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  • AVALIAO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM PULSADO DE BAIXA INTENSIDADE NA

    REGENERAO DE MSCULOS ESQUELTICOS COM VISTAS APLICABILIDADE EM CLNICA

    FISIOTERAPUTICA

    Dyjalma Antnio Bassoli

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao Interunidades (Escola de Engenharia de So Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de Qumica de So Carlos) da Universidade de So Paulo, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Bioengenharia.

    ORIENTADOR: Affonso Luiz Ferreira

    So Carlos

    2001

  • ii

    Ficha catalogrfica preparada pela Seo de Tratamento da Informao do Servio de Biblioteca EESC/USP

    Bassoli, Dyjalma Antnio B322a Avaliao dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade na regenerao

    de msculos esquelticos com vistas aplicabilidade em clnica fisioteraputica /Dyjalma Antnio Bassoli. - So Carlos, 2001.

    Dissertao (Mestrado) - Escola de Engenharia de So Carlos/Faculdade deMedicina de Ribeiro Preto/Instituto de Qumica de So Paulo-Universidade de SoPaulo, 2001.

    rea: Bioengenharia. Orientador: Prof. Dr. Affonso Luiz Ferreira.

    1. Regenerao muscular. 2. Ultra-som pulsado de baixa intensidade. I. Ttulo.

  • iv

    ...H quem diga que todas as noites so de sonhos. Mas h tambm quem garanta que nem todas, s as de vero. Mas no fundo isso no tem muita importncia. O que interessa mesmo no so as noites em si, so os sonhos. Sonhos que o homem sonha sempre. Em todos os lugares, em todas as pocas do ano, dormindo ou acordado...

    William Shakespeare

  • v

    Dedico este trabalho a toda a minha famlia que me incentivou e me auxiliou em todos os momentos. Em especial Maria Emlia, minha filha e Ana Paula, minha esposa, os maiores motivos para vencer este desafio.

  • vi

    Ao Dr. Affonso Luiz Ferreira.

    H pensamentos que so oraes, h momentos nos quais, qualquer que seja a posio do corpo, a alma est de joelhos.

    Victor Hugo.

  • vii

    Tudo que tenho recebi de Deus; - de que queres me envaidea?

    Zlkind Platigrsky

    Quando se consegue chegar ao final do trabalho proposto, pode-se sentir o peso das contribuies dadas por pessoas que ao ajudarem, mesmo supondo serem contribuies simples ou obrigaes, muitas vezes no avaliam o peso de suas atitudes para quem as recebeu. Minha profunda gratido a todos que, direta ou indiretamente, contriburam para a elaborao deste trabalho e particularmente:

    A Ana Rosa Crisci, pela ajuda em todas as etapas deste trabalho. No carter, na conduta, no estilo, em todas as coisas, a simplicidade a suprema virtude (Henry Wadsworth Longfellow).

    A Carmen Aparecida Malagutti Barros, que por um destes felizes acasos que ocorrem em nossas vidas, me solicitou companhia para estar em So Carlos em um determinado dia que viria a culminar neste trabalho.

    Ao Dr. Jos Marcos Alves que, naquele dia, sugeriu que eu procurasse pelo Dr. Affonso Luiz Ferreira.

    A Ana Maria Arajo Ferreira, Eunice de Oliveira Marques e Luiz Csar Manetti pelas aulas de fsica e matemtica gentilmente oferecidas.

    Ao amigo Paulo de Tarso Camilo de Carvalho pela ajuda nas primeiras tradues, e na sua pessoa estendo o agradecimento a todos aqueles que junto conosco estiveram cursando as disciplinas tericas na EESC e FMRP, especialmente Elizabete Dias Flausino Gaspar Gomes.

    Ao Jos Lus Soares obrigado pela disponibilidade e pelo excelente trabalho na preparao das lminas histolgicas.

    A Dr. Catarina Satie Takahashi do Departamento de Gentica da USP, pela cesso da colchicina.

    Ao Dr. Orivaldo Lopes da Silva pela ajuda quando da procura da colchicina e pelas informaes sobre o Ultra-som.

    Aos funcionrios das Secretarias da Bioengenharia (So Carlos e Ribeiro Preto), em especial D. Marielza e Janete.

    Aos diretores, docentes, discentes e funcionrios da UNICLAR Unidade Batatais SP, pelo apoio e pela confiana.

    A Regina M. R. Pupin pelo trabalho de digitao e formatao deste trabalho.

    A Prof. Carolina Luiza Pippa Tomazella Videira pelo auxlio na confeco do abstract.

    Fisioterapia que tem realizado os meus sonhos e os da minha famlia.

  • viii

    SUMRIO

    LISTA DE FIGURAS .............................................................................. 10

    LISTA DE TABELAS ............................................................................. 13

    RESUMO .................................................................................................. 14

    ABSTRACT .............................................................................................. 15

    1 INTRODUO ......................................................................... 16

    2 O ULTRA-SOM ........................................................................ 20 2.1 Histrico ..................................................................................... 20 2.2 Fsica bsica ............................................................................... 21 2.2.1 Ondas .......................................................................................... 21 2.2.2 Caractersticas das ondas ultra-snicas .................................... 22 2.2.2.1 Velocidade de propagao (c) .................................................... 24 2.2.2.2 Intensidade e campo acstico ..................................................... 24 2.2.23 Modos de propagao ................................................................ 26 2.2.3 Impedncia acstica .................................................................. 27 2.2.4 Reflexo e Refrao ................................................................... 28 2.2.5 Interferncias e Ondas Estacionrias ....................................... 29 2.2.6 Mecanismos de atenuao ......................................................... 30 2.2.7 Transdutores ............................................................................... 31 2.3 Mecanismos de interao do ultra-som com clulas e

    tecidos biolgicos ....................................................................... 32 2.3.1 Mecanismo trmico .................................................................... 33 2.3.2 Mecanismos no-trmicos .......................................................... 35 2.3.2.1 Cavitao .................................................................................... 35 2.3.2.1.1 Cavitao transiente .................................................................... 36 2.3.2.1.2 Cavitao estvel ......................................................................... 36 2.3.2.2 Fluxo e Microfluxo ..................................................................... 37 2.3.2.3 Piezoeletricidade ......................................................................... 38

  • ix

    3 O TECIDO MUSCULAR ......................................................... 40 3.1 Caractersticas morfolgicas e funcionais do msculo .......... 40 3.2 O msculo estriado esqueltico ................................................ 42 3.3 Visualizao das principais estruturas do tecido muscular .. 50

    4 REVISO DA LITERATURA ................................................ 54

    5 MATERIAL E MTODOS ..................................................... 61 5.1 Animais de experimentao ..................................................... 61 5.2 Tcnicas Operatrias ................................................................ 61 5.3 Estmulo ultra-snico................................................................. 64 5.4 Elaborao do tecido muscular para o estudo histolgico..... 65

    6 RESULTADOS .......................................................................... 67

    7 DISCUSSO .............................................................................. 79

    8 CONCLUSO ........................................................................... 86

    REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................... 87

  • x

    LISTA DE FIGURAS

    FIGURA 01- Modo de propagao das ondas ultra-snicas......................... 22

    FIGURA 02 - Deslocamento de uma partcula em funo da distncia e do tempo ..................................................................................... 23

    FIGURA 03 - Variao da intensidade acstica (I) nos campos ultra-snicos prximos e distantes, em meio aquoso. Na parte a tem-se a variao de I ao longo do eixo x, na parte b tem-se a variao de I ao longo do eixo y (perpendicular pgina), e na parte c, o valor da intensidade mdia ao longo do eixo y, para uma determinada posio .................... 25

    FIGURA 04 - Sinal senoidal pulsado............................................................. 26

    FIGURA 05 - Tipos de msculos .. 41

    FIGURA 06 - Esquema ilustrativo da origem embriolgica de uma fibra muscular esqueltica............................................................... 43

    FIGURA 07 - Esquema ilustrativo da arquitetura de um msculo esqueltico .............................................................................. 45

    FIGURA 08 - Esquema ilustrativo de um sarcmero e seus componentes ... 46

    FIGURA 09 - Corte longitudinal de uma fibra de msculo estriado ............ 50

    FIGURA 10 - Representativo de um corte transversal de fibras musculares estriadas .................................................................................. 52

    FIGURA 11 - Corte transversal de fibras musculares estriadas .................... 52

    FIGURA 12- Anestesia mediante injeo intraperitoneal ............................ 62

    FIGURA 13 - Inciso dos planos superficiais ............................................... 62

    FIGURA 14 - Demonstrativos das incises praticadas no msculo glteo maior ....................................................................................... 63

  • xi

    FIGURA 15 - Demonstrativo da sntese dos planos muscular e superficiais 63

    FIGURA 16 Sinal eltrico que excita o transdutor ultra-snico pulsado.... 64

    FIGURA 17 - O aparelho de ultra-som pulsado ............................................ 64

    FIGURA 18 - Figura representativa de estimulao esttica com o transdutor ultrasnico ............................................................. 65

    FIGURA 19 - As fotomicrografias A e C correspondem a reas de necrose de msculos de animais controles (sem estmulo) aps 3 e 6 dias, respectivamente. As fotomicrografias B e D representam as mesmas reas de necrose em msculos de animais estimulados por 3 dias com o ultra-som pulsado. Notar, acima, a intensa proliferao de vasos neoformados ( ),em meio a restos de fibras musculares ( ) e uma diminuio do infiltrado inflamatrio ( ). Alguns animais estimulados (B e D), j apresentam fibroblastos ( ) e incio de formao de miotubos ( ). Cortes de 6 m, corados pelo H.E. Aumento A, C e D de 192x; B de 384x; nos destaques aumento de 288x ....................................................................

    69

    FIGURA 20 - As fotomicrografias da figura ilustram o msculo de 2 animais controles (A e C) e de 2 animais estimulados pelo ultra-som pulsado (B e D) durante 10 dias. Nos animais controles h ainda necrose em evoluo (crculo), nos animais estimulados h intensa neovascularizao( ), incio de migrao de clulas satlites para restos de membranas, visando a formao de miotubos ( ) e a formao de fibroblastos( ).Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A, B e C de 192x e D de 480x................................................ 71

    FIGURA 21 - As fotomicrografias so demonstrativas das diferentes clulas de tecido muscular com 3 dias cujos ncleos em diviso foram bloqueados pela colchicina. Na foto A indicativo de msculo de animal no estimulado cuja leso acha-se em fase inflamatria ( ). Na foto B, de um animal estimulado, esto indicadas metfases de ncleos de clulas satlites em diviso (mioblastos) ( ). Na foto C mioblastos, tambm de animal estimulado, agregando-se para constituir miotubos ( ). Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento: A e C de 480x e B de 1200x ................................................... 74

    FIGURA 22 - Fotomicrografias de clulas musculares normais, distantes da rea de leso com 10 dias. A foto A mostra clulas musculares no estimuladas( ). A foto B, trata-se de msculo estimulado, mostrando um ncleo de clula satlite em metfase ( ). Notar que o ncleo acha-se isolado da sarcolema da clula. Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento de 480x.................................................................... 75

  • xii

    FIGURA 23 - Fotomicrografias de miotubos ( ) de msculos de animais estimulados pelo ultra-som pulsado por 10 dias consecutivos. Apresentam vrias metfases de ncleos de clulas miognicas ( ), miotubos com numerosos ncleos enfileirados. Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A e D de 480x; B e C de 192x....................................................

    76

    FIGURA 24 - Fotomicrografia de uma clula muscular estimulada por 10 dias e formando miofibrilas tendendo a se constituir numa clula muscular normal. Corte de 6m corados pelo H.E.. Aumento de 480x e no destaque de 720x................................ 78

    FIGURA 25 - Vasos neoformados induzidos pela ao do ultra-som pulsado em msculo estimulado por 3 dias, com conseqente acelerao da inflamao. Aumento de 1200x... 84

  • xiii

    LISTA DE TABELAS

    TABELA 01- Propriedades acsticas tpicas de vrios meios ...................... 12

    TABELA 02- Coeficiente de absoro () em diferentes tecidos para a freqncia de 1 Mhz ............................................................... 16

  • xiv

    RESUMO

    BASSOLI, Dyjalma Antnio. Avaliao dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade na regenerao de msculos esquelticos com vistas aplicabilidade em clnica fisioteraputica. So Carlos, 2001. 94 p. Dissertao (Mestrado em Bioengenharia) - Escola de Engenharia de So Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo.

    Foi utilizado na presente pesquisa o ultra-som pulsado de baixa

    intensidade, com a finalidade de avaliar, experimentalmente, seus efeitos fsicos

    sobre a regenerao do msculo esqueltico de ratos. Foram empregados no

    experimento 10 animais de ambos os sexos. Aps eleio do msculo glteo maior,

    foram feitas incises perpendiculares (ps anestesia) s suas fibras, alcanando

    aproximadamente dois teros de sua espessura. Seguinte s incises, realizou-se

    sntese do msculo e dos planos superficiais. Foi convencionado estudar os efeitos do

    ultra-som pulsado aps 3, 6 e 10 dias de estmulo. Antes do sacrifcio dos animais

    foi-lhes administrado Colchicina, com a finalidade de bloquear aa clulas em diviso.

    Mediante anlise histopatolgica comparativa dos msculos, constatou-se que

    enquanto nos animais no estimulados desenvolveu-se, aos 3 dias, reas de necrose e

    inflamao, naqueles estimulados houve uma diminuio das mesmas. Alm disso,

    nos animais estimulados, ocorre intensa neovascularizao nas reas de leso.

    Observou-se tambm uma migrao de clulas miognicas (satlites) para restos de

    bainhas remanescentes de fibras musculares regeneradas. Constatou-se um aumento

    de mioblastos com ncleos em metfase. Aos 10 dias, os animais estimulados

    exibiam inmeros miotubos com formao de miofibrilas, caracterizando clulas

    musculares em franca maturao. Longe da rea estimulada, o ultra-som foi capaz de

    induzir mitoses em clulas satlites. Notou-se que os efeitos do ultra-som pulsado

    aceleram a regenerao de fibras musculares mediante uma intensa neoformao

    vascular, acelerando a reparao da necrose e formao de mioblastos, os quais

    agregam-se em miotubos formando novas clulas.

