quimiorreflexo e barorreceptores

Universidade de So Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

Programa de Ps-Graduao em Fisiologia

Mecanismos nitrrgicos envolvidos na neurotransmisso dos

componentes autonmicos e respiratrio do quimiorreflexo no NTS

caudal de ratos no-anestesiados

rica Maria Granjeiro

Ribeiro Preto

2009

Universidade de So Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

Programa de Ps-Graduao em Fisiologia

Mecanismos nitrrgicos envolvidos na neurotransmisso dos componentes autonmicos e respiratrio do quimiorreflexo no NTS

caudal de ratos no-anestesiados

rica Maria Granjeiro

Orientador: Prof. Dr. Benedito H. Machado

Ribeiro Preto

2009

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao

em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeiro

Preto, como parte das exigncias para obteno do

ttulo de Doutor em Cincias

Autorizo a reproduo e divulgao total ou parcial deste trabalho, por qualquer

meio convencional ou eletrnico, para fins de estudo e pesquisa desde que citada

fonte.

FICHA CATALOGRFICA

Granjeiro, rica Maria Mecanismos nitrrgicos envolvidos na neurotransmisso dos

componentes autonmicos e respiratrio do quimiorreflexo no NTS caudal de ratos no-anestesiados. Ribeiro Preto, 2009.

156 p.: il. ; 30cm Tese de Doutorado, apresentada Faculdade de Medicina de

Ribeiro- Preto - Universidade de So Paulo, 2009. rea de concentrao: Fisiologia. Orientador: Machado, Benedito Honrio.

1. ncleo do trato solitrio. 2. xido ntrico. 3. quimiorreflexo. 4. controle autonmico. 5. controle respiratrio.

APOIO FINANCEIRO CNPq (471184/2007-1; 142029/2005-0) FAPESP (2004/03285-7)

A cincia humana de maneira nenhuma nega a

existncia de Deus. Quando considero quantas e quo

maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e

consegue realizar, ento reconheo claramente que o

esprito humano obra de Deus, e a mais notvel.

Galileu Galilei

Ao meu filho Pedro Henrique

pelo tempo dele roubado, pela pacincia e

compreenso nos momentos em que estive ausente

realizando este trabalho e principalmente pela

imensa felicidade que traz a minha vida todos os

dias.

AGRADECIMENTOS

A Deus, sempre, por colocar as oportunidades em meu caminho e me

dar capacidade para transpor as dificuldades.

Aos meus queridos pais Francisco e Maria Pedrina, exemplos de amor e

doao. Serei eternamente grata a vocs pelo apoio, incentivo e

dedicao desprendidos em todas as etapas de minha vida.

Aos meus queridos irmos Aurlio e Leonardo, exemplos de

determinao, fora e superao.

Ao meu querido esposo Paulo Csar pelo companheirismo, apoio e

dedicao incondicionais, os quais tornam o meu caminho mais suave.

Aos meus queridos familiares Paulo e Judit, por suas oraes em meu

favor.

Ao meu orientador Prof. Dr. Benedito H. Machado, por ter me recebido

em seu laboratrio, pelo estmulo sempre importante para as nossas

realizaes e pela sua presena sempre fundamental em todos os

momentos de necessidade.

A tcnica do laboratrio Leni Gomes H. Bonagamba pelo excelente

apoio tcnico, pela amizade e principalmente pelo seu exemplo de

integridade e carter.

Ao Prof. Dr. Fernando Corra Morgan pelas ricas discusses sobre

Farmacologia e Estatstica e por seu eterno bom humor.

Ao meu querido amigo Prof. Dr. Leonardo Resstel Barbosa Moraes

pelas ricas e infinitas discusses sobre Farmacologia e Estatstica, pelos

conselhos e principalmente pela palavra amiga de f e de perseverana.

Agradeo tambm sua esposa Prof. Dr. Smia Regiane Loureno Joca

por ser to amvel e atenciosa.

Aos queridos amigos Daniela Acorssi-Mendona, Daniel Zoccal e Carlos

Eduardo Almado (Cadu) pela generosidade e despreendimento

dedicados em muitas discusses de Fisiologia.

Aos meus queridos amigos Josiane, Joo Henrique, Gisela, Roberta,

Davi, Daniel Penteado, Lgia, Fernada, Fabianda, Gabriela, Marina,

Joo Paulo, Renata, Glauber, Mrcio, Olagide, Simone, Andr pela

preciosa oportunidade de conviver e desfrutar de suas amizades.

Ao tcnico Rubens Fernando de Melo pelo empenho nas preparaes

histolgicas sempre conduzidas com muita qualidade.

Aos funcionrios da secretaria deste departamento: Elisa, Cludia,

Fernando e Carlos pela competncia e prontido em todos os servios

por eles prestados.

A todos os docentes deste Departamento que souberam conduzir, com

extrema competncia, meus conhecimentos na rea de Fisiologia.

SUMRIO

RESUMO.....................................................................................................................x ABSTRACT..............................................................................................................xiii 1. INTRODUO ......................................................................................................16 2. OBJETIVOS..........................................................................................................29 3. MATERIAL E MTODOS .....................................................................................31

3.1. Animais ...........................................................................................................32 3.2. Grupo de Animais ...........................................................................................32 3.3. Implante de cnulas-guia dirigidas para o NTS comissural caudal.................32 3.4. Microinjees de drogas no NTS comissural caudal ......................................34 3.5. Canulao da artria e veia femoral ...............................................................35 3.6. Estimulao dos quimiorreceptores perifricos ..............................................36 3.7. Registro da presso arterial e da freqncia cardaca ...................................37 3.8. Registro da ventilao e anlise de dados .....................................................37

3.8.1. Anlise da freqncia respiratria ............................................................38 3.8.2. Anlise do volume corrente e da ventilao minuto nos animais submetidos ao protocolo de microinjeo unilateral de ATP no NTS caudal .....40

3.9. Registros simultneos da presso arterial, freqncia cardaca e ventilao.43 3.10. Solues e drogas utilizadas ........................................................................45 3.11. Histologia ......................................................................................................46 3.12. Anlise estatstica dos resultados.................................................................47 3.13. Protocolos Experimentais .............................................................................48

3.13.1 Respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo com KCN em ratos no-anestesiados antes e aps as microinjees bilaterais no NTS comissural caudal do inibidor no-seletivo da NOS (L-NAME) ou do veculo (salina).............................................................................48 3.13.2. Respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo com KCN em ratos no-anestesiados antes e aps as microinjees bilaterais no NTS comissural caudal do inibidor seletivo da NOS neuronal (N-PLA) ou do veculo (salina)....................................................49 3.13.3. Respostas cardiovasculares e ventilatrias microinjeo unilateral de ATP (1,25 nmoles/50 nL) no NTS caudal de ratos no-anestesiados antes e aps a microinjeo unilateral de N-PLA (3 pmoles/50 nL) ou do veculo (salina) no mesmo stio ......................................................................................50

4. RESULTADOS......................................................................................................52 4.1. Experimentos de ativao do quimiorreflexo em ratos no-anestesiados ......53

4.1.1. Respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v) antes e aps as microinjees bilaterais de L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal de ratos no-anestesiados.......................................................................................................55 4.1.2. Respostas cardiovasculares e ventilatria decorrentes da ativao do quimiorreflexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v) antes e aps as microinjees bilaterais de N-PLA (3 pmoles/50 nL) no NTS comissural caudal de ratos no-anestesiados ...............................................................................................64 4.1.3. Anlise histolgica dos ratos submetidos ao protocolo de ativao do quimiorreflexo com KCN (40g/0,1 mL) antes e aps as microinjees bilaterais dos inibidores da NOS (seletivo e no-seletivo) ou do veculo (salina, 50 nL) no NTS comissural caudal..........................................................66

4.2. Experimentos de microinjeo unilateral de ATP no NTS de ratos no-anestesiados..........................................................................................................74

4.2.1. Respostas cardiovasculares e ventilatrias microinjeo unilateral de ATP (1,25 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal de ratos no-anestesiados antes e aps a microinjeo unilateral de N-PLA (3 pmoles/50 nL) ou do veculo (salina) no mesmo stio .......................................................................................76 4.2.2. Anlise histolgica dos ratos submetidos ao protocolo de microinjeo unilateral de ATP (1,25 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal antes e aps a microinjeo de N-PLA (3 pmoles/50 nL) ou do veculo (salina, 50 nL) no mesmo stio ........................................................................................................78

5. DISCUSSO.........................................................................................................88

5.1. xido Ntrico e modulao autonmica basal no NTS caudal de ratos no-anestesiados..........................................................................................................89 5.2. xido Ntrico e a neurotransmisso do quimiorreflexo no NTS caudal de ratos no-anestesiados .........................................................................................92 5.3. xido Ntrico e ATP no NTS caudal de ratos no-anestesiados ..................102

6. CONSIDERAES FINAIS ................................................................................108 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................................110 8. APNDICE..........................................................................................................129 9. PUBLICAES ..................................................................................................157

RESUMO

Resumo xi

O ncleo do trato solitrio uma rea integrativa do sistema nervoso central

(CNS) envolvida no controle autonmico e respiratrio. Estudos da literatura

sugerem que o xido ntrico (NO) exerce um importante papel na modulao dos

reflexos cardiovasculares e ventilatrios no NTS. Alm disso, evidncias da literatura

indicam uma possvel interao entre o NO e o ATP no SNC. Fundamentados

nessas evidncias, no presente estudo, avaliamos a possvel participao do NO na

modulao dos parmetros cardiorespiratrios basais e no processamento das

respostas cardiovasculares e respiratrias ativao do quimiorreflexo no NTS

caudal de ratos no-anestesiados. Alm disso, o possvel papel do NO produzido

pela xido ntrico sintase neuronal (nNOS) nas respostas cardiovasculares e

respiratrias microinjeo unilateral de ATP no NTS caudal tambm foi avaliado.

