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AVALIAO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM PULSADO DE BAIXA INTENSIDADE NA REGENERAO DE MSCULOS ESQUELTICOS COM VISTAS APLICABILIDADE EM CLNICA FISIOTERAPUTICA Dyjalma Antnio Bassoli Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao Interunidades (Escola de Engenharia de So Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de Qumica de So Carlos) da Universidade de So Paulo, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Bioengenharia. ORIENTADOR: Affonso Luiz Ferreira So Carlos 2001 ii Ficha catalogrfica preparada pela Seo de Tratamento da Informao do Servio de Biblioteca EESC/USP Bassoli, Dyjalma Antnio B322a Avaliao dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade na regeneraode msculos esquelticos com vistas aplicabilidade em clnica fisioteraputica /Dyjalma Antnio Bassoli. - So Carlos, 2001. Dissertao (Mestrado) - Escola de Engenharia de So Carlos/Faculdade deMedicina de Ribeiro Preto/Instituto de Qumica de So Paulo-Universidade de SoPaulo, 2001. rea: Bioengenharia. Orientador: Prof. Dr. Affonso Luiz Ferreira. 1. Regenerao muscular. 2. Ultra-som pulsado de baixa intensidade. I. Ttulo. iv ...H quem diga que todas as noites so de sonhos. Mas h tambm quem garanta que nem todas, s as de vero. Mas no fundo isso no tem muita importncia. O que interessa mesmo no so as noites em si, so os sonhos. Sonhos que o homem sonha sempre. Em todos os lugares, em todas as pocas do ano, dormindo ou acordado... William Shakespeare v Dedico este trabalho a toda a minha famlia que me incentivou e me auxiliou em todos os momentos. Em especial Maria Emlia, minha filha e Ana Paula, minha esposa, os maiores motivos para vencer este desafio. vi Ao Dr. Affonso Luiz Ferreira. H pensamentos que so oraes, h momentos nos quais, qualquer que seja a posio do corpo, a alma est de joelhos. Victor Hugo. vii Tudo que tenho recebi de Deus; - de que queres me envaidea? Zlkind Platigrsky Quando se consegue chegar ao final do trabalho proposto, pode-se sentir o peso das contribuies dadas por pessoas que ao ajudarem, mesmo supondo serem contribuies simples ou obrigaes, muitas vezes no avaliam o peso de suas atitudes para quem as recebeu. Minha profunda gratido a todos que, direta ou indiretamente, contriburam para a elaborao deste trabalho e particularmente: A Ana Rosa Crisci, pela ajuda em todas as etapas deste trabalho. No carter, na conduta, no estilo, em todas as coisas, a simplicidade a suprema virtude (Henry Wadsworth Longfellow). A Carmen Aparecida Malagutti Barros, que por um destes felizes acasos que ocorrem em nossas vidas, me solicitou companhia para estar em So Carlos em um determinado dia que viria a culminar neste trabalho. Ao Dr. Jos Marcos Alves que, naquele dia, sugeriu que eu procurasse pelo Dr. Affonso Luiz Ferreira. A Ana Maria Arajo Ferreira, Eunice de Oliveira Marques e Luiz Csar Manetti pelas aulas de fsica e matemtica gentilmente oferecidas. Ao amigo Paulo de Tarso Camilo de Carvalho pela ajuda nas primeiras tradues, e na sua pessoa estendo o agradecimento a todos aqueles que junto conosco estiveram cursando as disciplinas tericas na EESC e FMRP, especialmente Elizabete Dias Flausino Gaspar Gomes. Ao Jos Lus Soares obrigado pela disponibilidade e pelo excelente trabalho na preparao das lminas histolgicas. A Dr. Catarina Satie Takahashi do Departamento de Gentica da USP, pela cesso da colchicina. Ao Dr. Orivaldo Lopes da Silva pela ajuda quando da procura da colchicina e pelas informaes sobre o Ultra-som. Aos funcionrios das Secretarias da Bioengenharia (So Carlos e Ribeiro Preto), em especial D. Marielza e Janete. Aos diretores, docentes, discentes e funcionrios da UNICLAR Unidade Batatais SP, pelo apoio e pela confiana. A Regina M. R. Pupin pelo trabalho de digitao e formatao deste trabalho. A Prof. Carolina Luiza Pippa Tomazella Videira pelo auxlio na confeco do abstract. Fisioterapia que tem realizado os meus sonhos e os da minha famlia. viii SUMRIO LISTA DE FIGURAS .............................................................................. 10 LISTA DE TABELAS ............................................................................. 13 RESUMO .................................................................................................. 14 ABSTRACT .............................................................................................. 15 1 INTRODUO ......................................................................... 16 2 O ULTRA-SOM ........................................................................ 20 2.1 Histrico ..................................................................................... 20 2.2 Fsica bsica ............................................................................... 21 2.2.1 Ondas .......................................................................................... 21 2.2.2 Caractersticas das ondas ultra-snicas .................................... 22 2.2.2.1 Velocidade de propagao (c) .................................................... 24 2.2.2.2 Intensidade e campo acstico ..................................................... 24 2.2.23 Modos de propagao ................................................................ 26 2.2.3 Impedncia acstica .................................................................. 27 2.2.4 Reflexo e Refrao ................................................................... 28 2.2.5 Interferncias e Ondas Estacionrias ....................................... 29 2.2.6 Mecanismos de atenuao ......................................................... 30 2.2.7 Transdutores ............................................................................... 31 2.3 Mecanismos de interao do ultra-som com clulas e tecidos biolgicos ....................................................................... 32 2.3.1 Mecanismo trmico .................................................................... 33 2.3.2 Mecanismos no-trmicos .......................................................... 35 2.3.2.1 Cavitao .................................................................................... 35 2.3.2.1.1 Cavitao transiente .................................................................... 36 2.3.2.1.2 Cavitao estvel ......................................................................... 36 2.3.2.2 Fluxo e Microfluxo ..................................................................... 37 2.3.2.3 Piezoeletricidade ......................................................................... 38 ix 3 O TECIDO MUSCULAR ......................................................... 40 3.1 Caractersticas morfolgicas e funcionais do msculo .......... 40 3.2 O msculo estriado esqueltico ................................................ 42 3.3 Visualizao das principais estruturas do tecido muscular .. 50 4 REVISO DA LITERATURA ................................................ 54 5 MATERIAL E MTODOS ..................................................... 61 5.1 Animais de experimentao ..................................................... 61 5.2 Tcnicas Operatrias ................................................................ 61 5.3 Estmulo ultra-snico................................................................. 64 5.4 Elaborao do tecido muscular para o estudo histolgico..... 65 6 RESULTADOS .......................................................................... 67 7 DISCUSSO .............................................................................. 79 8 CONCLUSO ........................................................................... 86 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................... 87 x LISTA DE FIGURAS FIGURA 01- Modo de propagao das ondas ultra-snicas......................... 22 FIGURA 02 - Deslocamento de uma partcula em funo da distncia e do tempo ..................................................................................... 23 FIGURA 03 - Variao da intensidade acstica (I) nos campos ultra-snicos prximos e distantes, em meio aquoso. Na parte a tem-se a variao de I ao longo do eixo x, na parte b tem-se a variao de I ao longo do eixo y (perpendicular pgina), e na parte c, o valor da intensidade mdia ao longo do eixo y, para uma determinada posio .................... 25 FIGURA 04 - Sinal senoidal pulsado............................................................. 26 FIGURA 05 - Tipos de msculos .. 41 FIGURA 06 - Esquema ilustrativo da origem embriolgica de uma fibra muscular esqueltica............................................................... 43 FIGURA 07 - Esquema ilustrativo da arquitetura de um msculo esqueltico .............................................................................. 45 FIGURA 08 - Esquema ilustrativo de um sarcmero e seus componentes ... 46 FIGURA 09 - Corte longitudinal de uma fibra de msculo estriado ............ 50 FIGURA 10 - Representativo de um corte transversal de fibras musculares estriadas .................................................................................. 52 FIGURA 11 - Corte transversal de fibras musculares estriadas .................... 52 FIGURA 12- Anestesia mediante injeo intraperitoneal ............................ 62 FIGURA 13 - Inciso dos planos superficiais ............................................... 62 FIGURA 14 - Demonstrativos das incises praticadas no msculo glteo maior ....................................................................................... 63 xi FIGURA 15 - Demonstrativo da sntese dos planos muscular e superficiais 63 FIGURA 16 Sinal eltrico que excita o transdutor ultra-snico pulsado.... 64 FIGURA 17 - O aparelho de ultra-som pulsado ............................................ 64 FIGURA 18 - Figura representativa de estimulao esttica com o transdutor ultrasnico ............................................................. 65 FIGURA 19 - As fotomicrografias A e C correspondem a reas de necrose de msculos de animais controles (sem estmulo) aps 3 e 6 dias, respectivamente. As fotomicrografias B e D representam as mesmas reas de necrose em msculos de animais estimulados por 3 dias com o ultra-som pulsado. Notar, acima, a intensa proliferao de vasos neoformados ( ),em meio a restos de fibras musculares ( ) e uma diminuio do infiltrado inflamatrio ( ). Alguns animais estimulados (B e D), j apresentam fibroblastos ( ) e incio de formao de miotubos ( ). Cortes de 6 m, corados pelo H.E. Aumento A, C e D de 192x; B de 384x; nos destaques aumento de 288x .................................................................... 69 FIGURA 20 - As fotomicrografias da figura ilustram o msculo de 2 animais controles (A e C) e de 2 animais estimulados pelo ultra-som pulsado (B e D) durante 10 dias. Nos animais controles h ainda necrose em evoluo (crculo), nos animais estimulados h intensa neovascularizao( ), incio de migrao de clulas satlites para restos de membranas, visando a formao de miotubos ( ) e a formao de fibroblastos( ).Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A, B e C de 192x e D de 480x................................................ 71 FIGURA 21 - As fotomicrografias so demonstrativas das diferentes clulas de tecido muscular com 3 dias cujos ncleos em diviso foram bloqueados pela colchicina. Na foto A indicativo de msculo de animal no estimulado cuja leso acha-se em fase inflamatria ( ). Na foto B, de um animal estimulado, esto indicadas metfases de ncleos de clulas satlites em diviso (mioblastos) ( ). Na foto C mioblastos, tambm de animal estimulado, agregando-se para constituir miotubos ( ). Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento: A e C de 480x e B de 1200x ................................................... 74 FIGURA 22 - Fotomicrografias de clulas musculares normais, distantes da rea de leso com 10 dias. A foto A mostra clulas musculares no estimuladas( ). A foto B, trata-se de msculo estimulado, mostrando um ncleo de clula satlite em metfase ( ). Notar que o ncleo acha-se isolado da sarcolema da clula. Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento de 480x.................................................................... 75 xii FIGURA 23 - Fotomicrografias de miotubos ( ) de msculos de animais estimulados pelo ultra-som pulsado por 10 dias consecutivos. Apresentam vrias metfases de ncleos de clulas miognicas ( ), miotubos com numerosos ncleos enfileirados. Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A e D de 480x; B e C de 192x.................................................... 76 FIGURA 24 - Fotomicrografia de uma clula muscular estimulada por 10 dias e formando miofibrilas tendendo a se constituir numa clula muscular normal. Corte de 6m corados pelo H.E.. Aumento de 480x e no destaque de 720x................................ 78 FIGURA 25 - Vasos neoformados induzidos pela ao do ultra-som pulsado em msculo estimulado por 3 dias, com conseqente acelerao da inflamao. Aumento de 1200x... 84 xiii LISTA DE TABELAS TABELA 01- Propriedades acsticas tpicas de vrios meios ...................... 12 TABELA 02- Coeficiente de absoro () em diferentes tecidos para a freqncia de 1 Mhz ............................................................... 16 xiv RESUMO BASSOLI, Dyjalma Antnio. Avaliao dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade na regenerao de msculos esquelticos com vistas aplicabilidade em clnica fisioteraputica. So Carlos, 2001. 