Londrina 2015

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

RAYANNE TOMÁS FERREIRA

ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO rs7903146 NO GENE TCF7L2, CAPACIDADE FUNCIONAL E DIABETES

MELLITUS TIPO 2 EM IDOSOS

RAYANNE TOMÁS FERREIRA

Cidade ano

AUTOR

Londrina

2015

ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO rs7903146 NO GENE TCF7L2, CAPACIDADE FUNCIONAL E DIABETES

MELLITUS TIPO 2 EM IDOSOS

Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação. Orientador: Profª. Drª. Regina Célia Poli-Frederico

RAYANNE TOMÁS FERREIRA

ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO rs7903146 NO GENE TCF7L2,

CAPACIDADE FUNCIONAL E DIABETES MELLITUS TIPO 2 EM IDOSOS.

Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciências da Reabilitação,

área e concentração em Avaliação e Intervenção em Reabilitação como requisito

parcial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora

formada pelos professores:

___________________________________________________ Orientadora Profa. Dra. Regina Célia Poli-Frederico

UNOPAR

___________________________________________________ Profa. Dra. Hellen Kuasne

Hospital A. C. Camargo – Instituto Internaconal de Pesquisa

___________________________________________________ Profa. Dra. Vanessa Suziane Probst

UNOPAR

Londrina, 02 de março de 2015.

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná

Biblioteca Central

Setor de Tratamento da Informação

Ferreira, Rayanne Tomás.

F439a Análise da associação do polimorfismo rs7903146 no gene TCF7L2, capacidade

funcional e diabetes mellitus tipo 2em idosos / Rayanne Tomás Ferreira.

Londrina: [s.n], 2015.

61f.

Dissertação (Mestrado). Ciências da Reabilitação. Universidade Norte do

Paraná e Universidade Estadual de Londrina.

Orientadora: Profª Drª. Regina Celia Poli-Frederico.

1- Ciências da reabilitação - dissertação de mestrado - UNOPAR /UEL 2-

Diabettes mellitus tipo 2 3- Polimorfismo genético 4- Gene TCF7L2 5-

Capacidade funcional I- Poli-Frederico, orient. II- Universidade Norte do Paraná.

III- Universidade Estadual de Londrina.

CDU 615.8:616.379-008.64

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação aos meus pais, Helena

e Francisco, e ao meu noivo, Marcos Ulysses,

que incentivam a minha carreira acadêmica e

me apoiaram na decisão de ingressar no

programa de mestrado, além de não medirem

esforços para que eu chegasse até esta etapa

da minha vida e realizasse tais conquistas.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, o Senhor Onipotente, que iliminou

meus caminhos e me deu força е coragem durante toda esta longa caminhada.

Aos meus pais, Helena e Francisco, por acreditarem e investirem em

mim. Mãe, seu amor, cuidado e apoio foi que deram, em alguns momentos, a

esperança para seguir. Pai, sua determinação e força foi o incentivo para enfrentar

os obstáculos.

Agradeço aos meus familiares, em especial minha tia Maria

Aparecida (Cidinha), pelas lições de organização, as quais foram muito úteis ao

mestrado e à vida.

Ao meu noivo, Marcos Ulysses, homem com que eu decidi partilhar

a vida para sempre. Com você me sinto mais viva e sou capaz de alcançar o

impossível. Obrigada pelo amor, carinho, paciência e companheirismo. Obrigada

pela sua capacidade de colocar meus pés no chão quando sonho alto de mais e de

me trazer paz na correria do dia-a-dia.

Agradeço a minha orientadora, Regina, não só pela constante

orientação neste trabalho, mas sobretudo pela sua amizade. Obrigada por acreditar

no meu trabalho e não medir esforços para que tudo ocorresse da maneira mais

correta. Agradeço, professora, em especial, por todos os conhecimentos

compartilhados, que permitiu incisivamente para o meu crescimento científico.

Aos professores do Programa Associado UEL/UNOPAR de Pós-

Graduação em Ciências da Reabilitação pelos ensinamentos, os quais contribuiram

para minha formação e crescimento acadêmico. Agradeço em especial os

professores da banca, Hellen e Vanessa, que aceitaram o convite e contribuíram

com sugestões e correções necessárias, o que engrandeceu este trabalho.

Aos colegas que partilharam seu tempo e alegria, fazendo com que

o caminha a ser percorrido fosse mais agradável. Agradeço em especial, minha

amiga Juzeli, pеlаs alegrias e dificuldades compartilhadas. Cоm você, аs pausas

entre υm parágrafo е outro dе produção permitiram que eu melhorasse tudo о qυе

fiz, tanto nesta dissertação quanto nа vida.

Gostaria de agradecer também a Universidade Norte do Paraná pela

infraestrutura fornecida e também a todos aqueles que conviveram comigo neste

período, foi isto que garantiu o sucesso desta pesquisa.

Epígrafe

Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível, e de repente você estará

fazendo o impossível (São Francisco de Assis).

(...) Quem acredita sempre alcança (Renato Russo).

FERREIRA, Rayanne Tomás. ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO rs7903146 NO GENE TCF7L2, CAPACIDADE FUNCIONAL E DIABETES MELLITUS TIPO 2 EM IDOSOS. 2015. 61 folhas. Mestrado em Ciências da Reabilitação – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2015.

RESUMO

Introdução: O Diabetes Mellitus é uma enfermidade endócrino-metabólica definida como uma síndrome caracterizada por secreção e/ou ação diminuída de insulina que resulta em um quadro de hiperglicemia crônica, a qual pode ocasionar complicações, que aumentam a morbimortalidade dos seus portadores, constituindo uma preocupação na saúde mundial. O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), é o tipo mais comum de DM, e está associado à resistência periférica de insulina, havendo de uma deficiência até uma incapacidade da ação ou secreção da mesma. Alterações genéticas têm sido constantemente relacionadas ao desenvolvimento de DM2, dentre elas pode-se citar o polimorfismo de nucleotídeo único rs7903146 do gene TCF7L2, uma vez que a expressão deste gene está relacionada à sobrevivência, proliferação e diferenciação das células β-pancreáticas além da regulação da secreção de insulina por meio da produção do GLP-1 (glucagon like peptide type 1). O DM2 também tem sido associado a uma diminuição da capacidade funcional de exercício, principalmente em idosos. Assim, o objetivo deste trabalho é identificar a possível associação entre o SNP rs7903146 do gene TCF7L2, a capacidade funcional e o DM2 em idosos. Métodos: 408 idosos foram alocados em três grupos: não diabéticos (n=135, gNDM), pré-diabéticos (n=144, gPDM) e diabéticos tipo 2 (n=129, gDM2) após passarem por entrevista, análise de prontuário e exames laboratoriais. Também foi realizada a coleta de leucócitos do sangue periférico para extração de DNA e posterior genotipagem do SNP rs7903146 pela técnica de PCR em tempo real quantitativa (sistema TaqMan®). Para a análise da capacidade funcional de exercício foi realizado o teste de caminhada de 6 minutos (6MWT). O teste de qui-quadrado foi utilizado para avaliar a associação entre genótipos e alelos do SNP rs7903146 do gene TCF7L2, DM2 e capacidade funcional de exercício, assim como, para avaliar se a frequência genotípica estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A influência do polimorfismo genético no DM2 foi avaliada pela análise de razão de chance (OR) com intervalo de confiança de 95%. O nível de significância adotado para todas as análises foi de p<0,05. Resultados: Houve uma associação estatisticamente significativa (p = 0.035) entre o genótipo TT e o alelo T (p = 0.017) do SNP rs7903146 do gene TCF7L2 e o gDM2 em relação ao gNDM. Também foi verificado que os idosos portadores do genótipo TT, assim como do alelo T, apresentaram 2,96 e 1,67 mais chances de desenvolver DM2, respectivamente, em comparação com os indivíduos que abrigavam os genótipos CC + CT (IC95% = 1.19 – 7.36; p = 0.02; IC95% = 1.16 – 2.29. p = 0.0073, respectivamente). Não foi encontrada uma associação significativa do SNP rs7903146 e dos grupos com a capacidade funcional de exercício. Conclusão: Desta forma, considerando a falta de evidências entre a relação entre polimorfismos no gene TCF7L2, o DM2 e a capacidade funcional de exercício são necessários a realização de estudos que

analisem a associação entre esses três parâmetros para verificar se o polimorfismo no gene está diretamente relacionado a uma capacidade de exercício prejudicada ou se esta é consequência das alterações metabólicas decorridas do DM2. Palavras-chave: Diabetes mellitus tipo 2. Polimorfismo genético. Gene TCF7L2. Capacidade Funcional.

FERREIRA, Rayanne Tomás. ANALYSIS OF THE ASSOCIATION OF rs7903146 POLYMORPHISM IN TCF7L2 GENE, FUNCTIONAL CAPACITY AND TYPE 2 DIABETES MELLITUS IN THE ELDERLY. 2015. 61 pages. Rehabilitation Sciences Master Degree – University of North Paraná, Lodrina, 2015.

