QO423

Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas

O que é a massa de um átomo ?O que é a massa de um átomo ?

M 5M = 5

11H (1p, 1e) = 1.0079H (1p, 1e) = 1.007922H (1p, 1n, 1e) = 2.0141H (1p, 1n, 1e) = 2.014144He (2p 2n 2e) = 4 0026He (2p 2n 2e) = 4 002644He (2p, 2n, 2e) = 4.0026He (2p, 2n, 2e) = 4.0026

4He/ 2H = 1.98 !!

Como é um átomo ?Como é um átomo ?

Como o núcleo ã l d ?!!não explode ?!!

Modelo de Bohr

Forças FundamentaisForças Fundamentais

E 2E = m . c2

Qual é a massa de um átomo ?Qual é a massa de um átomo ?

Massa

=

Soma das massas das partículasSoma das massas das partículas

–

Energia liberada na formação do átomo (núcleo)

Defeito de massaDefeito de massa

• Nenhum átomo (c/ excessão do 12C) tem massa inteira

• Diferença é chamada de Defeito de Massa

Defeito de Massa

Energia de Ligação do Núcleo e Defeito de MassaDefeito de Massa

0,02

0,00

Mas

sa

-0,02

efei

to d

e M

-0,04De

H He Li Be B C N O F Ne Na Mg Al Si P S Cl

-0,06

Elemento

Unidade de massa atômica (u)Unidade de massa atômica (u)

u = 1.6605 x 10-27 kg ( 1/12 12C)

Proton: 1.6726×10-27 kg (1.0073 u)

Nêutron:1.6749 x 10-27 kg (1.0086 u)

Elétron: 9.1093 × 10-31 kg (0.0005u)

Tipos de massas atômicasTipos de massas atômicas• Nominal:• Nominal:

– Massa aredondada em 1 u:H = 1, C = 12, Cl = 35

• Média:• Média:– Massa média dos isótopos:H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532

M i ó i• Monoisotópica:– Massa do isótopo mais abundante:pH = 1.0078, C = 12.0000, Cl = 34.9688

Massas Moleculares ExatasMassas Moleculares Exatas

• Consiste na soma das massas atômicas

É única para cada fórmula

N2 = 28.0061N2 28.0061C2H4 = 28.0313CO = 27 9949CO = 27.9949B2H6 = 28.0656

Isótopos NaturaisIsótopos Naturais

• Substâncias Orgânicas: • 1H (99 98%) 2H (0 01%)H (99.98%), H (0.01%)• 12C (98.93%), 13C (1.07%)• 14N (99.63%), 15N (0.37%)• 16O (99 80%) 18O (0 20%)• O (99.80%), O (0.20%)• 32S (94.93%), 34S (4.29%)• 35Cl (75.78%), 37Cl (24.22%)• 79Br (50 69%) 81Br (49 31%)• 79Br (50.69%), 81Br (49.31%)

MS e Padrão IsotópicoMS e Padrão Isotópico

• MS mede isótopos individuais e não massas médias

• Substâncias apresentam várias massas dependendo da composição isotópicadependendo da composição isotópica

• Composição isotópica varia de acordo com a composição química

Padrão Isotópicop100 9.88e1216.0313

%

CH4

mass14 15 16 17 18 19 20

0

100 9.35e1278.0470

%

C6H6

%

mass0

79.0470

76 77 78 79 80 81 82

[M+1] = 6%[ ]

Benzo[a]Pireno: C HBenzo[a]Pireno: C20H12

[M 1] 22 5%[M+1] = 22.5%[M+2] = 2.3%

100 7.84e12368.1372

C H N OC20H20N2O5

%

369.1372

mass367 368 369 370 371 372 373 374 375

0370.1450

[M+1] = 23 4%[M+1] = 23.4%[M+2] = 3.6%

100 7.49e1249.9923

%

51 992351.9923

mass45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57

0

CH3Cl

100 5.68e1283.9534

85.9534

CH2Cl2

%

87.9455

mass79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93

0

[M+1] = 1%[M+2] = 64%[M+3] = 0%[M+4] = 10%

100 5.13e12204.0473

%

206.0473

%

C10H14Cl2

mass203 204 205 206 207 208 209 210 211

0

205.0473 208.0394207.0473

203 204 205 206 207 208 209 210 211

[M+1] = 11%[M+2] = 64%[M+3] = 7%[M+3] = 7%[M+4] = 10%[M+5] = 1%

100( ) ( ); ( , )