    Palavras-chave : regenerao muscular; ultra-som pulsado de baixa intensidade.

  • xv

    ABSTRACT

    BASSOLI, Dyjalma Antnio. Evaluation of the effects of low intensity pulsed ultrasound on skeletal muscle regeneration having in mind its applicability to physiotherapeutic clinic. So Carlos, 2001. 94 p. Dissertao (Mestrado em Bioengenharia) - Escola de Engenharia de So Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo.

    It was used in the present research the low intensity pulsed ultrasound

    with aim of evaluating, experimentally, its physical effects on the regeneration of rats

    skeletal muscle. Ten male and female animals were used in this experiment. After

    election of the gluteus maximus muscle, perpendicular incisions were made (after

    anesthesia) in its fibers, reaching approximately two thirds of its thickness. After the

    incisions, a synthesis of the muscles and superficial plans was performed. It was

    established to study the effects of the pulsed ultrasound after 3, 6 and 10 day-stimuli.

    Before sacrificing the animals Colchinine was given aiming to block cells in

    division. By means of comparative histopathological analysis of the muscles, it was

    verified that in non-stimulated animals an area of necrosis developed in three days,

    while in those that were simulated there was a decrease of the same. Moreover, on

    the stimulated animals, there is intense neovascularization in the damaged area. A

    migration of myogenic cells (satellites) to rests of remaining sheaths from

    regenerated muscle fiber was also observed. It was verified an increase of myoblasts

    with nuclei in metaphase. In ten days, the stimulated animals showed countless

    myotubes with formations of myofibrils, characterizing mature muscle cells. Far

    from the stimulated area, the ultrasound was able of inducing mitosis to satellite

    cells. It was noticed that the effects of the pulsed ultrasound accelerate muscle fiber

    regeneration by means of an intense vascular neoformation, accelerating the

    restoration of the necrosis and the formation of myoblasts, which aggregates in

    myotubes forming new cells.

    Keywords: muscle regeneration; low intensity pulsed ultrasound.

  • 16

    1 INTRODUO

    A 22 de Agosto de 1999, o atleta americano Maurice Greene, conseguiu

    a marca de 9.80 s para percorrer os 100 metros em linha reta, tornando-se o homem

    mais veloz do mundo. Pode-se perguntar quais os fatores predisponentes para essa

    performance. A, perder-se-ia em uma srie de cogitaes, mas um dos fatores

    primordiais, certamente ser o fisiolgico: as fibras musculares deste fabuloso atleta,

    especialmente as das suas coxas, contriburam por um lapso de tempo extremamente

    curto, maior fora que de seus competidores.

    Naturalmente, se se voltar para o lado esportivo, as pesquisas esto quase

    sempre envolvidas na capacidade dos msculos adaptarem-se a diferentes desafios,

    quer o desempenho em uma maratona quer na exploso muscular na largada de uma

    corrida.

    O msculo esqueltico o tecido mais abundante do nosso corpo e um

    dos que podem causar grandes adaptaes. Exerccios podem aumentar o msculo

    em sua seco fisiolgica de 2 a 3 vezes, podem sofrer um encurtamento de cerca de

    20% em pouco tempo, garantindo um aumento do seu trabalho e da sua potncia.

    A quantidade e qualidade de fenmenos bioqumicos para que o msculo

    consiga tais adaptaes extremamente complexa. A composio material de um

    msculo proporciona-lhe a velocidade de contrao dependendo da qualidade e

    quantidade na composio de suas fibras. As fibras de contrao lenta dependem

    relativamente mais de um metabolismo aerbico eficiente, enquanto que as fibras

  • 17

    rpidas dependem mais de um metabolismo anaerbico. As fibras de contrao lenta

    destinam-se a trabalhos mais prolongados (como maratonas, natao em provas de

    longa distncia), enquanto que as fibras de contrao rpida esto relacionadas a

    trabalhos intensos e de curta durao. Na espcie humana h msculos que

    apresentam contingentes de fibras rpidas e lentas, na mesma proporo, como no

    quadrceps. Entretanto existem grandes variaes entre pessoas na proporo da

    qualidade de fibras. Existem tambm fibras hbridas contendo miosina das duas

    espcies em propores iguais.

    Duas das mais fundamentais reas do estudo em pesquisa sobre msculos

    esquelticos esto ligadas diretamente performance atltica, procurando a melhor

    maneira de hipertrofiar a musculatura e como esta atividade poderia converter um

    tipo de fibra em outro.

    O outro aspecto de grande relevncia o relacionado regenerao

    muscular correlacionada resposta das clulas satlites, ditas clulas precursoras

    musculares. Acredita-se que o exerccio rigoroso conduz ao aparecimento de micro-

    rupturas de fibras musculares. A rea danificada atrairia clulas precursoras

    (satlites), que se incorporariam ao tecido muscular e iniciariam a produo de

    protenas para preencher o intervalo lesado. Estes ncleos tornar-se-iam indistintos

    dos ncleos prprios das clulas musculares. Com esses ncleos adicionais, as fibras

    ficariam aptas a produzir mais protenas e criar novas miofibrilas. A criao de

    protenas seria decorrente de gene nuclear e o processo mediante o qual a informao

    passaria do ncleo para o citoplasma, onde a protena dever ser produzida inicia

    com uma transcrio (ANDERSEN et al., 2000).

    Desde 1960, pesquisas foram conduzidas no sentido de converter fibras

    lentas em fibras rpidas (BUELLER et al. apud ANDERSEN et al., 2000) mediante

    inverso de inervao procurando transpor nervos destinados a msculos de fibras

    lentas para msculo de fibras rpidas de modo a controlar fibras de tipos opostos. Os

    autores relatam que um componente da molcula de miosina, a cadeia denominada

    pesada, determina as caractersticas funcionais da fibra muscular. Em um adulto, esta

    cadeia pesada existe em trs variedades diferentes, que so designadas como I, IIa,

  • 18

    IIx. As fibras do tipo I, tambm so conhecidas como fibras lentas; as fibras tipo IIa

    tipo IIx so chamadas fibras rpidas. So assim classificadas por uma boa razo: a

    velocidade de contrao mxima da fibra tipo I aproximadamente um dcimo da

    fibra tipo IIx. A velocidade da fibra tipo IIa est entre as de tipo I e IIx.

    Pesquisadores procuraram demonstrar se a possibilidade de fibras

    musculares transmudarem-se em tamanho e tipo, referida como plasticidade

    muscular, fosse tambm aplicvel ao homem. Um exemplo extremo o caso de

    paraplgicos, sem estmulo muscular levado a uma perda extrema de tecido. Mas,

    surpreendentemente, o tipo de msculo muda dramaticamente. Estes indivduos

    paralisados experimentam um decrscimo agudo de quantidade de miosina lenta,

    enquanto que a quantidade de miosina rpida realmente aumenta. Aps longo

    perodo predomina a miosina rpida no quadrceps, relembrando que em indivduos

    sadios a proporo de miosina rpida e lenta no quadrceps de 50%. Levantou-se a

    hiptese que a ausncia de estmulo nervoso pela ativao eltrica seria necessria

    para manter a relao de miosina.

    A converso de fibras no se restringe a indivduos com paralisias

    musculares. Quando o indivduo submetido a exerccios de fora repetidamente

    com pesos programados, o nmero de fibras rpidas (IIx) declina, pois se convertem

    em rpidas (IIa). Ao mesmo tempo as fibras aumentam sua produo de protenas e

    se espessam (ANDERSEN et al., 2000).

    Conquanto essas pesquisas conduzidas no sentido de modificar a

    composio muscular levantando at a hiptese de injees de DNA no msculo

    estejam em andamento, discute-se muito ainda sobre os mecanismos da regenerao

    muscular.

    Qualquer dispositivo, de preferncia no invasivo, que assegurasse uma

    acelerao do reparo do msculo lesado, seria altamente desejvel. Vive-se uma

    poca em que a competio esportiva e o culto ao corpo esto amplamente

    exacerbados. No obstante, as atividades modernas, os esportes radicais e o

    desempenho da atividade motora levam ao aparecimento de leses musculares, mais

    ou menos graves, que certamente conduzem a uma perda de atividades, as quais

  • 19

    dariam como somatrio, um grande prejuzo funcional e mesmo de natureza

    econmica. A possibilidade de, mediante estmulos fsicos no invasivos como o

    Ultra-Som Pulsado (USP) de baixa intensidade (1 a 5% da intensidade do ultra-som

    fisioteraputico), poder abreviar ou acelerar a reparao de leses musculares, foi o

    fator que levou a empreender a presente pesquisa.

    Este trabalho tem pois, como finalidade precpua, demonstrar

    experimentalmente os efeitos do USP de baixa intensidade, como o utilizado no

    tratamento de fraturas, na regenerao do msculo esqueltico de ratos.

  • 20

    2 O ULTRA-SOM

    2.1 Histrico

    Durante o sculo XIX foi demonstrado que o ouvido humano capaz de

    detectar sons cujas freqncias de ondas estejam entre 16 Hz e 21 kHz,

    aproximadamente. No incio do sculo XX, conseguiu-se produzir e detectar ondas

    sonoras com freqncia acima deste limite, audvel pelo homem, dando origem ao

    termo Ultra-som (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986).

    A primeira aplicao prtica do ultra-som foi em 1917 com a criao de

    sonares para a deteco de submarinos, utilizando o mtodo pulso-eco. Alguns anos

    mais tarde, descobriu-se que o ultra-som produzia aumento da temperatura em

    tecidos biolgicos, entre 1930 e 1940 ele foi introduzido na prtica mdica como um

    recurso teraputico, usado particularmente para produzir calor em tecidos profundos.

    De 1940 at os dias atuais, o ultra-som vem sendo extensamente usado

    em reas mdicas e industriais, e novos efeitos e aplicaes do ultra-som vem sendo

    pesquisados.

  • 21

    2.2 Fsica bsica

    2.2.1 Ondas

    As ondas ultra-snicas possuem uma freqncia que varia em torno de

    20.000 e 20.000.000 de ciclos por segundo (1 ciclo = 1 hertz), que se propaga como

    uma onda de presso causando agitao nas molculas do meio em que esto se

    propagando, fazendo-as oscilarem, quer o meio seja slido, lquido ou gasoso (TER

    HAAR, 1987). O ultra-som transmitido em forma de ondas de compresso, onde a

    oscilao de partculas se d paralelamente direo de propagao da onda,

    constituindo zonas de compresso e rarefao; ou em forma de ondas de

    cisalhamento (somente para slidos), onde as partculas oscilam em direo

    perpendicular direo de propagao das ondas.

    As ondas ultra-snicas so ondas mecnicas e transmitem energia atravs

    da matria causando uma oscilao nas posies de equilbrio das suas partculas.

    Estes movimentos oscilatrios so resistidos por foras elsticas de acordo com a

    estrutura molecular do meio (FREDERICK, 1965).

    Nos meios slidos podem ser produzidas ondas de trs tipos:

    longitudinal, transversal e superficial. A onda longitudinal ou depresso se

    caracteriza por causar oscilaes nas partculas na mesma direo de propagao da

    onda. A onda transversal causa oscilaes nas partculas em direo perpendicular

    direo de propagao da onda, e a onda superficial causa oscilaes elipsoidais nas

    partculas. Nos meios lquidos e gasosos podem ser produzidas ondas apenas do tipo

    longitudinal (WELLS, 1977).

  • 22

    Onda Configurao

    Longitudinal

    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    Transversal

    FIGURA 1 Modo de propagao das ondas ultra-snicas

    Devidos ao fato dos tecidos moles do corpo humano serem considerados

    como um fluido, no presente trabalho sero consideradas somente as ondas ultra-

    snicas do tipo longitudinal.

    2.2.2 Caractersticas das ondas ultra-snicas

    As ondas ultra-snicas apresentam caractersticas dos demais tipos de

    ondas, como o comprimento, a amplitude, o perodo e a freqncia (TER HAAR,

    1987).

    O comprimento da onda () corresponde a distncia entre regies

    adjacentes de compresso ou de rarefao mxima, cujas partculas encontram-se em

    um mesmo estado de movimento, em um dado instante de tempo.

    Amplitude (A) corresponde ao deslocamento mximo que uma

    partcula experimenta partir de sua posio de equilbrio. Descreve a magnitude do

    distrbio causado pela onda.

    Perodo (T) o intervalo de tempo necessrio para que uma partcula

    realize um ciclo completo de movimento.

  • 23

    Potncia (P) energia (E) total do feixe em um intervalo de tempo (t),

    expressa em Watts.

    A freqncia (f) corresponde ao nmero de vezes que uma partcula

    realiza um ciclo oscilatrio por unidade de tempo.

    FIGURA 2 Deslocamento de uma partcula em funo da distncia e do tempo (TER HAAR, 1978).

  • 24

    2.2.2.1. Velocidade de propagao (c)

    A velocidade de propagao de uma onda (c) definida como a distncia

    percorrida pela onda ultra-snica por unidade de tempo.

    No entanto, a velocidade de onda ultra-snica depende do tipo de onda

    considerada e das constantes elsticas do meio em que se propaga.

    A velocidade de propagao das ondas sonoras decresce dos meios

    slidos para os lquidos e destes para os gasosos. Nos tecidos moles do corpo

    humano a velocidade de propagao da onda ultra-snica est ao redor de 1.500 m/s

    (YOUNG, 1990).

    2.2.2.2. Intensidade e campo acstico

    Intensidade (I) quando uma onda atravessa um meio, as partculas do

    meio comeam a vibrar e adquirem energia cintica. A energia associada com a onda

    ultra-snica chamada de intensidade acstica e pode ser definida como a energia

    (E) que atravessa uma rea (S) em um intervalo de tempo (t). (TER HAAR, 1987).