Para tanto, os animais foram submetidos ao implante de cnulas guia em direo ao

NTS caudal e canulao da artria e veia femoral. Os parmetros ventilatrios

foram avaliados pelo mtodo de pletismografia de corpo inteiro. A anlise dos

resultados monstrou que as microinjees bilaterais do L-NAME, um inibidor no-

seletivo da NOS, no NTS caudal, promoveram um aumento significativo na presso

arterial basal dos animais, sugerindo um papel modulatrio do NO sobre os

neurnios envolvidos com as vias neurais do barorreflexo. No entanto, as

microinjees bilaterais do N-PLA, um inibidor seletivo da nNOS, no NTS caudal,

no promoveram alteraes significativas na presso arterial basal, sugerindo que a

produo do NO envolvido no controle autonmico basal no NTS caudal no

dependente da atividade da nNOS. Com relao s respostas do quimiorreflexo, as

microinjees bilaterais do L-NAME ou do N-PLA, no NTS caudal de ratos no-

anestesiados, promoveram um atenuao significativa no aumento da freqncia

respiratria (fR) ativao do quimiorreflexo, sugerindo a participao do NO

Resumo xii

produzido pela nNOS na modulao do componente respiratrio do quimiorreflexo

no NTS caudal. No entanto, as respostas pressora e bradicrdicas decorrentes da

ativao do quimiorreflexo no foram alteradas pelas microinjees bilaterais do L-

NAME ou N-PLA no NTS caudal, sugerindo que o NO no est envolvido na

modulao das respostas cardiovasculares decorrentes da ativao deste reflexo.

No que diz respeito s respostas decorrentes da microinjeo de ATP no NTS

caudal, a anlise dos resultados demonstrou que as respostas de aumento na

presso arterial, fR e ventilao minuto produzidas pela microinjeo unilateral de

ATP no NTS caudal de ratos no-anestesiados foram significativamente atenuadas

aps a microinjeo do N-PLA no mesmo stio, sugerindo a participao do NO

produzido pela nNOS na modulao de tais respostas. Neste contexto, os achados

do presente trabalho sugerem que no NTS caudal: 1) o NO, provavelmente

produzido pela NOS endotelial, exerce um importante papel modulatrio nas vias

neurais do barorreflexo; 2) a neurotransmisso do aumento da fR decorrente da

ativao do quimiorreflexo envolve a formao de NO produzido pela nNOS; 3) a

neurotransmisso das respostas cardiovasculares decorrentes da ativao do

quimiorreflexo no envolve a formao de NO; 4) a neurotransmisso das respostas

cardiovascualres e respiratrias decorrentes da microinjeo unilateral de ATP

envolve a formao de NO produzido pela nNOS.

ABSTRACT

Abstract xiv

The nucleus tractus solitarius (NTS) is an integrative area in the central

nervous system (CNS) involved with the ventilatory and autonomic control. Several

studies suggest that nitric oxide (NO) in the NTS plays an important role in the

modulation of the cardiovascular and ventilatory reflexes. In addition, there is

evidence indicating a possible interaction of NO and ATP in the CNS. Considering

these findings, in the present study, we evaluated the possible role of NO on the

modulation of the basal cardiorespiratory parameters as well as on the processing of

the cardiovascular and ventilatory responses elicited by chemoreflex activation in the

caudal NTS of awake rats. In addition, the possible role of NO produced by neuronal

nitric oxide sintase (nNOS) on the cardiovascular and respiratory responses

produced by unilateral microinjection of ATP into the caudal NTS was also evaluated.

For this purpose, rats received bilateral guide cannulae in direction of the caudal NTS

and femoral artery and vein were cannulated. The ventilatory measurements were

obtained by whole-body pletismograph method. Our data showed that bilateral

microinjections of L-NAME, a non-selective NOS inhibitor, into the caudal NTS,

produced a significant increase in basaline mean arterial pressure, suggesting a

modulatory role of NO in the neural pathways of the baroreflex. However, bilateral

microinjections of N-PLA, a selective nNOS inhibitor, into the caudal NTS, produced

no significant changes in the baseline mean arterial pressure, suggesting that NO

produced by nNOS is not involved in the basal autonomic control in the caudal NTS.

With respect to chemoreflex responses, bilateral microinjections of L-NAME or N-

PLA, into the caudal, produced a significant attenuation in the increase in respiratory

frequency (fR) produced by chemoreflex activation, suggesting that NO produced by

nNOS is involved in the modulation of the respiratory component of the chemoreflex.

However, the pressor and bradicardic responses elicited by chemoreflex actiovation

Abstract xv

were not affected by microinjections of L-NAME or N-PLA, suggesting that NO is not

involved in the modulation of the cardiovascular responses. With respect to ATP

microinjection responses, the data showed that unilateral microinjection of ATP into

the caudal NTS produced increase in arterial pressure, fR and minute ventilation,

which were significantly attenuated by N-PLA, suggesting that NO produced by

nNOS is involved in the modulation of the cardiovascular and ventilatory responses

to ATP microinjection into the caudal NTS. In conclusion, the data of present study

indicate that in the caudal NTS: 1) NO, produced probably by endothelial NOS, plays

an important modulatory role on the neural pathways of the baroreflex; 2) the

neurotransmission of the increase in respiratory frequency to chemoreflex activation

involve NO production by nNOS. 3) NO is not involved in modulation of the

autonomic components of chemoreflex; 4) the cardiovascular and ventillatory

responses produced by ATP micronjection are, at least in part, mediated by NO

produced by nNOS.

1. INTRODUO

Introduo 17

O controle dos sistemas cardiovascular e respiratrio dos mamferos envolve

diferentes mecanismos, os quais tm como objetivo promover um aporte sangneo

adequado para todos os tecidos, transportando e distribuindo substncias essenciais

para a manuteno das clulas, assim como removendo os produtos provenientes

do metabolismo. Desta forma, os sistemas cardiovascular e respiratrio mantm as

trocas gasosas entre os meios interno e externo e contribuem para o controle da

temperatura e manuteno do equilbrio cido-base, exercendo um papel

fundamental na homeostase do organismo, o qual ocorre principalmente por meio de

mecanismos neurais.

Os mecanismos neurais de controle do sistema cardiovascular e respiratrio

envolvem a ativao de sensores perifricos, os quais transmitem, por meio de suas

aferncias, as informaes captadas para regies especficas do sistema nervoso

central (SNC). Nestas regies especficas, as informaes so integradas,

promovendo ajustes rpidos na presso arterial, freqncia cardaca e ventilao por

meio de alteraes nas atividades eferentes autonmicas e respiratrias, alm da

liberao de neurohormnios. Entre os sistemas sensoriais mais importantes para o

controle da funo cardiovascular e respiratria destacam-se os quimiorreceptores

perifricos, os quais esto distribudos nos corpsculos carotdeos e articos,

localizados bilateralmente na bifurcao da cartida comum (quimiorreceptores

carotdeos) ou em pequenos corpsculos espalhados entre o arco artico (Howe,

1956) e artria pulmonar [quimiorreceptores articos (Comroe, 1939; Kollmeyer e

Kleinman, 1975)]

Os quimiorreceptores perifricos so estruturas especializadas em detectar

alteraes na presso parcial de oxignio (PO2), na presso parcial de gs

carbnico (PCO2) e nas concentraes de ons hidrognio (pH) do sangue

Introduo 18

(Heymans e Bouckaert, 1930; Biscoe e cols., 1967 e 1969). As clulas

quimiossensveis localizadas nos corpsculos carotdeos constituem tecido

circunscrito que recebe irrigao por meio de uma pequena artria (artria do

corpsculo carotdeo), irrigao esta que lhes confere a maior relao perfuso

sangnea por grama de tecido de todo o organismo. Quando um animal

submetido a situaes de hipxia, o decrcimo na PO2 nas clulas glomus (tipo I)

causa, seqencialmente, inibio dos canais de K+ nas clulas quimiossensveis,

despolarizao da membrana e ativao dos canais de Ca+ voltagem-dependente,

liberao de neurotransmissores (dopamina e ATP) por vesculas e a gerao de

potenciais de ao nos terminais neurais que se propagam pelo nervo carotdeo, em

direo ao SNC (Gonzles e cols., 1995).

Em estudo clssico de Heymans e Bouckaert (1930) foi demonstrado que em

ces, a estimulao dos quimiorreceptores carotdeos, realizada por meio da

ocluso das artrias cartidas, promoveu um aumento da presso arterial e da

freqncia e amplitude da respirao dos animais. Da mesma forma, em estudo

posterior realizado por Bernthal (1938) foi evidenciado que a estimulao qumica

dos quimiorreceptores carotdeos com cianeto de sdio em ces promoveu

vasoconstrio perifrica, a qual foi tambm acompanhada por um aumento da

freqncia respiratria (fR). Estudos de Franchini e Krieger (1993) e Haibara e cols.

(1995) mostraram que a ativao do quimiorreflexo por meio da injeo de KCN

(i.v.), em ratos no-anestesiados, promove aumento da presso arterial, intensa

bradicardia e aumento na fR (taquipnia), bem como uma resposta comportamental

de explorao do ambiente. Alm disso, Haibara e cols. (1995) demonstraram que

as respostas cardiovasculares estimulao dos quimiorreceptores perifricos

(resposta pressora e bradicardia) so resultantes da ativao de dois mecanismos

Introduo 19

independentes: 1) a elevao da presso arterial, decorrente do aumento na

atividade simptica, a qual foi praticamente bloqueada pela injeo prvia (i.v.) de

prazosin (antagonista 1-adrenrgico) sem alterar a resposta de bradicardia e 2) a

resposta bradicrdica, decorrente da ativao da via parassimptica, a qual foi

bloqueada pela injeo prvia (i.v.) de metil-atropina (antagonista dos receptores

colinrgicos) sem alterar a resposta pressora.

A importncia relativa dos quimiorreceptores carotdeos e dos

quimiorreceptores articos no controle da funo cardiorespiratria parece ser

diferente de acordo com a espcie animal estudada. Estudos em ces e gatos tm

sugerido que tanto os quimiorreceptores carotdeos quanto os articos

desempenham um importante papel na funo cardiorespiratria (Comroe, 1939;

Daly e Ungar, 1966; Lahiri e cols., 1981; Hopp e cols., 1991; Marshall, 1994).

Entretanto, na espcie humana assim como no rato, estudos anatmicos tm

demonstrado que os quimiorreceptores articos encontram-se geralmente ausentes

(Easton e Howe, 1983). Alm disso, estudos realizados por Franchini e Krieger

(1992 e 1993) demonstraram que as alteraes cardiovasculares e respiratrias

induzidas pela injeo intravenosa de KCN foram completamente abolidas pela

ligadura bilateral da artria que irriga o corpsculo carotdeo, indicando que no rato

os quimiorreceptores carotdeos so relativamente mais importantes.