4.52e12228.0150 230.0150

%%

C10H13BrO

mass226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237

0

229.0150 231.0150

10 13

226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237

Padrão IsotópicoPadrão Isotópico

5730 3655 3660 2465 2095 1295

1000 2000 3000 4000 5000 6000

Regra do NitrogênioRegra do Nitrogênio

• Uma molécula orgânica neutra só terá massa impar se ela tiver número ímpar de p pnitrogênio

C H O: 44– C2H4O: 44– CH3CONH2: 59– C6H4(NH2)2: 108– C10H22O: 15810 22

Tabela de IsótoposElemento Isótopo Massa (u) Abundância

(%) 1H 1 00782 100H H 1.00782 100H2H 2.01410 0.02

12C 12.00000 100C13C 13.00335 1.07 14N 14.00307 100 N 1515N 15.00010 0.3716O 15.99491 100 O 18O 17 99916 0 20O 17.99916 0.2032S 31.97207 100 S 34S 33.96786 4.52S 33 96 86 535Cl 34.96885 100 Cl 37Cl 36.96590 31.96 7979Br 78.91833 100Br81Br 80.91628 97.27

Instrumentação

IntroduçãoIntroduçãode

amostras

Fonte de Ionização

Analizadorde m/z Detector

Vácuo

EICIAPCI

BQTof

Direto GCHPLC

Multiplicador e-

MCPAPCIAPPIESI

TofITLIT

HPLCCE

ESIMALDIFAB

ICROrbitrap …

DESIDART …

J J. Thomson recebeu o Prêmio Nobel de Física em

J J. Thomson recebeu o Prêmio Nobel de Física emPrêmio Nobel de Física em

1906Prêmio Nobel de Física em

1906

J. J. ThomsonJ. J. Thomson

Descoberta do elétron e medida da sua razão massa/carga (m/z) !!

Descoberta do elétron e medida da sua razão massa/carga (m/z) !!

Ionização por Elétrons (EI)Ionização por Elétrons (EI)

EIEI

Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorçãotérmica) a uma pressão típica de 10-5 torr sãotérmica), a uma pressão típica de 10 torr, sãobombardeadas por elétrons, com energia típica de 70eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura deum elétron formando íons M+. ou M-.. Íons positivossão predominantes. M-. se tornam importantes para

lé l lt EAmoléculas com alta EA.

M + e- (70 eV) M+. (~ 5-10 eV) + 2e- (~60-)65 eV)

Fonte de EIFonte de EI

EI: CaracterísticasEI: CaracterísticasProcesso unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídosda fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller“).

Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e sef t t t l i l tfragmentam total ou parcialmente.

EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) comotambém fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas detambém fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas deespectros de EI a 70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.

Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo pesomolecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicasrelativamente pequenas.

Q d í l l é b d (d id di iQuando o íon molecular não é observado (devido a dissociaçãoexcessiva), existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M+.

é uma espécie instável.

EI ocorre em ~10-16 s. Uma em cada 103-105 moléculas que entramna fonte de EI é ionizada.

Energia das MoléculasEnergia das Moléculas

ExemplosExemplos

Acetofenonam = 120

ExemplosExemplos

Progesteronem = 314

ExemplosExemplos

C7H16 m = 100

Energia dos ElétronsEnergia dos Elétrons

Energia x FragmentaçãoEnergia x Fragmentação

Dissociação de Íons RadicalaresDissociação de Íons RadicalaresM + e- M+. + 2e-M + e M + 2e

F+. + mol0 F+ + Rad.

F+ + mol0F+ + mol0 F+ + Rad

F+ l0

F+. + mol0 F+ + Rad.

