Ministério da Educação Secretaria de Educação Profissional e Tecnológica

Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia Goiano Curso Tecnólogo em Gestão Ambiental e Agronomia

Nome dos membros da Equipe:

ANA FLÁVIA DE JESUS PINTO

DÉBORA PIVA LIMA

DIEGO DE ALMEIDA

FERNANDA CORRÊA

JADH TAINÃ COSTA AQUINO

LAYANE YASMIM BERNARDES DINIZ

RAÍSSA RODRIGUES CANEDO

TONY DE LIMA

Relatório de Aula Prática:

DIVERSIDADE MICROBIANA E DE MACRORGANISMOS EM

DIFERENTES USOS DO SOLO NA FAZENDA PEDRA BRANCA E

PALMITAL, URUTAÍ, GO.

Urutaí, 30 de ABRIL de 2013.

1. INTRODUÇÃO

O uso intensivo e inadequado das diversas áreas exploradas tem contribuído para

o declínio considerável da fertilidade natural dos solos. Esse manejo inadequado tem

contribuído para o processo de degradação da matéria orgânica, causando perdas de

algumas propriedades físicas, químicas e biológicas, acelerando a erosão e diminuindo o

potencial produtivo das culturas (CALEGARI, 2000).

A diversidade de microrganismos como indicador da qualidade do solo tem sido

bastante debatido, especialmente na última década, com o advento de técnicas de

biologia molecular que têm favorecido a avaliação dos microrganismos em amostras

ambientais (COUTINHO et al., 1999; ROSADO, 2000; TIEDJE et al., 2001). O

principal argumento a favor dessa característica ambiental é o fato da diversidade

microbiana manter-se naturalmente inalterada ao longo do ano (SMIT et al., 2001;

JOHNSON et al., 2003).

Vê-se, dessa forma, que a diversidade de microrganismos é crítica para o

funcionamento do ecossistema, porque há a necessidade da manutenção de processos

ecológicos como a decomposição da matéria orgânica, ciclagem de nutrientes,

agregação do solo e controle de patógenos dentro do ecossistema (KENNEDY, 1999).

Dessa forma, é extremamente importante a busca de métodos de avaliação da

diversidade de microrganismos no solo e também de formas de utilização desses dados

como indicadores do estado da qualidade do solo.

Fungos e bactérias de solo são onipresentes no ambiente e cumprem uma gama

de funções ecológicas importantes, em particular aqueles associados à mineralização

de nutrientes no solo ( ANDERSON & CAIRNEY, 2004 ). Apesar disto, a

compreensão da dinâmica das populações de fungos de solo e bactérias é um desafio,

em especial fungos micorrízicos arbusculares (FMAs), devido à dificuldade de cultivo

e identificação destes organismos. Estudos através de isolamentos em meios de cultivo

artificiais são difíceis de serem executados e muitas vezes fornecem resultados não

conclusivos. Entretanto este desafio está sendo vencido com o auxílio de

novas técnicas baseadas no uso de marcadores moleculares. Recentes

investigações sobre a ecologia de fungos do solo estão sendo realizadas através da

extração do material genético diretamente do solo ou de raízes colonizadas, o que tem

trazido significativo aumento na compreensão da diversidade de fungos em raízes de

plantas e/ou solo (SIQUEIRA & MOREIRA, 1999).

A fauna do solo tem um importante papel na regulação dos sistemas agrícolas e,

desde os anos 1980, vem sendo pesquisada no Brasil como indicador de

sustentabilidade do manejo dos solos tropicais. Tem importante atuação nos processos

de decomposição, mineralização e humificação de resíduos orgânicos; imobilização e

mobilização de macro e micronutrientes; fixação de nitrogênio atmosférico;

estruturação e agregação do solo e conseqüente conservação e regulação de pragas e

doenças (auto-regulação), beneficiando os sistemas de produção como um todo

(LAVELLE et al, 1997).

Alguns organismos da macrofauna, principalmente os térmitas, as formigas, as

minhocas e larvas de coleópteros, são denominados “engenheiros do ecossistema”, pois

suas atividades levam à criação de estruturas biogênicas (galerias, ninhos, câmaras e

bolotas fecais), que modificam as propriedades físicas dos solos onde vivem e a

disponibilidade de recursos para outros organismos (WOLTERS, 2000). Por meio de

suas ações mecânicas no solo, a macrofauna contribui na formação de agregados

estáveis, que podem proteger parte da matéria orgânica de uma mineralização rápida e

que constituem, também, uma reserva de nutrientes potencialmente disponível para as

plantas (LAVELLE & SPAIN, 2001; DECÄENS et al., 2003).