Um importante aspecto a ser destacado o fato de que as respostas

cardiovasculares e respiratrias promovidas pela ativao do quimiorreflexo em

ratos anestesiados podem ser diferentes daquelas promovidas em ratos no-

anestesiados. Neste sentido, estudos de Franchini e Krieger (1993) documentaram

que o anestsico pentobarbital quase aboliu a resposta bradicrdica decorrente da

ativao do quimiorreflexo e que, de modo similar ao anestsico cloralose, bloqueou

Introduo 20

a resposta pressora. Em concordncia com esses achados, no estudo realizado por

Haibara (2006) foi demonstrado que em animais anestesiados com uretana ou

cloralose as respostas pressora, bradicardica e taquipneica (aumento da fR)

induzidas pela injeo i.v. de KCN foram significativamente atenuadas, indicando

que os diferentes anestsicos afetam as transmisso das respostas

cardiovasculares e respiratria decorrentes da ativao do quimiorreflexo. Alm

disso, estudos prvios do nosso laboratrio (Machado e Bonagamba, 1992b)

demonstraram que o anestsico uretana afeta a neurotransmisso no NTS, pois a

microinjeo de L-glutamato no NTS de ratos no-anestesiados produziu aumento

na presso arterial mdia (PAM), enquanto que no mesmo animal sob anestesia

com uretana, a microinjeo de L-glutamato produziu queda na PAM, sugerindo que

a presena dos anestsicos pode afetar profundamente as respostas reflexas

processadas no NTS. Em concordncia com esses achados, estudos posteriores do

nosso laboratrio (Acorssi-Mendona e cols., 2007) em fatias do tronco cerebral

demonstraram que a uretana, em concentraes similares quelas utilizadas em

animais inteiros anestesiados, promove uma reduo significativa da freqncia das

correntes espontneas GABArgicas em neurnios do NTS, indicando importantes

alteraes promovidas pelos anestsicos na dinmica do circuito sinptico no tronco

cerebral. Portanto, considerando os mltiplos aspectos integrativos envolvidos nas

respostas cardiovasculares e ventilatrias decorrentes da ativao dos

quimiorreceptores perifricos, estudos envolvendo a neurotransmisso das vias

neurais de diferentes reflexos devem ser preferencialmente realizados em modelos

experimentais nos quais no sejam utilizados os anestsicos.

As aferncias dos quimiorreceptores perifricos tm como primeira estao

sinptica pores distintas do ncleo do trato solitrio (NTS) (Cottle, 1964; Crill e

Introduo 21

Reis, 1968; Ciriello e cols., 1981; Mifflin, 1992). Este ncleo formado por um

conjunto heterogneo de neurnios localizados na poro dorso-medial do bulbo, o

qual no seu sentido rostro-caudal se estende em colunas bilaterais que se unem na

poro mais caudal (Ciriello e cols., 1994). O NTS pode ser dividido, de acordo com

a sua disposio rostro-caudal, em trs grandes regies, definidas com base na sua

posio em relao rea postrema: NTS rostral, NTS intermedirio ou

subpostremal e NTS caudal (Lowey, 1990). O NTS tambm pode ser dividido, com

sua posio em relao ao trato solitrio, em NTS medial e NTS lateral, sendo que

no limite entre essas duas subdivises encontra-se o trato solitrio (Torvik, 1956). A

poro caudal do NTS medial, ao nvel do calamus scriptorius, d origem a uma

nica estrutura, a qual recebe o nome de NTS comissural. Vrios estudos mostraram

que as aferncias dos quimiorreceptores carotdeos fazem as suas primeiras

sinapses principalmente nas sub-regies mediais e laterais do NTS comissural

caudal (Housley e Sinclair, 1988, Vardhan e cols., 1993; Chitravanshi e cols., 1994 e

Chitravanshi e Sapru, 1995). Alm disso, trabalhos de Akemi e cols., (2001)

demonstraram que a leso eletroltica do NTS comissural aboliu a resposta pressora

promovida pela ativao dos quimiorreceptores perifricos com KCN (i.v.) em ratos

no-anestesiados, levando os autores a sugerirem que a integridade dessa

subregio do NTS desempenha papel fundamental no componente simpato-

excitatrio (resposta pressora) decorrente da ativao do quimiorreflexo. No entanto,

os estudos realizados por Akemi e cols., (2001) no so conclusivos no sentido de

caracterizar a especifidade dos neurnios do NTS comissural nas respostas

decorrentes da ativao do quimiorreflexo, uma vez que tcnica de leso eletroltica

age de forma indistinta tanto na transmisso sinptica quanto na propagao do

impulso sinptico em fibras de passagem. Neste contexto, estudos utlizando a

Introduo 22

tcnica de microinjeo, a qual possibilita o bloqueio seletivo e reversvel da

transmisso sinptica, se fazem necessrios no sentido de caracterizar a

neurotransmisso cardiorespiratria na regio do NTS.

Vrios estudos funcionais tm sido feitos com o objetivo de identificar os

neurotransmissores e/ou neuromoduladores envolvidos no processamento sinptico

das vias ativadas pelo quimiorreflexo no NTS. Neste sentido, estudos sobre a

neurotransmisso das aferncias dos quimiorreceptores perifricos evidenciaram que

durante a hipxia sistmica em ratos houve um aumento dos nveis extracelulares de L-

glutamato no NTS caudal, sendo estes efeitos abolidos aps a seco do nervo do seio

carotdeo (Mizuzawa e cols., 1994). Neste mesmo estudo, os autores demonstraram

tambm, que o L-glutamato, quando microinjetado no NTS, promoveu aumento nos

parmetros ventilatrios e alm disso, o pr-tratamento com antagonistas de receptores

glutamatrgicos no NTS reduziu significativamente as respostas ventilatrias hipxia,

indicando a possvel participao dos receptores glutamatrgicos no NTS nas respostas

decorrentes da ativao dos quimiorreceptores perifricos.

Estudos de Haibara e cols. (1995) investigaram o possvel papel dos receptores

ionotrpicos de L-Glutamato do subtipo NMDA na neurotransmisso do quimiorreflexo

no NTS de ratos no-anestesiados. Esses autores observaram que microinjeo prvia

de AP-5 (antagonista dos receptores ionotrpicos de L-Glutamato do subtipo NMDA) no

NTS de ratos no-anestesiados bloqueou a resposta de bradicardia estimulao do

quimiorreflexo com KCN, indicando que os receptores NMDA estariam envolvidos na

neurotransmisso do componente parassimpato-excitatrio do quimiorreflexo. No

entanto, as respostas pressora (componente simpato-excitatrio) e respiratria do

quimiorreflexo no foram alteradas pelo bloqueio dos receptores glutamatrgicos do

subtipo NMDA (Haibara e cols., 1995).

Introduo 23

Uma vez caracterizada a participao dos receptores glutamatrgicos do

subtipo NMDA na neurotransmisso do componente parassimpato-excitatrio do

quimiorreflexo, estudos de Haibara e cols. (1999) avaliaram o possvel envolvimento

de receptores de aminocidos excitatrios (AAE) do subtipo no-NMDA (AMPA e

cainato) na neurotransmisso do componente simpato-excitatrio. Neste estudo, os

autores observaram que microinjees bilaterais do DNQX (um antagonista seletivo

para os receptores no-NMDA) ou do cido quinurnico (um antagonista no-

seletivo dos receptores de aminocidos excitatrios), no NTS de ratos no-

anestesiados, promoveu uma atenuao significativa da resposta pressora do

quimorreflexo. No entanto, esses resultados no foram conclusivos uma vez que

tanto a microinjeo bilateral do DNQX quanto do cido quinurnico no NTS

promoveram um aumento significativo da presso arterial basal dos animais.

Portanto, a reduo da resposta pressora aps ativao do quimiorreflexo poderia

estar relacionada com o aumento na linha de base da presso arterial promovido

pelo DNQX ou cido quinurnico. Posteriormente, estudo de Machado e Bonagamba

(2005) evidenciou que o aumento na presso arterial basal decorrente da

microninjeo de cido quinurnico no NTS caudal poderia atenuar a resposta

pressora ativao do quimiorreflexo. Quando esse aumento na PA basal foi

normalizado pela infuso intravenosa contnua de nitropussiato de sdio (NPS) e o

quimiorreflexo foi ativado nessa nova condio, a resposta pressora apresentou

magnitude semelhante quela observada antes da microinjeo do cido

quinurnico, sugerindo que a neurotransmisso do componente simpato-excitatrio

do quimiorreflexo no NTS caudal no envolve a participao de receptores

ionotrpicos glutamatrgicos.

Introduo 24

Com relao ao componente respiratrio do quimiorreflexo, estudos

anteriores do nosso laboratrio, realizados por Haibara e cols. (1995), demonstraram

que o antagonismo dos receptores ionotrpicos glutamatrgicos do subtipo NMDA,

produzido pela microinjeo de AP-5 no NTS, no promoveu alteraes significativas

no componente respiratrio do quimiorreflexo. Da mesma forma, resultados

posteriores de Braccialli e cols. (2008) observaram que microinjees bilaterais de

cido quinurnico no NTS caudal de ratos no-anestesiados tambm no

promoveram alteraes significativas no aumento da fR decorrente da ativao do

quimiorreflexo. Os resultados descritos anteriormente sugeriram que os receptores

ionotrpicos glutamatrgicos no NTS caudal no estariam envolvidos no

processamento sinptico das respostas cardiovasculares e respiratrias decorrentes

da ativao do quimiorreflexo deixando, desta forma, em aberto a possvel

participao de outros neurotransmissores presentes na regio do NTS na

modulao destas respostas.

