INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Computacional e Sistemas

RAFAEL MINA PIERGIORGE

Caracterização Molecular e Demografia Histórica de Populações do Camarão Sete-Barbas - Xiphopenaeus Kroyeri - (Heller 1889) do Sudoeste do Atlântico Por Meio de

Polimorfismos de Microssatélites e do Gene COI

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Computacional e Sistemas

Orientador: Dr. Fernando Araújo Monteiro

RIO DE JANEIRO

Abril de 2013

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Piergiorge, Rafael Mina Caracterização Molecular e Demografia Histórica de Populações do Camarão Sete-Barbas - Xiphopenaeus Kroyeri - (Heller 1889) do Sudoeste do Atlântico Por Meio de Polimorfismos de

Microssatélites e do Gene COI/ Rafael Mina Piergiorge. – Rio de Janeiro: 2013.

Dissertação de Mestrado em Biologia Computacional e Sistemas, área de concentração em Genômica funcional, evolução e filogenômica. Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ Rio de Janeiro, 2013 1. Genética de Populações 2. Citocromo c oxidase I 3. Genética pesqueira. 4. espécies crípticas

iii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

RAFAEL MINA PIERGIORGE

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E DEMOGRAFIA HISTÓRICA DE POPULAÇÕES DO CAMARÃO SETE-BARBAS - XIPHOPENAEUS KROYERI - (HELLER 1889) DO SUDOESTE DO ATLÂNTICO POR MEIO DE POLIMORFISMOS DE MICROSSATÉLITES E DO GENE COI

ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Araújo Monteiro Aprovado em: _____/_____/_____ EXAMINADORES: Prof. Dr. Renata Schama Lellis - Presidente Prof. Dr. Carolina Tavares Schumann Dr. Anderson Vilasboa de Vasconcellos Prof. Dr. Marcos Paulo Catanho de Souza RIO DE JANEIRO, 25 DE ABRIL DE 2013

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AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Luiz Piergiorge e Maria Helena Mina, que com muito amor e

carinho fizeram o possível e o impossível para me verem feliz. Agradeço muito aos

dois, pois sem o apoio de ambos eu não estaria perto de concluir esta etapa da

minha vida.

Ao meu orientador, Fernando Monteiro e a professora Jaqueline Gusmão –

UERJ pelo apoio durante o projeto.

À Karina Alessandra Morelli e Márcio Pávan pelo auxílio nas análises

estatísticas.

Ao CNPq e CAPES pelo apoio fincanceiro.

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LISTA DE FIGURAS

Página Figura 1.1 Morfologia externa de um exemplar de X. kroyeri

retirado de Pérez-Farfante (1988). 4

Figura 1.2 Amplitude da distribuição geográfica das duas espécies do gênero Xiphopenaeus: X. riveti está representada em verde e X. kroyeri em vermelho.

5

Figura 1.3 Distribuição geográfica da espécie X. kroyeri após a revisão morfológica realizada por Pérez Farfante e Kensley (1997).

6

Figura 1.4 Padrões eletroforéticos espécie-específicos para as duas espécies crípticas Xiphopenaeus, após a digestão enzimática com as duas enzimas (HinfI e HincII; Gusmão et al. ,2013; modificado a partir de Gusmão e Solé-Cava, 2002). Padrão “A” de HinfI Xiphopenaeus sp. I; padrão “E” Xiphopenaeus sp. II; HincII) Padrão “D” Xiphopenaeus sp. I; Padrão “C” Xiphopenaeus sp. II.

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Figura 1.5 Mapa indicando a distribuição conhecida de Xiphopenaeus spp.. Os pontos de ocorrência apenas de Xiphopenaeus sp. I estão representados “sinais de mais”; os “quadrados” representam as localidades em que as espécies ocorrem em simpatria; Xiphopenaeus sp.III está representada por “triângulos”. Localidades: 1) São Luís/MA (Maggioni, comunicação pessoal); 2) Natal/NA (Gusmão et al., 2006); 3) Poças/BA (Gusmão et al., 2006); 4) Ilhéus/BA (Piergiorge, 2010); 5) Caravelas/BA (Gusmão et al., 2006; Piergiorge, 2010); 6) Guarapari/ES (Francisco, 2009); 7) Nova Almeida/ES (Gusmão et al., 2006; Piergiorge, 2010); 8) Arraial do Cabo/RJ (Gusmão et al., 2006); 9) Macaé/RJ (Francisco, 2009); 10) Angra dos Reis/RJ (Francisco, 2009); 11) Ubatuba/SP (Gusmão et al., 2006; Francisco, 2009; Piergiorge, 2010); 12) Santos/SP (Piergiorge, 2010); 13) Cananéia/SP (Francisco, 2009; Piergiorge, 2010); 14) Guaratuba/PR (Maggioni, comunicação pessoal); 15) São Francisco do Sul/SC (Francisco, 2009); 16) Itajaí/SC (Francisco, 2009); 17) Barra Velha/SC (Piergiorge, 2010); 18) Camboriú/SC (Piergiorge, 2010); 19) Venezuela (Gusmão et al., 2006); 20) Panamá (Gusmão et al., 2006).

9

Figura 1.6 Dados referentes à captura do camarão sete-barbas na costa brasileira no período compreendido entre 1960-2010 (FAO, 2010).

12

Figura 1.7 Divisões biogeográficas do ambiente costeiro em ecorregiões proposta por Spalding et al., (2007).

19

vi

Figura 3.1 Exemplos de embarcações utilizadas na pesca artesanal de camarões em Cananéia/SP

22

Figura 3.2 Mapa indicando as localidades estudadas no presente trabalho. 1) Natal/RN; 2) Poças/BA; 3) Ilhéus/BA; 4) Caravelas/BA; 5) Nova Almeida/ES; 6) Atafona/RJ 7) Arraial do Cabo/RJ; 8) Ubatuba/SP; 9) Santos/SP; 10) Cananéia/SP; 11) Barra Velha/SC; 12) Camboriú/SC; 13) Venezuela; 14) Panamá.

22

Figura 3.3 Árvore de NJ de partida evidenciando o relacionamento dos haplótipos de COI. Em detalhe está o valor de s calculado para o conjunto de dados (s = 14). Legenda: BA (Poças), CA (Caravelas), NA (Nova Almeida), AT (Atafona), CB (Camboriu), VEN (Venezuela), SP (Ubatuba) e UB (Ubatuba).

33

Figura 3.4 As duas hipóteses testadas para origem populacional através do s de Slatkin e Maddison. A) Hipótese de formação gradual das populações, no sentido Norte-Sul; B) Origem simultânea.

34

Figura 4.1 Redes de haplótipos de sequências do gene COI geradas através do programa Network para (A) Xiphopenaeus sp. I e (B) Xiphopenaeus sp. II. O tamanho do círculo é proporcional a frequência do haplótipo e as cores representam cada localidade. Cada linha corresponde a um único passo mutacional, exceto as duas maiores em Xiphopenaeus sp. II que correspondem a dois passos mutacionais. (*) Localidades estudadas por Maggioni (Maggioni, comunicação pessoal).

45

Figura 4.2 Árvore de Neighbor Joining de Xiphopenaeus spp. baseada em distâncias Kimura 2-parâmetros; Valores abaixo dos ramos: teste estatístico de bootstrap (valores > 70).

46

Figura 4.3 Gráfico com os resultados da PCA para Xiphopenaeus sp. I: análise com todas as localidades (esquerda) e após a remoção de Poças e Venezuela (direita). Legenda: pop 1 (POCA: Poças); pop 2 (NVAL: Nova Almeida); pop 3 (UBAT: Ubatuba); pop 4 (VENE: Venezuela); pop 5 (CARA: Caravelas); pop 6 (CAMB: Camboriú); pop 7 (SANT: Santos); pop 8 (ILH: Ilhéus); pop 9 (ATAF: Atafona); pop 10 (CANA: Cananéia).

52

Figura 4.4 Mismatch distribution para os grupos significativos para o teste de neutralidade de Xiphopenaeus sp. I, segundo o modelo de expansão demográfica e geográfica. A) (1-2) Valores significativos no teste de neutralidade para a hipótese de seis grupos; B) (1-2) agrupamento significativo segundo a hipótese de 3 grupos.

55

Figura 4.5 Dendrograma de UPGMA construído a partir dos valores a de FST.

60

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LISTA DE TABELAS

Página Tabela 3.1 Amostras de Xiphopenaeus spp. da coleção de

DNA do LGPESC-UERJ utilizadas para as análises com cada um dos três marcadores moleculares estudados. Fonte: [1] Gusmão et al., 2006; [2] Piergiorge, 2010. As barras verticais “I” separam os números de amostras de Xiphopenaeus sp. I e Xiphopenaeus sp. II.

23

Tabela 3.2 Primers heterólogos de EPIC usados no trabalho. 24 Tabela 3.3 Agrupamentos populacionais construídos para a

análise de variância molecular (AMOVA) de Xiphopenaeus sp.I. As cores e os parênteses representam as localidades.

30

Tabela 3.4 Primers de microssatélites usados no trabalho; primers específicos para Xiphopenaeus kroyeri (Xkro) e heterólogos (Rcon, Lvan) que resultam em amplificações positivas em X. kroyeri em testes de amplificação cruzada. Em todas as reações foi utilizado 1,5mM de MgCl2. Temperatura de anelamento (Ta).

36

Tabela 3.5 Agrupamentos testados para a análise de variância molecular (AMOVA).

38

Tabela 4.1 Resumo dos resultados obtidos nas padronizações para amplificação dos íntrons de Amilase e Fator de alongamento.

39

Tabela 4.2 Distribuição dos haplótipos por localidade nas duas espécies de Xiphopenaeus. A-J) Haplótipos identificados por Gusmão e colaboradores (2006); 1.1–1.8) Haplótipos de Xiphopenaeus sp. I identificados neste trabalho; 2.1-2.5) Haplótipos de Xiphopenaeus sp. II identificados neste trabalho.

42

Tabela 4.3 Medidas de diversidade genética de populações de Xiphopenaeus sp. I.

43

Tabela 4.4 Medidas de diversidade genética de populações de Xiphopenaeus sp. II.

43

Tabela 4.5 Valores de estruturação genética das populações de Xiphopenaeus sp. I (ΦST). Em negrito estão representados os valores significativos após a correção de múltiplos testes (** - P <0,0011). Acima da diagonal estão os valores de migrantes calculados a partir de ΦST.

47

Tabela 4.6 Valores da estatística Φ encontrados para os seis agrupamentos populacionais testados a priori (AMOVA) para a espécie Xiphopenaeus sp. I.

48

Tabela 4.7 Agrupamentos obtidos a posteriori para a espécie 49

viii

Xiphopenaeus sp. I, por meio da análise espacial de variância molecular (SAMOVA).

Tabela 4.8 Valores da estatística Φ, provenientes de oito agrupamentos populacionais obtidos a posteriori (SAMOVA) para a espécie Xiphopenaeus sp. I.

50

Tabela 4.9 Testes de neutralidade com os dois agrupamentos testados: três gupos e seis grupos. Nível de significância p=0,05 para D de Tajima e 0.02 para o F de Fu; (*) e (**): Valores significativos.

54

Tabela 4.10 Tempo estimado de expansão, Segundo os modelos de expansão demográfica e geográfica para a hipótese de seis grupos.

55

Tabela 4.11 Valores significativos para as hipóteses testadas para o s Slatkin e Maddison (1989). Ne – Tamanho efetivo populacional; Hipóteses: [1] – origem gradual e [2] fragmentação.

56

Tabela 4.12 Ajustes de amplificação dos dez loci de microssatélites selecionados para as duas espécies. (-): amplificações negativas; (*) loci ainda não testados.

58

Tabela 4.13 Caracterização genética dos três loci de microssatélites para as quatro populações de Xiphopenaeus sp. I. N – Número amostral; Na – Número de alelos; Ne – Número efetivo de alelos; Ho – Heterozigosidade observada; He – Heterozigosidade esperada; FIS – Coeficiente de endocruzamento; PHW – Significância para o equilíbrio de Hardy-Weinberg.

59

Tabela 4.14 Frequências alélicas dos três loci de microssatélites observadas nas quatro populações.

60

Tabela 4.15 Valores de FST par a par entre as populações de Xiphopenaeus sp. I. Os valores de FST estão abaixo da diagonal e os de RST acima (*p < 0,0001).

60

Tabela 4.16 Valores de identidade genética entre populações de Xiphopenaeus sp. I.

60

Tabela 4.17 Valores estruturação genética das populações de Xiphopenaeus sp. I obtidos a partir da AMOVA. À esquerda: valores de FST; À direita: valores de RST. Os valores entre colchetes representam os códigos dos agrupamentos testados.

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AMOVA – Análise de variância molecular ATAF – Atafona CANA – Cananéia CAMB – Camboriú CARA – Caravelas CEPSUL – Centro de Pesquisa e Gestão de Recursos Pesqueiros do Litoral Sudeste e Sul COI – Citocromo c oxidase subunidade I DNA – Ácido desoxirribonucléico EPIC - Exon-primed intron-crossing FAO – Food and Agriculture Organization FST – índice de fixação de Wright H – Diversidade haplotípica He – Heterozigosidade esperada Ho – Heterozigosidade observada ILH – Ilhéus K – Comprimento da sequência mtDNA – DNA mitocôndrial N – Tamanho amostral NVAL – Nova Almeida Ne – Tamanho efetivo populacional PANA – Panamá PCA – Análise de Componente Principal PCR – reação em cadeia da polimerase POCA – Poças PPS - Sea Surface Salinity RFLP - Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição SANT – Santos SAMOVA – Análise espacial de variância molecular sp. – espécie spp. – espécies UBAT – Ubatuba VENE – Venezuel X. – Xiphopenaeus Φ – índice de variância análogo ao índice de fixação de Wright. π – Diversidade nucleotídica µ – micro

x

SUMÁRIO

RESUMO 1 ABSTRACT 3 1. INTRODUÇÃO 4 1.1 HISTÓRICO 4 1.2 CICLO DE VIDA 10 1.3 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA 11 1.4 GENÉTICA PESQUEIRA 13 1.4.1 DNA MITOCONDRIAL E O GENE CITOCROMO C OXIDASE SUBUNIDADE I

15

1.4.2 REGIÕES REPETITIVAS DE MICROSSATÉLITES DO GENOMA NUCLEAR

16

1.4.3 POLIMORFISMOS DE TAMANHO EM ÍNTRONS DE GENES NUCLEARES (EPIC; EXON- PRIMED INTRON-CROSSING)

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1.5 AMBIENTE MARINHO 17 2. OBJETIVOS 20 2.1 OBJETIVOS GERAIS 20 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20 3. MATERIAL E MÉTODOS 21 3.1 AMOSTRAGEM 21 3.2 ANÁLISE DE EPICS 24 3.2.1 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR 24 3.2.2 ANÁLISE DE POLIMORFISMOS EPIC 25 3.3 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE MITOCONDRIAL COI

26

3.3.1 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR 26 3.3.2 SEQUENCIAMENTO, EDIÇÃO E ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIAS

26

3.3.3 ANÁLISES DE VARIABILIDADE GENÉTICA E FILOGENI A MOLECULAR

28

3.3.4 ANÁLISES POPULACIONAIS 28 3.3.5 DEMOGRAFIA HISTÓRICA 30 3.4 ANÁLISE DE LOCI MICROSSATÉLITES 35 3.4.1 AJUSTES PARA AMPLIFICAÇÃO PELA PCR 35 3.4.2 GENOTIPAGENS E ANÁLISE DE POLIMORFISMOS 37 3.4.3 ANÁLISES POPULACIONAIS 37 4. RESULTADOS 39 4.1 ANÁLISE DE EPICS 39 4.1.1 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR 39 4.1.2 ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE TAMANHO 39 4.3 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE MITOCONDRIAL COI

40

4.3.1 ANÁLISES DE VARIABILIDADE GENÉTICA 40 4.3.2 ANÁLISES POPULACIONAIS 47 4.3.3 DEMOGRAFIA HISTÓRICA 52 4.4 ANÁLISE DE LOCI MICROSSATÉLITES 57

xi

4.4.1 AJUSTES PARA AMPLIFICAÇÃO PELA PCR 57 4.4.2 ANÁLISE DE DADOS 58 5. DISCUSSÃO 62 5.1. SISTEMÁTICA MOLECULAR 62 5.2. GENÉTICA DE POPULAÇÕES E DEMOGRAFIA HISTÓRICA 64