94 p. Dissertao (Mestrado em Bioengenharia) - Escola de Engenharia de So Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo. Foi utilizado na presente pesquisa o ultra-som pulsado de baixa intensidade, com a finalidade de avaliar, experimentalmente, seus efeitos fsicos sobre a regenerao do msculo esqueltico de ratos. Foram empregados no experimento 10 animais de ambos os sexos. Aps eleio do msculo glteo maior, foram feitas incises perpendiculares (ps anestesia) s suas fibras, alcanando aproximadamente dois teros de sua espessura. Seguinte s incises, realizou-se sntese do msculo e dos planos superficiais. Foi convencionado estudar os efeitos do ultra-som pulsado aps 3, 6 e 10 dias de estmulo. Antes do sacrifcio dos animais foi-lhes administrado Colchicina, com a finalidade de bloquear aa clulas em diviso. Mediante anlise histopatolgica comparativa dos msculos, constatou-se que enquanto nos animais no estimulados desenvolveu-se, aos 3 dias, reas de necrose e inflamao, naqueles estimulados houve uma diminuio das mesmas. Alm disso, nos animais estimulados, ocorre intensa neovascularizao nas reas de leso. Observou-se tambm uma migrao de clulas miognicas (satlites) para restos de bainhas remanescentes de fibras musculares regeneradas. Constatou-se um aumento de mioblastos com ncleos em metfase. Aos 10 dias, os animais estimulados exibiam inmeros miotubos com formao de miofibrilas, caracterizando clulas musculares em franca maturao. Longe da rea estimulada, o ultra-som foi capaz de induzir mitoses em clulas satlites. Notou-se que os efeitos do ultra-som pulsado aceleram a regenerao de fibras musculares mediante uma intensa neoformao vascular, acelerando a reparao da necrose e formao de mioblastos, os quais agregam-se em miotubos formando novas clulas. Palavras-chave : regenerao muscular; ultra-som pulsado de baixa intensidade. xv ABSTRACT BASSOLI, Dyjalma Antnio. Evaluation of the effects of low intensity pulsed ultrasound on skeletal muscle regeneration having in mind its applicability to physiotherapeutic clinic. So Carlos, 2001. 94 p. Dissertao (Mestrado em Bioengenharia) - Escola de Engenharia de So Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto e Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo. It was used in the present research the low intensity pulsed ultrasound with aim of evaluating, experimentally, its physical effects on the regeneration of rats skeletal muscle. Ten male and female animals were used in this experiment. After election of the gluteus maximus muscle, perpendicular incisions were made (after anesthesia) in its fibers, reaching approximately two thirds of its thickness. After the incisions, a synthesis of the muscles and superficial plans was performed. It was established to study the effects of the pulsed ultrasound after 3, 6 and 10 day-stimuli. Before sacrificing the animals Colchinine was given aiming to block cells in division. By means of comparative histopathological analysis of the muscles, it was verified that in non-stimulated animals an area of necrosis developed in three days, while in those that were simulated there was a decrease of the same. Moreover, on the stimulated animals, there is intense neovascularization in the damaged area. A migration of myogenic cells (satellites) to rests of remaining sheaths from regenerated muscle fiber was also observed. It was verified an increase of myoblasts with nuclei in metaphase. In ten days, the stimulated animals showed countless myotubes with formations of myofibrils, characterizing mature muscle cells. Far from the stimulated area, the ultrasound was able of inducing mitosis to satellite cells. It was noticed that the effects of the pulsed ultrasound accelerate muscle fiber regeneration by means of an intense vascular neoformation, accelerating the restoration of the necrosis and the formation of myoblasts, which aggregates in myotubes forming new cells. Keywords: muscle regeneration; low intensity pulsed ultrasound. 16 1 INTRODUO A 22 de Agosto de 1999, o atleta americano Maurice Greene, conseguiu a marca de 9.80 s para percorrer os 100 metros em linha reta, tornando-se o homem mais veloz do mundo. Pode-se perguntar quais os fatores predisponentes para essa performance. A, perder-se-ia em uma srie de cogitaes, mas um dos fatores primordiais, certamente ser o fisiolgico: as fibras musculares deste fabuloso atleta, especialmente as das suas coxas, contriburam por um lapso de tempo extremamente curto, maior fora que de seus competidores. Naturalmente, se se voltar para o lado esportivo, as pesquisas esto quase sempre envolvidas na capacidade dos msculos adaptarem-se a diferentes desafios, quer o desempenho em uma maratona quer na exploso muscular na largada de uma corrida. O msculo esqueltico o tecido mais abundante do nosso corpo e um dos que podem causar grandes adaptaes. Exerccios podem aumentar o msculo em sua seco fisiolgica de 2 a 3 vezes, podem sofrer um encurtamento de cerca de 20% em pouco tempo, garantindo um aumento do seu trabalho e da sua potncia. A quantidade e qualidade de fenmenos bioqumicos para que o msculo consiga tais adaptaes extremamente complexa. A composio material de um msculo proporciona-lhe a velocidade de contrao dependendo da qualidade e quantidade na composio de suas fibras. As fibras de contrao lenta dependem relativamente mais de um metabolismo aerbico eficiente, enquanto que as fibras 17 rpidas dependem mais de um metabolismo anaerbico. As fibras de contrao lenta destinam-se a trabalhos mais prolongados (como maratonas, natao em provas de longa distncia), enquanto que as fibras de contrao rpida esto relacionadas a trabalhos intensos e de curta durao. Na espcie humana h msculos que apresentam contingentes de fibras rpidas e lentas, na mesma proporo, como no quadrceps. Entretanto existem grandes variaes entre pessoas na proporo da qualidade de fibras. Existem tambm fibras hbridas contendo miosina das duas espcies em propores iguais. Duas das mais fundamentais reas do estudo em pesquisa sobre msculos esquelticos esto ligadas diretamente performance atltica, procurando a melhor maneira de hipertrofiar a musculatura e como esta atividade poderia converter um tipo de fibra em outro. O outro aspecto de grande relevncia o relacionado regenerao muscular correlacionada resposta das clulas satlites, ditas clulas precursoras musculares. Acredita-se que o exerccio rigoroso conduz ao aparecimento de micro-rupturas de fibras musculares. A rea danificada atrairia clulas precursoras (satlites), que se incorporariam ao tecido muscular e iniciariam a produo de protenas para preencher o intervalo lesado. Estes ncleos tornar-se-iam indistintos dos ncleos prprios das clulas musculares. Com esses ncleos adicionais, as fibras ficariam aptas a produzir mais protenas e criar novas miofibrilas. A criao de protenas seria decorrente de gene nuclear e o processo mediante o qual a informao passaria do ncleo para o citoplasma, onde a protena dever ser produzida inicia com uma transcrio (ANDERSEN et al., 2000). Desde 1960, pesquisas foram conduzidas no sentido de converter fibras lentas em fibras rpidas (BUELLER et al. apud ANDERSEN et al., 2000) mediante inverso de inervao procurando transpor nervos destinados a msculos de fibras lentas para msculo de fibras rpidas de modo a controlar fibras de tipos opostos. Os autores relatam que um componente da molcula de miosina, a cadeia denominada pesada, determina as caractersticas funcionais da fibra muscular. Em um adulto, esta cadeia pesada existe em trs variedades diferentes, que so designadas como I, IIa, 18 IIx. As fibras do tipo I, tambm so conhecidas como fibras lentas; as fibras tipo IIa tipo IIx so chamadas fibras rpidas. So assim classificadas por uma boa razo: a velocidade de contrao mxima da fibra tipo I aproximadamente um dcimo da fibra tipo IIx. A velocidade da fibra tipo IIa est entre as de tipo I e IIx. Pesquisadores procuraram demonstrar se a possibilidade de fibras musculares transmudarem-se em tamanho e tipo, referida como plasticidade muscular, fosse tambm aplicvel ao homem. Um exemplo extremo o caso de paraplgicos, sem estmulo muscular levado a uma perda extrema de tecido. Mas, surpreendentemente, o tipo de msculo muda dramaticamente. Estes indivduos paralisados experimentam um decrscimo agudo de quantidade de miosina lenta, enquanto que a quantidade de miosina rpida realmente aumenta. Aps longo perodo predomina a miosina rpida no quadrceps, relembrando que em indivduos sadios a proporo de miosina rpida e lenta no quadrceps de 50%. Levantou-se a hiptese que a ausncia de estmulo nervoso pela ativao eltrica seria necessria para manter a relao de miosina. A converso de fibras no se restringe a indivduos com paralisias musculares. Quando o indivduo submetido a exerccios de fora repetidamente com pesos programados, o nmero de fibras rpidas (IIx) declina, pois se convertem em rpidas (IIa). Ao mesmo tempo as fibras aumentam sua produo de protenas e se espessam (ANDERSEN et al., 2000). Conquanto essas pesquisas conduzidas no sentido de modificar a composio muscular levantando at a hiptese de injees de DNA no msculo estejam em andamento, discute-se muito ainda sobre os mecanismos da regenerao muscular. Qualquer dispositivo, de preferncia no invasivo, que assegurasse uma acelerao do reparo do msculo lesado, seria altamente desejvel. Vive-se uma poca em que a competio esportiva e o culto ao corpo esto amplamente exacerbados. No obstante, as atividades modernas, os esportes radicais e o desempenho da atividade motora levam ao aparecimento de leses musculares, mais ou menos graves, que certamente conduzem a uma perda de atividades, as quais 19 dariam como somatrio, um grande prejuzo funcional e mesmo de natureza econmica. A possibilidade de, mediante estmulos fsicos no invasivos como o Ultra-Som Pulsado (USP) de baixa intensidade (1 a 5% da intensidade do ultra-som fisioteraputico), poder abreviar ou acelerar a reparao de leses musculares, foi o fator que levou a empreender a presente pesquisa. Este trabalho tem pois, como finalidade precpua, demonstrar experimentalmente os efeitos do USP de baixa intensidade, como o utilizado no tratamento de fraturas, na regenerao do msculo esqueltico de ratos. 20 2 O ULTRA-SOM 2.1 Histrico Durante o sculo XIX foi demonstrado que o ouvido humano capaz de detectar sons cujas freqncias de ondas estejam entre 16 Hz e 21 kHz, aproximadamente. No incio do sculo XX, conseguiu-se produzir e detectar ondas sonoras com freqncia acima deste limite, audvel pelo homem, dando origem ao termo Ultra-som (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986). A primeira aplicao prtica do ultra-som foi em 1917 com a criao de sonares para a deteco de submarinos, utilizando o mtodo pulso-eco. Alguns anos mais tarde, descobriu-se que o ultra-som produzia aumento da temperatura em tecidos biolgicos, entre 1930 e 1940 ele foi introduzido na prtica mdica como um recurso teraputico, usado particularmente para produzir calor em tecidos profundos. De 1940 at os dias atuais, o ultra-som vem sendo extensamente usado em reas mdicas e industriais, e novos efeitos e aplicaes do ultra-som vem sendo pesquisados. 21 2.2 Fsica bsica 2.2.1 Ondas As ondas ultra-snicas possuem uma freqncia que varia em torno de 20.000 e 20.000.000 de ciclos por segundo (1 ciclo = 1 hertz), que se propaga como uma onda de presso causando agitao nas molculas do meio em que esto se propagando, fazendo-as oscilarem, quer o meio seja slido, lquido ou gasoso (TER HAAR, 1987). O ultra-som transmitido em forma de ondas de compresso, onde a oscilao de partculas se d paralelamente direo de propagao da onda, constituindo zonas de compresso e rarefao; ou em forma de ondas de cisalhamento (somente para slidos), onde as partculas oscilam em direo perpendicular direo de propagao das ondas. As ondas ultra-snicas so ondas mecnicas e transmitem energia atravs da matria causando uma oscilao nas posies de equilbrio das suas partculas. Estes movimentos oscilatrios so resistidos por foras elsticas de acordo com a estrutura molecular do meio (FREDERICK, 1965). Nos meios slidos podem ser produzidas ondas de trs tipos: longitudinal, transversal e superficial. A onda longitudinal ou depresso se caracteriza por causar oscilaes nas partculas na mesma direo de propagao da onda. A onda transversal causa oscilaes nas partculas em direo perpendicular direo de propagao da onda, e a onda superficial causa oscilaes elipsoidais nas partculas. Nos meios lquidos e gasosos podem ser produzidas ondas apenas do tipo longitudinal (WELLS, 1977). 22 Onda Configurao Longitudinal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transversal FIGURA 1 Modo de propagao das ondas ultra-snicas Devidos ao fato dos tecidos moles do corpo humano serem considerados como um fluido, no presente trabalho sero consideradas somente as ondas ultra-snicas do tipo longitudinal. 2.2.2 Caractersticas das ondas ultra-snicas As ondas ultra-snicas apresentam caractersticas dos demais tipos de ondas, como o comprimento, a amplitude, o perodo e a freqncia (TER HAAR, 1987). O comprimento da onda () corresponde a distncia entre regies adjacentes de compresso ou de rarefao mxima, cujas partculas encontram-se em um mesmo estado de movimento, em um dado instante de tempo. Amplitude (A) corresponde ao deslocamento mximo que uma partcula experimenta partir de sua posio de equilbrio. Descreve a magnitude do distrbio causado pela onda. Perodo (T) o intervalo de tempo necessrio para que uma partcula realize um ciclo completo de movimento. 23 Potncia (P) energia (E) total do feixe em um intervalo de tempo (t), expressa em Watts. A freqncia (f) corresponde ao nmero de vezes que uma partcula realiza um ciclo oscilatrio por unidade de tempo. FIGURA 2 Deslocamento de uma partcula em funo da distncia e do tempo (TER HAAR, 1978). 24 2.2.2.1. Velocidade de propagao (c) A velocidade de propagao de uma onda (c) definida como a distncia percorrida pela onda ultra-snica por unidade de tempo. No entanto, a velocidade de onda ultra-snica depende do tipo de onda considerada e das constantes elsticas do meio em que se propaga. A velocidade de propagao das ondas sonoras decresce dos meios slidos para os lquidos e destes para os gasosos. Nos tecidos moles do corpo humano a velocidade de propagao da onda ultra-snica est ao redor de 1.500 m/s (YOUNG, 1990). 2.2.2.2. Intensidade e campo acstico Intensidade (I) quando uma onda atravessa um meio, as partculas do meio comeam a vibrar e adquirem energia cintica. A energia associada com a onda ultra-snica chamada de intensidade acstica e pode ser definida como a energia (E) que atravessa uma rea (S) em um intervalo de tempo (t). (TER HAAR, 1987). A energia fornecida pelas ondas ultra-snicas ao atravessar o meio medida pela intensidade acstica. Esta definida como a razo mdia do fluxo de energia que atravessa uma unidade de rea pela unidade de tempo (Watts/cm2) (WELLS, 1977). Os valores de intensidades descritos na literatura referem-se geralmente a intensidade transmitida pelo transdutor, e no a intensidade in situ, pois esta difcil de ser medida, embora possa ser calculada teoricamente (ZISKIN, 1985). 