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Acta Ortopédica Brasileira
ISSN: 1413-7852
Sociedade Brasileira de Ortopedia e
Traumatologia
Brasil
Carvalho Leite de, Daniela Cristina; Cliquet, Alberto
Ação do ultra-som de baixa intensidade sobre ossos de ratas osteopênicas
Acta Ortopédica Brasileira, vol. 11, núm. 1, janeiro-março, 2003, pp. 17-24
Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia
São Paulo, Brasil
Disponível em: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=65711103
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ACTA ORTOP BRAS 11(1) - JAN/MAR, 2003 17
DANIELA CRISTINA LEITE DE CARVALHO1, ALBERTO CLIQUET JR2
ARTIGO ORIGINAL
SUMMARY
Several studies have already shown the beneficial effectsof low intensity pulsed ultrasound on osteogenesis in fractu-re cases. However, few reports have related the ultrasoundaction in bone with some injury but without fracture. Thus, weinduced a rat osteopenia model by ovariectomy and the pro-ximal third of rat femur was stimulated by ultrasound (200msburst of 1.5 MHz sine waves repeated at 1.0 kHz, 30mW/cm2,SATA) for 20 min/day, during 20 days.
After the treatment period, the body weight was signifi-cantly higher in the non-treated group than the treated one.No significant difference in bone mineral content was detec-ted among the groups (p>0.05). Also, no significant diffe-rence was noted in the mechanical properties of the femoraldiaphysis. However, histologic investigations showed that thetreated femur presented less microarchitectural deteriorationthan the non-treated group. Moreover, it was demonstratedthat the treated group did show recent bone formation whichwas not there in the non-treated group. These results su-ggest that the low intensity ultrasound can interfere in a posi-tive way on osteoporosis.
Key words: Ultrasonics; Bone diseases, Metabolic;Calcium/analysis; Phosphorus/analysis
INTRODUCTION
Osteoporosis is a metabolic bone disorder affectingmainly the aged population, generally post-menopausal wo-men due to lack of ovarian hormone. Bony mass reduction,mainly observed in cancellous bone, that is caused by incre-
Trabalho recebido em 29/09/2002. Aprovado em 27/11/2002
Trabalho realizado na Escola de Engenharia de São Carlos - USP, no Curso de PósGraduação Interunidades Bioengenharia e no Departamento de Ortopediae Traumatologia da Faculdade de Ciências Médicas - UNICAMP
1- Fisioterapeuta. Mestre em Bioengenharia. Aluna de Doutorado do Cursode Pós-Graduação em Cirurgia - UNICAMP2- Professor Titular EESC - USP / FCM - UNICAMP
Endereço para correspondência: Av. Trabalhador Sãocarlense, 400CEP 13566-590 - São Carlos - SPE-mail: [email protected]
Ação do ultra-som de baixa intensidade sobreossos de ratas osteopênicas
Low intensity ultrasound effects over osteopenicfemale rats bones
RESUMO
Neste estudo, nós analisamos a ação do ultra-som pul-sado de baixa intensidade (30mW/cm2, freqüência de repe-tição de 1Khz e ciclo de trabalho de 20%) durante 20 diasconsecutivos, por 20 minutos diários, como método nãoinvasivo, em modelo de ratas osteopênicas. A estimulaçãoultra-sônica foi realizada na região proximal dos fêmures,bilateralmente.
Apesar dos resultados quantitativos do conteúdo mine-ral ósseo (cálcio e fósforo) não terem demonstrado dife-renças significativas (p>0,05) entre os grupos tratado e nãotratado, as investigações histológicas mostraram que o fê-mur tratado apresentou uma menor deterioração microar-quitetural que o grupo não tratado, além da ocorrência deneoformação óssea, a qual não foi observada no gruponão tratado. Os resultados sugerem que o ultra-som pulsa-do de baixa intensidade pode interferir positivamente sobrea osteoporose.
Descritores: Ultrasom; Osteopatias metabólicas; Cálcio/análise;Fósforo/análise
INTRODUÇÃO
A osteoporose é uma doença óssea metabólica, queatinge principalmente a população idosa, geralmente mu-lheres pós-menopausais em decorrência da deficiência dohormônio ovariano. A diminuição de massa óssea, princi-palmente observada nos ossos trabeculares, causada porum aumento da atividade de reabsorção óssea pelos oste-oclastos torna os ossos mais frágeis e mais suscetíveis afraturas(6).
Work performed at Escola de Engenharia de São Carlos - (USP) at the Post-GraduateCourse in Interunidades Bioengenharia and at the Ambulatory of the Orthopedicsand Traumatology Department of Faculdade de Ciencias Médicas - UNICAMP.