ABSTRACT

Introduction: Diabetes Mellitus (DM) is an endocrine-metabolic disease defined as a syndrome characterized by secretion and/or decreased insulin action that results in a chronic hyperglycemia frame, which could result in complications that increase the morbidity and mortality of their carriers, constitutes a concern in global health. Diabetes mellitus type 2 (DM2) is the most common type of DM, and is associated with peripheral insulin resistance, with a loss to an inability of the action or secretion of it. Genetic alterations have been consistently linked to the development of type 2 diabetes, among them we can mention the single nucleotide polymorphism (SNP) rs7903146 TCF7L2 the gene, since this gene expression is related to survival, proliferation and differentiation of pancreatic β-cells Besides the regulation of insulin secretion through the production of GLP-1 (glucagon like peptide type 1). The DM2 has also been associated with a decrease in functional exercise capacity, especially in the elderly. The objective of this work is to identify the possible association between the SNP rs7903146 of TCF7L2 gene, functional capacity and DM2 in the elderly. Methods: 408 elderly were divided into three groups: non-diabetic (n = 135, gNDM), pre-diabetic (n = 144, gPDM) and type 2 diabetic patients (n = 129, gDM2) after spending interview, medical record analysis and laboratory tests. We also promoted the collection of peripheral blood leukocytes to sites of DNA extraction and genotyping of SNP rs7903146 later by PCR in real-time quantitative (TaqMan system). For the analysis of functional exercise was held the 6-minute walk test (6MWT). The chi-square test was used to assess the association between genotypes and alleles of SNP rs7903146 of TCF7L2 gene, DM2 and functional exercise capacity, as well as to evaluate the genotypic frequency was in Hardy-Weinberg equilibrium. The influence of genetic polymorphisms in T2DM was evaluated by odds ratio analysis (OR) with 95% confidence interval. The significance level for all analyzes was p <0.05. Results: There was a statistically significant association (p = 0.035) between the TT and the T allele genotype (p = 0.017) of SNP rs7903146 of TCF7L2 gene and the gDM2 compared to gNDM. They also found that the elderly with the TT genotype and T allele showed 2.96 and 1.67 as likely to develop type 2 diabetes, respectively, compared with individuals who housed the CC + CT genotypes (95%CI = 1.19 - 7.36; p = 0.02; 95%CI = 1.16 to 2.29 p = 0.0073, respectively). There was a significant association of SNP rs7903146 and groups with functional exercise. Conclusion: Thus, considering the lack of evidence of the relationship between polymorphisms in TCF7L2 gene, DM2 and functional exercise capacity are needed to carry out studies to examine the association between these three parameters to verify that the polymorphism in the gene is directly related to impaired exercise capacity or if this is a result of metabolic changes elapsed DM2.

Keywords: Diabetes mellitus type 2 genetic polymorphism. Gene TCF7L2. Functional capacity.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Representação esquemática da localização do gene TCF7L2 no

cromossomo 10 ........................................................................................................ 21

Figura 2 – Estrutura genética do gene TCF7L2, localização dos principais SNPs de

risco para o DM2 e estrutura da proteína TCF7L2 ................................................... 22

Figura 3 – Ativação da via Wnt canônica e o papel da família de proteínas TCF.... 24

Figura 4 – Alteração na expressão do gene TCF7L2 e a predisposição ao DM2 ... 25

Figura 5 – Teste de caminhada de 6 minutos.......................................................... 27

Artigo

Figura 1 – Discirminação alélica fornecida pelo equipamento Step One Plus. ........ 36

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Distribuição demográfica dos idosos participantes do estudo ................ 38

Tabela 2 – Distribuição das frequências genotípicas e alélicas do SNP rs7903146 do

gene TCF7L2 em não diabéticos, pré-diabéticos e diabéticos e os valores do teste

de associação .......................................................................................................... 39

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADA Associação Americana de Diabetes

AMB Associação Médica Brasileira

APC Proteína Adenomatous polyposis coli

Axin Proteína Axin

β-cat β-catenina

CFM Conselho Federal de Medicina

CtBp-1 C-terminal-binding protein 1

DM Diabetes Mellitus

DM2 Diabetes Mellitus tipo 2

DNA Ácido desoxirribonucleico

Dsh Fosfoproteína Dishevelled

Ex1b-e Sítio de início da transcrição Ex1b-e

Fz Família de receptores Frizzled

gDM2 Grupo de pacientes diabéticos tipo 2

GLP-1 Glucagon like peptide type 1

gNDM Grupo de pacientes não diabéticos

gPDM Grupo de pacientes pré-diabéticos

GSK-3 Glycoprotein sinthetase kinase type 3

GSK-3β Glycoprotein sinthetase kinase type 3β

Groucho Proteínas groucho

HBP1 HMG-box transcription factor 1

HMG Grupo de alta mobilidade

HMG-box Sítio de ligação de HMG

kDa Kilo-Dalton

LRP Correceptores da família Leucine-responsive Regulators Proteins

LRP5/6 Correceptor Leucine-responsive Regulators Proteins 5/6

PCR Reação em cadeia da polimerase

p300/CBP Família de coativadores p300/CBP

SBD Sociedade Brasileira de Diabetes

Sfrp1 Secreted frizzled-related protein 1

Smad Fatores de transcrição Smad

SNP Polimorfismo de Nucleotídeo Único

SPSS Statistical Package for Social Sciences

TCF Família de proteínas fatores de transcrição

TCF7L2 Proteína - Transcription factor 7-like 2

TCF7L2 Gene - Transcription factor 7-like 2

TC6min Teste de caminhada de seis minutos

WHO Organização Mundial da Saúde

6MWT Six-minute walking test

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15

2 REVISÃO DE LITERATURA - CONTEXTUALIZAÇÃO ........................................ 17

2.1 DIABETES MELLITUS .............................................................................................. 17

2.2 DIABETES MELLITUS TIPO 2 .................................................................................... 18

2.3 POLIMORFISMO GENÉTICO E DM2 ........................................................................... 19

2.4 DIABETES MELLITUS TIPO 2 E SUA RELAÇÃO COM ATIVIDADE FÍSICA E CAPACIDADE

FUNCIONAL DE EXERCÍCIO.......... .................................................................................. 25

3 OBJETIVOS ......................................................................................................... 28

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................... 28

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 28

4 ARTIGO: ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO

ÚNICO rs7903146 DO GENE TCF7L2, CAPACIDADE FUNCIONAL E O

DIABETES MELLITUS TIPO 2 ................................................................................. 29

CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................. 50

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 51

ANEXOS ................................................................................................................... 56

ANEXO A – Parecer de aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Estudo sobre

Envelhecimento e Longevidade ................................................................................ 57

ANEXO B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ....................................... 58

ANEXO C – Normas para publicação do artigo......................................................... 59

ANEXO D – Premiação recebida no 9º Congresso de Endocrinologia e Metabologia

da Região Sul ............................................................................................................ 61

15

1 INTRODUÇÃO

O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença crônica amplamente

conhecida. Não trata-se de uma doença única, mas um grupo heterogêneo de

distrúbios endócrino-metabólicos que apresenta um quadro de hiperglicemia

consequente da diminuição da secreção e/ou ação da insulina (SBD, 2014).

Devido, não só ao processo do aumento da população idosa

mundial, mas também a maior urbanização e aumento da prevalência da obesidade

por hábitos não saudáveis de vida, o número de pessoas diabéticas e das

complicações (principalmente cardiovasculares) provenientes desta doença vêm

aumentando, tornando o DM um grande problema da saúde pública (WHO, 2006;

ADA, 2010; SBD, 2014).

O tipo mais prevalente de DM, é o tipo 2 (DM2), relacionado

principalmente aos hábitos de vida como a má alimentação e sedentarismo.

Entretanto sabe-se que alterações genéticas podem contribuir incisivamente para o

seu desenvolvimento (SBD, 2014) uma vez que estudos têm demonstrado que SNPs

têm sido identificados e relacionados a um maior risco do desenvolvimento do DM2

em diferentes populações (GRANT et al, 2006; MARQUEZINE, 2009; VILLAREAL et

al, 2010; SOUSA, 2011; REIS et al, 2011; BARRA et al, 2012; DAYEH et al, 2013;

PENG et al, 2013; CANIVELL, S. et al, 2014).

Embora possa ser encontrado na literatura inúmeras pesquisas que

avaliaram a capacidade funcional em pacientes diabéticos tipo 2 (FRANCHI et al,

2008; SALOMÉ, BLANES E FERREIRA, 2009; ANJOS et al, 2012; MOHR, BEBER,

WINKELMANN, 2013), são poucas as que são conduzidas afim de associar a

capacidade funcional e polimorfismos genéticos (PEREIRA, 2012; CARVALHO,

2013). Entretanto, não foi encontrado na literatura estudos que analisassem a

existência ou não da associação entre a capacidade funcional, polimorfismos no

gene TCF7L2 e o DM2, concomitantemente.

Desta forma, o fato da contribuição genética ser uma evidência

importante no desenvolvimento do DM2, e esta condição clínica estar relacionada a

uma capacidade funcional de exercício prejudicada, faz-se necessário a realização

de estudos genéticos que identifique genes, e seus polimorfismos, além de análises

de associação entre a capacidade funcional e o DM2, uma vez que estão

associados ao risco de desenvolvimento e suas complicações.

16

A partir disso este trabalho teve como objetivo verificar a existência

da associação entre o DM2 e a diminuição da capacidade de exercício em idosos

portadores de genótipos desfavoráveis do gene TCF7L2.