F+ + mol0F+ + mol0F+ + Rad.F+. + mol0

Regra do Elétron Par

Í

Regra do Elétron Par

• Íons positivos radicalares (camada aberta) podem:p– Perder radical e formar fragmentos positivos

(camada fechada)(camada fechada)– Perder molécula neutra e ficar

positivo/radicalar (camada aberta)positivo/radicalar (camada aberta)• Íons positivos (camada fechada) podem:

– Perder moléculas neutras e ficar positivo (camada fechada)( )

DefiniçõesDefinições

Í• Íon Molecular: íon correspondente à

molécula ionizada: M+.molécula ionizada: M+

• Pico base: íon mais intenso no espectrop

Fragmentações em EIFragmentações em EI

Í• Localizar Íon Molecular• Observar característica do espectroObservar característica do espectro• Analisar as fragmentações

Íon MolecularÍon Molecular

Í• Íon de mais alta massa (descontado 13C)• Se tem alta exatidão calcular DBISe tem alta exatidão, calcular DBI• Verificar fragmentações lógicas

ExemploExemplo

152

195

ExemploExemplo

180

166

Exemplosp

Progesteronem = 314

ExemplosExemplos

C7H16 m = 100

Mecanismos de FragmentaçãoMecanismos de Fragmentação

• 4 clivagens principais:– Dissociação sigmaç g– Clivagem alfa

Clivagem indutiva– Clivagem indutiva– Fragmentação remota

• Rearranjos– MclaffertyMclafferty

Fragmentação de HidrocabonetosFragmentação de Hidrocabonetos

• Dissociação Sigma seguida de perda de alcenos

• Íons moleculares pouco intensosR ifi ã di i f t ã• Ramificação dirige a fragmentação

• Íons característicos: 15, 29, 43, 57, 71o s ca acte st cos 5, 9, 3, 5 ,

Exemplosp

ExemplosExemplos

ExemplosExemplos

AlcenosAlcenos

• Dissociação Sigma• Formação de íon alílicoFormação de íon alílico• Forma série C2H2n-1 (2 u menor que

Al )Alcano)

ExemplosExemplos

ÁlcooisÁlcoois

Exemplos

AromáticosAromáticos

• Formam gerlamente, m/z 77, 78 e/ou 79• m/z 91 / 92 para alquil-aromáticosm/z 91 / 92 para alquil aromáticos• Íons característicos de m/z 39, 51 e 65• Íons moleculares mais intensos que HC

AromáticosAromáticos

AromáticosAromáticos

ÁlcooisÁlcoois

ÁlcooisÁlcoois

Álcoois

154

156

EIEI

• Gera M+. e fragmentos• Pode não gerar íon molécularPode não gerar íon molécular

Ionização Química (CI)Ionização Química (CI)Munson and Field 1966Munson and Field - 1966

EI• EI:– Simples– Produz extensa fragmentação– Muitas vezes tem M+.Muitas vezes tem M– Quando não tem M+.

Controle da Exotermicidade da R ã E t ã d F t ãReação: Extensão de Fragmentação

CH44

Exemplos

Iso-C4H10

NH3

Exemplos

Exemplos

GC/MS

GC/MSGC/MS

Mass Analyzer

GC/MSGC/MS

Estrutura dos dadosEstrutura dos dados

GC/MS

GC/MSGC/MS

Mass Analyzer

GC/MSGC/MS

Estrutura dos dadosEstrutura dos dados

Modos de aquisiçãoModos de aquisição

• Varredura– Análises qualitativasq– Análises quantitativas (menor sensibilidade)

SIM (S l t d I M it i )• SIM (Selected Ion Monitoring)– Análises quantitativas (maior sensibilidade)

Eletrosprayp yJohn Fenn – 1989

Prêmio Nobel em Química 2002 !

Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451.

Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675.

Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64.

"Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,“

ESI: Princípio GeralESI: Princípio Geral

ESI: Princípio GeralESI: Princípio Geral( Uma solução da amostra em pH ácido ou básico (ou

“neutra” de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica Um fino sprayeletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino spray(aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico de +4000V (ou – 4000V). O u a to ca po e ét co de 000V (ou 000V). Ocontra-íon é oxidado (ou reduzido) e formam-se gôtas com excesso de carga positiva (ou negativa). O solvente evapora, e o volume das gôtas é reduzido, e as gôtas se subdividem. Eventualmente,devido a alta repulsão entre os íons de mesma cargadevido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons evaporam (são “ejetados”)( ) p ( j )das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).