1- Physiotherapist. Master in Bioengineering. Doctorate Student at Post-GraduationCourse in Surgery - UNICAMP2- Full Professor EESC - USP / FCM - UNICAMP
Address: Av. Trabalhador Sãocarlense, 400CEP 13566-590 - São Carlos - SPE-mail: [email protected]
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Desta forma, tratamentos para prevenir ou estabilizar o qua-dro de osteoporose são importantes. No entanto, os tratamentosexistentes para a osteoporose são, predominantemente, farma-cológicos, os quais em alguns casos são contra-indicados oumal tolerados por determinados pacientes. Assim, técnicas alter-nativas, não invasivas, são boas escolhas na tentativa de contro-lar a perda de massa óssea.
Baseado em princípios biomecânicos, em que cargamecânica promove deformação no osso e consequente-mente gera um estímulo para uma resposta óssea local, jápostulado por WOLLF em 1870, a utilização do ultra-somde baixa intensidade é uma alternativa para o estímulo deformação de osso, uma vez que o ultra-som é uma formade energia mecânica que gera microdeformações locais nosossos, de maneira similar às ocorridas sob força externa(2).Assim, a terapia com ultra-som, ao promover efeitos bené-ficos na estrutura óssea, pode ser utilizada em doençasque apresentam problemas na manutenção da massa ós-sea, como nos casos de osteoporose. Muitos estudos jámostraram a eficácia do ultra-som de baixa intensidade naaceleração do reparo de fraturas ósseas recentes, em ca-sos de não-união óssea e em pseudoartrose(3,8,9,15,17). Tam-bém foi demonstrado o efeito benéfico do ultra-som de baixaintensidade em casos de fratura em pacientes com doen-ças que prejudicam a recuperação óssea, como a osteo-porose e diabetes(10,16). No entanto, não existem muitos es-tudos relatando o efeito do ultra-som de baixa intensidadeem casos de osteoporose sem a ocorrência de fraturas.
Atualmente, o modelo de rata ovarectomizada tem ga-nhado ampla aceitação para o estudo das repercussões dadeficiência de hormônio ovariano sobre o sistema esquelé-tico, bem como para analisar as respostas ósseas aos no-vos tratamentos.
O presente estudo foi dividido em duas partes. Na pri-meira parte foi avaliada a eficácia de um protocolo de 30dias para a indução de osteopenia no osso femural de ra-tas, após a realização da histerectomia e ovarectomia bila-teral. Na segunda parte, avaliamos a eficiência do ultra-sompulsado de baixa intensidade (intensidade de 30mW/cm2,freqüência de 1,5 MHz, freqüência de repetição de 1 KHz,ciclo de trabalho de 20%) sobre a região proximal dos fê-mures osteopênicos das ratas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a primeira parte, foram utilizadas 11 ratas madurasisogênicas da raça Holstman (Rattus norvegicus albinus),com cerca de 200g de massa corpórea. As ratas foramseparadas em 2 grupos: grupo controle (5 animais), com-posto por ratas não ovarectomizadas e grupo de ratas ova-rectomizadas (6 animais). As operações foram realizadassob anestesia intramuscular, composta por Virbaxil 2%, nadose 0,04 ml/100g de massa corpórea e por Francotar nadose de 0,08 ml/100g de massa corpórea. Ovarectomia bi-lateral foi realizada em 6 ratas. Após o procedimento cirúr-gico, as ratas foram alimentadas ad libitum durante 30 dias.Foram ponderadas as massas corpóreas das ratas no iní-
ase in bony reabsorption by osteoclasts changes bones morefragile and subject to fractures(6).
Considering this, treatments preventing and stabilizing thispicture are important. However, treatments currently existingfor osteoporosis are predominantly pharmacological, and insome cases contra-indicated or poorly tolerated by somepatients. Thus, alternative noninvasive techniques are a goodchoice for controlling bony mass losses.
Based on biomechanical principles, where mechanicalload induces bone deformation and consequently causesstimulus for a local bony response, already presented byWOLLF in 1870, the use of low intensity ultrasound is an alter-native for bone formation stimulation, since ultrasound is amechanical energy type generating local bone micro-defor-mations, similarly to those occurring under external forces(2).Thus, therapy with ultrasound, by promoting beneficial effectsover bony structure may be used in diseases challenging theability to keeping bony mass, such as in osteoporosis. Manystudies have already demonstrated the efficacy of low inten-sity ultrasound in accelerating healing of recent bone fractu-res, in cases of non-union and in pseudarthrosis(3,8,9,15,17). Itwas also demonstrated the beneficial effect of low intensityultrasound in cases of patients with diseases impairing bonyrecovery, such as osteoporosis and diabetes(10,16). However,there are few studies reporting effects of low intensity ultra-sound in cases of osteoporosis without fractures.