Baseado em evidncias da literatura indicando o ATP como um importante

neurotransmissor na regio do NTS (Phillis e cols., 1977, Scislo e cols. 1997 e 1998;

Scislo e OLeary, 1998), experimentos foram realizados no nosso laboratrio, no sentido

de caracterizar a possvel participao dos receptores purinrgicos na

neurotransmisso das respostas cardiovasculares e ventilatrias decorrentes da

ativao do quimiorreflexo no NTS de ratos. Neste sentido, de Paula e cols. (2004) e

Antunes e cols. (2005a) observaram que a microinjeo unilateral de ATP no NTS

caudal de ratos no-anestesiados promoveu aumento da presso arterial, bradicardia e

aumento da fR, um perfil de respostas muito semelhante aquele promovido pela

ativao do quimiorreflexo, sugerindo a participao desta purina na neurotransmisso

das vias neurais envolvidas nas respostas cardiorespiratrias decorrentes da ativao

Introduo 25

dos quimiorreceptores perifricos. Entretanto, em estudos posteriores realizados por

Braccialli e cols. (2008), os quais investigaram a possvel participao dos receptores

purinrgicos no NTS caudal de ratos no-anestesiados nas respostas cardiovasculares

e ventilatrias decorrentes da ativao do quimiorreflexo, os autores observaram que a

administrao de PPADS (antagonista dos receptores ionotrpicos purinrgicos),

bilateralmente no NTS caudal de ratos no-anestesiados, no promoveu alteraes

significativas nas respostas cardiorrespiratrias do quimiorreflexo

Considerando que o antagonismo seletivo dos receptores ionotrpicos

glutamatrgicos (cido quinurnico) e dos receptores purinrgicos (PPADS), no NTS

de ratos no-anestesiados, no promoveu alteraes significativas nas respostas

cardiorespiratrias decorrentes da ativao do quimiorreflexo, Braga e cols. (2007)

realizaram o duplo bloqueio simultneo dos receptores ionotrpicos glutamatrgicos

(cido quinurnico) e purinrgicos (PPADS) no NTS caudal com o objetivo de avaliar

a possibilidade de que a neurotransmisso dos componentes autonmicos e

respiratrios do quimiorreflexo poderia envolver uma participao conjunta do ATP e

do L-glutamato. Neste estudo, os autores observaram que a administrao

simultnea do cido quinurnico e PPADS no NTS caudal promoveu uma atenuao

significativa do componente simpato-excitatrio do quimiorreflexo, porm a resposta

de aumento da fR promovida pela estimulao desse reflexo no foi alterada tanto

em animais no-anestesiados quanto na preparao corao-tronco-cerebral

isolados (CTCI), sugerindo que a neurotransmisso do componente respiratrio do

quimiorreflexo no NTS caudal no seria mediada pelos receptores ionotrpicos

glutamatrgicos e purinrgicos.

O conjunto de resultados descritos anteriormente sugere que outros

neurotransmissores possam estar envolvidos na ativao do componente

Introduo 26

respiratrio do quimiorreflexo no NTS. Uma grande diversidade de

neurotransmissores e/ou neuromoduladores encontrada na regio do NTS. O

xdo ntrico (NO), por sua vez, tem se destacado como um neuromodulador de

particular interesse, uma vez que existem evidncias experimentais indicando que

esta molcula esta presente e desempenha um importante papel em diferentes

reas do SNC, incluindo o NTS (Lewis e cols., 1991a; 1991b; Zanzinger e cols.,

1995; Lin e cols., 1998; 1999; Lin e cols., 2000; Pajolla e cols., 2009). Estudos de

imunoshistoqumica demonstraram a presena de discretas populaes de

neurnios no NTS contendo a enzima NO sintase [NOS, enzima responsvel pela

sntese de NO (Ohta e cols., 1993; Lin e cols., 2007)], enquanto estudos funcionais

evidenciaram o envolvimento do NO no controle autonmico e respiratrio basal no

NTS (Tseng e cols., 1996; Vitagliano e cols., 1996; Matsumura e cols., 1998). Alm

disso, existem evidncias indicando a participao de mecanismos nitrrgicos no

processamento sinptico das vias neurais dos reflexos cardiovasculares no NTS

(Machado and Bonagamba, 1992a; Hines e Mifflin, 1997; Dias e cols., 2005). Em

concordncia com esses achados, Lewis e cols. (1991a) estudaram a possvel

participao do NO na neurotransmisso do reflexo cardiopulmonar no NTS de ratos

anestesiados e mostraram que as respostas de bradicardia e hipotenso

decorrentes da ativao do reflexo cardiopulmonar foram reduzidas pela prvia

microinjeo bilateral no NTS de Azul de Metileno, um inibidor da enzima Guanilato

Ciclase (GC). Considerando que os efeitos NO podem envolver a ativao da

enzima GC (Lewis e cols., 1991b), os estudos de Lewis e cols. (1991a) sugeriram

que o NO participaria da neurotransmisso e/ou neuromodulao do reflexo

cardiopulmonar no NTS de ratos anestesiados.

Introduo 27

No que diz respeito hipxia, trabalhos de Ogawa e cols. (1995) e Gozal e

cols. (1997) mostraram que durante a hipxia aguda em ratos no-anestesiados e

anestesiados, respectivamente, ocorreu um aumento na concentrao de NO no

NTS destes animais, sugerindo um possvel envolvimento de mecanismos

nitrrgicos na neurotrasmisso e/ou neuromodulao do quimiorreflexo no NTS.

Alm disso, os estudos de Ogawa e cols. (1995) demonstraram que a microinjeo

unilateral do L-NMMA, um inibidor no-seletivo da NOS, no NTS caudal de ratos

no-anestesiados promoveu uma reduo significativa no aumento do volume

corrente (VT) em resposta ativao do quimiorreflexo, sugerindo que o NO no NTS

caudal exerce um papel excitatrio na resposta ventilatria hipxia. Em

concordncia com esses achados, trabalhos de Haxhiu e cols. (1995), ao realizarem

experimentos em gatos anestesiados, demonstraram que o pr-tratamento crnico

com L-NAME, um inibidor no-seletivo da NOS, produziu uma reduo significativa

no aumento da freqncia de disparos do nervo frnico em resposta hipxia.

Embora a participao de mecanismos nitrrgicos nas respostas ventilatrias

hipxia tenha sido avaliada por diferentes estudos da literatura (Patel et al., 1998; Gozal

et al., 1997; Gozal, 1998; Kline e cols., 1998; Gozal et al., 2000), nenhum estudo

anterior investigou a possvel participao do NO nas alteraes agudas das respostas

cardiovasculares e respiratrias decorrentes da hipxia-hipxica em ratos no-

anestesiados. Tendo em vista essas evidncias anteriores, ns levantamos a hiptese

de que a inibio da sntese de NO no NTS caudal de ratos no-anestesiados

promoveria uma atenuao significativa nas respostas autonmicas e respiratria

ativao do quimiorreflexo. Neste contexto, um dos principais objetivos do presente

estudo foi avaliar os possveis efeitos da administrao bilateral de diferentes inibidores

da NOS (no-seletivo e seletivo) no NTS caudal de ratos no-anestesiados nas

Introduo 28

respostas cardiovasculares e respiratria promovidas pela ativao do quimiorreflexo

com KCN em ratos no-anestesiados, principalmente no que diz respeito ao

componente respiratrio, uma vez que esta resposta no foi afetada pelo antagonismo

dos receptores ionotrpicos glutamatrgicos e purinrgicos.

Os efeitos do NO centralmente podem envolver a ativao de receptores

purinrgicos, uma vez que estudos existentes na literatura sugerem uma possvel

interao entre ATP e NO no SNC (Florenzano e cols., 2008). Nesse sentido, Yao e

cols. (2003) mostraram por meio de estudos de imunofluorescncia a co-localizao

de receptores purinrgicos da subclasse P2Y (seletivos para o ATP) e da enzima

NOS em diferentes reas do crebro, como por exemplo, hipocampo, hipotlamo

dorsomedial e amgdala. Alm disso, estudo in vitro realizado por Reiser (1995)

mostrou que a ativao de receptores purinrgicos com ATP promoveu um aumento

significativo na formao de NO em clulas neuronais, sugerindo que o NO e o ATP

possam atuar como co-transmissores. Estudos funcionais tambm reforam a idia

de interao entre ATP e NO no SNC, uma vez que a ativao de receptores

purinrgicos exerce importante papel nas funes neuronais envolvendo a

modulao do NO (Kittner et al., 2003, 2006; Seidel et al., 2006). Considerando os

estudos existentes na literatura indicando a interao entre ATP e NO no SNC e as

evidncias experimentais obtidas em nosso laboratrio sugerindo a participao do

ATP na neurotransmisso do componente simpato-excitatrio do quimiorreflexo no

NTS, no presente estudo avaliamos os possveis efeitos da inibio da NOS

neuronal nas respostas cardiovasculares e respiratrias decorrentes da microinjeo

unilateral de ATP no NTS caudal de ratos no-anestesiados.

2. OBJETIVOS

Objetivos 30

Avaliar a possvel participao de mecanismos nitrrgicos na

neurotransmisso ou neuromodulao das respostas cardiovasculares e

respiratria ativao do quimiorreflexo no NTS caudal de ratos no-

anestesiados;

Avaliar a possvel interao entre mecanismos nitrrgicos e purinrgicos no

NTS caudal de ratos no anestesiados.

3. MATERIAL E MTODOS

Material e Mtodos 32

3.1. Animais

Neste estudo utilizamos ratos Wistar, com peso entre 300 e 340 gramas. Os

animais foram fornecidos pelo Biotrio Central do Campus da USP de Ribeiro Preto

e mantidos em caixas individuais, em ambiente climatizado com temperatura mdia

de 22C, ciclo de claro e escuro de 12 horas, alimentados com rao granulada e

gua ad-libitum. Todos os procedimentos cirrgicos e experimentais foram

conduzidos de acordo com as normas e princpios ticos de experimentao em

animais de laboratrio estabelecidos pelo Comit Brasileiro de Experimentao

Animal (COBEA) e aprovados pelo Comit de tica em Experimentao Animal da

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto - USP (Protocolo n: 104/2005).

3.2. Grupo de Animais

Os ratos foram separados em cinco grupos. Em trs grupos foi realizado o

protocolo de ativao do quimiorreflexo antes e aps as microinjees bilaterais de

inibidores da NOS (no-seletivo ou seletivo) ou do veculo no NTS comissural

caudal. Em dois grupos de animais foi realizado o protocolo de microinjeo

unilateral de ATP no NTS comissural caudal antes e aps a microinjeo unilateral

do inibidor seletivo da NOS neuronal ou do veculo no mesmo stio.