17

2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO

2.1 DIABETES MELLITUS

De acordo com Tschiedel (2014) o papiro Ebers, escrito por volta de

1500 a.C. e descoberto por Gerg Ebers em 1872, foi o primeiro documento que

relatou uma patologia caracterizada por aumento de volume urinário e número de

micções. Acredita-se que este seja o primeiro relato sobre o DM, que apenas

recebeu o primeiro nome por volta do século II d.C. e o segundo no século XVIII.

Com o passar dos tempos médicos indianos, chineses e japoneses teriam detectado

que a urina de pacientes diabéticos apresentava certa doçura, devido a presença de

insetos como moscas e formigas ao seu redor. Entretanto isto só foi confirmado por

experimentos de Willis e Dobson, no século XVII e XVIII respectivamente.

Atualmente, o DM é uma enfermidade endócrino-metabólica,

mundialmente conhecida, definida como uma síndrome caracterizada por secreção

e/ou ação diminuída de insulina que resulta em um quadro de hiperglicemia crônica,

a qual pode ocasionar complicações, que aumentam a morbimortalidade dos seus

portadores, constituindo uma preocupação na saúde mundial (ADA, 2010; WHO,

2006).

Desde 2009, a Sociedade Brasileira de Diabetes têm avaliado a

magnitude do problema como uma epidemia em curso (SBD, 2009; SBD, 2014). Isso

se deve a estatísticas que estimavam haver 173 milhões de diabéticos no mundo em

2002 e que podem alcançar 300 milhões em 2030. Entretanto, dados da

organização mundial da saúde (WHO, 2014) revelam que atualmente já há 347

milhões de pessoas com DM em todo o mundo, superando a estimativa de

prevalência mundial para 2030 de 4,4% feita por Wild et al (2004). Já a prevalência

mundial é mais alta em pessoas acima de 40 anos, sendo estimada em 11% dos

indivíduos acima desta faixa etária.

Assim como em toda doença crônica, há fatores de risco que

favorecem o desenvolvimento do DM. Dentre eles, pode-se citar a idade, a

obesidade, o sedentarismo, o histórico familiar, outras patologias como a

hipertensão e alterações genéticas (SBD, 2014).

Segundo Tschiedel (2014) desde meados do século XIX, dois

estudiosos já cogitaram a existência de dois tipos de DM, um mais agressivo e

18

prevalente em jovens, e outro com evolução mais lenta que surgia em pacientes com

mais idade e obesos. Hoje em dia a Organização Mundial de Saúde e a American

Diabetes Association (ADA, 2010) propõem classificar a patologia em diferentes

tipos:

a) DM tipo 1 onde há uma destruição autoimune ou idiopática das

células β pancreáticas com consequente deficiência de insulina;

b) DM2 que está associado à resistência periférica de insulina,

havendo de uma deficiência até uma incapacidade da ação ou secreção da mesma;

c) DM gestacional, definido como qualquer nível de intolerância a

glicose, resultando em hiperglicemia de gravidade variável, com início ou diagnóstico

durante a gestação;

d) Outros tipos de DM que ocorrem secundariamente a outras

situações ou patologias como as endocrinopatias, infecções, alterações genéticas,

indução por drogas entre outros.

Há também o estado pré-diabético caracterizado por níveis

intermediários de glicemia, os quais não atingem o valor mínimo para o diagnóstico

do diabetes propriamente dito, entretanto não estão em concentrações que

caracterizem uma homeostase normal (SBD, 2009).

2.2 DIABETES MELLITUS TIPO 2

O DM2 é a forma mais comum e, de acordo com as Diretrizes da

Sociedade Brasileira de Diabetes (2014), está “presente em 90 a 95% dos casos e

caracteriza-se por defeitos na ação e secreção da insulina”. Segundo Stumvoll,

Goldstein e van Haeften (2005), o DM2 trata-se de um grupo heterogêneo de

desordens metabólicas caracterizadas pela incapacidade das células β-pancreáticas

em aumentar a secreção de insulina para compensar a resistência insulínica.

A Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia, juntamente

com a Associação Médica Brasileira e o Conselho Federal de Medicina no Projeto

Diretrizes (2011) define o DM2 como uma doença metabólica crônica multifatorial

caracterizado por resistência insulínica que evolui para progressiva deficiência de

insulina e a maioria dos pacientes diabéticos tipo 2 apresentam sobrepeso ou

obesidade (SBD, 2014). Ainda de acordo com as Diretrizes da Sociedade Brasileira

19

de Diabetes, “o DM2 pode ocorrer em qualquer idade, mas geralmente é

diagnosticado após os 40 anos” (2014).

O alerta mundial para a prevenção do diabetes tipo 2 é reforçado pelo substancial aumento na prevalência dessa doença nas últimas décadas. Apesar de a suscetibilidade genética parecer desempenhar um papel importante na ocorrência do diabetes tipo 2, a atual epidemia provavelmente reflete mudanças no estudo de vida, caracterizadas pelo aumento da ingestão energética e redução da atividade física que juntamente com sobrepeso e obesidade parecem exercer papel preponderante no aparecimento do diabetes (SBD, 2014).

Sabendo da importante contribuição genética no DM2, o Projeto

Diretrizes (2011) e Freeman e Cox (2006) relatam que a predisposição genética

além de fatores de risco ambientais estão diretamente ligados ao seu

desenvolvimento. Recentes estudos têm demonstrado que genes envolvidos na

função e desenvolvimento das células beta pancreáticas estão envolvidos na

patogênese do DM2 (TANGJITTIPOKIN et al, 2012).

2.3 POLIMORFISMO GENÉTICO E DM2

Polimorfismo genético é definido como “ocorrência conjunta em uma

população de dois ou mais genótipos alternativos, cada um em uma frequência

maior do que aquela que poderia ser mantida somente por mutação recorrente”

(NUSSBAUM, MCLNNES, WILLARD, 2008), ou seja, há uma coexistência de alelos

múltiplos em um determinado local do cromossomo. Ainda de acordo com estes

autores,

O mais simples e mais comuns de todos os polimorfismos são os polimorfismo de nucleotídeos individuais (SNPs). Os SNPs normalmente têm apenas dois alelos correspondendo a duas diferentes bases que ocupem uma localização em particular no genoma (NUSSBAUM, MCLNNES, WILLARD, 2008).

De uma maneira mais simplificada, SNPs (single nucleotide

polymorphisms) ou polimorfismo de nucleotídeo único, é a substituição de um único

nucleotídeo numa certa sequência de DNA. Estudos têm demonstrado que SNPs

têm sido identificados e relacionados a um maior risco do desenvolvimento do DM2

em diferentes populações (GRANT et al, 2006; MARQUEZINE, 2009; VILLAREAL et

al, 2010; SOUSA, 2011; REIS et al, 2011; BARRA et al, 2012; DAYEH et al, 2013;

PENG et al, 2013; CANIVELL, S. et al, 2014). Uma das hipóteses para isso é o fato

de que o diabetes seja uma doença multifatorial (ADA, 2010; WHO, 2006) e fatores

20

como alimentação não saudável, sedentarismo, a obesidade e o estresse podem

estar contribuindo incisivamente nestas taxas (MINAYO, 2014; ARSA et al, 2009;

SARTORELLI, FRANCO, 2003).

Por esse motivo, tem sido investigado amplamente os polimorfismos

genéticos na tentativa de identificar genes que conferem suscetibilidade ao indivíduo

para o desenvolvimento de DM2. Neste sentido, desde 2006, estudos têm mostrado

a associação entre polimorfismos no gene TCF7L2 e alterações em sua expressão e

o DM2, assim como têm buscado o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos

relacionados a essas alterações genéticas (GRANT et al, 2006; DAMCOTT et al,

2006; JIN, LIU, 2008; IP, REIS et al., 2011; CHIANG, JIN, 2012; DAYEH, T. A. et al,

2013; CANIVELL, S. et al, 2014).

O TCF7L2 (Figura 1) é um gene que está localizado no braço longo

do cromossomo 10 (10q25.3) e possui 217.329 pares de bases (GENBANK, 2014).

Ele codifica uma família de proteínas de fator de transcrição (TCF, entre elas o

TCF7L2), que faz parte de um grupo de alta mobilidade (HMG) desempenhando um

papel chave na via de sinalização Wnt (GENBANK, 2014). Esta via é responsável

pela regulação de aspectos cruciais durante o desenvolvimento embrionário, como a

organogênese, a proliferação, determinação do destino, migração e polaridade

celular (KOMIYA, HABAS, 2008), e na vida adulta, também é responsável pela

regulação da expressão gênica (JIN, LIU, 2008).

Sousa (2011) ressalta que devido a associações previamente

confirmadas, alterações no gene TCF7L2 são consideradas fatores de risco genético

mais importante para o desenvolvimento do DM2. Dentre as alterações presentes

neste gene, há vários SNPs, como o rs7903146 (C/T), uma alteração sem sentido,

localizado, na posição 114748339, sítio de splicing alternativo do gene, que tem sido

bastante associado ao desenvolvimento do DM2 (MARQUEZINE, 2009,

RHEINHEIMER et al, 2010; SOUSA, 2011; BARRA et al 2012), principalmente pelo

fato de interferir na homeostase da glicose (GENBANK, 2014). Ressalta-se aqui a

importância em se estudar este polimorfismo, já que de acordo com o HapMap

Project, trata-se de um tag SNP que está em desequilíbrio de ligação com outros

SNPs, como o rs12255772, rs4132670, rs4506565, rs7901695, rs17747324 em

populações caucasianas.