A macrofauna é constituída por uma complexidade de organismos que diferem

no tamanho, metabolismo, atividades e mobilidade (PASINI E BENTO, 2004), com

comprimento maior que 2 mm (SWIFT et al., 1979). Conforme Bayer e Mielniczuk

(1999), a macrofauna tem papel fundamental na fragmentação e incorporação dos

resíduos ao solo, criando assim, condições favoráveis à ação decompositora dos

microorganismos. Entretanto os benefícios da fauna edáfica são poucos conhecidos em

solos brasileiros (ALVES et al., 2006) apud Montenegro et al. (2010).

O objetivo deste trabalho é quantificar a diversidade microbiana e de

macrorganismos em diferentes usos de solo na fazenda Pedra Branca e Palmital.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido nos dias 26 de março e no dia 2 de abril, no Instituto

Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano, IF Goiano – campus Urutaí,

localizado no sudoeste goiano. As armadilhas foram instaladas na área de mata, em

pastagem e na área de pivô (cultivada).

Foram utilizadas armadilhas do tipo “Pitfall” compostas de garrafas PET com

capacidade de 600 mL cortadas na região do gargalo, de modo que o fundo da garrafa

fosse enterrado e o orifício ficasse ao nível da superfície do solo. Em cada ambiente, as

armadilhas foram marcadas com estacas posteriormente geo-referenciadas. Sobre as

armadilhas foi colocada uma proteção, essa proteção foi feita com bandejas de isopor e

palitos de churrasco, em cada extremidade da bandeja foi colocado um palito e eles

foram fincados no solo, formando uma casa para a garrafa pet. Em todas as áreas foram

colocados 5 pontos escolhidos aleatoriamente totalizando 20 amostras, 5 amostras de

cada grupo.

Foram coletadas aproximadamente 300 gramas de solo, em uma profundidade

máxima de 20 cm, utilizando enxadão para a retirada das amostras e colocadas em sacos

plásticos e levadas ao Laboratório de Microbiologia. Onde foi realizada a diluição em

série. Vale ressaltar que a coleta foi realizada logo após uma chuva.

Cada armadilha continha uma mistura de 100 mL de solução etanol e

detergente. Após sete dias a campo as armadilhas foram coletadas e encaminhadas para

o laboratório de microbiologia para posterior identificação da macrofauna edáfica.

Para a realização desse método, tomou-se 1 grama da amostra composta, pesada

em balança de precisão. Em seguida, essa amostra foi levada a câmara de fluxo laminar,

onde se realizou o restante dos procedimentos. Esta amostra foi transferida para um tubo

de ensaio, com o auxílio de pinça, contendo 9 mL de solução salina esterilizada,

tornando-se um solução diluída com concentração 10-1

.

Logo em seguida foi preparada a solução de 10-2

, transferindo com uma pipeta

estéril, 1 mL da concentração 10-1

, que foi agitada por aproximadamente 30 segundo em

agitador, para outro tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina.

Foram realizadas as diluições para as concentrações 10-3

, 10-4

e 10-5

, seguindo o

mesmo procedimento realizado anteriormente, esse procedimento pode ser melhor

compreendido de acordo com a Figura 1. Para a determinação da densidade microbiana

as concentrações de 10-1

e 10-2

foram descartadas.

Figura 1: Sequência de atividades para realização da diluição em série.

Logo após, de ser feitas as diluições foi feita a semeadura, com a ponteira, de

1μL das mesmas em placas de Petri contendo meio de cultura BDA, com duas

repetições para cada concentração. As placas foram vedadas e etiquetas e levadas à

estufa de crescimento biológico e deixadas por 48 horas à 35 oC.

Posteriormente, foi realizada a contagem da Unidade Formadora de Colônias

(ufc), de forma visual, dividindo a placa em quadrantes. Na contagem foi levado em

consideração o número total de unidades formadoras de colônias. Em seguida foi

realizado o cálculo para determinação da densidade microbiana. O cálculo foi feito da

seguinte maneira: como o volume na placa de Petri era de 1 μL, foi necessário encontrar

o número de ufc/mL através de regra de três simples, este valor foi multiplicado pelo

índice de diluição da amostra.

O valor de ufc encontrado nas placas de Petri foram submetidas à análise

estatística utilizando o software SAS. Foi realizado o teste paramétrico (ANOVA) e o

teste de Tukey. E quando submetidas à análise de significância as médias necessitaram

ser transformadas para melhorar a confiabilidade da análise.