Currently, the model of ovariectomized rat is gaining wideacceptance in the study of reflexes of lack of ovarian hormo-ne on skeletal system, as well as in evaluation of bony res-ponses to new treatments.
This study was divided into two parts. In the first it wasevaluated the efficacy of a 30-day protocol for induction ofosteopenia in femoral bone of female rats, after hysterec-tomy and bilateral ovariectomy. In the second, it was evalua-ted the efficiency of pulsed low intensity ultrasound (intensityof 30 mW/cm2, frequency of 1.5 MHz, repetition frequency of1 KHz, work cycle of 20%), over the proximal region of oste-openic femurs of female rats.
MATERIAL AND METHODS
For the first part were used 11 mature isogenic femaleHolstman rats (Rattus norvegicus albinus), with about 200 gof body mass. The animals were divided into two groups:control (5 animals) with non-ovarectomized animals and agroup of 6 ovarectomized animals. The surgeries were per-formed under intramuscular anesthesia with Virbaxil 2% in a0.04 ml/100 g of body mass and by Francotar in a 0.08 ml/100 g of body mass doses. Bilateral ovarectomy was perfor-med in 6 female rats. After the surgery, the animals were feedad libitum for 30 days. Body mass of the animals were evalu-ated in baseline and at the end of the experiment. In the 31st
day the animals were sacrificed, their left femur removed, cle-aned, washed in deionized water and kept in 10% formal-dehyde solution for 48 hours. After this period the boneswere standardized at 1.5 cm length from the great trochanterand calcined, dissolved in chloride acid at 37% and diluted in
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cio e no final do experimento. No 31º dia, as ratas foramsacrificadas, seus fêmures esquerdos retirados, limpados,banhados em água deionizada e mantidos em formaldeído10%, durante 48 horas. Após este período, estes ossos fo-ram padronizados em 1,5 cm de comprimento, a partir dotrocânter maior e foram calcinados, solubilizados em ácidoclorídrico a 37% e diluídos em 100ml. A realização destaetapa viabilizou a análise do conteúdo mineral ósseo. Paraanálise quantitativa de cálcio foi utilizado espectrofotôme-tro de absorção atômica por chama e para a análise defósforo foi utilizado espectrofotômetro de absorção mole-cular em sistema de análise por injeção em fluxo (FIA). Osfêmures direitos foram descalcificados através de MORSE(Citrato de Sódio à 20% e Ácido Fórmico à 50% - partesiguais de cada), desidratados, diafanizados e incluídos emparafina. Para cada peça foram realizados sete cortes seri-ados longitudinais (6 mm de espessura) da região proximaldo fêmur usando micrótomo, os quais foram excluídos.Seqüencialmente, foram realizados dois cortes seriados de50 mm de espessura, para cada peça. Após a realizaçãodos cortes, estes foram desparafinizados, secos em estufae fixados no suporte utilizado para a realização da análiseem microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os cortesforam metalizados com ouro para facilitar a condutibilidadeelétrica. Foi utilizado um equipamento LEO modelo 440.
As diferenças nas massas corpóreas em ambos os gru-pos foram avaliadas com o teste T, utilizando níveis de sig-nificância de 5%.
Na segunda parte do estudo, foram utilizadas 34 ratasisogênicas da raça Holstman (Rattus norvegicus albinus),com cerca de 200g de massa corpórea. Foi utilizado o mes-mo protocolo cirúrgico da primeira parte do estudo. Devi-do à eficácia do protocolo de ovarectomia na utilização de30 dias para a indução de osteopenia, os tratamentos co-meçaram no 31° dia após a cirurgia. As ratas foram dividi-das em dois grupos: grupo tratado (25 animais) e grupoplacebo (9 animais). No grupo experimental tratado, as ra-tas foram submetidas a aplicações de ultra-som com inten-sidade espacial e temporal média de 30mW/cm2. O equipa-mento utilizado foi fixado na mesa de suporte, onde as ra-tas eram imobilizadas. O cabeçote possuiu dimensões nor-mais para possibilitar que a aplicação de ultra-som fosserealizada ao mesmo tempo, em ambas patas traseiras,abrangendo a região desde a cabeça femural até terço dis-tal do fêmur. Foi utilizado gel para facilitar a condução docampo ultra-sônico. Calibração do equipamento foi realiza-da previamente à sua utilização no experimento.
Os animais do grupo placebo não foram submetidos aotratamento ultra-sônico, mas sofreram as mesmas interferênci-as que o estresse pode causar aos animais. Para isso, perma-neceram durante 20 minutos imobilizados por 20 dias conse-cutivos. O mesmo período usado para o tratamento com oultra-som nas ratas do grupo tratado.