21

Fonte: Genetics Home Reference. 2014. Disponível em: <http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TCF7L2>.

Figura 1 – Representação esquemática da localização do gene TCF7L2 no

cromossomo 10 (seta).

A figura 2 mostra que o gene TCF7L2 é composto por 17 exons e

possiu no mínimo 7 SNPs que podem ser associados com o risco de diabetes tipo 2

em uma variedade de populações. Isso ocorre porque o gene TCF7L2 sofre diversos

splicings alternativos, originando um grande número de transcritos e

consequentemente inúmeras isoformas. Dentre as principais isoformas estão

aquelas de 79 e 58 kDa de tamanho, resultado de códons de parada alternativos.

Entretanto, recentemente foi identificado um sítio de início da transcrição (Ex1b-e),

que leva a produção de uma isoforma de TCF7L2 menor (35-40 kDa). Também

nesta mesma figura é possível observar a proteína TCF7L2 de comprimento total.

Ela é composta por dois domínios principais, incluindo o domínio de ligação β-cat no

N-terminal, bem como a HMG-box para a ligação a DNA, além de outros diversos

sítios de ligação de fatores de transcrição (Groucho, Smad,, HBP1, p300/CBP, CtBp-

1, GSK-3)(IP, CHIANG, JIN, 2012).

22

Fonte: IP, CHIANG, JIN, 2012.

Figura 2 – Estrutura genética do gene TCF7L2, localização dos principais SNPs de

risco para o DM2 e estrutura da proteína TCF7L2. A) O gene TCF7L2 é composto

por 17 éxons (caixas escuras), dos quais pelo menos 5 estão em splicing alternativo

(caixas brancas). Estes splicings produzem inúmeros transcritos, que originam

diversas isoformas com tamanho de 58 a 79 kDa (TCF7L2, por exemplo). Entretanto,

um sítio de início de transcrição identificado recentemente (Ex1b-e), leva a produção

de uma isoforma TCF7L2 de tamanho entre 35-40 kDa. Devido aos splicings, tanto

para esta proteína 35-40 kDA quanto para a proteína que possui 58 kDa há uma

região de parada (STOP) antes do término do gene. B). A proteína TCF7L2 de

tamanho total possui dois domínios principais (domínio de ligação β-cat e a HMG-

box para a ligação a DNA), além de outros sítios de ligação a outros fatores de

transcrição (Groucho, Smad, HBP1, p300/CBP, CtBp-1, GSK-3).

De acordo com Sousa (2011), Marquezine (2009), Gloyn, Braun e

Rorsman (2009) o SNP rs7903146 no gene TCF7L2 favorece ao desenvolvimento

do DM2 por interferir na codificação de uma importante proteína do fator de

23

transcrição componente da regulação do complexo da β-catenina na via de

sinalização Wnt, um dos mecanismos responsáveis pela sobrevivência, proliferação

e diferenciação das células β–pancreáticas.

Quando proteínas Wnt ligam-se aos receptores frizzled, juntamente

com os correceptores da família LRP (Leucine-responsive Regulators Proteins), há a

ativação da via Wnt canônica (Figura 3), onde há a inibição da GSK-3β (glycoprotein

sinthetase kinase type 3β) por sua fosforilação, estabilização e aumento da

concentração de β-catenina no citoplasma da célula. Esta elevação na quantidade

de β-catenina, permite a sua migração para o núcleo celular, onde interage com a

proteína TCF7L2, ativando a expressão de genes relacionados a modulação de

proliferação e diferenciação celular além de genes associados ao GLP-1 (JIN, LIU,

2008; CHIANG, IP, JIN, 2012; FERREIRA, 2013).

Rheinheimer et al. (2010) também relatam que o SNP rs7903146 no

gene TCF7L2, também através da via de sinalização Wnt (canônica), altera a

secreção de insulina incretino-dependente, por interferir na produção de um

hormônio estimulador da secreção de insulina dependente de glicose, o GLP-1

(glucagon like peptide type 1), ou seja, tal SNP afeta a resposta da célula β-

pancreática a esta proteína hormonal (SOUSA, 2011).

24

Fonte: FERREIRA, 2013.

Figura 3 – Ativação da via Wnt canônica e o papel da família de proteínas TCF.

Quando a proteína Wnt não está ligada a um inibidor (Sfrp1), ela ativa os receptores

frizzled (Fz), juntamente com os correceptores da família LRP (LRP5/6), inibindo o

complexo de destruição da β-catenina (Axin, Dsh, GSK3β e APC), resultando na

acumulação citoplasmática desta proteína. A β-catenina então migra para o núcleo

celular e interage com as isoformas TCF, ativando o aumento ou a diminuição da

transcrição de diversos genes.

Desta forma, Hattersley (2007) sugere que é possível que alterações

no gene TCF7L2 interfiram na via Wnt canônica e na expressão de genes envolvidos

diretamente com a secreção de insulina pelas células β-pancreáticas (Figura 4), ou

ainda, indiretamente, com a secreção de insulina dependente de incretinas (JIN, LIU,

2008; GONÇALVES, 2010; CHIANG, IP, JIN, 2012; FERREIRA, 2013). De maneira

esquemática, a figura 5, mostra uma das formas de como o gene TCF7L2 pode estar

relacionada com uma maior predisposição ao DM2.

25

Fonte: HATTERSLEY, 2007 (modificado).

Figura 4 – Alteração na expressão do gene TCF7L2 e a suscetibilidade ao DM2

2.4 DIABETES MELIITUS TIPO 2 E SUA RELAÇÃO COM ATIVIDADE FÍSICA E CAPACIDADE

FUNCIONAL DE EXERCÍCIO

Diversos fatores de risco podem favorecer o desenvolvimento do

DM, dentre eles o sedentarismo, pertencente ao grupo de fatores considerados

modificáveis, pois são passíveis de intervenção (SEUS et al, 2012). Deste modo,

ações que controlem este hábito de vida, além de prevenir o surgimento de doenças

cardiovasculares, também previne o DM2 (SBD, 2014), fato que foi verificado pelo

Diabetes Prevention Program (2002). A partir disso,

Indivíduos em risco de desenvolver DM tipo 2, devem ser estimulados a mudanças de estilo de vida, a partir de programas educativos baseados em perda moderada de peso corporal e prática semanal de atividade física (150 minutos/semana) (SBD, 2014)

Evidências científicas mostram que a realização de atividade física

pode ser benéfica tanto na prevenção quanto no tratamento do DM2, já que auxilia

no controle glicêmico, na perda de peso e no aumento da massa muscular,

colaborando com a redução da resistência à insulina (SBD, 2014).

A atividade física promove maior capilarização das fibras musculares e melhor função mitocondrial, melhorando a sensibilidade dos tecidos à insilina. (...) Além disso, o exercício aumenta a captação da glicose sanguínea para os músculos por mecanismos não dependentes de insulina, envolvendo o GLUT4, proteína transportadora da glicose muscular ativada pela contração muscular (SBD, 2014)

Genótipo de risco

do rs7903146 do

gene TCF7L2

Suscetibilidade ao

Diabetes Mellitus

tipo 2

Redução da secreção

de insulina pelas

células β-pancreáticas

Associação genética

Associação genética

Alteração na expressão

de TCF7L2 nas células

β-pancreáticas

26

Apesar destes conhecidos benefícios da atividade física para o

paciente diabético, é amplamente difundido na literatura que diabéticos apresentam

menor condição aeróbica, menor força muscular e menor flexibilidade quando

comparados às outras pessoas sem a doença com a mesma idade e sexo (SBD,

2014). É importante enfatizar que patologias como o DM2, por serem doenças

crônico-degenerativas com alta prevalência na população em geral (WHO, 2014), e

principalmente em idosos (SARTORELLI, FRANCO, 2003), estão relacionadas com

uma maior incapacidade funcional nesta população (FANG et al, 2005; ALVES,

LEITE, MACHADO, 2010; BARBOSA et al, 2014).

Incapacidade funcional pode ser definida como uma a dificuldade de

realização com necessidade ou não de ajuda em atividades cotidianas necessárias

para uma vida independente (FRANCHI et al, 2008; ALVES, LEITE, MACHADO,

2010) e uma maior qualidade de vida (TAVARES, DIAS, 2012). Assim, a capacidade

funcional, ou de exercício, é o potencial que uma pessoa tem em realizar as suas

atividades físicas diárias independentemente.

Segundo Alves, Leite e Machado (2008 e 2010), a determinação da

incapacidade funcional pode ser feita por meio da mobilidade física, como por

exemplo no teste de caminhada de 6 minutos (TC6min) (Figura 5), das AVDs

(atividades de vida diária) e AIVDs (atividades instrumentais de vida diária). Cabe

ressaltar que além disso, também é necessário determinar a resistências aeróbica,

pois este é um importante aspecto para que as pessoas consigam realizar as suas

tarefas cotidianas (ALVES et al, 2004), principalmente em idosos diabéticos, pois

como já foi mencionado, apresentam menor condição aeróbica e capacidade de

funcional prejudicada devido ao processo de envelhecimento e à doença crônica

(FANG et al, 2005) ALVES, LEITE, MACHADO, 2008; RODRIGUES et al, 2013;

BARBOSA et al, 2014; SBD, 2014).