    A energia fornecida pelas ondas ultra-snicas ao atravessar o meio

    medida pela intensidade acstica. Esta definida como a razo mdia do fluxo de

    energia que atravessa uma unidade de rea pela unidade de tempo (Watts/cm2)

    (WELLS, 1977).

    Os valores de intensidades descritos na literatura referem-se geralmente a

    intensidade transmitida pelo transdutor, e no a intensidade in situ, pois esta

    difcil de ser medida, embora possa ser calculada teoricamente (ZISKIN, 1985).

  • 25

    A intensidade que caracteriza o campo acstico transmitido pelo

    transdutor medida atravs de dosmetros de ultra-som em um meio de baixa

    atenuao normalmente em gua. Esses dosmetros medem a fora de radiao (F),

    possibilitando assim o clculo da potncia acstica (P) e conseqentemente da

    intensidade acstica temporal e espacial mdia, que definida como o quociente

    entre a potncia acstica total transmitida e a rea do transdutor.

    A intensidade apresenta caractersticas diferentes no campo acstico,

    caracterizando no campo duas regies distintas: o campo prximo ou zona de Fresnel

    e o campo distante ou zona de Fraunhofer. No campo prximo a intensidade

    disforme, enquanto no campo distante ela decresce suavemente com a distncia da

    fonte, como ilustra a Figura 3.

    FIGURA 3 Variao da intensidade acstica (I) nos campos ultra-snicos prximos e distantes, em meio aquoso. Na parte a tem-se a variao de I ao longo do eixo x, na parte b tem-se a variao de I ao longo do eixo y (perpendicular pgina) , e na parte c, o valor da intensidade mdia ao longo do eixo y, para uma determinada posio (ALVES, 1988 adaptado de TER HAAR, 1978).

  • 26

    2.2.2.3. Modos de propagao

    As ondas ultra-snicas podem se propagar de dois modos, o contnuo e o

    pulsado, a diferena entre estes dois modos est na interrupo da propagao de

    energia.

    No modo contnuo no ocorre esta interrupo, havendo portanto um

    depsito ininterrupto de energia sobre os tecidos irradiados.

    No modo pulsado, no entanto, h interrupes freqentes na propagao

    de energia. Na utilizao do modo pulsado h portanto dois tipos de freqncias a

    serem consideradas a freqncia da onda (f) citada anteriormente, e a freqncia de

    repetio de pulso (Fr), como ilustra a Figura 4.

    FIGURA 4 Sinal senoidal pulsado. (HIKES et al., 1985).

  • 27

    2.2.3 Impedncia acstica

    Impedncia acstica (Z) a propriedade de um meio se opor vibrao

    de suas partculas frente passagem de ondas ultra-snicas. Indica a propriedade que

    as ondas tm de se deslocarem mais facilmente em alguns meios que em outros.

    A impedncia acstica pode ser expressa de diferentes formas

    (FREDERICK, 1965). No entanto, usa-se comumente a impedncia acstica

    caracterstica do meio ou condutncia acstica, que obtida pelo produto da

    intensidade do meio pela velocidade do som no mesmo (Z = . c).

    A impedncia acstica do meio considerada como constante, visto que,

    a velocidade do som no meio basicamente constante dentro de uma larga faixa de

    freqncia (WILLIAMS,1983). A tabela 1, mostra a impedncia acstica

    caracterstica de diversos meios, assim como suas densidades e as velocidades da

    onda ultra-snica nestes meios.

    TABELA 1 Propriedades acsticas tpicas de vrios meios (YOUNG, 1990)

    MEIO DENSIDADE

    (g/ml) VELOCIDADE DO SOM (m/s)

    IMPEDNCIA

    CARACTERSTICA

    (106 kg-2 ms 1)

    Ar 1.293 331.5 429

    gua (20) 1.0 1480 1.52

    Plasma sanguneo 1.06 1570 1.62

    Gordura 0.92 1460 1470 1.35

    Fgado 1.06 1540 1585 1.63 1.68

    Msculo 1.07 1545 1630 1.65 1.74

    Osso 1.38 1.81 2710 4080 3.75 7.38

  • 28

    2.2.4 Reflexo e Refrao

    Quando uma onda sonora encontra uma interface entre dois meios

    diferentes, parte da energia refletida e outra refratada. A onda refletida retorna em

    direo negativa atravs do meio incidentes com a mesma velocidade de propagao

    e a onda refratada continua em direo positiva, mas sua velocidade alterada em

    funo das caractersticas do meio (WELLS, 1977).

    Como o coeficiente de reflexo ( r) e o coeficiente de refrao ( t) para

    as ondas incidentes perpendiculares dependem exclusivamente das impedncias

    acsticas dos meios (FREDERICK, 1965) e as impedncias acsticas caractersticas

    dos meios abordados possuem valores muito prximos, ou seja, a impedncia

    caracterstica do gel (gua) est ao redor de 1,61 x 10-6 kg. m-2 s-1 e dos tecidos moles

    do corpo est ao redor de 1,62 x 10-6 kg. m-2 s-1 (YOUNG,1990). Os valores destes

    coeficientes so portanto muito prximos e os fenmenos de reflexo e refrao

    foram desconsiderados.

    A porcentagem de energia refletida (r = Ir/Ii) e transmitida ou refratada

    (t = It/Ii) obtida atravs das equaes 1 e 2, sendo Ii, Ir, e It as intensidades

    incidente, refletida e transmitida, respectivamente. Os ngulos de incidncia e

    transmisso so i e t, respectivamente.

    (1)

    (2)

    2

    tcos1Zicos2Ztcos1Zicos2Z

    iIrI

    +=

    2)tcos1Zicos2Z(

    tcosicos1Z2Z4

    iItI

    +

    =

  • 29

    Se a incidncia for perpendicular ao meio 2, isto I= 90o, as equaes 1

    e 2 so simplificadas:

    (3)

    (4)

    possvel obter total transmisso da energia acstica entre dois meios 1

    e 3 se entre eles for utilizado um meio 2 com impedncia acstica Z2 dada pela

    equao (5).

    (5)

    O uso do meio 2 com a finalidade acima denominada de casamento de

    impedncia e utilizada na construo de transdutores ultra-snicos.

    2.2.5 Interferncias e Ondas Estacionrias

    As ondas ultra-snicas podem apresentar um fenmeno exclusivo dos

    movimentos ondulatrios denominado interferncia. A interferncia corresponde

    2

    1Z2Z1Z2Z

    iIrI

    +=

    2)1Z2Z(

    1Z2Z4

    iIrI

    +=

    3Z1Z2Z =

  • 30

    combinao de duas ou mais ondas em um ponto do meio onde se propagam,

    podendo ser construtiva ou autodestrutiva.

    A interferncia construtiva ocorre com a superposio de ventre de ondas

    que se somam formando um ventre com maior amplitude. A interferncia

    autodestrutiva ocorre com a superposio de ondas com sinais invertidos, tendendo

    portanto a se anularem.

    Essas interferncias ocorrem, por exemplo, quando h reflexo de ondas

    com a formao de ondas estacionrias. Ondas estacionrias so ondas que refletidas

    ficam confinadas a um determinado espao e que se ao se sobreporem podem se

    anular ou se somar (WELLS, 1977).

    Como a intensidade proporcional ao quadrado da amplitude, deve-se

    procurar evitar a formao de ondas estacionrias, pois a formao de ondas

    construtivas pode elevar muito a amplitude e danificar os tecidos irradiados. No

    entanto, na geometria complexa dos tecidos humanos, a ocorrncia de ondas

    estacionrias pouco provvel (TER HAAR in REPACHOLI, 1987).

    2.2.6 Mecanismos de atenuao

    A atenuao corresponde ao decrscimo da intensidade em funo da

    distncia da fonte sonora, e ocorre devido a fatores geomtricos (dimenses da fonte

    sonora, comprimento de onda, presena de superfcies refletoras, etc.) e por

    mecanismos de absoro (viscosidade, tempo de relaxao, etc.). Estes mecanismos

    possuem caractersticas diferentes de acordo com o meio. Nos tecidos biolgicos a

    atenuao deve-se principalmente aos mecanismos de absoro - mecanismos pelos

    quais a energia mecnica das ondas ultra-snicas convertida em calor (TER HAAR,

    1978).

  • 31

    O coeficiente de absoro () diretamente proporcional freqncia,

    quanto maior a freqncia, mais rpida a absoro (TER HAAR, 1987).

    A Tabela 2 mostra o coeficiente de absoro para a freqncia de 1 MHz

    em diferentes meios:

    TABELA 2 - Coeficiente de absoro () em diferentes tecidos para a freqncia de 1 Mhz (WELL, 1977)

    Tecidos Coeficiente de absoro ()

    Sangue 0.18

    Gordura 0.63

    Crebro 0.85

    Fgado 0.94

    Rim 1.0

    Msculos (paralelo s fibras) 1.3

    Msculos (transversal s fibras) 3.3

    Miocrdio 1.8

    Ossos do crnio 20

    Pulmo 41

    2.2.7 Transdutores

    O ultra-som de uso mdico, fisioteraputico e odontolgico produzido

    por transdutores ultra-snicos. Transdutores so dispositivos com a capacidade de

    responder a uma tenso eltrica, deformando-se, ou a uma tenso mecnica,

    alterando sua polarizao. Este fenmeno, denominado, piezoeletricidade, foi

    descoberto por Pierre e Jacques Curie em 1880. Hoje se sabe que a piezoeletricidade

    uma propriedade natural de certos cristais e substncias cristalizadas que

  • 32

    apresentam anisotropia, ou seja, a capacidade de reagir diferentemente de acordo

    com a direo de propagao de um fenmeno fsico sobre si, como a luz, o calor,

    etc. (RICHARDSON, 1989).

    Alguns cristais naturais como o quartzo e a turmalina so piezoeltricos

    podendo ser usados como transdutores. No entanto, alguns transdutores podem ser

    produzidos artificialmente como o titanato de brio (BaTiO3) e o zirconato titanato

    de chumbo (PZT), por exemplo.

    Neste trabalho o elemento piezoeltrico usado como transdutor para

    produo de ondas ultra-snicas foi um disco circular de zirconato titanato de

    chumbo (PZT) de 22 mm de dimetro e freqncia de ressonncia de 1.5 MHz.

    2.3 Mecanismos de interao do ultra-som com clulas e tecidos

    biolgicos

    Os efeitos biolgicos da ao do ultra-som dependem de muitos fatores

    fsicos e biolgicos, tais como intensidade, tempo de exposio, estrutura espacial e

    temporal do campo ultra-snico e estado fisiolgico do objeto. Este grande nmero

    de variveis complica a compreenso exata do mecanismo de ao do ultra-som na

    interao com os tecidos biolgicos (SARVAZYAN, 1983).

    Experimentos realizados com o ultra-som demonstram que a interao

    deste com os tecidos biolgicos provoca alteraes fisiolgicas, que podem ser

    benficas ou provocar danos.

    Independente do tipo de mecanismo de interao que est agindo no

    tecido biolgico estudado, o objetivo principal tem sido estabelecer limiares para a

    intensidade ultra-snica, abaixo dos quais no ocorrem efeitos lesivos (FERRARI,

    1987).

  • 33

    HILL (1972) considerou o limiar de 100 mW/cm2 de intensidade como

    no lesivo para os tecidos biolgicos, com referncia especial desnaturao do

    colgeno.

    Os mecanismos fsicos envolvidos na teraputica do ultra-som que

    induzem respostas clinicamente significantes sobre as clulas, tecidos, rgos e

    organismos so geralmente classificados em mecanismos trmicos e no-trmicos

    (DYSON, 1987).

    Esses mecanismos e seus subseqentes efeitos esto diretamente

    relacionados com os parmetros fsicos do ultra-som, com o tempo e a tcnica de

    aplicao.

    2.3.1 Mecanismo trmico

    Quando uma onda ultra-snica atravessa um tecido biolgico, este

    aquecido ao absorver parte da energia mecnica ultra-snica. O aumento da

    temperatura provoca um aumento temporrio na extensibilidade das estruturas

    altamente colagenosas, como os tendes, ligamentos e cpsulas articulares, e uma

    reduo na dor e espasmos musculares alm de produzir uma reao inflamatria

    branda.

    O aquecimento local produzido pelo ultra-som depende do tipo de tecido

    (os tecidos altamente proticos absorvem energia mais prontamente do que os tecidos

    com alto teor de gordura), do fluxo sangneo que irriga o local (uma vez que o calor

    produzido pode ser dissipado por corrente sangunea) e da freqncia ultra-snica

    aplicada (as altas freqncias tm uma maior absoro) (DYSON, 1987).

  • 34

    Estudos indicam que as altas freqncias so lesivas e podem danificar

    tecidos e clulas quando a intensidade utilizada ultrapassa o limiar de 100 mW/cm2

    (HILL, 1972).

    A elevao da temperatura tecidual produzida atravs da absoro da

    energia ultra-snica pode trazer benefcios atravs de uma vasodilatao local ou at

    queimar os tecidos irradiados.

    O aumento da temperatura em um tecido irradiado com ultra-som

    determinado por diferentes fatores, dos quais os mais importantes so:

    O coeficiente de absoro do tecido;

    A taxa de energia ultra-snica depositada, a qual depende da intensidade

    ultra-snica, da distribuio de energia no campo e do modo de propagao da onda;

    A freqncia da onda ultra-snica;

    O tempo de irradiao local;

    A tcnica de aplicao: estacionria ou mvel;

    As dimenses do corpo aquecido;

    A presena ou ausncia de superfcies refletoras na frente ou atrs do

    tecido de interesse (WILLIAMS, 1983).