Os sacrifícios ocorreram 1 dia após o término do tratamen-to, seus fêmures esquerdos retirados e submetidos ao ensaiomecânico de flexão de três pontos para determinar as proprie-dades mecânicas dos ossos. Foi utilizado equipamento MTS
100 ml. This phase allowed the evaluation of the bony mineralcontent. For quantitative analysis of calcium it was used aflame atomic absorption spectrophotometer and for phos-phorus analysis a molecular absorption in an flow injectionanalysis (FIA) system spectrophotometer. The right femurswere decalcified by MORSE (Sodium citrate 20% and Formicacid 50% - equal parts) dehydrated and included in paraffin.For each piece seven serial longitudinal cuts were performed(6 mm thick) of proximal femur region by means of a microto-me that were excluded. Sequentially were performed two se-rial cuts of 50 mm thick for each piece. After the cuts, thesewere de-paraffined, dried in stove and fixed to a support usedfor electronic microscopic evaluation. The cuts were goldmetallized in order to facilitate electrical conduction. A LEOmodel 440 equipment was used.
The differences in body mass in both groups were evalu-ated with T test, with a 5% significance level.
In the second part of the study, 34 isogenic female Holst-man rats (Rattus norvegicus albinus), with about 200 mg ofbody mass, were used. Se same surgical protocol of the firststudy part was performed. Due to the efficacy of the 30 daysovariectomy protocol for induction of osteopenia, the treat-ments started at the 31st day after the surgery. The rats weredivided into two groups: a group treated (25 animals) and acontrol group (9 animals). In the treated group, the rats un-derwent ultrasound with a spatial and temporal intensity of 30mW/cm2 in average. The equipment used was fixated to thesupport table, where the rats were immobilized. The headhad normal size allowing the ultrasound application to beperformed at the same time in both hind-feet involving a regi-on from femoral head to distal third of femur. A gel was usedin order to enable the ultrasound field conduction. The equi-pment was calibrated previously to its use in the experiment.
The animals in control group did not underwent ultrasoundtreatment, however suffered the same interference stress cancause to animals. For this, they were immobilized for 20 mi-nutes during 20 consecutive days, that is, the same as withthe treated animals.
Animals were sacrificed 1 day after the treatment ended,and their left femurs removed and submitted to a three-pointflexion mechanical assay in order to determine their mechani-cal properties. A MTS TestStart II equipment was used for themechanical assay. The bones were laid over their extremitiesover two supports with 18 mm distance. The speed of loadapplication was 5 mm/min using a 100 Kgf load cell. Foreach load increase applied to the bone, it was retrieved thedeformation caused, allowing to plot a load versus deforma-tion curve. Through this curve, it was possible to evaluatemechanical properties such as maximal deformation, rigidity,resiliency and tenacity (Figure 1). The parameters were calcu-lated by means of the Mathematics 2.2 software. After theflexion assay, the femurs were standardized at 1.5 cm lengthfrom the great trochanter and prepared for a quantitative analy-sis of calcium and phosphorus. In each pot were placed twobones, except in some cases in it was necessary to put threebones. The right femurs were taken apart for common lightmicroscopy and electronic microscopy. After preparation, the
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modelo TestStart II para ensaio mecâ-nico. Os ossos foram apoiados emsuas extremidades, sobre dois supor-tes distanciados 18mm. A velocidadede aplicação da carga foi 5mm/min eutilizada célula de carga de 100 Kgf.Para cada aumento de carga aplicadano osso se obtém a deformação ge-rada, o que possibilita a construçãodo gráfico carga versus deformação.Através do gráfico foram analisadaspropriedades mecânicas como: defor-mação máxima, rigidez, resiliência e te-nacidade (Figura 1). Os parâmetrosforam calculados usando o softwareMathematics, versão 2.2. Após o en-saio de flexão, os fêmures foram pa-dronizados em 1,5 cm de comprimen-to, a partir do trocânter maior e prepa-rados para análise quantitativa de cál-cio e fósforo. Em cada cadinho fo-ram colocados dois ossos, excetoem alguns casos em que foi neces-sário colocar três ossos. Os fêmu-res direitos foram separados paraanálise de microscopia de luz co-mum e MEV. Após o preparo das pe-ças, foram realizados sete cortes se-riados longitudinais (6 mm de espes-sura) da região proximal do fêmurusando micrótomo, sendo as lâmi-nas coradas com Tricômico de Mas-son (TM). Seqüencialmente, foramrealizados dois cortes seriados de50 mm de espessura, os quais fo-ram preparados para serem anali-sados por MEV. Foram ponderadasas massas corpóreas das ratas noinício e no final do experimento.
Para comparar as diferenças de mas-sas corpóreas das ratas foi utilizado testeT e para comparar as variáveis mecâni-cas e a quantidade de material mineral ós-seo (cálcio e fósforo) entre os grupos es-tudados foi aplicada a análise de variância(ANOVA). Os dados submetidos à análi-se estatística utilizaram níveis de significância de 5%.