27

Figura 5 – Teste de Caminhada de 6 mintuos

Conforme já citado anteriormente, estudos têm mostrado tanto a

associação do DM2 com SNP rs7903146 do gene TCF7L2 quanto do DM2 e a

capacidade funcional. E embora possa ser encontrado na literatura inúmeras

pesquisas que avaliaram a capacidade funcional em pacientes diabéticos tipo 2

(FRANCHI et al, 2008; SALOMÉ, BLANES E FERREIRA, 2009; ANJOS et al, 2012;

MOHR, BEBER, WINKELMANN, 2013), são poucas as que são conduzidas afim de

associar a capacidade funcional e polimorfismos genéticos (PEREIRA, 2012;

CARVALHO, 2013). Entretanto, não foi encontrado na literatura estudos que

analisassem a existência ou não da associação entre a capacidade funcional,

polimorfismos no gene TCF7L2 e o DM2, concomitantemente.

Desta forma, considerando a falta de evidências entre a relação

entre polimorfismos no gene TCF7L2, o DM2 e a capacidade funcional de exercício

são necessários a realização de estudos que analisem a associação entre esses três

parâmetros para verificar se o polimorfismo no gene está diretamente relacionado a

uma capacidade de exercício prejudicada ou se esta é consequência das alterações

metabólicas decorridas do DM2.

28

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Verificar a existência da associação entre o DM2 e a capacidade de

exercício em idosos portadores de genótipos desfavoráveis do gene TCF7L2.

3.2 ESPECÍFICOS

Estimar as frequências alélica e genotípica do polimorfismo no gene

TCF7L2 na população estudada;

Determinar a prevalência de DM2 na população idosa avaliada;

Identificar a possível associação do polimorfismo no gene TCF7L2

com a maior propensão ao desenvolvimento do DM2;

Verificar a existência da associação entre o DM2 e a diminuição da

capacidade de exercício em idosos.

.

29

ARTIGO

ASSOCIAÇÃO ENTRE O SNP rs7903146 DO GENE TCF7L2, CAPACIDADE

FUNCIONAL E O DIABETES MELLITUS TIPO 2

(A ser submetido no periódico qualis área 21 “Journal of Aging and Physical Activity”, fator

de impacto 1.411)

Rayanne T. Ferreira, Myrian F. Merli, Audrey S. Marquez, Vanessa S. Probst e Regina C.

Poli-Frederico

Universidade Norte do Paraná, Londrina, Paraná

Rayanne T. Ferreira e Regina C. Poli-Frederico, Laboratório de Genética e Biologia

Molecular, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Norte do

Paraná; Myrian F. Merli e Vanessa S. Probst, Departamento de Fisioterapia, Universidade

Norte do Paraná; Audrey S. Marquez, Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde,

Universidade Norte do Paraná.

Esta pesquisa teve apoio financeiro da Editora Unopar, Funadesp e Capes.

A correspondência relativa a este artigo deve ser dirigida a Regina C. Poli-Frederico,

Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Reabilitação Universidade Norte do Paraná, Londrina, Paraná, Brasil. E-mail:

reginafrederico@yahoo.com.br

30

Resumo 1

2

Alterações genéticas e de capacidade funcional de exercício têm sido constantemente 3

relacionadas ao desenvolvimento de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2). Este estudo investigou a 4

associação entre o SNP rs7903146 no gene TCF7L2 e a capacidade de exercício em idosos 5

portadores DM2. Foram analisados 408 idosos, alocados previamente em três grupos [não 6

diabéticos (gNDM), pré-diabéticos (gPDM) e diabéticos tipo 2 (gDM2)]. Foi realizada 7

genotipagem pela técnica de qPCR e o teste de caminhada de 6 minutos, segundo a American 8

Thoracic Society. Os resultados mostraram uma associação estatisticamente significativa entre 9

o genótipo TT e alelo T do SNP rs7903146 do gene TCF7L2 e o risco de DM2 em 10

comparação entre gDM2 e gNDM. Foi observado que idosos portadores do genótipo TT e 11

alelo T apresentavam cerca de duas vezes mais chances de desenvolver DM2 em comparação 12

com idosos portadores dos genótipos CC+CT e alelo C. Não foi encontrada associação 13

significativa entre o SNP rs7903146, grupos gPDM e gDM2 com capacidade funcional. Os 14

dados obtidos aqui concordam com os dados de outros estudos nos quais o polimorfismo no 15

gene TCF7L2 desempenha um papel importante na etiologia do DM2 em idosos. Entretanto, 16

este foi o primeiro estudo que avaliou este polimorfismo em uma população heterogênea 17

como a brasileira. 18

19

Palavras-chave: Diabetes mellitus tipo 2, polimorfismo genético, capacidade funcional, gene 20

TCF7L2. 21

22

23

24

25

31

Introdução 1

2

O Diabetes Mellitus do tipo 2 (DM2) é uma doença metabólica crônica multifatorial 3

caracterizado por resistência insulínica que evolui para progressiva deficiência de insulina 4

(SBD, 2011). Segundo o Projeto Diretrizes (SBEM, 2011) e Freeman e Cox (2006), a 5

predisposição genética, além de fatores de risco ambientais, estão diretamente ligados ao seu 6

desenvolvimento. 7

Recentes pesquisas têm demonstrado que genes envolvidos na função e 8

desenvolvimento das células beta pancreáticas estão envolvidos na patogênese do DM2 9

(Tangjittipokin et al, 2012), assim, estudos sobre polimorfismos genéticos têm sido 10

conduzidos e a identificação de genes que conferem suscetibilidade ao indivíduo está sendo 11

amplamente investigada (Grant et al, 2006; Marquezine, 2009; Villareal et al, 2010; Sousa, 12

2011; Reis et al, 2011; Barra et al, 2012; Dayet et al, 2013; Peng et al, 2013; Canivell et al, 13

2014). 14

Reis et al (2011) relatam que há avanços no entendimento da base genética do DM2 e 15

demonstram uma possível participação do gene transcription factor 7 like-2 (TCF7L2) no 16

desenvolvimento desta doença. Há quase 10 anos, estudos têm demonstrado que SNPs (single 17

nucleotide polimorphysm) no gene TCF7L2 estão relacionados a um maior risco do 18

desenvolvimento do DM2 em diferentes populações (Grant et al, 2006; Marquezine, 2009; 19

Villareal et al, 2010; Sousa, 2011; Reis et al, 2011; Barra et al, 2012; Dayet et al, 2013; Peng 20

et al, 2013; Canivell et al, 2014). Sousa (2011) reporta que devido a essas associações 21

previamente confirmadas, alterações no gene TCF7L2 são consideradas um fator de risco 22

genético importante para o desenvolvimento do DM2. Estudos recentes também têm mostrado 23

a associação entre polimorfismos no gene TCF7L2 e alterações nos seus níveis de expressão 24

em pacientes com DM2 (Grant et al, 2006; Damcott et al, 2006; Dayeh et al, 2013; Canivell et 25

32

al, 2014). 1

O TCF7L2 é um gene que está localizado no braço longo do cromossomo 10 2

(10q25.3) e possui 217.329 pares de bases (GenBank, 2014). Este gene apresenta alguns 3

SNPs, dentre eles o rs7903146 (C/T), na posição 114748339, que tem sido bastante associado 4

ao desenvolvimento do DM2 (Rheinheimer et al, 2010; Sousa, 2011; Marquezine, 2009). 5

Ressalta-se aqui a importância em se estudar o SNP rs7903146, já que de acordo com o 6

HapMap Project, trata-se de um tag SNP que está em desequilíbrio de ligação com outros 7

SNPs (rs12255772, rs4132670, rs4506565, rs7901695, rs17747324) em populações 8

caucasianas. 9

De acordo com Sousa (2011), Marquezine (2009), Gloyn, Braun e Rorsman (2009), o 10

polimorfismo SNP rs7903146 no gene TCF7L2 favorece o desenvolvimento do DM2 por 11

interferir na codificação de uma importante proteína do fator de transcrição componente da 12

regulação do complexo da β-catenina na via de sinalização Wnt (via canônica), um dos 13

mecanismos responsáveis pela sobrevivência, proliferação e diferenciação das células β–14

pancreáticas e consequente secreção de insulina. Rheinheimer e colaboradores (2010) 15

sugerem que este SNP também altera a secreção de insulina por interferir na produção do 16

GLP-1 (glucagon like peptide tipo 1), hormônio estimulador da secreção de insulina 17

dependente de glicose. 18

Além disso, é importante enfatizar que estudos epidemiológicos tem identificado forte 19

relação de risco ao DM2 com obesidade, comportamento sedentário (Hu et al, 2001, Hu et al, 20

2003, Dunstan et al, 2007), dietas calóricas (Davis, Forbes, Wylie-Rosett, 2009), carboidratos 21

processados (Hu, Van Dam, Liu, 2001) e gordura animal (Winzell, Ahren, 2004). Evidências 22

científicas mostraram que intervenções intensivas no estilo de vida, tendo como alvo perda de 23

peso por meio da modificação da dieta e atividade física, apresentaram grande impacto 24

33

benéfico na incidência de indivíduos com risco aumentado ao DM2 (Lindstrom et al, 2006; 1

