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Leal, A.F.G. Queratinofilia e perfil histoquímico de fungos... 0

ANDRÉ FERRAZ GOIANA LEAL

QUERATINOFILIA E PERFIL HISTOQUÍMICO DE FUNGOS

ISOLADOS DO SOLO DE ÁREAS DE LAZER DA CIDADE DO REC IFE,

PERNAMBUCO, BRASIL.

RECIFE

MAIO/2010


UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

QUERATINOFILIA E PERFIL HISTOQUÍMICO DE FUNGOS ISOLADOS DO SOLO DE ÁREAS DE LAZER DA CIDADE DO REC IFE,

PERNAMBUCO, BRASIL.

Aluno: André Ferraz Goiana Leal Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Fungos de interesse médico Orientador: Profa. Dra. Rejane Pereira Neves Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão

RECIFE MAIO/2010


“Deixa- te disto criança

Deixa de orgulho e sossega

Olha que o mundo é um oceano

Por onde o acaso navega”

Tito Ferraz


Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) e a coordenação do programa de Pós-

graduação de Biologia de Fungos da Universidade Federal de Pernambuco.

À minha orientadora Profª Rejane Pereira Neves pelos seus ensinamentos, dedicação

e amizade. Muito obrigado.

Ao meu co-orientador Prof. Eduardo Beltrão por ter me ajudado a desenvolver a

pesquisa.

Aos professores Oliane Maria Correia Magalhães, Armando Lacerda Marsden,

Delson Laranjeira, Sami Jorge Michereff, Cristina Maria de Souza-Motta, Maria José dos

Santos Fernandes e Débora Maria Massa Lima por terem contribuído para a melhoria dos

meus conhecimentos.

A todos os amigos do Laboratório de Micologia Médica, Danielle Patrícia Cerqueira

Macêdo, Reginaldo Gonçalves de Lima-Neto, Flávia Cadengue Lopes, Fabíola Maria

Marques do Couto, Elvislene Camelo Soares Leite, Ana Maria Rabelo de Carvalho.

Aos professores do Curso de Pós-graduação em Biologia de Fungos, pelos seus

ensinamentos de micologia que contribuíram para minha formação profissional.


RESUMO GERAL Vários pesquisadores têm concluído que as lectinas são úteis para estabelecer o perfil de

carboidratos da parede celular dos fungos. Neste estudo, nós avaliamos a expressão de N-acetil-

D-glucosamina, L-fucose, D-galactose e glucose/manose na parede celular de fungos

filamentosos queratinofílicos, isolados de solos de áreas de lazer, através de um simples

protocolo de marcação com lectinas. As culturas fúngicas usadas foram isoladas de solos de

parquet público através da técnica “hair-bait”. As lectinas usadas no ensaio foram concanavalin

A (Con A), wheat germ agglutinin (WGA), Ulex europeus agglutinin I (UEA I) e peanut

agglutinin (PNA), todas conjugadas a peroxidase. Uma fita adesiva, posicionada com a parte

colante para baixo, foi levemente pressionada sobre a colônia do fungo. A amostra de fungo na

fita foi incubada com lectina (50µg/mL) por 1h a 4°C. A marcação com lectina foi visualizada

usando 3,3-diaminobendizina (DAB) e peróxido de hidrogênio. Houve uma alta expressão de N-

acetil-D-glucosamina sobre a parede celular de todas as espécies fúngicas testadas, enquanto a

expressão de L-fucose, D-galactose e glucose/manose apresentaram variações interespecíficas.

Nós concluímos que o ensaio de marcação com lectina apresentado neste trabalho, elimina

muito dos passos laboriosos envolvidos em outros protocolos. A quantidade e qualidade de

micélio e esporos imobilizados na fita adesiva foram adequadas para acessar os carboidratos da

parede celular de fungos filamentosos.

Palavras chave - Fungos queratinofílicos, solo, lectinas, parede celular.


ABSTRACT

Various researchers have concluded that lectins are useful reagents for the study of fungal cell

surface glycoconjugates. In this study, we evaluated the expression of N-acetyl-D-glucosamine,

L-fucose, D-galactose and glucose/mannose in the cell wall of keratinophilic filamentous fungi

using a simple lectin-binding protocol. The fungal cultures used were isolated from soils of

public parks by the hair-bait technique. Lectin assays used concanavalin A (Con A), wheat germ

agglutinin (WGA), Ulex europeus agglutinin I (UEA I) and peanut agglutinin (PNA), all

conjugated to horseradish peroxidase. A glue tape was placed adhesive-side down over the

fungal colony, gently pressed and then removed. Fungal-tape samples were incubated with the

lectin for 1h at 4°C. Lectin-binding was visualized using 3,3-diaminobendizine (DAB) and

hydrogen peroxidase. There was a high expression of N-acetyl-D-glucosamine on the cell wall

of all fungi species tested while the expression of L-fucose, D-galactose and glucose/mannose

demonstrated inter-specific variations. We conclude that the lectin-binding assay presented in

this paper eliminates many of the laborious steps involved in other protocols. The amount and

quality of the mycelium and spores immobilized by the glue tapes were suitable to access the

carbohydrate profile in glycoconjugates of the cell wall of filamentous fungi.

Palavras chave - keratinophilic fungi, soil, lectin-binding, cell wall.


Lista de figuras Capitulo 4

Páginas

Figura 1 - Fita adesiva pressionada sobre a colônia (a), a fita com amostra fúngica

é posicionada sobre uma lâmina (b), aplicação da solução com lectina (c) e

incubação (d). Para detalhes, ver na seção de material e métodos..............................

41

Figura 2 - Padrão de marcação com lectinas: intenso (a), moderado (b), fraco (c) e

ausente (d)....................................................................................................................

42


Lista de Tabelas

Capítulo 3

Páginas

Tabela 1 - Espécies fúngicas isoladas do solo do parque público I e II na Cidade de

Recife..........................................................................................................................

32

Capítulo 4

Tabela 1 - Padrão de marcação com lectinas em fungos filamentosos

queratinofílicos isolados de amostras de solo coletadas de parques públicos............

40


SUMÁRIO

Páginas

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 11

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................................... 13

2.1 Fungos queratinofílicos do solo............................................................................. 13

2.2 Parede celular......................................................................................................... 20

2.3 Lectinas.................................................................................................................... 21

3 CORRELAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA ENTRE FUNGOS

QUERATINOFÍLICOS DO SOLO E AGENTES DE DERMATOMICOSE .

24

4 CARACTERIZAÇÃO DA MARCAÇÃO COM LECTINAS EM

TRICHOPHYTON TONSURANS E OUTROS FUNGOS FILAMENTOSOS

QUERATINOFÍLICOS.........................................................................................

33

5 CONSIDERAÇÕES GERAIS............................................................................... 43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 44


1. INTRODUÇÃO

Os fungos são seres eucarióticos, heterotróficos, que se reproduzem assexuada e/ou

sexuadamente. São cosmopolitas, ocorrem em todos os climas e estão presentes na natureza

numa grande variedade de substratos. Atuam como sapróbios, parasitas ou simbiontes,

vivendo em associação com outros organismos (Alexopoulos et. al., 1996; Ferreira e Ávila,

1996; Trabulsi, 1999; Fisher e Cook, 2001).

O solo constitui o habitat natural dos fungos, dentre os quais se encontram os

queratinofílicos, microrganismos especializados em degradar a queratina e utilizá-la como

fonte de nutrição. Este grupo de microrganismos, através de um longo processo evolutivo,

tornou-se capaz de invadir e colonizar os tecidos queratinizados do homem e animais,

causando dermatomicoses (Kwon-Chung e Bennet, 1992; Lacaz et. al., 2002, Sidrim e

Rocha, 2004).

A queratinofilia exercida pelos fungos é a habilidade destes em atacar e perfurar diversos

substratos humanos, dentre eles, cabelos e unhas, os quais são constituídos de queratina uma

escleroproteína altamente polimerizada, constituída de cadeias de polipeptídeos unidas por

ligações dissulfeto as quais mantêm a forma tridimensional da molécula (El-Naghy et al., 1998;

Kaul e Sumbali, 1999; Viani e. al., 2001).

