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LÍVIA DORSCH ROCHA
EFEITOS DOS ÁCIDOS HÚMICOS EXTRAÍDOS DE LODO DE ESGOTO EM Zea mays L. SOB RESTRIÇÃO HÍDRICA E ESTRESSE
SALINO
VITÓRIA - ES
2018
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2
LÍVIA DORSCH ROCHA
EFEITOS DOS ÁCIDOS HÚMICOS EXTRAÍDOS DE LODO DE ESGOTO EM Zea Mays L. SOB RESTRIÇÃO HÍDRICA E ESTRESSE
SALINO
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Vegetal do Centro de Ciências
Humanas e Naturais da Universidade Federal do Espírito
Santo como parte dos requisitos exigidos para a obtenção
do título de Doutor em Biologia Vegetal.
Área de concentração: Fisiologia Vegetal.
Orientador(a): Prof.ª. Dr.ª Silvia Tamie Matsumoto
VITÓRIA - ES
2018
3
EFEITOS DOS ÁCIDOS HÚMICOS EXTRAÍDOS DE LODO DE ESGOTO
EM Zea mays L. SOB RESTRIÇÃO HÍDRICA E ESTRESSE SALINO
LÍVIA DORSCH ROCHA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Vegetal do Centro de Ciências Humanas e Naturais da Universidade Federal do
Espírito Santo como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Doutor em Biologia Vegetal na área de concentração Fisiologia Vegetal.
Aprovada em 16 de Março de 2018.
Comissão Examinadora:
___________________________________
Dr.a Silvia Tamie Matsumoto - UFES Orientador(a) e Presidente da Comissão
___________________________________
Dr. Antelmo Ralph Falqueto - UFES Examinador Interno
___________________________________
Dr.aCamila Dias Milanez - UFES Examinador Interno
_________________________________
Dr.a Dania Elisa Christofoletti Mazzeo Morales- UNESP Examinador Externo
___________________________________
Dr. Leonardo Barros Dobbss - UFVJM Examinador Externo
4
Aos familiares, namorado, amigos e
docentes que possibilitaram e torceram
pela realização desta tese, dedico.
5
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), funcionários e docentes,
agradeço pela estrutura, vivência e aprendizado que ao longo de dez anos
possibilitaram uma formação científica, profissional e pessoal de excelência.
Ao Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal da Universidade Federal do
Espírito Santo, reconheço e sou grato aos esforços dos funcionários e docentes que
ao longo da minha formação me concederam ensino, estrutura de qualidade e meios
para a realização desta tese.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) que
subsidiou a bolsa de pesquisa, agradeço pelo apoio financeiro, essencial ao longo
desta caminhada.
Ao Grupo de Estudos de Mutagênese e Toxicologia (GEMUT) da Universidade
Federal do Espírito Santo que ao longo de anos mostrou-se unido e estruturado para
a realização dos trabalhos científicos. Neste, agradeço aos amigos Me. Ian Drumond
Duarte, Ma. Francielen Barroso Aragão, Me. Edvar Junior Roncetti Coelho e Ian de
Oliveira Martins pela parceria e colaboração na realização desta tese. Aos novos e
mais recentes amigos, também agradeço.
À Profª Drª Marisa Narciso Fernandes, por disponibilizar seu laboratório para realização
de parte do projeto e por abrir portas para um novo caminho a seguir.
À todos os professores e profissionais do Programa de Pós-graduação em Biologia
Vegetal, pelo conhecimento transmitido, dedicação e valiosas contribuições.
À Profª. Dra. Silvia Tamie Matsumoto, pela amizade, por ter aceitado orientar este
trabalho e por todo o apoio durante a minha formação.
Agradeço aos membros da banca, que aceitaram corrigir este trabalho e por todas
as contribuições.
6
Aos velhos companheiros do GEMUT (Marina, Lívia, Ian e Iara), por dividirem cada
detalhe deste trabalho comigo, pela força, amor e respeito que recebi de vocês
todos esses anos.
Ao meu namorado Carlos Fernando Ávila Gratz sou imensamente grato pelo
companheirismo, essencial para a realização desta tese e todo estudo envolvido.
Mais que isso, agradeço à união estabelecida ao longo desses anos, seja na
pesquisa, seja em nossas vidas.