25 A intensidade que caracteriza o campo acstico transmitido pelo transdutor medida atravs de dosmetros de ultra-som em um meio de baixa atenuao normalmente em gua. Esses dosmetros medem a fora de radiao (F), possibilitando assim o clculo da potncia acstica (P) e conseqentemente da intensidade acstica temporal e espacial mdia, que definida como o quociente entre a potncia acstica total transmitida e a rea do transdutor. A intensidade apresenta caractersticas diferentes no campo acstico, caracterizando no campo duas regies distintas: o campo prximo ou zona de Fresnel e o campo distante ou zona de Fraunhofer. No campo prximo a intensidade disforme, enquanto no campo distante ela decresce suavemente com a distncia da fonte, como ilustra a Figura 3. FIGURA 3 Variao da intensidade acstica (I) nos campos ultra-snicos prximos e distantes, em meio aquoso. Na parte a tem-se a variao de I ao longo do eixo x, na parte b tem-se a variao de I ao longo do eixo y (perpendicular pgina) , e na parte c, o valor da intensidade mdia ao longo do eixo y, para uma determinada posio (ALVES, 1988 adaptado de TER HAAR, 1978). 26 2.2.2.3. Modos de propagao As ondas ultra-snicas podem se propagar de dois modos, o contnuo e o pulsado, a diferena entre estes dois modos est na interrupo da propagao de energia. No modo contnuo no ocorre esta interrupo, havendo portanto um depsito ininterrupto de energia sobre os tecidos irradiados. No modo pulsado, no entanto, h interrupes freqentes na propagao de energia. Na utilizao do modo pulsado h portanto dois tipos de freqncias a serem consideradas a freqncia da onda (f) citada anteriormente, e a freqncia de repetio de pulso (Fr), como ilustra a Figura 4. FIGURA 4 Sinal senoidal pulsado. (HIKES et al., 1985). 27 2.2.3 Impedncia acstica Impedncia acstica (Z) a propriedade de um meio se opor vibrao de suas partculas frente passagem de ondas ultra-snicas. Indica a propriedade que as ondas tm de se deslocarem mais facilmente em alguns meios que em outros. A impedncia acstica pode ser expressa de diferentes formas (FREDERICK, 1965). No entanto, usa-se comumente a impedncia acstica caracterstica do meio ou condutncia acstica, que obtida pelo produto da intensidade do meio pela velocidade do som no mesmo (Z = . c). A impedncia acstica do meio considerada como constante, visto que, a velocidade do som no meio basicamente constante dentro de uma larga faixa de freqncia (WILLIAMS,1983). A tabela 1, mostra a impedncia acstica caracterstica de diversos meios, assim como suas densidades e as velocidades da onda ultra-snica nestes meios. TABELA 1 Propriedades acsticas tpicas de vrios meios (YOUNG, 1990) MEIO DENSIDADE (g/ml) VELOCIDADE DO SOM (m/s) IMPEDNCIA CARACTERSTICA (106 kg-2 ms 1) Ar 1.293 331.5 429 gua (20) 1.0 1480 1.52 Plasma sanguneo 1.06 1570 1.62 Gordura 0.92 1460 1470 1.35 Fgado 1.06 1540 1585 1.63 1.68 Msculo 1.07 1545 1630 1.65 1.74 Osso 1.38 1.81 2710 4080 3.75 7.38 28 2.2.4 Reflexo e Refrao Quando uma onda sonora encontra uma interface entre dois meios diferentes, parte da energia refletida e outra refratada. A onda refletida retorna em direo negativa atravs do meio incidentes com a mesma velocidade de propagao e a onda refratada continua em direo positiva, mas sua velocidade alterada em funo das caractersticas do meio (WELLS, 1977). Como o coeficiente de reflexo ( r) e o coeficiente de refrao ( t) para as ondas incidentes perpendiculares dependem exclusivamente das impedncias acsticas dos meios (FREDERICK, 1965) e as impedncias acsticas caractersticas dos meios abordados possuem valores muito prximos, ou seja, a impedncia caracterstica do gel (gua) est ao redor de 1,61 x 10-6 kg. m-2 s-1 e dos tecidos moles do corpo est ao redor de 1,62 x 10-6 kg. m-2 s-1 (YOUNG,1990). Os valores destes coeficientes so portanto muito prximos e os fenmenos de reflexo e refrao foram desconsiderados. A porcentagem de energia refletida (r = Ir/Ii) e transmitida ou refratada (t = It/Ii) obtida atravs das equaes 1 e 2, sendo Ii, Ir, e It as intensidades incidente, refletida e transmitida, respectivamente. Os ngulos de incidncia e transmisso so i e t, respectivamente. (1) (2) 2tcos1Zicos2Ztcos1Zicos2ZiIrI+=2)tcos1Zicos2Z(tcosicos1Z2Z4iItI+= 29 Se a incidncia for perpendicular ao meio 2, isto I= 90o, as equaes 1 e 2 so simplificadas: (3) (4) possvel obter total transmisso da energia acstica entre dois meios 1 e 3 se entre eles for utilizado um meio 2 com impedncia acstica Z2 dada pela equao (5). (5) O uso do meio 2 com a finalidade acima denominada de casamento de impedncia e utilizada na construo de transdutores ultra-snicos. 2.2.5 Interferncias e Ondas Estacionrias As ondas ultra-snicas podem apresentar um fenmeno exclusivo dos movimentos ondulatrios denominado interferncia. A interferncia corresponde 21Z2Z1Z2ZiIrI+=2)1Z2Z(1Z2Z4iIrI+=3Z1Z2Z = 30 combinao de duas ou mais ondas em um ponto do meio onde se propagam, podendo ser construtiva ou autodestrutiva. A interferncia construtiva ocorre com a superposio de ventre de ondas que se somam formando um ventre com maior amplitude. A interferncia autodestrutiva ocorre com a superposio de ondas com sinais invertidos, tendendo portanto a se anularem. Essas interferncias ocorrem, por exemplo, quando h reflexo de ondas com a formao de ondas estacionrias. Ondas estacionrias so ondas que refletidas ficam confinadas a um determinado espao e que se ao se sobreporem podem se anular ou se somar (WELLS, 1977). Como a intensidade proporcional ao quadrado da amplitude, deve-se procurar evitar a formao de ondas estacionrias, pois a formao de ondas construtivas pode elevar muito a amplitude e danificar os tecidos irradiados. No entanto, na geometria complexa dos tecidos humanos, a ocorrncia de ondas estacionrias pouco provvel (TER HAAR in REPACHOLI, 1987). 2.2.6 Mecanismos de atenuao A atenuao corresponde ao decrscimo da intensidade em funo da distncia da fonte sonora, e ocorre devido a fatores geomtricos (dimenses da fonte sonora, comprimento de onda, presena de superfcies refletoras, etc.) e por mecanismos de absoro (viscosidade, tempo de relaxao, etc.). Estes mecanismos possuem caractersticas diferentes de acordo com o meio. Nos tecidos biolgicos a atenuao deve-se principalmente aos mecanismos de absoro - mecanismos pelos quais a energia mecnica das ondas ultra-snicas convertida em calor (TER HAAR, 1978). 31 O coeficiente de absoro () diretamente proporcional freqncia, quanto maior a freqncia, mais rpida a absoro (TER HAAR, 1987). A Tabela 2 mostra o coeficiente de absoro para a freqncia de 1 MHz em diferentes meios: TABELA 2 - Coeficiente de absoro () em diferentes tecidos para a freqncia de 1 Mhz (WELL, 1977) Tecidos Coeficiente de absoro () Sangue 0.18 Gordura 0.63 Crebro 0.85 Fgado 0.94 Rim 1.0 Msculos (paralelo s fibras) 1.3 Msculos (transversal s fibras) 3.3 Miocrdio 1.8 Ossos do crnio 20 Pulmo 41 2.2.7 Transdutores O ultra-som de uso mdico, fisioteraputico e odontolgico produzido por transdutores ultra-snicos. Transdutores so dispositivos com a capacidade de responder a uma tenso eltrica, deformando-se, ou a uma tenso mecnica, alterando sua polarizao. Este fenmeno, denominado, piezoeletricidade, foi descoberto por Pierre e Jacques Curie em 1880. Hoje se sabe que a piezoeletricidade uma propriedade natural de certos cristais e substncias cristalizadas que 32 apresentam anisotropia, ou seja, a capacidade de reagir diferentemente de acordo com a direo de propagao de um fenmeno fsico sobre si, como a luz, o calor, etc. (RICHARDSON, 1989). Alguns cristais naturais como o quartzo e a turmalina so piezoeltricos podendo ser usados como transdutores. No entanto, alguns transdutores podem ser produzidos artificialmente como o titanato de brio (BaTiO3) e o zirconato titanato de chumbo (PZT), por exemplo. Neste trabalho o elemento piezoeltrico usado como transdutor para produo de ondas ultra-snicas foi um disco circular de zirconato titanato de chumbo (PZT) de 22 mm de dimetro e freqncia de ressonncia de 1.5 MHz. 2.3 Mecanismos de interao do ultra-som com clulas e tecidos biolgicos Os efeitos biolgicos da ao do ultra-som dependem de muitos fatores fsicos e biolgicos, tais como intensidade, tempo de exposio, estrutura espacial e temporal do campo ultra-snico e estado fisiolgico do objeto. Este grande nmero de variveis complica a compreenso exata do mecanismo de ao do ultra-som na interao com os tecidos biolgicos (SARVAZYAN, 1983). Experimentos realizados com o ultra-som demonstram que a interao deste com os tecidos biolgicos provoca alteraes fisiolgicas, que podem ser benficas ou provocar danos. Independente do tipo de mecanismo de interao que est agindo no tecido biolgico estudado, o objetivo principal tem sido estabelecer limiares para a intensidade ultra-snica, abaixo dos quais no ocorrem efeitos lesivos (FERRARI, 1987). 33 HILL (1972) considerou o limiar de 100 mW/cm2 de intensidade como no lesivo para os tecidos biolgicos, com referncia especial desnaturao do colgeno. Os mecanismos fsicos envolvidos na teraputica do ultra-som que induzem respostas clinicamente significantes sobre as clulas, tecidos, rgos e organismos so geralmente classificados em mecanismos trmicos e no-trmicos (DYSON, 1987). Esses mecanismos e seus subseqentes efeitos esto diretamente relacionados com os parmetros fsicos do ultra-som, com o tempo e a tcnica de aplicao. 2.3.1 Mecanismo trmico Quando uma onda ultra-snica atravessa um tecido biolgico, este aquecido ao absorver parte da energia mecnica ultra-snica. O aumento da temperatura provoca um aumento temporrio na extensibilidade das estruturas altamente colagenosas, como os tendes, ligamentos e cpsulas articulares, e uma reduo na dor e espasmos musculares alm de produzir uma reao inflamatria branda. O aquecimento local produzido pelo ultra-som depende do tipo de tecido (os tecidos altamente proticos absorvem energia mais prontamente do que os tecidos com alto teor de gordura), do fluxo sangneo que irriga o local (uma vez que o calor produzido pode ser dissipado por corrente sangunea) e da freqncia ultra-snica aplicada (as altas freqncias tm uma maior absoro) (DYSON, 1987). 34 Estudos indicam que as altas freqncias so lesivas e podem danificar tecidos e clulas quando a intensidade utilizada ultrapassa o limiar de 100 mW/cm2 (HILL, 1972). A elevao da temperatura tecidual produzida atravs da absoro da energia ultra-snica pode trazer benefcios atravs de uma vasodilatao local ou at queimar os tecidos irradiados. O aumento da temperatura em um tecido irradiado com ultra-som determinado por diferentes fatores, dos quais os mais importantes so: O coeficiente de absoro do tecido; A taxa de energia ultra-snica depositada, a qual depende da intensidade ultra-snica, da distribuio de energia no campo e do modo de propagao da onda; A freqncia da onda ultra-snica; O tempo de irradiao local; A tcnica de aplicao: estacionria ou mvel; As dimenses do corpo aquecido; A presena ou ausncia de superfcies refletoras na frente ou atrs do tecido de interesse (WILLIAMS, 1983). Com os parmetros do feixe ultra-snico otimizados para o uso teraputico em tecidos superficiais (mdia e baixas intensidades e altas freqncias), o aumento local da temperatura e da ordem de centsimos de grau at pouco mais de 1 C (DYSON & SUCKLING, 1978). 35 2.3.2 Mecanismos no-trmicos Com a constatao dos efeitos lesivos provocados pelas altas intensidades, muitos autores tm utilizado intensidades acsticas mais baixas na estimulao ultra-snica. Estas intensidades so muito baixas para provocarem um aumento significativo na temperatura, fato que indica que outros mecanismos que no os trmicos esto envolvidos na interao do ultra-som com o tecido biolgico (DYSON, 1987). Dentre os mecanismos no-trmicos que produzem efeitos nos tecidos biolgicos podemos citar o mecanismo cavitacional. 2.3.2.1 Cavitao Cavitao o termo usado em geral para descrever as atividades de microbolhas em um meio contendo lquido (sangue ou em fluidos dos tecidos), quando estimulado acusticamente. A cavitao engloba formao, crescimento, colapso e efeitos (fsicos, qumicos e biolgicos) associados s bolhas gasosas (FRIZZEL & DUNN, 1984). Essas bolhas de gs formadas no tecido biolgico com a passagem de ondas ultra-snicas, podem permanecer intactas por muitos ciclos (cavitao estvel) ou entrar em colapso liberando grande quantidade de energia (cavitao transiente) (WELLS, 1977). No existem evidncias que ocorram efeitos danosos de cavitao in vivo em tecidos tratados com ultra-som de baixa intensidade (DYSON, 1990). 36 2.3.2.1.1 Cavitao transiente Quando o feixe ultra-snico atravessa o campo oscilando violentamente, provocando grandes alteraes no volume das bolhas levando-as ao colapso, o que pode determinar tambm a imploso celular, denomina-se cavitao transiente (TER HAAR, 1987). A cavitao transiente extremamente danosa. As alteraes de presso e temperatura produzidas no stio do colapso das bolhas podem desintegrar o tecido local com formao de radicais livres altamente reativos que podem causar mudanas qumicas nas clulas e lise celular (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986). No entanto, a cavitao transiente requer intensidades muito mais altas do que aquelas usadas terapeuticamente (aproximadamente 10 w/cm2) (LEITE, 1989), desta forma sua ocorrncia em tecidos biolgicos bastante improvvel. 2. 3.2.1.2 Cavitao estvel Quando as bolhas atravessam o campo ultra-snico oscilando em um feixe estvel, aumentando e diminuindo seu volume conforme as variaes de presso de campo, dizemos que a cavitao estvel (TER HAAR, 1987). Este tipo de cavitao responsvel, em parte, pela estimulao do reparo de tecidos que a onda ultra-snica produz, atravs de modificaes na permeabilidade da membrana celular para os ons de clcio (MUMMERY apud YOUNG & DYSON, 1978) e sdio (MORTIMER & DYSON, 1988) que provocam um aumento na sntese de protenas. H evidncias experimentais considerveis de que nveis teraputicos de ultra-som podem induzir a cavitao estvel in vivo (TER HAAR,1982), mas seus efeitos ainda no esto bem estabelecidos. Entretanto, sabe-se que a cavitao estvel 37 in vitro pode produzir efeitos irreversveis em suspenso celular, como a ruptura de membranas e de macromolculas, a desnaturao de enzimas, etc., dependendo dos parmetros usados (LEITE,1989). A intensidade limiar a partir do qual pode ocorrer cavitao foi determinada em meio aquoso por HILL (1971) em 0,1 W/cm2, e in vivo por TER HAAR et al. (1982) em 0,2 W/cm2. 