O processo infeccioso depende da virulência do agente e da incapacidade do hospedeiro

em reagir contra o agente colonizador. A alteração do equilíbrio entre parasita e hospedeiro

favorecerá o desenvolvimento de micose (Sidrim e Rocha, 2004).

Vários fatores estão envolvidos na patogenicidade e na virulência, como a queratinofilia,

capacidade de crescer a 37°C, se aderir aos tecidos vivos, variabilidade fenotípica e produção de

toxinas e enzimas (Hanel et al., 1995; Lacaz et al., 2002).

A temperatura de crescimento é considerada um dos mais importantes parâmetros

ambientais, tendo influência sobre diversas atividades fisiológicas dos fungos. A capacidade de

alguns fungos crescerem a 37°C dentre outras características, reforça seu caráter patogênico

(Hanel et al., 1995; Lacaz et al., 2002).

Estabelecendo-se as fontes de infecção, ou seja, o reservatório dos fungos patogênicos

torna-se possível a profilaxia e combate às micoses superficiais ou profundas (Lacaz et al.,

2002).


Técnicas histoquímicas que utilizam lectinas vegetais baseando-se na interação lectina-

carboidratos contribuem para o conhecimento sobre a composição de açúcares da parede celular

de fungos, assim como das diferentes características das micoses de origens variadas (Guillot et

al., 1990; Penha e Bezerra, 2000). Atualmente, muitas questões sobre a natureza e origem da

heterogeneidade das glicoproteínas foram elucidadas, onde as funções dos carboidratos das

glicoproteínas, o "glicocódigo" considerado um elemento importante no reconhecimento célula-

célula, interação invasor célula, envolvido no potencial patológico de diferentes espécies

fúngicas. O conhecimento deste código sacarídico apresenta-se como ferramenta para

identificação, caracterização de microrganismos patogênicos ou não bem como, seu modo de

infecção (Sharon, 2000).

Para uma melhor compreensão da diversidade e ecologia desses fungos potencialmente

patogênicos ao homem, este trabalho teve como objetivos isolar, identificar e caracterizar os

glicoconjugados da parede celular de fungos queratinofílicos do solo e correlacionar os dados

obtidos com os agentes de dermatomicoses isolados de pacientes atendidos no Laboratório de

Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil.


2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Fungos queratinofílicos do solo

De acordo com Al-Sane et. al. (2002) e Gugnani (2003), o solo constitui o habitat

natural dos fungos, dentre os quais se encontram os queratinofílicos, microrganismos

especializados em degradar a queratina procedente de várias fontes em componentes de

baixo peso molecular. Desse modo, várias espécies de fungos apresentando essa capacidade

estão presentes em áreas densamente populosas como praças, jardins públicos e parques

infantis usados como área de laser.

Vanbreuseghem em 1952 instituiu uma técnica para o isolamento de fungos

queratinofílicos, onde fragmentos de cabelo esterilizados foram colocados em contato com

amostras de solo para servirem como isca (Langaron e Vanbreuseghem 1952; Lacaz et. al.,

2002).

Vários fatores ecológicos são responsáveis pela distribuição e a sobrevivência dos

fungos queratinofílicos no solo dentre estes, se destaca o fluxo de pessoas e animais que

disponibilizam substratos queratinizados para esses microrganismos; o solo com pH quase

neutro a fracamente alcalino e organicamente rico com um elevado teor de carbono orgânico,

nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio, cálcio e ferro, favorece para o desenvolvimento

desses fungos. Vários trabalhos relataram que a ocorrência de fungos queratinofílicos

diminui nas regiões mais profundas do solo por causa da condição anóxica (Kaul e Sumbali,

1999; Kunert, 2000; Muhsin; Hadi, 2001; Ulfg et. al., 2007).

A capacidade queratinofílica tem sido considerada uma característica específica dos

dermatófitos. O qual é um grupo de fungos altamente especializados que, através de um

longo processo evolutivo, tornaram-se capazes de invadir e colonizar os tecidos

queratinizados do homem e de outros animais, tais como cabelo, pele, unhas, garras e chifres.

A queratina é uma escleroproteína altamente polimerizada, constituída de cadeias de

polipeptídeos unidas por ligações dissulfeto as quais mantêm a forma tridimensional da

molécula. Contudo, além dos dermatófitos, outros fungos como espécies de Aspergillus,

Fusarium, Penicillium, Chrysosporium, Scopulariopsis, Microascus, Aphanoascus,

Chaetomium, Alternaria e Curvularia estão relacionados a micoses superficiais de unhas e

espaços interdigitais dos pés demonstrando a capacidade patogênica destes microrganismos


(Agut et al., 1995; El-Naghy et. al., 1998; Kaul e Sumbali, 1999; Viani et. al., 2001;

Gugnani, 2003).

Nas últimas três décadas, tem aumentado os casos de infecções de pele humana e de

animais por fungos queratinofílicos que não são dermatófitos, causando lesões similares às

das dermatofitoses (Ali-Shtayeh e Jamous, 2000; Gugnani, 2003; Walsh et. al., 2004).

Gugnani (2003) realizou um importante estudo sobre os fungos filamentosos

queratinofílicos causadores de infecção humana excluindo os dermatófitos, concluindo que

estes fungos vivem saprobioticamente no solo, são isolados mais facilmente utilizando a

técnica “hair-bait” e pertencem ao grupo dos Hyphomycetes. O autor afirma que dentre as

espécies de fungos filamentosos queratinofílicos que causam infecções humanas estão as

espécies de Fusarium, Scopulariopsis, Aspergillus, Geotrichum, Alternaria, Curvularia,

Onychocola, Microascus, Aphanoascus e Chaetomium.

Segundo Sidrim; Rocha (2004), o processo infeccioso depende da virulência do

agente e da incapacidade do hospedeiro em reagir contra o agente colonizador. A alteração

do equilíbrio entre parasito e hospedeiro favorecerá o desenvolvimento de micose.

Vários fatores estão envolvidos na patogenicidade e na virulência microbiana como

queratinofilia, capacidade de crescer a 37°C, aderência aos tecidos vivos, variabilidade

fenotípica e produção de toxinas e enzimas (Hanel et. al., 1995; Lacaz et. al., 2002; Macêdo

et. al., 2005).

A temperatura de crescimento é considerada um dos mais importantes parâmetros

ambientais, tendo influência sobre diversas atividades fisiológicas fúngicas. Os fungos são

organismos com alta capacidade de adaptação e podem se desenvolver dentro de uma ampla

variação de temperatura, apresentando cada espécie, uma temperatura ótima de crescimento.

A capacidade de alguns fungos crescerem a 37ºC dentre outras características reforça seu

caráter patogênico (Hanel, et. al., 1995; Kunert, 2000; Lacaz, et. al., 2002).

A capacidade de invadir cabelo e unha in vitro é uma propriedade dos fungos

queratinofílicos, entretanto várias espécies diferem no seu modo de ação (Ali-Shtayeh;

Jamous, 2000, Macêdo et. al., 2005).

Muhsin; Hadi (2001) estudaram a habilidade de quatro espécies de fungos, dois

dermatófitos e dois sapróbios, em degradar três tipos de substratos de queratina, cabelo, pena

de galinha e pêlo de animal. Cabelos tiveram uma elevada taxa de degradação por

Chrysosporium pannicola e Microsporum gypseum, pena de galinha foi altamente degradada


por Aspergillus flavus, enquanto o pêlo foi altamente degradado por C. pannicola e

Trichophyton mentagrophytes var. erinacei.

Hannelore; Ziegler (1969) isolaram fungos queratinofílicos de 250 amostras de solo

coletadas em diferentes locais nos arredores de Berlim. A medição do pH das amostras de

solo variou dentro de um intervalo de 3,0 a 8,0. A maioria dos solos que apresentaram baixo

pH em torno de 3,0-4,5, não foram isolados fungos queratinofílicos, diferentemente dos solos

com pH superior a cinco, nos quais foram isoladas espécies queratinofílicas como

Chrysosporium keratinofilum, Keratinomyces ajelloi, C. indicum, M. cookei, M. gypseum e

Trichophyton ajelloi. A média do pH dos solos com ausência para estes fungos foi de pH 4,1.

