reginaldo franklin efeitos da leucoantocianidina …

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

REGINALDO FRANKLIN

EFEITOS DA LEUCOANTOCIANIDINA NO TECIDO HEPÁTICO DE COELHOS

ALBINOS (Oryctolagus cuniculus) SUBMETIDOS À ESTEATOSE HEPÁTICA NÃO

ALCOÓLICA EXPERIMENTAL

Niterói, RJ

2018

REGINALDO FRANKLIN




Dissertação submetida ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense como parte

dos requisitos necessários à obtenção do Grau

de Mestre. Área de Concentração: Ciências

Médicas.

ORIENTADOR: PROF. DR. MARCIO ANTONIO BABINSKI

COORIENTADOR: PROF. DR. JORGE HENRIQUE MARTINS MANAIA

Niterói, RJ

2018

REGINALDO FRANKLIN




Dissertação submetida ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense como parte

dos requisitos necessários à obtenção do Grau

de Mestre. Área de Concentração: Ciências

Médicas.

Aprovado em ___ de ___________________ de ________.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________________________

Prof. Dr. Vinicius Schott Gameiro

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF

_____________________________________________________________________

Prof. Dr. Marcelo Abidu-Figueiredo

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO - UFRRJ

____________________________________________________________________

Prof. Dr. Diogo Benchimol de Souza

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO - UERJ

Niterói

2018

Dedico este trabalho aos Meus pais,

Jorcelino e Marilene, todo o meu

reconhecimento pelo esforço desmedido com

sacrifício de seus próprios sonhos em favor

dos meus. Aos meus filhos Gabriel Fernandes

Franklin, André Philip Franklin e in

memoriam da minha preciosinha Ana Raquel

Beltre Franklin, as razões do meu entusiasmo,

motivação e alegria de continuar nessa carreira

de docência. Aos meus mestres por todas as

oportunidades em aprender com suas

experiências.

AGRADECIMENTOS

Agradecer, certamente, é o momento mais difícil, por falta de palavras que

expressem a dimensão da gratidão para com aqueles que me fizeram mais experiente e

consciente, neste campo apaixonado da pesquisa médica, e para com aqueles que tão somente

protegeram os meus passos e compreenderam a minha ausência nos momentos de dedicação à

confecção desta dissertação.

À minha família, em especial à minha mãe, Marilene Franklin Pereira e saudoso pai,

Jorcelino Ribeiro Pereira.

Aos meus amados filhos Gabriel Fernandes Franklin e André Philip Franklin. À

minha filha (in memorian) Ana Raquel Beltre Franklin.

À Dra Raquel Libanesa Rosário Beltre pelo companheirismo e compreensão.

Aos meus amigos de jornada dos cursos de mestrado e doutorado da Universidade

Federal Fluminense em especial Lucas e Albino.

Ao meu orientador prof. Dr. Marcio Babinski pela paciência, apoio e prestigiosa

competência e ao coorientador Dr. Jorge Henrique Martins Manaia.

Aos professores do estimado curso de pós-graduação em ciências médicas da UFF,

coordenação e secretárias.

Aos professores Dr. Celio Fernando Rodrigues e Dr. Monte Bispo pela prestimosa

colaboração em doar os tecidos experimentados.

Aos meus alunos de Medicina Legal do curso de medicina da Unigranrio, da

Universidade Estácio de Sá, dos cursos de Direito e Farmácia do Centro Universitário

Anhanguera, seus olhares atentos foram não só fontes de entusiasmo, mas, sobretudo, me

fizeram crer que o momento mais precioso de aprender é quando se está ensinando.

Com grande satisfação, manifesto com fidalguia e profunda gratidão a todos,

reiterando meu respeito e admiração.

“Todas as vezes que cometi erros crassos, ou percebi que meu

trabalho foi imperfeito, ou quando fui criticado com desprezo, repeti

dezenas de vezes para mim mesmo que trabalhei no meu máximo e da

melhor maneira que pude, pois nenhum homem pode fazer mais que

isso”.

Charles Darwin (1809-1882)

RESUMO

O objetivo foi avaliar as alterações na densidade volumétrica (Vv) do tecido hepático de

coelhos submetidos à dieta hiperlipidêmica tratados com leucoantocianidina. Trinta coelhos

albinos machos da raça Nova Zelândia (em média 7 meses de idade e 3 kg de peso) foram

distribuídos aleatoriamente em três grupos com dez animais, a saber: Grupo Controle (G1)

cujos animais receberam ração Purina®; Grupo Hiperlipidêmico (G2) ração Purina® + 1,5 g

de colesterol + 10 ml de gema de ovo de galinha (ovo Carnaúba® tipo grande diluído e em

100 ml) dividido em duas ingestões VO ao dia e o Grupo Tratado (G3) que além dos 10 ml de

gema, ingeriu 50 mg/kg/peso de leucoantocianidina de uva, bem como ração. Os três grupos

receberam água ad libitum. A dieta complementar nos grupos G2 e G3 foram preparadas e

administradas diariamente, durante 99 dias. O sangue foi coletado para verificar os níveis

séricos e após 99 dias de experimento, os animais foram submetidos à eutanásia para exérese

do fígado e obtenção de fragmentos. Para a eutanásia, os animais foram previamente

anestesiados com cloridrato de Ketamina®, 9 mg/Kg (IM), associado ao cloridrato de

Xilazina (Rompun®), 30 mg (IM). Após o sacrifício, os espécimes foram fixados em

formalina 10%, incluídos em parafina e processados histologicamente. Os elementos

histológicos foram avaliados pela microscopia de luz usando a técnica de coloração de

tricrômio de Masson. Estudos morfométricos foram realizados através da estereologia. Os

resultados (% média±SD) representam a expressão dos achados microscópicos de 25 campos

histológicos aleatórios para cada espécime de cada coelho. Os resultados foram analisados

pelos testes estatísticos ANOVA, TUKEY, KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS. No

presente modelo experimental em coelhos, a leucoantocianidina de uva não modifica, os

níveis de colesterol total, LDL, VLDL, HDL, triglicerídeos e lipídeos totais de forma

significante no G3 quando comparado com o G1 e G2. O Vv (%) dos hepatócitos nos grupos

G1, G2 e G3 foram respectivamente: 82,7±4,2, 37,4±13,1 e 72,4±7,8 (p > 0,0001). Nossos

resultados mostram que os hepatócitos dos coelhos do G2 sofreram diminuição significativa

de 54.5% em relação ao G1, enquanto que o G3 apresenta redução de 12.1%. Não houve

diferença estatisticamente significativa entre os grupos G2 e G3. O presente estudo revela que

o consumo de leucoantocianidina tem efeito protetor para o tecido hepático na esteatose

hepática não alcoólica.

Palavras-chave: Leucoantocianidina. Esteatose não alcoólica. Estereologia.

ABSTRACT

This study aims to evaluate the alterations in the volumetric density from the liver of rabbits

submitted to a hypercholesterolemic diet and treated with grape leucoanthocyanidin. 30 male

albino rabbits (New Zealand) (±7 months old, mean weight of ±3 kg) were randomly

distributed in three groups with ten animals each: the control group (G1), in which the

animals received a regular diet (Purina®); the hypercholesterolemic group (G2), in which the

rabbits received regular diet associated with 1.5 g of cholesterol and 10 ml of chicken egg

yolk (Carnaúba®) divided in two oral ingestions daily; and the treated group (G3), which

received the same diet of the G2 associated with 50 mg/kg of grape leucoanthocyanidin. All

three groups received water and food ad libitum. The complementary diet of the G2 and G3

was prepared and administered daily during 99 days. Blood samples were collected

throughout the study as well. On the last day of the experiment (100), the animals were

euthanized with 9 mg/Kg of ketamine and 30 mg of xilazine (Rompun®), both administered

by intramuscular injection. After euthanasia, their liver was excised and fixated in a 10%

formalin solution. Their macroscopical aspects were observed and compared, and histological

samples were also obtained. The liver tissue was fixated and routine histological preparations

were performed. The Masson’s trichrome stain was used. Sterelogical analysis was performed

and the results are expressed as %mean ± standard deviation and were determined by the

analysis of 25 random histological fields for each liver. Statistical analysis was performed by

the ANOVA, TUKEY, Kruskal-Wallis and the DUNNS post-test. It was observed that the

grape leucoanthocyanidin was not able to reduce the LDL, VLDL, HDL triglycerides and

total lipid rates, as there was no statistical significance between groups (G3 vs G1 and G2).

Despite that, it was observed that the grape leucoanthocyanidin had a positive effect on the

liver tissue. The volumetric density of the hepatocytes was 82.7±4.2, 37.4±13.1 and 72.4±7.8

on the G1, G2 and G3, respectively (p < 0.0001). Furthermore, the study conducted herein

showed that the hepatocytes from the G2 had a significant reduction of 52.5%, while the G3

had only a reduction of 12.2%, in comparison to the G1. There was no statistical significant

difference between the G2 and G3. This study concludes that grape leucoanthocyanidin had a

protective effect on the liver in cases of non-alcoholic fatty liver disease in rabbits.

Keyword: Leucoantocianidine. Non-alcoholic fatty liver disease. Stereology.