    Com os parmetros do feixe ultra-snico otimizados para o uso

    teraputico em tecidos superficiais (mdia e baixas intensidades e altas freqncias),

    o aumento local da temperatura e da ordem de centsimos de grau at pouco mais de

    1 C (DYSON & SUCKLING, 1978).

  • 35

    2.3.2 Mecanismos no-trmicos

    Com a constatao dos efeitos lesivos provocados pelas altas

    intensidades, muitos autores tm utilizado intensidades acsticas mais baixas na

    estimulao ultra-snica. Estas intensidades so muito baixas para provocarem um

    aumento significativo na temperatura, fato que indica que outros mecanismos que

    no os trmicos esto envolvidos na interao do ultra-som com o tecido biolgico

    (DYSON, 1987). Dentre os mecanismos no-trmicos que produzem efeitos nos

    tecidos biolgicos podemos citar o mecanismo cavitacional.

    2.3.2.1 Cavitao

    Cavitao o termo usado em geral para descrever as atividades de

    microbolhas em um meio contendo lquido (sangue ou em fluidos dos tecidos),

    quando estimulado acusticamente. A cavitao engloba formao, crescimento,

    colapso e efeitos (fsicos, qumicos e biolgicos) associados s bolhas gasosas

    (FRIZZEL & DUNN, 1984).

    Essas bolhas de gs formadas no tecido biolgico com a passagem de

    ondas ultra-snicas, podem permanecer intactas por muitos ciclos (cavitao estvel)

    ou entrar em colapso liberando grande quantidade de energia (cavitao transiente)

    (WELLS, 1977).

    No existem evidncias que ocorram efeitos danosos de cavitao in vivo

    em tecidos tratados com ultra-som de baixa intensidade (DYSON, 1990).

  • 36

    2.3.2.1.1 Cavitao transiente

    Quando o feixe ultra-snico atravessa o campo oscilando violentamente,

    provocando grandes alteraes no volume das bolhas levando-as ao colapso, o que

    pode determinar tambm a imploso celular, denomina-se cavitao transiente (TER

    HAAR, 1987). A cavitao transiente extremamente danosa. As alteraes de

    presso e temperatura produzidas no stio do colapso das bolhas podem desintegrar o

    tecido local com formao de radicais livres altamente reativos que podem causar

    mudanas qumicas nas clulas e lise celular (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986).

    No entanto, a cavitao transiente requer intensidades muito mais altas

    do que aquelas usadas terapeuticamente (aproximadamente 10 w/cm2) (LEITE,

    1989), desta forma sua ocorrncia em tecidos biolgicos bastante improvvel.

    2. 3.2.1.2 Cavitao estvel

    Quando as bolhas atravessam o campo ultra-snico oscilando em um

    feixe estvel, aumentando e diminuindo seu volume conforme as variaes de

    presso de campo, dizemos que a cavitao estvel (TER HAAR, 1987). Este tipo

    de cavitao responsvel, em parte, pela estimulao do reparo de tecidos que a

    onda ultra-snica produz, atravs de modificaes na permeabilidade da membrana

    celular para os ons de clcio (MUMMERY apud YOUNG & DYSON, 1978) e

    sdio (MORTIMER & DYSON, 1988) que provocam um aumento na sntese de

    protenas.

    H evidncias experimentais considerveis de que nveis teraputicos de

    ultra-som podem induzir a cavitao estvel in vivo (TER HAAR,1982), mas seus

    efeitos ainda no esto bem estabelecidos. Entretanto, sabe-se que a cavitao estvel

  • 37

    in vitro pode produzir efeitos irreversveis em suspenso celular, como a ruptura de

    membranas e de macromolculas, a desnaturao de enzimas, etc., dependendo dos

    parmetros usados (LEITE,1989).

    A intensidade limiar a partir do qual pode ocorrer cavitao foi

    determinada em meio aquoso por HILL (1971) em 0,1 W/cm2, e in vivo por TER

    HAAR et al. (1982) em 0,2 W/cm2.

    2.3.2.2 Fluxo e Microfluxo

    Fluxo (streaming) e microfluxo (microstreaming) correspondem a

    movimentos unidirecionais que ocorrem em fluidos submetidos a um campo ultra-

    snico. Esses movimentos originam foras e tenses que podem modificar a posio

    de partculas intra e extra-celulares ou mesmo a configurao normal das clulas, e

    consequentemente podem afetar a atividade celular (OKUNO, CALDAS & CHOW,

    1986).

    Podem alterar organelas celulares e membranas de maneira reversvel ou

    irreversvel, dependendo de sua magnitude. O microfluxo pode ter seu valor

    teraputico uma vez que sua ao facilita a difuso atravs de membranas.

    Dependendo do tipo de clula, a alterao inica produzida pode desenvolver

    alteraes na motilidade, sntese ou secreo celular, que podem acelerar o processo

    de reparo (DYSON, 1987).

    Diversos experimentos tm sugerido que o microfluxo causado em

    tecidos submetidos a nveis teraputicos de ultra-som um dos mecanismos

    responsveis pela regenerao de tecidos lesados (HADAAD, 1992).

  • 38

    2.3.2.3 Piezoeletricidade

    A piezoeletricidade foi descoberta em 1880 pelos irmos Curie

    (MASON, 1981) e definida como a propriedade fsica segundo a qual alguns

    materiais quando deformados por uma tenso mecnica, desenvolvem cargas

    eltricas superficiais e vice-versa, i. e., ao se colocar um material piezoeltrico sob

    campo eltrico, as cargas eltricas interagem com o mesmo e o material exibe

    deformaes mecnicas (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986).

    FUKADA & YASUDA (1957) foram os primeiros a descreverem a

    piezoeletricidade em um tecido biolgico o osso. Eles observaram os efeitos direto

    e inverso no osso, e mostraram que ao sofrer deformaes mecnicas, cargas

    eltricas so formadas na face oposta do osso, sendo este efeito devido molcula de

    colgeno.

    A piezoeletricidade continuou a despertar o interesse da comunidade

    cientfica, que procurou estabelecer uma relao entre eletricidade e os mecanismos

    de crescimento e regenerao.

    As pesquisas de aplicao com energia ultra-snica pulsada de baixa

    intensidade tiveram em nosso pas e na Amrica Latina como pioneiro o Prof. Luiz

    Romariz Duarte e sua equipe da Escola de Engenharia de So Carlos USP e seus

    estudos demonstraram evidncias de que o ultra-som pode acelerar o reparo sseo.

    Atribuiu a acelerao do processo de consolidao de fraturas sseas por ultra-som

    de baixa intensidade ao mecanismo de piezoeletricidade (DUARTE, 1983).

    XAVIER e DUARTE (1983) relatam o impacto que a descoberta da

    piezoeletricidade em tecido sseo por Fukuda teve no desenvolvimento de tcnicas

    no-invasivas de tratamento de fraturas. A interveno do homem resume-se, pois,

    em como colocar cargas eltricas no stio lesado ou como estabelecer uma corrente

    eltrica que produza ativao naquele ambiente. No caso do ultra-som, as cargas

    eltricas necessrias ao reparo sseo so produzidas no osso por meio do efeito

  • 39

    piezoeltrico, pois o USP atinge a superfcie do osso por uma sucesso de impulsos,

    cada um deles resultando em um sinal eltrico como resposta do osso. Da por diante,

    o processo de crescimento do osso regulado pelo campo eltrico assim formado e o

    metabolismo sseo estimulado bioeletricamente tal como nos outros mtodos

    invasivos ou no de tratamento de fraturas.

    A piezoeletricidade (definida no item 2.2.7) um dos principais

    mecanismos a que se atribui os efeitos ultra-snicos produzidos na reparao do

    tecido sseo.

    Este mecanismo se deve propriedade piezoeltrica da molcula de

    colgeno. Supe-se que a energia mecnica das ondas seja convertida em energia

    eltrica pelas unidades de tropocolgeno, criando assim um campo eltrico na

    superfcie do osso fraturado, o que estimularia a proliferao de clulas sseas

    (XAVIER & DUARTE, 1983).

    SILVA (1987) demonstrou teoricamente que a aplicao de um campo

    acstico em tecido sseo produz um campo eltrico ao nvel da membrana celular e

    pressupe que este efeito deve ocorrer em todos os tecidos que contm colgeno, o

    que pode ser um dos mecanismos para o efeito do ultra-som sobre o osso e a pele.

  • 40

    3 TECIDO MUSCULAR

    Segundo JUNQUEIRA & CARNEIRO (1999), o tecido muscular,

    responsvel pelos movimentos corporais, constitudo por clulas alongadas e que

    contm grande quantidade de filamentos citoplasmticos, responsveis pela

    contrao.

    So denominadas estriadas ou lisas dependendo, respectivamente, da

    presena ou ausncia de um arranjo de protenas contrteis miofibrilares, os

    miofilamentos, que se repetem regularmente (GARTNER & HIATT, 1997).

    A diferenciao das clulas musculares, de origem mesodrmica, ocorre

    principalmente devido a um processo de alongamento gradativo e, com simultnea

    sntese destas protenas filamentosas.

    3.1 Caractersticas morfolgicas e funcionais do msculo

    Pode-se distinguir nos mamferos trs tipos de tecido muscular: o

    msculo liso, o msculo estriado cardaco e o msculo estriado esqueltico (objeto

    deste estudo), observando suas caractersticas morfolgicas e funcionais (Figura 5).

  • 41

    As clulas musculares estriadas, cardacas e esquelticas, apresentam

    estriaes caractersticas, claras e escuras, que esto ausentes no msculo liso

    (GARTNER & HIATT, 1997).

    O msculo estriado esqueltico, responsvel pela maior parte da massa

    muscular voluntria do corpo, formado por feixes de clulas cilndricas muito

    longas e multinucleadas, que apresentam estriaes transversais. Tem contrao

    rpida, vigorosa e sujeita ao controle voluntrio. O msculo estriado cardaco,

    involuntrio e limitado quase exclusivamente ao corao. Apresenta estrias

    transversais, formado por clulas alongadas e ramificadas, que se unem por

    intermdio dos discos intercalares, estruturas encontradas exclusivamente no

    msculo cardaco. Apresentam contrao involuntria, vigorosa e rtmica. O msculo

    liso est localizado nas paredes dos vasos sangneos e nas vsceras, bem como na

    derme. formado por aglomerados de clulas fusiformes que no possuem estrias

    transversais. O processo de contrao lento e no est sujeito ao controle voluntrio

    (GARTNER & HIATT, 1997; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

    FIGURA 5 - Tipos de msculos (Junqueira & Carneiro, 1999, p. 159).

  • 42

    3.2 O msculo estriado esqueltico

    Termos prprios so freqentemente utilizados na descrio dos

    componentes das clulas musculares. Assim, a membrana celular chamada

    sarcolema; o citoplasma, sarcoplasma; o retculo endoplasmtico liso, retculo

    sarcoplasmtico; e, ocasionalmente, as mitocndrias, sarcossomas. Em razo de seu

    comprimento ser maior que sua largura, as clulas musculares so, freqentemente,

    chamadas de fibras musculares (GARTNER & HIATT, 1997) .

    Estas fibras so dispostas paralelamente em relao s vizinhas. Tem

    vrios ncleos, e esto situados na periferia da clula, sob a membrana celular

    (sarcolema). Os elementos contrteis ocupam a maior parte do volume da clula, que

    tem uma relao muita ordenada e especfica entre si, organizao essa responsvel

    pelas estriaes transversais vista nos cortes longitudinais das fibras musculares

    esquelticas e que deram origem denominao de msculo estriado. O msculo

    esqueltico fartamente irrigado com sangue e, geralmente, cada fibra tem em suas

    proximidades vrios capilares (ROSS & ROWRELL, 1993). Os vasos sangneos

    penetram no msculo atravs dos septos do tecido conjuntivo e formam uma rica

    rede de capilares que correm entre as fibras musculares (JUNQUEIRA &

    CARNEIRO, 1999).

    As fibras musculares estriadas tm at 30 cm, com um dimetro que varia

    de 10 a 100 m. Originam-se no embrio atravs da fuso de clulas alongadas, os

    mioblastos (Figura 5) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999; WILLIAMS et al.,

    1995).

  • 43

    FIGURA 6 - Esquema ilustrativo da origem embriolgica de uma fibra muscular esqueltica (WILLIAMS et a1., 1995).

  • 44

    Muitas centenas de mioblastos, alinham-se com as extremidades voltadas

    umas para outras, fundem-se e formam clulas longas, conhecidas como miotubos.

    Segundo MALTIN et al. (1983), miotubo um sinccio (clula que foi gerada pela

    fuso de duas ou mais clulas, atravs do desaparecimento das paredes de clulas

    contguas) no qual os ncleos so normalmente arranjados em uma cadeia central.

    Usualmente contm uma populao de miofibrilas limitada, amplamente espaadas.

    Estes miotubos recm-formados produzem os constituintes

    citoplasmticos, bem como elementos contrteis, chamados miofibrilas. As

    miofibrilas so formadas pelo arranjo especfico de miofilamentos, que so protenas

    responsveis pela capacidade contrtil das clulas.

    Num msculo, as fibras musculares esto organizadas em grupos de

    feixes (fascculos) envolvidos por uma camada de tecido conjuntivo, chamado

    epimsio. Do epimsio partem septos muito finos de tecido conjuntivo, que se

    dirigem para o interior do msculo, separando os feixes. Esses septos so chamados

    de perimsio. O perimsio envolve cada feixe de fibras musculares. Cada fibra

    muscular, por sua vez, envolvida por uma camada muito fina constituda pela

    lmina basal da fibra muscular e por fibras reticulares do endomsio (Figura 7).

    A funo deste tecido conjuntivo manter as fibras musculares unidas,

    permitindo que a fora de contrao gerada por cada fibra individualmente atue sobre

    o msculo inteiro (grande significado funcional) porque na maioria das vezes as

    fibras no se estendem de uma extremidade at a outra do msculo.

  • 45

    FIGURA 7 - Esquema ilustrativo da arquitetura de um msculo esqueltico segundo JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999.