6. CONCLUSÕES 70 7. REFERÊNCIAS 71

1

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E DEMOGRAFIA HISTÓRICA DE POPULAÇÕES DO CAMARÃO SETE-BARBAS - XIPHOPENAEUS KROYERI -

(HELLER 1889) DO SUDOESTE DO ATLÂNTICO POR MEIO DE POLIMORFISMOS DE MICROSSATÉLITES E DO GENE COI RESUMO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Rafael Mina Piergiorge

Xiphopenaeus kroyeri (Heller, 1862), é uma das espécies brasileiras mais importantes comercialmente, sendo explotada em toda a costa, principalmente nas regiões Sul e Sudeste. A partir da década de 60 sua explotação apresentou um grande crescimento, com oscilações até a década de 80. No entanto, após a década de 80 ocorreu um grande declínio na captura e, no período de 1990–1994, estão registrados os mais baixos valores das últimas décadas. Desde então o recurso encontra-se no limite de sustentabilidade. Em 2006, foram identificadas duas espécies crípticas em Xiphopenaeus no Atlântico. Entretanto, os órgãos responsáveis desconsideram essa informação, o que provavelmente acarretará consequências graves para uma ou ambas as espécies. O presente trabalho teve como objetivos: (1) ajustar as condições de amplificação de loci EPIC e caracterizar populações das duas espécies; (2) realizar análise populacional e demográfica histórica de Xiphopenaeus sp. I, em dez pontos ao longo da costa, através de polimorfismos do gene COI; e (3) ajustar as condições de amplificação de loci microssatélites e analisar quatro populações do Brasil. Apesar de resultarem em amplificações, os marcadores EPIC foram monomórficos nas duas espécies. Em relação ao marcador COI, oito novos haplótipos foram observados para Xiphopenaeus sp. I e cinco para Xiphopenaeus sp. II, totalizando quinze e oito haplótipos descritos, respectivamente. Apesar da identificação de novos haplótipos, o sistema de identificação molecular descrito para a identificação das espécies, continua válido. As análises de Φ apontaram que a população de Caracas (Venezuela) é geneticamente diferenciada das localidades brasileiras, enquanto que, no Brasil, Poças é diferente de Ubatuba, Santos e Cananéia. Por meio de análises de variância, confirmou-se a existência de uma separação pela ressurgência próxima de Cabo Frio. Foi verificado também que Xiphopenaeus sp. I sofreu expansão há 99,57 mil anos, provavelmente na última glaciação. Com microssatélites, apenas as análises de variância resultaram em valores significativos. Ao fim do estudo, os dados obtidos foram agrupados com informações prévias e foi construída uma distribuição consensual para a espécie. Todos esses resultados trazem importantes contribuições para o manejo de Xiphopenaeus spp, pois, além da existência de duas espécies, Xiphopenaeus sp. I é constituída por pelo menos

2

oito estoques geneticamente diferenciados. Este é o primeiro trabalho a realizar uma amostragem tão ampla em um estudo populacional da espécie. Além disso, os dados produzidos servirão como parâmetro de comparação para outros estudos de organismos marinhos da região.

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E DEMOGRAFIA HISTÓRICA DE POPULAÇÕES DO CAMARÃO SETE-BARBAS - XIPHOPENAEUS KROYERI -

(HELLER 1889) DO SUDOESTE DO ATLÂNTICO POR MEIO DE POLIMORFISMOS DE MICROSSATÉLITES E DO GENE COI ABSTRACT

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Rafael Mina Piergiorge

Xiphopenaeus kroyeri (Heller, 1862), is one of Brazil's most important commercial species being exploited across the coast mostly in the South and Southeast. From the 60's its exploitation showed large growth, with fluctuations up to the 80, but after the 80's there was a huge decline in the catch and in the period 1990-1994, are recorded the lowest values of decades. Since then the resource is within the limits of sustainability. In 2006 were identified two cryptic species in Xiphopenaeus in the Atlantic. However, the agencies responsible disregard this information, which probably will result in consequences for one or both species. This study focus to: (1) optimize the amplification conditions of EPIC loci and characterize populations of the two species, (2) perform analysis of historical demographic and population Xiphopenaeus sp. I, in ten points along the coast, through COI gene polymorphisms, and (3) standardize the amplification conditions of microsatellite loci and analyze four populations of Brazil. Despite the amplifications, EPIC markers were monomorphic in both species. In COI marker, eight new haplotypes were observed for Xiphopenaeus sp. I and five Xiphopenaeus sp. II, totaling three eight haplotypes. Even with the identification of new haplotypes, the identification system described for molecular identification of species remains valid. The Φ analysis showed that Venezuela is differentiated from Brazilian localities, while in Brazil Poças is different from Ubatuba, Santos and Cananéia. Through variance analysis was confirmed the existence of a separation next of the upwelling in Cabo Frio. We also noticed that Xiphopenaeus sp. I expanded on 99,570 years ago, probably in the last glaciation. Using microsatellites markers, the variance analysis was the only with significants values. At the end of this study, the data were clustered with previous informations and the consensus distribution was constructed for the species. All these results supply contributions to management of Xiphopenaeus spp., because beyond the existence of two species, Xiphopenaeus sp. I consists of at least eight genetically different stocks. This is the first work to perform as wide a sampling in a study population of the species. In addition, the data produced will serve as a point of reference for other studies of marine organisms in the region.

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1. INTRODUÇÃO

1.1 HISTÓRICO

Xiphopenaeus kroyeri (Heller, 1862), popularmente conhecido no Brasil como

camarão sete-barbas, pertence à família Penaeidae. Esta espécie é facilmente

identificada pelo rostro sinuoso, normalmente com cinco dentes rostrais, e pelos

longos pereópodes (Figura 1.1). Foi inicialmente descrita como pertencente ao

gênero Penaeus e, em 1869, após uma revisão taxonômica foi transferida para o

gênero Xiphopenaeus, passando a se chamar X. kroyeri (Smith, 1896).

Figura 1.1: Morfologia externa de um exemplar de X. kroyeri retirado de Pérez-Farfante (1988).

O gênero Xiphopenaeus (Smith, 1869), por sua vez, foi descrito como

monotípico, incluindo apenas a espécie X. hartii (Smith, 1869). Em 1869, Smith, ao

comparar espécimes de Penaeus kroyeri, identificados por Heller (1862), com X.

hartii, concluiu que se tratavam de exemplares de uma mesma espécie. Após a

revisão, além da transferência de gênero, a espécie X. hartii foi sinonimizada a X.

kroyeri, restabelecendo o caráter monotípico do gênero.

Em 1907, Bouvier descreveu uma segunda espécie pertencente ao gênero

Xiphopenaeus, chamada X. riveti, cuja distribuição se restringia ao Oceano Pacífico,

5

de Paita, no Peru, até Sinamoa, no México (Figura 1.2). A diagnose da espécie era

feita (dentre outras características morfológicas), pela presença de um rostro

levemente arqueado com quatro dentes desiguais.

Figura 1.2: Amplitude da distribuição geográfica das duas espécies do gênero Xiphopenaeus: X. riveti está representada em verde e X. kroyeri em vermelho.

Pérez Farfante e Kensley (1997), em uma revisão morfológica do gênero,

consideraram a espécie do Pacífico um sinônimo júnior de X. kroyeri. Deste modo,

os espécimes encontrados no Atlântico e Pacífico foram considerados como

pertencentes à mesma espécie e o gênero tornou-se novamente monotípico. Como

consequência, a distribuição da espécie X. kroyeri foi ampliada, desde a Carolina do

Norte (Estados Unidos) até Florianópolis (Brasil) no Oceano Atlântico, e de Sinamoa

(México) até Paita (Peru), no Pacífico (Figura 1.3). Em 2002, D’Incao et al.,

registraram a ocorrência da espécie no Rio Grande do Sul (Brasil).

6

Figura 1.3: Distribuição geográfica da espécie X. kroyeri após a revisão morfológica realizada por Pérez Farfante e Kensley (1997).

Gusmão e Solé-Cava (2002), utilizaram PCR/RFLP do gene mitocondrial COI

(citocromo c oxidase subunidade 1) para desenvolver um sistema de identificação

molecular para sete espécies comerciais de camarões marinhos brasileiros. Este

sistema molecular permitiu identificar com segurança materiais processados, que

muitas vezes não contêm os caracteres morfológicos diagnósticos das espécies.

Nesse estudo, detectou-se a presença de dois haplótipos distintos em populações

de camarões sete-barbas: um padrão de PCR/RFLP (AD) foi encontrado em

amostras coletadas no Espírito Santo e Rio de Janeiro, e um outro (EC) detectado

apenas em Natal (Figura 1.4). Este resultado indicou a possível presença de duas

espécies crípticas de Xiphopenaeus na costa brasileira.

7

Figura 1.4: Padrões eletroforéticos espécie-específicos para as duas espécies crípticas Xiphopenaeus, após a digestão enzimática com as duas enzimas (HinfI e HincII; Gusmão et al. ,2013; modificado a partir de Gusmão e Solé-Cava, 2002). Padrão “A” de HinfI Xiphopenaeus sp. I; padrão “E” Xiphopenaeus sp. II; HincII) Padrão “D” Xiphopenaeus sp. I; Padrão “C” Xiphopenaeus sp. II.

Em 2006, Gusmão e colaboradores realizaram um estudo abrangente de

populações brasileiras de camarão sete-barbas, utilizando o sistema de identificação

por PCR/RFLP (Gusmão e Solé-Cava, 2002), sequenciamento do gene mitocondrial

COI e análise isoenzimática. O estudo confirmou a existência de duas espécies

crípticas de Xiphopenaeus no Atlântico, Xiphopenaeus sp. I e Xiphopenaeus sp. II,

além de confirmar a existência de uma terceira espécie no Pacífico (Xiphopenaeus

sp. III), considerada X. riveti.

Análises isoenzimáticas de populações do litoral brasileiro revelaram

deficiência de heterozigotos na população de Ubatuba e, por meio de análise

multivariada, foi confirmada a existência de dois grupos de indivíduos: o primeiro

compreende indivíduos de Arraial do Cabo, Ubatuba, Nova Almeida, Caravelas,

Poças, Natal e Caracas (Venezuela), e o segundo, apenas indivíduos de Ubatuba e

Natal.

8

As análises de sequências COI mostraram que as amostras identificadas

como pertencentes aos padrões de PCR/RFLP AD e EC correspondem, na verdade,

a duas espécies crípticas de Xiphopenaeus na costa Oeste do Atlântico. Os padrões

de AD e EC foram, respectivamente, designados Xiphopenaeus sp I e Xiphopenaeus

sp II. De todas as localidades estudadas, Xiphopenaeus sp. I foi observado em todos

os pontos de coleta, desde Caracas (Venezuela) até Ubatuba. Xiphopenaeus sp. II

apresentou distribuição descontínua, encontrada apenas em Ubatuba/SP e

Natal/RN. Foram identificados sete haplótipos para a espécie I, três para a espécie II

e quatro para Xiphopenaeus sp. III (Pacífico).

Recentemente, Francisco (2009) propôs um sistema de identificação

molecular por PCR baseado na metodologia de Gusmão e Solé-Cava (2002) para

identificação das duas espécies da costa brasileira, e realizou um estudo

populacional da Xiphopenaeus sp. I nas regiões Sudeste e Sul do Brasil,

empregando marcadores microssatélites.

Os resultados encontrados quanto à distribuição geográfica das duas

espécies corroboraram resultados anteriores, tendo sido acrescido mais um ponto de

ocorrência para a espécie II, Cananéia/SP (Figura 1.5).

Em 2010, com o intuito de mapear a distribuição das espécies crípticas de

Xiphopenaeus do Atlântico, Piergiorge analisou 74 sequências de Xiphopenaeus

spp. e observou três novos haplótipos em Xiphopenaeus sp. I e um em

Xiphopenaeus sp. II. Mesmo com a baixa variação nucleotídica encontrada nas

espécies, 0,0010 e 0,0002, foi constada a utilidade deste marcador para elucidar

eventos demográficos. A distribuição conhecida das espécies está apresentada na

figura 1.5.

9

Figura 1.5: Mapa indicando a distribuição conhecida de Xiphopenaeus spp.. Os pontos de ocorrência apenas de Xiphopenaeus sp. I estão representados “sinais de mais”; os “quadrados” representam as localidades em que as espécies ocorrem em simpatria; Xiphopenaeus sp.III está representada por “triângulos”. Localidades: 1) São Luís/MA (Maggioni, comunicação pessoal); 2) Natal/NA (Gusmão et al., 2006); 3) Poças/BA (Gusmão et al., 2006); 4) Ilhéus/BA (Piergiorge, 2010); 5) Caravelas/BA (Gusmão et al., 2006; Piergiorge, 2010); 6) Guarapari/ES (Francisco, 2009); 7) Nova Almeida/ES (Gusmão et al., 2006; Piergiorge, 2010); 8) Arraial do Cabo/RJ (Gusmão et al., 2006); 9) Macaé/RJ (Francisco, 2009); 10) Angra dos Reis/RJ (Francisco, 2009); 11) Ubatuba/SP (Gusmão et al., 2006; Francisco, 2009; Piergiorge, 2010); 12) Santos/SP (Piergiorge, 2010); 13) Cananéia/SP (Francisco, 2009; Piergiorge, 2010); 14) Guaratuba/PR (Maggioni, comunicação pessoal); 15) São Francisco do Sul/SC (Francisco, 2009); 16) Itajaí/SC (Francisco, 2009); 17) Barra Velha/SC (Piergiorge, 2010); 18) Camboriú/SC (Piergiorge, 2010); 19) Venezuela (Gusmão et al., 2006); 20) Panamá (Gusmão et al., 2006).

10

1.2 CICLO DE VIDA

O ciclo biológico de Xiphopenaeus kroyeri ocorre em torno de 18 meses

(Neiva e Wise, 1963) e é composto por seis fases: fase adulta, na qual ocorre a

reprodução, fases larvais (náuplio, protozoea, mysis), fase pós-larval e fase juvenil.

Em relação à maturação de estruturas sexuais, a maturidade é alcança mais

rapidamente em machos (Mota-Alves e Rodrigues, 1977), porém as fêmeas atingem

maiores dimensões (Boschi, 1969; Branco et al., 1999; Mota-Alves e Rodrigues,

1977; Nakagaki e Negreiros-Fransozo, 1998).

Diferente de outros camarões peneídeos (i.e. Farfantepenaeus brasiliensis), o

camarão sete-barbas não necessita de estuários para completar o seu ciclo biológico

(Valentini et al., 1991; Rodrigues et al., 1993). Apesar de X. kroyeri ser considerado

não dependente de estuário para completar seu ciclo de vida, já foram observados

indivíduos nestes ambientes (Nakagaki e Negreiros-Fransozo, 1998) e, durante os

períodos de seca, em rios (Williams, 1965), mas tanto a elevada presença da

espécie em ambientes estuarinos quanto em ambientes fluviais pode estar

associada com a salinidade (Branco, 1999).

A distribuição de X. kroyeri é restrita a áreas com faixas de temperatura e

salinidade de 21.2 – 27.8°C e 31.062 – 37.252 PPS ( Ocean Biogeographic

Information System – IOBIS; Intergovernmental Oceanographic Commission (IOC).

Estudos mostraram que alterações sazonais em fatores abióticos ampliam as

diferenças nas proporções de machos e fêmeas (Mota-Alves e Rodrigues, 1977;

Nakagaki e Negreiros-Fransozo, 1998; Paiva et al., 1971).

Na região de Ubatuba, localidade onde foi verificada a ocorrência das duas

espécies, o camarão sete-barbas apresenta um ciclo reprodutivo que se estende por

todo o ano, mas possui dois picos reprodutivos, um na primavera e outro no outono

(Nakagaki e Negreiros-Fransozo, 1998). Castro (1997) relacionou a sazonalidade no

padrão reprodutivo de X. kroyeri com a disponibilidade de alimentos para as larvas.

No entanto, não é descartada a possibilidade dos dois picos estarem relacionados

com a reprodução de espécies diferentes.

Em um estudo acerca da dinâmica populacional e distribuição ecológica no

estuário de Santos, foi considerado que a desova de X. kroyeri não ocorre em águas

profundas, contrariando outros autores (Mota-Alves e Rodrigues, 1977), e sim em

11

locais mais rasos, devido à disponibilidade de alimento para as larvas. Além disso,

não foi verificada uma separação de habitats ao longo do ciclo de vida, já que

juvenis e adultos ocupam o mesmo habitat (Heckler, 2010). O mesmo padrão de

estruturação foi observado para a espécie na região Sul do Brasil (Branco, 2005).