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Composição da dieta (Purina®) utilizada no presente experimento, p. 26

TABELA 2 – Composição da gema de ovo (100 g) utilizada no presente experimento, p. 27

TABELA 3 – Média e desvio padrão do CT, conforme o dia e grupo, p. 35

TABELA 4 – Média e desvio padrão do LDL, conforme o dia e grupo, p. 37

TABELA 5 – Média e desvio padrão do VLDL, conforme o dia e grupo, p. 39

TABELA 6 – Média e desvio padrão do HDL, conforme o dia e grupo, p. 41

TABELA 7 – Média e desvio padrão do nível de triglicerídeos (TGC), conforme o dia e

grupo, p. 43

TABELA 8 – Média e desvio padrão do nível de lipídeos totais (LPT), conforme o dia e

grupo, p. 45

TABELA 9 – Média e desvio padrão do nível de TGP e TGO (mg/dL), conforme o dia e

grupo, p. 46

TABELA 10 – Média e desvio padrão da densidade volumétrica no tecido hepático em G1,

G2 e G3, p. 53

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DE COELHO, p. 21

Figura 2 – ADMINISTRAÇÃO DA GEMA DE OVO, p. 28

Figura 3 – SISTEMA-TESTE M42, p. 31

Figura 4 – XANTOMA, p. 32

Figura 5 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO XANTOMA, p. 33

Gráfico 1 – EVOLUÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS DURANTE O EXPERIMENTO, p. 34

Gráfico 2 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE COLESTEROL TOTAL DOS ANIMAIS

DURANTE O EXPERIMENTO, p. 35

Gráfico 3 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LDL DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO, p. 37

Gráfico 4 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE VLDL DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO, p. 39

Gráfico 5 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO, p. 40

Gráfico 6 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL E LDL DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO, p. 41

Gráfico 7 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TRIGLICERÍDEOS DOS ANIMAIS


Gráfico 8 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LIPÍDEOS TOTAIS DOS ANIMAIS


Gráfico 9 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TGP E TGO DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO, p. 46

Figura 6 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 1, p.

47

Figura 7 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 1

(MASSON), p. 48

Figura 8 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 2, p.

49


(MASSON), p. 50

Figura 10 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 3,

p. 51


(MASSON), p. 52

Gráfico 10 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DOS HEPATÓCITOS, p. 53

Gráfico 11 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DA ESTEATOSE HEPÁTICA, p. 54


(H&E), p. 55

Figura 13 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 2, p.

56


(H&E), p. 57

LISTA DE ABREVIATURAS

CT – Colesterol total

D0 – Início do experimento

DHGNA – Doença hepática gordurosa não-alcoólica

EHNA – Esteatose hepática não-alcoólica

G1 – GRUPO 1 (Controle, 200g de ração)

G2 – GRUPO 2 (Hiperlipidêmico, 200g de ração + 10 mL de gema de ovo + 1,5 g de

colesterol)

G3 – GRUPO 3 (Tratado, 200g de ração, + 10 mL de gema de ovo + 1,5 g de colesterol +

leucoantocianidina de uva)

HDL – Lipoproteína de alta densidade

IV – Intravenosa

IM – Intramuscular

LPT – Lipídeos totais

LDL – Lipoproteína de baixa densidade

NS – Não significativo

SM – Síndrome metabólica

TGC – Triglicerídeos

TGO – Transaminase glutâmica oxalacética

TGP – Transaminase glutâmico pirúvica

VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade

Vv – Densidade volumétrica

SUMÁRIO

1 JUSTIFICATIVA, p. 16

2 OBJETIVOS, p. 18

2.1 OBJETIVOS GERAIS, p. 18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 18

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p. 19

3.1 MODELO EXPERIMENTAL DE HIPERLIPIDEMIA EM COELHOS, p. 19

3.2 ANATOMIA, FISIOLOGIA E METABOLISMO HEPÁTICO DE COELHOS, p. 20

3.3 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA, p. 22

3.4 LEUCOANTOCIANIDINA, p. 23

4 MATERIAIS E MÉTODOS, p. 25

4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS, p. 25

4.2 AMOSTRA, p. 25

4.3 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DA DIETA HIPERLIPIDÊMICA, p. 27

4.4 DOSAGEM BIOQUÍMICA, p. 28

4.5 EUTANÁSIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO, p. 29

4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA, p. 30

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 31

5 RESULTADOS, p. 32

5.1 ALTERAÇÕES PATOLÓGICAS NA PELE, p. 32

5.2 VALORES BIOQUÍMICOS E PESO DOS ANIMAIS, p. 33

5.2.1 Peso dos animais, p. 33

5.2.2 Colesterol Total, p. 34

5.2.3 Colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade), p. 36

5.2.4 Colesterol VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade), p. 38

5.2.5 Colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade), p. 40

5.2.6 Evolução do LDL e HDL, p. 41

5.2.7 Triglicerídeos, p. 42

5.2.8 Lipídeos Totais, p. 43

5.2.9 TGP e TGO, p. 45

5.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA, p. 47

6 DISCUSSÃO, p. 58

7 CONCLUSÕES, p. 64

8 OBRAS CITADAS, p. 65

9 ANEXOS, p. 73

9.1 PROTOCOLO DE COLABORAÇÃO CIENTÍFICA, p. 73

9.2 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS, p. 74

9.3 PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFAL, p. 75

9.4 COMUNICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFF, p. 76

9.5 ESCORE DE ATIVIDADE DA ESTEATOSE HEPÁTICA, p. 77

16

1 JUSTIFICATIVA

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), também conhecida como

esteatose hepática não alcoólica (EHNA), é uma doença caracterizada pela infiltração e

subsequente depósito de lipídeos nos hepatócitos. Essa distribuição pode ser difusa ou

focal no tecido hepático. Possui similaridades com a doença hepática alcoólica, apesar

de ocorrer em indivíduos sem ingesta significativa de álcool (Augustin et al., 2017;

Ferramosca et al., 2017; Qiu et al., 2013)

A EHNA é uma doença comum, e estima-se que esta afeta em torno de 27% da

população geral. Está em geral associada com obesidade, diabetes mellitus (tipo 2) e

dislipidemias, sendo estes também fatores de risco para o desenvolvimento da DHGNA

(Khoshbaten et al., 2010).

Alguns autores acreditam que a EHNA deve ser incluída como critério durante o

diagnóstico da síndrome metabólica (Mantovani & Targher, 2017; Massart et al., 2017;

Qiu et al. , 2013).

Não existe tratamento farmacológico aprovado para a EHNA e os pacientes são

orientados a mudarem hábitos de dieta e exercício, além do tratamento das

comorbidades. Devido a isto, diversos estudos objetivam a utilização de substâncias

naturais ou farmacológicas para o tratamento desta doença, infelizmente, sem resultados

positivos ou significativos (Abdelmalek et al., 2009; Augustin et al. , 2017; Ferramosca

et al. , 2017; Machado et al., 2016; Sanyal et al., 2010).

Em contrapartida, os efeitos benéficos do vinho, em doses diárias são bem

difundidos nos meios de comunicação. Ampla também é a divulgação dos seus efeitos

benéficos e protetores contra doenças cardiovasculares. Esses efeitos pesquisados e

propagados são hoje sabiamente conhecidos devidos aos princípios ativos da Vitis

vinifera, dentre eles a leucoantocianidina de uva (pó liofilizado) que é bastante

difundido e comercializado (Beidokhti & Jager, 2017; Fernandes et al., 2017; Howes &

Simmonds, 2014; Ivey et al., 2017; Tangney & Rasmussen, 2013).

Muito se tem pesquisado sobre a relação entre o consumo do vinho e suas

frações flavonoides (antocianidinas, proantocianidinas e leucoantocianidinas). Porém os

efeitos benéficos sobre o tecido hepático não são tão claros, já que o efeito benéfico do

17

vinho, do extrato bruto de antioxidante, sejam flavonoides ou outros, dependem dos

seguintes fatores: se o experimento é in vitro ou in vivo, a espécie de animal utilizado,

modelo experimental de indução da patologia, idade dos animais, origem do extrato e

sua via de administração, bem como o tempo de duração do experimento (Fernandes et

al. , 2017; Pizzino et al., 2017; van der Worp et al., 2010).

Após extensa pesquisa na base de dados Scielo e Medline (National Library of

Medicine), não foram encontrados trabalhos experimentais sobre a densidade

volumétrica (Vv) do tecido hepático esteatótico não alcoólico em coelhos submetidos ao

tratamento com a leucoantocianidina de uva, o que justifica a produção deste presente

trabalho.

18

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Verificar o efeito protetor da leucoantocianidina ao avaliar as alterações

morfológicas e morfométricas do tecido hepático de coelhos submetidos à dieta

hiperlipidêmica e tratados com leucoantocianidina.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar através de métodos estereológicos a densidade volumétrica (Vv) dos

hepatócitos de coelhos submetidos a dieta hiperlipidêmica e tratados com

leucoantocianidina.

Verificar os efeitos da leucoantocianidina de uva sobre o: colesterol total, LDL,

HDL, VLDL, Lipídios totais, triglicerídeos, TGP e TGO.

19

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 MODELO EXPERIMENTAL DE HIPERLIPIDEMIA EM COELHOS

O uso de animais em pesquisas biomédicas tem sido recomendado para

aperfeiçoar e validar procedimentos já existentes, desenvolvimento de novos materiais e

compreensão dos diferentes processos fisiológicos e patológicos porque não há modelos

in vitro capazes de imitar completamente a complexidade do organismo humano

(Fagundes & Taha, 2004). Os modelos animais permitem controlar numerosas variáveis

que normalmente não podem ser obtidas em estudos com seres humanos (Bozkurt &

Pekiner, 2006; Traish et al., 2005).