3.3. Implante de cnulas-guia dirigidas para o NTS comissural caudal

Utilizando-se um aparelho estereotxico (David-Kopf, Tujunga, CA, EUA),

cnulas-guia foram implantadas bilateralmente em direo regio do ncleo do


trato solitrio (NTS) comissural caudal de acordo com a tcnica descrita por Michelini

e Bonagamba (1988). Cnulas de ao inoxidvel (15 mm de comprimento)

confeccionadas a partir de agulhas hipodrmicas (27 x 0,7 mm) foram fixadas no

suporte da torre do estereotxico. Para os procedimentos cirrgicos os animais

foram anestesiados com tribromoetanol [250 mg/Kg, i.p. (Aldrich Chemical Co. Inc.,

Milwaukee, EUA)], depilados na regio dorsal da cabea, e colocados no aparelho

estereotxico, onde a cabea do animal foi colocada na posio plana e fixada por

meio de duas barras auriculares do aparelho estereotxico. A seguir foi injetado,

subcutneamente, um anestsico local com vasoconstritor (cloridrato de lidocana a

3% com bitartarato de norepinefrina 1:50.000), na regio superior da cabea a ser

aberta, a fim de minimizar o sangramento aps a inciso cirrgica. Logo aps a

assepsia criteriosa da pele com soluo de lcool iodado, foi feita uma inciso

longitudinal na pele e tecido celular subcutneo, expondo-se a regio da calota

craniana, a qual foi posteriormente tratada com soluo fisiolgica e gua

oxigenada, a fim de realizar a completa assepsia da rea. A torre do estereotxico

foi colocada na posio vertical (angulao zero) e a cabea do animal ajustada at

que os pontos da suturas sagitais (bregma) e occiptal (lambda) da calota craniana

ficassem no mesmo nvel horizontal e, ento, foram feitas as leituras dos parmetros

ntero-posterior (AP), lateral (L) e dorso-ventral (DV) a partir do bregma. Uma vez

determinado o ponto de introduo da cnula-guia, foi feita a trepanao da calota

craniana com o auxlio de uma broca odontolgica esfrica acoplada a um motor de

baixa rotao. Por esse orifcio foram introduzidas as cnulas bilateralmente, cuja

extremidade inferior das mesmas ficaram cerca de 1 mm acima da superfcie dorsal

do tronco cerebral. A localizao desta extremidade foi feita a partir de parmetros

previamente estabelecidos em nosso laboratrio juntamente com o auxlio das


coordenadas estereotxicas do Atlas de Paxinos e Watson (2007) [AP = -15,2 mm

em relao ao bregma; L = 0,5 mm da linha mdia; DV = -8,2 mm ventral

superfcie do osso]. Posteriormente, essas cnulas foram fixadas ao crnio com

resina acrlica de uso odontolgico (Simplex, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e ancoradas

por pequenos parafusos de ao inoxidvel, previamente fixados na calota craniana.

Aps a completa fixao das cnulas, a torre do estereotxico foi removida e com o

objetivo de se evitar a obstruo das cnulas-guia introduzimos, nas mesmas,

oclusores (15 mm) tambm de ao inoxidvel, os quais foram mantidos at a

realizao dos experimentos. O animal foi retirado do aparelho estereotxico e,

como medida profiltica ps-cirrgica, foram injetados 0,3 mL de Pentabitico

Veterinrio de amplo-espectro (associao de penicilina e estreptomicina, 1.200.000

UI, Fort Dodge, Campinas, SP, Brasil) por via intramuscular. Em seguida os animais

foram colocados em caixas individuais, com gua e rao ad-libitum e mantidos em

salas com temperatura, umidade e luminosidade controladas, por um perodo de 3 a

4 dias.

3.4. Microinjees de drogas no NTS comissural caudal

As drogas utilizadas nesse estudo foram dissolvidas em soluo fisiolgica

estril [NaCl 154 mM (0,9 %)] e foram manualmente microinjetadas no NTS

comissural caudal utilizando-se de uma seringa Hamilton de 1 L (Hamilton, Reno,

NV), conectada por meio de um tubo de polietileno PE-10 a uma agulha injetora (33

gauge) 1,5 mm mais longa que a cnula-guia, a fim de que as microinjees

atingissem diretamente o NTS. O volume microinjetado no NTS foi sempre de 50 nL,

com a durao da microinjeo de aproximadamente 5 segundos. O pH das

solues foi determinado por meio do indicador de pH (Spezialindikator, pH 6.0


8.0, Merck, Darmstadt, Germany) e ajustado com bicarbonato de sdio (Reagen, Rio

de Janeiro, RJ, Brasil) para valores prximos a 7,4.

3.5. Canulao da artria e veia femoral

Na vspera dos experimentos, os animais foram anestesiados com

tribromoetanol [250 mg/Kg, i.p. (Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, EUA)] e

submetidos ao implante cirrgico de cnulas de polietileno. As cnulas utilizadas

foram confeccionadas a partir de um tubo de polietileno (PE-10) (Clay Adams,

Parsipanny, NJ, EUA) de 4 a 5 cm soldado a um outro tubo de polietileno (PE-50)

com comprimento ajustado (aproximadamente 18 cm) de acordo com o tamanho do

animal. Antes de serem implantadas, as cnulas foram preenchidas com soluo

fisiolgica e obstrudas na extremidade livre do PE-50 com pinos de metal.

Os animais submetidos ao protocolo de ativao do quimiorreflexo receberam

duas cnulas: 1) a cnula arterial, a qual foi introduzida em direo da aorta

abdominal, via arterial femoral, e 2) a cnula venosa, a qual foi introduzida na veia

femoral. Uma vez implantadas, nos respectivos vasos, as cnulas foram

exteriorizadas na regio escapular dorsal do rato com o auxlio de um trocater, onde

foram fixadas com linha de sutura. A cnula arterial foi utilizada para registro direto

de presso arterial (PA) e freqncia cardaca (FC) e cnula venosa para a

administrao sistmica de drogas. Os animais submetidos ao protocolo de

microinjeo unilateral de ATP no NTS comissural caudal receberam apenas uma

cnula arterial.


3.6. Estimulao dos quimiorreceptores perifricos

No presente estudo, a estimulao dos quimiorreceptores perifricos em ratos

no-anestesiados foi realizada de acordo com mtodo descrito por Franchini e

Krieger (1992). Para tanto, utilizamos uma soluo de cianeto de potssio (KCN) em

uma concentrao nica de 40 g/0,1 mL/rato, a qual foi administrada atravs da

cnula previamente implantada na veia femoral acoplada a uma cnula extensora

constituda de um tubo de polietileno (P-50) com volume interno de

aproximadamente 0,2 mL. O uso desta cnula extensora visou proporcionar ao

animal o mnimo de estresse possvel, visto que a mesma nos possibilitou

administrar drogas, com o animal dentro da cmara pletismogrfica, sem que fosse

necessrio um contato muito prximo.

O KCN uma droga capaz de estimular o quimiorreflexo e isto se d devido a

sua interferncia na utilizao do oxignio pelos tecidos, pois inibe a ao da enzima

citocromo-oxidase da cadeia respiratria. Desta feita, produz-se um dficit

energtico celular associado indisponibilidade de oxignio, promovendo hipxia

citotxica, levando, portanto, ativao dos quimiorreceptores perifricos (Biscoe e

cols., 1969). Vale destacar que a dose de KCN (40 g/0,1 mL), utilizada no presente

estudo, tem seus efeitos restritos s clulas quimiossensveis localizadas nos

corpsculos carotdeos, uma vez que no estudo realizado por Barros e cols. (2002),

os autores observaram que as respostas cardiovasculares e respiratrias

decorrentes da administrao intravenosa de KCN (40 g/0,1 mL), em ratos no-

anestesiados, foram abolidas aps a remoo dos corpsculos carotdeos.


3.7. Registro da presso arterial e da freqncia cardaca

O registro da presso arterial foi realizado em animais no-anestesiados no

dia seguinte ao das canulaes da artria e veia femoral. Realizamos estes registros

por meio de uma cnula arterial, previamente heparinizada, conectada a um

transdutor mecanoeltrico de presso (MLT 844, ADInstruments, Power Lab, Bella

Vista, NSW, Australia), cujo sinal foi devidamente amplificado, digitalizado atravs de

uma interface analgico/digital a uma freqncia de 1000 Hz em um

microcomputador equipado com um software apropriado (ChartTM Pro,

ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia), para anlise posterior. A PAM e FC

foram derivadas da PAP por meio deste sistema de aquisio.

3.8. Registro da ventilao e anlise de dados

Os parmetros ventilatrios foram medidos pelo mtodo pletismografia de

corpo inteiro para pequenos animais descrito por Bartlett e Tenney (1970). O

procedimento consiste na colocao do animal em uma cmara rgida vedada

entrada de gases (figura 1). Para o clculo dos parmetros ventilatrios foram

consideradas as oscilaes de presso no interior da cmara em decorrncia da

diferena de temperatura entre o gs inspirado (25C) e o gs expirado (37C).

Durante a realizao de cada medida de ventilao, a cmara do animal

permaneceu totalmente vedada por curtos perodos de tempo (~2 min) e os sinais

gerados pelas oscilaes de presso causadas pela respirao do animal foram

captados por um dispositivo conectado cmara que contm um transdutor de

presso diferencial de alta sensibilidade (ML141 Spirometer, PowerLab,


ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia). O software de aquisio de dados

(PowerLab, ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia) amplifica os sinais captados

pelo transdutor e quantifica a amplitude e a freqncia dos sinais respiratrios.

Dessa forma, o registro nos permite calcular, o volume corrente (VT) e a freqncia

respiratria (fR) do animal. No presente estudo, os parmetros ventilatrios avaliados

foram a fR, o VT e a ventilao minuto (VE).

Figura 1: Mtodo de pletismografica de corpo inteiro. Foto de um animal no-anestesiado, no dia do experimento, dentro de uma cmara pletismogrfica de corpo inteiro.

3.8.1. Anlise da freqncia respiratria

Embora o clculo da fR, possa ser realizado por meio do software de

aquisio de dados (PowerLab, ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia), no

presente estudo, em todos os protocolos experimentais, o clculo da fR foi

realizado manualmente. A abordagem manual se fez necessria, no sentido de

garantir a anlise correta dos registros respiratrios, uma vez que, a


movimentao natural do animal, o qual se encontra acordado durante a

realizao do experimento e a resposta comportamental de explorao do

ambiente produzida pela ativao do quimiorreflexo com KCN (Franchini e

Krieger, 1993) poderiam interferir na captao e anlise dos registros.

A figura 2 ilustra o critrio utilizado no presente estudo para a quantificao

da fR frente ativao do quimiorreflexo com KCN em ratos no-anestesiados.

Durante a realizao dos protocolos experimentais, as oscilaes de presso

produzidas pela respirao do rato foram registradas durante 20 segundos antes

e 20 segundos aps a injeo intravenosa de KCN (figura 2, painel A). A

quantificao da fR frente ativao do quimiorreflexo foi feita manualmente a

cada intervalo de 2 segundos e o nmero de ciclos obtidos neste perodo foi

multiplicado por 30 (figura 2, painis B1 e B2), com o objetivo de expressar o

nmero de ciclos por minuto (cpm). Finalmente, a fR foi representada

graficamente a cada intervalo de 2 segundos durante 20 segundos antes e 20

segundos aps a administrao de KCN, permitindo a observao da sua

variao nesse perodo de tempo (figura 2, painel B).