    O citoplasma da fibra muscular apresenta-se preenchido, quase

    completamente, principalmente por fibrilas paralelas, as miofibrilas (cilndricas, com

    um dimetro de 1 a 2 m). Aparecem com estriaes transversais, pela alternncia de

    faixas claras e escuras. A faixa escura (anisotrpica) recebeu o nome de banda A,

    enquanto a faixa clara (isotrpica) banda I. No centro de cada banda I aparece uma

    linha transversal escura a linha Z.

    A estriao da miofibrila devida repetio de unidades iguais,

    chamadas sarcmeros. Cada sarcmero formado pela parte da miofibrila que fica

    entre as duas linhas Z sucessivas e contm uma banda A separando duas

    semibandas I.

  • 46

    A banda A apresenta uma zona mais clara no seu centro, a banda H. A

    disposio dos sarcmeros coincide nas vrias miofibrilas da fibra muscular, e as

    bandas formam um sistema de estriaes transversais, paralelas, que caracterstico

    das fibras musculares estriadas.

    FIGURA 8 Esquema ilustrativo de um sarcmero e seus componentes, segundo JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999.

  • 47

    O microscpio eletrnico revela a presena de filamentos finos de actina

    e filamentos grossos de miosina dispostos longitudinalmente nas miofibrilas e

    organizados numa distribuio simtrica e paralela (Figura 8). Na contrao

    muscular os filamentos de actina deslizam sobre os filamentos de miosina. A miosina

    e a actina representam 55% do total de protenas do msculo estriado.

    Essa organizao dos filamentos miofibrilares mantida por diversas

    protenas, como por exemplo filamentos intermedirios de desmina, que ligam as

    miofibrilas umas s outras. O conjunto de miofibrilas (actina e miosina) , por sua

    vez, preso membrana plasmtica da clula muscular por meio de diversas protenas

    que tem afinidade pelos miofilamentos e por protenas da membrana plasmtica.

    Uma dessas protenas, chamada distrofina, liga os filamentos de actina a protenas

    integrais da membrana plasmtica.

    A contrao normal das fibras musculares esquelticas comandada por

    nervos motores que se ramificam no tecido conjuntivo do perimsio, onde cada nervo

    origina numerosas terminaes. No local de inervao, o nervo perde sua bainha de

    mielina e forma uma dilatao que se coloca dentro de uma depresso da superfcie

    da fibra muscular. Esta estrutura chama-se placa motora.

    A despolarizao iniciada na placa motora propaga-se ao longo da

    membrana da fibra muscular e penetra na profundidade da fibra atravs do sistema de

    tbulos transversais. Em cada trade, estrutura tripla vista no corte transversal, onde

    as duas cisternas terminais ladeiam um tbulo transversal na juno A-I, o sinal

    despolarizador passa para o retculo sarcoplasmtico e resulta na liberao de Ca2+,

    que inicia o ciclo de contrao. Quando a despolarizao termina, o Ca2+

    transportado ativamente de volta para as cisternas do retculo sarcoplasmtico e o

    msculo relaxa (ROSS & ROWRELL, 1993; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

    Uma fibra nervosa pode inervar uma nica fibra muscular ou ento se

    ramificar e inervar at 160 ou mais fibras musculares. A fibra nervosa e as fibras

    musculares por ela inervadas formam uma unidade motora.

  • 48

    A cor do msculo esqueltico vai do rseo ao vermelho, por causa do

    rico suprimento vascular, bem como da presena de pigmentos de mioglobina, que

    so protenas transportadoras de oxignio, semelhantes hemoglobina, mas que so

    menores do que esta. Dependendo da quantidade de mioglobina, do nmero de

    mitocndrias, da concentrao de vrias enzimas e do grau de contrao, a fibra

    muscular pode ser classificada de vermelha (tipo I), branca (tipo II) e intermediria

    (GARTNER & HIATT, 1997; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

    As fibras musculares esquelticas identificadas como do tipo I, ou fibras

    lentas, so ricas em sarcoplasma, de cor vermelho-escura, adaptadas para contraes

    continuadas. As fibras do tipo II, ou fibras rpidas, so de cor vermelho-clara,

    adaptadas para contraes rpidas e descontnuas (JUNQUEIRA & CARNEIRO,

    1999).

    Dois importantes processos podem modificar o tecido muscular:

    hipertrofia (processo caracterizado pelo aumento do volume das clulas), e

    hiperplasia (crescimento devido proliferao das clulas por multiplicao

    mittica) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

    Quanto regenerao: no adulto, os trs tipos de tecido muscular exibem

    diferenas na capacidade regenerativa aps uma leso que produza destruio parcial

    do msculo. O msculo cardaco no se regenera. Nas leses do corao, como nos

    enfartes, por exemplo, as partes destrudas so invadidas por fibroblastos que

    produzem fibras colgenas, formando uma cicatriz de tecido conjuntivo denso. O

    msculo liso capaz de uma resposta regenerativa eficiente. Ocorrendo leso, as

    clulas musculares lisas que permanecem viveis entram em mitose e reparam o

    tecido destrudo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

    Segundo CARLSON apud WILLIAMS et al. (1995), a regenerao do

    msculo esqueltico do homem limitada, e se a leso grande, a regenerao pode

    no ocorrer, o msculo perdido ento substitudo por tecido conectivo.

    Embora os ncleos das fibras musculares esquelticas no se dividam, o

    msculo tem uma pequena capacidade de reconstituio. Admite-se que as clulas

  • 49

    satlites sejam responsveis pela regenerao do msculo esqueltico. A Clula

    Satlite uma clula mononucleada situada entre a membrana plasmtica e a lmina

    basal da fibra muscular (MALTIN et al., 1983). As clulas satlites so fusiformes,

    dispostas paralelamente s fibras musculares, dentro da lmina basal que envolve as

    fibras e s podem ser identificadas no microscpio eletrnico (JUNQUEIRA &

    CARNEIRO, 1999).

    Essas clulas satlites, apresentam ncleos que parecem pertencer

    clula muscular, mas que na realidade pertencem a estas pequenas clulas. Elas

    localizam-se entre a membrana celular da clula muscular e sua lmina basal; so

    clulas-tronco latentes (so consideradas mioblastos inativos) que podem proliferar

    aps qualquer pequena leso para dar origem a novos mioblastos. Aps uma leso ou

    outro estmulo, as clulas satlites tornam-se ativas, proliferam por diviso mittica e

    se fundem umas s outras para formar novas fibras musculares esquelticas.

    Enquanto a lmina basal permanece ntegra, os mioblastos fusionam-se dentro dela

    para formar miotubos que, quando maduros, originam novas fibras. Em

    contrapartida, o rompimento da lmina basal produz o reparo por fibroblastos do

    local lesado com formao de tecido cicatricial. As clulas satlites tambm entram

    em mitose quando o msculo submetido a exerccio intenso. Neste caso elas se

    fundem com as fibras musculares preexistentes, contribuindo para a hipertrofia do

    msculo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999; ROSS & ROWRELL, 1993).

  • 50

    Legenda A - Banda A I - Banda I Z - Linha Z M - Fibra muscular C - Capilares

    Asteriscos regio do citoplasma livre de miofibrila Aumento de 400x

    3.3 Visualizao das principais estruturas do tecido muscular

    FIGURA 9 Corte longitudinal de uma fibra de msculo estriado (ROSS & ROWRELL, 1993).

    Neste corte pode-se observar o alinhamento paralelo (M) das fibras

    musculares; elas esto orientadas verticalmente na ilustrao e parecem ter

    espessuras diferentes. No destaque circular so vistas as estriaes. Podem ser

    visualizadas as bandas A (mais escura) e a banda I (mais clara). Alm disso, esse

  • 51

    destaque mostra uma linha delgada que divide em duas a banda I; trata-se da linha Z.

    A banda H no visvel.

    Ainda no destaque, pode-se examinar o citoplasma em torno do ncleo.

    Este revela que as estriaes transversais no se estendem at as reas

    citoplasmticas adjacentes aos plos nucleares. Esse citoplasma cora-se ligeiramente

    (asterisco) e contm uma concentrao de organelas que no participam diretamente

    do processo de contrao.

    Entre as fibras musculares h uma pequena quantidade de tecido

    conjuntivo delicado, o endomsio (a letra C mostra a presena eritrcitos nos

    capilares situados no endomsio).

    Na Figura 10 possvel observar a forma poligonal das fibras quando

    cortadas transversalmente. Ocorre uma grande variao no que diz respeito largura

    de cada fibra includa no corte, porque algumas podem ser cortadas ao longo do seu

    dimetro maior; outras, ao longo do seu dimetro menor; e outras, ainda, ao longo de

    dimetro intermedirios.

    So parcialmente definidas por numerosos ncleos, mas, no aumento

    mostrado na Figura 10, no fcil afirmar se esses ncleos pertencem s clulas

    musculares, s clulas do endotlio capilar, s clulas satlites ou aos fibroblastos do

    endomsio, que circunda cada clula muscular. Uma quantidade maior de tecido

    conjuntivo (CT) separa os feixes de fibras musculares; este tecido conjuntivo

    chamado perimsio; contm artrias e veias.

  • 52

    Legenda

    FIGURA 10 Representativo de um corte transversal de fibras musculares estriadas (aumento de 260x) (ROSS & ROWRELL, 1993).

    Legenda

    FIGURA 11 Corte transversal de fibras musculares estriadas (aumento de 640 vezes) (ROSS & ROWRELL, 1993).

    BV Vasos sanguneos CT Tecido conjuntivo (perimsio) M - Fibra muscular

    (envolvida pelod i )

    N - Ncleos das clulasmusculares

    Setas eritrcitos nos capilares

  • 53

    A Figura 11 mostra vrias clulas musculares, em maior aumento. Os

    ncleos (N) que se projetam para o interior do citoplasma pertencem clula

    muscular (contudo, deve-se observar que alguns ncleos, nessa posio, podem

    pertencer s clulas satlites, indiferenciadas, situadas no lado muscular da lmina

    basal e que no podem ser identificadas com preciso em amostras coradas com H &

    E). Revelam-se numerosas estruturas anulares (asteriscos) no endomsio; trata-se de

    capilares vazios. As setas mostram eritrcitos de capilares que foram cortados mais

    oblqua ou longitudinalmente.

  • 54

    4 REVISO DA LITERATURA

    A regenerao do msculo esqueltico sempre foi investigada tendo

    como padro alguns dispositivos e artifcios experimentais para a sua investigao,

    tais como: transplante de msculo; regenerao de enxertos livres; regenerao aps

    denervao ou de msculo inervado; padronizao de leses; injees de anestsicos

    ou venenos; exerccios exaustivos; calor; frio; isquemias; incises; transplantes de

    fragmentos e auto transplantes.

    LAWSON-SMITH & McGEACHIE (1998), referem que a miognese e

    a regenerao celular dependem das clulas satlites (mpc clulas mioprecursoras),

    as quais seriam as precursoras da miognese, embora pouco se saiba (a exceo de

    sua localizao anatmica em relao clula muscular normal ou sua capacidade

    de migrar), a respeito do seu papel na miognese. O uso da timidina triciada para

    marcar a proliferao de clulas satlites (as quais no so distinguveis no tempo) e

    a subsequente localizao de sua progenie nos ncleos dos miotubos revelaram uma

    coincidncia com o tempo da miognese, mas no com a natureza das clulas

    satlites.

    CAMPION (1984) na sua reviso sobre clula satlite muscular (mpc)

    diz que desde 1961, quando houve a primeira referncia s clulas satlites, sabe-se

    consideravelmente sobre sua distribuio filogentica, sua localizao, morfologia e

    funo. No h dvidas que seja capaz de multiplicar-se e ter uma considervel

    motilidade. Funcionam como progenitoras de ncleos de miofibras e so

    provavelmente adicionadas durante o crescimento ps-natal do msculo. Quando da

  • 55

    regenerao muscular funcionam como clula tronco da miognese para produzir

    mioblastos que se alinham, usando como suporte as lminas basais remanescentes,

    ou migram nos interstcios para produzir uma neofibra.

    Os mecanismos mediante os quais um grande nmero de estmulos

    ativam as clulas satlites no so conhecidos e nem aqueles mecanismos que

    mantm as clulas satlites inativas durante o crescimento e na idade adulta. Fatores

    mitogenticos esto presentes na leso muscular; suas caractersticas especficas e

    mecanismos de ao so desconhecidos. Maior compreenso desses mecanismos

    poderia aumentar a possibilidade da recuperao total do msculo submetido a uma

    leso ou doena.

    CARLSON (1986), considera que entre os modelos experimentais para o

    estudo da regenerao muscular o ideal seria o transplante de fragmentos musculares.

    Assim considerando, os trs maiores fenmenos ligados regenerao seriam: a

    revascularizao, a reinervao e o restabelecimento de conexes tendinosas.

    No que concerne ao comportamento das clulas na regenerao do

    msculo lesado, LEFAUCHER & SBILLE (1995) consideram que este

    comportamento varia com a natureza da leso. A leso isqumica comparada leso

    txica (como aquela provocada pela injeo de veneno de cobra), injetada no

    msculo tibial anterior do camundongo, mostrou que a leso isqumica seria

    caracterizada por um infiltrado inflamatrio mais extenso e a fase de fagocitose das

    miofibras degeneradas seria mais curto. Este fato levaria produo precoce de

    clulas precursoras (satlites) por fatores liberados pelas clulas inflamatrias. A

    leso txica mostrou maior conservao de membrana de miofibras necrosadas que

    serviam de suporte para fuso de clulas satlites (mpc) em miotubos e melhor

    microvascularizao.

    BODINE-FOWLER (1994), admitiu que o msculo esqueltico tem uma

    grande capacidade de regenerao aps leso, seja parcial ou completa, de suas

    fibras. Entre os tipos de leso inclui como leses diretas: esmagamento, puno,

    incises, congelamento, isquemia, aplicao local de anestsicos, exerccios

    excntricos e uma grande variedade de doenas neuromusculares.