RESULTADOS
Primeira parte do estudo: No momento do sacrifício, ob-servou-se um ganho significativo das massas corpóreasdas ratas ovarectomizadas comparado com o das ratascontrole (Tabela 1).
Através da análise quantitativa de cálcio e fósforo dos fêmuresdos animais dos dois grupos experimentais, observou-se que asratas do grupo controle apresentaram maior quantidade de cálcio
Figura 1 - Exemplo de gráfico carga versusdeformação. LP: limite proporcional (ponto
final da região elástica); LR: limite de ruptura(limite máximo); área do triângulo O-A-LP:
resiliência; tangente do ângulo O: rigidez; áreatotal sob a curva O-LP-LR: tenacidade.Figure 1 - Graphic example of load vs
deformation. LP: proportional limit (end pointof elastic region); LR: rupture limit (maximum
limit); triangle O-A-LP: resiliency; tangentto O angle: rigidity; total área under the
curve O-LP-LR: tenacity.
Tabela 1 - Valores médios e desvios padrões(DP) das massas corpóreas dos dois
grupos experimentais.Table 1 - Mean and standard deviation (DP)
values of body mass of both experimental groups.
Figura 2 - Quantidades de cálcio e fósforo emg/kg dos grupos controle e ovarectomizado.
Figure 2 - Quantities of calcium andphosphorus in g/kg of the control and
pieces were cut longitudinally (6 mmthick) from proximal femur region bymeans of a microtome, and the flakesstained with Masson Tricromion.
Sequentially, serial cuts were per-formed at 50 ìm thick, and preparedto be analyzed under electronic mi-croscopy. The body mass were wei-ghted from baseline to the end of theexperiment.
In order to compare the female ratsbody mass it was used the T test; forcomparing mechanical variables andbony mineral contents (calcium andphosphorus) between the groups, thevariance analysis (ANOVA). Significan-ce level was 5%.
RESULTS
First study part: at the time ofthe sacrifice it was observed a signi-ficant increase in body mass of ova-rectomized female rats as shown in(Table 1).
By means of a quantitative analysisof calcium and phosphorus of the fe-mur of animals from both experimentalgroups, it was observed that rats fromcontrol group had a higher amount ofcalcium and phosphorus (average: cal-cium, 180.59 g/kg; phosphorus 90 g/kg) in comparison to the group of ova-rectomized rats (average: calcium,140.94 g/kg and phosphorus, 73.49 g/kg). There was a 21.956% reduction incalcium and 18.34% in phosphorus inthe ovarectomized rats in comparisonto the control ones (Figure 2).
By means of electronic microsco-py it was possible to compare thestructural differences between femurof control and ovarectomized groups( Figures 3) shows the differences in
cancellous structures between the groups. Through the com-parison it is possible to observe that the bony trabeculae inovarectomized female rats are more spaced and with redu-ced conectivities in comparison to the normal rats group,characterizing a larger bony reabsorption by osteoclasts intrabecullary plates.
Second part of the study: (Table 2) presents the meanand SD values of the body mass measurements of femalerats in control and treated groups, in baseline and at the endof the trial. Statistically significant differences (p= 0.005) inbody mass gain between both groups were observed, larger
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e fósforo (médias: 180,59 g/kg de cálcio; 90g/kg de fósforo) quando comparados com ogrupo de ratas ovarectomizadas (médias:140,94 g/kg de cálcio e 73,49 g/kg de fósfo-ro). Ocorreu diminuição de 21,956% de cálcioe 18,34% de fósforo nas ratas ovarectomiza-das comparado com as ratas do grupo con-trole (Figura 2).
Através da microscopia eletrônica de var-redura foi possível comparar as diferençasestruturais dos fêmures das ratas dos gruposcontrole e ovarectomizado. A (Figura 3) mos-tra as diferenças, entre os grupos, da estrutu-ra trabecular dos fêmures das ratas. Atravésde comparação, é possível observar que astrabéculas ósseas existentes no fêmur de rataovarectomizada estão mais espaçadas e comsuas conectividades reduzidas comparadocom o grupo de ratas normais, caracterizan-do uma maior reabsorção óssea pelos oste-oclastos nas placas trabeculares.
Segunda parte do estudo:A (Tabela 2) mos-tra os valores médios e DP das medidas demassa corpórea das ratas dos grupos placeboe tratado no início e no final do experimento. Ob-servam-se diferenças estatisticamente significa-tivas (p = 0.005) no ganho de massa corpóreaentre os dois grupos, sendo maior nas rataspertencentes ao grupo placebo.