Os roedores e coelhos são muito utilizados para mimetizar doenças humanas e

melhorar o entendimento das causas e da progressão das doenças, e para testar

intervenções terapêuticas potenciais (Torres, 2012).

A dieta moderna, especialmente a dos países Ocidentais, é rica em carboidratos,

como frutose e sacarose, bem como em gordura. O aumento da ingestão de calorias está

associado com muitas complicações induzidas por dieta incluindo a síndrome

metabólica (SM), doenças cardiovasculares e DHGNA (Massiera et al., 2010; Sulaiman

et al., 2017; Torres, 2012).

A combinação de carboidratos e gorduras nos componentes da dieta tem sido

usada em roedores para mimetizar os sinais e sintomas da SM em humanos (Abidu-

Figueiredo et al., 2011; Fonseca Jr et al., 2016; Qiu et al. , 2013; Torres, 2012).

A padronização dos ingredientes utilizados no que se refere à quantidade e

qualidade dos nutrientes foi possível pela publicação de um documento que estabeleceu

o requerimento de macronutrientes e micronutrientes para roedores nas diferentes fases

da vida (Reeves et al., 1993). Desta forma, dietas ricas em lipídios têm sido usadas para

induzir obesidade, dislipidemia e resistência à insulina em roedores (Abidu-Figueiredo

et al. , 2011; Fonseca Jr et al. , 2016; Torres, 2012). Em camundongos, a dieta

hiperlipídica aumenta a pressão arterial sistólica e induz a disfunção endotelial

(Kobayasi et al., 2010).

20

Diferentes tipos de dietas hiperlipídicas têm sido usados com frações de gordura

variando entre 20% a 60% de energia, assim como a origem da gordura, se animal,

como banha de porco e sebo, ou óleos de plantas, como óleo de oliva ou de coco

(Buettner et al., 2006). Roedores alimentados cronicamente com dieta hiperlipídica têm

a massa corporal aumentada (Lei et al., 2007; Qiu et al. , 2013; Sutherland et al., 2008;

Torres, 2012), desenvolvimento de hiperglicemia e sintomas de SM (Abidu-Figueiredo

et al. , 2011; Sutherland et al. , 2008; Sweazea et al., 2010).

Os coelhos utilizados são da classe Mammalia, pertencente à família Leporidae,

ordem Lagomorpha, em geral da espécie Oryctolagus cuniculus. A variedade Albino é

de difícil criação, especialmente a raça Nova Zelândia, que chega a pesar até ±5 kg

(Mapara et al., 2012; Mitchell-Jones et al., 1999).

É um bom modelo experimental para estudo dos efeitos sistêmicos de dietas

hiperlipídicas e aterogênicas, pois o metabolismo do coelho é lento e a dieta gordurosa

em excesso não queimada é armazenada como gordura do corpo, trazendo mais

similaridades com o metabolismo humano no que tange os lipídeos (Fan et al., 2017).

Drogas podem ser administradas por via oral (VO), por meio de sonda

orogástrica ou na água ingerida. Injeções intravenosas (IV) podem ser feitas com muita

facilidade na veia marginal da orelha, pela qual também se pode colher amostras de

sangue para diferentes análises (Stahlke Jr et al., 2004). Tanto a artéria quanto a veia

auricular são excelentes vias medicamentosas, anestésicas e de punção em relação a

outros vasos (Quesenberry & Carpenter, 2012).

3.2 ANATOMIA, FISIOLOGIA E METABOLISMO HEPÁTICO DE COELHOS

O fígado do coelho albino (Figura 1) tem em sua topografia diversas

similaridades com o de humanos: está posicionado caudalmente ao diafragma, e é

dividido em duas grandes metades (lobo direito e esquerdo). Porém, o fígado dessa

espécie é subdividido em um número maior de lobos (lateral e medial esquerdo, lateral e

medial direito, além do logo quadrado e caudado), totalizando ao todo 6 lobos distintos

(Quesenberry & Carpenter, 2012).

21

Figura 1 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DE COELHO

Ilustração mostrando a topografia do fígado do coelho adulto. Fonte: Varga (2013).

A fisiologia hepática do coelho é mais similar a de humano do que os ratos (Fan

et al. , 2017). Isso se deve por inúmeros fatores, como por exemplo: o uso do LDL

como fonte energética em maior quantidade, moléculas de HDL mais heterogêneas, o

papel vital do fígado no armazenamento de colesterol, pouca secreção de bile e no geral

melhores respostas em relação às dietas hiperlipídicas do que ratos (Fan et al. , 2017).

O fígado tem papel de secretar bile e esta por sua vez tem a função de

emulsificar lipídeos. A absorção de lipídeos e triglicerídeos é passiva, ou seja, não

consume energia. Após chegarem à corrente sanguínea, as moléculas já reduzidas em

tamanho circulam como monoglicerídeos de cadeias longas e médias, sendo sintetizados

e cobertos por uma camada lipoproteica – formando quilomícrons, que entram na

circulação linfática (Blas & Wiseman, 2010; Fan et al. , 2017).

22

O coelho é bastante suscetível a dietas ricas em lipídeos, e estas possuem

impacto não somente no sistema gastrointestinal e vascular, mas também são

responsáveis por modificações no leite gerado pelas lactantes (Blas & Wiseman, 2010;

Quesenberry & Carpenter, 2012).

3.3 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma condição clínico-

patológica caracterizada pela infiltração e acúmulo de lipídeos no interior dos

hepatócitos com distribuição que pode ser difusa ou focal de gordura no parênquima

hepático (Augustin et al. , 2017; Ferramosca et al. , 2017; Qiu et al. , 2013). O quadro

patológico lembra a lesão induzida por álcool, mas ocorre em indivíduos sem ingestão

etílica significativa (Augustin et al. , 2017; Ferramosca et al. , 2017).

A DHGNA apresenta como principais fatores de risco a obesidade, diabetes

mellitus e dislipidemia. A resistência à insulina parece desempenhar um papel

fundamental na patogênese destas condições, e por isso tem sido sugerido que a

DHGNA (esteatose e esteato-hepatite) seja considerada como mais um critério no

diagnóstico da síndrome metabólica (Mantovani & Targher, 2017; Qiu et al. , 2013;

Tarantino & Finelli, 2013).

Devido ao fato de ser associada com diabetes, obesidade e resistência a insulina,

sua prevalência está aumentando na população de todas as faixas etárias, em especial de

países industrializados (Farrell et al., 2005; Tirosh, 2015). Estima-se que sua

prevalência aumente de forma considerável nos indivíduos portadores das condições

supracitadas (Farrell et al. , 2005).

As estimativas atuais da DHGNA giram em torno de 17% a 33% da população

mundial, e a esteatohepatite não alcoólica – uma de suas complicações mais comuns – é

prevalente em torno de 5,7% a 16,5% da população (Farrell et al. , 2005; Tirosh, 2015).

Algumas alterações contribuem para o desenvolvimento de DHGNA que estão

relacionadas à síndrome metabólica. São elas: anormalidades no metabolismo dos

lipídeos, que promove maior oferta de ácidos graxos livres no fígado; aumento da

síntese endógena de ácidos graxos, intensificação da β-oxidação mitocondrial e maior

23

liberação de ácidos graxos dos hepatócitos, que aumentam a resistência à insulina;

produção anormal de citocinas como interleucina 8 (IL-8), interleucina 6 (IL-6) e fator

de necrose tumoral alfa (TNF-α); estresse oxidativo; inibição do peroxisome proliferator

activated receptor (PPAR) e alterações no metabolismo do ferro (Cruz et al., 2005;

Kassi et al., 2011; Kaur, 2014).

O diagnóstico de pacientes com DHGNA é sugerido quando há hepatomegalia

assintomática (40% a 100% dos casos) ou associada ao desconforto epigástrico ou no

hipocôndrio direito. A histologia hepática demonstra esteatose, alterações celulares

(balonização e/ou necrose), inflamação com ou sem fibrose e corpúsculos de Mallory.

Os métodos de imagem contribuem para o reconhecimento de esteatose (Chalasani &

Szabo, 2016; Cruz et al. , 2005; Farrell et al. , 2005; Kassi et al. , 2011; Tirosh, 2015).

Várias drogas são usadas na redução do colesterol e consequentemente tratam da

DHGNA, tais como: inibidores da enzima HMG-CoA redutase, sequestradores de

colesterol, fitoesteróis, fitofármacos e os fibratos (Augustin et al. , 2017; Dongiovanni

& Valenti, 2017; Ferramosca et al. , 2017; Sanyal et al. , 2010; Younossi, 2008).

Apesar disso, ainda não existe tratamento farmacológico específico para o

controle da esteatose hepática. Portanto, todos os pacientes portadores da DHGNA são

encorajados a reduzir a ingestão de gorduras e realizar exercícios físicos regulares, com

o objetivo de aumentar o gasto energético diário (Augustin et al. , 2017; Dongiovanni &

Valenti, 2017; Musso et al., 2010).

3.4 LEUCOANTOCIANIDINA

As leucoantocianidinas pertencem à família dos polifenóis naturais pertencentes

à classe dos bioflavonoides. Sua característica marcante é a ação antioxidante

hidrossolúvel presente em sua estrutura que chega a ser mais forte que a vitamina E. Sua

ação antioxidante se deve ao fato das leucoantocianidinas eliminarem qualquer espécie

de radicais livres envolvidas no processo (Beidokhti & Jager, 2017; Belwal et al., 2017;

Lee et al., 2017).