A quantificao da fR frente microinjeo de ATP no NTS comissural

caudal de ratos no-anestesiados tambm foi avaliada a cada 2 segundos

durante 20 segundos antes e 20 segundos aps a microinjeo de ATP,

utilizando-se o mesmo critrio adotado aos animais submetidos ao protocolo de

ativao do quimiorreflexo.


VE (mL.Kg-1.min-1) = VT (mL.Kg-1) x fR (cpm)

VT = Vk x PT x Tc (PB - PA)Pk Tc (PB - PA) - TA (PB - PC)

3.8.2. Anlise do volume corrente e da ventilao minuto nos animais

submetidos ao protocolo de microinjeo unilateral de ATP no NTS caudal

A quantificao dos parmetros ventilatrios VT e VE dos animais foram feitas

a partir das equaes citadas abaixo (Drorbaugh e Fenn, 1955). A calibrao do

volume foi obtida durante cada experimento, injetando-se um volume conhecido de

ar (1mL) dentro da cmara do animal com o uso de uma seringa graduada.

Onde:

VK: Volume de ar injetado na cmara do animal para calibrao;

PT: Deflexo de presso associada com cada volume de ar corrente;

PK: Deflexo de presso associada com cada volume de ar injetado para

calibrao,

TC: Temperatura corporal;

TA: Temperatura do ar dentro da cmara do animal;

PB: Presso baromtrica;

PC: Presso de vapor dgua temperatura corporal;

PA: Presso de vapor dgua temperatura da cmara.

Durante a realizao de todos os experimentos de medida do VT e VE, as

temperaturas da cmara pletismogrfica e da sala de experimentos foram

constantemente monitoradas. Os parmetros ventilatrios VT e VE foram

quantificados durante 20 segundos antes e 20 segundos aps a microinjeo de


ATP no NTS comissural caudal de ratos no-anestesiados e representados

graficamente a cada intervalo de 2 segundos, permitindo a observao de suas

variaes ao longo do tempo. Entretanto, o VT e o VE dos animais submetidos ao

protocolo de ativao do quimiorreflexo no foram calculados, uma vez que a injeo

de KCN promove uma exuberante resposta comportamental (Franchini e Krieger,

1993), com conseqente aumento na linha de base do sinal respiratrio. De acordo

com estudos de Mortola and Frappel (1998), para uma anlise confivel do VT e da

VE, o animal deve estar quieto durante a captao dos registros respiratrios, uma

vez que a atividade muscular e a compresso pulmonar e/ou de gases

gastrointestinais em decorrncia da locomoo do animal podem modificar a

presso da cmara alterando o sinal gerado pela respirao. Deste modo, no

protocolo de ativao do quimiorreflexo, a cmara pletismogrfica dos animais no

foi calibrada para medidas da ventilao e apenas a fR dos animais foi avaliada.

Como citado anteriormente, o sistema de pletismografia de corpo inteiro para

registro dos parmetros ventilatrios apresenta limitaes, uma vez que a movimentao

do animal pode interferir na captao e anlise dos ciclos respiratrios. Neste sentido, os

animais considerados neste trabalho foram previamente adaptados ao sistema de

plestimografia, e aqueles animais que no apresentaram condies adequadas para a

experimentao, os quais apresentavam-se estressados e com valores

cardiorespiratrios basais dbios foram desconsiderados, no sentido de garantir a anlise

correta dos registros. No presente estudo, os registros ventilatrios em condies basais

foram feitos em todos os grupos experimentais, apresentando valores mdios: (fR: 9610

cpm), (VT: 5,90,6 mL.Kg-1), (VE: 556110 mL.Kg-1.min-1), os quais correspondem aos

valores ventilatrios basais de ratos no-anestesiados observados em estudos prvios da

literatura (Mauad e cols., 1992; Machado e cols., 1992; Braccialli e cols., 2008).


Figura 2: Representao esquemtica da quantificao da freqncia respiratria em ratos no-anestesiados submetidos ativao do quimiorreflexo com KCN (40g/0,1mL). Painel A: Registros das oscilaes de presso pletismogrficas produzidas pela respirao de um rato, representativo do grupo, mostrando as alteraes respiratrias 20 segundos antes e 20 segundos aps a ativao do quimiorreflexo com KCN (40g/0,1mL). Painis A1 e A2 so exemplos destes registros respiratrios em uma escala expandida de tempo (2 segundos). Painel B: Grfico mostrando os nmeros de ciclos por minuto, quantificados a cada 2 segundos, 20 segundos antes e 20 segundos aps a administrao de KCN. Cada ponto deste grfico corresponde ao nmero de ciclos quantificados no intervalo de tempo de 2 segundos multiplicado por 30 (Painis B1 e B2), com o objetivo de expressar o nmero de ciclos por minuto.


3.9. Registros simultneos da presso arterial, freqncia cardaca e ventilao

No presente trabalho, utilizamos a tcnica de pletismografia de corpo inteiro

em animais no-anestesiados, a qual possibilita o registro simultneo dos

parmetros cardiovasculares e das oscilaes de presso decorrentes da respirao

do animal e permite um estudo fisiolgico integrado dos diferentes parmetros

autonmicos e ventilatrios, dentre os quais podemos destacar a presso arterial, a

freqncia cardaca e a freqncia respiratria. Desta forma, a utilizao do mtodo

de pletismografia de corpo inteiro possibilita uma avaliao completa desses

parmetros em situaes basais e em resposta ativao do quimiorreflexo ou

microinjees no NTS.

Neste contexto, todos os experimentos foram realizados com os animais no-

anestesiados dentro da cmara pletismogrfica de corpo inteiro conforme

demonstrado na figura 1. Para tanto, no dia seguinte aos procedimentos cirrgicos,

sem o efeito indesejvel da anestesia, os animais foram colocados dentro da cmara

pletismogrfica pelo menos 30 minutos antes do incio dos experimentos, para

ambientao. Durante esse perodo a cmara permanecia aberta, permitindo o livre

fluxo de ar entre o interior e exterior da cmara. Aps a ambientao do animal, as

cnulas arterial e venosa, previamente implantadas, foram exteriorizadas atravs de

um pequeno orifcio existente na tampa da cmara, o qual foi posteriormente ocludo

com vaselina. A cnula arterial foi conectada a um transdutor de presso e um dos

orifcios da cmara pletismogrfica foi conectado ao transdutor das variaes de

presso pletismogrficas, utilizado para a quantificao dos parmetros ventilatrios.

Os dois transdutores estavam acoplados a um mesmo sistema de aquisio,


permitindo o registro simultneo das alteraes cardiovasculares e ventilatrias aps

o fechamento da cmara.

Durante a realizao dos protocolos experimentais, a cmara pletismogrfica

permaneceu fechada por no mximo 2 minutos e nos intervalos entre as ativaes

do quimiorreflexo ou entre as microinjees de ATP no NTS comissural caudal, a

cmara foi aberta permitindo a completa troca do ar. Nos experimentos de ativao

do quimiorreflexo, foram feitas injees intravenosas de KCN por meio da cnula

venosa conectada a uma extenso de polietileno (PE-50), a qual foi previamente

exteriorizada atravs do orifcio na parte superior da tampa da cmara

pletismogrfica. Nos experimentos de microinjeo de ATP no NTS, a extenso de

PE-10 conectando a seringa (Hamilton, 1 L) agulha injetora tambm foi

previamente exteriorizada atravs do orifcio na parte superior da tampa da cmara

pletismogrfica e posteriormente a agulha injetora usada para as microinjees de

drogas no NTS foi conectada cnula-guia na cabea do animal. Estes

procedimentos permitiram a ativao do quimiorreflexo e/ou a microinjeo de ATP

no NTS caudal de ratos no-anestesiados, com os animais dentro da cmara

pletismogrfica fechada, possibilitando, assim, o registro simultneo dos parmetros

cardiovasculares e ventilatrios durante os procedimentos de ativao ou

microinjeo. Durante as microinjees dos inibidores da NOS (seletivo e no-

seletivo) ou do veculo (salina) apenas os registros cardiovasculares foram captados,

uma vez que estes procedimentos foram realizados com a cmara pletismogrfica

aberta.


3.10. Solues e drogas utilizadas

Soluo Fisiolgica estril [NaCl 154 mM; (0,9%) veculo.

Bicarbonato de sdio (utilizado para ajustar o pH das solues, 30 - 50 g),

Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

2,2,2-tribromoetanol (anestsico, 250 mg/Kg i.p), Aldrich Chemical Co. Inc.,

Milwaukee, EUA.

Tionembutal (anestsico, 50 mg/Kg, i.p), Abott, EUA.

Cianeto de Potssio (KCN, inibidor da enzima citocromo oxidase; 40 g/0,1

mL, i.v), Merk, Darmstadt, Alemanha. A dose de KCN utilizada foi baseada no

trabalho de Haibara e cols., (1995).

NG-nitro-L-arginine methyl ester [(L-NAME, inibidor no-seletivo da xido

ntrico sintase (NOS); 200 nmoles/50 nL], Sigma Chemical, St Louis MO. A

dose de L-NAME utilizada foi baseada no trabalho de Hines e Mifflin (1997).

N-Propyl-L-arginina [N-PLA, inibidor seletivo da xido ntrico sintase

neuronal (nNOS); 3 pmoles/50 nL], Tocris, Ellisvilee, MO, USA. A dose de N-

PLA utilizada foi baseada no trabalho de Zang e cols., (1997).

Adenosina 5-trifosfato dissdico (agonista dos receptors P2 do ATP; 1,25

nmoles/50 nL), RBI, Natick, MA, EUA. A dose de ATP utilizada foi baseada no

trabalho de de Paula e cols., (2004).