Aos meus nobres amigos que sempre me fortaleceram com suas belas palavras e
ajudas.
Aos colegas do PPGBV, pelo apoio e por todos os momentos excepcionais que
passamos juntos.
À minha amada família, pela confiança, suporte, amor e carinho. Sem vocês e seu
suporte emocional e financeiro eu não conseguiria.
A Deus, gratidão.
7
RESUMO
A falta de destinação de resíduos sólidos gerados por tratamentos de lodo de esgoto
sanitário tem motivado pesquisas na área da ciclagem destes materiais. Uma das
alternativas que vem sendo investigada é a extração de substâncias húmicas e/ou
de suas frações bioativas. O ácido húmico é uma das frações mais investigada
devido sua alta interatividade com o vegetal promovendo seu crescimento por meio
do desenvolvimento fisiológico e bioquímico. Sabe-se também que estresses
abióticos causados pela deficiência hídrica compromete o desenvolvimento
fisiológico da planta bem como seu crescimento. Neste sentido, o presente trabalho
visa investigar as respostas à aplicação de ácido húmico proveniente de lodo de
esgoto (AH-LE- 2.0 mM C L-1) em plântulas de milho estressada por NaCl-100mM
(estresse salino) e por PEG 6000 (restrição hídrica) por meio da integração de
análises elementares, fisiológicas, bioquímicas, toxicogenéticas e do crescimento
vegetal buscando avaliar os potenciais benefícios/ riscos da utilização deste
bioestimulante. A fim de investigar a atuação do ácido húmico de lodo de esgoto, foi
realizada hidroponia em plântulas de milho com imposição de restrição hídrica (PEG
6000 + NaCl) com aplicação do ácido (2.0 mM C L-1). Resultados da quantificação
dos elementos C, H, N e O do AH-LE indicaram-no como fonte de nutrientes para as
plantas devido a disponibilização destes elementos. Taxas da fotossíntese, como
assimilação de carbono, transpiração e condutância mostraram-se amenizadas em
tratamentos com adição do ácido húmico, tanto em estresse salino quanto em déficit
hídrico. Taxas de crescimento corroboraram com resultados da fotossíntese
indicando menores perdas de biomassas dos órgãos vegetais e maior crescimento
de raízes quando relacionados aos tratamentos com ácido húmico sob estresses.
Além disso, marcadores bioquímicos antioxidantes (SOD, APX) ratificaram o
potencial bioquímico do AH-LE em aumentar a defesa de plantas sob deficiência
hídrica contra espécies reativas de oxigênio. Foi observada também, maior atividade
das enzimas ligadas à permeabilidade da membrana plasmática tais como H+-
ATPases em tratamentos com material húmico confirmando esta característica
intrínseca. Outro indicador bioquímico de estresse abiótico foi o acúmulo do
aminoácido prolina que se mostrou mais eficiente em plantas sob estresse com
adição do AH-LE. Estas mesmas plantas tiveram redução da peroxidação lipídica
(LPO) e do extravasamento de eletrólitos apresentando-se menos afetadas quanto
8
aos seus teores relativos de água. Adicionalmente, a análise toxicogenética não
indicou potenciais citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos nos tratamentos
evidenciando, desta forma, maior segurança com a utilização AH-LE a nível celular.
Diante destes resultados, é possível sugerir a utilização do ácido húmico em plantas
estressadas por restrição hídrica como remediador dos efeitos causados pela
deficiência hídrica.
Palavras-chave: material húmico • efluente sanitário • fisiologia vegetal • estresse
abiótico • milho •
9
ABSTRACT
The lack of disposal of solid waste generated by sewage sludge treatment has
motivated research in the area of cycling of these materials. One of the alternatives
that has been investigated is an extraction of chemical substances and / or their
bioactive fractions. Humic acid is one of the fractions most investigated due to its
high interactivity with the vegetable promoting its growth through the biochemical
development. It is also known that abiotic stress caused by water deficiency
compromises the physiological plant development as well as its growth. (AH-LE- 2.0
mM C L-1) in maize seedlings stressed by NaCl-100 mM (saline stress) and by PEG
6000 (water restriction) by integrating elemental, physiological, biochemical,
toxicogenic and of plant growth, seeking to evaluate the potential benefits / risks of
using this biostimulant. A solution for the application of humic acid from sewage
sludge was performed with hydroponics in maize seedlings with water restriction
(PEG 6000 + NaCl) with application of acid (2.0 mM C L-1). Results of the
quantification of the elements C, H, N o O AH-LE indicated it as a source of nutrients
for the plants due to the availability of these elements. Photosynthesis rates, such as
carbon assimilation, transpiration and conductance, are shown to be attenuated in
treatments with the addition of humic acid, both in saline stress and in water deficit.