  • 56

    Os fatores que limitariam a capacidade de regenerao do msculo

    esqueltico aps trauma ou doena seriam a populao de clulas satlites viveis, a

    reinervao e a revascularizao.

    CARLSON & FAULKNER (1983) consideram a regenerao como a

    nica adaptao do msculo esqueltico que ocorre em resposta a uma leso, a

    regenerao resultaria na restaurao maior ou menor da estrutura original e funo

    do msculo. Admitem que a regenerao de msculos esquelticos comparvel,

    estrutural e funcionalmente, com a constituio do msculo durante o

    desenvolvimento embrionrio.

    BISCHOFF (1975), muniu-se de um sistema de cultura de clulas

    musculares esquelticas isoladas de ratos adultos, com a finalidade de estudar a

    origem e o comportamento dos mioblastos mononucleares durante a regenerao

    muscular. Durante as primeiras poucas horas as fibras in vitro sofrem alteraes

    degenerativas incluindo grumos miofibrilares de contrao e picnose de mioncleos.

    ALBROOK (1962), afirma que a capacidade de fibras musculares

    estriadas sofrerem uma regenerao limitada aps leso um fato bem estabelecido,

    mas a maneira precisa como isto ocorre est ainda aberto a investigaes. O quadro

    citolgico da necrose da fibra muscular e sua regenerao subsequente so

    complexos devido variada velocidade das alteraes morfolgicas nas diferentes

    regies da leso e do numeroso tipo de clulas que tomam parte no processo

    regenerativo.

    FISCHER et al. (1990), consideram que 6 a 24 h aps o trauma do

    msculo, o segmento danificado mostra uma grosseira dilacerao e degenerao.

    Aps 24 at 48 h h um aumento do nmero de ncleos sarcolemais, alguns dos

    quais so semelhantes s clulas satlites que se originam. Dentro de 3 dias clulas

    regeneradoras do msculo desenvolvem ncleos centrais e reorganizam sarcmeros.

    NIKOLAOU et al. (1987), admitem que aps leso controlada,

    provocada por esforo, a cicatrizao da leso muscular 7 dias aps apresentava

    inflamao reduzida e a fibrose por colgeno mais avanada. Os achados desses

  • 57

    autores demonstraram que a recuperao funcional do msculo ocorre 48 horas aps,

    a despeito da inflamao e da cicatrizao ativas.

    CRISCO et al. (1994), desenvolveram uma tcnica reproduzvel de lesar

    o msculo e passvel de quantificao. Confirmam histologicamente diferentes

    estadios de leso da fibra leso aguda, degenerao, regenerao e normalizao. A

    funo contrtil como indicativa de performance muscular, estaria significativamente

    comprometida pela leso por contuso e melhorava a cada estgio histolgico.

    NOONAN et al. (1994), procuraram determinar as primeiras evidncias

    da leso muscular induzida por estiramento passivo em msculo de coelho.

    Consideram que alteraes nas propriedades contrteis e o estgio histolgico

    parecem ser mais sensveis no prognstico da leso, que as medidas da falncia das

    propriedades estruturais. Este estudo oferece clinicamente a evidncia de que o uso

    do msculo que portador de uma pequena leso disrruptiva predispe o indivduo a

    uma leso adicional .

    BRASSEUR et al. (1997), no estudo da degenerao e regenerao de

    fibras musculares estriadas na distrofia de Duchenne, consideram que esta doena

    caracterizada pela coexistncia de leses degenerativas de fibras musculares e de

    alteraes regenerativas. Neste trabalho os autores procuram verificar o grau de

    regenerao em diferentes estadios da doena, analisando a expresso de vrios

    marcadores de proliferao celular e diferenciao muscular. Estudando a expresso

    de marcadores musculares (vimentin, desmin, isoforms of the myosin heavy chain)

    foi possvel determinar-se o grau preciso de maturao e diferenciao de fibras em

    regenerao. Os resultados sugerem que uma regenerao abortada de fibras

    musculares na sndrome pode explicar, pelo menos parcialmente, a evoluo

    progressiva da doena.

    KUREK et al. (1996), admitem que um grande nmero de fatores de

    crescimento esto envolvidos na coordenao da proliferao e diferenciao de

    clulas musculares e, particularmente aps leso em doenas. O fator inibidor da

    leucemia (LIF) estimula fortemente a proliferao de mioblastos in vitro e in vivo, e

    sua expresso na leso muscular sugere que o LIF pode ter um papel como um fator

  • 58

    de trauma. Administrado a msculos de camundongos demonstrou estimular a

    formao de longos miotubos. Esta ao miotrfica indica que o LIF contribui para a

    regenerao do msculo.

    HURME & KALIMO (1992), consideram importante para a cicatrizao

    da leso muscular a remoo do material muscular necrosado por macrfagos da rea

    da leso o mais cedo possvel, pois esse processo parece ser um pr-requisito para a

    ativao e proliferao de clulas satlites nas vizinhanas da rea da leso. A

    proliferao de clulas satlites deveria comear antes da granulao e que o tecido

    cicatricial prolifere excessivamente e obstrua a regenerao de clulas musculares

    atravs do intervalo entre os cotos das miofibras rompidas.

    BISCHOFF & HEINTZ (1994), afirmam que o msculo esqueltico tem

    uma acentuada capacidade de regenerao sob condies experimentais; substanciais

    quantidades de msculo perdidas por leso ou isquemia no so geralmente repostas

    em situaes clnicas (KAKULAS,1982 apud BISCHOFF & HEINTZ, 1994).

    RANTANEN et al. (1999), trataram experimentalmente a leso do

    msculo gastrocnmio do rato com USP em leso produzida por contuso. A

    velocidade da mioregenerao dos animais tratados com USP foi comparada aos

    controles por imunohistoqumica, morfometria e anlise cintilogrfica. Embora as

    clulas satlites tivessem aumentado 96% nos tratados com Ultra-Som durante os

    primeiros estgios da regenerao, no houve o mesmo efeito na produo de

    miotubos. O perodo de proliferao rpida de fibroblastos de 3 a 4 dias aumentou de

    7 a 10 dias comparando-se o grupo controle com o tratado pelo USP, enquanto a

    recapilarizao no foi afetada. Embora o USP promova um aumento na proliferao

    de clulas satlites na fase de mioregenerao, no parece ter efeitos significativos

    sobre as demais manifestaes morfolgicas da regenerao muscular.

    SCHULTZ & JERYSZAK (1985), em seus estudos observaram que as

    clulas satlites do msculo so as clulas tronco miognicas que funcionam para

    reparar as fibras musculares lesadas. A participao das clulas satlites na resposta

    regenerativa leso muscular resulta numa significante reduo de seu potencial

  • 59

    cumulativo de proliferao. A magnitude da reduo proporcional ao nmero de

    respostas de regenerao nas quais elas participam.

    DANILOV et al. (1996), estudaram as particularidades da regenerao

    aps danos por tiro em coelhos. A fase inicial do processo seria a de uma zona de

    necrose ps-traumtica, desintegrao do tecido muscular esqueltico e ativao de

    macrfagos. A fase proliferativa inicia-se 36 horas aps a leso e inclui a ativao de

    miosatelitcitos, proliferao e aparecimento de mioblastos. O processo de

    diferenciao celular miognica semelhante quela embrionria.

    CHOU & NONAKA (1977), afirmam que a formao de miotubos,

    caracterstica habitual da miognese, raramente ocorre no processo regenerativo

    institudo pelas clulas satlites em doenas dos msculos esquelticos humanos.

    BODINE-FOWLER (1994), no estudo da leso muscular revelam que o

    msculo esqueltico tem uma remarcvel capacidade de regenerao resultante de

    leso parcial ou total da fibra muscular. A regenerao segue numa seqncia

    caracterstica e est limitada a trs fatores: populao de clulas satlites, reinervao

    e revascularizao.

    BISCHOFF (1990), estudou as miofibras com suas clulas satlites

    isoladas de ratos adultos para verificar a influncia de miofibras maduras na

    proliferao de clulas satlites. As clulas satlites permanecem quiescentes quando

    cultivadas em meio contendo soro, mas proliferam quando expostas ao fator

    mitogentico extrado de msculos adultos esmagados. Os resultados indicam que o

    contato com a superfcie de uma miofibra madura suprime a proliferao de clulas

    miognicas mas as clulas no se fundem com a miofibra.

    HURME & KALIMO (1992), afirmam que ncleos de clulas satlites

    marcadas no aparecem antes que se iniciem a fagocitose de restos necrotizados.

    Geralmente um dia aps o trauma muitos ncleos so encontrados na rea de necrose

    de miofibras rompidas, enquanto que poucos deles na poro sobrevivente. extensa

    a proliferao de clulas satlites no 4 dia de regenerao e poucas marcadas no 7

    dia. Especula-se se o fator de crescimento liberado pelos macrfagos seria necessrio

  • 60

    em vista do decrscimo de clulas satlites marcadas ao 7 dia. A maioria dos

    mioncleos, necessria regenerao de miofibras, produzida precocemente dentro

    dos cilindros de lminas basais preservadas e distribudas naquelas partes das

    miofibras que se estendem entre o tecido conjuntivo e o muscular.

    Como j havamos visto, LEFAUCHER & SBILLE (1995), estudaram

    os eventos celulares da degenerao e regenerao do msculo com vrios modelos

    de leso. A comparao da leso isqumica com a txica mostrou nesta, uma

    extenso do infiltrado inflamatrio e um encurtamento da fase de fagocitose do dano

    das miofibras. Isto levou diferenciao e proliferao de clulas precursoras (mpc)

    ocorrer mais precocemente o que pode ter sido promovido por fatores de crescimento

    liberado pelas clulas inflamatrias.

    O incio da regenerao muscular est estreitamente ou fortemente

    relacionado aos eventos que ocorrem durante a fase de regenerao.

  • 61

    5 MATERIAL E MTODOS

    5.1 Animais de experimentao

    Na presente pesquisa foram utilizados 10 ratos albinos da variedade

    Wistar com pesos variando de 120-140 g e obtidos no biotrio da Faculdade de

    Medicina de Ribeiro Preto. Colocados em gaiolas apropriadas, foram mantidos 24

    horas no ambiente do laboratrio para aclimatao. Durante o experimento e nos

    perodos ps-operatrios at o sacrifcio, foram mantidos sob condies ambientais,

    com um ritmo circadiano de luz e escuro, recebendo gua e rao balanceada

    (Purina) vontade.

    5.2 Tcnicas Operatrias

    As leses musculares, padronizadas, foram obtidas conforme os

    seguintes passos:

    a) anestesia mediante injeo intraperitoneal de Rompum e Ketalar em

    quantidades iguais, na dose de 0.10 ml da soluo, para cada 100 g de peso do

  • 62

    animal;

    FIGURA12 Anestesia mediante injeo intraperitoneal.

    b) fixao do animal em prancha operatria seguida de tricotomia da face

    externa das coxas D e E;

    c) aps assepsia com lcool-iodado a 2% fazia-se uma inciso

    longitudinal com bisturi (lmina 4), dos planos cutneos e fscia do msculo glteo

    maior;

    FIGURA 13 Inciso dos planos superficiais.

  • 63

    d) exposto o msculo faziam-se cortes perpendiculares s suas fibras

    alcanando, em profundidade, cerca de 2/3 da espessura do msculo;

    FIGURA 14 Demonstrativos das incises praticadas no msculo glteo maior.

    e) a seguir, as leses musculares eram suturadas com fios de nylon 4.0, e

    pontos separados. A sutura dos planos superficiais tambm era feita com o mesmo

    tipo de fio e pontos separados;

    FIGURA 15 Demonstrativo da sntese dos planos muscular e superficiais.

  • 64

    5.3 Estmulo ultra-snico

    Aps as incises nos msculos das duas coxas, marcaram-se os animais

    para compor os 3 grupos experimentais, de maneira aleatria. Compostos os grupos,

    procedeu-se um sorteio para o sacrifcio aps 3, 6 ou 10 dias de aplicao do USP. O

    equipamento utilizado tinha as seguintes caractersticas: freqncia fundamental de

    1,5 MHz, pulsado, freqncia de repetio dos pulsos de 1 kHz, largura de pulso de

    200s. Os tecidos, alvos deste trabalho, foram submetidos ao campo prximo do

    transdutor, onde a intensidade medida foi de 16 mW/cm2 em meio aquoso.

    FIGURA 16 Sinal eltrico que excita o transdutor ultra-snico pulsado.

    FIGURA 17 O aparelho de USP (produzido no Laboratrio de Bioengenharia do Grupo de Bioengenharia do Departamento de Engenharia de Materiais, Aeronutica e Automobilstica da EESC - USP).

  • 65

    Todos os animais s foram estimulados aps decorridos 24 horas da

    cirurgia. Os animais foram estimulados sempre do lado direito com o USP, sendo o

    transdutor aplicado de maneira estacionria acoplado com hidrogel. Cada aplicao

    durava dez minutos a cada dia, pela manh e o lado esquerdo, que servia como

    controle era submetido a uma sonicao fictcia (Figura 18).

    FIGURA 18 Figura representativa de estimulao esttica com o transdutor ultrasnico.

    5.4 Elaborao do tecido muscular para o estudo histolgico

    Para o estudo histopatolgico, e para avaliar a multiplicao celular, os

    animais foram inoculados, via intraperitoneal, com 0,15 ml de uma soluo padro

    de Colchicina para cada 100 gr de peso, 6 horas antes do sacrifcio. (Colchicina

    cedida pela Prof. Dr. Catarina Satie Takahashi do Depto de Gentica da USP

    Faculdade de Filosofia).

    Os animais, decorridos os tempos estabelecidos para a aplicao do USP,

    foram sacrificados por inalao excessiva de ter etlico. Os msculos eram

  • 66

    reduzidos a fragmentos contendo uma poro da rea lesada pelas incises e os

    pontos de sutura do tegumento eram retirados, assim como os pontos que foram

    dados nos msculos.