Mecanismo de DessorçãoMecanismo de Dessorção

Sonda de ESISonda de ESI

ESI e NanoESIESI e NanoESI

ESI: Moléculas OrgânicasESI: Moléculas Orgânicas

ESI: Moléculas OrgânicasESI: Moléculas Orgânicas

Complexos OrganometálicosComplexos Organometálicos

O

ORuOO

O

N100 913.0

912.0

911.0

910.0

O

Ru

RuO

OOO

OO

O

N N

%909.0

908.0

907.0

914.0

915.0

916.0

ON

903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923m/z0

906.0

905.0

904.0

918.0917.0

919.1

100 913.0

%

620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940m/z0

PolímerosPolímeros

C9H19 O(CH2CH2O)n H

ESI Glu Fibrinopeptídeo (1568 9)ESI Glu-Fibrinopeptídeo (1568.9)100

( )234785.46

100204785.46

785 97

%

%

785.97

786 47

m/z785 786 787 788

0

786.47

786.95

m/z0 m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

0

(1568 9 + 2 ) / 2 = 785 46(1568.9 + 2 ) / 2 = 785.46(1569.9 + 2 ) / 2 = 785.96

Íons Multicarregados:Padrão Isotópico

+1 = 1/1 = 1.00

+2 = 1/2 = 0.50+2 1/2 0.50

3 1/3 0 33+3 = 1/3 = 0.33

+4 = 1/4 = 0.25

Íons MulticarregadosÍons MulticarregadosB-Gal 10 fm/uL

100

hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 302671.41

B-Gal 10 fm/uL

100

hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 228567.38100

567.38

567.63

671.90

100

567.12567.63

%

668.70567.85

617.44

575.82604.17576.81587.29

626.92

653.41627.90

672.42

672.91

%

567.85

568.11568 39

m/z560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680

0

587.29 627.90

m/z567 568

0

568.39

B-Gal 10 fm/uL

100

hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 103668.70668.37

B-Gal 10 fm/uL

100

hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 302671.41100 668.37

669.04

100

671.90

%

668.18667 36

669.37

669.68

670 10 670 38

%

672.42

672.91673 40

m/z668 669 670

0

667.36 670.10 670.38m/z

671 672 673 6740

673.40

ESI de ProteínasESI de ProteínasMioglobina: (16881 Da) : (16881 + 20) / 20 = 845.1Mioglobina: (16881 Da) : ( )

(16881 + 21) / 21 = 804.9(16881 + 22) / 22 = 768.3teste

100

Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907) TOF MS ES+ 1.48e3804.9

% (M + x) / x = m/z1

m/z804 805 806

0

( )(M + x +1) / (x +1) = m/z2

1001.48e3804.9768.3735.0

704.4

845.1889.5

938 9

%

676.3

650 3

938.9

994.11056.1

1126.5

m/z650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200

0

650.31206.9

ESI: ComplexosESI: Complexos

Urease da Helicobacter pylori

1.05 MDa !

ESI de Vírus Intacto

LC MSLC-MS

• ESI: Introdução de amostra em solução• Possibilidade de acoplamento c/ HPLCPossibilidade de acoplamento c/ HPLC

LC MS Urina: MetabólitosLC-MS Urina: Metabólitos

Total: ~1500 peptídeos!

MALDIMALDIIonização e Dessorção a LASER

Auxiliada por Matriz

Koichi Tanaka

Franz HillenkampMichael KarasMichael Karas

MALDI: PrincípioMALDI: Princípio

ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi andION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and Richard Knochenmuss, Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17, 337–366

MALDI: Princípio

Nuvem de plasma (Plume)Nuvem de plasma (Plume)

MALDIMALDI

MALDI: Íons MonocarregadosMALDI: Íons Monocarregados

100( ) ( ) ( ) ( )

3.60e312417.97

% 17016.75

12630.54

24042.51

m/z0

17224.64

10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000m/z0

MALDI: SensibilidadeMALDI: Sensibilidade

42 Zeptomols42 Zeptomols (25000 Moléculas)de substância P !!!

J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12, 1055–1063

MatrizesMatrizes

FulerenosFulerenos

PolímerosPolímeros

PEG 10KDa

ProteínasProteínas

?

MALDI: CaracterísticasMALDI: Características

• Forma íons monocarregados• SensívelSensível• Rápido para amostras individuais• Mais Tolerante a contaminantes• Problemas com massa baixa• Problemas com massa baixa

MS: Métodos de IonizaçãoMS: Métodos de Ionização

MALDI

ssa

Mas

EI ESIPolaridade