2.3.2.2 Fluxo e Microfluxo Fluxo (streaming) e microfluxo (microstreaming) correspondem a movimentos unidirecionais que ocorrem em fluidos submetidos a um campo ultra-snico. Esses movimentos originam foras e tenses que podem modificar a posio de partculas intra e extra-celulares ou mesmo a configurao normal das clulas, e consequentemente podem afetar a atividade celular (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986). Podem alterar organelas celulares e membranas de maneira reversvel ou irreversvel, dependendo de sua magnitude. O microfluxo pode ter seu valor teraputico uma vez que sua ao facilita a difuso atravs de membranas. Dependendo do tipo de clula, a alterao inica produzida pode desenvolver alteraes na motilidade, sntese ou secreo celular, que podem acelerar o processo de reparo (DYSON, 1987). Diversos experimentos tm sugerido que o microfluxo causado em tecidos submetidos a nveis teraputicos de ultra-som um dos mecanismos responsveis pela regenerao de tecidos lesados (HADAAD, 1992). 38 2.3.2.3 Piezoeletricidade A piezoeletricidade foi descoberta em 1880 pelos irmos Curie (MASON, 1981) e definida como a propriedade fsica segundo a qual alguns materiais quando deformados por uma tenso mecnica, desenvolvem cargas eltricas superficiais e vice-versa, i. e., ao se colocar um material piezoeltrico sob campo eltrico, as cargas eltricas interagem com o mesmo e o material exibe deformaes mecnicas (OKUNO, CALDAS & CHOW, 1986). FUKADA & YASUDA (1957) foram os primeiros a descreverem a piezoeletricidade em um tecido biolgico o osso. Eles observaram os efeitos direto e inverso no osso, e mostraram que ao sofrer deformaes mecnicas, cargas eltricas so formadas na face oposta do osso, sendo este efeito devido molcula de colgeno. A piezoeletricidade continuou a despertar o interesse da comunidade cientfica, que procurou estabelecer uma relao entre eletricidade e os mecanismos de crescimento e regenerao. As pesquisas de aplicao com energia ultra-snica pulsada de baixa intensidade tiveram em nosso pas e na Amrica Latina como pioneiro o Prof. Luiz Romariz Duarte e sua equipe da Escola de Engenharia de So Carlos USP e seus estudos demonstraram evidncias de que o ultra-som pode acelerar o reparo sseo. Atribuiu a acelerao do processo de consolidao de fraturas sseas por ultra-som de baixa intensidade ao mecanismo de piezoeletricidade (DUARTE, 1983). XAVIER e DUARTE (1983) relatam o impacto que a descoberta da piezoeletricidade em tecido sseo por Fukuda teve no desenvolvimento de tcnicas no-invasivas de tratamento de fraturas. A interveno do homem resume-se, pois, em como colocar cargas eltricas no stio lesado ou como estabelecer uma corrente eltrica que produza ativao naquele ambiente. No caso do ultra-som, as cargas eltricas necessrias ao reparo sseo so produzidas no osso por meio do efeito 39 piezoeltrico, pois o USP atinge a superfcie do osso por uma sucesso de impulsos, cada um deles resultando em um sinal eltrico como resposta do osso. Da por diante, o processo de crescimento do osso regulado pelo campo eltrico assim formado e o metabolismo sseo estimulado bioeletricamente tal como nos outros mtodos invasivos ou no de tratamento de fraturas. A piezoeletricidade (definida no item 2.2.7) um dos principais mecanismos a que se atribui os efeitos ultra-snicos produzidos na reparao do tecido sseo. Este mecanismo se deve propriedade piezoeltrica da molcula de colgeno. Supe-se que a energia mecnica das ondas seja convertida em energia eltrica pelas unidades de tropocolgeno, criando assim um campo eltrico na superfcie do osso fraturado, o que estimularia a proliferao de clulas sseas (XAVIER & DUARTE, 1983). SILVA (1987) demonstrou teoricamente que a aplicao de um campo acstico em tecido sseo produz um campo eltrico ao nvel da membrana celular e pressupe que este efeito deve ocorrer em todos os tecidos que contm colgeno, o que pode ser um dos mecanismos para o efeito do ultra-som sobre o osso e a pele. 40 3 TECIDO MUSCULAR Segundo JUNQUEIRA & CARNEIRO (1999), o tecido muscular, responsvel pelos movimentos corporais, constitudo por clulas alongadas e que contm grande quantidade de filamentos citoplasmticos, responsveis pela contrao. So denominadas estriadas ou lisas dependendo, respectivamente, da presena ou ausncia de um arranjo de protenas contrteis miofibrilares, os miofilamentos, que se repetem regularmente (GARTNER & HIATT, 1997). A diferenciao das clulas musculares, de origem mesodrmica, ocorre principalmente devido a um processo de alongamento gradativo e, com simultnea sntese destas protenas filamentosas. 3.1 Caractersticas morfolgicas e funcionais do msculo Pode-se distinguir nos mamferos trs tipos de tecido muscular: o msculo liso, o msculo estriado cardaco e o msculo estriado esqueltico (objeto deste estudo), observando suas caractersticas morfolgicas e funcionais (Figura 5). 41 As clulas musculares estriadas, cardacas e esquelticas, apresentam estriaes caractersticas, claras e escuras, que esto ausentes no msculo liso (GARTNER & HIATT, 1997). O msculo estriado esqueltico, responsvel pela maior parte da massa muscular voluntria do corpo, formado por feixes de clulas cilndricas muito longas e multinucleadas, que apresentam estriaes transversais. Tem contrao rpida, vigorosa e sujeita ao controle voluntrio. O msculo estriado cardaco, involuntrio e limitado quase exclusivamente ao corao. Apresenta estrias transversais, formado por clulas alongadas e ramificadas, que se unem por intermdio dos discos intercalares, estruturas encontradas exclusivamente no msculo cardaco. Apresentam contrao involuntria, vigorosa e rtmica. O msculo liso est localizado nas paredes dos vasos sangneos e nas vsceras, bem como na derme. formado por aglomerados de clulas fusiformes que no possuem estrias transversais. O processo de contrao lento e no est sujeito ao controle voluntrio (GARTNER & HIATT, 1997; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). FIGURA 5 - Tipos de msculos (Junqueira & Carneiro, 1999, p. 159). 42 3.2 O msculo estriado esqueltico Termos prprios so freqentemente utilizados na descrio dos componentes das clulas musculares. Assim, a membrana celular chamada sarcolema; o citoplasma, sarcoplasma; o retculo endoplasmtico liso, retculo sarcoplasmtico; e, ocasionalmente, as mitocndrias, sarcossomas. Em razo de seu comprimento ser maior que sua largura, as clulas musculares so, freqentemente, chamadas de fibras musculares (GARTNER & HIATT, 1997) . Estas fibras so dispostas paralelamente em relao s vizinhas. Tem vrios ncleos, e esto situados na periferia da clula, sob a membrana celular (sarcolema). Os elementos contrteis ocupam a maior parte do volume da clula, que tem uma relao muita ordenada e especfica entre si, organizao essa responsvel pelas estriaes transversais vista nos cortes longitudinais das fibras musculares esquelticas e que deram origem denominao de msculo estriado. O msculo esqueltico fartamente irrigado com sangue e, geralmente, cada fibra tem em suas proximidades vrios capilares (ROSS & ROWRELL, 1993). Os vasos sangneos penetram no msculo atravs dos septos do tecido conjuntivo e formam uma rica rede de capilares que correm entre as fibras musculares (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). As fibras musculares estriadas tm at 30 cm, com um dimetro que varia de 10 a 100 m. Originam-se no embrio atravs da fuso de clulas alongadas, os mioblastos (Figura 5) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999; WILLIAMS et al., 1995). 43 FIGURA 6 - Esquema ilustrativo da origem embriolgica de uma fibra muscular esqueltica (WILLIAMS et a1., 1995). 44 Muitas centenas de mioblastos, alinham-se com as extremidades voltadas umas para outras, fundem-se e formam clulas longas, conhecidas como miotubos. Segundo MALTIN et al. (1983), miotubo um sinccio (clula que foi gerada pela fuso de duas ou mais clulas, atravs do desaparecimento das paredes de clulas contguas) no qual os ncleos so normalmente arranjados em uma cadeia central. Usualmente contm uma populao de miofibrilas limitada, amplamente espaadas. Estes miotubos recm-formados produzem os constituintes citoplasmticos, bem como elementos contrteis, chamados miofibrilas. As miofibrilas so formadas pelo arranjo especfico de miofilamentos, que so protenas responsveis pela capacidade contrtil das clulas. Num msculo, as fibras musculares esto organizadas em grupos de feixes (fascculos) envolvidos por uma camada de tecido conjuntivo, chamado epimsio. Do epimsio partem septos muito finos de tecido conjuntivo, que se dirigem para o interior do msculo, separando os feixes. Esses septos so chamados de perimsio. O perimsio envolve cada feixe de fibras musculares. Cada fibra muscular, por sua vez, envolvida por uma camada muito fina constituda pela lmina basal da fibra muscular e por fibras reticulares do endomsio (Figura 7). A funo deste tecido conjuntivo manter as fibras musculares unidas, permitindo que a fora de contrao gerada por cada fibra individualmente atue sobre o msculo inteiro (grande significado funcional) porque na maioria das vezes as fibras no se estendem de uma extremidade at a outra do msculo. 45 FIGURA 7 - Esquema ilustrativo da arquitetura de um msculo esqueltico segundo JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999. O citoplasma da fibra muscular apresenta-se preenchido, quase completamente, principalmente por fibrilas paralelas, as miofibrilas (cilndricas, com um dimetro de 1 a 2 m). Aparecem com estriaes transversais, pela alternncia de faixas claras e escuras. A faixa escura (anisotrpica) recebeu o nome de banda A, enquanto a faixa clara (isotrpica) banda I. No centro de cada banda I aparece uma linha transversal escura a linha Z. A estriao da miofibrila devida repetio de unidades iguais, chamadas sarcmeros. Cada sarcmero formado pela parte da miofibrila que fica entre as duas linhas Z sucessivas e contm uma banda A separando duas semibandas I. 46 A banda A apresenta uma zona mais clara no seu centro, a banda H. A disposio dos sarcmeros coincide nas vrias miofibrilas da fibra muscular, e as bandas formam um sistema de estriaes transversais, paralelas, que caracterstico das fibras musculares estriadas. FIGURA 8 Esquema ilustrativo de um sarcmero e seus componentes, segundo JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999. 47 O microscpio eletrnico revela a presena de filamentos finos de actina e filamentos grossos de miosina dispostos longitudinalmente nas miofibrilas e organizados numa distribuio simtrica e paralela (Figura 8). Na contrao muscular os filamentos de actina deslizam sobre os filamentos de miosina. A miosina e a actina representam 55% do total de protenas do msculo estriado. Essa organizao dos filamentos miofibrilares mantida por diversas protenas, como por exemplo filamentos intermedirios de desmina, que ligam as miofibrilas umas s outras. O conjunto de miofibrilas (actina e miosina) , por sua vez, preso membrana plasmtica da clula muscular por meio de diversas protenas que tem afinidade pelos miofilamentos e por protenas da membrana plasmtica. Uma dessas protenas, chamada distrofina, liga os filamentos de actina a protenas integrais da membrana plasmtica. A contrao normal das fibras musculares esquelticas comandada por nervos motores que se ramificam no tecido conjuntivo do perimsio, onde cada nervo origina numerosas terminaes. No local de inervao, o nervo perde sua bainha de mielina e forma uma dilatao que se coloca dentro de uma depresso da superfcie da fibra muscular. Esta estrutura chama-se placa motora. A despolarizao iniciada na placa motora propaga-se ao longo da membrana da fibra muscular e penetra na profundidade da fibra atravs do sistema de tbulos transversais. Em cada trade, estrutura tripla vista no corte transversal, onde as duas cisternas terminais ladeiam um tbulo transversal na juno A-I, o sinal despolarizador passa para o retculo sarcoplasmtico e resulta na liberao de Ca2+, que inicia o ciclo de contrao. Quando a despolarizao termina, o Ca2+ transportado ativamente de volta para as cisternas do retculo sarcoplasmtico e o msculo relaxa (ROSS & ROWRELL, 1993; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). Uma fibra nervosa pode inervar uma nica fibra muscular ou ento se ramificar e inervar at 160 ou mais fibras musculares. A fibra nervosa e as fibras musculares por ela inervadas formam uma unidade motora. 48 A cor do msculo esqueltico vai do rseo ao vermelho, por causa do rico suprimento vascular, bem como da presena de pigmentos de mioglobina, que so protenas transportadoras de oxignio, semelhantes hemoglobina, mas que so menores do que esta. Dependendo da quantidade de mioglobina, do nmero de mitocndrias, da concentrao de vrias enzimas e do grau de contrao, a fibra muscular pode ser classificada de vermelha (tipo I), branca (tipo II) e intermediria (GARTNER & HIATT, 1997; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). As fibras musculares esquelticas identificadas como do tipo I, ou fibras lentas, so ricas em sarcoplasma, de cor vermelho-escura, adaptadas para contraes continuadas. As fibras do tipo II, ou fibras rpidas, so de cor vermelho-clara, adaptadas para contraes rpidas e descontnuas (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). Dois importantes processos podem modificar o tecido muscular: hipertrofia (processo caracterizado pelo aumento do volume das clulas), e hiperplasia (crescimento devido proliferao das clulas por multiplicao mittica) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). Quanto regenerao: no adulto, os trs tipos de tecido muscular exibem diferenas na capacidade regenerativa aps uma leso que produza destruio parcial do msculo. O msculo cardaco no se regenera. Nas leses do corao, como nos enfartes, por exemplo, as partes destrudas so invadidas por fibroblastos que produzem fibras colgenas, formando uma cicatriz de tecido conjuntivo denso. O msculo liso capaz de uma resposta regenerativa eficiente. Ocorrendo leso, as clulas musculares lisas que permanecem viveis entram em mitose e reparam o tecido destrudo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). Segundo CARLSON apud WILLIAMS et al. (1995), a regenerao do msculo esqueltico do homem limitada, e se a leso grande, a regenerao pode no ocorrer, o msculo perdido ento substitudo por tecido conectivo. Embora os ncleos das fibras musculares esquelticas no se dividam, o msculo tem uma pequena capacidade de reconstituio. Admite-se que as clulas 49 satlites sejam responsveis pela regenerao do msculo esqueltico. A Clula Satlite uma clula mononucleada situada entre a membrana plasmtica e a lmina basal da fibra muscular (MALTIN et al., 1983). As clulas satlites so fusiformes, dispostas paralelamente s fibras musculares, dentro da lmina basal que envolve as fibras e s podem ser identificadas no microscpio eletrnico (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). Essas clulas satlites, apresentam ncleos que parecem pertencer clula muscular, mas que na realidade pertencem a estas pequenas clulas. Elas localizam-se entre a membrana celular da clula muscular e sua lmina basal; so clulas-tronco latentes (so consideradas mioblastos inativos) que podem proliferar aps qualquer pequena leso para dar origem a novos mioblastos. Aps uma leso ou outro estmulo, as clulas satlites tornam-se ativas, proliferam por diviso mittica e se fundem umas s outras para formar novas fibras musculares esquelticas. Enquanto a lmina basal permanece ntegra, os mioblastos fusionam-se dentro dela para formar miotubos que, quando maduros, originam novas fibras. Em contrapartida, o rompimento da lmina basal produz o reparo por fibroblastos do local lesado com formao de tecido cicatricial. As clulas satlites tambm entram em mitose quando o msculo submetido a exerccio intenso. Neste caso elas se fundem com as fibras musculares preexistentes, contribuindo para a hipertrofia do msculo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999; ROSS & ROWRELL, 1993). 