Através do ensaio de flexão foi possívelconstruir gráficos de carga versus deforma-ção (Figuras 4 e 5) e, assim, obter e compararos valores das propriedades mecânicas dasdiáfises femorais dos ossos de diferentes gru-pos experimentais. A tabela 3 mostra os valo-res médios e os DP das propriedades mecâ-nicas dos fêmures das ratas dos dois gruposexperimentais: placebo e tratado. Observa-se que não ocorreram diferenças estatistica-mente significativas quando relacionadas asvariáveis mecânicas e os grupos estudados (carga máximap=0,5603; deformação máxima p=0.1551; rigidez p=0.0546; re-siliência p=0.5835; tenacidade p=0.2926).
As análises quantitativas de cálcio e fósforo realizadas mos-traram que o grupo de ratas ovarectomizadas submetidas aotratamento de ultra-som de baixa intensidade alcançaram valo-res não estatisticamente significativos comparado com os va-lores obtidos nas ratas do grupo placebo (p = 0.734 paracálcio; p = 0.396 para fósforo). A tabela 4 mostra os valores decálcio e fósforo dos dois grupos experimentais.
As figuras 6-AB e 6-CD comparam a região da cabeça femuralentre o grupo placebo e tratado. A coloração com tricrômico deMasson possibilita estudar a idade óssea, sendo que ossos ma-duros se coram em azul e os ossos imaturos se coram em ver-melho. É possível observar que, no grupo placebo a matriz ósseaé predominantemente formada por osso maduro, não indicando
Figura 3 - A) Microscopia eletrônicade varrredura da cabeça femural de
rata controle; B) Microscopiaeletrônica de varredura da cabeçafemural de rata ovarectomizada.
Elipses indicam diferenças estruturaisentre os grupos. Observam-se poros
mais profundos e de maioresdimensões no grupo ovarectomizado
comparado com grupo controle.Aumento de 100x.
Figure 3 - A) Electronic microscopy ofcontrol female rat femoral head; B)
Electronic microscopy ofovarecnomized female rat femoral
head. The ellipsis indicate the structuraldifferences between the groups. Deeper
and larger dimension pores areobserved in the ovarectomized group in
comparison to the control group.Magnification 100x.
in the control animals.
By means of the flexion assay it waspossible to plot curves load versus defor-mation (Figures 4 and 5), so obtaining andcomparing the values of mechanical pro-perties of femoral shafts from different ex-perimental groups. Table 3 shows the meanvalues and SD of mechanical properties offemale rats in both groups: control and tre-ated. It is observed that there were no sta-tistically significant differences when me-chanical variables were compared (maxi-mum load p = 0,5603; maximum defor-mation p=0.1551; rigidity p=0.0546; resi-liency p=0.5835; tenacity p=0.2926).
The quantitative calcium and phospho-rus analysis showed that the group of ova-rectomized female rats that underwent lowintensity ultrasound treatment reached non-statistically significant values in compari-son to those found in control animals (cal-cium, p=0.734; phosphorus, p=0.396).(Table 4) shows calcium and phosphorusvalues in both groups.
Figures 6-AB and 6-CD compare thefemoral head region between the controland treated groups. Masson Tricromiumstaining allows studying the bony age.Mature bone is stained in blue and imma-ture ones in red. It is possible to observethat, in control group, bony matrix is pre-dominantly formed by mature bone, withoutindication of recent bony formation. In thetreated group, there are neo-bony formati-on zones, indicating active osteoblasts.The increase in the osteoblastic activity wassubjectively observed, without the use ofmorphometric methods.
Images obtained by electronic micros-copy show structural differences of the fe-
moral head region between control and treated group. It ispossible to observe structural differences between the expe-rimental groups, with a larger loss of trabecullar bone in con-trol group (Figures 7 and 8).
DISCUSSION
Ovarectomized female rats is an useful model due to pre-senting biological mechanisms that are similar to those oc-curring in osteoporotic women(11,14). This study showed thatthe ovarian hormone deficiency for 30 days leads to bonyloss in mature female rats, and a body mass increase that isstatistically significant in comparison to the control group (p< 0.05), supporting the literature reports showing that ovari-ectomy causes metabolic changes responsible for a pro-nounced increase in food intake and body mass (as a con-
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formação óssea recente. No grupotratado, observam-se regiões comneoformação óssea, o que indica os-teoblastos ativos. O aumento da ati-vidade osteoblástica foi subjetivamen-te observado, não se utilizando mé-todos morfométricos.
As imagens obtidas por MEVmostram as diferenças estruturais daregião da cabeça femural entre osgrupos placebo e tratado. É possívelobservar diferenças estruturais entreos grupos experimentais, com maiorperda de osso trabecular no grupoplacebo (Figuras 7 e 8).