Hamman et al, 2006). 2

Embora possa ser encontrado na literatura inúmeras pesquisas que avaliaram a 3

capacidade funcional de exercício em pacientes diabéticos tipo 2 (Franchi et al, 2008; Salomé, 4

Blames e Ferreira, 2009; Anjos et al, 2012; Mohr, Beber, Winkelmann, 2013), são poucas as 5

que são conduzidas envolvendo a capacidade funcional de exercício e polimorfismos 6

genéticos (Pereira, 2012; Carvalho, 2013). Ressalta-se que não foi encontrado até o momento, 7

estudos que analisassem a relação entre a capacidade funcional de exercício, polimorfismos 8

no gene TCF7L2 e o DM2, concomitantemente. 9

Diante disto, a hipótese deste estudo é de que idosos portadores da variante rara 10

(desfavorável) do gene TCF7L2, que confere suscetibilidade ao DM2, apresentam pior 11

capacidade funcional de exercício. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a associação 12

entre o SNP no gene TCF7L2 (rs7903146), e capacidade funcional de exercício em idosos 13

fisicamente independentes com DM2. 14

15

Materiais e Métodos 16

17

Delineamento e critérios de elegibilidade da população de estudo 18

19

Este é um estudo com delineamento transversal derivado do projeto interdisciplinar 20

EELO (Estudo sobre Envelhecimento e Longevidade) que teve como objetivo principal 21

realizar um estudo epidemiológico de fatores sociodemográficos e indicadores das condições 22

de saúde de idosos em Londrina, uma cidade do Norte do Paraná, Brasil entre os anos de 2009 23

e 2011. 24

34

A partir de 43.610 idosos cadastrados em 38 unidades básicas de saúde na área urbana 1

da cidade de Londrina – PR, foi realizada uma estratificação aleatória, considerando o gênero 2

e as cinco regiões da cidade, com intervalo de confiança de 95% e margem de erro aceitável 3

de 5%. O cálculo amostral resultou em 343 indivíduos e foi realizado segundo Barbetta 4

(2006).. Entretanto foram avaliados 408 idosos, (343 + 20% - perda de 3 indivíduos) com 5

idade ≥ 60 anos, fisicamente independentes, de acordo com a classificação pelo Estado 6

Funcional de Spirduso (níveis 3 e 4 ) (Spirduso, 2005). 7

O critério de exclusão utilizado foi a presença de diabetes mellitus diferente do tipo 2. 8

Todos os participantes concordaram em participar e assinaram um termo de consentimento 9

livre e esclarecido. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Norte do 10

Paraná (PP0070/09). 11

12

Diagnóstico de DM2 13

14

Todos os pacientes passaram por entrevistas as quais se verificou o autorrelato de 15

DM2, e a utilização de medicamento para a doença em questão. Também foi realizada a 16

análise de prontuários e de exames laboratoriais (glicemia de jejum e hemoglobina glicada). 17

Então, a partir dos valores de referência da Sociedade Brasileira de Diabetes (2014) foi 18

realizadaa classificação dos idosos em três grupos: não diabéticos (gNDM) (glicemia ≤ 99 19

mg/dL e hemoglobina glicada < 6,5%), pré-diabéticos (gPDM) (glicemia entre 100 mg/dL e 20

125 mg/dL) e diabéticos (gDM2) (glicemia ≥ 126 mg/dL e hemoglobina glicada > 6,5%). 21

22

Coleta de material, obtenção e extração do DNA 23

24

35

Para a obtenção de DNA foram coletados de cada paciente 5 ml de sangue periférico 1

com anticoagulante EDTA por punção venosa. A extração de DNA foi realizada por meio da 2

utilização do Kit PureLink® (Invitrogen) de acordo com as instruções e protocolo do 3

fabricante. A avaliação da qualidade e quantidade de DNA foi feita por espectrofotometria no 4

equipamento Nanodrop® e os DNAs foram armazenado a -80ºC. 5

6

Identificação do polimorfismo genético rs7903146 7

8

A genotipagem do SNP rs7903146 (C__29347861_10) foi realizada pela técnica de 9

reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) em tempo real com sistema TaqMan® e 10

utilizando o equipamento Step One Plus® da Applied Biosystems. 11

Para a realização da qPCR foram utilizados para um volume final de 20 µL: 0,5 µL 12

dos pares de primers e sondas marcadas com os fluoróforos VIC e FAM (1x): 5’ 13

TAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGATA[C/T]TATATAATTTAATTGCCGTATGAGG3’ e 14

3’ATCTCTCGATTCGTGAAAAATCTAT[G/A]ATATATTAAATTAACGGCATACTC 15

C5’; 7,5 µL de água ultrapura, 10 µL do TaqMan® Universal PCR Master Mix (1x) e 2 µL de 16

amostra do DNA genômico na concentração de 30 ng/µL com a seguinte ciclagem: 60ºC por 17

30 segundos (pré-desnaturação), 95ºC por 10 minutos para desnaturação inicial, 50 ciclos de 18

95ºC por 15 segundos (desnaturação) e 60ºC por 1 minuto (pareamentos dos primers e 19

extensão), e um ciclo final 30 segundos a 60ºC. 20

Após a realização do procedimento, foi realizada a análise do gráficos fornecidos 21

(figura 1) pelo equipamento para que se identificasse os genótipos presentes em cada amostra 22

(CC, CT ou TT). 23

36

1 Figura 1 – Discriminação alélica fornecida pelo equipamento Step One Plus. Os pontos azuis 2

indicam as amostras homozigóticas para o alelo T. Os pontos verde representam as amostras 3

heterozigóticas. E os pontos vermelho são as amostras homozigóticas para o alelo C 4

5

Avaliação da capacidade funcional de exercício 6

7

Para a avaliação da capacidade funcional de exercício na população do estudo foi 8

realizado o teste de caminha de 6 minutos (TC6min) de acordo com o protocolo da American 9

Thoracic Society (2002). A análise foi baseada na porcentagem de valores preditos de acordo 10

com Troosters et al (1999). A capacidade de exercício foi considerada preservada quando os 11

valores do TC6min encontravam-se maior ou igual a 80% dos valores preditos, enquanto a 12

prejudicada tinham valores menores que 80%. É importante mencionar que 66 indivíduos não 13

37

realizaram este teste por não estarem presentes no dia de sua realização ou ainda por 1

possuírem comorbidades incapacitantes. 2

3

Análise estatística 4

5

Simultaneamente à coleta, confeccionou-se um banco de dado, o qual foi 6

posteriormente analisado. Foi utilizado o pacote estatístico Statistical Package for Social 7

Science – SPSS, versão 20, com digitação única, propiciando à pesquisa uma maior 8

fidedignidade e confiabilidade. 9

O teste do Qui-quadrado foi utilizado para verificar a associação e estabelecer 10

diferenças significativas entre as frequências alélicas e genotípicas do gene TCF7L2 entre os 11

grupos de idosos gNDM, gPDM e gDM2, assim como para investigar se as freqüências 12

genotípicas estavam no equilíbrio de Hardy-Weinberg e se havia associação entre gNDM, 13

gPDM e gDM2 e a capacidade de exercício. A razão de chances entre as frequências alélica e 14

genotípica e o DM2 foi calculada pelo teste Odds Ratio com intervalo de confiança (IC) de 15

95%. Para realizar esta análise entre a frequência genotípica e o DM2 houve a divisão dos 16

grupos CC + CT (prevalente) e TT (raro). Foi adotado o nível de significância de 5%. 17

18

Resultados 19

20

Dos 408 idosos analisados, cerca de 70% (287) pertenciam ao gênero feminino, quase 21

54% (219) tinham entre 65 e 74 anos, ressaltando que a média de idade dos idosos foi de 69.5 22

± 6.5. Do total, quase um terço (1/3) dos idosos (129) eram diabéticos (Tabela 1). 23

24

Tabela 1 25

Características clínicas dos idosos participantes do estudo 26

38

Características N %

Gênero Feminino 287 70.3

Masculino 121 29.7

Idade

< 65 anos 107 26.2

65 – 74 anos 219 53.7

> 74 anos 82 20.1

DM2

Ausência de DM2 135 33.1

Pré-diabéticos 144 35.3

Diabéticos 129 31.6

CF Preservada 298 87.1

Prejudicada 44 12.9

DM2 = Diabetes Mellitus tipo 2. Ausência de DM2 (glicemia ≤ 99 mg/dL e hemoglobina 1

glicada < 6.5%). Pré-diabéticos (glicemia entre 100 mg/dL e 125 mg/dL). Diabéticos 2

(glicemia ≥ 126 mg/dL e hemoglobina glicada > 6.5%. CF = Capacidade funcional de 3

Exercício. Preservada (>80% do valor predito) e prejudicada (<80% do valor predito). 4

5

As frequências alélicas e genotípicas estão apresentadas na tabela 2. Pode-se verificar 6

que aproximadamente 44% dos pacientes que possuíam o genótipo TT eram diabéticos, 7

enquanto quase 37% dos pacientes não diabéticos eram portadores do genótipo CC. As 8

frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p >.05). 9

Foi observada uma associação significativa entre o genótipo TT e alelo T do gene 10

TCF7L2 (rs7903146) (p = .035 e p = .017, respectivamente) e o grupo gDM2. A associação 11

pôde ser percebida ao se constatar que quase 37% dos pacientes com genótipo CC e cerca de 12