O material coletado foi lavado em peneira e com o auxílio de pinças, foi feita a

contagem e identificação da macrofauna, os organismos foram então, colocados em um

vidro contendo álcool.

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância usando o software

SAS e quando significativos (p<0,05), baseado nos valores do coeficiente de variação

foi realizado a comparação entre as médias por meio da aplicação do teste do Tukey. A

diversidade foi avaliada pela Riqueza de espécies e pelos índices de Shannon, Fisher e

Simpson utilizando o software SPADE.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A comparação da diversidade dos indivíduos da macrofauna presente nos demais

ambientes: área de mata, pastagens e área do pivô (cultivada) demonstrou uma grande

variação de grupos faunísticos, onde foram coletados 1613 indivíduos, pertencentes a

vários grupos taxonômicos. Observou-se um maior número de indivíduos da ordem dos

Coleoptera (besouros, vagalume), Hymenoptera (formiga, mariposas) e Orthoptera

(grilo, gafanhoto), o grupo de menor representante foi Hylidae (Perereca) onde se

encontrou 1 indivíduo.

Por causa da grande área rizosférica e grande quantidade de matéria orgânica

fornecida era de ser esperar que a floresta apresentasse um grande de microrganismos.

Mas a área de culturas (pivô) apresentou se um maior número de ufc’s (Tabela 1).

Deve-se A diversidade vegetal, umidade, aeração e presença de uma vasta rizosfera

onde os microrganismos se desenvolvem e contribuem para um bom solo onde se

proporciona um substrato ideal para um crescimento de árvores, gramíneas.

Média do Número de Unidades Formadoras de Colônias por mL de solução do

solo (ufc/mL) em relação às diluições e as áreas.

Tabela 1. Média do número de Unidades Formadoras de Colônias por mL de solução

de solo (ufc/mL) em relação às diluições.

ÁREA/DILUIÇÃO 10-3

10-4

10-5

Pastagem 1 1,78x105 2,95x10

6 1,2x10

7

Floresta 9,1x105 2,1x10

6 5x10

6

Pastagem 2 1,23x106 2,2x10

6 1x10

6

Culturas 3,6x106 6,75x10

6 1,2x10

7

Analisando as médias de ufc por cada mL de solução do solo a densidade

microbiana nos solos de culturas é superior. A pequena diferença entre as médias em solo

de cultivo e pastagem pode ser explicada pelo uso contínuo de fertilizantes para o plantio e

cobertura. Estes fertilizantes possibilitam um maior número de nutrientes disponível as

plantas, melhorando, então, a rizosfera. Além disso, estes fertilizantes não deixam de liberar

nutrientes diretamente para o desenvolvimento de microrganismos.

Estatisticamente, pelo teste F (ANOVA) a análise de variância é um

procedimento utilizado para comparar três ou mais tratamentos. Existem muitas

variações da ANOVA devido aos diferentes tipos de experimentos que podem ser

realizados. A hipótese da nulidade H0 foi rejeitada tanto a 1% quando a 5 % sendo o

valor F calculado maior que o valor F tabelado (Tabela 2), as médias se diferem entre

elas, portanto os tratamentos são diferentes.

Tabela2. Teste paramétrico ANOVA das médias do número de ufc

transformadas encontradas nas diluições.

FATORES DE VARIAÇÃO VALOR F

Riqueza de Espécies 14,77**< O, OOO1

Índice de Shanon 11,73**<O, OOO1

Índice de Simpson 9,97** <O, OOO1

Índice de Fisher 12,05** <O, OOO1

A diversidade biológica foi avaliada através da aplicação dos índices de

Shannon, Simpson e de Fisher, que mostram o domínio dos grupos faunísticos nas áreas

estudadas. O índice de Shannon mede o grau de incerteza em prever a que espécie

pertencerá um indivíduo escolhido ao acaso. Quanto menor o valor do índice de

Shannon, menor o grau de incerteza e, portanto a diversidade da amostra é baixa. A

diversidade tende a ser mais alta quanto maior o valor do índice.

Um parâmetro utilizado é a riqueza de espécies, que diz pouco a respeito da

organização da comunidade, mas serve com indicativo de diversidade de organismos

onde houve maior número na área da mata quando comparada com a área de pivô que

apresentou menor número de riqueza sendo o ambiente mais desequilibrado das áreas

pesquisadas.

Figura 2. Médias dos valores de riqueza de espécies nos diferentes usos do solo

(valores seguidos de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a P~0,05).