Segundo os autores a ausência de fungos queratinofílicos em solos de baixo pH pode ser

explicada pela inativação das enzimas em condições de acidez. K. ajelloi foi o fungo que

apresentou maior tolerância quanto à variação do pH, sendo isolado de solos com pH de 5-8.

Chmel et. al. (1972) estudaram a influência de fatores ecológicos sobre os fungos

queratinofílicos do solo. O pH e a temperatura não influenciaram no desenvolvimento dos

fungos. Os autores observaram que Keratinomyces ajelloi e Microsporum gypseum renderam

um aumento na concentração de húmus de 5,1% e 1,5%, respectivamente.

Blanca et. al. (1975) isolaram dermatófitos de 24 amostras de solo de diferentes

cidades da Argentina. Os locais escolhidos para as coletas foram praças, parques e terrenos

baldios. Várias espécies de fungos queratinofílicos foram isoladas pela técnica de

Vanbreuseghem como Arthroderma uncinatum, Chrysosporium keratinofilum, C. parvum,

M. gypseum, M. canis, M. cookei, Nannizzia incurvata e T. ajelloi.

Carreta e Piontelli (1975) isolaram de 125 amostras de solo de diferentes locais da

cidade de Paiva, Itália. Os locais selecionados para a realização das coletas foram os mais

freqüentados como parques, campos, criatórios de aves e bosques. Foram isolados pela

técnica de Vanbreuseghem um total de 42 amostras de fungos queratinofílicos incluindo M.

gypseum, M. vanbreuseghemii, A. uncinatum, Ctemyces serratus e Chrysosporium tropicum.

Batteli et. al. (1978) isolaram dermatófitos de 127 amostras de solos de Marmot,

Itália. Neste estudo foram coletadas amostras das cidades de Sardinia, Emilia - Romana,

Bologna, Pávia e Roma. Os autores afirmaram que grande movimento de pessoas enriquece o

solo com cabelo, crostas e outros materiais, criando condições favoráveis para crescimento

de fungos queratinofílicos, sendo M. gypseum a espécie dominante.


Mercantini et. al. (1980) investigaram amostras de superfície de solos de áreas

bastante populosas como jardins públicos, pátios e campos de grandes cidades como

Sardenha, Bologna, Pávia, Gênova e mencionaram que a distribuição de fungos

queratinofílicos no solo depende da elevada quantidade de material queratinizado neste

habitat. M. gypseum e espécies de Fusarium e Gliocadium foram isoladas pela técnica de

Vanbreuseghem.

McAleer (1980) analisou 299 amostras de solo coletadas em áreas que apresentavam

grande fluxo de pessoas e animais como jardins e parques na Austrália. Os fungos

queratinofílicos foram isolados pela técnica de Vanbreuseghem, sendo obtidos C. tropicum,

C. indicum, C. asperatum, C. evolceanui, C. keratinophilum, M. gypseum, M. cookei, T.

ajelloi, Verticillium chlamydosporium e V. psalliotae.

Abdel-Hafez et. al. (1982) analisaram 60 amostras de solo coletadas de diferentes

locais em Upper (Egito) e na costa do Mediterrâneo, utilizando como isca, cabelo humano,

pêlo animal e pena de pombo. Foram isoladas Acremonium sclerotigenum, Acrophialophora

fusispora, Allescheria boydii, Arachniotus dankaliensis, Aspergillus flavus, Cephalosporium

acremonium, Chrysosporium. indicum, C. keratinophilum, C. tropicum, F. moniliforme, F.

solani, Gymnoascus uncinatus, Humicola grisea, Microsporum gypseum, Mucor hiemalis,

Myrothecium verrucaria, P. funiculosum, S. brevicaulis, V. intertextum assim como espécies

de Chrysosporium e Microsporum não identificadas em nível de espécie. Não foi isolado

nenhum fungo queratinofílico nas oito amostras de solo coletadas nos pântanos de sal da área

da costa do Mediterrâneo, sendo atribuído pelos autores que à alta salinidade em torno de 5,8

a 15,6 contribuiu para esse fato. Entretanto, nas amostras de solos cultivados foi evidenciado

um aumento do número de espécies, de uma para quatro.

Mercantini et. al. (1983) estudaram a incidência de fungos queratinofílicos em poeira

de salas de aula de escolas primárias em Roma. Das 20 amostras analisadas, 253 colônias de

fungos queratinofílicos pertencentes a três gêneros, foram isoladas, onde Chrysosporium teve

uma incidência de 100% enquanto espécies de Microsporum e Trichophyton tiveram 40% e

65% respectivamente.

Marsella e Mercantini (1986) analisaram 161 amostras de solo do Parque Nacional de

Abruzzo (Itália). Os fungos queratinofílicos isolados pela técnica “hair-bait” foram C.

asperatum, C. keratinophilum, C. pannorum, C. tropicum, M. cookei, T. ajelloi, T. terrestre e

outras amostras de fungo identificadas em nível de gênero como Absidia, Acremonium,


Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Cunninghamella, Diheterospora,

Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Malbranchea, Metarhizium, Mucor, Paecilomyces,

Penicillium, Rhizoctonia, Rhizopus, Trichotecium e Verticillium. Os autores concluíram que

a ausência desses fungos em algumas áreas está relacionada com a baixa densidade

populacional humana e animal.

Ali-Shtayeh (1988) estudou a incidência de fungos queratinofílicos em solo de

parques públicos e escolas da cidade de Nablus em Israel, utizando a técnica de “hair bait”.

Foram isoladas as espécies Chrysosporium keratinophilum, C. evolceanui, Microsporum

gypseum e Trichophyton mentagrophytes.

Magiaterra e Alonso (1989) isolaram do solo da cidade de Correntes (Argentina), 116

amostras de fungos queratinofílicos pelo método de Vanbreuseghen no inverno e verão. As

áreas escolhidas foram às praças mais freqüentadas. Nas amostras de solo coletadas foram

isolados fungos queratinofílicos pertencentes aos gêneros Chrysosporium, Ctenomyces

Drechslera, Microsporum, Penicillium e Trichophyton. O estudo do solo revelou a existência

de condições favoráveis para o desenvolvimento de fungos queratinofílicos como

alcalinidade e um bom conteúdo de fósforo assimilável.

Marchisio et. al., (1991) isolaram 33 espécies de fungos com atividade queratinolítica

do solo de Papua Nova Guiné. As áreas escolhidas foram as que apresentavam um grande

fluxo de pessoas. Pelo método de isolamento “hair bait” foi possível obter Anthroderma

cuniculi, A. curreyi, Chrysosporium sp., C. indicum, Mucor hiemalis, Myceliophthora

vellerea, Myrothecium roridum, Paecilomyces carneus, P. marquandii, Penicillium

brevicompactum, Rhinocladiella mansonii, T. ajelloi, e Verticillium lecanii.

Soon (1991) isolou de 230 amostras de solo da Malásia, pelo método de “hair bait”,

seis espécies de fungos com atividade queratinofílica. As áreas escolhidas foram jardins,

campos e solos das margens de rios de diferentes partes do país. Chrysosporium

keratinophilum, C. tropicum, Keratinophyton terreum, Microsporum gypseum, T. terrestre e

outras espécies de Chrysosporium foram isoladas. Comparando os seus resultados com de

outros autores, Soon concluiu que as três espécies de fungos queratinofílicos mais comuns no

solo da Malásia são M. gypseum, C. keratinophilum e C. tropicum.

Carreta et. al., (1992) coletaram amostras de solo de nove parques na província de Paiva

(Itália) e isolaram fungos queratinofílicos utilizando como iscas cabelo e pena. Arthroderma


gypsea, A. uncinatum, Aphanoascus fulvescens, Amaurascus mutatus, Ctenomyces serratus,

Gymnascella dankaliensis, Gymnoascus intermedius e G. reessii foram os fungos isolados.

Agut et. al., (1995) utilizaram a técnica de Vanbreuseghen para estudar a distribuição

dos fungos queratinofílicos em 39 amostras de solo coletadas da cidade de Brittany, França.

Foram isolados fungos em 35 amostras de solo, sendo os mais freqüentes F. moniliforme e P.

viridicatum, contudo foram constatados os gêneros Acremonium, Crysosporium,

Gliocladium, Mucor, Trichoderma e Trichophyton.