Dall et al., (1990) descreveram os ciclos biológicos dos camarões,

classificando-os em quatro tipos:

Tipo I – Ciclo estuarino, no qual a biologia inteira da espécie ocorre em regiões

estuarinas.

Tipo II – Ciclo dependente de estuários, onde os juvenis migram para estuários costa

devido à preferência de recursos.

Tipo III – Ciclo costeiro e oceânico, no qual a reprodução ocorre em mar aberto e as

pós-larvas migram para a costa.

Tipo IV – Ciclo oceânico ou de mar aberto, no qual o ciclo biológico ocorre

inteiramente na região oceânica.

O ciclo de X. kroyeri foi considerado como dependente de estuários, sendo,

portanto, classificado como do tipo II. Porém, outros autores classificam o ciclo

biológico da espécie como sendo o tipo III, não necessitando dessas regiões para

completarem o ciclo (Valentini et al., 1991; Rodrigues et al., 1993). O recrutamento e

a reprodução ocorrem ao longo de todo o ano, mas ocorrem picos reprodutivos

durante dezembro e maio, e de juvenis em dezembro e janeiro (Rodrigues et al,

1993; Nakagaki e Negreiros-Fransozo, 1998; Branco et al., 1999; Branco, 2005;

Castro et al., 2005).

1.3 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

A pesca camaroneira é uma das principais atividades pesqueiras em diversos

países e membros da família penaeidae estão entre as espécies que mais

12

proporcionam lucro para os países explotadores (Paiva, 2004). No Brasil,

Xiphopenaeus kroyeri é pescado ao longo de toda costa e nas regiões Sudeste e

Sul, corresponde a uma das duas espécies mais importantes (D’Incao et al., 2002).

Entre o período de 1960 e 1981 foi observado crescimento na captura de

camarão sete-barbas, com pequenas oscilações. Durante a primeira metade da

década de 80, os valores ultrapassaram a marca de 15.000 toneladas, porém entre

1982 e 1994 a produção média anual do recurso foi marcada por uma grande

redução, com indicativos significativos de sobre-explotação nas regiões Sudeste e

Sul. No período de 1990-1994, a captura de X. kroyeri foi inferior a 6.000 toneladas,

o valor mais baixo das últimas décadas, sendo superior apenas aos anos de 1960-

61 e 1963 (FAO, 2010) (Figura 1.6). Esta redução pode ser explicada pela

diminuição na captura de outras espécies importantes economicamente e,

buscando-se novas espécies que atendessem as exigências do mercado, o camarão

sete-barbas teve a sua captura aumentada nos anos anteriores (Costa et al., 2007).

No entanto, a partir de 1995 é observado novamente aumento nas capturas da

espécie.

Figura 1.6: Dados referentes à captura do camarão sete-barbas na costa brasileira no período compreendido entre 1960-2010 (FAO, 2010).

Captura de Xiphopenaeus spp. na costa brasileira

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

1960

1962

1964

1966

1968

1970

1972

1974

1976

1978

1980

1982

1984

1986

1988

1990

1992

1994

1996

1998

2000

2002

2004

2006

2008

2010

Cap

tura

(t)

13

As variações na captura da espécie podem estar relacionadas ao grande

esforço de pesca decorrente da década de 80, mas podem ter sido (e ainda estar

sendo) influenciadas por medidas adotadas para a preservação das espécies

brasileiras. Segundo Souza (2008), uma das medidas pioneiras para o controle da

pesca do camarão-sete-barbas foi tomada em 1969, quando a utilização de redes

tipo arrastão de porta, com mais de 12 metros de comprimento na tralha superior foi

proibida, assim como de malhas inferiores a 15 mm entre-nós contíguos.

Posteriormente, em 1983 foi instituído o período de defeso (posto em prática apenas

no ano seguinte), como medida adotada para proteger as populações do camarão

rosa (Farfantepenaeus brasiliensis). Mais tarde naquele ano, foi implementado o

período de defeso para as demais espécies comerciais de camarões do Sul e

Sudeste do país, passando por pequenas modificações desde então.

Segundo o CEPSUL, a pesca de X. kroyeri (assim como a de outras espécies

demersais), é realizada mediante a utilização de duas redes cônicas puxadas por

uma única embarcação, denominado arrasto duplo. Este equipamento é muito

utilizado nas regiões Sudeste e Sul do Brasil, embora seja considerada de natureza

predatória, pois pode resultar na captura acidental de outras espécies (i.e.

tartarugas, cetáceos; Branco, 2005; Silva et al., 2010).

1.4 GENÉTICA PESQUEIRA

O ramo da genética pesqueira estuda a variabilidade genética de populações

de importância comercial, visando gerar subsídios para a conservação e uso

sustentável dos recursos pesqueiros. Os estudos atuam no reconhecimento de

estoques pesqueiros, seus tamanhos e limites de distribuição. A delimitação das

subpopulações pode ser realizada através de dados genéticos, citogenéticos,

marcação e recaptura, morfológicos, dados de captura, imunogenética e

parasitologia (Begg e Waldman, 1999)

Embora o conceito de “estoque” seja fundamental para a conservação dos

recursos pesqueiros, existem diversas definições para o termo. Segundo Hilborn e

Walters (1992), estoques são grupos arbitrários grandes o suficiente, auto-

sustentáveis e onde os membros de cada grupo compartilham histórias de vidas

14

similares. Os estoques podem ser também considerados como subpopulações,

agrupamentos geneticamente auto-sustentáveis, em que os estoques são uma

fração de uma população, em que os indivíduos apresentam similaridades impostas

pelo ambiente. O conceito proposto por Ovenden (1990) combina informação

genética, reconhecimento de limites geográficos e considera as populações como

auto recrutantes.

Em relação à Xiphopenaeus kroyeri, poucos trabalhos analisaram a

estruturação dos estoques pesqueiros. Voloch e Solé-Cava (2005), observaram

padrões de estruturação genética no sudeste do Brasil, utilizando 10 loci

isoenzimáticos. Foram detectadas diferenças significativas (FST = 0,223) entre

Ubatuba/SP e as populações de Nova Almeida/ES e Cabo Frio/RJ. A população de

Ubatuba, no entanto, apresentou desvios significativos do equilíbrio de Hardy-

Weinberg em dois loci, devido à grande deficiência observada de heterozigotos (Ho

= 0,000).

Em 2006, Gusmão e colaboradores realizaram uma investigação ampla de

cinco populações: Natal, Poças, Nova Almeida, Cabo Frio e Ubatuba, utilizando

análises de isoenzimas, PCR/RFLP e análises de sequências do gene mitocondrial

COI (Gusmão et al., 2006). Em decorrência de cinco loci diagnósticos presentes em

indivíduos das populações de Natal e Ubatuba, foram observadas taxas elevadas de

deficiências de heterozigotos (FIS = 0,575, P <0,05), alertando para a existência de

espécies diferentes do camarão sete-barbas em simpatria em Natal e Ubatuba.

Além disso, os resultados de PCR/RFLP e sequenciamento, de diferentes

populações do Atlântico e Pacífico, confirmaram a presença de duas espécies

crípticas de Xiphopenaeus no Atlântico, nomeadas Xiphopenaeus sp. I e

Xiphopenaeus sp. II, e uma terceira espécie no Pacífico, Xiphopenaeus sp. III,

considerada X. riveti Bouvier (1907) por Gusmão et al. (2006).

As análises de sequências do gene COI mostraram altos níveis de

divergência entre as espécies do Atlântico (12%), apesar da grande similaridade

morfológica. As duas espécies do Atlântico exibiram diferentes distribuições ao longo

da costa e a amplitude da distribuição geográfica das duas espécies não foi

completamente elucidada.

Francisco (2009) realizou um estudo populacional da espécie I nas regiões

Sudeste e Sul do Brasil, empregando marcadores microssatélites. A análise

molecular revelou uma maior variabilidade genética (Ho = 0,029 a 0,735) nas

15

populações de Xiphopenaeus sp. I nas regiões Sul e Sudeste do que a encontrada

por Gusmão e colaboradores, (2006) através de marcadores aloenzimáticos (Ho =

0,019 a 0,114). Além disso, no trabalho não foi observada estruturação populacional

em Xiphopenaeus sp. I, sendo necessários novos estudos em outras localidades

para uma melhor compreensão da estruturação dos estoques.

A constatação da presença de duas espécies crípticas de Xiphopenaeus na

costa brasileira é um fato ainda pouco difundido, especialmente fora da comunidade

cientifica especializada. Dessa forma, os estudos sobre a biologia da espécie, as

estatísticas pesqueiras e os dados do próprio IBAMA e da FAO (2010), ainda

desconsideram a existência de mais de uma espécie no Oceano Atlântico. O

camarão sete-barbas, depois do camarão rosa (Farfantepenaeus brasiliensis), é o

segundo recurso pesqueiro mais importante das regiões sul e sudeste do Brasil,

tendo sido incluído na lista de espécies sobreexplotadas em 2004 (DOU, 2004). Este

fato, aliado a existência de espécies crípticas, que são exploradas de forma

indiscriminada, evidencia a importância de que seja feita a caracterização dos

estoques genéticos das duas espécies na costa brasileira.

Os resultados produzidos em estudos populacionais anteriores são ainda

incipientes e contraditórios quanto à estruturação genética dos estoques das duas

espécies. Além disso, a distribuição geográfica das espécies na costa brasileira

ainda não foi plenamente esclarecida.

1.4.1 DNA MITOCONDRIAL E O GENE CITOCROMO C OXIDASE

SUBUNIDADE I

O mtDNA é geralmente uma molécula circular de herança exclusivamente

materna, que não sofre recombinação genética e apresenta uma taxa evolutiva

diferente do DNA nuclear. Por apresentar múltiplas cópias por célula, seus genes

são adequados para estudos forenses e trabalhos com material antigo, geralmente

degrado. A molécula possui tamanho variado entre grupos, com tamanho na faixa de

16.000pb em camarões (Peregrino-Uriarte et al., 2009).

Dos genes mitocondriais utilizados em estudos populacionais e de sistemática

molecular, destaca-se o Citocromo c Oxidase I (COI). Por ser relativamente

16

conservado dentro das espécies e variar entre espécies, possibilita sua utilização

para a resolução de problemas filogenéticos e sistemática molecular de grupos

próximos (Cristescu e Hebert, 2002; Koenemann et al., 2010; Palumbi e Baker,1994;

Hebert et al. ,2004). No entanto, a variação encontrada dentro de algumas espécies

possibilita a realização em estudos populacionais e filogeográficos (Laurenzano et

al., 2012; Russ et al., 2010).

Em camarões peneídeos, o gene mitocondrial COI tem sido usado em

estudos filogenéticos e de genética pesqueira e identificação molecular de espécies

crípticas (Piergiorge, 2010; Li et al., 2009; Russ et al., 2010; Gusmão et al., 2006).

Em função de sua grande utilidade para identificação de espécies, em 2003, a

região foi selecionada por Hebert e colaboradores como ferramenta para estudos de

sistemática molecular em metazoários (projeto DNA barcoding; Hebert et al., 2003).

1.4.2 REGIÕES REPETITIVAS DE MICROSSATÉLITES DO GEN OMA

NUCLEAR

O DNA nuclear de organismos eucariontes é uma molécula linear encontrada

no núcleo das células. Possui taxa de evolução mais lenta do que o mtDNA,

apresenta herança biparental, sofre recombinação e modificação na própria

estrutura, o que influencia a taxa que os genes são transcritos e traduzidos em

proteínas (Caccone et al., 2004).

Dentre as regiões nucleares, destacam-se as repetições curtas e altamente

variáveis, denominadas microssatélites. Microssatélites são unidades repetitivas em

tandem no DNA, que apresentam grande utilidade para estudos populacionais e

forenses (Góes et al., 2002). Esses marcadores são unidades repetitivas de 1 a 6

nucleotídeos, com elevadas taxas mutacionais, e os alelos são caracterizados de

acordo com o tamanho dos fragmentos (Litt e Luty, 1989; DeWoody e Avise, 2000).

Os loci são definidos segundo o motif, tipo de sequência repetida em tandem,

podendo ser mono, di, tri, tetra, penta ou hexanucleotídeo, que evoluem por slippage

durante e recombinação entre as fitas DNA (Ferreira e Grattapaglia, 1996).

São marcadores co-dominantes, geralmente multialélicos (possibilitam a

distinção de genótipos homozigotos dominantes de heterozigotos) (Goldstein e

Schlotterer, 1999), são distribuídos por todo o genoma e flanqueados por regiões

17

conservadas, o que possibilita a amplificação através da técnica de PCR (Weber e

May. 1989).

Nos últimos anos, conjuntos de primers de microssatélites foram

desenvolvidos para o gênero Xiphopenaeus (Francisco et al., 2009). Cinco loci

específicos foram desenvolvidos para Xiphopenaeus sp. I, mas primers heterólogos

já foram testados para o gênero, resultando em amplificações positivas. No entanto,

nenhum artigo publicado utilizou esses marcadores para análises populacionais das

espécies de Xiphopenaeus.

1.4.3 POLIMORFISMOS DE TAMANHO EM ÍNTRONS DE GENES

NUCLEARES (EPIC; EXON- PRIMED INTRON-CROSSING)

Dentre as regiões nucleares utilizadas em estudos populacionais, podem ser

citados os polimorfismos em íntrons (Touriya et al., 2003). Diversos íntrons de genes

nucleares foram identificados a partir de DNA genômico e cDNA de espécies de

camarões penaeídeos, e polimorfismos de tamanho dos fragmentos amplificados

foram detectados em Litopenaeus vannamei e Penaeus monodon (France et al.,

1999; Bierne et al., 2000). A amplificação específica é feita usando-se primers que

pareiam nos éxons, técnica conhecida como “exon-primed intron-crossing PCR

(EPIC-PCR; Palumbi, 1995). Alguns primers específicos para análises de EPIC-

PCR, com alta variabilidade, já foram usados em estudos populacionais de

camarões peneídeos (Bierne et al., 2000).

1.5 AMBIENTE MARINHO

A costa brasileira é influenciada por três correntes marítimas: a Corrente da

Costa Norte do Brasil (CCNB); a Corrente do Brasil (CB); e a Corrente das Malvinas

(CM). As correntes da costa norte e do Brasil são correntes de temperatura e

salinidade altas e pobres em sais nutrientes, formadas a partir da corrente sul

equatorial, próxima a João Pessoa (PB). Já a Corrente das Malvinas possui alta

concentração de nutrientes e baixa temperatura e salinidade, flui de sul para norte,

encontra-se com a Corrente do Brasil e resulta na Convergência Subtropical.

18

Segundo Spalding et al., (2007), os fatores físicos possibilitam dividir as

regiões costeiras em reinos, províncias e ecorregiões. As ecorregiões são as

menores divisões do ambiente marinho e podem ser delimitados por uma variedade

de fatores, por exemplo, tipo de sedimentos, ressurgência, fluxo de nutrientes e

temperatura. No Brasil são encontradas nove ecorregiões (Figura 1.7).

19

Figura 1.7: Divisões biogeográficas do ambiente costeiro em ecorregiões proposta por Spalding et al., (2007).

20

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

2.1.1 ANÁLISE POPULACIONAL E DEMOGRÁFICA

• Caracterizar geneticamente os estoques de pesca de Xiphopenaeus kroyeri do

Atlântico, utilizando análise de polimorfismos de microssatélites, EPIC e análise

de seqüências do gene mitocondrial COI, gerando dados que forneçam

subsídios para a exploração sustentável e conservação dos recursos pesqueiros.

• Investigar os padrões evolutivos que moldaram a variação genética presente nas

populações de Xiphopenaeus spp. e os eventos históricos e demográficos que

levaram a atual distribuição geográfica de Xiphopenaeus sp. I.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Ajustar as condições de amplificação por PCR de amostras da espécie I e II,

empregando os primers de microssatélites e EPIC já descritos na literatura.

• Analisar a variabilidade genética em populações representativas da amplitude de

distribuição da espécie ao longo da costa brasileira empregando análise de loci

microssatélites e de seqüências mitocondriais do gene COI.

• Delimitar os estoques genéticos de pesca das duas espécies na costa brasileira,

por meio de análises com os dois marcadores.