50 Legenda A - Banda A I - Banda I Z - Linha Z M - Fibra muscular C - Capilares Asteriscos regio do citoplasma livre de miofibrila Aumento de 400x 3.3 Visualizao das principais estruturas do tecido muscular FIGURA 9 Corte longitudinal de uma fibra de msculo estriado (ROSS & ROWRELL, 1993). Neste corte pode-se observar o alinhamento paralelo (M) das fibras musculares; elas esto orientadas verticalmente na ilustrao e parecem ter espessuras diferentes. No destaque circular so vistas as estriaes. Podem ser visualizadas as bandas A (mais escura) e a banda I (mais clara). Alm disso, esse 51 destaque mostra uma linha delgada que divide em duas a banda I; trata-se da linha Z. A banda H no visvel. Ainda no destaque, pode-se examinar o citoplasma em torno do ncleo. Este revela que as estriaes transversais no se estendem at as reas citoplasmticas adjacentes aos plos nucleares. Esse citoplasma cora-se ligeiramente (asterisco) e contm uma concentrao de organelas que no participam diretamente do processo de contrao. Entre as fibras musculares h uma pequena quantidade de tecido conjuntivo delicado, o endomsio (a letra C mostra a presena eritrcitos nos capilares situados no endomsio). Na Figura 10 possvel observar a forma poligonal das fibras quando cortadas transversalmente. Ocorre uma grande variao no que diz respeito largura de cada fibra includa no corte, porque algumas podem ser cortadas ao longo do seu dimetro maior; outras, ao longo do seu dimetro menor; e outras, ainda, ao longo de dimetro intermedirios. So parcialmente definidas por numerosos ncleos, mas, no aumento mostrado na Figura 10, no fcil afirmar se esses ncleos pertencem s clulas musculares, s clulas do endotlio capilar, s clulas satlites ou aos fibroblastos do endomsio, que circunda cada clula muscular. Uma quantidade maior de tecido conjuntivo (CT) separa os feixes de fibras musculares; este tecido conjuntivo chamado perimsio; contm artrias e veias. 52 Legenda FIGURA 10 Representativo de um corte transversal de fibras musculares estriadas (aumento de 260x) (ROSS & ROWRELL, 1993). Legenda FIGURA 11 Corte transversal de fibras musculares estriadas (aumento de 640 vezes) (ROSS & ROWRELL, 1993). BV Vasos sanguneos CT Tecido conjuntivo (perimsio) M - Fibra muscular (envolvida pelod i )N - Ncleos das clulasmusculares Setas eritrcitos nos capilares 53 A Figura 11 mostra vrias clulas musculares, em maior aumento. Os ncleos (N) que se projetam para o interior do citoplasma pertencem clula muscular (contudo, deve-se observar que alguns ncleos, nessa posio, podem pertencer s clulas satlites, indiferenciadas, situadas no lado muscular da lmina basal e que no podem ser identificadas com preciso em amostras coradas com H & E). Revelam-se numerosas estruturas anulares (asteriscos) no endomsio; trata-se de capilares vazios. As setas mostram eritrcitos de capilares que foram cortados mais oblqua ou longitudinalmente. 54 4 REVISO DA LITERATURA A regenerao do msculo esqueltico sempre foi investigada tendo como padro alguns dispositivos e artifcios experimentais para a sua investigao, tais como: transplante de msculo; regenerao de enxertos livres; regenerao aps denervao ou de msculo inervado; padronizao de leses; injees de anestsicos ou venenos; exerccios exaustivos; calor; frio; isquemias; incises; transplantes de fragmentos e auto transplantes. LAWSON-SMITH & McGEACHIE (1998), referem que a miognese e a regenerao celular dependem das clulas satlites (mpc clulas mioprecursoras), as quais seriam as precursoras da miognese, embora pouco se saiba (a exceo de sua localizao anatmica em relao clula muscular normal ou sua capacidade de migrar), a respeito do seu papel na miognese. O uso da timidina triciada para marcar a proliferao de clulas satlites (as quais no so distinguveis no tempo) e a subsequente localizao de sua progenie nos ncleos dos miotubos revelaram uma coincidncia com o tempo da miognese, mas no com a natureza das clulas satlites. CAMPION (1984) na sua reviso sobre clula satlite muscular (mpc) diz que desde 1961, quando houve a primeira referncia s clulas satlites, sabe-se consideravelmente sobre sua distribuio filogentica, sua localizao, morfologia e funo. No h dvidas que seja capaz de multiplicar-se e ter uma considervel motilidade. Funcionam como progenitoras de ncleos de miofibras e so provavelmente adicionadas durante o crescimento ps-natal do msculo. Quando da 55 regenerao muscular funcionam como clula tronco da miognese para produzir mioblastos que se alinham, usando como suporte as lminas basais remanescentes, ou migram nos interstcios para produzir uma neofibra. Os mecanismos mediante os quais um grande nmero de estmulos ativam as clulas satlites no so conhecidos e nem aqueles mecanismos que mantm as clulas satlites inativas durante o crescimento e na idade adulta. Fatores mitogenticos esto presentes na leso muscular; suas caractersticas especficas e mecanismos de ao so desconhecidos. Maior compreenso desses mecanismos poderia aumentar a possibilidade da recuperao total do msculo submetido a uma leso ou doena. CARLSON (1986), considera que entre os modelos experimentais para o estudo da regenerao muscular o ideal seria o transplante de fragmentos musculares. Assim considerando, os trs maiores fenmenos ligados regenerao seriam: a revascularizao, a reinervao e o restabelecimento de conexes tendinosas. No que concerne ao comportamento das clulas na regenerao do msculo lesado, LEFAUCHER & SBILLE (1995) consideram que este comportamento varia com a natureza da leso. A leso isqumica comparada leso txica (como aquela provocada pela injeo de veneno de cobra), injetada no msculo tibial anterior do camundongo, mostrou que a leso isqumica seria caracterizada por um infiltrado inflamatrio mais extenso e a fase de fagocitose das miofibras degeneradas seria mais curto. Este fato levaria produo precoce de clulas precursoras (satlites) por fatores liberados pelas clulas inflamatrias. A leso txica mostrou maior conservao de membrana de miofibras necrosadas que serviam de suporte para fuso de clulas satlites (mpc) em miotubos e melhor microvascularizao. BODINE-FOWLER (1994), admitiu que o msculo esqueltico tem uma grande capacidade de regenerao aps leso, seja parcial ou completa, de suas fibras. Entre os tipos de leso inclui como leses diretas: esmagamento, puno, incises, congelamento, isquemia, aplicao local de anestsicos, exerccios excntricos e uma grande variedade de doenas neuromusculares. 56 Os fatores que limitariam a capacidade de regenerao do msculo esqueltico aps trauma ou doena seriam a populao de clulas satlites viveis, a reinervao e a revascularizao. CARLSON & FAULKNER (1983) consideram a regenerao como a nica adaptao do msculo esqueltico que ocorre em resposta a uma leso, a regenerao resultaria na restaurao maior ou menor da estrutura original e funo do msculo. Admitem que a regenerao de msculos esquelticos comparvel, estrutural e funcionalmente, com a constituio do msculo durante o desenvolvimento embrionrio. BISCHOFF (1975), muniu-se de um sistema de cultura de clulas musculares esquelticas isoladas de ratos adultos, com a finalidade de estudar a origem e o comportamento dos mioblastos mononucleares durante a regenerao muscular. Durante as primeiras poucas horas as fibras in vitro sofrem alteraes degenerativas incluindo grumos miofibrilares de contrao e picnose de mioncleos. ALBROOK (1962), afirma que a capacidade de fibras musculares estriadas sofrerem uma regenerao limitada aps leso um fato bem estabelecido, mas a maneira precisa como isto ocorre est ainda aberto a investigaes. O quadro citolgico da necrose da fibra muscular e sua regenerao subsequente so complexos devido variada velocidade das alteraes morfolgicas nas diferentes regies da leso e do numeroso tipo de clulas que tomam parte no processo regenerativo. FISCHER et al. (1990), consideram que 6 a 24 h aps o trauma do msculo, o segmento danificado mostra uma grosseira dilacerao e degenerao. Aps 24 at 48 h h um aumento do nmero de ncleos sarcolemais, alguns dos quais so semelhantes s clulas satlites que se originam. Dentro de 3 dias clulas regeneradoras do msculo desenvolvem ncleos centrais e reorganizam sarcmeros. NIKOLAOU et al. (1987), admitem que aps leso controlada, provocada por esforo, a cicatrizao da leso muscular 7 dias aps apresentava inflamao reduzida e a fibrose por colgeno mais avanada. Os achados desses 57 autores demonstraram que a recuperao funcional do msculo ocorre 48 horas aps, a despeito da inflamao e da cicatrizao ativas. CRISCO et al. (1994), desenvolveram uma tcnica reproduzvel de lesar o msculo e passvel de quantificao. Confirmam histologicamente diferentes estadios de leso da fibra leso aguda, degenerao, regenerao e normalizao. A funo contrtil como indicativa de performance muscular, estaria significativamente comprometida pela leso por contuso e melhorava a cada estgio histolgico. NOONAN et al. (1994), procuraram determinar as primeiras evidncias da leso muscular induzida por estiramento passivo em msculo de coelho. Consideram que alteraes nas propriedades contrteis e o estgio histolgico parecem ser mais sensveis no prognstico da leso, que as medidas da falncia das propriedades estruturais. Este estudo oferece clinicamente a evidncia de que o uso do msculo que portador de uma pequena leso disrruptiva predispe o indivduo a uma leso adicional . BRASSEUR et al. (1997), no estudo da degenerao e regenerao de fibras musculares estriadas na distrofia de Duchenne, consideram que esta doena caracterizada pela coexistncia de leses degenerativas de fibras musculares e de alteraes regenerativas. Neste trabalho os autores procuram verificar o grau de regenerao em diferentes estadios da doena, analisando a expresso de vrios marcadores de proliferao celular e diferenciao muscular. Estudando a expresso de marcadores musculares (vimentin, desmin, isoforms of the myosin heavy chain) foi possvel determinar-se o grau preciso de maturao e diferenciao de fibras em regenerao. Os resultados sugerem que uma regenerao abortada de fibras musculares na sndrome pode explicar, pelo menos parcialmente, a evoluo progressiva da doena. KUREK et al. (1996), admitem que um grande nmero de fatores de crescimento esto envolvidos na coordenao da proliferao e diferenciao de clulas musculares e, particularmente aps leso em doenas. O fator inibidor da leucemia (LIF) estimula fortemente a proliferao de mioblastos in vitro e in vivo, e sua expresso na leso muscular sugere que o LIF pode ter um papel como um fator 58 de trauma. Administrado a msculos de camundongos demonstrou estimular a formao de longos miotubos. Esta ao miotrfica indica que o LIF contribui para a regenerao do msculo. HURME & KALIMO (1992), consideram importante para a cicatrizao da leso muscular a remoo do material muscular necrosado por macrfagos da rea da leso o mais cedo possvel, pois esse processo parece ser um pr-requisito para a ativao e proliferao de clulas satlites nas vizinhanas da rea da leso. A proliferao de clulas satlites deveria comear antes da granulao e que o tecido cicatricial prolifere excessivamente e obstrua a regenerao de clulas musculares atravs do intervalo entre os cotos das miofibras rompidas. BISCHOFF & HEINTZ (1994), afirmam que o msculo esqueltico tem uma acentuada capacidade de regenerao sob condies experimentais; substanciais quantidades de msculo perdidas por leso ou isquemia no so geralmente repostas em situaes clnicas (KAKULAS,1982 apud BISCHOFF & HEINTZ, 1994). RANTANEN et al. (1999), trataram experimentalmente a leso do msculo gastrocnmio do rato com USP em leso produzida por contuso. A velocidade da mioregenerao dos animais tratados com USP foi comparada aos controles por imunohistoqumica, morfometria e anlise cintilogrfica. Embora as clulas satlites tivessem aumentado 96% nos tratados com Ultra-Som durante os primeiros estgios da regenerao, no houve o mesmo efeito na produo de miotubos. O perodo de proliferao rpida de fibroblastos de 3 a 4 dias aumentou de 7 a 10 dias comparando-se o grupo controle com o tratado pelo USP, enquanto a recapilarizao no foi afetada. Embora o USP promova um aumento na proliferao de clulas satlites na fase de mioregenerao, no parece ter efeitos significativos sobre as demais manifestaes morfolgicas da regenerao muscular. SCHULTZ & JERYSZAK (1985), em seus estudos observaram que as clulas satlites do msculo so as clulas tronco miognicas que funcionam para reparar as fibras musculares lesadas. A participao das clulas satlites na resposta regenerativa leso muscular resulta numa significante reduo de seu potencial 59 cumulativo de proliferao. A magnitude da reduo proporcional ao nmero de respostas de regenerao nas quais elas participam. DANILOV et al. (1996), estudaram as particularidades da regenerao