El-Said (1995) isolou fungos queratinofílicos de 50 amostras de solo coletadas em

diferentes lugares de Yemem, República Árabe pelo método de “hair bait”. Incluídos em

Alternaria alternata, Arthroderma cuniculi, A. curreyi, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A.

ustus, A. wentii, A. niger, A. terreus, A. raphani, A. tenuissima, Crysosporium indicum, C.

tropicum, C. keratinophilum, C. pannicola, C. pruinosum, C. carmicaelli, C. lucknowense, C.

xerophilum, C. asperatum, Prectinotrichum llanence, Microsporum gypseum, Trichophyton

terrestre, T. mentagrophytes, T. equinum, T. rubrum, T. soudanense, e outras espécies de

Cunninghamella, Fusarium, Macrophomina, Penicillium, Rhizopus e Ulocladium.

Simpanya e Baxter (1996) obtiveram 236 amostras de solo de parques recreativos,

áreas escolares, curral, terrenos baldios, beira de estradas, áreas bastante freqüentadas por

homens e animais na Nova Zelândia. Foram isoladas pela técnia de “hair bait” 168 (71,2%)

amostras de fungos queratinofílicos como Gliocadium (25,0%), Paecilomyces (14,8%) e

Trichophyton (11,9%) isolados de solo umedecido com água destilada esterilizada contendo

antibiótico. Por outro lado, os solos umedecidos com água destilada esterilizada sem

antibiótico apresentaram Trichophyton (32,6%), Paecilomyces (27,5%), Diheterospora

(16,5%), Gliocadium (13,6%) e Fusarium (13,1%).

Papini et. al., (1998) estudaram a relação entre espécies de fungos queratinofílicos,

isolados do parque da cidade de Pisa, Itália e risco de infecções fúngicas da pele. Utilizaram

a técnica “hair-bait” com três diferentes iscas, cabelo, crina e pena. A crina e o cabelo

apresentaram-se como os melhores substratos para a obtenção de fungos queratinofílicos do

solo. As espécies isoladas foram Chrysosporium indicum, C. keratinophilum, C. luteum,

Microsporum cookei, M. fulvum, M. gypseum, T. ajelloi e T. terrestre. Os autores concluíram

que os fungos queratinofílicos podem representar um risco para o desenvolvimento de

dermatomicose no homem e animal.


Deshmukh (1999) isolou fungos queratinofílicos de 80 amostras de solo coletadas em

várias áreas de Mumbai (Índia). Foram obtidos 55 isolados de fungos queratinofílicos, destes

C. indicum, C. lobatum, C. tropicum, C. zonatum, Chrysosporium sp, Ctenomyces serratus, M.

gypseum e Malbranchea aurantiaca.

Al-Sane et. al., (2002), através da técnica de “hair bait”, usando com substrato pêlo de

animal, isolaram fungos queratinofílicos de amostras de solo coletadas em diferentes partes do

Kuwaiti. As espécies de fungos isoladas foram Chrysosporium zonatum, C. pannicola, C.

keratinophylum, C. indicum, C. queenlandiscum e C. tropicum, assim como Acremonium sp.,

Aspergillus sp. e Fusarium sp.

Shadzi et. al., (2002) coletaram 330 amostras de solo de 13 escolas e sete parques

públicos na província de Isfahan (Irã) para o isolamento de fungos queratinofílicos pelo

método de “hair bait”. A espécie mais freqüente foi C. keratinophilum com 54,2% do número

total de 214 isolados.

Vidyasagar et. al., (2005) isolaram, usando a técnica de “hair bait”, fungos

queratinofílicos do solo de 21 lugares públicos e poeira de 11 hospitais. As espécies

predominantes foram Microsporum gypseum, C. keratinophilum, T. mentagrophytes,

Microsporum nanum e C. tropicum.

Zaki et. al., (2005), isolaram fungos queratinofílicos de amostras de solo lamacento

coletadas em diferentes partes ao redor da cidade do Cairo. Os fungos isolados foram

identificados como C. carmichaelii, C. queenslandicum, C. zonatum, C. indicum, Aphanoascus

mephitalis e Uncinocarpus reesii. C. zonatum foi à espécie mais prevalente e representou 42,5%

do total de isolados.

Gugnani et. al., (2007) analisaram 215 amostras de solo de tocas de ratos e de plantações

de bambu em diferentes partes da Índia e Nepal. Os fungos isolados foram M. gypseum,

Pseudallescheria boydii, Scytalidium hyalinum, Trichosporon asteroides e Trichophyton

mentagrophytes var. mentagrophytes. O estudo também revelou a primeira ocorrência de P.

boydii e T. mentagrophytes var. mentagrophytes em solo nepalês. Entre os outros fungos foram

isolados espécies de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Geotrichum, Mucor,

Paecilomyces, Penicillium, Rhizopus, Rhodotorula e Trichosporon.

O estabelecimento de fontes de infecção, ou seja, o reservatório dos fungos

patogênicos torna-se possível a profilaxia e combate às micoses, quer sejam elas superficiais

ou profundas (Lacaz et. al., 2002).


A interação entre fungos patogênicos e células do hospedeiro é mediada pelas moléculas

presentes na parede celular. Os compostos da superfície celular possuem importância

fundamental no processo infeccioso como, interação célula-célula e microrganismo-hospedeiro

(Esquenazi et. al., 2004).

2.2 Parede celular

A descoberta de determinados carboidratos na superfície de microrganismos patogênicos

tem causado impacto devido à importância destes açúcares na interação dos fungos e bactérias

com seus hospedeiros (Sharon e Ofek, 2000).

A parede celular é um dos principais componentes estruturais da célula fúngica. A maior

parte das funções biológicas relacionadas à patogenicidade e virulência reside nesta estrutura,

uma vez que medeia a interação fungo-hospedeiro (Martinez, et. al., 1998; Gozalbo et. al.,

2004).

López-Ribot et. al., (2004) afirmam que a parede celular é uma estrutura complexa,

dinâmica e com várias camadas, localizada externamente a membrana plasmática, e responsável

pela manutenção da forma somática do fungo. Participa da interação inicial entre o

microrganismo e o ambiente, atua como barreira permeável, possuindo funções nutricionais e

protegendo o protoplasma contra injúrias físicas ou osmóticas.

De acordo com López-Ribot et. al., (1999) e Shibata e Okawa (2006) os componentes de

sua constituição compreendem 80 a 90% de carboidratos como manano ou polímeros de manose

covalentemente associados a proteínas, originando glicoproteinas, também referidas como

mananoproteínas; β-glucanos, polímeros ramificados de glicose que possuem ligações β-1,3 e β-

1,6 e quitina, um homopolímero não-ramificado de N-acetil-D-glicosamina contendo ligações

β-1,4.

Os maiores componentes da parede celular dos fungos, β-glucanos e quitina, formam

uma rígida rede microfibrilar que mantêm a forma da célula e permite que ela tenha resistência

à lise pela fagocitose ou pelo complemento desencadeando reações granulomatosas. As

proteínas como glicomananoproteínas estão ligadas a este esqueleto, além de estarem presentes

na superfície externa da célula. As proteínas e lipídios estão presentes em menor quantidade na

parede da célula fúngica. (Coberllini et al., 1996; Shaum e Stephen, 2006).

Todos os carboidratos representados essencialmente pelos polissacarídeos podem

apresentar-se como homo ou heteropolímeros e encontram-se associados à polipeptídeos,


constituindo as glicoproteínas da parede celular, que desempenham funções enzimáticas,

estruturais, homeostáticas, metabólicas e patogênicas, pois estimulam a ação antigênica no

hospedeiro (Sidrim e Rocha, 2004; De Groot et. al., 2005; Latgé, 2007).

Segundo Gozalbo et. al., (2004) e Shaum e Stephen (2006) um melhor entendimento

sobre os componentes da parede celular facilita a compreensão da interação inicial entre o fungo

e o ambiente, incluindo neste o hospedeiro, além de prover as bases para o desenvolvimento de

procedimento efetivo para o diagnóstico de micoses e de novas estratégias profiláticas e

terapêuticas para o controle dessas infecções, como drogas direcionadas e vacinas.