35% dos indivíduos com alelo C pertenciam ao gNDM, e que aproximadamente 44% dos 13

idosos com genótipo TT e 39% dos paciente com alelo T eram do gDM2. Não foi encontrada 14

associação significativa entre o gPDM e os genótipos e alelos (p = .1129 e p = .4155, 15

respectivamente). 16

Em relação à capacidade funcional de exercício e os grupos avaliados (gNDM, gPDM 17

e gDM2) não foi verificada uma associação significativa nas comparações realizadas(Tabela 18

2). Adicionalmente, não foi encontrada uma associação estatística entre a capacidade 19

39

funcional de exercício e os genótipos (CC, CT e TT) e alelos (C e T) do SNP rs7903146 do 1

gene TCF7L2 (p = .065). 2

Tabela 2 3

Associação entre Diabetes Mellitus tipo 2, capacidade funcional de exercício e a variante 4

rs7903146 do gene TCF7L2 5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29 Χ

2 = Qui-quadrado. TC6min = Teste de caminhada de 6 minutos. * = significância estatística 30

(p < .05). 31

32

Na análise de razão de chance verificou-se que os indivíduos portadores do genótipo 33

TT apresentaram 2.96 vezes mais chances de desenvolver DM2 em comparação com os 34

indivíduos portadores dos genótipos CC + CT (IC95% = 1.1944 – 7.3616; p = .02). Também 35

foi observado que os portadores do alelo T apresentaram 1.67 vezes mais chances de terem 36

DM2 em relação aos que possuíam o alelo C (IC95% = 1.1621 – 2.298; p = .0073). 37

38

39

40

Distribuição Genotípica

Não Diabéticos

N(%)

Pré-Diabéticos

N(%)

Diabéticos

N(%)

Χ2(Valor de p)

CC 68 (50.3%) 71 (49.3%) 47(36.4%)

CT 60 (44.4%) 57 (39.6%) 64 (49.6%) 10.325 (.035)*

TT 7 (5.3%) 16 11.1(%) 18 14(%)

Total 135 (100%) 144 (100%) 129 (100%)

Distribuição Alélica

Não Diabéticos

N(%)

Pré-Diabéticos

N(%)

Diabéticos

N(%)

Χ2(Valor de p)

C 196 (72.6%) 199 (69.1%) 158 (61.2%)

T 74 (27.4%) 89 (30.9%) 100 (38.8%) 8.143 (.017)*

Total 270 (100%) 288 (100%) 258 (100%)

TC6min

Não Diabéticos

N(%)

Pré-Diabéticos

N(%)

Diabéticos

N(%)

TC6min

preservada

93 (83%) 114 (92.7%) 91 (86.7%)

TC6min

prejudicada

19 (17%) 9 (7.3%) 14 (13.3%) 5.472 (.065)

Total 112 (100%) 123 (100%) 105 (100%)

40

Discussão 1

2

O DM2 é uma condição clínica multifatorial em que alterações genéticas podem estar 3

associadas. Assim, no presente estudo foi investigada a associação entre o SNP (rs7903146) 4

no gene TCF7L2 com capacidade de exercício e DM2 em idosos fisicamente independentes. 5

Houve uma prevalência alta de pré-diabéticos e diabéticos, 35.3% e 31.6%, 6

respectivamente, na população estudada. Este resultado era esperado uma vez que já é 7

mundialmente sabido que há altas taxas de prevalência de DM tipo 2 em idosos, isso porque o 8

processo de envelhecimento tem como consequência a diminuição das funções orgânicas, o 9

que leva a um aumento da incidência e prevalência, além da gravidade de doenças crônicas 10

degenerativas (Minayo, 2014). O resultado encontrado é semelhante ao que foi descrito em 11

uma pesquisa realizada pelo National Diabetes Statistics Report (ADA, 2014), que relatou 12

que há mais de 25% de idosos americanos com diabetes. Pesquisas realizadas com população 13

adulta não idosa no Brasil também observaram prevalências semelhantes de diabéticos 14

(Sousa, 2011; Marquezine, 2009). 15

Os resultados deste estudo demonstram uma associação estatisticamente significativa 16

entre o alelo T e o genótipo TT do SNP rs7903146 do gene TCF7L2 com o desenvolvimento 17

de DM tipo 2 (Tabela 2), corroborando com outros estudos também realizados na população 18

brasileira (Barra et al, 2012; Marquezine, 2009; Sousa, 2011). Cabe ressaltar que a associação 19

do SNP rs7903146 do gene TCF7L2 com o desenvolvimento de DM tipo 2 também foi 20

observada em populações de outros países (Jyothi et al, 2013; Tangjittipokin et al, 2012; 21

Sanghera et al, 2008; Florez et al, 2006). 22

Isso provavelmente estaria relacionado ao fato de que o SNP rs7903146 no 23

gene TCF7L2 favorece ao desenvolvimento do DM2 por interferir na codificação de uma 24

importante proteína do fator de transcrição componente da regulação do complexo da β-25

41

catenina na via de sinalização Wnt, um dos mecanismos responsáveis pela sobrevivência, 1

proliferação e diferenciação das células β–pancreáticas (Sousa, 2011; Marquezine, 2009; 2

Gloyn, Braun, Rorsman, 2009). Já o segundo, relacionaria-se ao motivo de que o SNP 3

rs7903146 no gene TCF7L2, também através da via de sinalização Wnt (canônica), alteraria a 4

secreção de insulina incretino-dependente, por interferir na produção de um hormônio 5

estimulador da secreção de insulina dependente de glicose, o GLP-1 (glucagon like peptide 6

type 1), ou seja, tal SNP afeta a resposta da célula β-pancreática a esta proteína hormonal 7

(Sousa, 2011; Rheinheimer et al. 2010). 8

Os resultados demonstraram que o alelo T do gene TCF7L2 está associado a maior 9

prevalência de DM2 nos idosos avaliados. Esta alteração genética provavelmente implica na 10

codificação da proteína TCF7L2 de menor tamanho que perde a afinidade pela união com a -11

catenina e assim não promove a ativação da expressão de genes relacionados a modulação de 12

proliferação e diferenciação das células β-pancreáticas, e consequentemente alteração na 13

secreção de insulina, além de genes associados ao GLP-1. Portanto, o polimorfismo no gene 14

TCF7L2 desempenha um papel importante na etiologia da DM2 em idosos. 15

Foi possível constatar que não foi encontrada associação entre o DM2 e a capacidade 16

funcional de exercício, corroborando parcialmente com resultados de Franchi et al (2008), já 17

que mencionam a inexistência de uma associação entre o DM2 e a capacidade funcional de 18

exercício mas explicam que a falta de associação entre o DM e diminuição da capacidade 19

funcional pode estar relacionado a subestimação de diabéticos na idosa física e mentalmente 20

independentes, o que não se aplica a este estudo. Entretanto estes resultados estão em 21

discordância aos encontrados em outras pesquisas que analisaram tal variável na população 22

idosa em geral, não necessariamente diabéticos, (Alves, Leite, Machado, 2010; Barbosa et al, 23

2014), uma vez que elas encontraram uma associação entre o DM e a diminuição da 24

capacidade funcional de exercício. 25

42

A divergência nos resultados pode estar relacionada com a população avaliada, já que 1

a amostra populacional estudada nesta pesquisa é composta por idosos fisicamente 2

independentes, segundo os critérios de Spirduso (2005). Isso pode ser percebido ao verificar 3

que 87% da amostra tinha capacidade funcional de exercício preservada (> 80%) e, apenas 4

13%, uma capacidade funcional de exercício prejudicada (< 80%), reforçando a 5

independência dos idosos da amostra. Cabe frisar que 66 idosos não realizaram o TC6min 6

neste estudo. 7

Entretanto cabe frisar que não há estudos brasileiros que avaliam a associação do SNP 8

rs7903146 do gene TCF7L2, capacidade funcional e DM2 na população idosa. Estudos mais 9

abrangentes devem ser realizados a fim de esclarecer lacunas que ainda podem estar presentes 10

nos estudos acerca do DM2 e alterações genéticas no gene TCF7L2. O alelo T e genótipo 11

homozigoto TT do SNP rs7903146, parecem influenciar no risco de desenvolver DM2 em 12

idoso, mas há necessidade de se realizar estudos funcionais para entender melhor a função 13

deste SNP. 14

15

Conclusão 16

17

A partir dos resultados obtidos neste estudo, conclui-se que há uma associação entre o 18

SNP rs7903146 do gene TCF7L2 e o DM2 e uma alta prevalência de DM2 na população 19

idosa fisicamente independente, entretanto não se pôde estabelecer nesta amostra uma relação 20

desta doença com a capacidade funcional de exercício. Ressalta-se que idosos portadores do 21

alelo T em apresentam quase duas vezes mais chances (1.67; IC95% = 1.1621 – 2.298; p = 22

.0073) e o genótipo TT quase três vezes mais chances (2.96; IC95% = 1.1944 – 7.3616; p = 23

.02) de ter DM2 comparados aos idosos portadores do alelo C e genótipos CC + CT. 24

Alterações genéticas deste tipo, em conjunto com outros fatores e aspectos, pode elevar 25

43

significativamente as chances de uma pessoa desenvolver o DM2. Deste modo, avaliações 1

dessas alterações genéticas e o seu entendimento podem ser importantes na identificação de 2

indivíduos que possuem maior risco para DM2 e na utilização de medidas profiláticas. 3

4

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50

CONCLUSÃO GERAL

A partir das análises realizadas neste trabalho, pode-se concluir que:

a) Há uma alta prevalência de DM2 na população idosa estudada,

devido provavelmente ao processo de envelhecimento e aos hábitos atuais;

b) Existe uma associação entre o SNP rs7903146 do gene TCF7L2

e o DM2, sendo importante frisar que a presença do alelo recessivo T em uma

pessoa aumenta as chances de apresentar DM2;

c) Embora o genótipo CC e o alelo C serem mais frequentes na

população em geral, o genótipo TT e o alelo T são comuns nos idosos diabéticos

reforçando o fato de que a presença do alelo recessivo T aumenta as chances de

desenvolvimento de DM2;

d) Não foi possível estabelecer, nesta amostra, uma associação

entre o DM2 e um déficit da capacidade funcional de exercício. Acredita-se que a

ausência desta associação esteja relacionada com a população, já que a amostra

populacional estudada nesta pesquisa é composta por idosos fisicamente

independentes, segundo os critérios de Spirduso (2005).