DISCUSSÃO
A rata ovarectomizada é um mo-delo útil devido ao fato de apresentarmecanismos biológicos similaresaqueles ocorridos em mulheres os-teoporóticas(11,14). O presente estudomostrou que a deficiência do hormô-nio ovariano durante 30 dias promo-ve perda óssea nas ratas maduras,além de um ganho de massa corpó-rea, estatisticamente significativo,quando comparado com o grupocontrole (p < 0,05), corroborandocom os relatos da literatura que de-monstraram que a ovarectomia pro-voca alterações metabólicas respon-sáveis pelo aumento pronunciado daingestão alimentar e massa corpórea(em conseqüência do aumento degordura corpórea)(5,18,19). O ganho demassa corpórea é maior em ratasovarectomizadas comparado comratas intactas mesmo em condiçõessimilares de ingestão alimentar(5,13).
Através da análise por MEV foipossível observar diferenças estrutu-rais entre os fêmures dos grupos con-trole e ovarectomizado. Estes acha-dos roboram os estudos que tam-bém observaram perda óssea trabe-cular em conseqüência da carênciade hormônio ovariano(1,6,7,18).
Após analisar a eficiência do proto-colo de ovarectomia, foi estudado oefeito do ultra-som de baixa intensida-de sobre ossos osteopênicos. Os nos-sos resultados mostraram um ganhode massa corpórea estatisticamente significativo no grupo experi-mental placebo (p = 0,005) quando comparado com o grupo trata-do, o que estabelece uma correlação entre o ultra-som e um menor
Tabela 2 - Valores médios e DP das medidascorpóreas dos dois grupos experimentais.
Table 2 - Mean and DP values of body measures ofboth experimental groups.
Tabela 3 - Propriedades mecânicas dos fêmures dasratas dos dois grupos experimentais (média ± DP).
Table 3 - Mechanical properties of female ratsfemurs from both experimental groups (mean + DP).
Tabela 4 - Valores médios e DP das quantidades decálcio e fósforo dos fêmures das ratas dos dois
grupos experimentais.Table 4 - Mean and DP values of the amounts of
calcium and phosphorus of female rats femurs fromboth experimental groups.
Figure 4 - Gráfico FxD dos fêmures das ratasdo grupo placebo (média ± DP).
Figure 4 - FxD graphic of placebo groupfemale rats femurs (mean + SD).
sequence of increase of bodyfat)(5,18,19). The body mass increaseis higher in ovarectomized rats incomparison to intact female rats insimilar food-intake conditions(5,13).
By means of electronic micros-copy analysis it was possible toobserve structural differences be-tween the femurs of control andovarectomized groups. The findin-gs support the results of studiesthat also found trabecullar boneloss in consequence of lack of ova-rian hormone(1,6,7,18).
After the analysis of the effici-ency of the ovariectomy protocol,it was studied the effect of low in-tensity ultrasound on osteopenicbones. Our results showed an in-crease in body mass that was sta-tistically significant in the controlgroup (p = 0.005) in comparisonto the treated group, establishing acorrelation between ultrasound anda lower body mass increase. Ho-wever, there were not found in theliterature works correlating ultra-sound to body mass in ovarecto-mized animals.
Flexion test results had no sta-tistically significant differences (p >0.05) in relation to the several stu-died mechanic variables. The treat-ment did not interfere in femoralshaft mechanic properties. Ultra-sound may have not stimulated anincrease in the bony mineral con-tent, and consequently in femoralshaft bony endurance, due to a lo-wer change in bony metabolism inregions with predominance of cor-tical bone, making them less sen-sitive to ultrasound stimuli.
Quantitative results of mineralcontent did not show a significantincrease of calcium and phospho-rus in osteopenic bone of femalerats treated with low intensity ultra-sound in comparison to non-trea-ted control female rats. Neverthe-less this quantitative analysis failedto show statistically significant di-fferences (p > 0.05) in comparisonof the groups, qualitative findings
pointed to structural differences between the groups.
The histological analysis (stained with Masson Tricro-mium) showed bony neoformation in the treated group which
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ganho de massa corpórea. No entan-to, não foram encontrados na literatu-ra trabalhos relacionando o ultra-soma massa corpórea em animais ova-rectomizados.
Os resultados do teste de flexãonão apresentaram diferenças signifi-cativas (p > 0.05) quando relaciona-das as variáveis mecânicas aos gru-pos estudados. O tratamento não in-terferiu nas propriedades mecânicasda diáfise femural. O ultra-som talveznão tenha estimulado o aumento doconteúdo mineral ósseo e, conse-quentemente, da força óssea na diáfi-se femural devido à menor alteraçãodo metabolismo ósseo nas regiõescom predominância de osso cortical,o que as torna menos sensíveis ao estímulo ultra-sônico.