A constituição da parede celular pode ser um critério taxonômico adicional de distinção

entre espécies fúngicas. Ao lado de técnicas como extrações químicas, degradação enzimática

seguida pela análise dos produtos hidrolisados, comparação de frações antigênicas utilizando

soro imune ou microscopia eletrônica, o uso de lectinas contribui significativamente para a

caracterização da natureza dos açúcares presentes na parede celular (Guillot et. al., 1990).

2.3 Lectinas

Lectinas são proteínas de origem não imunológica as quais estão amplamente

distribuídas na natureza, sendo encontradas em seres unicelulares, pluricelulares, tais como

fungos, animais e vegetais (Yamaguchi et. al., 1998; Kawagishi et. al., 1997; Khan et. al., 2007;

Ye e Ng, 2000; Coelho e Silva, 2000). Essas proteínas reconhecem carboidratos livres ou

ligados às superfícies celulares, sem alterar a estrutura dos ligantes, através de sítios de ligação

nos quais a hidrofobicidade é a principal força de interação (Peumans e Van Damme, 1998;

Nishimura et. al., 2000; Sharon, 2007). A maioria das lectinas é designada de “aglutinina”,

sendo denominada por abreviações como Ulex europaeus agglutinin (UEA-1) ou Peanut

agglutinin (PNA), está nomenclatura é recomendada internacionalmente (Peumans e Van

Damme, 1994).

De acordo com Sharon e Lis (2001) a maioria das lectinas possui pelo menos dois sítios

de reconhecimento a carboidratos ou derivados a partir de uma porção limitada da molécula

protéica. Este segmento é denominado de domínio de reconhecimento ao carboidrato. Os

carboidratos interagem com lectinas através de pontes de hidrogênio obtidas pela

disponibilidade de um grande número de hidroxilas nos açúcares, que atuam como doadores ou

receptores de hidrogênio e participam da interação lectina-carboidrato, interações hidrofóbicas e

força de Van Der Walls (Drickamer, 1995; Loris et. al., 2000).


Devido à estabilidade química, metodologias de utilização bem padronizadas e

sensibilidade no reconhecimento de porções de carboidratos específicos, as lectinas têm sido

otimisadas e aplicadas como citotoxinas, agentes mitogênicos e aglutinantes celulares,

determinação de grupos sanguíneos, inibição do crescimento de células tumorais, marcadores de

células transformadas, bem como em diversos estágios da interação parasito-hospedeiro nas

doenças infecciosas (Ghosh et. al., 1999; Lovatt et. al., 2000; Morgan e Watkins, 2000; Jack et.

al., 2001; Sames et. al., 2001).

Lectinas podem ser conjugadas com isotiocianato de fluoresceína ou tetrametilrodamina

e examinadas através da microscopia de fluorescência com a utilização de filtros apropriados

(Remani et. al., 1994); podem ainda ser ligadas a enzimas como a “horseradish” peroxidase e

analisados por microscopia óptica (Zanbenedetti, et. al., 1998), ou serem biotiniladas e

conjugadas a anticorpos (Honjo et. al., 2000). Além disso, através da microscopia eletrônica,

protocolos utilizando lectinas conjugadas a partículas de ouro coloidal ou prata, podem ser

usadas como marcadores ultraestruturais prioritários para alguns tipos de células e tecidos (Roth

et. al., 1998).

O reconhecimento específico entre fungos patogênicos e células do hospedeiro pode ser

mediado pela interação de proteínas que se ligam a carboidratos, como as lectinas, presentes na

superfície de uma das células e que permitirá complementaridade com açúcares na superfície da

outra célula (Esquenazi et. al., 2003).

Esta hipótese é suportada por modelos de estudo que evidenciam adesinas e moléculas

receptoras na interface fungo-hospedeiro (Mendes-Giannini et. al., 2000). Diante disso, a

composição qualitativa e quantitativa dos glicoconjugados das membranas celulares torna-se

significativa no desenvolvimento e evolução de várias doenças (Takano et. al., 2000; Yu et. al.,

2001).

As lectinas podem ser usadas em sistemas de liberação controlada de drogas, as quais

funcionam como proteínas que direcionam as drogas para sítios alvos específicos, como

microrganismos, células cancerosas ou com distúrbios metabólicos refletidos na superfície

celular por uma expressão acentuada de carboidratos superficiais (Bies et. al., 2004).

Atualmente, muitas questões sobre a natureza e origem da enorme heterogenicidade das

glicoproteínas foram elucidadas, contudo, até o momento, sabe-se que as funções dos

carboidratos nas glicoproteínas são indubitavelmente tão complexas quanto às dos aminoácidos

em uma proteína, tendo sido o “glicocódigo” considerado um elemento importante


correlacionado com diagnóstico e potencial patológico de diferentes microrganismos (Sharon e

OFEK, 2000; Esquenazi et. al., 2004).


3 CORRELAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA ENTRE FUNGOS QUERATINOF ÍLICOS

ISOLADOS DO SOLO E AGENTES DE DERMATOMICOSES3

_______________________ 3 Trabalho publicado na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical como Leal, A.F.G., Macêdo, D.P.S., Laranjeira, D., Souza-Motta, C.M., Fernandes, M.J.S., Magalhães, O.M.C., Beltrão, E.I.C., Neves, R.P. Correlação epidemiológica entre fungos queratinofílicos isolados do solo e agentes de dermatomicoses.


Resumo

Este trabalho teve como objetivo isolar e identificar os fungos queratinofílicos do solo e

correlacioná-los com os agentes de dermatomicose. De acordo com nossos resultados, o

predomínio de Trichophyton tonsurans como agente de dermatomicose em crianças na cidade

do Recife-PE, deve-se provavelmente ao maior contato destas com o solo.

Palavras-chaves: Trichophyton tonsurans. Solo. Dermatomicose.


Introdução

O solo constitui o habitat natural dos fungos, dentre os quais se encontram os

queratinofílicos, microrganismos especializados em degradar a queratina e utilizá-la como fonte

de nutrição. Este grupo de microrganismos, através de um longo processo evolutivo, tornou-se

capaz de invadir e colonizar os tecidos queratinizados do homem e animais, causando

dermatomicoses (Kunert, 2000).

Para uma melhor compreensão da diversidade e ecologia desses fungos potencialmente

patogênicos ao homem, este trabalho teve como objetivos isolar e identificar fungos

queratinofílicos do solo e correlacionar os dados obtidos com os agentes de dermatomicoses

isolados de pacientes atendidos no Laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal

de Pernambuco, Brasil.

Material e Métodos

Sabendo-se que a presença de homens e animais influencia na distribuição dos fungos

queratinofílicos no ambiente (Kunert, 2000), foram selecionados para este estudo, dois parques

públicos da cidade do Recife-PE, Brasil. 80 amostras de solo foram coletadas dos tanques de

areia, onde ficam os brinquedos infantis. O material foi coletado da superfície do solo com até

15cm de profundidade, acondicionado em sacos plásticos e posteriormente transportados para o

Laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco. Os fungos

queratinofílicos foram isolados pelo método hair-bait modificado (Vanbreausghem, 1952).

Cinco tipos de iscas foram testadas durante o estudo como fragmentos de cabelos e unha, penas

de galinha, raspado de chifre e crina. Cada amostra de solo foi inicialmente homogeneizada e

25g foram acondicionadas em placas de Petri previamente esterilizadas e umedecidas com água

destilada esterilizada (ADE). Iscas autoclavadas foram espalhadas sobre o solo umedecido e em

seguida as preparações foram incubadas a 25ºC e 37ºC. Cada teste foi realizado em dezesseis


repetições totalizando 32 preparações contendo solo e isca. Os testes foram acompanhados

diariamente por até cinco semanas antes de serem descartados. A presença de fungos

queratinofílicos foi confirmada por meio de exame microscópico. Os fragmentos de iscas

colonizados foram inoculados em placas contendo meio ágar Sabouraud adicionado de 50mg/L

de cloranfenicol e incubados durante duas semanas a 25ºC.

Para confirmação da capacidade queratinofílica e/ou queratinolítica foi realizado teste in

vitro baseado na metodologia utilizada por Macêdo et. al. 2005.

Para o exame direto, as iscas colonizadas foram retiradas das placas e colocadas entre

lâmina e lamínula utilizando-se 20µL de KOH a 20% como clarificante. A partir do exame

direto foi avaliada a capacidade do fungo de colonizar com ou sem degradação as iscas e formar

órgãos de perfuração.