O teste de Riqueza de Espécies (Figura 2), a área de Floresta apresentou maior

índice de 25.3, enquanto a pastagem 2 (Fazenda Palmital), culturas e pastagem 1 (Pedra

Branca) apresentaram os seguintes valores 22.5; 10.2 e 4.1 respectivamente. Floresta e

Pastagem 2 foi classificado “a” por apresentar um grande número de organismos

naquele espaço, onde pode ser considerados estatisticamente iguais, já Culturas e

Pastagem 1 foi classificado “b” por ressaltar diferença de organismos no ambiente

assim sendo diferentes da Floresta e Pastagem 2 .

Figura 3. Médias dos valores do índice de Shannon nos diferentes usos do solo (valores

seguidos de mesma letra não diferem entre si ao Teste Tukey a P~0,05).

No índice de Shannon (Figura 3) é observada a diversidade de espécies, onde se

leva a riqueza e a equabilidade em consideração. A floresta, pastagem 2 e cultura (pivô)

apresentaram os valores respectivamente maiores do que a Pastagem1 que se diferencia

por ter um menor índice.

Figura 4. Médias dos valores do índice de Simpson nos diferentes usos do solo (valores

seguidos de mesma letra não diferem entre si ao Teste Tukey a P~0,05).

O Índice de Simpson (Figura 4) também leva em consideração a riqueza e a

igualdade como nos demais gráficos. Neste índice, a pastagem 1 obteve maior índice ,

pois possui um número maior de indivíduos, pois neste ambiente pode ser de um solo

estável de bom desenvolvimento aos organismos. Diferenciando dos demais índices

pastagem 2, floresta e culturas que estão menor mais são equivalentes.

Figura 5. Médias dos valores do índice de Fisher nos diferentes usos do solo (valores

seguidos de mesma letra não diferem entre si ao Teste Tukey a P~0,05).

No Índice de Fisher (Figura 5) é analisada a relação do número de espécies

representadas por apenas 1 indivíduo na comunidade. Novamente a área de floresta

apresentou se uma maior média se diferenciando dos demais tratamentos que

apresentaram médias como a pastagem 2, a área de cultura e a pastagem 1. Isso pode

ser explicado pela grande diversidade que a área de floresta apresenta, pois ela apresenta

uma vegetação mais diversificada, fornecendo maior matéria orgânica e

conseqüentemente um maior número de organismos interagindo no ambiente.

4. CONCLUSÃO

A preservação de áreas florestais contribui para a existência de uma elevada

densidade microbiana no solo, devido a fatores favoráveis ao desenvolvimento desse

tipo de organismos. Em áreas que sofreram ações antrópicas essa densidade é inferior,

já que houve interferência nas propriedades físicas, químicas e na diversidade vegetal

do ambiente, cujas estão interligadas ao crescimento de microrganismos no solo.

As áreas em que foi feito a análise de ambientes diferentes como floresta,

pastagem 1, pastagem 2 e culturas era de se esperar que a área de floresta apresentasse

média superior de ufc e organismos comparadas as demais. Isso se deve a grande

biodiversidade das áreas preservadas, que pode ser explicado pela maior quantidade de

matéria orgânica oriunda da diversidade vegetal, umidade, aeração e presença de uma

vasta rizosfera, proporcionando um substrato ideal para o desenvolvimento de

microrganismos.

Mas isso não ocorreu, a área de culturas apresentou um maior número de ufc e

organismos, talvez haja um fator de desequilíbrio onde tal espécie possa estar

predominando no momento, por falta de competição ou agentes que a controla, a

contagem do número de ufc também pode ter sido feita de maneira errônea em qualquer

área estudada. Outro fator que pode ter interferido no número de organismos

encontrados na área de pivô foi o fato de terem utilizado sacolas plásticas de cor

amarela o que chama atenção dos organismos.

Uma área nativa constitui um sistema em equilíbrio e sofre pouco influências

antrópicas como os demais tratamentos e o não revolvimento do solo e a permanência

dos resíduos possibilitam melhor desenvolvimento dos microrganismos, principalmente

devido ao aumento dos teores de matéria orgânica nas camadas mais superficiais. Nas

áreas de cultura e pastagem há o uso de fertilizantes para plantio, o que permite um

maior número de nutrientes disponível para as plantas. Também se percebe que o tipo

de manejo, seja ele um plantio direto com milho ou uma pastagem não interfere na

densidade microbiana entre os solos desses ambientes.

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