Growth rates corroborated with photosynthesis results indicating lower biomass loss
of plant organs and higher root growth when related to treatments with humic acid
under stress. In addition, biochemical antioxidant markers (SOD, APX) ratified the
biochemical potential of AH-LE in increasing the defense of plants under water
deficiency against reactive oxygen species. It was also observed higher activity of
enzymes bound to plasma membrane permeability such as H + -ATPases in
treatments with humic material confirming this intrinsic characteristic. Another
biochemical indicator of abiotic stress was the accumulation of the amino acid proline
that was shown to be more efficient in stress plants with AH-LE addition. These
plants are successful in LPP and electrolyte leakage and are less affected by their
effects. In addition, a toxicogenic analysis did not indicate cytotoxic, genotoxic and
mutagenic potentials in the treatments, thus evidencing greater safety with the use of
AH-LE alection cell. Considering these results, it is possible to suggest a use of
humic acid in plants stressed by water restriction as a remedy of the effects caused
by water deficiency.
10
Keywords: humic material • sanitary effluent • plant physiology • abiotic stress • corn
•
11
LISTA DE TABELAS
CAPITULO 1 –RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS, CITOGENÉTICAS E
DO CRESCIMENTO EM Zea mays L. SOB RESTRIÇÃO HÍDRICA TRATADA COM
ÁCIDO HÚMICO PROVENIENTE DO LODO DE ESGOTO
Tabela 1: Caracterização Elementar do Ácido Húmico de Lodo de Esgoto..........121
Tabela 2: Análise de Troca Gasosa em Zea mays.................................................122
Tabela 3: Parâmetros Foliares em Zea mays..........................................................122
Tabela 4: Análise do Crescimento Vegetal de Zea mays .......................................122
Tabela 5: Análise de Marcadores Bioquímicos em raízes e folhas de Zea mays..123.
Tabela 6: Análise Citogenética em raízes de Zea mays..........................................123
CAPITULO 2 –RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS, CITOGENÉTICAS E
DO CRESCIMENTO EM Zea mays L. SOB ESTRESSE SALINO TRATADA COM
ÁCIDO HÚMICO PROVENIENTE DO LODO DE ESGOTO
Tabela 1: Caracterização Elementar do Ácido Húmico de Lodo de
Esgoto..........Erro! Indicador não definido.124
Tabela 2: Análise de Troca Gasosa em Zea mays................................................125
Tabela 3: Parâmetros Foliares em Zea mays.............................................Erro!
Indicador não definido.............125
Tabela 4: Análise do Crescimento Vegetal de Zea mays ......................................125
Tabela 5: Análise de Marcadores Bioquímicos em raízes e folhas de Zea mays..126
Tabela 6: Análise Citogenética em raízes de Zea mays..........................................126
12
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 155
2. OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 157
3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 177
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................... 199
4.1 Lodo de Esgoto Sanitário ...................................... Erro! Indicador não definido.9
4.2 Substâncias Húmicas e Ácidos Húmicos .............. Erro! Indicador não definido.9
4.3 Déficit Hídrico ......................................................... Erro! Indicador não definido.
4.4 Ácidos Húmicos e Estresses hídricos..........................................................24 4.5 Milho ................................................................. Erro! Indicador não definido...24
4.6 Investigação Biológicas............................................................................. 25
CAPITULO1– RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS, CITOGENÉTICAS E
DO CRESCIMENTO EM Zea mays L. SOB ESTRESSE SALINO TRATADA COM ÁCIDO
HÚMICO PROVENIENTE DO LODO DE ESGOTO SANITÁRIO........................................