21

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAGEM

As amostras de Xiphopenaeus analisadas neste trabalho pertencem à coleção

de DNA do Laboratório de Genética Pesqueira e da Conservação (LGPesC - UERJ). Os

espécimes foram obtidos diretamente de pescadores, imediatamente após o

desembarque de pequenas embarcações (Figura 3.1), em nove localidades: Ilhéus (–

14°46'S –39°01'W; BA), Caravelas (–17°44’S –39°15’W ; BA), Nova Almeida (–20°03’S –

40°11’W; ES), Atafona (–21°37'S –41°0'W; RJ), Ubatu ba (–23°26’S –45°04’W; SP),

Santos (–23°58' –46° 19'; SP), Cananéia (–25°02'S – 47°55'W; SP), Barra Velha (–

26°37', –48°40'; SC) e Balneário Camboriú (–26º59'0 7''S –48º35'58”W; SC) foram

obtidas entre setembro de 2008 e junho de 2010 (Figura 3.2) (Tabela 3.1).

Nove amostras de Natal (–5°52’S –35°10’W; RN), oito da Venezuela (10°36’N –

66°59’W), quatro de Poças (-11°46’S 37°32W; BA), du as de Nova Almeida, quatro de

Ubatuba (–23°26’S –45°04’W; SP), duas de Arraial do Cabo (–22°58’S –42°01’W; RJ) e

três de Caravelas, amostradas por Gusmão e colaboradores (2006) também foram

incluídas nas análises populacionais. Quatro sequências oriundas do Panamá (8°53’N –

79°35’W) foram usadas em análises filogenéticas (nú mero de acesso: DQ084377.1;

DQ084378.1; DQ084379.1; DQ084380.1; Gusmão et al., 2006).

22

Figura 3.1: Exemplos de embarcações utilizadas na pesca artesanal de camarões em Cananéia/SP.

Figura 3.2: Mapa indicando as localidades estudadas no presente trabalho. 1) Natal/RN; 2) Poças/BA; 3) Ilhéus/BA; 4) Caravelas/BA; 5) Nova Almeida/ES; 6) Atafona/RJ 7) Arraial do Cabo/RJ; 8) Ubatuba/SP; 9) Santos/SP; 10) Cananéia/SP; 11) Barra Velha/SC; 12) Camboriú/SC; 13) Venezuela; 14) Panamá.

23

Tabela 3.1: Amostras de Xiphopenaeus spp. da coleção de DNA do LGPESC-UERJ utilizadas para as análises com cada um dos três marcadores moleculares estudados. Fonte: [1] Gusmão et al., 2006; [2] Piergiorge, 2010. As barras verticais “I” separam os números de amostras de Xiphopenaeus sp. I e Xiphopenaeus sp. II. Localidade Código da

Localidade

Fonte Data da Coleta Marcador molecular

(Número de indivíduos)

COI EPIC Microssatélites

Panamá PANA 1 2001 (4)

Venezuela VENE 1 2001 (7) -

Natal NATA 1 02/2001 (1|8) (-|4)

Poças POCA 1 09/2002 (4) -

Ilhéus ILH 2 07/2009 (10) (4)

Caravelas CARA 1 2001 (3) -

Caravelas CARA 2 07/2009 (8) (4) (29)

N. Almeida NVAL 1 2001 (2) -

N. Almeida NVAL 2 03/2009 (11) (4)

Atafona ATAF 2 09/2008 (10) (4) (32)

A. do Cabo ARRA 1 2001 (2) -

Ubatuba UBAT 1 2001 (2|2) (-|4)

Ubatuba UBAT 2 12/2009 (22|14) (4|4) (23)

Santos SANT 2 12/2008 (10) (4)

Cananéia CANA 2 06/2010 (10|4) (4|4) (29)

B. Velha BARR 2 07/2009 (1) (4)

B. Camboriú CAMB 2 2010 (11) (4) (32)

Total 145 52 145

24

3.2 ANÁLISE DE EPICS

3.2.1 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR

A) TRIAGEM DE MARCADORES EPIC-PCR PARA ESTUDOS

POPULACIONAIS DE XIPHOPENAEUS SPP.:

Foram testados em exemplares das duas espécies de Xiphopenaeus três pares

de iniciadores heterólogos, descritos na literatura para a amplificação de íntrons (EPIC-

PCR) de diferentes genes de espécies de camarões peneídeos. As sequências dos

primers utilizados e fonte bibliográfica estão listadas na tabela 3.2:

Tabela 3.2: Primers heterólogos de EPIC usados no trabalho. Primers Sequência do Primer (5’-3’) Fonte

Am2b2F

Am2b3R

5’-GGCGATAAGTTGTCTTACACC-3’;

5’-AGCCCTCTCCCCAGTTCCTGC-3’

Bierne et al., 2000

PmEf2-F

PmEf2-R

5’-GTCTTCGTGCAGGAGAAACTCG-3’;

5’-GAGGGCGAGGTTCTCGTCACTCCAGC-3’

Bierne et al., 2000

DecapANT-F

DecapANT-R

5’-CCTCTTGAYTTCGCKCGAAC-3’;

5’-TCATCATGCGCCTACGCAC-3’

Teske e Beheregaray, 2009

As reações de amplificação dos íntrons dos genes amilase e fator de

alongamento-2 foram feitas em um termociclador Veriti 96 Well termalcycler (Applyed

Biosystems) em um volume de 20 µL por reação contendo 2µL de tampão 10X

(Invitrogen), 0,5 µM de dNTP, 0,5 µM de cada primer, 2,5 µM de MgCl2, 1U de Taq

polimerase (Invitrogen), e 50 ng de DNA molde. As condições de ciclagem descritas por

Atarhouch et al., (2007) foram otimizadas para a análise das espécies brasileiras. Duas

temperaturas de pareamento dos primers foram testadas, 52 e 54°C. As ciclagens

consistiram de 3 minutos de desnaturação a 94ºC, 35 ciclos de 1 minuto de

25

desnaturação a 94ºC, 1 minuto de pareamento a 52/54ºC e 1 minuto de extensão e 20

segundos a 72ºC.

As reações de amplificação do íntron do gene adenina nucleotídeo translocase

foram conduzidas em um termociclador Veriti 96 Well termalcycler (Applyed

Biosystems) em um volume de 30 µL por reação contendo 3 µL de tampão 10X

(Biotools), 0,5 µM de dNTP, 0,5 µM de cada primer, 2,5 µM de MgCl2, 1U de Taq

polimerase (Biotools), e 50-100 ng de DNA molde. As condições de ciclagem descritas

por Teske e Beheregaray (2009) foram otimizadas para a análise das espécies

brasileiras. As ciclagens consistiram de 3 minutos de desnaturação a 94ºC, 35 ciclos de

30 segundos de desnaturação a 94ºC, 40 segundos de pareamento a 56ºC, 45

segundos de extensão a 72ºC e uma etapa final de extensão a 72ºC por 3 minutos.

Foram testadas temperaturas de pareamento de 50º a 55ºC.

3.2.2 ANÁLISE DE POLIMORFISMOS EPIC

Os produtos de amplificação foram analisados primeiramente em géis de

agarose 3%, para verificar o sucesso da amplificação. Em uma etapa subsequente, as

combinações de primers que produziram amplificações positivas para as duas

espécies foram testadas para diversos indivíduos para verificar a existência de

polimorfismos de tamanho. Os produtos de amplificação foram analisados por

eletroforese em géis de poliacrilamida 10% (150V; 3h), corado com nitrato de prata e

fotografado, ou, alternativamente, 8µL do produto de amplificação foram analisados no

equipamento Qiaxcel (QUIAGEN).

26

3.3 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE MITOCONDRIAL

COI

3.3.1 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR

Um fragmento de 677pb a 5’ do gene mitocondrial COI foi amplificado através da

reação em cadeia da polimerase (PCR), usando os iniciadores COIf [5’-CCTG

CAGGAGGAGGAGA(C/T)CC-3’] e COI0 [5’-TAAGCGTCTGGGTAGTCTGA(A/G)

TA(T/G)CG-3’] descritos por Palumbi e Benzie (1991) e Baldwin et al., (1998),

respectivamente, segundo as condições de amplificação e ciclagem descritas por

Gusmão e Solé-Cava (2002). Foram utilizados 50ng de DNA molde, 1 unidade de Taq

polimerase (Biotools), 200mM de cada dinucleotídeo, 1,5mM de MgCl2, 125mM de cada

oligonucleotídeo iniciador, em 2µL de tampão de PCR 1x (Biotools), em um volume total

de 50µl por reação. As amplificações foram conduzidas em um termociclador PTC-100

(MJ Research) programado para uma etapa de desnaturação a 94°C por 3 minutos

seguida de 40 ciclos com 1 minuto de desnaturação a 94°C, 1 minuto de pareamento a

51°C, 45 segundos de extensão a 72°C e uma etapa fi nal de 5 minutos de extensão a

72°C. Controles negativos com H 2O Milli Q no lugar do DNA molde foram incluídos em

todas as amplificações. Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de

agarose 1% corado com brometo de etídio ou Gel RedTM.

3.3.2 SEQUENCIAMENTO, EDIÇÃO E ALINHAMENTO DE

SEQUÊNCIAS

Cinquenta espécimes de Xiphopenaeus spp. foram sequenciados para

confirmação da identificação molecular por PCR-RFLP e utilização nas análises

populacionais de Xiphopenaeus spp. As reações de sequenciamento consistiram em

2µL de DNA molde (5-20 ng), 1,5µL de Tampão Applied Biosystems 5x, 1µL de BigDye

(Applied Biosystems) e água Milli-Q q.s.p para o volume final de 20µL.

27

As reações foram conduzidas em um termociclador Veriti Well 96 (Applied

Biosystems), utilizando a seguinte programação de ciclagem: 35 ciclos de 96°C por 15

segundos, 50°C por 10 segundos e 60°C por 4 minutos . O sequenciamento das duas

fitas de DNA foi realizado em sequenciador automático (ABI3130). As sequências foram

editadas e alinhadas no programa Bioedit (Hall, 1999). As sequências foram analisadas

em conjunto com as 74 de Piergiorge (2010) e 21 de Gusmão e colaboradores (2006),

totalizando 145 amostras. Os alinhamentos foram inspecionados visualmente e, para

confirmar a amplificação do produto correto e descartar a possível amplificação de

pseudogenes ou NUMTs (nuclear mitochondrial DNA; Lopez et al., 1994), foi feita a

tradução das sequências editadas na proteína correspondente usando o programa

Mega 5 (Tamura et al., 2011), não tendo sido observados códons de parada ou indels

nas sequências alinhadas.

28

3.3.3 ANÁLISES DE VARIABILIDADE GENÉTICA E FILOGENI A

MOLECULAR

A análise dos dados foi feita utilizando as 50 sequências parciais do gene

mitocondrial COI geradas neste trabalho em conjunto com nove haplótipos

representando outras 95 sequências de Xiphopenaeus spp. depositadas no GenBank,

com os seguintes códigos de acesso: DQ084367-DQ084380, AY135200.1 (Gusmão et

al., 2006; Maggioni, comunicação pessoal). Foram calculados os valores de diversidade

haplotípica (H), diversidade nucleotídica (π) e determinados os números de sequências

existentes em cada espécie (K) e o número de sítios polimórficos (S).

A composição nucleotídica para cada espécie foi calculada usando o programa

MEGA 5. As diversidades haplotípica e nucleotídica, bem como número de haplótipos e

sítios polimórficos foram calculados usando o programa DNASP 4.0 (Rozas, 2003).

A análise filogenética foi realizada usando o programa MEGA 5. Foi gerada uma

árvore de Neighbor Joining (Saitou e Nei, 1987) empregando o modelo de distância

Kimura-2 parâmetros (Kimura, 1980) e a consistência da topologia da árvore foi

verificada através do teste estatístico de Bootstrap (Felsenstein, 1985). Sequências de

Metapenaeus ensis (FJ435651) foram usadas como grupo externo. Também foram

calculadas as distâncias interespecíficas e intraespecíficas.

3.3.4 ANÁLISES POPULACIONAIS

As amostras de Xiphopenaeus sp. II não foram utilizadas nas análises

populacionais a seguir, devido ao reduzido número. Também foram excluídas as

localidades de Arraial do Cabo, Poças, Barra Velha e Natal das análises populacionais

de Xiphopenaeus sp. I, por conta do reduzido tamanho amostral.

O FST é um índice genético derivado da estatística F de Wright, também

conhecido como índice de fixação. O método utiliza a heterozigosidade como ponto de

partida para encontrar diferenças entre as subpopulações, através da variabilidade total

e a encontrada em cada subpopulação. Reduções na heterozigosidade devido à

29

estruturação podem ser quantificadas com o teste. O índice de fixação varia de 0 a 1,

sendo (0) ausência de estruturação populacional, valores intermediários apontam para

a presença de fluxo gênico e o valor (1) corresponde a populações completamente

diferenciadas. É o antecessor de vários outros testes de diferenciação populacional,

como AMOVA e RST.

A análise de Variância Molecular (AMOVA) é um método baseado em hipóteses

sobre diferenciação molecular, estimando estruturações a partir de dados moleculares.

O teste é uma variação da estatística F de Fisher, porém assumindo a existência

múltiplos grupos hierárquicos e utilizando informação molecular para inferir a

estruturação. A variação dos componentes pode ser utilizada para realizar uma

estatística análoga à estatística F, denominada Estatística (Φ) (Excoffier, et al., 1992;

Excoffier, 2001). Os valores da estatística (Φ) foram calculados através do programa

Arlequin e, posteriormente, realizada a correção de múltiplos testes de Bonferroni

(1936).

A análise de variância molecular (AMOVA) foi realizada segundo a hipótese de

separação de duas populações (Norte e Sul), devido a fatores físicos (ressurgência)

próximos à região de Cabo Frio (Rio de Janeiro). Geralmente as áreas de ressurgência

possuem grande riqueza de nutrientes, devido ao afloramento de águas mais profundas

(Moreira, 1971). Para testar se as condições abióticas nessa região funcionariam como

uma barreira para o fluxo gênico entre populações ao Norte e ao Sul de Cabo Frio,

diferentes cenários de agrupamentos foram testados por AMOVA (Tabela 3.3).

Através do programa SAMOVA 1.0 (Spatial Analysis of Molecular Variance –

Análise Espacial de Variância Molecular) (Dupanloup et al., 2002) foram criados grupos

hierárquicos a posteriori. O programa gera uma análise similar à AMOVA, porém, não é

necessário informar a priori os grupos a serem testados, apenas o número de grupos

que serão verificados e informar a coordenada geográfica das localidades.

O programa utiliza os dados de sequências e informações de coordenadas

geográficas dos pontos de coletas, retornando os valores de Φ e a significância

estatística. A análise é útil para reconhecer pontos que funcionam como barreiras ao

fluxo gênico, através das distâncias entre as localidades e da variação genética das

30

amostras. Com base nos resultados encontrados, a hipótese inicial foi refinada,

considerando subdivisões dentro dos dois grupos inicialmente propostos.

Com o intuito de testar a correlação entre distância geográfica e genética, foi

realizado o teste de Mantel (Mantel, 1967) no programa Arlequin 3.5. No programa

GenAlEx 6.5 (Peakall e Smouse, 2012) foi realizada a análise de componentes

principais (PCA).

Tabela 3.3: Agrupamentos populacionais construídos para a análise de variância molecular (AMOVA) de Xiphopenaeus sp.I. As cores e os parênteses representam as localidades.

3.3.5 DEMOGRAFIA HISTÓRICA

As sequências produzidas neste estudo, em conjunto com as disponíveis no

GenBank, foram usadas para construir duas redes de haplótipos, uma para cada

espécie, por meio do programa Network 4.6.1.0 (Fluxus Technology Ltd, 1999-2012).

Foram utilizados os algoritmos de Median Joining (Bandelt et al., 1999) e de parcimônia

e a consistência dos resultados foi testada através de variações no parâmetro epsilon

Agrupamentos testados Grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT) X (ATAF+NVAL+CARA+ILH+POCA+VENE) 2 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT) X (ATAF+NVAL+CARA+ILH+POCA) X (VENE) 3 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT) X (ATAF+NVAL+CARA+ILH) X (POCA) X

(VENE)

4 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT) X (ATAF+NVAL) X (CARA+ILH) X (POCA) X

(VENE)

5 grupos

(CAMB) X (CANA+SANT+UBAT) X (ATAF+NVAL) X (CARA+ILH) X (POCA) X

(VENE)

6 grupos

(CAMB) X (CANA+SANT) X (UBAT) X (ATAF+NVAL) X (CARA+ILH) X (POCA)

X (VENE)

7 grupos

31

(0-50), na taxa de transversão e transição (10:30), sendo atribuído peso ao caractere de

acordo com a posição no códon (20, 30 e 10 para 1ª, 2ª e 3ª, respectivamente). Uma

rede de parcimônia também foi construída com o programa TCS (Clement et al., 2000).