Os resultados quantitativos do conteúdo mineral não de-monstraram um aumento significativo de cálcio e fósforo nosossos osteopênicos das ratas tratadas com ultra-som de bai-xa intensidade comparado com ossos de ratas não tratadas.Embora esta análise quantitativa não tenha mostrado diferen-ças estatisticamente significativas (p>0.05) ao comparar osgrupos experimentais, os achados qualitativos apontaram di-ferenças estruturais entre os grupos.
Figura 5 - Gráfico FxD dos fêmures das ratasdo grupo tratado (média ± DP).
Figure 5 - FxD graphic of treated groupfemale rats femurs (mean + SD).
Figura 6 - A-B) Fotomiografia de tecido ósseo da região proximaldo fêmur de ratas do grupo placebo; setas indicam matriz óssea
formada por osso maduro (trabéculas totalmente coradas emazul); C-D) Fotomiografia de tecido ósseo da região proximal dofêmur de ratas do grupo tratado; as setas indicam neoformação
óssea (regiões trabeculares coradas em vermelho). Cortelongitudinal. Coloração TM. Aumento de 160x.
Figure 6 - A-B) Photomicrography of placebo group female ratsproximal femur bony tissue; arrows indicate bony matrix formed bymature bone (completely stained in blue); C-D) Photomicrography
of treated group female rats proximal femur bony tissue; arrowsindicate bony neoformation (trabecullary region stained in red).
Sagittal cut. Staining: TM. Magnification 160x.
was not observed in the controlgroup.
By means of electronic mi-croscopy it could be noticed thatin the group treated with low in-tensity ultrasound, bony micro-ar-chitecture appears to be morepreserved than the one in the con-trol group, with less bony trabe-cullar loss, making it to appear asmore dense.
From the quantitative and qua-litative obtained data, it can bepresumed that treatment with lowintensity ultrasound in osteopenicbone lead to an improvement inthe bony trabecullate. Qualitativeresults showed a slight improve-
ment of the architecture of treated bone. However, this incre-ase and/or preservation of the mineral content was not quan-
Figura 8 - A) Microscopia eletrônica de varredura da cabeçafemural de rata grupo placebo. As setas indicam maior destruição
da microarquitetura óssea comparado com o grupo tratado; B)Microscopia eletrônica de varredura da cabeça femural de rata
grupo tratado. Aumento 200x.Figure 8 - A) Electronic microscopy of placebo group female ratfemoral head. Arrows indicate a larger destruction of bony micro-
architecture in comparison to the treated group; B) Electronicmycroscopy of treated group female rat femoral head.
Magnification 200x.
Figura 7 - A) Microscopia eletrônica de varredura da cabeçafemural de rata do grupo placebo; B) Foto da cabeça femural do
grupo tratado. Elipses indicam a diferença estrutural entre osgrupos. Pode-se observar, no grupo placebo, trabeculado ósseo
mais separados. Aumento 100x.Figure 7 - A) Electronic microscopy of placebo group female rat
femoral head; B) Photography of femoral head of the treatedgroup. Ellipsis indicate the structural difference between the
groups. It can be observed in group placebo a more scarce bonytrabecullate. Magnification 100x.
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A análise histológica (coloração com Tricrômico de Mas-son) mostrou a ocorrência de neoformação óssea no grupotratado, a qual não foi observado no grupo placebo.
Através da MEV pôde-se notar que, no grupo tratado comultra-som de baixa intensidade, a microarquitetura óssea apa-renta estar mais preservada que a do grupo sem tratamento,com uma menor perda de trabeculado ósseo, o que torna oseu aspecto mais denso.
Através dos resultados quantitativos e qualitativos obtidos pode-se presumir que o tratamento com ultra-som de baixa intensidade emossos osteopênicos propiciou uma melhora do trabeculado ósseo.Os resultados qualitativos mostraram uma discreta melhora da ar-quitetura dos ossos submetidos ao tratamento. No entanto, esteaumento e/ou preservação do conteúdo mineral não foi observadode forma quantitativa. Assim, pode-se supor que a análise quantita-tiva não tenha apontado diferenças devido ao fato de existir grandequantidade de tecido neoformado, o qual ainda não está totalmentemineralizado(4,12). Talvez a duração do tratamento com ultra-som debaixa intensidade não tenha sido suficiente para possibilitar a totalmineralização das regiões estimuladas, o que não permitiu observarestas alterações de forma quantitativa.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP (#96/12198-2) e à CAPES pelo suporte financeiroconcedido.
titatively observed. Thus, it can be supposed that the quanti-tative analysis did not demonstrate any difference due to thepresence of large quantities of new formed not yet minerali-zed bone 4, 12. Perhaps the duration of the low intensity ultra-sound treatment was not sufficient for allowing the total mi-neralization of the stimulated regions, preventing these chan-ges to be quantitatively observed.
AKNOWLEGEMENTS
To FAPESP (#96/12198-2) and to CAPES for financialsupport.