aps danos por tiro em coelhos. A fase inicial do processo seria a de uma zona de necrose ps-traumtica, desintegrao do tecido muscular esqueltico e ativao de macrfagos. A fase proliferativa inicia-se 36 horas aps a leso e inclui a ativao de miosatelitcitos, proliferao e aparecimento de mioblastos. O processo de diferenciao celular miognica semelhante quela embrionria. CHOU & NONAKA (1977), afirmam que a formao de miotubos, caracterstica habitual da miognese, raramente ocorre no processo regenerativo institudo pelas clulas satlites em doenas dos msculos esquelticos humanos. BODINE-FOWLER (1994), no estudo da leso muscular revelam que o msculo esqueltico tem uma remarcvel capacidade de regenerao resultante de leso parcial ou total da fibra muscular. A regenerao segue numa seqncia caracterstica e est limitada a trs fatores: populao de clulas satlites, reinervao e revascularizao. BISCHOFF (1990), estudou as miofibras com suas clulas satlites isoladas de ratos adultos para verificar a influncia de miofibras maduras na proliferao de clulas satlites. As clulas satlites permanecem quiescentes quando cultivadas em meio contendo soro, mas proliferam quando expostas ao fator mitogentico extrado de msculos adultos esmagados. Os resultados indicam que o contato com a superfcie de uma miofibra madura suprime a proliferao de clulas miognicas mas as clulas no se fundem com a miofibra. HURME & KALIMO (1992), afirmam que ncleos de clulas satlites marcadas no aparecem antes que se iniciem a fagocitose de restos necrotizados. Geralmente um dia aps o trauma muitos ncleos so encontrados na rea de necrose de miofibras rompidas, enquanto que poucos deles na poro sobrevivente. extensa a proliferao de clulas satlites no 4 dia de regenerao e poucas marcadas no 7 dia. Especula-se se o fator de crescimento liberado pelos macrfagos seria necessrio 60 em vista do decrscimo de clulas satlites marcadas ao 7 dia. A maioria dos mioncleos, necessria regenerao de miofibras, produzida precocemente dentro dos cilindros de lminas basais preservadas e distribudas naquelas partes das miofibras que se estendem entre o tecido conjuntivo e o muscular. Como j havamos visto, LEFAUCHER & SBILLE (1995), estudaram os eventos celulares da degenerao e regenerao do msculo com vrios modelos de leso. A comparao da leso isqumica com a txica mostrou nesta, uma extenso do infiltrado inflamatrio e um encurtamento da fase de fagocitose do dano das miofibras. Isto levou diferenciao e proliferao de clulas precursoras (mpc) ocorrer mais precocemente o que pode ter sido promovido por fatores de crescimento liberado pelas clulas inflamatrias. O incio da regenerao muscular est estreitamente ou fortemente relacionado aos eventos que ocorrem durante a fase de regenerao. 61 5 MATERIAL E MTODOS 5.1 Animais de experimentao Na presente pesquisa foram utilizados 10 ratos albinos da variedade Wistar com pesos variando de 120-140 g e obtidos no biotrio da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto. Colocados em gaiolas apropriadas, foram mantidos 24 horas no ambiente do laboratrio para aclimatao. Durante o experimento e nos perodos ps-operatrios at o sacrifcio, foram mantidos sob condies ambientais, com um ritmo circadiano de luz e escuro, recebendo gua e rao balanceada (Purina) vontade. 5.2 Tcnicas Operatrias As leses musculares, padronizadas, foram obtidas conforme os seguintes passos: a) anestesia mediante injeo intraperitoneal de Rompum e Ketalar em quantidades iguais, na dose de 0.10 ml da soluo, para cada 100 g de peso do 62 animal; FIGURA12 Anestesia mediante injeo intraperitoneal. b) fixao do animal em prancha operatria seguida de tricotomia da face externa das coxas D e E; c) aps assepsia com lcool-iodado a 2% fazia-se uma inciso longitudinal com bisturi (lmina 4), dos planos cutneos e fscia do msculo glteo maior; FIGURA 13 Inciso dos planos superficiais. 63 d) exposto o msculo faziam-se cortes perpendiculares s suas fibras alcanando, em profundidade, cerca de 2/3 da espessura do msculo; FIGURA 14 Demonstrativos das incises praticadas no msculo glteo maior. e) a seguir, as leses musculares eram suturadas com fios de nylon 4.0, e pontos separados. A sutura dos planos superficiais tambm era feita com o mesmo tipo de fio e pontos separados; FIGURA 15 Demonstrativo da sntese dos planos muscular e superficiais. 64 5.3 Estmulo ultra-snico Aps as incises nos msculos das duas coxas, marcaram-se os animais para compor os 3 grupos experimentais, de maneira aleatria. Compostos os grupos, procedeu-se um sorteio para o sacrifcio aps 3, 6 ou 10 dias de aplicao do USP. O equipamento utilizado tinha as seguintes caractersticas: freqncia fundamental de 1,5 MHz, pulsado, freqncia de repetio dos pulsos de 1 kHz, largura de pulso de 200s. Os tecidos, alvos deste trabalho, foram submetidos ao campo prximo do transdutor, onde a intensidade medida foi de 16 mW/cm2 em meio aquoso. FIGURA 16 Sinal eltrico que excita o transdutor ultra-snico pulsado. FIGURA 17 O aparelho de USP (produzido no Laboratrio de Bioengenharia do Grupo de Bioengenharia do Departamento de Engenharia de Materiais, Aeronutica e Automobilstica da EESC - USP). 65 Todos os animais s foram estimulados aps decorridos 24 horas da cirurgia. Os animais foram estimulados sempre do lado direito com o USP, sendo o transdutor aplicado de maneira estacionria acoplado com hidrogel. Cada aplicao durava dez minutos a cada dia, pela manh e o lado esquerdo, que servia como controle era submetido a uma sonicao fictcia (Figura 18). FIGURA 18 Figura representativa de estimulao esttica com o transdutor ultrasnico. 5.4 Elaborao do tecido muscular para o estudo histolgico Para o estudo histopatolgico, e para avaliar a multiplicao celular, os animais foram inoculados, via intraperitoneal, com 0,15 ml de uma soluo padro de Colchicina para cada 100 gr de peso, 6 horas antes do sacrifcio. (Colchicina cedida pela Prof. Dr. Catarina Satie Takahashi do Depto de Gentica da USP Faculdade de Filosofia). Os animais, decorridos os tempos estabelecidos para a aplicao do USP, foram sacrificados por inalao excessiva de ter etlico. Os msculos eram 66 reduzidos a fragmentos contendo uma poro da rea lesada pelas incises e os pontos de sutura do tegumento eram retirados, assim como os pontos que foram dados nos msculos. Aps fixao em soluo fixadora de Bouin por cerca de 2 horas, os fragmentos musculares eram processados rotineiramente para incluso em parafina e posterior obteno de cortes histolgicos com 6 m de espessura. Os cortes foram corados com hemalumem e eosina. As lminas contendo os cortes corados, foram examinadas e fotografadas em fotomicroscpios Zeiss sob diferentes aumentos. 67 6 RESULTADOS Na exposio dos resultados procurou-se seguir uma ordenao de acordo com a proposta inicial do trabalho. Convencionou-se conduzir o experimento de modo que o msculo do lado direito, submetido s incises, seria o estimulado por 3, 6 e 10 dias, enquanto que o do lado esquerdo, igualmente submetido s incises, seria submetido a uma estimulao fictcia, por perodos equivalentes. A regenerao do msculo estriado ou esqueltico adulto, independentemente do tipo de leso, obedece a um cortejo de fatos, ou etapas, mais ou menos bem definidas e caracterizveis histopatologicamente. Aproveita-se a oportunidade de dizer aqui, porm, para posterior discusso, que nem todos os fatos relacionados regenerao do msculo esqueltico esto, at hoje, bem esclarecidos. Da seqncia de eventos caracterizveis histopatologicamente durante a regenerao muscular, tem-se de incio uma necrose tecidual com a mobilizao de clulas inflamatrias, seguida de fagocitose de restos celulares pela ao de macrfagos provindos da circulao sangnea adjacente rea de necrose. necrose seguem-se a revascularizao e a proliferao de clulas mio-precursoras, ou satlites (MAURO, 1961), tambm chamadas de miognicas. Em seguida estas clulas se diferenciam em mioblastos os quais se fundem para 68 constituir os miotubos, que por sua vez amadurecem e se transformam em novas fibras musculares (LAWSON-SMITH & McGEACHIE, 1998). A regenerao muscular em quaisquer dos modelos experimentais, seja por incises ou traumatizando fibras musculares, nas quais apenas parte das fibras so lesadas, so seguidas de um modelo rpido e completo de regenerao (CHURCH, 1970; CHURCH, apud MAURO et al., 1970; SCHULTZ et al., 1985). A velocidade de regenerao, entretanto, no ocorre naqueles modelos aos quais a perda muscular (injeo de txicos , p.e.) muito intensa (BENOIT & BELT, 1970; ONO et al., 1993). Na Figura 19, esto documentados, mediante fotomicrografias, aspectos histopatolgicos da evoluo da necrose das reas incisionadas de msculos de animais no estimulados, aos 3 e 6 dias aps leso. Pode-se verificar uma intensa inflamao, com restos celulares de fibras lesadas. Com a administrao da colchicina, clulas inflamatrias e clulas precursoras da miognese esto com seus ncleos bloqueados em metfase. Notar que aos 6 dias diminui o nmero de clulas inflamatrias e j h a formao de fibroblastos jovens de permeio a restos celulares e clulas satlites. Aps estmulo pelo USP, aos 3 dias, observa-se restos de clulas musculares, diminuio das clulas inflamatrias e uma intensa neoformao vascular. Em alguns casos j h a confluncia de mioblastos agregando-se para formar miotubos, cujos extremos esto voltados para a rea de reparo da necrose (19D). A necrose a primeira ocorrncia que se segue ao dano causado s fibras musculares. o primeiro acontecimento reconhecvel histopatologicamente, e que em geral fica restrito ao centro da rea lesada. Procurou-se na Figura 19 documentar o centro das reas de necrose. 69 B AFIGURA 19 As fotomicrografias A e C correspondem a reas de necrose de msculos de animais controles (sem estmulo) aps 3 e 6 dias, respectivamente. As fotomicrografias B e D representam as mesmas reas de necrose em msculos de animais estimulados por 3 dias com o ultra-som pulsado. Notar, acima, a intensa proliferao de vasos neoformados ( ), em meio a restos de fibras musculares ( )e uma diminuio do infiltrado inflamatrio( ) . Alguns animais estimulados (B e D), j apresentam fibroblastos( ) e incio de formao de miotubos ( ). Cortes de 6 m, corados pelo H.E. Aumento A, C e D de 192x; B de 384x; nos destaques aumento de 288x. D C 70 Aps a leso, a necrose das fibras lesadas que ocorre precocemente caracterizada pela grande mobilizao de clulas inflamatrias, enquanto que as fibras musculares situadas distantes da leso permanecem ntegras, mesmo porque o msculo no fora denervado. A irrigao das fibras no envolvidas na rea de necrose preservada. Em seqncia fase inflamatria, inicia-se a fagocitose de restos celulares, por macrfagos migrados da circulao adjacente para a rea de necrose. Estudos tm demonstrado que este fato ocorre 24 a 48 horas aps. A tendncia a evoluo da necrose para uma fibrose reparadora. As metfases observadas na sua maioria so de clulas que futuramente vo se transformar em mioblastos (possivelmente metfases de ncleos de clulas miognicas - m.p.c.). No se pode assegurar, entretanto, que todos os ncleos em metfase sejam de clulas satlites ou precursoras, mas provavelmente de fibroblastos ou de outras clulas inflamatrias mobilizadas para resolver o processo de necrose, pois so indiferentemente bloqueados pela colchicina. Compe-se a Figura 20 de fotomicrografias de msculos de animais controle, sem estmulo, e de animais estimulados pelo USP. 71 A B C D FIGURA 20 As fotomicrografias da figura ilustram o msculo de 2 animais controles (A e C) e de 2 animais estimulados pelo ultra-som pulsado (B e D) durante 10 dias. Nos animais controles h ainda necrose em evoluo (circulo), nos animais estimulados h intensa neovascularizao ( ), incio de migrao de clulas satlites para restos de membranas, visando a formao de miotubos ( ) e a formao de fibroblastos ( ). Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A, B e C de 192x e D de 480x. 72 Enquanto nos msculos estimulados, h formao de vasos, alguns de parede j constituda e contendo sangue (animais estimulados por 10 dias), naqueles no estimulados h ainda zonas de necrose, infiltrados inflamatrios e restos celulares. A agregao de mioblastos nos animais estimulados tambm evidenciada. Pode-se constatar que mesmo decorridos 10 dias aps leso, nos animais no estimulados havia ainda necrose, enquanto que nos estimulados, alm de intensa neoformao vascular (que induzida precocemente), ocorreu tambm a agregao de mioblastos em colunas. Na Figura 19B (pgina 69) pode-se tambm notar a flagrante quantidade de ncleos em metfase na fotomicrografia de um animal estimulado por 3 dias, o que permite supor que o USP estimula tambm a produo celular, especialmente de clulas miognicas. Entretanto no se pode configurar na maioria dos ncleos bloqueados um volume de citoplasma que pudesse caracteriza-los como ncleos de mioblastos, ou que nem todas as mitoses bloqueadas correspondam a ncleos de clulas mioprecursoras. O evento decisivo na regenerao do msculo esqueltico a proliferao de clulas miognicas precursoras e sua diferenciao em mioblastos. Nem todos os msculos esquelticos dentro de uma mesma espcie animal tm a distribuio linear de clulas satlites semelhante (CAMPION, 1984). Alm disso, a relao entre clulas satlites e ncleo de fibras de 1:9. As clulas satlites existem em associao com vrios tipos de fibras descritas no msculo esqueltico (SCHMALBRUCH & HELLHAMMER apud CAMPION, 1984). As clulas satlites no aparecem antes que os restos de tecidos necrotizados tenham sido fagocitados, geralmente um dia aps o trauma (fcil de ser constatado nas figuras nas quais esto representados msculos que foram estimulados). A maior parte das clulas satlites est localizada na poro necrosada 73 das miofibras rompidas, enquanto apenas poucas se localizam na regio de fibras no lesadas e em geral situadas a uma certa distncia da rea de leso ou necrose (Figura 22). Alguns autores (HURME & KALIMO, 1992) no admitem a migrao de clulas satlites, considerando que a maioria das clulas satlites produzida localmente ou prximo ao local da leso. Na Figura 21 esto fotomicrografias que documentam metfases de ncleos, que se constituem em mioblastos caractersticos de animais estimulados pelo USP por 3 dias. Estas clulas parecem ter a capacidade de migrar de clulas vizinhas ntegras ou de clulas musculares que estiveram envolvidas na degenerao necrtica. Comparando-se as trs fotomicrografias podemos verificar que no animal no estimulado (A), h maior nmero de clulas inflamatrias, enquanto que nos animais estimulados (B, C) parece haver uma induo para a formao de mioblastos e para que estes se agreguem. Alguns mioblastos parecem estar penetrando em restos de membrana celular de clulas degeneradas, para constituir futuros miotubos (Figura 21C). Miofibras isoladas com clulas satlites isoladas de ratos adultos foram usadas para verificar a influncia da fibra madura em relao proliferao celular. Embora experincias desta natureza sejam conduzidas in vitro e portanto difceis de serem extrapoladas para o comportamento da regenerao muscular in vivo, alguns fatos parecem conciliar o que aqui foi exposto. As clulas satlites seriam estimuladas em presena de extratos de msculos adicionados ao meio de cultura, enquanto isto no feito, elas permanecem quiescentes. O contato da clula satlite com a miofibrila suprime a proliferao das mesmas, mas estas no se prendem a miofibra. Admite-se tambm que o nmero de clulas satlites esteja relacionado com o grau de regenerao das fibras. 