de cultivo exigem a construo de novas curvas padres. Por qu?

Porque a mudana destes parmetros pode causar algum tipo de diferena na leitura da DO o que acarretaria em erros de simulao, pois a curva seria baseada em dados que no corresponderiam aos parmetros da amostra em anlise.

7- Avallie e justifique se os mtodos para confeco da curva padro e a curva de crescimento so viveis em escala industrial.No, pois para uma escala industrial h a necessidade de que o processo seja contnuo, com variveis controlveis e fixas. Para a construo das curvas padro e de crescimento, h vrias variveis que mudam com o tempo, perdendo a reprodutibilidade do processo.

5- Concluso Os objetivos da prtica foram realizados com sucesso. Construiu-se as curvas padro e de crescimento para a Saccharomyces cerevisiae, o grfico de pH versus tempo e calculou-se o valor da taxa de crescimento (), sendo 0,4244h-1 e o tempo de gerao de 1,633h ou 1h38min.6- Referncias Bibliogrficas

1 Pelezar, M.; Reid, R.; Chan, E. C. S. Microbiologia, v. 1. Editora McGraw-Hill do Brasil, So Paulo, 1980, p. 7-13.2 Rettori, D.; Volpe, P. L. O. Microcalometria: uma tcnica aplicvel ao estudo do diauxismo da Saccharomyces cerevisiae. Quim Nova, 2000, 23, 2, 257-261.

3 McCornick, T. S. R. The Essencials of Microbiology, Research and Education association. Piscataway, 1995, p. 42-44.

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