Paralelo ao período de coleta de solos foi realizado estudo prospectivo a partir dos

laudos dos pacientes diagnosticados para dermatomicoses no Laboratório de Micologia Médica

da Universidade Federal de Pernambuco de Janeiro de 2006 a Junho de 2008. Foram coletados

dados referentes à idade e agentes etiológicos de dermatomicoses.

Parte das amostras dos solos dos parques públicos também foram transportadas para o

Laboratório de Fertilidade do Solo na Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA)

e uma amostragem foi submetida para análises de pH e fertilidade.

Resultados e Discussão

A partir de 80 amostras de solos provenientes dos parques públicos I e II, foi obtido um

total de 164 isolados de fungos queratinofílicos. Do parque I foram isolados 114 amostras de

fungos incluindo Aspergillus tamarii (2), Fusarium oxysporum (10), Fusarium solani (28),

Microsporum gypseum (9), Myceliophthora vellerea (3), Paecillomices lilacinus (17) e

Trichophyton tonsurans (45). Do parque público II foram isoladas 50 amostras de fungos


identificados como Aspergillus tamarii (1), Aspergillus terreus (5), Fusarium solani (12) e

Trichophyton tonsurans (32). Todas estas espécies são conhecidas como colonizadores de

substratos queratinizados. A Tabela 1 apresenta a freqüência das espécies isoladas pelas

diferentes iscas e condições de temperatura.

A atividade queratinofílica foi verificada em todas as espécies isoladas; todavia, a

capacidade de formar órgãos de perfuração e degradar as iscas foi visualizada apenas nos

dermatófitos Microsporum gypseum e Trichophyton tonsurans.

A condição de temperatura ideal para o isolamento foi 25°C, na qual 114 (76%) isolados

foram obtidos através da colonização dos substratos testados.

Verificamos que dos 2.964 casos investigados no Laboratório de Micologia Médica

durante o período de Janeiro de 2006 a Junho de 2008, 458 (15,4%) pacientes foram

diagnosticados com dermatofitose e 45 (1,51%) com fusariose. Devido à necessidade de

liberação do resultado para o início do tratamento do paciente, 283 culturas fúngicas de

Trichophyton sp e as 45 de Fusarium sp não foram identificadas em nível de espécie.

Dentre as espécies de fungos identificadas, as mais prevalentes foram Trichophyton

rubrum acometendo 71 (40,6%) pacientes, Trichophyton tonsurans com 50 (28,6%) e

Microsporum canis com 31 (17,7%). Epidermophyton floccosum e Trichophyton

mentagrophytes foram as espécies menos freqüentes, acometendo sete pacientes e

correspondendo a 4% dos casos. Ao analisar o grupo de pacientes com a faixa etária abaixo de

12 anos foi verificado que as espécies mais prevalentes foram respectivamente: Trichophyton

tonsurans com 34 casos (23,4%) e Microsporum canis com 29 (20%). Os agentes menos

freqüentes foram Trichophyton rubrum com 4 (2,8%) casos, Microsporum gypseum com 2

(1,4%), Epidermophyton floccosum, Trichophyton mentagrophytes e uma espécie não

identificada de Fusarium sp acometeram apenas um paciente, o que corresponde a 0,7%.


Amostras de solo do parque I apresentaram as seguintes características físico-químicas:

solo arenoso, pH de 6,8 a 7,13; níveis de fósforo de 26 a 30mg/dm3, magnésio de 0,2 a 0,8

cmolc/dm3, hidrogênio de 0,41 a 0,57 cmolc/dm3, cálcio de 1,95 cmolc/dm3 e potássio 0,07

cmolc/dm3. O parque II exibiu pH variando de 5,10 a 6,27; níveis de fósforo de 40 a 43mg/dm3,

magnésio 0,25 a 0,4 cmolc/dm3, cálcio de 0,95 a 1,50 cmolc/dm3; potássio 0,07 a 0,08

cmolc/dm3 e níveis de hidrogênio 0,49 cmolc/dm3.

Vários fatores ecológicos são responsáveis pela distribuição e sobrevivência dos fungos

queratinofílicos no solo dentre estes, se destaca o fluxo de pessoas e animais que disponibilizam

substratos queratinizados para esses microrganismos, o solo com pH quase neutro a fracamente

alcalino e a disponibilidade de carbono orgânico, nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio, cálcio

e ferro. Muitos trabalhos relatam que a ocorrência de fungos queratinofílicos diminui nas

regiões mais profundas do solo por causa da condição anóxica (Kunert, 2000; Ulfg et. al. 2007).

De acordo com nosso estudo, as duas condições que foram determinantes para a maior

diversidade e ocorrência de fungos queratinofílicos no solo do Parque público I foram o pH do

solo quase neutro e o grande fluxo de pessoas e animais domésticos.

Nas últimas três décadas, um número crescente de fungos queratinofílicos filamentosos

não-dermatofíticos têm sido reconhecidos como agentes de infecções cutâneas em seres

humanos e animais produzindo lesões clinicamente similares às causadas por dermatófitos

(Gugnani, 2003).

No laboratório avaliado as 45 espécies de Fusarium foram diagnosticadas como agentes

de onicomicose, sendo as unhas dos pés a região mais afetada. Os principais fatores

predisponentes para infecções das unhas por Fusarium são traumas, distrofias ou infecções já

presentes causadas por dermatófitos ou leveduras. Dentre as espécies de Fusarium destaca-se


Fusarium solani e Fusarium oxysporum como os principais agentes de onicomicoses (Gugnani,

2003).

De acordo com nossos resultados, o predomínio de Trichophyton tonsurans como agente

de dermatomicose entre as crianças com a faixa etária abaixo de 12 anos de idade deve-se

provavelmente ao maior contato com o solo, especialmente de áreas de lazer. Na região

Nordeste, esta espécie é o agente mais freqüentemente isolado de lesões de couro cabeludo

(Brilhante et. al. 2004).

Damazio et. al. (2007) cols2 compilaram as dermatofitoses mais comuns em pacientes

atendidos no laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco no

período de Janeiro de 1995 a Junho de 2005. Num total de 1.238 casos de dermatofitoses,

observou-se um predomínio das tinhas do couro cabeludo (33,7%) causadas por Trichophyton

tonsurans (25,5%), entre 1995 e 1999. No período de 2000 a 2005, as tinhas de pele glabra

(35,5%) foram as mais prevalentes sendo Trichophyton rubrum (34%) o principal agente. O

trabalho também destaca a redução de Trichophyton mentagrophytes como agente de micose no

último período considerado.

Na literatura existem relatos de que as espécies Aspergillus tamarii, Aspergillus terreus,

e Paecillomices lilacinus estão envolvidas em casos de dermatomicoses, ocorrendo a grande

maioria em pacientes imunocomprometidos (Gugnani, 2003). Com relação ao fungo

Myceliophthora vellerea, conhecido por colonizar substratos queratinizados, até o momento não

existem relatos desta espécie como patógeno humano.

Para o controle das micoses, é essencial à aquisição de conhecimento sobre o habitat

natural dos agentes etiológicos. Tais informações permitem a delimitação de regiões endêmicas

e a detecção dos pontos de foco, para estabelecimento de medidas de controle epidemiológico

(Panasiti et. al. 2007). Neste caso, uma medida que poderia minimizar a ocorrência de fungos


queratinofílicos no solo seria a proibição da entrada de animais domésticos nos tanques de areia

onde ficam os brinquedos infantis.


Tabela 1- Espécies fúngicas isoladas do solo do parque público I e II na Cidade de Recife.

Espécies isoladas Freqüência (%)

Substratos fragmentos

de unha cabelo crina pena de

galinha raspado de

chifre temperatura

25°C 37°C 25°C 37°C 25°C 37°C 25°C 37°C 25°C 37°C

Parque I

Aspergillus tamarii 1,2 - - - - - - - - - 2

Fusarium oxysporum 6,2 3 - - - 5 - - - 2 -

Fusarium solani 17,5 4 3 - 1 7 3 5 2 3 -

Microsporum gypseum 5,6 5 - - - 4 - - - - -

Myceliophthora vellerea 1,8 - 3 - - - - - - - -

Paecillomyces lilacinus 10,6 4 2 - - - - 3 - 5 3

Trichophyton tonsurans 28,1 6 2 5 3 9 5 7 5 3 -

Parque II

Aspergillus tamarii 0, 6 - - - - - - - - - 1

Aspergillus terreus 3, 1 - - - - - 3 - - - 2

Fusarium solani 7,5 4 - - - 5 - 3 - - -

Trichophyton tonsurans 20 5 2 3 2 8 3 6 3 - -

Total 164 43 14 52 34 21

Não houve colonização (-).