74 B A C FIGURA 21 As fotomicrografias so demonstrativas das diferentes clulas de tecido muscular com 3 dias cujos ncleos em diviso foram bloqueados pela colchicina. Na foto A indicativo de msculo de animal no estimulado cuja leso acha-se em fase inflamatria( ). Na foto B, de um animal estimulado, esto indicadas metfases de ncleos de clulas satlites em diviso (mioblastos)( ). Na foto C mioblastos, tambm de animal estimulado, agregando-se para constituir miotubos ( ). Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento: A e C de 480x e B de 1200x. 75 Ao se examinar a Figura 22, pode-se constatar que no animal estimulado, as fibras ntegras, longe da rea lesada, apresentam estriao e clulas satlites em metfases. Enquanto este fato mais raro nas fibras dos animais no estimulados. A simples observao dos ncleos das fibras mostra igualmente diferena na morfologia e na basofilia dos mesmos. FIGURA 22 - Fotomicrografias de clulas musculares normais, distantes da rea de leso com 10 dias. A foto A mostra clulas musculares no estimuladas ( . ). A foto B, trata-se de msculo estimulado, mostrando um ncleo de clula satlite em metfase ( . ). Notar que o ncleo acha-se isolado da sarcolema da clula. Cortes de 6m corados pelo H.E. Aumento de 480x. Msculos de animais estimulados por 10 dias consecutivos mostram a presena ainda de numerosas clulas satlites bloqueadas em metfase e em contato ou nas proximidades de miotubos prximos rea da leso. O nmero porm, de metfases reduz quantitativamente, embora no tenhamos feito nenhum tipo de contagem, mas apenas avaliando a quantidade de metfases encontradas aos 3 dias e 10 dias aps estmulo. Nas fotomicrografias da Figura 23 verifica-se a formao de numerosos miotubos e um decrscimo de ncleos de clulas miognicas em A B 76 A C D B metfase. notvel tambm o nmero de ncleos por miotubo. FIGURA 23 Fotomicrografias de miotubos ( ) de msculos de animais estimulados pelo ultra-som pulsado por 10 dias consecutivos. Apresentam vrias metfases de ncleos de clulas miognicas ( ), miotubos com numerosos ncleos enfileirados. Cortes de 6m corados pelo H.E.. Aumento: A e D de 480x; B e C de 192x. 77 O nmero de ncleos existentes nos miotubos (em alguns chegando a vrias dezenas) parece decorrer da adio de mioblastos j que consenso a regenerao muscular fazer-se de maneira semelhante, seguindo, estrutural e funcionalmente, o que ocorre durante o desenvolvimento embrionrio do msculo. Para esclarecimento do leitor sugere-se reportar ao esquema da evoluo embrionria de uma fibra muscular pgina 43. O processo regenerativo, quaisquer sejam os tipos de agentes lesivos e leses provocadas, parece seguir um esquema relativamente rgido e comum a todos os tipos de leses, exceto aquelas determinadas por agentes txicos ou com grande perda de substncia muscular. Segundo alguns autores o exerccio facilitaria a regenerao, mas pouco se sabe quanto ao incio ou quanto intensidade adequada dos mesmos para o favorecimento da regenerao. O sucesso da regenerao muscular aps leso requer a ativao das clulas satlites dormentes, as quais esto contidas na lmina basal das clulas musculares adjacentes. Em presena de uma adequada vascularizao, proliferam em miotubos, os quais certamente iro evoluir para novas clulas musculares, fatos demonstrveis nas fotomicrografias ilustrativas de etapas da nossa experimentao. A Figura 24 representativa de miotubos de msculos estimulados por 10 dias, mostrando a formao de miofibrilas, caracterizando a maturidade da clula muscular regenerada. 78 FIGURA 24 - Fotomicrografia de uma clula muscular estimulada por 10 dias e formando miofibrilas (no destaque) tendendo a se constituir numa clula muscular normal. Corte de 6m corados pelo H.E.. Aumento de 480x e no destaque de 720x. 79 7 DISCUSSO Os trabalhos desenvolvidos para aumentar a compreenso sobre a regenerao muscular, com conseqente uso pela fisioterapia, procuram estudar a dinmica muscular aps leso, to comuns em clnica fisioteraputica. Assim, so utilizados alguns modelos de tratamento, muitos deles objeto de trabalho da fisioterapia (como o USP), que apesar de muito utilizados, ainda carecem de informaes cientficas a respeito de seus efeitos sobre a recuperao do msculo esqueltico lesado. A inteno que, posteriormente, possam ajudar a embasar protocolos de reabilitao mais eficientes para os indivduos acometidos pelas leses musculares. No foi encontrado na literatura relacionada com o assunto que ora pesquisou-se seno apenas dois trabalhos nos quais os autores utilizam-se do USP para avaliar os efeitos do mesmo sobre a regenerao de msculo estriado. pertinente lembrar que o aumento local da temperatura com os parmetros usados no presente trabalho considerado desprezvel (DUARTE, 1987; HADAAD, 1992; ZISKIN, 1989), portanto os resultados decorrentes do uso do Ultra-som, neste experimento, devem-se exclusivamente aos mecanismos no-trmicos. A capacidade das fibras musculares esquelticas se regenerarem uma realidade estabelecida e aceita pelos citologistas, muito embora numerosos profissionais engajados no tratamento de pacientes com leses musculares, 80 permaneam ainda desconhecendo esta realidade. Aps uma leso muscular grave, entretanto, uma certa quantidade de fibras, entra em necrose e no se recupera mais funcionalmente. A membrana sarcolemal que envolve as fibras na rea de necrose fica porm, geralmente e parcialmente preservada e espessada, podendo esvaziar-se de seu sarcoplasma. O espao entre fibras lesadas sofre inicialmente um edema e/ou hematoma (KRIINEN et al., 1998), e aps cerca de 12 horas invadido por um infiltrado celular inflamatrio que migra para a rea lesada e passados 4 dias, o infiltrado celular diminui. So substitudos por fagcitos (macrfagos) que migram para a rea lesada com a finalidade de remover e fagocitar restos celulares da rea de necrose. Dentro de 4 a 6 dias aps a leso das clulas, os tubos sarcolemais so liberados dos detritos da necrose inicial se alinham em colunas de mioblastos agregados. WALKER (1963), por um processo de excluso, admitia que os mioblastos se originariam de clulas musculares. Outros autores entretanto relacionam-os s clulas satlites (MAURO, 1961); MUIR et al. (1965) afirmam que esses mioblastos formariam um sinccio alongado dentro dos tubos sarcolemais nos quais se dispe como uma longa cadeia de ncleos. Nestas clulas, que os autores chamam agora de miotubos apareceriam precocemente miofilamentos abaixo da membrana plasmtica, fato demonstrado a microscopia eletrnica por ALBROOK (1962). Outros autores (HOLTZER et al., 1957) evidenciaram a formao de miofilamentos com o emprego da antimiosina fluorescente, demonstrando que se dispunham de cada lado das cadeias de ncleos dos miotubos. Os achados desta pesquisa, entretanto, mostraram que antes da constituio dos miotubos o processo regenerativo do msculo lesado apresenta a formao de um tecido semelhante ao tecido cicatricial, com grande quantidade de vasos neoformados induzidos pelo USP nos animais estimulados, pois nos animais controle a proliferao de vasos neoformados no ocorre no local da rea de necrose muscular. 81 fato notvel tambm que o USP induz a uma multiplicao celular intensa, quer de clulas satlites, que se transformaro em mioblastos, quer de clulas inflamatrias ou de outra natureza, provavelmente fibroblastos (vide Figura 20). Estes achados que esto demonstrados nas fotomicrografias contradizem com aqueles de RANTANEN et al. (1999), que empregando o USP, mas usando parmetros e tempos diferentes (USP de 2 s de durao a intervalos de 10 s (20%) a uma freqncia de 3 MHz e uma intensidade de 1,5 W/cm2, transdutor estacionrio durante 6 minutos), admitem que o nico efeito do USP seria o de promover o aumento de clulas satlites (at 96%), durante os estadios iniciais da regenerao, mas no obteve tal efeito na produo de miotubos. O mesmo autor considera que o perodo de produo de fibroblastos, que nos controles ocorreu rapidamente, entre o 3 e 4 dias, no grupo tratado, essa proliferao estendeu-se por 7 a 10 dias, enquanto a recapilarizao era virtualmente inalterada. Os achados desta pesquisa no condizem com os de RANTANEN et al. (1999), pois flagrante a maior quantidade de vasos neoformados induzidos pelo USP bem como a constituio de miotubos em maior quantidade nos msculos estimulados e mais precocemente. GOUVEA et al. (1998), usando o ultra-som teraputico pulsado (freqncia de 1 MHz, intensidade de 0,5 W/cm2, pulsado 1:5, durante 5 minutos) propuseram-se estudar a regenerao de fibras musculares do msculo tibial anterior de ratos, mediante leses chamadas pelos autores de incisivas. Admitem que o padro histolgico (sic) do msculo lesado e tratado com ultra-som foi muito diferente do padro histolgico do msculo controle. A reao inflamatria foi acelerada pelo ultra-som, o que possibilitou uma remoo mais eficiente das fibras necrticas do msculo. Apresentou maior nmero de vasos e fibras recm-formadas. O ultra-som estimulou a regenerao muscular com correspondente diminuio do tecido fibrtico. Embora os achados desta pesquisa, sob alguns aspectos, assemelham-se aos dos autores citados, fica difcil uma comparao pois estes autores avaliaram os aspectos histopatolgicos em cortes transversais do msculo. 82 Um fato importante, at pouco tempo no reconhecido, que as fibras musculares so constitudas a partir da coalescncia de mioblastos. Este fato foi reconhecido em cultura de tecido muscular (KONIGSBERG, 1961). Esta ocorrncia foi evidenciada mediante a marcao de ncleos com istopos radioativos e clulas individuais com antimiosina fluorescente para detectar a natureza da populao celular (HOLTZER, MARSHAL & FINCK, 1957; WALKER 1963). Examinando as Figuras 19D e 20B pode-se constatar que os miotubos decorrentes da agregao de mioblastos so mais precoces nos animais estimulados com o USP. O emprego do USP condiz com as idias de BISCHOFF & HEINTZ (1994) os quais admitem uma grande capacidade de regenerao do msculo esqueltico sob variadas condies experimentais e que diante deste fato, novas estratgias deveriam ser utilizadas com a finalidade de induzir um aumento da regenerao de fibras musculares. Uma efetiva regenerao muscular requer clulas satlites e condies para a miognese. As clulas satlites (descobertas h cerca de 30 anos por MAURO, 1961) constituem-se na nica fonte de clulas miognicas tronco no msculo esqueltico adulto. Segundo SCHMALBRUCH apud BISCHOFF & HEINTZ (1994), a freqncia de clulas satlites no msculo maduro da ordem de 5% de todos os ncleos que se situam dentro da lmina basal, com variaes, dependendo da espcie animal e tipo de msculo. As clulas satlites mantm-se viveis mesmo aps tratamento que matam ou alteram as miofibrilas, tais como: esmagamentos, anestsicos locais, e venenos; e as clulas satlites so tambm mais resistentes isquemia que as miofibras. Quando ativadas so capazes de cruzar a lmina sarcolemal da miofibra em ambas as direes (LIPTON & SCHULTZ, 1979) e migram considerveis distncias dentro do msculo (SCHULTZ et al., 1985; 1988). Este fato talvez explicasse a grande quantidade de ncleos nos miotubos, relatada nos resultados 83 desta investigao, decorrentes, provavelmente, de clulas satlites migradas e que, inicialmente, se constituiriam em mioblastos e aps, em miotubos. BISCHOFF (1986), estudou unidades de clula satlite em cultura retirado de msculo de rato adulto esmagado, para identificar e caracterizar a sua mitognese. Observou que a quantidade e a rapidez da regenerao dependeu dos parmetros de ativao e do ciclo celular das clulas satlites, isto foi importante para compreender os fatores que governam o recrutamento e a proliferao destas clulas. Relatou tambm que injeo de mitognico (extrato de msculo) tambm estimula o crescimento muscular neonatal de rato in vivo. Isto foi observado pelo aumento do nmero de mioncleos por fibra depois de tratamento com o extrato de msculo. Tambm sugerem que o extrato de msculo estimula a fuso de mioblastos in vivo. Isto poderia evidenciar que clulas satlites quiescentes tornam-se ativadas por fatores de crescimento liberados por miofibrilas vizinhas lesadas. A proliferao continuada das clulas satlites seria sustentada por fatores mitogenticos como fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator insulnico de crescimento (IGF) os quais seriam regulados pelo msculo aps a leso (JENNISCHE & OLIVECRONA, 1987). Muitas clulas satlites no msculo em regenerao proliferam dentro de mangas vazias de lmina basal de miofibras em degenerao e este material teria importncia como: a) suporte mecnico; b) reservatrio de fatores de crescimento e c) substrato de macromolculas favorveis miognese. Finalmente, o restabelecimento da irrigao e inervao do msculo em regenerao seria essencial para o crescimento normal e o seu funcionamento (GROUNDS, 1991). Considerando a grande capacidade do USP na induo de vasos neoformados, quer nos parecer que parte da recuperao de fibras decorra deste fato. Acredita-se que parte da velocidade da regenerao decorra da ao do USP. Em primeiro lugar pela neoformao vascular que abreviaria a fase necrtica da leso favorecendo a fibrose; e em segundo lugar aumentando o nmero de clulas satlites 84 e sua transformao em mioblastos, estimulando igualmente a agregao dos mesmos em miotubos. Para ganho de tempo do