    Aps fixao em soluo fixadora de Bouin por cerca de 2 horas, os

    fragmentos musculares eram processados rotineiramente para incluso em parafina e

    posterior obteno de cortes histolgicos com 6 m de espessura.

    Os cortes foram corados com hemalumem e eosina. As lminas contendo

    os cortes corados, foram examinadas e fotografadas em fotomicroscpios Zeiss sob

    diferentes aumentos.

  • 67

    6 RESULTADOS

    Na exposio dos resultados procurou-se seguir uma ordenao de

    acordo com a proposta inicial do trabalho.

    Convencionou-se conduzir o experimento de modo que o msculo do

    lado direito, submetido s incises, seria o estimulado por 3, 6 e 10 dias, enquanto

    que o do lado esquerdo, igualmente submetido s incises, seria submetido a uma

    estimulao fictcia, por perodos equivalentes.

    A regenerao do msculo estriado ou esqueltico adulto,

    independentemente do tipo de leso, obedece a um cortejo de fatos, ou etapas, mais

    ou menos bem definidas e caracterizveis histopatologicamente.

    Aproveita-se a oportunidade de dizer aqui, porm, para posterior

    discusso, que nem todos os fatos relacionados regenerao do msculo esqueltico

    esto, at hoje, bem esclarecidos.

    Da seqncia de eventos caracterizveis histopatologicamente durante a

    regenerao muscular, tem-se de incio uma necrose tecidual com a mobilizao de

    clulas inflamatrias, seguida de fagocitose de restos celulares pela ao de

    macrfagos provindos da circulao sangnea adjacente rea de necrose.

    necrose seguem-se a revascularizao e a proliferao de clulas mio-

    precursoras, ou satlites (MAURO, 1961), tambm chamadas de miognicas. Em

    seguida estas clulas se diferenciam em mioblastos os quais se fundem para

  • 68

    constituir os miotubos, que por sua vez amadurecem e se transformam em novas

    fibras musculares (LAWSON-SMITH & McGEACHIE, 1998).

    A regenerao muscular em quaisquer dos modelos experimentais, seja

    por incises ou traumatizando fibras musculares, nas quais apenas parte das fibras

    so lesadas, so seguidas de um modelo rpido e completo de regenerao

    (CHURCH, 1970; CHURCH, apud MAURO et al., 1970; SCHULTZ et al., 1985).

    A velocidade de regenerao, entretanto, no ocorre naqueles modelos

    aos quais a perda muscular (injeo de txicos , p.e.) muito intensa (BENOIT &

    BELT, 1970; ONO et al., 1993).

    Na Figura 19, esto documentados, mediante fotomicrografias, aspectos

    histopatolgicos da evoluo da necrose das reas incisionadas de msculos de

    animais no estimulados, aos 3 e 6 dias aps leso. Pode-se verificar uma intensa

    inflamao, com restos celulares de fibras lesadas. Com a administrao da

    colchicina, clulas inflamatrias e clulas precursoras da miognese esto com seus

    ncleos bloqueados em metfase. Notar que aos 6 dias diminui o nmero de clulas

    inflamatrias e j h a formao de fibroblastos jovens de permeio a restos celulares

    e clulas satlites.

    Aps estmulo pelo USP, aos 3 dias, observa-se restos de clulas

    musculares, diminuio das clulas inflamatrias e uma intensa neoformao

    vascular. Em alguns casos j h a confluncia de mioblastos agregando-se para

    formar miotubos, cujos extremos esto voltados para a rea de reparo da necrose

    (19D).

    A necrose a primeira ocorrncia que se segue ao dano causado s fibras

    musculares. o primeiro acontecimento reconhecvel histopatologicamente, e que

    em geral fica restrito ao centro da rea lesada. Procurou-se na Figura 19 documentar

    o centro das reas de necrose.

  • 69

    B A

    FIGURA 19 As fotomicrografias A e C correspondem a reas de necrose de msculos de animais controles (sem estmulo) aps 3 e 6 dias, respectivamente. As fotomicrografias B e D representam as mesmas reas de necrose em msculos de animais estimulados por 3 dias com o ultra-som pulsado. Notar, acima, a intensa proliferao de vasos neoformados ( ), em meio a restos de fibras musculares ( )e uma diminuio do infiltrado inflamatrio( ) . Alguns animais estimulados (B e D), j apresentam fibroblastos( ) e incio de formao de miotubos ( ). Cortes de 6 m, corados pelo H.E. Aumento A, C e D de 192x; B de 384x; nos destaques aumento de 288x.

    D C

  • 70

    Aps a leso, a necrose das fibras lesadas que ocorre precocemente

    caracterizada pela grande mobilizao de clulas inflamatrias, enquanto que as

    fibras musculares situadas distantes da leso permanecem ntegras, mesmo porque o

    msculo no fora denervado. A irrigao das fibras no envolvidas na rea de

    necrose preservada.

    Em seqncia fase inflamatria, inicia-se a fagocitose de restos

    celulares, por macrfagos migrados da circulao adjacente para a rea de necrose.

    Estudos tm demonstrado que este fato ocorre 24 a 48 horas aps. A tendncia a

    evoluo da necrose para uma fibrose reparadora.

    As metfases observadas na sua maioria so de clulas que futuramente

    vo se transformar em mioblastos (possivelmente metfases de ncleos de clulas

    miognicas - m.p.c.).

    No se pode assegurar, entretanto, que todos os ncleos em metfase

    sejam de clulas satlites ou precursoras, mas provavelmente de fibroblastos ou de

    outras clulas inflamatrias mobilizadas para resolver o processo de necrose, pois

    so indiferentemente bloqueados pela colchicina.

    Compe-se a Figura 20 de fotomicrografias de msculos de animais

    controle, sem estmulo, e de animais estimulados pelo USP.

  • 71

    A B

    C D

    FIGURA 20 As fotomicrografias da figura ilustram o msculo de 2 animais controles (A e C) e de 2 animais estimulados pelo ultra-som pulsado (B e D) durante 10 dias. Nos animais controles h ainda necrose em evoluo (circulo), nos animais estimulados h intensa neovascularizao ( ), incio de migrao de clulas satlites para restos de membranas, visando a formao de miotubos ( ) e a formao de fibroblastos ( ). Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A, B e C de 192x e D de 480x.

  • 72

    Enquanto nos msculos estimulados, h formao de vasos, alguns de

    parede j constituda e contendo sangue (animais estimulados por 10 dias), naqueles

    no estimulados h ainda zonas de necrose, infiltrados inflamatrios e restos

    celulares.

    A agregao de mioblastos nos animais estimulados tambm

    evidenciada.

    Pode-se constatar que mesmo decorridos 10 dias aps leso, nos animais

    no estimulados havia ainda necrose, enquanto que nos estimulados, alm de intensa

    neoformao vascular (que induzida precocemente), ocorreu tambm a agregao

    de mioblastos em colunas.

    Na Figura 19B (pgina 69) pode-se tambm notar a flagrante quantidade

    de ncleos em metfase na fotomicrografia de um animal estimulado por 3 dias, o

    que permite supor que o USP estimula tambm a produo celular, especialmente de

    clulas miognicas. Entretanto no se pode configurar na maioria dos ncleos

    bloqueados um volume de citoplasma que pudesse caracteriza-los como ncleos de

    mioblastos, ou que nem todas as mitoses bloqueadas correspondam a ncleos de

    clulas mioprecursoras.

    O evento decisivo na regenerao do msculo esqueltico a

    proliferao de clulas miognicas precursoras e sua diferenciao em mioblastos.

    Nem todos os msculos esquelticos dentro de uma mesma espcie

    animal tm a distribuio linear de clulas satlites semelhante (CAMPION, 1984).

    Alm disso, a relao entre clulas satlites e ncleo de fibras de 1:9.

    As clulas satlites existem em associao com vrios tipos de fibras

    descritas no msculo esqueltico (SCHMALBRUCH & HELLHAMMER apud

    CAMPION, 1984). As clulas satlites no aparecem antes que os restos de tecidos

    necrotizados tenham sido fagocitados, geralmente um dia aps o trauma (fcil de ser

    constatado nas figuras nas quais esto representados msculos que foram

    estimulados). A maior parte das clulas satlites est localizada na poro necrosada

  • 73

    das miofibras rompidas, enquanto apenas poucas se localizam na regio de fibras no

    lesadas e em geral situadas a uma certa distncia da rea de leso ou necrose (Figura

    22).

    Alguns autores (HURME & KALIMO, 1992) no admitem a migrao

    de clulas satlites, considerando que a maioria das clulas satlites produzida

    localmente ou prximo ao local da leso.

    Na Figura 21 esto fotomicrografias que documentam metfases de

    ncleos, que se constituem em mioblastos caractersticos de animais estimulados

    pelo USP por 3 dias. Estas clulas parecem ter a capacidade de migrar de clulas

    vizinhas ntegras ou de clulas musculares que estiveram envolvidas na degenerao

    necrtica.

    Comparando-se as trs fotomicrografias podemos verificar que no animal

    no estimulado (A), h maior nmero de clulas inflamatrias, enquanto que nos

    animais estimulados (B, C) parece haver uma induo para a formao de

    mioblastos e para que estes se agreguem.

    Alguns mioblastos parecem estar penetrando em restos de membrana

    celular de clulas degeneradas, para constituir futuros miotubos (Figura 21C).

    Miofibras isoladas com clulas satlites isoladas de ratos adultos foram

    usadas para verificar a influncia da fibra madura em relao proliferao celular.

    Embora experincias desta natureza sejam conduzidas in vitro e portanto difceis

    de serem extrapoladas para o comportamento da regenerao muscular in vivo,

    alguns fatos parecem conciliar o que aqui foi exposto. As clulas satlites seriam

    estimuladas em presena de extratos de msculos adicionados ao meio de cultura,

    enquanto isto no feito, elas permanecem quiescentes. O contato da clula satlite

    com a miofibrila suprime a proliferao das mesmas, mas estas no se prendem a

    miofibra. Admite-se tambm que o nmero de clulas satlites esteja relacionado

    com o grau de regenerao das fibras.

  • 74

    B A

    C

    FIGURA 21 As fotomicrografias so demonstrativas das diferentes clulas de tecido muscular com 3 dias cujos ncleos em diviso foram bloqueados pela colchicina. Na foto A indicativo de msculo de animal no estimulado cuja leso acha-se em fase inflamatria( ). Na foto B, de um animal estimulado, esto indicadas metfases de ncleos de clulas satlites em diviso (mioblastos)( ). Na foto C mioblastos, tambm de animal estimulado, agregando-se para constituir miotubos ( ). Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento: A e C de 480x e B de 1200x.

  • 75

    Ao se examinar a Figura 22, pode-se constatar que no animal estimulado,

    as fibras ntegras, longe da rea lesada, apresentam estriao e clulas satlites em

    metfases. Enquanto este fato mais raro nas fibras dos animais no estimulados. A

    simples observao dos ncleos das fibras mostra igualmente diferena na

    morfologia e na basofilia dos mesmos.

    FIGURA 22 - Fotomicrografias de clulas musculares normais, distantes da rea de leso com 10 dias. A foto A mostra clulas musculares no estimuladas ( . ). A foto B, trata-se de msculo estimulado, mostrando um ncleo de clula satlite em metfase ( . ). Notar que o ncleo acha-se isolado da sarcolema da clula. Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento de 480x.

    Msculos de animais estimulados por 10 dias consecutivos mostram a

    presena ainda de numerosas clulas satlites bloqueadas em metfase e em contato

    ou nas proximidades de miotubos prximos rea da leso. O nmero porm, de

    metfases reduz quantitativamente, embora no tenhamos feito nenhum tipo de

    contagem, mas apenas avaliando a quantidade de metfases encontradas aos 3 dias e

    10 dias aps estmulo. Nas fotomicrografias da Figura 23 verifica-se a formao de

    numerosos miotubos e um decrscimo de ncleos de clulas miognicas em

    A B

  • 76

    A

    C D

    B

    metfase. notvel tambm o nmero de ncleos por miotubo.

    FIGURA 23 Fotomicrografias de miotubos ( ) de msculos de animais estimulados pelo ultra-som pulsado por 10 dias consecutivos. Apresentam vrias metfases de ncleos de clulas miognicas ( ), miotubos com numerosos ncleos enfileirados. Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A e D de 480x; B e C de 192x.

  • 77

    O nmero de ncleos existentes nos miotubos (em alguns chegando a

    vrias dezenas) parece decorrer da adio de mioblastos j que consenso a

    regenerao muscular fazer-se de maneira semelhante, seguindo, estrutural e

    funcionalmente, o que ocorre durante o desenvolvimento embrionrio do msculo.

    Para esclarecimento do leitor sugere-se reportar ao esquema da evoluo embrionria

    de uma fibra muscular pgina 43.

    O processo regenerativo, quaisquer sejam os tipos de agentes lesivos e

    leses provocadas, parece seguir um esquema relativamente rgido e comum a todos

    os tipos de leses, exceto aquelas determinadas por agentes txicos ou com grande

    perda de substncia muscular.

    Segundo alguns autores o exerccio facilitaria a regenerao, mas pouco

    se sabe quanto ao incio ou quanto intensidade adequada dos mesmos para o

    favorecimento da regenerao.

    O sucesso da regenerao muscular aps leso requer a ativao das

    clulas satlites dormentes, as quais esto contidas na lmina basal das clulas

    musculares adjacentes. Em presena de uma adequada vascularizao, proliferam em

    miotubos, os quais certamente iro evoluir para novas clulas musculares, fatos

    demonstrveis nas fotomicrografias ilustrativas de etapas da nossa experimentao.

    A Figura 24 representativa de miotubos de msculos estimulados por 10

    dias, mostrando a formao de miofibrilas, caracterizando a maturidade da clula

    muscular regenerada.