Os testes de neutralidade D de Tajima e F de Fu foram calculados usando o

programa Arlequin 3.5, seguindo os resultados de estruturação populacional

encontrados nos testes anteriores (FST, PCA, AMOVA e SAMOVA).

Os valores negativos e significativos encontrados para o D de Tajima (1989) e o

F de Fu (1995) são interpretados como desvios na taxa de evolução do marcador,

segundo a teoria neutra da evolução molecular. Essa teoria foi inicialmente proposta

por Kimura (1968) e considera uma população de tamanho finito na qual a diversidade

genética encontrada não influencia no sucesso reprodutivo da espécie. Além disso, a

quantidade de variação em uma população é mantida por meio de um equilíbrio

existente entre alelos novos que surgem por mutação e alelos que são perdidos devido

à deriva genética. Alterações na taxa de evolução neutra são indicativos de eventos

históricos como gargalos populacionais, expansões populacionais ou ação de seleção

natural, servindo como ferramentas para estudos demográficos.

O teste de Tajima é baseado no modelo de sítios infinitos sem recombinação. A

significância da estatística D é testada através de amostragens aleatórias, segundo a

hipótese de neutralidade seletiva e equilíbrio populacional, usando uma simulação de

coalescência adaptada partir Hudson (1990). Vale ressaltar que valores significativos

podem ser causados por outros fatores, como expansão populacional, bottleneck, ou

variação nas taxas mutacionais.

A estatística F é mais sensível na detecção de eventos de expansões

populacionais, que geralmente resultam em grandes valores negativos de F (Fu, 1997).

A significância estatistica é testada por meio de amostragens aleatórias, segundo a

hipótese de neutralidade seletiva e equilíbrio populacional, através de uma simulação

de coalecência adaptada a partir de Hudson (1990). O autor do teste observou que o

valor 5% só é válido para valores p< 0,02, pois 2% equivale ao valor de corte de 5%

nesta distribuição estatística.

Os grupos que apresentaram valores significativos nos testes de neutralidade

foram representados através do teste mismatch distribution e os resultados foram

32

utilizados para datar a expansão populacional, segundo os modelos de expansão

espacial e demográfica. O resultado foi plotado e a expansão foi calculada em anos (t),

segundo a seguinte fórmula: t = τ/2µ. O cálculo foi feito segundo a equação de Roger e

Harpending (1992), onde µ = 2µ0.k, µ0 é a taxa mutacional por sítio e por nucleotídeo e

k é o comprimento da sequência nucleotídica. Segundo Roger e Harpending (1992), por

meio da análise de mismatch distribution é possível compreender o passado das

populações, pois cada localidade apresenta uma curva característica de diferenças

nucleotídicas que reflete sua história demográfica. Foi utilizada a taxa mutacional de

1,4%/ Ma calculada para Alpheidae (Knowlton e Weigt, 1998).

O programa Mesquite versão 2.75 (Maddison e Maddison, 2011) foi utilizado

para calcular o coeficiente s de Slatkin e Maddison (1989), com o objetivo de testar

duas hipóteses para a origem das populações: origem gradual (considerando as

populações ao norte como mais antigas) e fragmentação (origem simultânea). Foi

utilizado um haplótipo de cada tipo por população evolutiva, com o intuito de reduzir a

variância da análise. Esse coeficiente representa o número de mudanças

parcimoniosas em uma linhagem.

Segundo os autores, o tamanho efetivo populacional afeta a significância do

teste, por conta disso, as duas hipóteses foram testadas variando o tempo de

coalescência (10.000, 100.000, 1.000.000, 3.000.000 e 6.000.000 gerações) e o

tamanho efetivo populacional (1.000, 10.000, 100.000 e 1.000.000). Utilizou-se uma

árvore de NJ como partida para a análise (Figura 3.3) e duas representando as

hipóteses (Figura 3.4). Foram consideradas cinco populações estruturadas: Venezuela;

Poças/BA; Nordeste (Ilhéus/BA e Caravelas/BA), Sudeste (Nova Almeida/ES e

Atafona/RJ) e Sudeste/Sul (Ubatuba/SP, Santos/SP, Cananéia/SP e Balneário

Camboriú/SC).

33

Figura 3.3: Árvore de NJ de partida evidenciando o relacionamento dos haplótipos de COI. Em detalhe está o valor de s calculado para o conjunto de dados (s = 14). Legenda: BA (Poças), CA (Caravelas), NA (Nova Almeida), AT (Atafona), CB (Camboriu), VEN (Venezuela), SP (Ubatuba) e UB (Ubatuba).

34

Figura 3.4: As duas hipóteses testadas para origem populacional através do s de

Slatkin e Maddison. A) Hipótese de formação gradual das populações, no sentido

Norte-Sul; B) Origem simultânea.

A

B

35

3.4 ANÁLISE DE LOCI MICROSSATÉLITES

3.4.1 AJUSTES PARA AMPLIFICAÇÃO PELA PCR

Para as análises de microssatélites foram selecionadas cinco localidades do

banco de DNA: Caravelas (–17°44’S –39°15’W; BA), At afona (–21°37'S –41°0'W; RJ),

Ubatuba (–23°26’S –45°04’W; SP), Cananéia (–25°02'S –47°55'W; SP) e Balneário

Camboriú (–26º59'07''S –48º35'58”W; SC). Foi adotada a metodologia de Schuelke

(2000). Esse protocolo consiste na utilização de um iniciador universal marcado com um

fluoróforo, denominado M13 (5’-ACATTTTGCTGCCGGTCA-3’), complementar a uma

sequência de 18pb (5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’), acrescida à porção 5’ dos

primers forward. Foram usados quatro espécimes de três populações (Caravelas,

Atafona e Camboriú) para cada espécie e marcador, objetivando testar as melhores

condições de amplificação para cada marcador. Para as amostras de Xiphopenaeus sp.

II foram utilizadas apenas a localidades de Ubatuba e Cananéia. Foram testados os

seguintes loci da literatura : Xkro10 – Xkro14; Rcon6 – Rcon7; Lvan6 – Lvan10 (Tabela

3.4).

A amplificação das reações de PCR foi realizada em um termociclador Veriti

(Applied Biosystems), em 10 µl, utilizando 20ng de DNA, 0.04 µM de iniciador F e 0.16

µM de iniciadores R e M13, 0,15µM de dNTP, e tampão de reação 1x, em um volume

final de 10µl. As condições de ciclagem foram feitas segundo Francisco et al., (2009),

variando apenas a temperatura de pareamento dos primers. Foram testados gradientes

de temperaturas de 49°C – 58°C, duas concentrações de MgCl2 (1,5mM e 2,5mM),

duas concentrações de Taq polimerase (1U e 0,5U) e quatro fluorocromos para cada

loco (6-FAM, NED, PET e VIC).

36

Tabela 3.4. Primers de microssatélites usados no trabalho; primers específicos para Xiphopenaeus kroyeri (Xkro) e heterólogos (Rcon, Lvan) que resultam em amplificações positivas em X. kroyeri em testes de amplificação cruzada. Em todas as reações foi utilizado 1,5mM de MgCl2. Temperatura de anelamento (Ta).

Locus/ nº GenBank Sequência do Primer (5’-3’) Motif Ta Fonte

Xkro10/EU559719 F: GTGTTGAGACGAAACATGG

R: CGACCTAGAGAATGTAGGCA

(TC)8 55.6 Francisco et al., 2009

Xkro11/EU559720 F: CGATAGCATCTACCTCTTCC

R: ACAGAGGGTATTTCACTTCATC

(CTTCCT)9 55.6 Francisco et al., 2009

Xkro13/EU559722 F: CACGCTCATATACACTCACA

R: GAACTGCAGGTGGTGAAGTC

(CA)6 55 Francisco et al., 2009

Xkro14/ - F: GAATGATTGCCTGGATTAAG

R: ACTCCGTATCAAGTCG

(GATT)4 49 Francisco, 2009

Rcon06/EU59716 F: GTTGCTTATTGCTGAACC

R: GACAACGCCGACTATAAC

(GTT)12 57,8 Francisco et al., 2009

Rcon07/EU59717 F: AATAGGATTCGGATACGC

R: AGCAAAAAGTCTGCGTTC

(GTTT)5 48,1 Francisco et al., 2009

Lvan06/DQ988334 F: TAGATCCGTTTAAGTCACA

R: GTATAATGTCGAATGCTCAC

(TATC)2 … (TGTC)3

…(TGTC)3

53 Freitas et al., 2007

Lvan08 /DQ988336 F: CTTCACAGAGGTTGGATAG

R: CGATAAGGAAACTGACATTG

(AGC)8 53 Freitas et al., 2007

Lvan09 /DQ988337 F: ATCTCGATAAGGAAACTGAC

R: GACAGGTTTGTCTTCACAG

(TGC)9 51 Freitas et al., 2007

Lvan10 /DQ988335 F: ATAAGAAGGTCGTTTCTCTC

R: AATACGACTCAACTATAGGG

(A)4(AG)6(AAAG)3(A)6 53 Freitas et al., 2007

37

3.4.2 GENOTIPAGENS E ANÁLISE DE POLIMORFISMOS

Após os testes iniciais de padronização, cinco loci produziram amplificações

satisfatórias em Xiphopenaeus spp.. Os produtos de amplificação de 145 indivíduos de

cinco populações foram genotipados para verificar a presença de polimorfismos. Os

produtos de amplificação marcados com fluorescência foram analisados no

sequenciador automático ABI3130 da Plataforma Genômica Multiusuária do IBRAG-

UERJ. As reações de genotipagem consistiram em: 8,75 µL de formamida Hi-di, 1 µL de

produto de amplificação e 0,25 µL do marcador de peso molecular Lis500. As análises

de fragmentos e a caracterização alélica foram feitas usando o programa Peak Scanner

versão 1.0 (Applied Biosystems).

3.4.3 ANÁLISES POPULACIONAIS

As análises populacionais de microssatélites foram feitas usando três dos cinco

loci selecionados na etapa anterior e um total de 113 indivíduos de quatro populações:

Caravelas/BA, Atafona/RJ, Ubatuba/SP e Cananéia/SP.

Com o intuito de testar se os alelos dos loci estudados apresentam desequilíbrio

de ligação, foi utilizado o programa Arlequin 3.5, com correção sequencial de

Bonferroni. O desequilíbrio de ligação é a associação não aleatória de alelos de dois ou

mais loci, que apresentam frequência maior ou menor, do que seria esperado com a

segregação aleatória dos alelos. A quantidade de desequilíbrio de ligação depende da

diferença entre as frequências alélicas observadas e esperadas (Silva, 2001).

A análise dos dados de genética populacional básica foi feita com os programas

Arlequin 3.5, GenAlEx 6.5 e Msa 1.0 (Dieringer e Schlötterer, 2003). No GenAlEx 6.5 foi

estimada a identidade genética de Nei. O nível de diferenciação entre as populações foi

estimado a partir do índice de endocruzamento (FIS). Através do programa Arlequin 3.5

foi estimado o índice RST, análago ao FST, proposto por Slatkin (1995) para análise de

microssatélites, com correção de Bonferroni. A comparação das populações nos

diversos pontos de coleta e a estimativa do nível de heterogeneidade populacional para

38

cada espécie foram feitas por análise molecular de variância (Tabela 3.5) (AMOVA;

Excoffier, 1994).

Tabela 3.5: Agrupamentos testados para a análise de variância molecular (AMOVA).

Código Agrupamentos testados Grupos

1 (CARA+ATAF) x (UBAT+CANA) 2 grupos

2 (CARA+ATAF+UBAT) X (CANA) 2 grupos

3 (CARA) x (ATAF) x (UBAT+CANA) 3 grupos

39

4. RESULTADOS

4.1 ANÁLISE DE EPICS

4.1.1 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR

As duas espécies apresentaram amplificações positivas para íntrons dos genes

amilase e fator de alongamento-2 (FA), utilizando uma temperatura de pareamento de

52°C. Entretanto, apenas Xiphopenaeus sp. I teve o íntron de FA amplificado com

sucesso, na temperatura de pareamento de 54°C. Util izando a temperatura de

pareamento 55° C foram obtidas amplificações positi vas para as duas espécies com o

gene ANT. Dos três pares de iniciadores testados, apenas, amilase (AMY), fator de

alongamento – (FA) e adenina nucleotídeo translocase (ANT), resultaram em

amplificações positivas e os demais produziram resultados negativos (Tabela 4.1).

Tabela 4.1: Resumo dos resultados obtidos nas padronizações para ampli ficação dos íntrons de Amilase e Fator de alongamento.

4.1.2 ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE TAMANHO

Após os testes iniciais os primers que resultaram em amplificações positivas

foram usados em uma análise preliminar de polimorfismos. Foram analisados 4

espécimes de 9 populações para o íntron FA, 4 espécimes de 8 populações para o

+ + - + X. kroyeri sp. II

+ + + + X. kroyeri sp. I

F. A. Amilase F. A. Amilase

Programa 2 (52°C) Programa 1 (54°C)

PCR

(+) Amplificação Positiva; ( -) Amplificação Negativa

40

íntron AMY e 3 espécimes de 9 populações para ANT. Apesar de ter resultado em

amplificações positivas para as duas espécies, os íntrons de ANT, FA e AMY não

apresentaram polimorfismos de tamanho, sendo monomórficos entre todos os

espécimes analisados para as duas espécies.

4.3 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE MITOCONDRIAL

COI

4.3.1 ANÁLISES DE VARIABILIDADE GENÉTICA

Foram analisadas 117 sequências de espécimes de Xiphopenaeus sp. I e 28 de

Xiphopenaeus sp. II. As sequências de COI obtidas confirmaram resultados anteriores

de identificação baseados em PCR-RFLP. A distância genética (p-distance) foi de 12%

entre espécimes das duas espécies do Atlântico, 0,7% para variação intraespecífica de

Xiphopenaeus sp. I e de 0,2% para Xiphopenaeus sp. II.

Oito novos haplótipos foram observados em oito espécimes, que mostraram

variação em um único sítio, das localidades de Ubatuba/SP, Caravelas/BA e

Camboriú/SC, totalizando quinze haplótipos identificados para Xiphopenaeus sp. I.

Cinco novos haplótipos foram identificados para Xiphopenaeus sp. II nas localidades de

Natal, Ubatuba e Cananéia (Tabela 4.2). O haplótipo mais frequente para

Xiphopenaeus sp. I corresponde ao designado como "A" no trabalho de Gusmão et al.,

(2006), ocorrendo em 84,2% dos espécimes estudados e, em Xiphopenaeus sp. II foi o

haplótipo denominado "H" pelos mesmos autores citados anteriormente (94,12%). Os

haplótipos "A" e “H” foram encontrados em todas as localidades estudadas.

Treze sítios variáveis (S) foram observados para Xiphopenaeus sp. I, enquanto

foram observados apenas nove para Xiphopenaeus sp. II. Os valores de diversidade

haplotípica (H) para Xiphopenaeus sp. I variaram de 0 (Santos / SP) a 0,714 (Ilhéus /

BA) e a diversidade haplotípica de todas as localidades foi 0,517; o valor de H para

Xiphopenaeus sp. II variou de 0 a 0,5 (Cananéia e Ubatuba / SP; Natal/RN) e a total foi

0,118. A diversidade nucleotídica (π) para Xiphopenaeus sp. I variou de 0 a 0,002

41

(Santos / SP e Ilhéus / BA) e (π) total 0,001 (Tabela 4.3) para Xiphopenaeus sp. II o

valor de (π) e (π) total foi 0,0001 (Tabela 4.4). A distância (p-distance) dentro de cada

espécie foi 0,3% para Xiphopenaeus sp. I e Xiphopenaeus sp. II. As variações entre os

grupos foram: 10% entre Xiphopenaeus sp.III e Xiphopenaeus sp. II, 11 % entre

Xiphopenaeus sp.III e Xiphopenaeus sp. I e 12% entre Xiphopenaeus sp. I e

Xiphopenaeus sp. II.

42

Tabela 4.2: Distribuição dos haplótipos por localidade nas duas espécies de Xiphopenaeus. A-J) Haplótipos identificados

por Gusmão e colaboradores (2006); 1.1–1.8) Haplótipos de Xiphopenaeus sp. I identificados neste trabalho; 2.1-2.5)

Haplótipos de Xiphopenaeus sp. II identificados neste trabalho.