3.11. Histologia

Ao trmino dos protocolos experimentais foram realizadas microinjees

bilaterais do corante azul de Evans (2%) (Vetec, Qumica Fina Ltda, Rio de Janeiro,

RJ, Brasil) nos mesmos stios de microinjees bilaterais de L-NAME, N-PLA ou

salina. Os animais submetidos ao protocolo de microinjeo unilateral de ATP

receberam microinjees unilaterais, do corante azul de Evans (2%), no lado que

apresentou respostas a microinjeo de ATP. Em todos os animais, as microinjees

do corante foram realizadas no volume de 50 nL, a fim de determinar o stio

especfico da microinjeo no NTS. A seguir, os animais foram anestesiados com

Tionembutal (50 mg/kg) e submetidos abertura da regio torcica para a exposio

do corao, o qual foi perfundido com soluo fisiolgica (NaCl, 0,9%), seguido de

soluo de formol (10%) tamponada. Para facilitar a perfuso cerebral bloqueamos a

aorta descendente com pina hemosttica e a cava superior foi seccionada. O

crebro foi removido e fixado em formol (10%) por 48 horas. A seguir, o tronco

cerebral foi includo em bloco de parafina e seccionado transversalmente, por meio

de um micrtomo, em fatias de 15 m de espessura. Os cortes histolgicos foram

fixados e corados utilizando-se o mtodo de Nissl. A extenso das reas atingidas

pela microinjeo no NTS foi verificada em anlise microscpica por meio de

comparaes das seces com o atlas estereotxico de Paxinos & Watson (2007).

Na anlise dos resultados, apenas os animais que apresentaram os centros da

microinjees localizados no NTS comissural caudal foram considerados como

tendo histologia positiva. Os animais, os quais apresentaram os centros das

microinjees localizados fora do NTS comissural caudal foram analisados como


histologia negativa (grupo fora do NTS caudal) e foram considerados como controle

negativo.

Os animais que no apresentaram respostas cardiovasculares e respiratria

consistentes ativao do quimiorreflexo com KCN no foram submetidos aos

protocolos experimentais e foram sacrificados com overdose de Tionembutal (50

mg/kg).

3.12. Anlise estatstica dos resultados

Os resultados apresentados esto expressos como mdia erro padro da

mdia (EPM). Para anlise estatstica, os parmetros cardiovasculares basais (PA e

FC) foram analisados imediatamente antes das ativaes do quimiorreflexo ou das

microinjees de ATP no NTS caudal e comparados com os respectivos tempos e

grupos controles determinados em cada protocolo experimental. Para anlise

estatstica dos parmetros ventilatrios (fR, VT e VE) basais, consideramos a mdia

dos 10 pontos obtidos (a cada 2 segundos) antes das administraes de KCN ou

das microinjees de ATP. A magnitude das respostas cardiovasculares e

ventilatrias frente ativao do quimiorreflexo ou microinjeo de ATP no NTS

comissural caudal foram analisadas no pico mximo das respostas. Aos dados

obtidos foi aplicada anlise de varincia para medidas repetidas (ANOVA-Two-way)

e quando houve significncia utilizamos o ps-teste de Tukey ou Dunnet pareado

para mltiplas comparaes. A anlise das mdias individuais entre os grupos L-

NAME e N-PLA foi feita pelo test-t de Student no-pareado. O nvel de significncia

adotado foi sempre de p < 0,05.


3.13. Protocolos Experimentais

3.13.1 Respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo

com KCN em ratos no-anestesiados antes e aps as microinjees bilaterais

no NTS comissural caudal do inibidor no-seletivo da NOS (L-NAME) ou do

veculo (salina).

A realizao desse protocolo experimental teve como objetivo avaliar a

possvel participao do NO diretamente no NTS comissural caudal nas respostas

cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo. Para tanto, no dia do

experimento, sem o efeito indesejvel do anestsico, o animal foi colocado dentro da

cmara pletismogrfica para adaptao s novas condies ambientais durante um

perodo de 30-60 min. Aps este perodo de adaptao inicial, a cmara

pletismogrfica foi fechada permitindo os registros simultneos dos parmetros

cardiovasculares e ventilatrios basais. Em seguida, a cmara pletismogrfica foi

aberta e foi realizado o procedimento de identificao funcional do NTS caudal, o

qual consistiu da microinjeo de L-glutamato (1 nmole/50 nL) no NTS caudal

utilizando-se injetoras de diferentes comprimentos (16.0 - 16.6 mm), at se obter

uma resposta cardiovascular tpica microinjeo de L-glutamato no NTS caudal de

ratos no anestesiados (Machado e Bonagamba, 1992b). Aps este procedimento

de identificao funcional do NTS caudal e estabilizao dos registros

cardiovasculares e respiratrios, a cmara pletismogrfica foi fechada e realizamos a

ativao do quimiorreflexo com KCN na concentrao nica de 40 g/0,1 mL, por via

intravenosa e obtivemos respostas controles. As ativaes do quimiorreflexo foram

realizadas at que tivssemos duas respostas subseqentes semelhantes, com


intervalos de 10 minutos entre elas, e a ltima resposta foi tomada como dado para a

anlise estatstica. Dez minutos aps a ltima ativao controle do quimiorreflexo, os

animais receberam microinjees bilaterais do inibidor no-seletivo da NOS (L-

NAME) e realizamos novamente ativaes do quimiorreflexo aos 5, 10 e 30 minutos

aps as microinjees de L-NAME. Nos animais do grupo controle, foi desenvolvido

um protocolo similar substituindo-se o L-NAME pelo seu veculo (salina, 50 nL). A

magnitude das respostas cardiovasculares e ventilatria decorrentes da ativao do

quimiorreflexo foram comparadas com as respostas controle por meio de testes

estatsticos previamente descritos.

3.13.2. Respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo

com KCN em ratos no-anestesiados antes e aps as microinjees bilaterais

no NTS comissural caudal do inibidor seletivo da NOS neuronal (N-PLA) ou do

veculo (salina).

A realizao desse protocolo experimental tem como objetivo avaliar a

possvel participao do NO produzido pela NOS neuronal (nNOS) no NTS

comissural caudal nas respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do

quimiorreflexo. Para tanto, no dia do experimento, foram realizados procedimentos

iguais aqueles descritos nos item anterior. Dez minutos aps a ltima ativao

controle do quimiorreflexo os animais receberam microinjees bilaterais do inibidor

seletivo da nNOS (N-PLA, 3 pmoles/50 nL) e realizamos novamente ativaes do

quimiorreflexo aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees do N-PLA. Nos animais

do grupo controle, foi desenvolvido um protocolo similar substituindo-se o N-PLA

pelo seu veculo (salina, 50 nL). A magnitude das respostas cardiovasculares e


ventilatria decorrentes da ativao do quimiorreflexo foram comparadas com as

respostas controle por meio de testes estatsticos previamente descritos.

3.13.3. Respostas cardiovasculares e ventilatrias microinjeo unilateral de

ATP (1,25 nmoles/50 nL) no NTS caudal de ratos no-anestesiados antes e

aps a microinjeo unilateral de N-PLA (3 pmoles/50 nL) ou do veculo (salina)

no mesmo stio

A realizao desse protocolo experimental teve como objetivo avaliar se as

respostas cardiovasculares e respiratrias promovidas pela ativao dos receptores

P2X e P2Y com ATP no NTS caudal de ratos no-anestesiados seriam alteradas

pela inibio da sntese do NO proveniente da nNOS. Para tanto, no dia do

experimento, sem o efeito indesejvel do anestsico, o animal foi colocado dentro da

cmara pletismogrfica para adaptao s novas condies ambientais durante um

perodo de 30-60 min. Aps este perodo de adaptao inicial, a cmara

pletismogrfica foi fechada permitindo os registros simultneos dos parmetros

cardiovasculares e ventilatrios basais. Em seguida, a cmara pletismogrfica foi

aberta e foi realizado o procedimento de identificao funcional do NTS caudal, o

qual consistiu da microinjeo de ATP (1,25 nmoles/50 nL) no NTS caudal

utilizando-se injetoras de diferentes comprimentos (16.0 - 16.6 mm), at se obter

uma resposta cardiovascular tpica microinjeo de ATP no NTS caudal de ratos

no anestesiados (de Paula e cols., 2004; Antunes e cols., 2005a). Aps este

procedimento de identificao funcional do NTS caudal, a cmara pletismogrfica foi

fechada e foram realizadas 2 microinjees controles de ATP no NTS caudal, com

intervalos de 10 minutos entre elas. Caso no houvesse semelhanas entre as


respostas cardiovasculares e respiratrias microinjeo unilateral de ATP, uma

terceira microinjeo era feita para que tivssemos pelo menos duas respostas

controles similares. Dez minutos aps a ltima microinjeo unilateral de ATP no

NTS caudal, os animais receberam uma microinjeo unilateral do N-PLA (3

pmoles/50 nL) no mesmo stio do NTS e aos 2, 5, 10, 15 e 30 minutos foram feitas

novas microinjees unilaterais de ATP. Nos animais do grupo controle, foi

desenvolvido um protocolo similar substituindo-se o N-PLA pelo seu veculo (salina,

50 nL). A magnitude das respostas cardiovasculares e ventilatrias decorrentes da

microinjeo unilateral de ATP foram comparadas com as respostas controle por

meio de testes estatsticos previamente descritos.

4. RESULTADOS

Resultados 53

4.1. Experimentos de ativao do quimiorreflexo em ratos no-anestesiados

Foram conduzidos experimentos de ativao do quimiorreflexo em ratos no-

anestesiados antes e aps as microinjees bilaterais de diferentes inibidores da

NOS (no-seletivo e seletivo) no NTS comissural caudal, com a finalidade de se

avaliar a possvel participao de mecanismos nitrrgicos no NTS comissural caudal

na modulao dos parmetros cardiovasculares e respiratrio basais e nas

respostas autonmicas e respiratrias decorrentes da ativao do quimiorreflexo.

Para tanto, foram considerados como tendo histologia positiva e inseridos na anlise

dos resultados um total de 22 animais, que foram divididos em 3 grupos: grupo L-

NAME bilateral NTS caudal (n=8); grupo N-PLA bilateral NTS caudal (n=7), grupo

salina bilateral NTS caudal (n=7). Alm disso, foram considerados como tendo

histologia negativa e inseridos na anlise dos resultados um total de 14 animais, que

foram divididos em 2 grupos: grupo L-NAME fora do NTS caudal (n=8); grupo N-PLA

fora do NTS caudal (n=6). Estes animais, cujos centros das microinjees foram

localizados em regies adjacentes ao NTS comissural caudal (dorsal e lateral),

foram considerados como controle negativo e foram analisados individualmente e

comparados com seus respectivos controles positivos.

A figura 3 apresenta traados de um rato, representativo do grupo, mostrando

os efeitos na PA, FC e na respirao de um animal no-anestesiado em condies

basais e no momento da ativao do quimiorreflexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v).

Como podemos observar, a ativao do quimiorreflexo em animais no-

anestesiados produz respostas de aumento na presso arterial e freqncia

respiratria e diminuio na freqncia cardaca. Os parmetros avaliados nos

grupos de animais submetidos ao protocolo de ativao do quimiorreflexo foram: a

presso arterial (PA), a freqncia cardaca (FC) e a freqncia respiratria (fR).