4 CARACTERIZAÇÃO DA MARCAÇÃO COM LECTINAS EM TRICHOPHYTON

TONSURANS E OUTROS FUNGOS FILAMENTOSOS QUERATINOFÍLICOS 4

_______________________ 4 Trabalho submetido para publicação a Mycoses: Diagnosis, Therapy and Prophylaxis of Fungal Disaeses como Leal, A.F.G., Lima-Neto, R.G., Macêdo, D.P.S., E.I.C., Neves, R.P. Caracterização da marcação com lectina em Trichophyton tonsurans e outros fungos filamentosos queratinofílicos.


Resumo

Antecedentes: Vários pesquisadores têm concluído que as lectinas são úteis para estabelecer o

perfil de carboidratos da parede celular dos fungos. Objetivos: Neste estudo, nós avaliamos a

expressão de N-acetil-D-glucosamina, L-fucose, D-galactose e glucose/manose na parede

celular de Trichophyton tonsurans e outros fungos filamentosos queratinofílicos através de um

simples protocolo de marcação com lectinas. Métodos: As culturas fúngicas usadas foram

isoladas de solos de parquet público através da técnica “hair-bait”. As lectinas usadas no ensaio

foram concanavalin A (Con A), wheat germ agglutinin (WGA), Ulex europeus agglutinin I

(UEA I) e peanut agglutinin (PNA), todoas conjugadas a peroxidase. Uma fita adesiva,

posicionada com a parte colante para baixo, foi levemente pressionada sobre a colônia do fungo.

A amostra de fungo na fita foi incubada com lectina (50µg/mL) por 1h a 4°C. A marcação com

lectina foi visualizada usando 3,3-diaminobendizina (DAB) e peróxido de hidrogênio.

Resultados: Houve uma alta expressão de N-acetil-D-glucosamina sobre a parede celular de

todas as espécies fúngicas testadas, enquanto a expressão de L-fucose, D-galactose e

glucose/manose apresentaram variações interespecíficas. Conclusões: Nós concluímos que o

ensaio de marcação com lectina apresentado neste trabalho, elimina muito dos passos laboriosos

envolvidos em outros protocolos. A quantidade e qualidade de micélio e esporos imobilizados

na fita adesiva foram adequadas para acessar os carboidratos da parede celular de fungos

filamentosos.

Palavras-chaves: Marcação com lectinas, Trichophyton tonsurans, fungos queratinofílicos.


Introdução

Cada carboidrato presente na superfície celular é um potencial sítio de ligação para

lectina. A capacidade das lectinas de reconhecer glicoconjugados tornou possível empregar

essas proteínas em estudos microbiológicos, especialmente na caracterização das glicoproteínas

da superfície celular (Sharon, 2007).

Vários pesquisadores têm concluído que as lectinas são úteis para estabelecer o perfil de

carboidratos da parede celular dos fungos e auxiliar na sua classificação taxonômica (Munõz et.

al., 2003; Pinto et. al., 2008).

Os fungos filamentosos queratinofílicos é um grupo de fungos ecologicamente

importante que podem degradar e utilizar a queratina como fonte de carbono e nitrogênio.

Algumas espécies são potencialmente patogênicas, e podem causar infecções na pele e couro

dos mamíferos (dermatófitos) (Jain et. al., 2004).

Por exemplo, Trichophyton tonsurans é um dermatófito antropofílico cosmopolita

comumente isolado nos casos de Tinea captis em crianças do nordeste do Brasil (Damázio et.

al., 2007).

De acordo com Leal et. al. (2009) a predominância de T. tonsurans como agente de

dermatomicoses em crianças no nordeste do Brasil, deve-se provavelmente ao maior contato

destas com o solo.

A interação entre fungo e paciente ocorre primeiramente ao nível da parede celular

(Calderone, 1993). Assim, a caracterização dos carboidratos da superfície celular pode conduzir

a uma melhor compreensão da adesão fúngica a célula do hospedeiro e mecanismos pelo qual o

fungo evita a ação do sistema imunológica, ajudando no desenvolvimento de testes diagnósticos

baseados na identificação desses carboidratos (Bose et. al., 2003).


Lima-Neto et. al. (2009) avaliou a correlação entre a aderência de duas espécies de

Candida (C. albicans and C. parapsilosis) a células epiteliais da mucosa bucal humana e a

expressão de carboidratos da superfície celular dos fungos através da marcação com lectina. Os

resultados mostraram que a aderência foi bem maior nas amostras com alta expressão α-L-

fucose como indicado pela marcação com UEA-I. Além disso, seus resultados indicaram a

presença de α-D-glucose/ α-D-manose, N-acetyl-D-glucosamina/N-acetylneuraminic ácido e D-

galatose/N-acetyl-D-galactosamina na parede celular.

Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de N-acetyl-D-glucosamina, L-

fucose, D-galactose e glucose/manose na parede celular de Trichophyton tonsurans e outros

fungos filamentosos queratinofílicos através de um simples protocolo de marcação com lectinas.

Material e métodos

Microorganismos

Os fungos filamentosos queratinofílicos foram isolados de solo de parques públicos da

cidade do Recife, Brasil pela técnica “hair-bait” [Leal et. al., 2009]. Para o ensaio de marcação

com lectina, 90 amostras fúngicas, pertencentes a sete gêneros, foram usadas. Trichophyton

tonsurans (com 30 isolados) e Fusarium solani (com 20 isolados) foram as espécies mais

representativas. Várias amostras de outros fungos queratinofílicos bastante comuns também

foram avaliadas, incluindo Paecillomices lilacinus (10), F. oxysporum (10), Microsporum

gypseum (9), Aspergillus terreus (5), A. tamarii (3) e Myceliophthora vellerea (3).

Ensaio de marcação com lectinas

Concanavalin A (Con A), wheat germ agglutinin (WGA), Ulex europeus agglutinin I

(UEA-I) e peanut agglutinin (PNA), todas conjugadas a peroxidase (Sigma Chemical Co., St

Louis, MO, USA) foram usadas de acordo com a técnica modificada publicada por Lima-Neto

et. al., (2009). As amostras fúngicas foram cultivadas em meio espécífico como agar Sabouraud


(Difco), agar Czapek (Difco) e batata-dextrose agar (Difco) por dez dias a 25ºC. Uma fita

adesiva, posicionada com a parte colante para baixo, foi levemente pressionada sobre a colônia

do fungo. A fita foi subsequentemente removida e colocada longitudinalmente sobre laminas de

microscópio. A amostra de fungo na fita foi incubada com lectina (50µg/mL) por 1h a 4°C (Fig.

1). A marcação com lectina foi visualizada usando 3,3-diaminobendizina (DAB) e peróxido de

hidrogênio em PBS por até 8 min. Entre cada etapa foram realizadas lavagens com PBS washes

(2 x 5 min). Ensaios controle foram feitos por ligação da lectina na preparação do açúcar

específico correspondente: N-acetil-D-glucosamina, α-L-fucose, D-galactose e metil-α-D-

manoside para WGA, A UEA mantém I, PNA e Con A, respectivamente, a 300 mM

concentração. O controle da amostra de fungo na fita foi através da ausência da lectina.

O padrão de marcação foi avaliado por microscopia de luz e classificado

qualitativamente como intenso (+++), moderado (++), fraco (+) ou negativo (-), conforme Ozer

(2000).

Resultados

O ensaio de marcação com as lectinas WGA, UEA, PNA e Con A resultaram em seis

padrões de marcação, diferenciando as espécies Aspergillus tamarii, Fusarium oxysporum, F.

solani e Myceliophthora vellerea. As duas espécies de dermatófitos M. gypseum e T. tonsurans

tiveram o mesmo padrão de marcação, bem como A. terreus e Paecillomices lilacinus (Tabela

1).