Haplótipos encontrados por localidade Xiphopenaeus sp. I Xiphopenaeus sp. II

Localidade A B C D E F G 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 H I J 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 Venezuela X X X X

Natal X X X X X X X Poças X X X X Ilhéus X X X X X

Caravelas X X X X X X X X N. Almeida X X X X X X

Atafona X X X X Arraial X

Ubatuba X X X X X X X X Santos X

Cananéia X X X B. Velha X

Camboriú X X X X

43

Tabela 4.3: Medidas de diversidade genética de populações de Xiphopenaeus sp. I.

População N H π Nh S

Venezuela 7 0,5238 0,0014 3 2

Poças 4 0,5000 0,0028 2 3

Ilhéus 10 0,6000 0,0029 3 4

Caravelas 14 0,6813 0,0026 6 6

Nova Almeida 13 0,3376 0,0020 4 5

Atafona 10 0,5111 0,0017 3 4

Ubatuba 22 0,3376 0,0006 5 4

Santos 10 0,0000 0,0000 1 0

Cananéia 10 0,0000 0,0000 1 0

Balneário Camboriú 11 0,4909 0,0013 4 4

N – Número de indivíduos; H – Diversidade haplotípica; π - Diversidade nucleotídica; Nh - Número de haplótipos; S - Número de sítios polimórficos.

Tabela 4.4: Medidas de diversidade genética de populações de Xiphopenaeus sp. II.

População N H π Nh S

Natal 8 0,786 0,0022 5 5

Ubatuba 16 0,205 0,0005 3 3

Cananéia 4 0,500 0,0009 2 1

As redes de haplótipos estão representadas na Figura 4.1. A distribuição dos

haplótipos das duas espécies resultou em duas redes em forma de estrela, indicando

expansão populacional em ambas as espécies. Além do haplótipo central, três outros

haplótipos foram compartilhados entre indivíduos em Xiphopenaeus sp. I. No entanto,

nenhum haplótipo além do central foi compartilhado entre espécimes e localidades para

Xiphopenaeus sp. II. Com todas as variações testadas as redes das duas espécies

apresentaram uma única topologia, o que sustenta a confiabilidade nos resultados.

44

Apesar da observação de novos haplótipos o sistema de identificação molecular

proposto por Gusmão e Solé-Cava (2002) continua válido, com os haplótipos novos

agrupando com as sequências já descritas das duas respectivas espécies (Figura 4.2).

45

Figura 4.1: Redes de haplótipos de sequências do gene COI geradas através do programa Network para (A) Xiphopenaeus sp. I e (B) Xiphopenaeus sp. II. O tamanho do círculo é proporcional a frequência do haplótipo e as cores representam cada localidade. Cada linha corresponde a um único passo mutacional, exceto as duas maiores em Xiphopenaeus sp. II que correspondem a dois passos mutacionais. (*) Localidades estudadas por Maggioni (Maggioni, comunicação pessoal).

B A

46

Figura 4.2: Árvore de Neighbor Joining de Xiphopenaeus spp. baseada em distâncias Kimura 2-parâmetros; Valores abaixo dos ramos: teste estatístico de bootstrap (valores > 70).

Xiphopenaeus sp. I Xiphopenaeus riveti

(sp. III)

Xiphopenaeus sp. II

X . k ro y e r i _ C a n a n e ia _ 0 9

X . k ro y e r i_ V e n e z u e la _ 0 1

X . k ro y e r i _ C a m b o r i u _ 4 2

X . k ro y e r i _ N o va _ A lm e id a _ 2 9

X . k ro y e r i _ A r ra ia l _ 1 6

X . k ro y e r i _ S a n t o s _ 0 7

X . k ro y e r i _ B a r ra _ V e lh a _ 1 0

X . k ro y e r i_ U b a t u b a _ 6 2

X . k ro y e r i _ P o c a s _ 0 2

X . k ro y e r i _ C a r a ve la s _ 0 3

X . k ro y e r i _ Il h e u s _ 2 6

X . k ro y e r i_ U b a t u b a _ 2 3

X . k ro y e r i _ C a r a ve la s _ 0 4

X . k ro y e r i _ U b a t u b a _ 2 1

X . k ro y e r i _ A t a fo n a _ 2 4

X . k ro y e r i _ V e n e z u e la _ 0 6

X . k ro y e r i_ N o va _ A lm e id a _ 3 0

X . k ro y e r i_ C a ra ve la s _ 0 8

X . k ro y e r i_ C a m b o r i u _ 1 1

X . k ro y e r i_ C a ra ve la s _ 0 9

X . k ro y e r i _ U b a t u b a _ 4 6

X . k ro y e r i _ N o va _ A lm e id a _ 2 8

X . k ro y e r i _ V e n e z u e la _ 0 3

X . k ro y e r i _ N o va _ A lm e id a _ 2 1

X . k ro y e r i _ A t a fo n a _ 0 5

X . k ro y e r i _ U b a t u b a _ 1 5

X . k ro y e r i _ C a ra ve la s _ 1 7

X . k ro y e r i _ Il h e u s _ 0 9

X . k ro y e r i _ C a m b o r i u _ 3 3

X . k ro y e r i _ C a r a ve la s _ 0 1

X . k r o y e r i _ C a m b o r i u _ 3 0

X . k ro y e r i_ P o c a s _ 0 1

X . k ro y e r i_ Il h e u s _ 2 0

X . k ro y e r i_ N o va _ A lm e id a _ 1 5

X . k ro y e r i_ A t a fo n a _ 3 5

X ip h o p e n a e u s s p . I

X . r i ve t i P a n a m a 1

X . r i ve t i P a n a m a 2

X . r i ve t i P a n a m a 3

X . r i ve t i P a n a m a 4

X ip h o p e n a e u s r iv e t i

X . k ro y e r i _ U b a t u b a _ 6 0

X . k ro y e r i_ N a t a l_ 2 1

X . k ro y e r i _ C a n a n e ia _ 1 6

X . k ro y e r i _ N a t a l_ 0 4

X . k ro y e r i _ U b a t u b a _ 1 0 8

X . k ro y e r i _ C a n a n e ia _ 0 1

X . k ro y e r i _ N a t a l_ 0 8

X . k ro y e r i _ U b a t u b a _ 1 2 2

X . k ro y e r i _ N a t a l_ 0 3

X . k ro y e r i _ N a t a l_ 0 1

X ip h o p e n a e u s s p . I I

M e t a p e n a e u s _ e n s is

1 0 0

1 0 0

9 3

1 0 0

0 . 0 2

47

4.3.2 ANÁLISES POPULACIONAIS

Nas análises de estruturação populacional de Xiphopenaeus sp. I, as

estimativas de ΦST resultaram apenas em valores significativamente diferentes de

zero nas comparações entre Venezuela e as demais localidades (P<0,0011) e entre

Poças-Ubatuba, Poças-Santos e Poças-Cananéia (Tabela 4.5). Esse resultado

indica homogeneidade populacional de Xiphopenaeus sp. I abaixo de Poças/BA,

provavelmente por conta de elevado fluxo gênico.

Já nas análises de variância, a maior variação foi encontrada dentro das

populações. Segundo o modelo de dois grupos, tanto para a AMOVA quanto

SAMOVA, não existem diferenças significativas entre os grupos. No entanto, exceto

pelo agrupamento com cinco grupos, os demais agrupamentos foram significativos

para a AMOVA (Tabela 4.6), enquanto apenas mais de quatro grupos foram

significativos para a SAMOVA (Tabela 4.7 e Tabela 4.8). Esses resultados

corroboram a divisão populacional barreira biogeográfica, acima e abaixo da

ressurgência.

Tabela 4.5: Valores de estruturação genética das populações de Xiphopenaeus sp. I (ΦST). Em negrito estão representados os valores significativos após a correção de múltiplos testes (** - P <0,0011). Acima da diagonal estão os valores de migrantes calculados a partir de ΦST.

Localidades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1- VENE 0.249 1.006 1.189 1.067 1.006 0.467 0.309 0.309 0.775

2- POCA 0.667** 2.308 0.983 0.457 0.488 0.156 0.115 0.115 0.350

3- ILH 0.332** 0.178 ∞ 7.833 249.5 1.627 2.000 2.000 5.993

4- CARA 0.296** 0.337 0.000 30.75 ∞ 4.550 7.564 7.564 124.5

5- NVAL 0.319** 0.522 0.060 0.016 ∞ 5.181 4.819 4.819 9.916

6- ATAF 0.332** 0.506 0.002 0.000 0.000 13.01 10.86 10.86 ∞

7- UBAT 0.517** 0.762** 0.235 0.099 0.088 0.037 ∞ ∞ 28.91

8- SANT 0.618** 0.812** 0.200 0.062 0.094 0.044 0.000 ∞ ∞

9- CANA 0.618** 0.812** 0.200 0.062 0.094 0.044 0.000 0.000 ∞

10- CAMB 0.392** 0.588 0.077 0.004 0.048 0.000 0.017 0.000 0.000

48

Tabela 4.6: Valores da estatística Φ encontrados para os seis agrupamentos populacionais testados a priori (AMOVA) para a espécie Xiphopenaeus sp. I.

Hipótese: 2 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.03272 6.54 NS ΦCT = 0.06536

Entre populações dentro das regiões

0.08010 16.00 ** ΦSC = 0.17121

Dentro das populações 0.38778 77.46 *** ΦST = 0.22537 Hipótese: 3 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ

Entre regiões 0.09011 17.34 * ΦCT = 0.17340 Entre populações dentro

das regiões 0.04178 8.04 NS ΦSC = 0.09726

Dentro das populações 0.38778 74.62 *** ΦST = 0.25380 Hipótese: 4 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ

Entre regiões 0.15446 28.70 *** ΦCT = 0.28703 Entre populações dentro

das regiões -0.00411 -0.76 NS ΦSC = -0.01072

Dentro das populações 0.38778 72.06 *** ΦST = 0.27938 Hipótese: 5 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ

Entre regiões -0.03300 -6.71 NS ΦCT =-0.06706 Entre populações dentro

das regiões 0.31051 63.10 *** ΦSC =0.59134

Dentro das populações 0.21458 43.61 *** ΦST =0.56394 Hipótese: 6 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ

Entre regiões 0.14192 27.88 *** ΦCT = 0.27885 Entre populações dentro

das regiões - 0.02189 -4.30 NS ΦSC = -0.05964

Dentro das populações 0.38893 76.42 *** ΦST = 0.23584 Hipótese: 7 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ

Entre regiões 0.13096 26.36 *** ΦCT = 0.26364 Entre populações dentro

das regiões -0.02314 -4.66 NS ΦSC = 0.26364

Dentro das populações 0.38893 78.30 *** ΦST = 0.21705 NS – Não significativo * - P < 0,05 ** - P < 0,001 *** - P < 0,0001

49

Tabela 4.7: Agrupamentos obtidos a posteriori para a espécie Xiphopenaeus sp. I, por meio da análise espacial de variância molecular (SAMOVA).

Agrupamentos testados Grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT+ATAF+NVAL+CARA+ILH+VENE) x (POCA) 2 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT+ATAF+NVAL+CARA+ILH) X (VENE) x (POCA)

3 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT+VENE+ATAF+NVAL) X (CARA) X (ILH) X (POCA)

4 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT+ATAF+NVAL) X (CARA) X (ILH) X (POCA) x (VENE)

5 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT+ATAF) X (NVAL) X (CARA) X (ILH) X (POCA) x (VENE)

6 grupos

(CAMB+CANA+SANT+UBAT) X (ATAF) X (NVAL) X (CARA) X (ILH) X (POCA) x (VENE)

7 grupos

(CANA+SANT) X (CAMB) X (UBAT) X (ATAF+NVAL) X (CARA) X (ILH) X (POCA) x (VENE)

8 grupos

(CANA+SANT) X (CAMB) X (UBAT) X (ATAF) X (NVAL) X (CARA) X (ILH) X (POCA) x (VENE)

9 grupos

50

Tabela 4.8: Valores da estatística Φ, provenientes de oito agrupamentos populacionais obtidos a posteriori (SAMOVA) para a espécie Xiphopenaeus sp. I.

Hipótese: 2 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.60448 57.94 NS ΦCT = 0.57938

Entre populações dentro das regiões

0.05105 4.89 *** ΦSC = 0.11633

Dentro das populações

0.38778 37.17 *** ΦST = 0.62832

Hipótese: 3 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.38203 48.41 NS ΦCT = 0.48406

Entre populações dentro das regiões

0.01941 2.46 *** ΦSC = 0.04767

Dentro das populaces 0.38778 49.13 *** ΦST = 0.50865 Hipótese: 4 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ

Entre regiões 0.12507 22.63 NS ΦCT = 0.22633 Entre populações dentro das regiões

0.03976 7.19 *** ΦSC = 0.09299

Dentro das populações

0.38778 70.17 *** ΦST = 0.29828

Hipótese: 5 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.17832 31.65 ** ΦCT = 0.31652

Entre populações dentro das regiões

-0.00272 -0.48 ** ΦSC = -0.00706

Dentro das populações

0.38778 68.83 *** ΦST = 0.31170

Hipótese: 6 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.15639 29.49 * ΦCT = 0.29487

Entre populações dentro das regiões

-0.01379 -2.60 *** ΦSC = -0.03688

Dentro das populações

0.38778 73.11 *** ΦST = 0.26886

Hipótese: 7 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.14575 28.40 * ΦCT = 0.05534

Entre populações dentro das regiões

-0.02033 -3.96 NS ΦSC = 0.24438

Dentro das populações

0.38778 75.56 *** ΦST = 0.28400

Hipótese: 8 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.13565 27.57 *** ΦCT = 0.27565

Entre populações dentro das regiões

-0.03133 -6.37 *** ΦSC = -0.08790

Dentro das populações

0.38778 78.80 *** ΦST = 0.21198

Hipótese: 9 grupos Variância % total p-valor Estatística Φ Entre regiões 0.13993 28.62 *** ΦCT = 0.28620

Entre populações dentro das regiões

-0.03878 -7.93 NS ΦSC = -0.11111

Dentro das populações

0.38778 79.31 NS ΦST = 0.20688

NS – Não significativo * - P < 0,05 ** - P < 0,001 *** - P < 0,0001

51

Nos resultados da análise de componentes principais (PCA), ao analisar

todas as localidades, foram encontrados três grupos, Poças, Venezuela e as demais

localidades. No entanto, foi observada uma leve diferenciação das localidades

Atafona e Nova Almeida, em relação às demais. Ao repetir a análise, porém

removendo Poças e Venezuela, em função da grande distância genética entre as

demais localidades, foram encontrados três agrupamentos: Caravelas + Ilhéus;

Atafona + Nova Almeida; Ubatuba + Santos + Cananéia + Balneário Camboriú

(Figura 4.3). Esse resultado corrobora a hipótese de divisão populacional por meio

da região biogeográfica de Cabo Frio.

Em relação à análise espacial (Mantel), foi verificado ao nível de significância

de 5%, que as populações não estão estruturadas segundo o modelo de isolamento

por distância. Isso significa que as distâncias geográficas existentes entre as

localidades não estão positivamente correlacionadas com as distâncias genéticas

entre populações.

52

Figura 4.3: Gráfico com os resultados da PCA para Xiphopenaeus sp. I: análise com todas as localidades (esquerda) e após a remoção de Poças e Venezuela (direita). Legenda: pop 1 (POCA: Poças); pop 2 (NVAL: Nova Almeida); pop 3 (UBAT: Ubatuba); pop 4 (VENE: Venezuela); pop 5 (CARA: Caravelas); pop 6 (CAMB: Camboriú); pop 7 (SANT: Santos); pop 8 (ILH: Ilhéus); pop 9 (ATAF: Atafona); pop 10 (CANA: Cananéia).

4.3.3 DEMOGRAFIA HISTÓRICA

Com base nos resultados populacionais obtidos, foram construídas duas

hipóteses para os testes de neutralidade (Tabela 4.9). Ambas as análises resultaram

em valores negativos e significativos, indicativo de expansão populacional.

Principal Coordinates

Pop 10

Pop 9Pop 8

Pop 7Pop 6

Pop 5

Pop 4

Pop 3Pop 2

Pop 1

Coord. 1

Co

ord

. 2

Série1

Principal Coordinates

Pop 10

Pop 9

Pop 8Pop 7

Pop 6Pop 5

Pop 3

Pop 2

Coord. 1

Co

ord

. 2

Série1

NVAL+ATAF

53

Segundo a hipótese de três grupos, foram encontrados valores negativos e

significativos para F de Fu (-9,71) e D de Tajima (-1,75) para o maior agrupamento

(todas as localidades, exceto Poças e Venezuela), indicativo de expansão

populacional (Tabela 4.7). Na hipótese de seis grupos, foram observados valores

significativos e negativos para F de Fu (-8,98) e D de Tajima (-2,24), também

indicando expansão para o grupo abaixo da região de ressurgência (Ubatuba +

Camboriú + Cananéia + Santos). Com esses resultados, foi realizada a mismatch

distribution apenas para os grupos significativos para os testes de neutralidades.