42
RESUMO .................................................................................................................. 43
ABSTRACT .............................................................................................................. 44
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 45
2. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 47
2.1. Preparo das amostras ................................................................................... 47
2.2. Extração de substâncias húmicas ................................................................. 47
2.3. Análise elementar do ácido húmico ............................................................... 48
2.4. Ensaio com Zea mays L. ............................................................................... 48
2.5. Análise de trocas gasosas e concentração relativa da clorofila ..................... 48
2.6. Densidade estomática ................................................................................... 49
2.7 Extravasamento de eletrólitos.........................................................................49
2.8 Determinação do status hídrico da Zea mays................................................49
2.9 Análises Quantitativas do Crescimento Vegetal.............................................50
3.0 Análises bioquímicas em Zea mays L.............................................................50
3.1 Análise Citogenética em Zea mays L..............................................................51
3.2 Análises Estatísticas................................................................................51
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................51
3.1 Análise Elementar CHN .................................................................................. 51
3.2 Análises de Trocas Gasosas ......................... Erro! Indicador não definido.52
3.3 Status hídrico de Zea mays L. ....................................................................... 54
13
3.3.2 Tolerância Protoplasmática ......................................................................... 54
3.3.3 Densidade Estomática....................................................................................56
3.4 Análises Quantitativas do Crescimento Vegetal em Zea mays L....................57
3.5 Biomarcadores Bioquímicos em Raízes e Folhas de Zea mays L...................59
3.6 Avaliação Citogenética em Raízes de Zea mays L...........................................62
4. CONCLUSÕES .................................................................................................... 63
6. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 63
CAPITULO 2 – INFLUÊNCIA DO ÁCIDO HÚMICO DE LODO DE ESGOTO SANITÁRIO EM
PLÂNTULAS DE Zea mays L. SOB REGIME DE DÉFICIT HÍDRICO QUANTO AOS
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS, CITOGENÉTICOS, FISIOLÓGICOS E DE
CRESCIMENTO....................................................................................................................87
ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.RESUMO ...................................................... 88
ABSTRACT .............................................................................................................. 89
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 90
2. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 93
2.1 Preparo das amostras ................................................................................... 93
2.2 Extração de substâncias húmicas ................................................................. 93
2.3 Análise Elementar do Ácido Húmico .............................................................. 94
2.4 Condições experimentais Ensaio com Zea mays L. ...................................... 94
2.4.1 Análises de Trocas Gasosas e Concentração Relativa da Clorofila............. 94
2.4.2 Parâmetros Foliares.......................................................................................94
2.4.3 Densidade Estomática....................................................................................95
2.4.4 Extravasamento de Eletrólitos........................................................................96
2.4.5 Determinação do Status Hídrico de Zea mays............................................96
2.4.6 Análises do Crescimento Vegetal................................................................96
2.4.7. Análises Bioquímicas em Zea mays...........................................................96
2.4.8 Análise Citogenética em Zea mays.............................................................97
2.5 Análises Estatística........................................................................................97
3. RESULTADOS e DISCUSSÃO ......................................................................... .100
3.1 Análise Elementar CHN ............................................................................ ...100
3.2 Análises de Trocas Gasosas...........................................................................101
3.3 Parâmetros Foliares .................................................................................... 103
3.3.1 Status hídrico de Zea mays...........................................................................103
3.3.2 Tolerância Protoplasmática.......................................................................104.
14
3.3.3 Densidade Estomática ...............................................................................105
3.4 Análises do Crescimento Vegetal em Zea Mays L.......................................106
3.5 Análise Bioquímica em Raízes e Folhas de Zea mays L..............................108
3.6 Avaliação Citogenética em Raízes de Zea mays L. ....................................111
4. CONCLUSÃO .................................................................................................... 111
5. AGRADECIMENTOS.............................................................................................112
6. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 112
7. CONCLUSÃO GERAL.............................................................................................120
15
1. INTRODUÇÃO GERAL
O lodo de esgoto sanitário (LES) vem se tornando uma problemática na sociedade
devido a sua alta produção sem destinação adequada, pois se trata de um resíduo
sólido que muitas vezes pode apresentar contaminantes e poluentes químicos e
biológicos em sua composição, embora também apresente micro e macronutrientes
na sua elevada carga orgânica. O Brasil produz cerca de 150 mil a 220 mil toneladas
de matéria seca por ano onde apenas 37% da população urbana tem seu esgoto
devidamente coletado e tratado. Diante desta situação, diversas aplicações, com o
uso direto tratado ou não do lodo vêm sendo desenvolvidas no sentido de reduzir a
geração deste resíduo, sendo que a principal é o seu uso na agricultura como
condicionador e fertilizante do solo.