O consumo dos flavonoides (leucoantocianidinas, proantocianidinas e

antocianidinas) vem sendo bastante estudado recentemente devido às suas propriedades

24

antioxidativas. Estudos demonstraram que os flavonoides tem o potencial de reduzir o

risco de doenças cardiovasculares, câncer, obesidade e diabetes, elementos intrínsecos

da síndrome metabólica (Fernandes et al. , 2017; Lee et al. , 2017; Mantovani &

Targher, 2017; Pizzino et al. , 2017; Shin & Jung, 2017).

Portanto, práticas como o consumo regulado de vinho e a ingesta de uvas, frutas

vermelhas e nozes vem sendo estimulado, pois tais alimentos e bebidas possuem em sua

composição os flavonoides e outras substâncias antioxidantes (Fernandes et al. , 2017;

Pizzino et al. , 2017).

Apesar do vasto conhecimento adquirido a respeito das leucoantocianidinas, os

efeitos sobre o tecido hepático não são tão claros, pois muitos resultados dependem dos

seguintes fatores: se o experimento é in vitro ou in vivo, a espécie de animal utilizado,

modelo experimental de indução a patologia, idade dos animais, origem do extrato e sua

via de administração, bem como o tempo de duração do experimento (van der Worp et

al. , 2010).

Uma revisão da literatura demonstrou que de fato os flavonoides podem reduzir

o dano realizado por diversas doenças, em destaque, a síndrome metabólica, mas, não

existem estudos que avaliaram o tecido hepático em animais com DHGNA, em

específico (Shin & Jung, 2017).

25

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS

Este projeto faz parte do protocolo de colaboração científica entre a

Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e Universidade Federal Fluminense (Anexos

9.1 e 9.2) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (protocolo de pesquisa

nº011034/2007-55) da UFAL (Anexo 9.3).

Além disso, o projeto também foi aprovado em reunião do Departamento de

Morfologia da UFF. Reitera-se que este presente trabalho não necessitou de nova

aprovação pelo CEP da Instituição de Ensino Superior supracitada devido ao fato de

tratar-se de doação de material previamente aprovado (Anexo 9.4).

4.2 AMOSTRA

Foram utilizados 30 coelhos adultos e machos da raça Nova Zelândia (Oryctolagus

cuniculus). Os animais foram desmamados após 40 dias, sendo nessa época admitidos

ao experimento com peso que variou entre 1,5Kg e 1,6Kg, alimentados com ração

Socil® (Tabela 1) e água ad libitum.

Quando os animais atingiram entre 7 e 8 meses iniciou-se o experimento, apesar de

serem criados nas mesmas condições e local, em gaiolas individuais, pesavam entre

2500 e 4100 g. Estes coelhos ficaram em um biotério apropriado com a temperatura e

luz natural onde foram acompanhados por médicos veterinários antes e durante o

experimento.

26

Tabela 1 – Composição da dieta (Socil®) utilizada no presente experimento.

Produto Quantidade (%)

Proteína bruta 15%

Extrato etéreo 2,5%

Matéria fibrosa 16%

Matéria mineral 10%

Cálcio 2,%

Fósforo 0,42%

Umidade 13%

Carboidratos 31,58%

Trinta animais foram alocados em três grupos, sendo denominados de G1, G2 e

G3 com 10 animais cada grupo, sendo um coelho por gaiola. Os coelhos foram pesados

com uma balança digital de precisão Marte®, modelo AS 5000 C com carga máxima de

5kg e mínima 5g. Para evitar a mistura de animais durante as manipulações, cada animal

recebeu um número na face interna da orelha esquerda, com pincel atômico de cor preta.

A descrição dos grupos randomizados é descrita a seguir:

a) O grupo G1 (grupo controle) foi alimentado com 200g da ração Socil® que

tem a composição básica necessária ao animal: proteína bruta (15%), extrato etéreo

(2,5%), matéria fibrosa (16%), matéria mineral (10%), cálcio (2,5%), fósforo (0,42%),

umidade (13%), carboidrato (31,58%). Como os coelhos são lagomorfos, quando a

ração não tinha mais a forma de peletas, era desprezada e substituída por nova.

b) O grupo G2 foi alimentado com 200g da mesma ração do grupo controle,

juntamente com 10 mL de gema de ovo Carnaúba® grande 1,5 g de colesterol puro

(Imprextraco®). A gema de ovo, além de ser uma fonte de colesterol e outros lipídeos,

também foi utilizada como veículo para administração do colesterol que foi dissolvido e

injetado por seringa via orofaríngea (Fonseca Jr et al. , 2016). Os componentes da gema

de ovo estão descritos na Tabela 2.

c) O grupo G3 foi alimentado nas mesmas condições do grupo G2,

diferenciando apenas na administração do antioxidante - leucoantocianidina de uva

50mg/Kg conforme Segura et al. (2003).

27

A administração de colesterol e/ou gema bem como da leucoantocianidina de

uva nos animais dos grupos 2 e 3, foi realizada com sondagem orofaríngea, através de

sonda de nelaton número 18 conectada a uma seringa descartável de 10mL. A

leucoantocianidina de uva, foi administrada 2h antes da dieta aterogênica, diluída em 3

mL de água destilada. A dieta complementar foi preparada diariamente, durante 100

dias.

Para todos os grupos, foi oferecida diariamente, 200 gramas de ração e água ad

libitum, havendo sobra, a dieta era novamente complementada até 200 g.

Tabela 2 – Composição da gema de ovo (100 g) utilizada no presente experimento.

Produto Quantidade

Lipídeos totais (g/100g) 28,7 (0,3)

Colesterol (MG/100g) 997,5 (30,1)

Ácidos graxos (g/100g) -

Saturados 8,53

Monoinsaturados 10,84

Poli-insaturados 4,19

Ômega-3 0,17

Ômega-6 4,02

4.3 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DA DIETA HIPERLIPIDÊMICA

O preparo da dieta foi diário para evitar contaminação dos animais ou do

alimento. Antes da sondagem orofaríngea, o ovo foi lavado com hipoclorito de sódio

diluído em água e deixando-os durante 5 min imersos nessa solução. A retirada da gema

foi realizada com a ajuda de uma colher em seguida foi separada a gema da clara em um

recipiente plástico.

Utilizando uma seringa de 20 mL retirou-se 10 mL de gema que foi colocado em

um recipiente onde continha 1,5g de colesterol previamente pesado. O colesterol foi

misturado à gema com o auxilio de um bastão de vidro. A administração foi realizada

28

utilizando uma seringa de 10 mL que foi acoplada a uma sonda que foi introduzida até a

orofaringe (Figura 2).

Figura 2 – ADMINISTRAÇÃO DA GEMA DE OVO

Gema de ovo ofertada em seringa com 10 ml por via oral. Fonte: Dados da pesquisa.

A leucoantocianidina de uva foi diluída em 3 mL de água destilada e injetada

com a utilização de uma seringa de 10mL acoplada a uma sonda de nelaton número 18 e

repetindo o procedimento semelhante ao do colesterol e a gema 2h depois no grupo G3.

4.4 DOSAGEM BIOQUÍMICA

Foi realizada análise bioquímica do sangue após jejum de 12 a 14 horas em

todos os coelhos, para verificação de suas taxas de colesterol Total, HDL, VLDL, LDL,

lipídeos totais, bem como de triglicerídeos, TPG e TGO. O procedimento foi realizado 4

vezes (início do experimento, dias 33, 66 e 99) em todos os animais.

O sangue foi coletado através da punção da artéria auricular central, com seringa

de 10 mL e armazenado para análise em tubos de ensaio de 5 mL sem anticoagulante.

29

Ao fim da coleta amostras eram encaminhadas ao laboratório onde foram

centrifugadas e seguiu o procedimento operacional padrão para análise do colesterol

total e frações. Após a coleta, as amostras foram levadas ao Centro de Patologia e

Medicina Laboratorial — CPML, da Universidade Estadual de Ciências da Saúde de

Alagoas — e colocadas em um analisador automático modelo AU400e Olympus®.

4.5 EUTANÁSIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Ao término do experimento os coelhos foram submetidos à eutanásia (100º dia).

Para tanto, foi realizada inicialmente anestesia geral (Xilazina a 2% - Rompum® – e

Quetamina a 5% - Ketalar®), via intramuscular. Com o animal profundamente

anestesiado, foi aplicado lentamente 10 mL de cloreto de potássio 19,1%, via

endovenosa, monitorando o animal até o óbito, sendo que todo este procedimento

sempre foi acompanhado pelo veterinário responsável, respeitando a recomendação do

Conselho Federal de Medicina Veterinária, resolução nº 714 Art. 13, de 20 de junho de

2002.

Cada animal foi submetido a procedimento para a retirada de fragmentos

hepáticos; para isto foi realizada a incisão mediana toracoabdominal e cada animal foi

dissecado por planos até expor todo o fígado para a retirada dos fragmentos que foram

lavados em soro fisiológico 0,9% e fixados com formalina a 10% (tamponada).

Os espécimes foram submersos em solução de formaldeído a 10% e enviados

ao Laboratório de Morfologia Experimental (LAMEx) da UFF os quais foram

processados em rotina histológica para microscopia de luz e corados com Hematoxilina

e Eosina, Tricrômico de Masson e Fucsina-Resorcina de Weigert para microscopia de

luz (Bancroft & Cook, 1994).