54

Tabela 4.9: Testes de neutralidade com os dois agrupamentos testados: três gupos e seis grupos. Nível de significância p=0,05 para D de Tajima e 0,02 para o F de Fu; (*) e (**): Valores significativos.

N° Grupos Agrupamentos D de Tajima F de Fu

3 Grupos

VENE -0.27 -0.44

POCA -0.75 1.72

ILH + CARA + ATAF + NVAL + UBAT + SANT +

CANA + CAMB

-1.75* -9.71**

6 Grupos

VENE -0.27 -0.44

POCA -0.75 1.72

ILH 0.51 1.45

CARA -0.89 -1.92

NVAL + ATAF -0.79 0.11

UBAT + CAMB + CANA+SANT

-2.24* -8.98**

Os resultados da análise da distribuição de diferenças entre pares de

sequências (mismatch distribution) foram plotados em gráficos (Figura 4.4). A

distribuição unimodal encontrada na hipótese de seis populações indica que

expansões (demográfica e geográfica) ocorreram na população do Sul do Brasil

(Ubatuba, Santos, Cananéia e Balneário Camboriú), e que a significância do

agrupamento de três populações está provavelmente relacionada com Ubatuba e

Balneário Camboriú, as únicas populações significativas para os testes de

neutralidade. Os valores de θ0 e θ1 foram 0,00000 e 0,33848, respectivamente. Por

meio desses resultados foram calculados os tempos decorridos desde a expansão

(Tabela 4.10), que coincidem com o período da última glaciação (110-10 mil anos)

(Lee et al., 2006).

O valor obtido de s, a partir da árvore de relacionamento dos haplótipos (NJ),

foi comparado com os valores estatísticos das hipóteses. A hipótese de formação

gradual das populações foi significativa para os períodos de 10.000 e 100.000 anos

(Tabela 4.11). Esses resultados corroboram os dados obtidos através da mismatch

55

distribution, em que foram verificadas expansões para os períodos de 10.000 e

100.000 anos. Os dados indicam que a hipótese Norte-Sul foi a melhor entre as

testadas. Contudo, os testes s de Slatkin e Maddison para 10.000 anos (Ne =

100.000) e 100.000 (Ne = 1.000.000) para a hipótese de fragmentação resultaram

em valores limítrofes (borderline) ao nível de 5%.

Figura 4.4: Mismatch distribution para os grupos significativos para o teste de neutralidade de Xiphopenaeus sp. I, segundo o modelo de expansão demográfica e geográfica. A) (1-2) Valores significativos no teste de neutralidade para a hipótese de seis grupos; B) (1-2) agrupamento significativo segundo a hipótese de 3 grupos.

Tabela 4.10: Tempo estimado de expansão, segundo os modelos de expansão demográfica e geográfica para a hipótese de seis grupos.

Expansão Populacional

Tau K µ 0 µ Tempo Estimado

Geográfica 0.33 538 bp 1,4% Ma 3,0128x10-5 10,95 mil anos

Demográfica 3.00 538 bp 1,4% Ma 3,0128x10-5 99,57 mil anos

Spatial expansion model

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4

Number of differences between haplotypes

Fre

quen

cy

ObservedDistribution

ExpectedDistribution

Sudden expansion model

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4

Number of differences between haplotypes

Fre

quen

cy ObservedDistribution

ExpectedDistribution

Spatial expansion model

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 1 2 3 4 5

Number of differences between haplotypes

Fre

quen

cy ObservedDistribution

ExpectedDistribution

Sudden expansion model

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1 2 3 4 5

Number of differences between haplotypes

Fre

quen

cy ObservedDistribution

ExpectedDistribution

A.1 A.2

B.1 B.2

56

Tabela 4.11: Valores significativos para as hipóteses testadas para o s Slatkin e Maddison (1989). Ne – Tamanho efetivo populacional; Hipóteses: [1] – origem gradual e [2] fragmentação.

Anos Ne Hipótese Significância

10.000 100.000 1 *

10.000 1.000.000 1 *

100.000 1.000.000 1 *

10.000 100.000 2 NS

100.000 1.000.000 2 NS

NS – Não significativo * - P < 0,05

57

4.4 ANÁLISE DE LOCI MICROSSATÉLITES

4.4.1 AJUSTES PARA AMPLIFICAÇÃO PELA PCR

Foram usados quatro espécimes de três populações para cada espécie e

marcador, objetivando testar as melhores condições de amplificação. Após os testes

iniciais, os primers que não funcionaram foram Rcon7, para Xiphopenaeus sp. I e

Xiphopenaeus sp. II, e Xkro14, para Xiphopenaeus sp. II. Os primers desenvolvidos

para Litopenaeus vannamei (Lvan) ainda não foram testados em Xiphopenaeus sp.

II e não resultaram em amplificações em Xiphopenaeus sp. I.

As reações de PCR foram realizadas em um termociclador Veriti (Applied

Biosystems), em 10 µL e as melhores amplificações foram obtidas através das

seguintes condições: 20 ng de DNA molde; 0,04 µM de iniciador F; 0,16 µM de

iniciadores R e M13; 2,5mM MgCl2; 0,15 µM de dNTP; 0,5 U de GoTaq polimerase;

tampão de reação 1x. As condições de ciclagem foram feitas segundo Francisco e

colaboradores (2009), variando apenas a temperatura de pareamento dos primers.

As temperaturas de amplificação ajustadas estão representadas na Tabela 4.12.

58

Tabela 4.12: Ajustes de amplificação dos dez loci de microssatélites selecionados para as duas espécies. (-): amplificações negativas; (*) loci ainda não testados.

Locus Xiphopenaeus sp. I Xiphopenaeus sp. II

Xkro10 55.6°C 55.6°C

Xkro11 55.6°C 56°C

Xkro13 57°C 56°C

Xkro14 49°C -

Rcon06 57.8°C 57.8°C

Rcon07 - -

Lvan06 - *

Lvan08 - *

Lvan09 - *

Lvan10 - *

4.4.2 ANÁLISE DE DADOS

Foram analisados ao todo 113 amostras de quatro localidades: Caravelas

(28), Atafona (28), Ubatuba (29) e Cananéia (29) (Tabela 4.13). Também foram

amplificadas 32 amostras de B. Camboriú para os três loci, mas por conta de

dúvidas que surgiram durante a interpretação dos resultados, a população não foi

incluída nas análises.

Os testes de desequilíbrio de ligação, com todos os loci agrupados indicaram

que os loci Xkro10 e Xkro11 estão ligados (p = 0,00000). No entanto a análise com

os loci isolados mostrou que os dois loci permaneceram ligados apenas na

localidade de Caravelas. Em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, o locus

Xkro13 não apresentou desvio significativo para nenhuma localidade, enquanto o

locus Xkro10 não apresentou desvio significativo apenas na localidade de Ubatuba.

A localidade de Cananéia apresentou desvios significativos para Xkro11.

Ao considerar todos os loci, o número total de alelos variou de oito (Ubatuba)

a dez (Atafona). Os valores individuais foram um (Ubatuba) a três (Caravelas;

Atafona; Cananéia) para o locus Xkro10. Para os loci Xkro11 e Xkro13 os números

variaram de quatro (Caravelas; Cananéia) a cinco (Atafona; Ubatuba) e de dois

59

(todas as localidades), respectivamente. Já os valores de heterozigosidades

observadas variaram de 0,037 (Cananéia) a 0,286 (Caravelas) para o locus Xkro10,

de 0,500 (Atafona) a 0,905 (Cananéia) para Xkro11 e entre 0,043 (Atafona) e 0,143

(Caravelas) para Xkro13, respectivamente. As frequências dos alelos em cada

população estão representadas na Tabela 4.14.

Nas comparações par a par entre populações foram observados valores

significativos de FST (p<0,05), sendo Caravelas e Atafona geneticamente distintas de

Ubatuba e Cananéia (Figura 4.5; Tabela 4.15). Resultados similares foram

encontrados por meio do método de identidade (Tabela 4.16). Além disso, o padrão

observado não reflete um isolamento pela região de ressurgência. No entanto, a

grande distância genética entre Cananéia e as demais localidades por ser causada

pela presença de alelos nulos. Um padrão de agrupamento que não condiz com a

hipótese de estruturação em função da região de ressurgência também foi

encontrado pelos métodos de variância (AMOVA; Tabela 4.17). Dos três

agrupamentos testados, apenas a separação de Cananéia das demais localidades

foi significativa (FST e RST) e, em todos os agrupamentos, a maior parte da variação

foi encontrada dentro das populações.

Tabela 4.13: Caracterização genética dos três loci de microssatélites para as quatro populações de Xiphopenaeus sp. I. N – Número amostral; Na – Número de alelos; Ne – Número efetivo de alelos; Ho – Heterozigosidade observada; He – Heterozigosidade esperada; FIS – Coeficiente de endocruzamento; PHW – Significância para o equilíbrio de Hardy-Weinberg.

População Locus N Na Ne Ho He Fis PHW CARA Xkro10 28 3 2,010 0,286 0,503 0.438776 *

Xkro11 28 4 2,583 0,571 0,613 0.076600 Ns Xkro13 28 2 1,153 0,143 0,133 -0.067961 Ns

ATAF Xkro10 28 3 1,972 0,250 0,493 0.499675 ** Xkro11 28 5 2,462 0,500 0,594 0.166667 Ns Xkro13 23 2 1,044 0,043 0,043 -0.011236 Ns

CANA Xkro10 27 3 1,206 0,037 0,171 0.786720 *** Xkro11 21 4 2,714 0,905 0,632 -0.422831 ** Xkro13 29 2 1,187 0,103 0,158 0.351044 Ns

UBAT Xkro10 22 1 1,046 0,045 0,044 -0.011765 Ns Xkro11 22 5 3,408 0,636 0,707 0.110783 Ns Xkro13 22 2 1,095 0,091 0,087 -0.036145 Ns

60

Tabela 4.14: Frequências alélicas dos três loci de microssatélites observadas nas quatro populações.

Locus Alelo CARA ATAF CANA UBAT Xkro10 N 28 28 27 22

260 0,357 0,339 0,000 0,000 262 0,607 0,625 0,074 0,977 264 0,036 0,036 0,907 0,023 266 0,000 0,000 0,019 0,000

Xkro11 N 28 28 21 22 170 0,286 0,250 0,429 0,318 176 0,054 0,036 0,000 0,091 182 0,125 0,125 0,143 0,091 188 0,536 0,571 0,405 0,409 194 0,000 0,018 0,024 0,091

Xkro13 N 28 23 29 22 160 0,071 0,022 0,086 0,045 162 0,929 0,978 0,914 0,955

Tabela 4.15: Valores de FST par a par entre as populações de Xiphopenaeus sp. I.

Os valores de FST estão abaixo da diagonal e os de RST acima (*p < 0,0001).

1 2 3 4 CARA -0.01593 0.04702 -0.01495 ATAF -0.03155 0.09155 -0.01850 CANA 0.35460* 0.38367* -0.01696 UBAT 0.10191* 0.11220* 0.49137*

Tabela 4.16: Valores de identidade genética entre populações de Xiphopenaeus sp. I.

CARA

ATAF

UBAT

CANA

0.000.050.100.15

Figura 4.5: Dendrograma de UPGMA construído a partir dos valores a de FST.

1 2 3 4 1-CARA - 2-ATAF 0,998 - 3-CANA 0,682 0,681 - 4-UBAT 0,930 0,933 0,612 -

61

Tabela 4.17: Valores estruturação genética das populações de Xiphopenaeus sp. I obtidos a partir da AMOVA. À esquerda: valores de FST; À direita: valores de RST. Os valores entre colchetes representam os códigos dos agrupamentos testados.

FST RST

Fonte da variação Variância % do total F ST Variância % do total R ST

Entre Grupos [1] 0,00464 0,63978 0,00640 1,80195 2,51826 0,02518

Entre populações dentro dos grupos [1] 0,17932 24,73682 0,24896* 0,21476 0,30014 0,00308 Dentro das populações [1] 0,54094 74,62340 0,25377* 69,53840 97,18160 0,02818

Fonte da variação Variância % do total F ST Variância % do total R ST

Entre Grupos [2] 0,29052 33,55975 0,33560* 4,50658 6,15062 0,06151* Entre populações dentro dos grupos [2] 0,03422 3,95279 0,05949* -0,77477 -1,05742 -0,01127 Dentro das populações [2] 0,54094 62,48747 0,37513* 69,53840 94,90679 0,05093

Fonte da variação Variância % do total F ST Variância % do total R ST

Entre Grupos [3] -0,24904 -36,23126 -0.36231 0,02366 0,03334 0,00033

Entre populações dentro dos grupos [3] 0,39547 57,53360 0,42232* 1,38376 1,95044 0,01951 Dentro das populações [3] 0,54094 78,69767 0,21302* 69,53840 98,01622 0,01984 (*) P < 0,05

62

5. DISCUSSÃO

5.1. SISTEMÁTICA MOLECULAR

Xiphopenaeus sp. I provavelmente possui distribuição geográfica contínua ao

longo de toda a área estudada, enquanto Xiphopenaeus sp. II foi observado até o

momento apenas nos estados de São Paulo e Rio Grande do Norte. Esses padrões

podem ser causados por diferentes tolerâncias às condições ambientais,

possivelmente menores em Xiphopenaeus sp. II. No entanto, é possível que

Xiphopenaeus sp. II apresente uma ampla distribuição, mas devido aos métodos de

coleta empregados, esta pode não ser amostrada com tanta eficiência como

Xiphopenaeus sp. I. Nas análises de sequencias do gene COI, observou-se que a

variação dentro das espécies foi baixa (0,7% - Xiphopenaeus sp. I; 0,2% -

Xiphopenaeus sp. II), porém com elevada divergência entre as espécies (12% entre

Xiphopenaeus sp. I - Xiphopenaeus sp. II; 11% entre Xiphopenaeus sp. I e

Xiphopenaeus sp. III; 10% entre Xiphopenaeus sp. II e Xiphopenaeus sp. III). A

sustentação estatística dos ramos das três espécies foi alta (100%), inclusive entre

as espécies irmãs (Xiphopenaeus sp. III e Xiphopenaeus sp. II; 93%).

Lessios (2008) utilizou sequências disponíveis no Genbank e comparou a

distância entre diversas espécies separadas pelo Istmo do Panamá, por meio de

regiões nucleares e mitocondriais. Os valores de distância (K2P) encontrados para

crustáceos através de COI, variaram de 4,1% a 22,6%. Entre estas, as distâncias

inferiores a nove corresponderam a valores posteriores ao final do fechamento do

Istmo.

Segundo Gusmão e colaboradores (2006), a origem de Xiphopenaeus sp. I e

do ancestral comum de Xiphopenaeus sp. III e Xiphopenaeus sp. II ocorreu a partir

do mesmo evento de cladogênese, há 4,5 Ma, enquanto Xiphopenaeus sp. III e

Xiphopenaeus sp. II surgiram do ancestral mais recente, há 4Ma. Os resultados aqui

obtidos evidenciam a grande distância genética existente entre Xiphopenaeus sp. I e

Xiphopenaeus II (12%). É possível que a divergência a partir da elevação do Istmo

seja anterior à interrupção do fluxo marinho entre as regiões e alguns trabalhos

sustentam a idéia de que o isolamento no mar, em muitos casos, pode ocorrer sem a

63

existência de barreiras físicas (Palumbi, 1994; Palumbi et al., 1997; Barber et al.,

2000), mas sim ocasionado por barreiras ao fluxo gênico decorrentes de vários

aspectos do comportamento e fisiologia larval (Knowlton e Weigt, 1998).

Foi observada uma grande distância genética entre as três espécies (superior

a 10%), equivalente às distâncias existentes entre comparações de espécimes dos

gêneros Litopenaeus e Farfantepenaeus. É possível que outras espécies mais

próximas de Xiphopenaeus sp. II tenham existido no Atlântico e outras de

Xiphopenaeus sp. III, no Pacífico, mas foram extintas, por conta das alterações

sofridas pelo ambiente durante o soerguimento do Istmo do Panamá.