Resultados 54

Figura 3: Traados de um rato representativo dos grupos ilustrando os registros da freqncia cardaca (FC, bpm), presso arterial mdia (PAM, mmHg), presso arterial pulstil (PAP) e das oscilaes de presso decorrentes da respirao de um animal ( inspirao) antes (basal) e aps a ativao do quimiorreflexo com KCN (40 g/0,1mL). O momento da injeo intravenosa de KCN (40 g/0,1mL) indicado pela seta.

Resultados 55

4.1.1. Respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorreflexo com

KCN (40 g/0,1 mL, i.v) antes e aps as microinjees bilaterais de L-NAME (200

nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal de ratos no-anestesiados

A figura 4 apresenta traados de um rato no-anestesiado, representativo do

grupo, mostrando as alteraes na PAM basal em decorrncia das microinjees

bilaterais de L-NAME (200 nmoles/50nL) no NTS comissural caudal. Na figura 5

apresentado o conjunto das variaes na PAM e FC basais antes e aps as

microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal (n=8).

Como podemos observar no painel A da figura 5, as microinjees bilaterais do L-NAME

(200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal promoveram uma elevao significativa na

PAM basal aos 5 (1002 vs 1104 mmHg; p0,05). Ao final

destes experimentos, a mesma dose de L-NAME (200 nmoles/50 nL) microinjetada no

NTS comissural caudal foi administrada endovenosamente nos animais, com o objetivo

de avaliar os efeitos perifricos do L-NAME (i.v.) nos parmetros cardiovasculares

basais. No entanto, a administrao perifrica de L-NAME (200 nmoles/50 nL) no

promoveu alteraes significativas na PAM e FC basais dos animais.

Resultados 56

Figura 4: Efeitos das microinjees bilaterais do L-NAME no NTS comissural caudal sobre os parmetros cardiovasculares basais. Traados, de um animal no-anestesiado representativo do grupo, mostrando as alteraes na freqncia cardaca (FC), presso arterial mdia (PAM) e presso arterial pulstil (PAP) antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal.

Resultados 57

0

90

110

130

L-NAME bilateral NTS caudal (n=8)

SALINA bilateral NTS caudal (n=7)L-NAME fora NTS caudal (n=8)

A

PAM

(mm

Hg)

0

200

300

400B

CONTROLE 5 10 30 min

FC (b

pm)

Figura 5: Efeitos das microinjees bilaterais do L-NAME no NTS comissural caudal sobre os parmetros cardiovasculares basais. Presso arterial mdia basal (PAM, mmHg, painel A) e freqncia cardaca mdia basal (FC, bpm, painel B) antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) ou do veculo (salina, n=7) no NTS comissural caudal de ratos no-anestesiados; antes e aps as microinjees do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) fora do NTS caudal. *p < 0,05 comparado ao grupo salina; p < 0,05 comparado ao grupo L-NAME fora do NTS caudal.

Resultados 58

A figura 6 apresenta traados de um rato, representativo do grupo, mostrando

os efeitos cardiovasculares e respiratrios promovidos pela injeo de cianeto de

potssio (KCN, 40 g/0,1 mL, i.v.) antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as

microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal

de ratos no-anestesiados. Na figura 7 esto apresentados o conjunto dos

resultados das variaes na PAM e FC promovidas pela injeo de KCN (40 g/0,1

mL, i.v) antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees bilaterais do

L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal (n=8). Como podemos

observar nesta figura, as respostas pressoras (p>0,05; figura 7A) e bradicrdicas

(p>0,05; figura 7B) decorrentes da ativao do quimiorreflexo com KCN (40 g/0,1

mL, i.v) aps a administrao de L-NAME no foram estatisticamente diferentes em

relao s respostas controle. Microinjeces bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50

nL) em regies adjacentes ao NTS comissural caudal no promoveram alteraes

significativas nas respostas cardiovasculares frente ativao do quimiorreflexo

(n=8, p>0,05, figura 7). Da mesma forma, microinjees bilaterais do veculo (salina,

0,9%) no NTS comissural caudal no promoveram efeitos significativos em tais

parmetros cardiovasculares (n=7, figura 7; p>0,05).

Em todos os grupos experimentais, a cada ativao do quimiorreflexo, a fR dos

animais foi quantificada a cada 2 segundos durante 20 segundos antes e 20 segundos

aps a administrao de KCN, em condies basais (perodo controle) e aos 5, 10 e 30

minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS

comissural caudal (figura 8). O painel A da figura 9 apresenta o conjunto das variaes

mdias na fR basal antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees

bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal (n=8). Como

podemos observar nas figuras 8 e 9, a inibio no-seletiva da sntese de NO no NTS

comissural caudal no promoveu alteraes significativas na fR basal dos animais

(p>0,05). Microinjeces do L-NAME (200 nmoles/50 nL) em regies adjacentes ao NTS

Resultados 59

comissural caudal tambm no promoveram alteraes significativas na fR basal (n=8,

figuras 8 e 9, p>0,05). Da mesma forma, microinjees bilaterais do veculo (salina,

0,9%) no NTS comissural caudal no promoveram alteraes significativas na fR basal

dos animais (n=7, figuras 8 e 9; p>0,05).

Com relao resposta de aumento da fR decorrente da ativao do

quimiorreflexo, a anlise dos resultados demonstrou que em todos os grupos

experimentais, a mdia do aumento mximo na fR decorrente da ativao do

quimiorreflexo ocorreu 2 segundos aps a administrao do KCN (figura 8). No

painel B da figura 9 esto apresentadas as mdias do aumento mximo na fR 2

segundos aps a ativao do quimiorreflexo antes (controle) e aos 5, 10 e 30

minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS

comissural caudal (n=8). Os resultados apresentados na figura 9 demonstram que

as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS caudal

promoveram uma atenuao significativa na magnitude da mdia do aumento

mximo na fR frente ativao do quimiorrefexo aos 5 (13810 vs 8111 cpm; n=8;

p0,05).

Resultados 60

INSP

IRA

O

100

500

400

FC (

bpm

)

300

200

0

200

150

PAM

(m

mH

g)

100

50

0

200

150

PAP

(m

mH

g)

100

50

L-NAMENTS caudal

KCNcontrole

KCN5 min

KCN30 min

KCN10 min

2 s

Figura 6: Efeitos das microinjees bilaterais do L-NAME no NTS comissural caudal sobre as respostas cardiovasculares e ventilatria ativao do quimiorrefexo. Traado, de um animal no-anestesiado representativo do grupo, mostrando as alteraes na freqncia cardaca (FC, bpm), presso arterial mdia (PAM, mmHg), presso arterial pulstil (PAP) e nas oscilaes de presso decorrentes da respirao ( inspirao) em resposta ativao do quimiorrefexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v.) antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL) no NTS comissural caudal.

Resultados 61

CONTROLE 5 10 300

SALINA bilateral NTS caudal (n=7)

L-NAME bilateral NTS caudal (n=8)L-NAME fora NTS caudal (n=8)

A

25

50

75

min

PA

M (m

mH

g)

-350

-250

-150

B 0

FC

(bpm

)

Figura 7: Efeitos das microinjees bilaterais do L-NAME no NTS comissural caudal sobre as respostas cardiovasculares ativao do quimiorrefexo. Variaes mdias na presso arterial mdia ( PAM, painel A) e na freqncia cardaca ( FC, painel B) em resposta ativao do quimiorrefexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v.) antes (controle) e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) ou do veculo (salina, n=7) no NTS comissural caudal; antes e aps as microinjees do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) fora do NTS caudal de ratos no-anestesiados.

Resultados 62

-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

50

100

150

200

250

300 A- CONTROLE

KCN

seg

f R (c

pm)

-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

50

100

150

200

250

300 B- 5 min

KCN

seg

f R (c

pm)

-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

50

100

150

200

250

300 D- 30 min

KCN

seg

f R (c

pm)

-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

50

100

150

200

250

300 C- 10 min

KCN

seg

L-NAME bilateral NTS caudal (n=8)L-NAME fora NTS caudal (n=8)SALINA bilateral NTS caudal (n=7)

f R (c

pm)

Figura 8: Efeitos das microinjees bilaterais do L-NAME no NTS comissural caudal sobre a freqncia respiratria basal e sobre a resposta de aumento da freqncia respiratria ativao do quimiorreflexo. Alteraes na freqncia respiratria (fR, cpm) basal e na resposta de aumento da fR ativao do quimiorrefexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v.) antes (controle, A) e aos 5 (B), 10 (C) e 30 minutos (D) aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) ou do veculo (salina, n=7) no NTS comissural caudal; antes e aps as microinjees do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) fora do NTS caudal de ratos no-anestesiados. O momento da injeo intravenosa de KCN (40 g/0,1mL) indicado pela seta. *p < 0,05 comparado ao grupo salina; p < 0,05 comparado ao grupo L-NAME fora do NTS caudal.

Resultados 63

0

50

100

150A

L-NAME bilateral NTS caudal (n=8)L-NAME fora NTS caudal (n=8)SALINA bilateral NTS caudal (n=7)

f R (c

pm)

CONTROLE 5 10 300

min

B

60

120

180

f R

(cpm

)

Figura 9: Efeitos das microinjees bilaterais do L-NAME no NTS comissural caudal sobre a freqncia respiratria basal e sobre a resposta de aumento da fR ativao do quimiorreflexo. Variaes mdias na freqncia respiratria basal (fR, cpm, painel A) e no aumento da fR (fR, cpm, painel B) 2 segundos aps (pico mximo da resposta) ativao do quimiorrefexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v.) antes e aos 5, 10 e 30 minutos aps as microinjees bilaterais do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) ou do veculo (salina, n=7) no NTS comissural caudal; antes e aps as microinjees do L-NAME (200 nmoles/50 nL, n=8) fora do NTS caudal.*p < 0,05 comparado ao grupo salina; p < 0,05 comparado ao grupo L-NAME fora do NTS caudal.

Resultados 64

4.1.2. Respostas cardiovasculares e ventilatria decorrentes da ativao do

quimiorreflexo com KCN (40 g/0,1 mL, i.v) antes e aps as microinjees

bilaterais de N-PLA (3 pmoles/50 nL) no NTS comissural caudal de ratos no-

anestesiados

A figura 10 apresenta traados de um rato, representativo do grupo,

mostrando as alteraes na PA basal em decorrncia das microinje

quimiorreflexo e barorreceptores

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