Após a obtenção dos fragmentos, esses sofreram a clivagem "ortrip"

(Mandarim-de-Lacerda, 2003) para a realização da estereologia. Esse método consiste

de seccões ortogonais dos fragmentos, três vezes consecutivamente, sendo o primeiro

corte aleatório, o segundo ortogonal ao primeiro e o terceiro também ortogonal ao

segundo. Desta forma, obtêm-se cortes aleatórios uniformemente isotrópicos.

30

4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA

Para a análise histopatológica e estereológica, as amostras foram posteriormente

desidratadas em soluções crescentes de álcoois, iniciando com 70% até o álcool

absoluto, clarificadas em xilol e incluídas em parafina. Os cortes de 5 μm de espessura

das amostras coletadas foram corados inicialmente com hematoxilina-eosina para

exclusão do material apresentando artefatos de fixação e ou processamento (Behmer et

al., 1975).

De cada fígado foram retirados 5 fragmentos, que originaram 5 cortes diferentes

de 5 μm de espessura. De cada corte foram analisados 5 campos aleatórios, perfazendo

um total de 25 áreas teste analisadas em cada fragmento hepático.

Utilizou-se a técnica de Tricrômio de Masson onde os cortes selecionados foram

corados para evidenciar o tecido conjuntivo, que se cora em azul em contraste marcante

com as fibras musculares lisas e demais células sanguíneas, coradas em tons de

vermelho, devido ao chromotrope 2R presente na solução (Bancroft & Cook, 1994;

Behmer et al. , 1975). A coloração de Hematoxilina e Eosina também foi utilizada com

o propósito de ter uma visão melhor do tecido adiposo.

As imagens para análise e quantificação bidimensional foram obtidas em

aumento de 400X, em microscópio óptico Olympus acoplado a uma câmera de vídeo

Sony CCD, sendo a imagem dos campos microscópicos transferida para um monitor.

Para a análise histopatológica, foi utilizada a coloração de Hematoxilina e

Eosina e as lâminas foram sujeitas à análise por dois patologistas não envolvidos no

estudo. O escore de EHNA mundialmente consagrado foi utilizado para avaliar a

gravidade e extensão da DHGNA nos animais (Kleiner et al., 2005). O escore está

presente no Anexo 9.6.

Os dados foram obtidos pelo método de contagem de pontos superpondo um

sistema teste M 42 sobre a tela do monitor (Weibel et al., 1966). As características

básicas do sistema-teste são Ap (área do ponto-teste), Pt (número de pontos-teste) e d (a

menor distância entre pontos-teste). A área-teste pode ser conhecida multiplicando-se o

número de pontos-teste pela área de um ponto-teste (Mandarim-de-Lacerda, 1998;

Mandarim-de-Lacerda, 2003; Weibel et al. , 1966). O sistema-teste M42 de Weibel et

31

al. (1966) apresenta 42 pontos-teste (Figura 3), a linha-teste mede 21d e a área-teste

mede: 423

2. .d²

Figura 3 – SISTEMA-TESTE M42

As estruturas que tocam as linhas proibidas (tracejadas) não são contadas. As linhas curtas (d) calibram

esse sistema-teste e suas extremidades são consideradas os pontos-teste (PP) (Mandarim-de-Lacerda,

1998; Mandarim-de-Lacerda, 2003). Fonte: Weibel et al. (1966).

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram analisados através da estatística descritiva usando como

ferramenta software IBM SPSS (versão 21). Os dados desta análise foram expressos em

média e desvio padrão (SD). Primeiramente foi feito o teste de normalidade em cada

grupo (G1, G2 e G3), para verificar se os dados seguem ou não a distribuição normal.

Para comparações entre os grupos (G1, G2 e G3) foi usado o ANOVA one-way e o pós-

teste de TUKEY para os dados que seguem a distribuição normal. Para os resultados

que não seguem a distribuição normal foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o

pós-teste DUNNS. Para a avaliação do escore de EHNA, foi utilizado o teste qui-

quadrado. O valor de p < 0,05 foi considerado significativo para os testes estatísticos.

32

5 RESULTADOS

Para melhor análise dos efeitos da leucoantocianidina de uva serão apresentados

inicialmente os resultados da adaptação à dieta de todos os grupos, a saber: alterações

patológicas na pele, resultados dos exames bioquímicos e o peso dos animais, assim

como as alterações hepáticas no tecido macroscópico e microscópico e por fim,

alterações encontradas na avaliação estereológica do tecido.

5.1 ALTERAÇÕES PATOLÓGICAS NA PELE

Durante a necropsia foram observados sinais de hiperlipidemia, como o acúmulo

de gordura subcutânea (xantomas). Estes possuíam comprimentos superiores a 2 cm

(Figura 4).

Figura 4 – XANTOMA

Acúmulo de gordura subcutânea (xantoma) na face interna da pata direita (seta) (Grupo G2 – Ração: 1,5g

de colesterol e 10mL de gema). Fonte: Dados da pesquisa.

Os xantomas foram encontrados em maior tamanho e quantidade nos G2.

Somente três animais do G3 tiveram xantomas,e estes eram menores que 2 cm. Após a

análise macroscópica de todos os animais, os xantomas foram removidos e levados para

33

o laboratório de histologia, onde foram preparados por procedimentos de rotina. O

aspecto microscópico dos xantomas pode ser observado na Figura 5.

Figura 5 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO XANTOMA

Fotomicrografia do xantoma corado com Hematoxilina e Eosina (10 X). Podem ser observados

macrófagos espumosos e acúmulo de lipídeos na derme. Xantoma pertencente a um coelho do Grupo

G2 (Ração,1,5g de colesterol e 10mL de gema). Fonte: Dados da pesquisa.

5.2 VALORES BIOQUÍMICOS E PESO DOS ANIMAIS

5.2.1 Peso dos animais

A média do peso dos animais no início do experimento para os grupos foi de

3,4341kg (±0,4093) para o G1, 3,0591kg (±0,3985) para o G2 e 3,3263kg (±0,51281)

para o G3. Observou-se a diminuição do peso dos animais dos grupos G1 e G3 nos

primeiros 33 dias de experimento e aumento de peso dos animais do grupo G2 nos

primeiros 33 dias, no entanto, não houve diferença estatisticamente significativa no peso

dos animais durante todo experimento (p > 0,05), conforme demonstrado no Gráfico 1

sobre a evolução de peso.

34

Gráfico 1 – EVOLUÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO

0 50 100 1502.5

3.0

3.5

4.0G1

G2

G3

DIAS

PE

SO

(K

g)

Representação de evolução do peso dos animais durante o experimento dos grupos: G1, G2 e G3, durante

os 100 dias de experimento. Observa-se que não houve diferença significante entre os pesos dos animais

em todos os tempos do experimento, p = 0,7895. Fonte: Dados da pesquisa.

5.2.2 Colesterol Total

Ao analisar os níveis de colesterol total (CT) dos coelhos do grupo G1, G2 e G3

no dia zero (D0) verificou-se que não houve diferença significante entre os grupos (p >

0,05). Nos dias zero, 33, 66 e 99 observou-se que os níveis do CT do grupo G1

permaneceram normais, já nos grupos G2 e G3 houve aumento significante conforme

demonstram o Gráfico 2 e a Tabela 3.

35

Gráfico 2 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE COLESTEROL TOTAL DOS

ANIMAIS DURANTE O EXPERIMENTO

Gráfico da evolução do nível de colesterol total dos animais (G1, G2, G3) durante o experimento Fonte:

Dados da pesquisa.

Tabela 3 – Média e desvio padrão do CT, conforme o dia e grupo experimental.

Variável G1 G2 G3

Média SD± Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

CT (dia zero) 54,86 29,58 40,93 9,84 38,46 20,95

CT(dia 33) 38,32 17,19 897,30* 32,97 926,10* 44,44

CT(dia 66) 44,86 19,04 917,20* 39,67 899,60* 46,80

CT(dia 99) 32,80 21,08 892,07* 37,85 910,61* 32,42 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

No início do experimento (D0), a comparação entre os grupos G1, G2 e G3 não

gerou diferenças estatisticamente significativas (p = 0,1645). No dia 33, a comparação

entre os grupos G2 e G3 apresentou resultado significante quando comparados com o

grupo G1 (p < 0,05).

36

Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante no restante do

experimento (p > 0,05). No dia 66, a comparação entre os grupos, G1 e G2 apresentou

resultado significante (p < 0,05).

Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante (p > 0,05). Em todas as

comparações anteriores foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste

DUNNS. No dia 99, a comparação entre os grupos, G1 comparados com o G2 e G3

apresentou resultado estatisticamente significante (p < 0,05).

Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante (p > 0,05). Em todas as

comparações do dia 99 foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de TUKEY.

5.2.3 Colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade)

Ao analisar os níveis do LDL, dos três grupos no dia (zero) observou-se que não

houve diferença significante (p > 0,05) entre os grupos G1, G2 e G3, durante os dias

zero, 33, 66 e 99 do experimento. Os níveis plasmáticos do LDL do grupo G1 se

mantiverem sem alterações significantes.

No início do experimento (dia zero), a comparação entre os grupos G1, G2 e G3,

não houve diferença significante (p > 0,05). No dia 33, a comparação entre os grupos,

G1 comparados com o, G2 e G3 apresentou resultado significante (p < 0,05).

Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significativo, e em todas as

comparações (dia zero e 33) foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste

DUNNS. No dia 66, a comparação entre os grupos, G1 comparados com o, G2 e G3

apresentaram resultado significante (p < 0,05).

Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante. Em todas as

comparações foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de TUKEY. No dia

99, a comparação entre os grupos, G1 comparados com o, G2 e G3 apresentaram

resultado significante (p > 0,05). Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não

significante e em todas as comparações foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o

pós-teste DUNNS.

Esses resultados estão representados no Gráfico 3 e na Tabela 4.

37

Gráfico 3 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LDL DOS ANIMAIS

DURANTE O EXPERIMENTO

Gráfico representando a evolução do nível de LDL dos animais (G1 , G2 e G3) durante o experimento

Fonte: Dados da pesquisa.

Tabela 4 – Média e desvio padrão do LDL, conforme o dia e grupo.

Variável G1 G2 G3

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

LDL (dia zero) 14,50 19,22 6,22 4,77 12,41 9,23

LDL (dia 33) 6,73 5,56 826,50* 51,17 866,70* 48,352

LDL (dia 66) 14,47 9,82 845,03* 44,98 848,84* 58,34

LDL (dia 99) 17,10 11,39 809,29* 78,67 844,01* 36,91 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

38

5.2.4 Colesterol VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade)

A análise dos níveis do VLDL, no dia (zero) demonstrou que não houve

diferença significante entre os grupos, permaneceu sem alterações significantes no dia

33 (p > 0,05). Nos dias 66 e 99 houve aumento dos níveis plasmáticos dos grupos G2 e

G3 em relação ao grupo G1, e a diferença não foi significante entre si (p > 0,05).

No dia 33, entre os grupos G1, comparado com os grupos G2 e G3 houve

diferença significante (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G2 e G3,

observamos não houve diferença significativa. Em todas as comparações foi utilizado o

teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.

No dia 66, a comparação entre os grupos G1 e G2 demonstrou diferença

significativa (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G1 e G3, G2 e G3 o

resultado foi não significante (p > 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste

ANOVA one-way e o pós-teste de TUKEY.

No dia 99, o resultado da comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3 foi

significante (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G2 e G3 não houve diferença

significante (p > 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste de KRUSKAL-

WALLIS e o pós-teste DUNNS.

Os dados referentes a essa análise podem ser conferidos no Gráfico 4 e na

Tabela 5.

39

Gráfico 4 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE VLDL DOS ANIMAIS


Gráfico representando a evolução do nível de VLDL dos animais (G1 , G2 e G3) durante o experimento


Tabela 5 – Média e desvio padrão do VLDL, conforme o dia e grupo.

Variável G1 G2 G3

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

VLDL (dia zero) 16,01 6,29 12,09 5,51 15,70 10,58

VLDL (dia 33) 13,73 5,20 42,09 17,65 35,07* 20,16

VLDL (dia 66) 14,27 4,47 47,69 20,95 33,73 19,17

VLDL (dia 99) 13,34 5,87 67,17 69,63 38,02* 16,72 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

40

5.2.5 Colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade)

Observou-se que no início do experimento (dia zero), a comparação dos

resultados entre os grupos G1, G2 e G3 não significante (p > 0,05). No dia 33, a

comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 não foi significativa (p > 0,05).

Viu-se que no dia 66, a comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 não foi

significante (p > 0,05). Em todas as comparações (nos dias zero, 33 e 66) foi utilizado o

teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.

No dia 99, a comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 o resultado

foi não significante (p > 0,05). Foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de

TUKEY nesta comparação.

Os dados estão representados no Gráfico 5 e na Tabela 6.

Gráfico 5 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL DOS ANIMAIS DURANTE O

EXPERIMENTO

Gráfico representando a evolução do nível de HDL dos animais (G1, G2, G3) durante o experimento


41

Tabela 6 – Média e desvio padrão do HDL, conforme o dia e grupo.

Variável G1 G2 G3

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

HDL (dia zero) 20,84 8,17 30,41 6,68 26,50 11,24

HDL (dia 33) 27,90 12,48 28,70 12,31 24,38 7,61

HDL (dia 66) 25,04 8,29 24,50 7,96 17,06 7,51

HDL (dia 99) 21,26 9,09 15,63 5,34 16,82 4,24 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

5.2.6 Evolução do LDL e HDL

Ao analisar os níveis do LDL e HDL, no dia zero pode-se observar que não

houve diferença significante entre os três grupos (p > 0,05). No dia 33 houve um

aumento do LDL com média de 826,50mg/dL para o grupo G2 e 866,70 mg/dL para o

grupo G3, não obtendo diferença significante (p > 0,05).

As taxas de HDL não tiveram diferenças significativas entre os grupos durante

todo experimento (p > 0,05). No entanto, no dia 66 até o término do experimento os

níveis de HDL do grupo G3 deixaram de diminuir e se estabilizaram.

Esses resultados podem ser observados no Gráfico 6.

Gráfico 6 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL E LDL DOS ANIMAIS


Gráfico representando a evolução do nível de LDL e HDL dos animais (G1, G2, G3) durante o

experimento Fonte: Dados da pesquisa.

42

5.2.7 Triglicerídeos

Observa-se que no inicio do experimento (dia zero), o resultado da comparação

entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 não foi significante (p > 0,05). No dia 33, a

comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, o resultado foi significante (p < 0.05),

no entanto, comparando os grupos G2 com G3 não houve diferença significante (p >

0,05). Em todas as comparações (nos dias: zero e 33) foi utilizado o teste de

KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.

Viu-se que no dia 66, a comparação entre os grupos G1 e G2 houve diferença

significante (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G1 com G3 e G2 com G3 não

houve diferença significante em todas as comparações (p > 0,05). Observa-se que no dia

99, a comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 o resultado não foi

significante (p > 0,05), porém, pudemos verificar que os coelhos pertencentes ao G3

obtiveram valores nas taxas de triglicerídeos mais próximos ao grupo controle. Em

todas as comparações (nos dias 66 e 99) foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-

teste de TUKEY.

Esses dados estão representados no Gráfico 7 e Tabela 7.

43

Gráfico 7 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TRIGLICERÍDEOS DOS ANIMAIS


Gráfico representando a evolução do nível de triglicerídeos dos animais (G1, G2, G3) durante o


Tabela 7 – Média e desvio padrão do nível de triglicerídeos (TGC), conforme o dia e

grupo.

Variável G1 G2 G3

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

TGC (dia zero) 73,74 31,09 98,96 88,22 78,52 52,93

TGC (dia 33) 68,67 26,01 210,36 88,21 175,31* 100,86

TGC (dia 66) 69,69 20,66 238,41 104,70 168,63 95,81

TGC (dia 99) 62,36 17,95 335,68 347,85 179,68 87,97 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

5.2.8 Lipídeos totais

No início do experimento (dia zero), a comparação dos resultados entre os grupos

G1, G2 e G3 demonstrou que não houve diferença significativa (p > 0,05). Evidenciou-

44

se que no dia 33, houve diferença significante na comparação dos resultados entre os

grupos G1 e G2, e G1 e G3 (p < 0,05), no entanto comparando os grupos G2 com o G3

não houve diferença significante (p > 0,05). No dia 66, houve diferença significativa na

comparação dos resultados entre os grupos G1 e G2, e G1 e G3 (p < 0,05), no entanto

comparando os grupos G2 com o G3 não houve diferença significante (p > 0,05).

Em todas as comparações (nos dias zero, 33 e 66) foi utilizado o teste ANOVA one-

way e o pós-teste de TUKEY.

Observou-se que a diferença entre os grupos G1 com G2 e G1 com G3 no dia 99

foi significativa (p < 0,05), porém, comparando os grupos G2 com o G3 não houve

diferença significante (p > 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste de


Tais dados encontram-se resumidos no Gráfico 8 e Tabela 8.

Gráfico 8 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LIPÍDEOS TOTAIS DOS ANIMAIS


Gráfico representando a evolução do nível de lipídeos totais dos animais (G1, G2, G3) durante o


45

Tabela 8 – Média e desvio padrão do nível de lipídeos totais (LPT), conforme o dia e

grupo.

Variável G1 G2 G3

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

LPT (dia zero) 419,51 39,47 389,39 26,38 403,99 53,017

LPT (dia 33) 394,00 27,52 1394,50* 64,24 1388,40* 106,75

LPT (dia 66) 404,48 24,25 1442,60* 117,83 1355,30* 71,77

LPT (dia 99) 384,11 13,96 1514,90* 353,18 1378,30* 90,745 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

5.2.9 TGP e TGO

Observa-se que no inicio do experimento (dia zero), o resultado da comparação dos

níveis de TGP e TGO não foi estatisticamente significativo (p > 0,05).

Observou-se que a diferença dos níveis de TGO entre os grupos G1 com G2 e

G1 com G3 no dia 99 foi significativa (p < 0,05), assim como a diferença entre o G2 e

os animais do G3 (p < 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste de


Tais dados encontram-se resumidos no Gráfico 9 e Tabela 9.

46

Gráfico 9 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TGP E TGO DOS ANIMAIS


Gráfico representando a evolução do nível de TGO e TGP dos animais (G1, G2, G3) durante o


Tabela 9 – Média e desvio padrão do nível de TGP e TGO (mg/dL), conforme o dia e

grupo.

TGP G1 G2 G3 Valor de p

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão > 0,05

Dia 0 41,22 9,15 59,50 8,55 46,96 8,23

Dia 99 30,98 3,91 51,74 10,58 55,70 18,71

TGO G1 G2 G3 Valor de p

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão

Média Desvio

Padrão < 0,05

Dia 0 21,53 8,90 30,54 12,52 18,36 8,72

Dia 99 4,51 1,69 32,68* 8,56 22,36* 9,7 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.