Desta forma, a análise do gene TCF7L2, em especial, do

polimorfismo rs7903146 pode contribuir muito para a prática clínica, uma vez que

com a sua realização, os profissionais podem traçar um plano de prevenção mais

eficaz para seus pacientes contra o DM2.

Assim, é importante a realização de estudos posteriores que

investiguem a capacidade funcional em idosos portadores ou não do SNP

rs7903146 do gene TCF7L2, uma vez que este está relacionado a uma maior

chance de desenvolvimento de DM2, doença crônica que pode prejudicar a

capacidade funcional e interferir na qualidade de vida de seus portadores.

51

REFERÊNCIAS

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ANEXOS

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ANEXO A

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ANEXO B

Termo de consentimento livre e esclarecido

Termo de consentimento livre e esclarecido para participação na pesquisa intitulada “PROJETO ELLO: ESTUDO

EPIDEMIOLÓGICO DOS FATORES SÓCIO-DEMOGRÁFICOS E INDICADORES DAS CONDIÇÕES DE SAÚDE DE IDOSOS DO MUNICÍPIO

DE LONDRINA-PR” (de acordo com a Resolução 196 de 10/10/1996 do Conselho Nacional de Saúde). Eu,_______________________________________________________________________, RG nº __________________________ livremente, consinto em participar da pesquisa “PROJETO ELLO: ESTUDO

EPIDEMIOLÓGICO DOS FATORES SÓCIO-DEMOGRÁFICOS E INDICADORES DAS CONDIÇÕES DE SAÚDE DE IDOSOS DO MUNICÍPIO

DE LONDRINA-PR” sob responsabilidade da professora Audrey Marquez de Souza, diretora do Centro de Pesquisa em Saúde da Universidade do Paraná, localizada à Av. Paris, 675, Jardim Piza, Londrina/PR. Objetivo da pesquisa:

Este estudo pretende avaliar os fatores sócio-demográficos e os indicadores das condições de saúde de idosos independentes do munícipio de Londrina/PR,. Procedimentos que serão necessários: A pesquisa será conduzida da seguinte maneira: a) inicialmente será realizada uma entrevista estruturada com o objetivo de obter informações sobre qualidade

de vida e funcionalidade motora; b) quando necessário será realizado o exame de Raio X para verificar osteoartrite e osteoartrose; c) quando necessário será realizado o exame de densitometria óssea a fim de verificar a presença de

osteoporose; d) será necessário coletar uma pequena quantidade de sangue em jejum para realizar exames de sangue e

extração de DNA e RNA; Esclarecemos que o risco decorrente da sua participação é o mesmo de procedimentos rotineiros de coleta de sangue, ou seja, não haverá nenhum risco porque será utilizado material descartável e as pessoas são totalmente treinadas para realizar esta tarefa. Obs. Serão solicitadas duas autorizações aos doadores de sangue. A primeira é uma autorização específica para o estudo discutido acima, a segunda é uma permissão para usar o DNA, extraído das células do sangue, e as alíquotas de soro que serão guardadas para o uso em outros estudos que porventura a UNOPAR venha a desenvolver no futuro, sempre com a aprovação das comissões de ética da instituição. O DNA e o soro estocados poderão ser guardados por mais de 10 anos desde que em condições ideais de preservação. Caso o doador concorde em participar somente do primeiro estudo, ao final deste todo o material colhido do participante será descartado e não mais será usado em outras pesquisas. ____________________________ __________________________ Autorização para participar somente Autorização para usar a doação no primeiro estudo. em futuros estudos.

Privacidade:

Os dados individualizados serão confidenciais. Os resultados coletivos serão divulgados apenas em eventos e revistas meios científicos e não é possível a sua identificação. Benefícios:

As informações obtidas nesta pesquisa poderão ser úteis cientificamente e de ajuda para todos, porém não receberei nenhuma compensação financeira por participar deste estudo, como também não terei nenhum custo sobre os exames de Raio X e densitometria. Riscos:

Não haverá nenhum risco para a minha integridade física, mental ou moral por participar desta pesquisa. Desistência:

Poderei desistir a qualquer momento deste estudo, sem qualquer conseqüência para mim. O(a) senhor(a) tem o direito de pedir outros esclarecimentos sobre a pesquisa que considerar necessário e de se recusar a participar ou interromper a sua participação a qualquer momento, sem que isso lhe traga qualquer prejuízo. Contato com os pesquisadores: Centro de Pesquisa em Saúde da UNOPAR, (43) 3371-7990, nos seguintes horários: 8h:00min. às 12h:00min. e das 14h:00min às 17h:00min. Declaro estar ciente das informações deste termo de consentimento livre e esclarecido e concordo em participar desta pesquisa. ________________________________ _____________________________ Assinatura do entrevistado Assinatura do (a) Pesquisador (a)

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ANEXO C

Submission Guidelines for JAPA

Please refer to the Mission Statement for a general description of the journal mission and of types of articles suitable for publication in the Journal of Aging and Physical Activity.

In preparing manuscripts for publication in the Journal of Aging and Physical Activity, authors should adhere to the guidelines in the Publication Manual of the American Psychological Association (6th edition, 2009) unless otherwise noted in these submission guidelines. Copies of the APA Publication Manual can be found in most university libraries or may be obtained through the APA Order Dept., P.O. Box 92984, Washington, DC 20090-2984 (www.apa.org/books). Tel: 800-374-2721. Please note that the APA guidelines (p. 15) particularly require that authors acknowledge the existence of similar publications so that the Editor can “make an informed judgment as to whether the submitted manuscript includes sufficient new information to warrant consideration.” If similar publications exist, please address this in your cover letter and provide a brief explanation of how the submitted manuscript adds to the literature. Manuscripts that do not conform to APA guidelines and to the guidelines described here may be rejected without review.

All manuscripts must include an abstract of 100–150 words. The manuscript must be double-spaced, including the abstract, references, and any block quotes. Include line numbers that restart on each page of the manuscript (through Page Setup in Microsoft Word). Please also include, when relevant, a statement regarding compliance with regulations for the use of human subjects. All art must be professionally prepared, with clean, crisp lines; freehand or typewritten lettering will not be accepted. If photos are used, they should be black and white, be sharply focused, and show good contrast. Each figure and photo must be properly identified. In graphs, use black and white or gray shading only, no color. Keep labels proportionate with the size of the figures on the journal page, which is 6.5 in. wide. Digital images should be 300 dpi at full size for photos and 600 dpi for line art. Format tables in the table function of your word-processing program rather than aligning columns in text with tabs and spaces or using text boxes.

Manuscripts should be submitted electronically via ScholarOne: mc.manuscriptcentral.com/hk_japa. Please upload as a separate document a Title Page that includes the title, names of authors, institutional affiliations, running head, and full mailing address, e-mail address, and telephone and fax numbers of the author who is to receive the galley proofs. The manuscript itself should not contain any author-identifying information and should be uploaded as the Main Document. The first page of the manuscript should contain only the title of the article. Page 2 should contain the abstract, with the text of the manuscript beginning on page 3. Every effort should be made to see that the manuscript itself contains no clue to the author’s identity.

Manuscripts must not be submitted to another journal at the same time. Authors are advised to check very carefully the typing of the final copy, particularly the accuracy of references, and to retain a duplicate copy to guard against loss. Authors of manuscripts accepted for publication must transfer copyright to Human Kinetics, Inc.

Manuscripts are read by the Editor and/or an Associate Editor and, when possible, by at least one member of the editorial board and one or two additional reviewers. The review process is expected to take 9–12 weeks. There are no page charges to contributors. Manuscripts are evaluated through blind review.

All submissions should show evidence of good scholarship, judged by the explanation and rationale for the study, topical relevance and interest to the readership, the design and conduct of the project, and the presentation and discussion of results. Manuscripts that are judged as failing to meet these initial criteria may be rejected by the Editor without further review.

Editorial Ethics Policy

Disponível em: <http://journals.humankinetics.com/submission-guidelines-for-japa>. Acesso: nov. 2014.

60

Disponível em: <http://www.uai.cl/images/carlos_escarate/citas_bibliograficas/APA6th.pdf>. Acesso nov. 2014.

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ANEXO D