Além disso, as condições abióticas encontradas no Mar do Caribe seriam

próximas das existentes no Pacífico antes da interrupção do fluxo das águas (Coates

e Obando, 1996; Collins, 1996), servindo como “refúgios” para várias espécies. Por

meio de dados fósseis, já foi confirmado que essas modificações ambientais

resultaram em uma grande extinção de moluscos (Jackson et al., 1993; Marko,

2002). Porém, devido à ausência de estruturas calcificadas, dificilmente os camarões

são preservados como fósseis (Ma et al., 2009) e não existem informações sobre

grandes extinções do grupo. É possível que outras espécies tenham sido extintas,

entretanto a existência atual dessas não pode ser descartada, por conta das poucas

localidades estudadas, principalmente no Pacífico.

Todos esses eventos marítmos resultaram em processos de especiação

dentro do gênero Xiphopenaeus, contudo as caracteríticas morfológicas não

divergiram da mesma maneira que o conteúdo genético, impossibilitando a descrição

e validação das mesmas. Apesar da aparente ausência de caracteres diagnósticos,

seria indispensável o uso de dados morfológicos para a resolução da sistemática do

grupo, o que em alguns casos podem apresentar polimorfismos intraespecíficos. Um

exemplo disso é X. riveti, que, de acordo com Bouvier (1907), era diferenciado de X.

kroyeri a partir de diferenças no número de dentes rostrais, com quatro dentes e X.

kroyeri com cinco. No entanto, já foram observadas variações em exemplares de

Xiphopenaeus sp. I (três e quatro dentes; Gusmão et al., 2006) e recentemente nas

duas espécies do Atlântico (dois a seis em Xiphopenaeus sp. I e de quatro a seis em

Xiphopenaeus sp. II; Piergiorge, dados não publicados).

Vale ressaltar que, mesmo com a grande distância genética existente entre as

três espécies, as mesmas são muito similares morfologicamente. Embora o trabalho

de revisão morfológica de Pérez Farfante e Kensley (1997) não justifique o porquê

64

da união das duas espécies em X. kroyeri, é possível que os autores tenham se

deparado com exemplares das duas espécies do Atlântico. E, considerando as

informações genéticas, a maior proximidade entre as espécies Xiphopenaeus sp. II

do Atlântico e Xiphopenaeus sp. III, do Pacífico, pode estar refletida em

semelhanças morfológicas entre as duas espécies, o que pode ter levado os autores

a considerarem que as variações morfológicas contidas em exemplares do Atlântico

tratassem de plasticidade fenotípica da espécie.

5.2. GENÉTICA DE POPULAÇÕES E DEMOGRAFIA HISTÓRICA

O gene mitocondrial COI revelou baixa variabilidade genética nas populações

de Xiphopenaeus sp. I e Xiphopenaeus sp. II, porém mostrou-se útil na detecção de

estruturação populacional e na elucidação de eventos demográficos em

Xiphopenaeus sp. I. A hipótese proposta de divisão populacional dos estoques, pela

barreira biogeográfica de Cabo Frio, foi sustentada através das análises de variância

e PCA. Entretanto, por conta da baixa variação existente no gene COI, a análise de

ΦST não foi capaz de detectar estruturação nessa região.

Os resultados obtidos na SAMOVA foram significativos a partir de cinco

grupos, porém, exceto para oito grupos, todos os agrupamentos produzidos

corresponderam às populações não agrupadas, formadas a partir da fragmentação

de um agrupamento maior (contendo as 10 populações). Após a construção de nove

grupos, as populações ao norte foram todas isoladas e apenas Cananéia e Santos

foram mantidas juntas. Depois da exclusão da população de Poças, os valores da

AMOVA não foram significativos para a divisão das populações em dois grupos,

considerando a região de ressurgência como barreira para o fluxo gênico (ΦCT =

0,00135). Com o agrupamento de Ilhéus com Caravelas e de Atafona com Nova

Almeida o valor de ΦCT (0,20694) foi altamente significativo (p < 0,0001). Contudo, a

significância foi reduzida após o isolamento de B. Camboriú e Ubatuba das

localidades de Cananéia e Santos (ΦCT = 0,19640; p < 0,001). Apesar da redução

dos valores de ΦCT, os resultados de estruturação foram mantidos mesmo após a

exclusão de Poças, sustentando a confiabilidade dos resultados. Entretanto, a

AMOVA não detectou o mesmo padrão de estruturação.

Com os resultados de identidade genética de Nei e FST, baseados em

análises de microssatélites de quatro localidades (Caravelas, Atafona, Ubatuba e

65

Camboriú), verificou-se que as localidades de Caravelas e Atafona são mais

próximas entre si, apresentando identidade genética de I=0,998. Esse resultado está

de acordo com os obtidos pela PCA, a partir de sequências de COI, em que foram

observados três agrupamentos: um que compreendeu o grupo formado por

populações abaixo da região de Cabo Frio, um formado por localidades da Bahia

(Ilhéus e Caravelas) e o terceiro por populações ao norte da região Sudeste (Nova

Almeida e Atafona). O padrão observado condiz com a distância existente entre as

localidades e a proximidade genética de Ubatuba com Caravelas e Atafona pode

estar relacionada com a não amostragem das populações mais próximas

geneticamente. A baixa variabilidade encontrada em COI pode ser decorrente do

grande esforço de pesca exercido sobre o recurso pesqueiro nas últimas décadas ou

de um gargalo populacional ocorrido na última glaciação, antes da expansão

demográfica observada.

Os resultados encontrados por Gusmão e colaboradores (2006), utilizando

isoenzimas indicaram que Xiphopenaeus sp. I é geneticamente estruturada ao longo

da costa. Valores significativos de FST foram observados entre Nova Almeida e Cabo

Frio, entre Nova Almeida e Poças (BA), entre Poças e Ubatuba e entre Cabo Frio e

Ubatuba. Recentemente, através de morfometria geométrica, já foram observadas

variações na curvatura do rostro em populações de Xiphopenaeus sp. I. Os autores

concluíram que as populações de Nova Almeida, Atafona, Ubatuba e Balneário

Camboriú são estruturadas e, provavelmente, correspondem a diferentes estoques

pesqueiros (Gusmão et al., 2013).

Em relação a marcadores moleculares microssatélites, Francisco (2009) não

observou qualquer tipo de estruturação genética espacial para Xiphopenaeus sp. I

em sete localidades ao sul de Nova Almeida (FST = 0,000). A autora associou as

flutuações sazonais ocorridas na região de ressurgência com a ausência de

diferenciação populacional, pois durante o inverno o evento perde intensidade e

possibilita a migração.

De forma similar, Gusmão e colaboradores (2005), empregando marcadores

isoenzimáticos, não observaram estruturação para Farfantepenaeus brasiliensis e

Litopenaeus schmitti ao longo da costa brasileira. Contudo, F. paulensis apresentou

estruturação, sendo as localidades Rio de Janeiro e Santos geneticamente distintas

de Lagoa dos Patos. Além disso, Farfantepenaeus sp. foi altamente estruturada ao

longo da costa.

66

Vários outros trabalhos utilizaram genes mitocondriais e microssatélites para

estudos populacionais em camarões, demonstrando que o DNA é útil para a datação

de eventos de expansão e as regiões repetitivas para a detecção de estruturação:

Chu e colaboradores (2012) estudaram sequências de RCM (Região Controle

Mitocondrial) de populações de Metapenaeopsis sp. na costa chinesa e Taiwan. Os

autores encontraram estruturação genética e dois clados significativos. Em relação

às análises demográficas, apenas os clados separados geraram distribuições

unimodais na mismatch distribution. A datação foi calculada 13,8-22,4 para o clado I

e 26,8-39,1 mil anos para o II.

Através da RCM, Mcmillen-Jackson e Bert (2004) não observaram

estruturação populacional para Farfantepenaeus duorarum coletados no Golfo do

México. Entretanto, o marcador foi capaz de detectar sinais de expansão

populacional, datada em 36 mil anos. Em um outro trabalho das autoras (Mcmillen-

Jackson e Bert, 2003) foram observados padrões de expansões para

Farfantepenaeus aztecus e Litopenaeus setiferus, datadas para a última era glacial.

Já em Feneropenaeus chinensis, Li e colaboradores (2009), utilizando o gene

mitocondrial COI, não detectaram estruturação genética. Apesar disso, as análises

demográficas indicaram expansão populacional, coincidindo com a última glaciação.

Porém, Russ e colaboradores (2010) observaram estruturação ao utilizar o gene COI

para estudos populacionais de Metabetaeus lohena, nas ilhas havainas. Foram

encontrados 43 haplótipos, 41 sítios variáveis e evidências de expansão

populacional.

Com o gênero Penaeus (Penaeus monodon), You e colaboradores (2008),

que utilizaram nove loci de microssatélites e detectaram estruturação populacional

no Indo-Pacífico. Em outro trabalho, feito por Premruethai Supungul e colaboradores

(2000), foi apresentado resultados de estruturação em populações dessa espécie na

Tailândia, por meio de cinco loci de microssatélites.

Em relação ao presente estudo, os resultados de estruturação encontrados

com o gene COI condizem com os encontrados por Maggioni e colaboradores (2003)

para Litopenaeus schmitti, por meio de marcadores microssatélites. Os autores

observaram um padrão de estruturação norte-sul, que coincide com a barreira

biogeográfica de Cabo Frio (23°S). Além disso, atri buíram a ressurgência nessa

região como uma possível limitação para a dispersão de L. schmitti.

67

Em analogia ao número de alelos observados por Francisco (2009) foram

observados dois novos alelos para o locus Xkro10, nas localidades de Cananéia,

Camboriú, Atafona e Caravelas. O locus Xkro11 apresentou cinco dos sete alelos já

amostrados, sendo 170 e 188 pb os mais frequentes. Apesar de serem citados três

alelos para o locus, a autora descreve apenas dois (166 e 168 pb). No presente

estudo, foram observados apenas dois alelos (160 e 162 pb) que diferem em relação

aos valores de heterozigosidade observadas (Ho) encontrados por Francisco (2009).

A rede de haplótipos produzida para Xiphopenaeus sp. I com base em

sequências COI possui topologia em estrela, porém, apenas Ubatuba e B. Camboriú

apresentaram indícios de expansão. No entanto, como não foram observadas

estruturações populacionais para nenhuma das localidades abaixo da região de

Cabo Frio, todas as populações da região foram agrupadas. A expansão foi sugerida

através dos seguintes resultados: (1) a topologia da rede em forma de estrela; (2) os

desvios significativos para os testes neutralidade; (3) os valores de θ antes e após a

expansão; (4) a distribuição unimodal encontrada na mismatch distribution.

Considerando os dados gerados neste estudo e as informações disponíveis

na literatura sobre a estruturação de Xiphopenaeus sp. I (Voloch, 2005; Gusmão et

al., 2006; Francisco, 2009; Tavares et al., 2013), obteve-se a distribuição consensual

da espécie. Foram observados oito pontos de estruturação ao longo da costa: três

ao sul (Camboriú; Santos e Cananéia; Ubatuba), dois pontos no sudeste, acima da

região de ressurgência (Atafona; Nova Almeida), dois na Bahia (Caravelas e Ilhéus;

Poças) e um que corresponde à população da Venezuela. Esses dados suportam o

isolamento das populações próximas à região de Cabo Frio e sugere os outros

isolamentos, possivelmente, por conta de aportes de água doce entre essas regiões.

Segundo Branco e colaboradores (1999), a abundância da espécie está relacionada

com as variações de temperatura e salinidade, o que pode variar em regiões

próximas a rios. Entretanto, essas flutuações podem refletir padrões do aporte

continental, o verdadeiro fator responsável pelas mudanças na abundância do

camarão sete-barbas (Dias Neto, 2011).

Em relação à população da Venezuela, além de ser mais distante

geograficamente das demais, está restrita a uma outra corrente marinha (CCNB), ao

norte do delta do Amazonas, e está contida em uma das ecorregião de Spalding e

colaboradores (66 - sul do Caribe). Apesar dessas ecorregiões permitirem algumas

correlações com os dados obtidos, por exemplo as regiões 180 e 76, não foi possível

68

relacionar a estruturação das genética das populações Atafona, Nova Almeida e

Caravelas e Ilhéus com nenhuma das ecorregiões.

Todos os resultados demográficos apontam que Xiphopenaeus sp. I sofreu

contração populacional seguida de expansão, nas localidades abaixo de Cabo Frio.

Os valores da datação coincidem com o início e término da última glaciação, no qual

é possível que a espécie tenha passado por redução populacional e geográfica.

Essa diminuição pode estar relacionada com a perda de ambientes favoráveis e

ocupação de regiões com condições ambientais propícias (refúgios). Alguns

trabalhos com organismos marinhos sustentam a hipótese da existência de refúgios

durantes as glaciações (Kettle et al., 2011; Panova et al., 2011). Populações que

possuem elevada variabilidade genética estão menos sujeitas às perturbações

decorrentes de mudanças ambientais, porém o Brasil ainda não faz uso de

informações genéticas para auxiliar na elaboração dos períodos de defeso. Até o

momento, para fins de conservação, a existência de um complexo críptico para o

gênero Xiphopenaeus ainda é completamente ignorada.

O reconhecimento dessas espécies crípticas permite a associação entre

padrões bimodais de distribuição com a existência de mais de uma espécie em

certas localidades. Por exemplo, alguns estudos ecológicos encontraram dois picos

reprodutivos para o camarão sete-barbas em Ubatuba (Nakagaki e Negreiros-

Fransozo, 1998; Castro et al., 2005). Tais picos podem estar relacionados à

reprodução das duas espécies (Piergiorge, 2010), e, caso reflitam isso, o período de

defeso estaria protegendo somente uma delas, pois a proteção se restringe apenas

à captura da espécie durante o outono (1 Março – 31 Maio), permitindo a captura

dos espécimes durante a primavera. De forma similar, Santos e Magalhães (2001)

encontraram dois picos reprodutivos em F. subtilis ao sul da Bahia, espécie que

possui dois morfotipos conhecidos que foram identificados como duas espécies

crípticas com base em estudos moleculares (Gusmão et al., 2000).

Além disso, em todos os trabalhos que realizaram identificação molecular das

espécies crípticas do gênero Xiphopenaeus, a maioria dos espécimes identificados

corresponderam a Xiphopenaeus sp. I (Gusmão et al. 2006; Francisco, 2009;

Piergiorge, 2010). A menor frequência de Xiphopenaeus sp. II nas amostragens

pode refletir o tamanho populacional da espécie, mas não pode ser descartada a

possibilidade desses espécimes apresentarem um hábito de vida diferente de

Xiphopenaeus sp. I, o que dificulta sua amostragem (i.e. modificação do padrão de

69

forrageamento por conta da turbidez da água; Natividade, 2006). Contudo, caso a

espécie seja realmente “rara”, é possível que a exploração indiscriminada do recurso

diminua a variabilidade genética e, consequentemente, leve a depleção do estoque

pesqueiro, e a extinção da espécie.

70

6. CONCLUSÕES

� Apesar de resultar em amplificações, os três íntrons dos genes selecionados

não foram polimórficos para Xiphopenaeus spp..

� As medidas de diversidades genética encontradas em Xiphopenaeus sp. I

foram baixas, coincidindo com as encontradas em espécies que sofreram

expansão populacional recente.

� As análises demográficas mostraram que Xiphopenaeus sp. I sofreu duas

expansões populacionais (demográfica e geográfica), datadas em 99,57 e

10,95 mil, respectivamente. Provavelmente essas datações refletem

mudanças ambientais decorrentes da última glaciação.

� Apenas as análises de variância e componente principal resultaram em

padrões de estruturação populacional para as populações de Xiphopenaeus

sp I. O padrão de estruturação encontrado coincide com a localização da

barreira biogeográfica de Cabo Frio. Já os marcadores microssatélites, além

de polimórficos, permitiram a identificação de três populações, uma acima de

Cabo Frio (Caravelas + Atafona) e duas abaixo (Cananéia; Ubatuba).

Considerando todos os dados disponíveis sobre Xiphopenaeus sp I, foram

observadas oito populações ao longo da costa.

� A distribuição geográfica encontrada para as duas espécies corrobora

resultados anteriores. Xiphopenaeus sp. I é encontrado em todas as

localidades já estudadas, sendo seus extremos conhecidos de distribuição

geográfica: Balneário Camboriú/SC e Venezuela. Já para Xiphopenaeus sp.

II, a espécie foi apenas observada em São Paulo (Cananéia e Ubatuba) e em

Natal/RN, mas a possibilidade de ocorrência em outras localidades não deve

ser descartada.

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