47

5.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA

Não foram encontradas alterações hepáticas macroscópicas e microscópicas nos

animais do grupo controle, conforme Figura 6 e Figura 7.

Figura 6 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO

GRUPO 1

Fotomacrografia de Fígado de um coelho normal (ausência de esteatose) (G1 – Grupo Controle).

Macroscopicamente bem perfundido e sem sinais de esteatose. Fonte: Dados da pesquisa.

48

Figura 7 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO

GRUPO 1 (MASSON)

Fotomicrografia de Fígado de um coelho normal (ausência de esteatose). Tecido hepático denso rico em

sinusóides onde observa-se hepatócito normal (delineados em cor amarelo). Tricrômio de Masson (40X)

(G1 – Grupo Controle). Fonte: Dados da pesquisa.

Os coelhos do G2 adaptaram-se bem à dieta administrada. O experimento foi

iniciado com 10 animais nesse grupo, porém, durante o experimento ocorreram 3 óbitos

(acidente vascular encefálico, infarto agudo do miocárdio e esteatose hepática como

causas). Os óbitos ocorreram no 45º, 60º e 92º dias. O fígado dos demais animais

apresentavam alterações macroscópicas (Figura 8) e microscópicas (Figura 9).

49


GRUPO 2

Fotomacrografia de Fígado de coelho com esteatose hepática não alcoólica (G2). Observa-se aspecto

macroscópico mais amarelado-esbranquiçado devido ao acúmulo de gordura. Fonte: Dados da pesquisa.

50


GRUPO 2 (MASSON)

Fotomicrografia de Fígado de um coelho com esteatose hepática. Tecido hepático desorganizado, pouco

perfundido e com hepatócito aumentado (delineado em cor amarela) e morte celular (delineado em cor

vermelha). Tricrômio de Masson (40X) (G2). Fonte: Dados da pesquisa.

Os coelhos do G3 se adaptaram bem à dieta. O experimento foi iniciado com 10

animais, porém, também ocorreram 3 óbitos durante o estudo (dias 72, 86 e 95, todos

com sinais de acidente vascular encefálico).

Esteatose hepática moderada (com microvilosidades) foi observada na análise

macroscópica nos coelhos que vieram a óbito, assim como nos outros 7 animais do

grupo. Nestes grupos, as fezes apresentaram tonalidade escura. As alterações

macroscópicas (Figura 10) e microscópicas (Figura 11) podem ser observadas à seguir.

51


GRUPO 3

Fotomacrografia de Fígado de coelho com esteatose hepática não alcoólica tratado com

leucoantocianidina (G3). Observa-se provável proteção na perfusão sanguínea de capilares difusamente.


52


GRUPO 3 (MASSON)

Fotomicrografia de Fígado de um coelho com esteatose hepática microvesicular tratado com

leucoantocianidina. Tecido hepático moderadamente organizado com presença de vários sinusóides,

hepatócito balonizado (seta). Observamos delineados (cor vermelha), hepátocitos morfologicamente

íntegros. Tricrômio de Masson (40X) (G3). Fonte: Dados da pesquisa.

A densidade volumétrica (Vv%) dos hepatócitos nos grupos G1, G2 e G3 foram

respectivamente: 78,4±8,3; 72,4±10 e 25,5±6,4 (p < 0,05) (Tabela 10). Ao analisar o

tecido esteatótico, verificamos que a Vv nos grupos G1,G2 e G3 foram respectivamente:

1,5±2,6; 72,8± e 19,5±5,7 (p < 0,05) (Tabela 10). Logo, foi observado que a Vv de

tecido hepático saudável foi inversamente proporcional a medida que a esteatose se

instalava nos coelhos do G2 e G3.

53

Tabela 10 – Média e desvio padrão da densidade volumétrica no tecido hepático em

G1, G2 e G3.

Variável G1 G2 G3 p

Vv Hepatócitos 78,4±8,3 7,2±10 25,5±6.4 < 0,05*

Vv Esteatose 1,5±2,6 72,8±17,1 19,5±5.7 < 0,05*

*Teste de Kruskal-Wallis e DUNN. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.


Os hepatócitos dos coelhos do G2 sofreram diminuição estatisticamente

significativa (p < 0,05) de 90.8% em relação ao G1, enquanto que o G3 apresentou

redução de 32,5%. A proporção inversa (aumento de tecido esteatótico e diminuição do

tecido hepático saudável) também foi estatisticamente significativa (Gráficos 10 e 11).

Gráfico 10 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DOS HEPATÓCITOS

Demonstração gráfica comparativa do percentual de densidade volumétrica (Vv%) dos hepatócitos entre

os grupos analisados (G1, G2 e G3). Fonte: Dados da pesquisa.

54

Gráfico 11 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DA ESTEATOSE HEPÁTICA

Demonstração gráfica comparativa do percentual de densidade volumétrica (Vv%) da esteatose hepática

entre os grupos analisados (G1, G2 e G3). Fonte: Dados da pesquisa.

No que tange a avaliação pelo escore de EHNA, o escore médio do grupo 1 foi

0, o escore médio do G2 foi 6 (Esteatose = 3, Inflamação = 2 e Balonização de

hepatócito = 1) e 4 (Esteatose = 2, Inflamação = 1 e Balonização de hepatócito = 1) para

o G3 (p < 0.05) (Figuras 12, 13 e 14).

55


GRUPO 1 (H&E).

Fotomicrografia de Fígado de um coelho do G1. Algumas concentrações de gordura podem ser

observadas (seta preta), mas, estas não caracterizam EHNA (<5%). Hematoxilina/Eosina (100X). Fonte:

Dados da pesquisa.

56


GRUPO 2 (H&E).

Fotomicrografia de Fígado de um coelho do G2. Mudanças degenerativas podem ser observadas, assim

como esteatose macro e microvesicular (setas pretas) afetando aproximadamente 70% da superfície.

Balonização de hepatócitos pode ser observada nas setas brancas. Hematoxilina/Eosina (100X). Fonte:

Dados da pesquisa.

57


GRUPO 3 (H&E).

Fotomicrografia de Fígado de um coelho do G3. Estes coelhos apresentaram uma redução do foco de

esteatose (setas pretas) e menor quantidade de balonização de hepatócitos (setas brancas) em relação ao

G2. Hematoxilina/Eosina (100X). Fonte: Dados da pesquisa.

58

6 DISCUSSÃO

Como visto anteriormente, os coelhos são modelos animais mais adequados para

o estudo de doenças relacionadas ao metabolismo de lipídeos, visto maior similaridade

em sua digestão e armazenamento com o metabolismo humano (Fan et al. , 2017)

Sendo assim, pesquisadores utilizaram coelhos adultos nos experimentos com

dieta rica em colesterol, gema de ovo e banha, e assim desenvolveram o processo da

arteriosclerose em coelhos (Dornas et al., 2010; Fonseca Jr et al. , 2016; Jaldin et al.,

2006).

No início de administração de uma dieta aterogênica rica em colesterol e gordura

saturada, os níveis das lipoproteínas aumentam em curto prazo (Giroldo et al., 2007;

Kolankiewicz et al., 2008; Saez Lancellotti et al., 2010; Wagar et al., 2010).

Estas informações coincidem com as observadas em nossos resultados, onde a

dieta hiperlipidêmica elevou os níveis das lipoproteínas que atingiu nível superior a 800

mg/dL.

Segundo Ramalho et al. (2007) a concentração do colesterol em ovos de galinha

é de 956 mg/100g, por ter um alto teor de lipídios o ovo é considerado importante para o

desenvolvimento das dislipidemias e arteriosclerose, além do aumento significativo na

concentração de colesterol plasmático.

No presente experimento o colesterol contido na gema de ovo foi de

997,5mg/100g (realizado por cromatografia – HPLC High Performance / Pressure

Liquide Chromatography).

Essas evidências são fidedignas, indicando a importância do tipo de gordura em

relação ao risco das dislipidemias, síndrome metabólica com consequências hepáticas e

cardiovasculares, comprovando que a dieta rica em colesterol e gordura saturada tem

graves consequências para a saúde.

No presente trabalho utilizamos a mesma dosagem que Segura et al. (2003), de

50mg/Kg de proantocianidinas oligoméricas que são capazes de reduzir a oxidação da

LDL e aumentar o HDL, sendo a dosagem reajustada a cada 33 dias, sendo usado o pó

liofilizado (processo de desidratação) de leucoantocianidina de uva.

59

Em experimento em coelhos Nova Zelândia realizado por Teixeira Damasceno

et al. (2007) utilizaram 7,3mg/Kg/dia de isoflavona da soja e mostraram efeitos

hipolipemiantes e de diminuição da subfração pró-inflamatória de LDL no plasma

sanguíneo dos animais.

Já por sua vez, outros autores verificaram a influência da antocianina extraída do

arroz preto na arteriosclerose em ratas (300mg/Kg/dia), tendo êxito na melhora do perfil

lipídico, diminuindo os triglicerídeos, colesterol total e aumentando o HDL (Xia et al.,

2006).

O possível motivo do sucesso do experimento deve-se ao uso do extrato bruto e

não purificado, já que algumas vezes o extrato bruto possui um efeito terapêutico mais

significativo em virtude da soma de todas as substâncias encontradas no presente extrato

(Xia et al. , 2006).

Em nosso experimento não houve melhora estatisticamente significante na

redução do colesterol total, LDL, lipídeos totais, triglicerídeos.