Outra alternativa que vem sendo estudada para destinação final do LES é a extração
de substâncias húmicas (SH). As SH representam o maior componente da matéria
orgânica do solo e é produzida a partir da ação microbiana, por meio da
decomposição biológica, que formam agregados supramoleculares com domínios
hidrofílicos (ácidos fúlvicos - AF), e/ou hidrofílico-hidrofóbicos (ácidos húmicos- AH).
Essas substâncias promovem diversos benefícios nos vegetais podendo influenciar
no transporte, biodisponibilidade e complexação de metais e pesticidas no ambiente,
são capazes de adsorver diversos poluentes orgânicos, são reguladoras de troca
catiônica, promovem crescimento radicular, aumentam o conteúdo de clorofila,
auxiliam o sistema bioquímico de defesa entre outras características.
Os ácidos húmicos (AH) são uma fração com bioatividade alta por apresentarem
componentes de fácil interação com compostos orgânicos e inorgânicos. Estes
ácidos são solúveis em meio alcalino e decantam em meio ácido. Pesquisas
apontam diversos benefícios gerados pelo uso deste ácido orgânico como
tratamento ou bioestimulantes em conjunto com outros fertilizantes por baratear o
custo final do cultivo. São muitas as colaborações que o AH promove no
desenvolvimento vegetal, dentre elas podemos citar: atuação na permeabilidade da
membrana celular, na entrada de oxigênio e outros nutrientes, no aumento da
respiração e fotossíntese, na maior absorção do sistema radicular e estimulando
atividade de diversas enzimas e metabólitos que agem na defesa. Por estes motivos,
essa fração foi escolhida como objeto de estudo neste trabalho.
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Embora as frações húmicas estejam estabelecidas em promover benefícios
fisiológicos na planta, pouco se sabe sobre o potencial do AH na interação com o
vegetal frente a estresses causados pela deficiência hídrica. O estresse salino é
estresse abiótico que provoca deficiência hídrica devido ao ajuste osmótico interagir
com soluções de alta concentração de solutos que acabam aumentando o potencial
osmótico/solutos que colaboram para passagem de água a compartimentos mais
concentrados por meio da osmose. Ambos os estresses causados pela deficiência
hídrica geram mecanismos de proteção para amenizar a perda de água pela planta.
Ações mecânicas, biológicas e químicas em plantas são modificadas no sentido de
prevenir a queda no potencial de água nos tecidos vegetais provocada pela
desidratação celular sem que haja danos fatais nos processos metabólicos.
Respostas anatômicas e fisiológicas são ativadas, tais como, o aprofundamento do
sistema radicular, aumento da razão raiz/parte aérea, ajuste da osmorregulação das
raízes e folhas, redução da condutância (menor transpiração), diminuição da
superfície evaporativa (área foliar e estômatos) e ajuste osmótico (acúmulo de
solutos). Apesar de existir uma reação intrínseca do vegetal buscando a redução de
danos, prejuízos em processos metabólicos são gerados, principalmente se tratando
da fotossíntese que é a responsável pela produção de energia e esqueleto
carbônico. Com o fechamento e redução dos estômatos a capacidade difusiva dos
gases diminui, reduzindo a entrada de CO2 que é o subtrato principal do processo de
fotossíntese, desta forma acaba comprometendo a produtividade da planta caso o
estresse seja prolongado e, se estabelecido por muito tempo pode causar sua morte.
Ao se tratar de efeitos antagônicos tanto os promovidos pelos estresses hídricos
quanto os pelo AH foi percebido a necessidade da investigação a nível fisiológico e
bioquímico em plântula de milho. O milho foi escolhido como organismo teste devido
sua grande importância econômica global, também por ser usado tanto em testes
fisiológicos e citogenéticos e por ser um vegetal de literatura científica ampla que
facilita correlações futuras já que o presente assunto no meio científico ainda é
escasso.