leitor em evidenciar a grande capacidade do USP de baixa intensidade na induo de formao de vasos neo-formados, bem como acelerar o processo cicatricial, junta-se aqui a Figura 25 com esta finalidade. FIGURA 25 Vasos neoformados induzidos pela ao do ultra-som pulsado em msculo estimulado por 3 dias, com conseqente acelerao da inflamao. Aumento de 1200x. Embora os conhecimentos sobre a regenerao do msculo estriado tenham progredido nos ltimos anos, demonstrando a influncia de diferentes fatores, acredita-se tratar de assunto altamente relevante, pois o progresso em quaisquer novos conhecimentos beneficiaro muito os tratamentos mdicos e fisioteraputicos. A regenerao de fibras musculares esquelticas tem sido documentada aps vrios tipos de leses a que so submetidas. Com cada tipo de leso, tanto os 85 danos das fibras quanto a regenerao, no seriam avaliadas convenientemente segundo CARLSON & FAULKNER (1983) seno mediante transplante total do msculo. No compartilhamos com as idias destes autores, porque com nossa metodologia conseguimos resultados demonstrativos da regenerao muscular. Embora os estudos no sejam definitivos, o processo regenerativo parece seguir um determinado padro. No resta dvidas que os resultados desta pesquisa com o uso do USP de baixa intensidade demonstram a acelerao da velocidade da regenerao que pode ser caracterizado comparativamente nas fotomicrografias. Os msculos lesados nas suas fibras por incises com o bisturi, regeneram mais precocemente quando se lhes aplica o USP. Fica tambm demonstrado que o nmero de mitoses aumenta sob o efeito do USP, bem como o aparecimento precoce de miotubos e a migrao de clulas satlites para a formao dos mesmos. Estes fatos decorrem, provavelmente da vascularizao induzida pelo USP, a qual se fazem tambm mais intensa e precocemente nos animais estimulados por mais tempo. Verifica-se ainda, nos animais estimulados, a presena de grande nmero de clulas em mitose bem como o aparecimento de miofilamentos nos miotubos recm constitudos. Nas fotomicrografias de clulas musculares ntegras fora da rea da leso, encontra-se ainda mitoses de clulas satlites, fato no encontradio nos animais controles, no estimulados. inteno o prosseguimento nesta linha de pesquisa utilizando-se de animais isognicos nos quais promover-se-ia o transplante de msculos seguido de estmulos com o USP e bloqueio de mitoses com injees de mitostticos. 86 8 CONCLUSO Os resultados, obtidos mediante a anlise histopatolgica da evoluo temporal da regenerao de fibras musculares esquelticas, produzidas experimentalmente no msculo glteo de ratos, permitem admitir uma regenerao precoce das fibras musculares quando estimuladas pelo USP de baixa intensidade. H uma intensa formao neovascular, aumento do nmero de mitoses de clulas mioprecursoras, maior quantidade de miotubos com miofilamentos nos animais estimulados pelo USP, em comparao com o msculo de animais no estimulados, submetidos ao mesmo tipo de leso e avaliados a iguais perodos evolutivos. 87 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ALBROOK, D. (1962). An electron microscopic study of regenerating skeletal muscle. J. Anat., v.96, n.2, p.137-52. ALVES, J.M. (1988). Efeitos da energia ultra-snica na regenerao de pele de animal com queimadura por calor. So Carlos. Dissertao (Mestrado) Escola de Engenharia de So Carlos/Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo. ANDERSEN, J.L.; SCHJERLING, P.; SALTIN, B. (2000). Muscle, genes and athletic performance. Scientific American, v.283, n.3, p.30-7, Sept. BENOIT, P.W.; BELT, W.D. (1970). Destruction and regeneration of skeletal muscle after treatment with a local anaesthetic bupivicaine (Marcaine). J. Anat., v.107, p.547-66. BISCHOFF, R. (1975). Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec., v.182, p.215-236. BISCHOFF, R. (1986). A satellite cell mitogen from crushed adult muscle. Developmental Biology. v. 115, p. 140-147. BISCHOFF, R.; HEINTZ, C. (1994). Enhancement of skeletal muscle regeneration. Developmental Dynamics, v.201, p.41-54. BISCHOFF, R. (1990). Interaction between satellite cells and skeletal muscle fibers. Development, v.109, p.943-52. 88 BODINE-FOWLER, S. (1994). Skeletal muscle regeneration after injury - An Overview. Journal of Voice, v.8, n.1, p.53-62. BRASSEUR, G.; ONOLFO, J.P.; COPIN, H.; LEPERCHEY, F.; BARBET, J.P. (1997). Degeneration and regeneration of striated muscle fibers in Duchenne muscular dystrophy. Bull. Assoc. Anat (Morphologie), v. 81, n.252, p.9-13 /Resumo. CAMPION, D. R. (1984). The muscle satellite cell: a review. International Review of Cytology, v.87, p. 225-51. CARLSON, B. M.; FAULKNER, J. A. (1983) The regeneration of skeletal muscle fibers following injury: a review. Medicine and Science in Sports and Exercise. v.15, n.3, p.187-98. CARLSON, B. M. (1986). Regeneration of entire skeletal muscle. Federation Proceedings. v.45, n.5, p.1456-60. CHOU, S. M.; NONAKA, I. (1977). Satellite cells and muscle regeneration in disease human skeletal muscle. Journal of the Neurological Sciences, v.34, p.131-45. CHURCH, J. C. T. (1970). Cell populations in skeletal muscle after regeneration. Embryol. Exp. Morph. v.23, p.531-7. CRISCO, J. J.; JOKL, P.; HEINEN, G. T.; CONNELL, M. D.; PANJABI, M. M. (1994). A muscle contusion injury model - biomechanics, phisiology and histology. The American Journal of Sports Medicine, v.22, n.5, p.702-10. DANILOV, R.K.; ODINTSOVA, I.A.; NAIDENOVA, I.U.G. (1996). The regeneration of skeletal muscle tissue after a gunshot injury. Morfologia, v.110, n.5, p.86-90 /Resumo. DUARTE, L.R. (1987) Estimulao ultra-snica do calo sseo. So Carlos. Tese (Livre-Docncia) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo. DUARTE, L.R. (1983). The stimulation of bone growth by ultrasound. New York, Archives of Orthopaedic and Traumatic Surgery, v.101, p.153-9. DYSON, M. (1987). Mechanisms Involved in Therapeutic Ultrasound. Physiotherapy, v.73, n.3, p.116-20, Mar. DYSON, M. (1990). Role of Ultrasound in Wound Healing. In: KLOTH, L.C. et al. (eds.). Altternatives in Wound Management. Phyladelphia: F. Davis. p.259-284. 89 DYSON, M.; SUCKLING, J. (1978). Stimulation of tissue repair by ultrasound: a survey of the mechanisms involved. Physiotherapy, v. 64, n.4, p.105-8, apr. FERRARI, A. L. (1987) Estudos dos mecanismos de cavitao em meio biolgico. So Carlos, 133p. Dissertao (Mestrado) Escola de Engenharia de So Carlos/Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo. FISCHER, B.D.; BARACOS, V.E.; SHNITKA, T.K.; MENDRYK, S.W.; REID, D.C. (1990). Ultrastutural events following acute muscle trauma. Medicine and Science in Sports and Exercise. v.22, n.2, p.185-93. FREDERICK, J. R. Ultrasound engineering. New York, John Willey & Sons, 1965. 379p. FRIZZEL, L. A.; DUNN, F. (1984) Biphysics of ultrasound. In: Lehman J.F. Therapeutic heat and cold. 3.ed. London, Willians & Wilkins. Cap. 8-10, p. 353-562. FUKADA, E.; YASUDA, I. (1957). On Piezoeletric Effect of Bone. Journal of Physical Society of Japan. v.12, n.10, p.1152-62, Oct. GARTNER, P.L.; HIATT, J.L.(1999). Histologia. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. GOUVA, C.M.C.P; VIEIRAL, P.M.N. & AMARAL, A.C. (1998) Efeito do Ultra-som na recuperao de msculo tibial anterior de rato lesado. Rev. Univ. Alfenas, v.4, p.165-173. GROUNDS, M.D. (1991). Towards understanding skeletal muscle regeneration. Pathol. Res. Pract. v.187, n.1, p.1-22. HADAAD, S. (1992) Estmulo do testculo de ratos pr-pberes, pberes e adultos com ultra-som pulsado de baixa intensidade. Ribeiro Preto. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo. HIKES, D. L; HEDRICK, W. R.; STARCHMAN, D. E. (1985) Ultrasound physics and instrumentations. New York, Churchill Livingstone. 247p. HILL, C. R. (1972). Ultrasonic Exposure Threshold for Changes in Cell and Tissues. The Journal of the Acoustical Society of America, v.52, p.667-72. HOLTZER, H.; MARSHAL, J.M.; FINCK, H. (1957). Analysis os myogenesis by the use of fluorescent antimyosin. J. Biophys. Biochem. Cytol. v.3, p.705-24. 90 HURME, T.; KALIMO, H. (1992). Activation of myogenic precursor cells after muscle injury . Medicine and Sciences in Sports and Exercise, v.24, n.2, p.197-205. JENNISCHE, E.; OLIVECRONA, H. (1987). Transient expression of insulin-like growth factor I immunoreactivity in skeletal muscle cells during postnatal development in the rat. Acta Physiol. Scand. v.131, p.619-622. JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. (1999) Histologia Bsica. 9.ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. KRIINEN, M.; KRIINEN, J.; JRVINEN, T.L.N.; SIEVNEN, H.; KALIMO, H.; JRVINEN, M. (1998). Correlation between biomechanical and structural changes during the regeneration of skeletal muscle after laceration injury. Journal Of Orthopaedic Research, v. 16, p. 197-206. KONIGSBERG, I. R. (1961) Cellular differentiation in colonies derived from single cell platings of freshly isolated chick embryo muscle cells. Proc. Nat. Acad. Sci., v.47, p.1868-72. KUREK, J.; BOWER, J.; ROMANELLA, M.; AUSTIN, L. (1996). Leukaemia inhibitory factor treatment stimulates muscle regeneration in the mdx mouse. Neurosci. Lett., , v.212, n.3, p.167-70. LAWSON-SMITH, M. J.; McGEACHIE, J. K. (1998). The identification of myogenic cells in skeletal muscle, with emphasis on the use of tritiated thymidine autoradiography and desmin antibodies. J. Anat. , v.192, p.161-171. LEFAUCHER, J. P.; SBILLE, A. (1995). The cellular events of injured muscle regeneration depend on the nature of injury. Neuromusc. Disord. v.5, n.6, p. 501-509. LEITE, A. J. (1989). Quantificao da ruptura celular produzida por Ultra-som em eritrcitos do sangue humano. Ribeiro Preto. Dissertao (Mestrado) - Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras, Universidade de So Paulo. LIPTON, B.H.; SCHULTZ, E. (1979). Developmental fate of skeletal muscle satellite cells. Science, v.205, p.75-80. MALTIN, C. HARRIS, J.B.; CULLEN, M.J. (1983). Regeneration of mammalian skeletal muscle following the injection of the snake-venom toxin, paipoxin. Cell. Tissue Res., v.232, p.565-77. MASON, W. P. (1981). Piezoelectricity, its History and Applications. Journal Acoust. Soc. Am., v.70, p. 1561-6. 91 MAURO, A. (1961). Satellite cells of skeletal muscle fibers. J. Biophys. Biochem. Cytol. v.9, p.493-5. MAURO, A.; SHAFIQ, S.A.; MIHORAT, A. T. (eds). (1970). Regeneration of striated muscle and myogenesis. Amsterdan: Excerpta Medica, p.118-121. MOTIMER JR, A.; DYSON, M. (1988). The effect of therapeutic ultrasound on calcium uptake in fibroblasts. Ultrasound in Medicine and Biology, v.14, n.6, p.499-506. MUIR, A. R.; KANJI, A. H. M.; ALBROOK, D. (1965) The struture of the satellite cell in skeletal muscle. J. Anat., v.99, p.435-444. NIKOLAOU, P.K.; MACDONALD, B.L.; GLISSON, R.R.; SEABER, A.V.; GARRET JR, W.E. (1987). Biomechanical and histological evaluation of muscle after controlled strain injury. The American Journal of Sports Medicine, v.15, n.1, p.9-14. NOONAN T.J.; BEST, T.M.; SEABER, A.V.; GARRETT JR., W.E. (1994). Identification of a threshold for skeletal muscle injury. The American Journal of Sports Medicine, v.22, n.2, p.257-261, mar./apr. OKUNO, E.; CALDAS, I.L.; CHOW, C. Fsica para cincias biolgicas e biomdicas. So Paulo, Harba, 1986. 490 p. ONO, K.; ABE, J.I.; KAGAWA, H.; HIZAWA, K. (1993). Imunohistochemical analysis of myoblast proliferation and differentiation in experimental skeletal muscle regeneration. Zentralbl. Pathol., v.139, p.231-237. RANTANEN, J.; THORSSON, O.; WOLLMER, P.; HURME, T.; KALIMO, H. (1999). Effects of therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after experimental muscle injury. The American Journal of Sports Medicine, v.27, n.1, p.54-59. RICHARDSON, P.D. (1989). Piezoelectric plymers. IEEE. Medicine and Biology Magazine, jun. ROSS, M.H.; ROMRELL, L.J. (1993). Histologia: texto e atlas. 2.ed. So Paulo, Panamericana. SARVAZYAN, A. P. (1983). Some General Problems of Biological Action of Ultrasound. IEEE Transactions on Sonics and Ultrasonics, v.30, n.1, p.2-12, Jan. SCHULTZ, E.; ALBRIGHT, D.J.; JARYSZAK, D.L.; DAVID, T.L. (1988). Survival of satellite cells in whole muscle transplants. Anat. Rec., v.222, p.12-7. 92 SCHULTZ, E.; JARYSZAK, D.L.; VALLIERE, C.R. (1985). Response of satellite cells to focal skeletal muscle injury. Muscle Nerve, v.8, p.217-22. SCHULTZ, E.; JARYSZAK, D. L. (1985). Effects of skeletal muscle regeneration on the proliferation potential of satellite cells. Mech Ageing Dev., v.30, n.1, p.63-72, Apr. SILVA, O. L. (1987). Estudo do mecanismo da ao do ultra-som na estimulao do tecido sseo. So Carlos. Dissertao (Mestrado) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo. TER HAAR, G. (1978). Basic physics of therapeutic ultrasound. Physiotherapy, vol. 64, n. 4., p.100-103. TER HAAR, G.; DANIELS, S.; EASTAUGH, K.C.; HILL, C.R. (1982). Ultrassonically induced cavitation in vivo. BR. J. Cancer, vol.45, supl.5, n.151. TER HAAR, G. (1987). Physic of Therapeutic Ultrasound. London, Physiotherapy, v. 73, n.3, Mar. TER HAAR, G. (1987). Tissue regenerations. In: REPACHOLI, M.H. et al. Ultrasound. Medical aplications, biological effects and hazard potential. New York, Plenun Press. WALKER, B.E. (1963.). Skeletal muscle regeneration in young rats. Am. J. Anat., v.133, p.369-78. WELLS, P. N. T. Biomedical ultrasonics. London: Academic Press, 1977. 635 p. WILLIAMS, P.L. WARWICK, R.; DYSON, M.; BANNISTER, L.H. (1995). Gray Anatomia. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. v.1. WILLIAMS, R. A. (1983). Ultrasound: biological effect and potential hazards. London, Academic Press. XAVIER, C.; DUARTE, L. R. (1983). Estimulao ultrasnica do calo sseo. Revista Brasileira Ortopdica, v.18, n.3, p.73-80, maio/jun. YOUNG, S.R.; DYSON, M. (1978). Macrophage Responsiveness to Therapeutic Ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology, v.16, n.8, p.809-816, 190. YOUNG, S. R. (1990). The effect of therapeutic ultrasound on the biological mechanisms envolved in dermal repair. London. Thesis (PhD) - University of London. 93 ZISKIN, M. C. (1985). Clinics in diagnostic ultrasound. In: NYBORG, W. L.; ZISKIN, M. C. Biological effects of Ultrasound. New York, Churchill Livingstone. ZISKIN, M. C. (1989). Report on the safety of the SAPHS device. Temple University Medical School, Philadelphia, PA, USA. (not published).