Meyer et al. (1997) relata que as atividades antioxidantes dos extratos fenólicos

de 14 diferentes tipos de uvas frescas foram investigadas através da verificação da

inibição da lipoproteína de baixa densidade (LDL) in vitro.

No entanto, segundo van der Worp et al. (2010) nem sempre experimentos

realizados com resultados positivos in vitro tem o mesmo resultado in vivo e também

nem sempre experimentos in vitro possuem o mesmo grau de reprodutibilidade de

forma plena in vivo.

Finné Nielsen et al. (2005) realizaram um estudo utilizando uma substância

purificada de fração de antocianinas de groselha preta em coelhos.

Neste estudo o extrato purificado aumentou significativamente o colesterol

plasmático e LDL, mas reduziu o VLDL de forma significante.

No presente experimento não houve diferença significante comparando o grupo

tratado com leucoantocianidina de uva e o grupo 2 (1,5g de colesterol e 10mL de gema

de ovo).

Apesar das diferenças estatisticamente significativas do peso corporal e do perfil

lipídico entre o G2 e o G3, os animais do grupo tratados com leucoantocianidina (G3)

tiveram um peso corporal e taxas de colesterol total, triglicerídeos e VLDL diminuídas.

60

Isso pode ter sido resultado dos efeitos anti-obesogênicos da leucoantocianidina,

previamente descrito na literatura (Kuang et al., 2017; Martel et al., 2017)

Em contraste, alguns estudos observaram de fato diferenças estatisticamente

significativas no perfil lipídico de coelhos tratados com flavonoides (baicalina e

escutelarina) em comparação com o grupo hipercolesterolêmico (Zhang et al., 2018;

Zhang et al., 2018).

Em adição, os valores de TGP não tiveram diferença estatisticamente

significante, mas, em relação aos valores séricos de TGO estas diferenças foram

significativas (p < 0,05), o que pode indicar um efeito protetor da leucoantocianidina

nessa enzima, considerada um marcador para doenças hepáticas.

Em contrapartida, o estudo realizado por Zhang et al. (2018) demonstrou

diferenças significativas em ambos marcadores.

Porém, estes estudos (Zhang et al. , 2018; Zhang et al. , 2018) foram realizados

em animais (camundongos) com doses diferentes de flavonoides diferentes, aliados ao

fato de que os animais foram induzidos a um estado de hipercolesterolemia com a

utilização de dietas diferentes e estes estudos supracitados tiveram duração menor do

que a do presente trabalho.

Tais divergências metodológicas dificultam comparação dos resultados entre

diferentes estudos (van der Worp et al. , 2010).

Em relação ao escore de atividade da EHNA, houve redução de 6 para 4 no

grupo tratado em relação ao grupo hipercolesterolêmico. Porém, houve somente redução

significativa da esteatose, e redução não significativa da inflamação.

O estudo realizado por Zhang et al. (2018) demonstrou que a baicalina também

reduziu o escore.

No que se refere a análise estereológica, observou-se, no presente estudo,

redução significativa de 54,5% na densidade volumétrica (Vv%) dos hepatócitos em

resposta à ingestão de 10mL de gema de ovo associado a 1,5g de colesterol puro na

ração (G2), quando comparado com o grupo controle (G1).

Proporcionalmente a redução de hepatócitos, observamos nesse mesmo grupo

(G2), uma remodelação e aumento quantitativo significativo de esteatose

macrovesicular (p < 0,05) em relação ao grupo controle.

61

No grupo que recebeu gema de ovo e foi simultaneamente tratado com a

leucoantocianidina de uva 50mg/Kg (G3), observamos recuperação do tecido hepático

de 12.1%.

Isso nos leva a crer que a leucoantocianidina de uva apresenta um efeito protetor

dos hepatócitos na DHGNA, uma vez que os animais consumiam gema de ovo

associado a ingestão de leucoantocianidina de uva.

A leucoantocianidina possui três vezes mais benefícios do que a Vitamina E

(Fernandes et al. , 2017; Pizzino et al. , 2017; Tangney & Rasmussen, 2013) –

substância utilizada sem sucesso significativo para tratar a EHNA (Machado et al. ,

2016; Sanyal et al. , 2010).

Essa proporção deve-se ao fato de que a leucoantocianidina é um antioxidante,

além de possuir ações imunomodulatórias, vasodilatativas e propriedades anti-

inflamatórias (Fernandes et al. , 2017; Pizzino et al. , 2017; Tangney & Rasmussen,

2013).

Além disso, acredita-se que os bioflavonoides se conectam aos componentes da

matriz extracelular presente nos vasos sanguíneos e aumentam a resistência deles contra

enzimas (Shi et al., 2005).

Desse modo, a leucoantocianidina aumenta o tônus e a resistência das paredes

dos capilares, o que pode ter contribuído para uma melhora na perfusão hepática

encontrada no grupo tratado (G3) nesse presente trabalho.

Recentemente, a escutelarina (Zhang et al. , 2018), a baicalina (Zhang et al. ,

2018) e a rutina (Liu et al., 2017) vem sendo utilizada com certo grau de sucesso para

atenuar os efeitos da DHGNA.

Especula-se que estes flavonoides possuem seus efeitos de redução de lipídeos

devido ao fato de ativarem diferentes vias de sinalização que são capazes de reduzir a

biossíntese de colesterol, ácidos graxos e triglicerídeos pelo fígado (AMPK,

PPARc/PGC-1a-Nrf2 e outras vias).

Outro mecanismo proposto para seus efeitos incluem a regulação negativa de

células inflamatórias e citocinas pró-inflamatórias, assim como seus efeitos

antioxidativos (Cha et al., 2016; Fernandes et al. , 2017; Kuang et al. , 2017; Zhang et

al. , 2018).

62

Outros antioxidantes como o ômega-3, ácido linolênico e óleo de perila também

foram estudados no que tange a redução da EHNA (Cha et al. , 2016).

Dentre as drogas elencadas, aquela que, ultimamente, tem conseguido maior

prestígio parece ser a vitamina E, graças ao seu papel antioxidante (Sanyal et al. ,

2010).

O estudo PIVENS, foi conduzido pela NASH Clinical Research Network e

comparou o uso de 800UI/dia de vitamina E, e o de 30mg/dia de pioglitazona com

biópsias hepáticas antes e depois do tratamento.

Nos dois grupos (Vit E e pioglitazona) de tratamento ocorreu redução

significativa da esteatose, da inflamação lobular e balonização celular foi reduzida

(Sanyal et al. , 2010).

Ambas as substâncias mostraram redução NAFLD Activity Score (escore de

atividade da EHNA).

Porém, há uma inquietação com o uso de pioglitazona devido à observação

recente de uma possível associação do fármaco com câncer de bexiga (Lewis et al.,

2011).

É válido ressaltar que alguns estudos supracitados (Liu et al. , 2017; Machado et

al. , 2016; Xia et al. , 2006; Zhang et al. , 2018; Zhang et al. , 2018) objetivaram os

efeitos de uma única substância, porém, sabe-se que muitos destes compostos naturais

podem ser ingeridos em conjunto através de uma dieta adequada e diversa.

Devido a isso, acredita-se que as propriedades dessas diversas substâncias

podem entrar em sinergia e reduzirem juntas, com maior capacidade, a disfunção

endotelial e o metabolismo exacerbado de lipídeos (Fernandes et al. , 2017; Kim et al.,

2018; Mozaffarian & Wu, 2018; Zhang et al. , 2018).

Outros trabalhos usaram o tratamento farmacológico para obesidade com

sibutramina e a orlistate com melhora na bioquímica, redução de peso, e regressão da

esteatose avaliada pela ultrassonografia, entretanto sem a biópsia hepática seriada que

foi uma limitação do estudo (Sabuncu et al., 2003).

A rosiglitazona também foi satisfatoriamente eficaz no tratamento da DHGNA

(Neuschwander-Tetri et al., 2003; Ratziu et al., 2008), por outro lado, esta droga teve

sua comercialização suspensa após suspeitas de que estivesse associada a risco

63

aumentado de infarto agudo do miocárdio e insuficiência cardíaca (Nissen, 2010; Nissen

& Wolski, 2007).

Portanto, nenhum medicamento isoladamente foi aprovado de forma inconteste

como primeira linha de tratamento (Augustin et al. , 2017; Dongiovanni & Valenti,

2017; Ferramosca et al. , 2017; Mantovani & Targher, 2017; Musso et al. , 2010; Shin

& Jung, 2017).

64

7 CONCLUSÕES

No presente estudo, foi observado que a leucoantocianidina:

- reduziu de forma significativa a esteatose hepática, de acordo com a análise

macroscópica, microscópica e análise do escore de EHNA;

- não foi capaz de reduzir significativamente o peso dos animais nem os níveis

séricos de colesterol total, LDL, HDL, VLDL, lipídeos totais, triglicerídeos e TGP, mas

teve capacidade de reduzir os níveis de TGO de forma significativa.

65

8 OBRAS CITADAS

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73

9 ANEXOS

9.1 PROTOCOLO DE COLABORAÇÃO CIENTÍFICA

74

9.2 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS

75

9.3 PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFAL

76

9.4 COMUNICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFF

77

9.5 ESCORE DE ATIVIDADE DA ESTEATOSE HEPÁTICA NÃO ALCOÓLICA

De acordo com (Kleiner et al. , 2005).

reginaldo franklin efeitos da leucoantocianidina …

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