A lectina WGA marcou intensamente todas as amostras estudadas (Fig. 2a); UEA-I

marcou intensamente os dermatófitos e moderadamente os outros. A lectina PNA marcou

intensamente F. oxysporum; marcou moderadamente Aspergillus, F. solani e P. lilacinus; e

marcou fracamente M. gypseum, M. vellerea e T. tonsurans. Con A marcou moderadamente F.

solani, marcou fracamente A. tamarii e não exibiu nenhuma marcação nos outros fungos.


Nossos resultados mostraram que houve uma alta expressão de N-acetil-D-glucosamina

sobre a parede celular de todas as espécies fúngicas testadas, enquanto a expressão de L-fucose,

D-galactose e glucose/manose apresentaram variações interespecíficas. Glucose e/ou manose

não foram expressas ou não foram acessíveis na parede celular dos isolados A. terreus, F.

oxysporum, M. gypseum, Myceliophthora vellerea, P. lilacinus e T. tonsurans como mostrado

pela ausência de marcação com a lectina Con A.

Discussão

A interação entre lectina e carboidratos da parede celular de fungo tem sido demonstrada

em várias espécies de importância médica como Aspergillus fumigatus, Candida albicans,

Cryptococcus neoformans, F. solani, Paracoccidioides brasiliensis. Estes estudos mostraram

que a maioria dos fungos avaliados exibia N-acetil-D-glucosamina e glucose/manose sobre a

superfície celular, como demonstrada pela marcação com WGA e Con A, respectivamente

(Doyler, 1994; Masuoka, 2004).

Usando lectinas conjugadas a isotiocianato de fluoresceina, Robin et. al., (1986)

descreveram o padrão de marcação com lectinas em A. fumigatus e F. solani isolados de casos

de infecções oculares. Em ambas as espécies WGA, UEA-I e Con A marcaram intensamente

enquanto PNA não exibiu marcação. Este resultado está de acordo com nossos achados, embora

tenha havido algumas variações, talvez devido as condições de crescimento. Nós cultivamos as

amostras fúngicas em meios espécificos como agar Czapek (Difco) e batata-dextrose agar

(Difco) por dez dias a 25ºC. Vários estudos sugerem que a expressão de carboidratos varia de

acordo a idade/ambiente do fungo (Alvino et. al., 2004).

Avaliando os componentes da superfície celular, Esquenazi et. al., (2003) descreveram o

padrão de marcação com lectinas em amostras patogênicas de T. mentagrophytes e T. rubrum


isolados de casos de dermatofitoses. Seus resultados foram similares aos obtidos com nossos

isolados de T. tonsurans que apresentou a reação com WGA mais forte do que com PNA.

O conhecimento do perfil sacarídico da superfície fúngica permite a seleção de lectinas

específicas para, tratamentos terapêuticos, como tem sido proposto para infecções bacterianas

por Umamaheshwari et. al. (2003). Desde que ocorra a expressão de N-acetil-D-glucosamina

sobre a superfície celular do fungo, lectinas específicas para marcar N-acetil-D-glucosamina,

como WGA, poderia ser a base de um tratamento terapêutico, ou como veículo para o

direcionamento da fármaco em casos de infecções invasivas e disseminadas (Trindade et. al.,

2006; Vardar et. al., 1998).

Ao longo das últimas três décadas, um número crescente de fungos filamentosos

queratinofílicos não-dermatófitico foram reconhecidos como agentes de infecção de pele em

humanos e animais produzindo lesões clinicamente similares àquelas causadas por dermatófitos

(Gugnani, 2003).

Ensaio com marcação com lectinas constitui outra abordagem de identificação e

tipificação de fungos, e são facilmente realizadas na maioria dos contextos de laboratórios. O

papel das lectinas no diagnóstico micológico foi examinado em detalhes por vários autores

(Doyler, 1994; Garcia et. al., 2002; Masuoka, 2004).

Nós concluímos que o ensaio de marcação com lectina apresentado neste trabalho,

elimina muito dos passos laboriosos envolvidos em outros protocolos (Recobert et al., 1996;

Lima-Neto et. al., 2009). A quantidade e qualidade de micélio e esporos imobilizados na fita

adesiva foram adequadas para acessar os carboidratos da parede celular de fungos filamentosos

isolados de solos de parques públicos da cidade do Recife, Pernambuco, Nordeste do Brasil.


Tabela 1. Padrão de marcação com lectinas em fungos filamentosos queratinofílicos isolados de amostras de solo coletadas de parques públicos.

Espécies

Números de isolados/

meio de cultura

Padrão de marcação com

lectinas

WGA UEA-I PNA Con A

Aspergillus tamarii 3/ agar Czapek +++ ++ ++ +

A. terreus 5/ agar Czapek +++ ++ ++ -

Fusarium oxysporum 10/ potato-dextrose agar +++ ++ +++ -

F. solani 20/ potato-dextrose agar +++ ++ ++ ++

Microsporum gypseum 9/ agar Sabouraud +++ +++ + -

Myceliophthora vellerea 3/ agar Sabouraud +++ ++ + -

Paecillomyces lilacinus 10/ agar Czapek +++ ++ ++ -

Trichophyton tonsurans 30/ agar Sabouraud +++ +++ + -

Total 90

Padrão de marcação: intenso (+++), moderado (++), fraco (+) ou ausente (-).


Figura 1. Fita adesiva pressionada sobre a colônia (a), a fita com amostra fúngica é posicionada sobre uma lâmina (b), aplicação da solução com lectina (c) e incubação (d). Para detalhes, ver na seção de material e métodos.


Figura 2. Padrão de marcação com lectinas: intenso (a), moderado (b), fraco (c) e ausente (d).


5. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Com base nos resultados obtidos foi possível concluir:

● Aspergillus flavus, A. terreus, Fusarium oxysporum, F. solani, Microsporum gypseum,

Myceliophthora vellerea, Paecillomyces lilacinus e Trichophyton tonsurans são fungos

queratinofílicos isolados do solo de áreas de lazer da cidade do Recife-PE, Brasil.

● O predomínio de Trichophyton tonsurans como agente de dermatomicose entre as

crianças com a faixa etária abaixo de 12 anos de idade deve-se provavelmente ao maior

contato com o solo, especialmente de áreas de lazer.

● A melhor isca para o isolamento de fungos queratinofílicos do solo é crina de cavalo.

A temperatura de 25°C favorece o isolamento e colonização de fungos queratinofílicos em

comparação com a temperatura de 37ºC.

● Os principais fatores ecológicos responsáveis pela distribuição e sobrevivência dos fungos

queratinofílicos no solo são: o elevado fluxo de pessoas e animais domésticos, o solo com

pH quase neutro a fracamente alcalino e a disponibilidade de carbono orgânico, nitrogênio,

fósforo, potássio, magnésio, cálcio e ferro.

● A lectina WGA específica para N-acetyl-D-glucosamine, apresenta-se como melhor

marcador para a superfície celular de A. flavus, A. terreus, F. oxysporum, F. solani, M.

gypseum, Myceliophthora vellerea, P. lilacinus e T. tonsurans.

● Os isolados A. terreus, F. oxysporum, M. gypseum, Myceliophthora vellerea, P. lilacinus e

T. tonsurans não expressam methyl-α-D-mannoside na superfície celular, evidenciado pelo

padrão de marcação com a lectina Con A.

● As espécies dos gêneros Aspergillus e Fusarium testadas demonstram diferenças no

padrão de marcação dos glicoconjugados, sugerindo variações interespecíficas.

● O padrão de aglutinação aos glicoconjugados da superfície celular dos fungos, através da

marcação com lectinas, pode ser utilizado como uma ferramenta para auxiliar na

caracterização dos glicoconjugados da superfície celular dos fungos.

● O ensaio de marcação com lectina apresentado neste trabalho, elimina muito dos passos

laboriosos envolvidos em outros protocolos. A quantidade e qualidade de micélio e esporos

imobilizados na fita adesiva foram adequadas para acessar os carboidratos da parede celular

de fungos filamentosos.


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ANEXOS

queratinofilia e perfil histoquÍmico de fungos ......de fungos, assim como das diferentes...

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