  • 78

    FIGURA 24 - Fotomicrografia de uma clula muscular estimulada por 10 dias e formando miofibrilas (no destaque) tendendo a se constituir numa clula muscular normal. Corte de 6m corados pelo H.E.. Aumento de 480x e no destaque de 720x.

  • 79

    7 DISCUSSO

    Os trabalhos desenvolvidos para aumentar a compreenso sobre a

    regenerao muscular, com conseqente uso pela fisioterapia, procuram estudar a

    dinmica muscular aps leso, to comuns em clnica fisioteraputica. Assim, so

    utilizados alguns modelos de tratamento, muitos deles objeto de trabalho da

    fisioterapia (como o USP), que apesar de muito utilizados, ainda carecem de

    informaes cientficas a respeito de seus efeitos sobre a recuperao do msculo

    esqueltico lesado. A inteno que, posteriormente, possam ajudar a embasar

    protocolos de reabilitao mais eficientes para os indivduos acometidos pelas leses

    musculares.

    No foi encontrado na literatura relacionada com o assunto que ora

    pesquisou-se seno apenas dois trabalhos nos quais os autores utilizam-se do USP

    para avaliar os efeitos do mesmo sobre a regenerao de msculo estriado.

    pertinente lembrar que o aumento local da temperatura com os

    parmetros usados no presente trabalho considerado desprezvel (DUARTE, 1987;

    HADAAD, 1992; ZISKIN, 1989), portanto os resultados decorrentes do uso do

    Ultra-som, neste experimento, devem-se exclusivamente aos mecanismos no-

    trmicos.

    A capacidade das fibras musculares esquelticas se regenerarem uma

    realidade estabelecida e aceita pelos citologistas, muito embora numerosos

    profissionais engajados no tratamento de pacientes com leses musculares,

  • 80

    permaneam ainda desconhecendo esta realidade. Aps uma leso muscular grave,

    entretanto, uma certa quantidade de fibras, entra em necrose e no se recupera mais

    funcionalmente.

    A membrana sarcolemal que envolve as fibras na rea de necrose fica

    porm, geralmente e parcialmente preservada e espessada, podendo esvaziar-se de

    seu sarcoplasma. O espao entre fibras lesadas sofre inicialmente um edema e/ou

    hematoma (KRIINEN et al., 1998), e aps cerca de 12 horas invadido por um

    infiltrado celular inflamatrio que migra para a rea lesada e passados 4 dias, o

    infiltrado celular diminui. So substitudos por fagcitos (macrfagos) que migram

    para a rea lesada com a finalidade de remover e fagocitar restos celulares da rea de

    necrose.

    Dentro de 4 a 6 dias aps a leso das clulas, os tubos sarcolemais so

    liberados dos detritos da necrose inicial se alinham em colunas de mioblastos

    agregados.

    WALKER (1963), por um processo de excluso, admitia que os

    mioblastos se originariam de clulas musculares. Outros autores entretanto

    relacionam-os s clulas satlites (MAURO, 1961); MUIR et al. (1965) afirmam que

    esses mioblastos formariam um sinccio alongado dentro dos tubos sarcolemais nos

    quais se dispe como uma longa cadeia de ncleos. Nestas clulas, que os autores

    chamam agora de miotubos apareceriam precocemente miofilamentos abaixo da

    membrana plasmtica, fato demonstrado a microscopia eletrnica por ALBROOK

    (1962). Outros autores (HOLTZER et al., 1957) evidenciaram a formao de

    miofilamentos com o emprego da antimiosina fluorescente, demonstrando que se

    dispunham de cada lado das cadeias de ncleos dos miotubos.

    Os achados desta pesquisa, entretanto, mostraram que antes da

    constituio dos miotubos o processo regenerativo do msculo lesado apresenta a

    formao de um tecido semelhante ao tecido cicatricial, com grande quantidade de

    vasos neoformados induzidos pelo USP nos animais estimulados, pois nos animais

    controle a proliferao de vasos neoformados no ocorre no local da rea de necrose

    muscular.

  • 81

    fato notvel tambm que o USP induz a uma multiplicao celular

    intensa, quer de clulas satlites, que se transformaro em mioblastos, quer de clulas

    inflamatrias ou de outra natureza, provavelmente fibroblastos (vide Figura 20).

    Estes achados que esto demonstrados nas fotomicrografias contradizem

    com aqueles de RANTANEN et al. (1999), que empregando o USP, mas usando

    parmetros e tempos diferentes (USP de 2 s de durao a intervalos de 10 s (20%)

    a uma freqncia de 3 MHz e uma intensidade de 1,5 W/cm2, transdutor estacionrio

    durante 6 minutos), admitem que o nico efeito do USP seria o de promover o

    aumento de clulas satlites (at 96%), durante os estadios iniciais da regenerao,

    mas no obteve tal efeito na produo de miotubos. O mesmo autor considera que o

    perodo de produo de fibroblastos, que nos controles ocorreu rapidamente, entre o

    3 e 4 dias, no grupo tratado, essa proliferao estendeu-se por 7 a 10 dias, enquanto

    a recapilarizao era virtualmente inalterada.

    Os achados desta pesquisa no condizem com os de RANTANEN et al.

    (1999), pois flagrante a maior quantidade de vasos neoformados induzidos pelo

    USP bem como a constituio de miotubos em maior quantidade nos msculos

    estimulados e mais precocemente.

    GOUVEA et al. (1998), usando o ultra-som teraputico pulsado

    (freqncia de 1 MHz, intensidade de 0,5 W/cm2, pulsado 1:5, durante 5 minutos)

    propuseram-se estudar a regenerao de fibras musculares do msculo tibial anterior

    de ratos, mediante leses chamadas pelos autores de incisivas. Admitem que o

    padro histolgico (sic) do msculo lesado e tratado com ultra-som foi muito

    diferente do padro histolgico do msculo controle. A reao inflamatria foi

    acelerada pelo ultra-som, o que possibilitou uma remoo mais eficiente das fibras

    necrticas do msculo. Apresentou maior nmero de vasos e fibras recm-formadas.

    O ultra-som estimulou a regenerao muscular com correspondente diminuio do

    tecido fibrtico. Embora os achados desta pesquisa, sob alguns aspectos,

    assemelham-se aos dos autores citados, fica difcil uma comparao pois estes

    autores avaliaram os aspectos histopatolgicos em cortes transversais do msculo.

  • 82

    Um fato importante, at pouco tempo no reconhecido, que as fibras

    musculares so constitudas a partir da coalescncia de mioblastos. Este fato foi

    reconhecido em cultura de tecido muscular (KONIGSBERG, 1961). Esta ocorrncia

    foi evidenciada mediante a marcao de ncleos com istopos radioativos e clulas

    individuais com antimiosina fluorescente para detectar a natureza da populao

    celular (HOLTZER, MARSHAL & FINCK, 1957; WALKER 1963).

    Examinando as Figuras 19D e 20B pode-se constatar que os miotubos

    decorrentes da agregao de mioblastos so mais precoces nos animais estimulados

    com o USP.

    O emprego do USP condiz com as idias de BISCHOFF & HEINTZ

    (1994) os quais admitem uma grande capacidade de regenerao do msculo

    esqueltico sob variadas condies experimentais e que diante deste fato, novas

    estratgias deveriam ser utilizadas com a finalidade de induzir um aumento da

    regenerao de fibras musculares.

    Uma efetiva regenerao muscular requer clulas satlites e condies

    para a miognese. As clulas satlites (descobertas h cerca de 30 anos por MAURO,

    1961) constituem-se na nica fonte de clulas miognicas tronco no msculo

    esqueltico adulto.

    Segundo SCHMALBRUCH apud BISCHOFF & HEINTZ (1994), a

    freqncia de clulas satlites no msculo maduro da ordem de 5% de todos os

    ncleos que se situam dentro da lmina basal, com variaes, dependendo da espcie

    animal e tipo de msculo. As clulas satlites mantm-se viveis mesmo aps

    tratamento que matam ou alteram as miofibrilas, tais como: esmagamentos,

    anestsicos locais, e venenos; e as clulas satlites so tambm mais resistentes

    isquemia que as miofibras.

    Quando ativadas so capazes de cruzar a lmina sarcolemal da miofibra

    em ambas as direes (LIPTON & SCHULTZ, 1979) e migram considerveis

    distncias dentro do msculo (SCHULTZ et al., 1985; 1988). Este fato talvez

    explicasse a grande quantidade de ncleos nos miotubos, relatada nos resultados

  • 83

    desta investigao, decorrentes, provavelmente, de clulas satlites migradas e que,

    inicialmente, se constituiriam em mioblastos e aps, em miotubos.

    BISCHOFF (1986), estudou unidades de clula satlite em cultura

    retirado de msculo de rato adulto esmagado, para identificar e caracterizar a sua

    mitognese. Observou que a quantidade e a rapidez da regenerao dependeu dos

    parmetros de ativao e do ciclo celular das clulas satlites, isto foi importante

    para compreender os fatores que governam o recrutamento e a proliferao destas

    clulas. Relatou tambm que injeo de mitognico (extrato de msculo) tambm

    estimula o crescimento muscular neonatal de rato in vivo. Isto foi observado pelo

    aumento do nmero de mioncleos por fibra depois de tratamento com o extrato de

    msculo. Tambm sugerem que o extrato de msculo estimula a fuso de mioblastos

    in vivo. Isto poderia evidenciar que clulas satlites quiescentes tornam-se ativadas

    por fatores de crescimento liberados por miofibrilas vizinhas lesadas.

    A proliferao continuada das clulas satlites seria sustentada por

    fatores mitogenticos como fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator

    insulnico de crescimento (IGF) os quais seriam regulados pelo msculo aps a leso

    (JENNISCHE & OLIVECRONA, 1987).

    Muitas clulas satlites no msculo em regenerao proliferam dentro de

    mangas vazias de lmina basal de miofibras em degenerao e este material teria

    importncia como: a) suporte mecnico; b) reservatrio de fatores de crescimento e

    c) substrato de macromolculas favorveis miognese.

    Finalmente, o restabelecimento da irrigao e inervao do msculo em

    regenerao seria essencial para o crescimento normal e o seu funcionamento

    (GROUNDS, 1991).

    Considerando a grande capacidade do USP na induo de vasos

    neoformados, quer nos parecer que parte da recuperao de fibras decorra deste fato.

    Acredita-se que parte da velocidade da regenerao decorra da ao do USP. Em

    primeiro lugar pela neoformao vascular que abreviaria a fase necrtica da leso

    favorecendo a fibrose; e em segundo lugar aumentando o nmero de clulas satlites

  • 84

    e sua transformao em mioblastos, estimulando igualmente a agregao dos

    mesmos em miotubos.

    Para ganho de tempo do leitor em evidenciar a grande capacidade do

    USP de baixa intensidade na induo de formao de vasos neo-formados, bem como

    acelerar o processo cicatricial, junta-se aqui a Figura 25 com esta finalidade.

    FIGURA 25 Vasos neoformados induzidos pela ao do ultra-som pulsado em msculo estimulado por 3 dias, com conseqente acelerao da inflamao. Aumento de 1200x.

    Embora os conhecimentos sobre a regenerao do msculo estriado

    tenham progredido nos ltimos anos, demonstrando a influncia de diferentes

    fatores, acredita-se tratar de assunto altamente relevante, pois o progresso em

    quaisquer novos conhecimentos beneficiaro muito os tratamentos mdicos e

    fisioteraputicos.

    A regenerao de fibras musculares esquelticas tem sido documentada

    aps vrios tipos de leses a que so submetidas. Com cada tipo de leso, tanto os

  • 85

    danos das fibras quanto a regenerao, no seriam avaliadas convenientemente

    segundo CARLSON & FAULKNER (1983) seno mediante transplante total do

    msculo. No compartilhamos com as idias destes autores, porque com nossa

    metodologia conseguimos resultados demonstrativos da regenerao muscular.

    Embora os estudos no sejam definitivos, o processo regenerativo parece

    seguir um determinado padro.

    No resta dvidas que os resultados desta pesquisa com o uso do USP de

    baixa intensidade demonstram a acelerao da velocidade da regenerao que pode

    ser caracterizado comparativamente nas fotomicrografias. Os msculos lesados nas

    suas fibras por incises com o bisturi, regeneram mais precocemente quando se lhes

    aplica o USP.

    Fica tambm demonstrado que o nmero de mitoses aumenta sob o efeito

    do USP, bem como o aparecimento precoce de miotubos e a migrao de clulas

    satlites para a formao dos mesmos. Estes fatos decorrem, provavelmente da

    vascularizao induzida pelo USP, a qual se fazem tambm mais intensa e

    precocemente nos animais estimulados por mais tempo. Verifica-se ainda, nos

    animais estimulados, a presena de grande nmero de clulas em mitose bem como o

    aparecimento de miofilamentos nos miotubos recm constitudos.

    Nas fotomicrografias de clulas musculares ntegras fora da rea da

    leso, encontra-se ainda mitoses de clulas satlites, fato no encontradio nos

    animais controles, no estimulados.

    inteno o prosseguimento nesta linha de pesquisa utilizando-se de

    animais isognicos nos quais promover-se-ia o transplante de msculos seguido de

    estmulos com o USP e bloqueio de mitoses com injees de mitostticos.

  • 86

    8 CONCLUSO

    Os resultados, obtidos mediante a anlise histopatolgica da evoluo

    temporal da regenerao de fibras musculares esquelticas, produzidas

    experimentalmente no msculo glteo de ratos, permitem admitir uma regenerao

    precoce das fibras musculares quando estimuladas pelo USP de baixa intensidade.

    H uma intensa formao neovascular, aumento do nmero de mitoses de

    clulas mioprecursoras, maior quantidade de miotubos com miofilamentos nos

    animais estimulados pelo USP, em comparao com o msculo de animais no

    estimulados, submetidos ao mesmo tipo de leso e avaliados a iguais perodos

    evolutivos.

  • 87

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