Diante deste exposto, foi realizada uma investigação da atuação do ácido húmico,
proveniente do lodo de esgoto sanitário, sobre plântulas de milho em solução
hidropônica tratadas com PEG 6000, mimetizando o estresse hídrico para
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estabelecer a comparação e o efeito biológico esperado. Análises de crescimento,
da fisiologia, citogenética e bioquímicas do vegetal foram realizadas a fim de se
complementarem quanto ao resultado final. Concomitante, foi realizada também a
investigação do mesmo ácido húmico frente a estresse salino, por meio do sal NaCl,
em plântulas de milho seguidas das mesmas análises onde foram descritas e
discutidas no segundo capítulo.
2. OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos dos ácidos húmicos
provenientes de lodo de esgoto sanitário sobre plântulas de milho sob déficit
hídrico (PEG-6000) e estresse salino (NaCl), no aspecto fisiológico, bioquímico e
toxicogenético.
3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Quantificar os elementos (C, H, N e O) do ácido húmico proveniente de lodo
de esgoto sanitário (AH-LE);
2. Avaliar por meio de parâmetros foliares o potencial hídrico, teor relativo de
água, extravasamento de eletrólitos e densidade estomática em folhas de
plântulas de Zea mays L. sob imposição de restrição hídrica (PEG-6000) e
estresse salino (NaCl) com tratamento com AH-LE.
3. Investigar a taxa de crescimento e o teor de clorofila relativo do Zea mays L.
sob restrição hídrica imposta por PEG 6000 e NaCl tratados com AH-LE.
4. Quantificar as atividades dos marcadores bioquímicos superóxido dismutase
(SOD), peróxido de ascorbato (APX), glutationa reduzida (GSH), protoatpase
(H+-ATPase) e protoatpase total, bem como avaliar os teores do aminoácido
prolina e da peroxidação lipídica (LPO) da membrana plasmática em raízes e
18
folhas de plântulas de Zea mays sob tratamento com ácido húmico após
imposição de restrição hídrica por meio do PEG 6000 e NaCl.
5. Avaliar os efeitos toxicogenéticos (citotoxicidade, genotoxicidade e
mutagenicidade) dos tratamentos PEG 6000 e NaCl aplicados nas raízes de
Zea mays com adição do AH-LE.
19
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Lodo de Esgoto Sanitário
Lodo de esgoto sanitário (LES) é um resíduo sólido gerado nos processos de
tratamento de efluente sanitário, constituindo-se de uma fonte de matéria orgânica e
de nutrientes com alto potencial de riscos à saúde pública e ao ambiente devido à
chance de proliferação de vetores de moléstias e organismos nocivos (Resolução
CONAMA 375/2006). O Brasil produz, anualmente, cerca de 150 a 220 mil toneladas
de matéria seca de lodo de esgoto (LE) (Pedroza, 2010) sendo que apenas 37,9%
da população urbana têm seu esgoto devidamente coletado e tratado (SNIS, 2010).
Até a década de 60, a disposição final do lodo, resultante de sistemas de tratamento
de efluentes, era feita em aterros sanitários. Mas, devido ao aumento na geração
deste resíduo, essa destinação a ser ineficaz do ponto de vista físico e ambiental
(GEYER, 2001). Mundialmente, têm-se aplicado diferentes métodos de
reaproveitamento deste material, variando conforme as características intrínsecas de
cada caso.
O lodo de esgoto tem sido fortemente sugerido para a aplicação na agricultura como
condicionador e fertilizante do solo, pois apresenta em sua composição altos teores
de matéria orgânica (BETTIOL e CAMARGO, 2006; LIMA et al., 2011). Entretanto,
como o lodo pode conter elevadas concentrações de contaminantes químicos e
biológicos, essa prática pode levar à adição direta de diversos patógenos e
substâncias químicas não desejadas ao solo agriculturável e, consequentemente, na
cadeia alimentar. Outro fator de preocupação é a composição variável do resíduo
nas diferentes regiões e épocas do ano, dificultando o monitoramento dos
contaminantes (SAITO, 2005).
Umas das alternativas de ciclagem deste composto, que possui elevada carga
orgânica, é a extração de substâncias húmicas, seguida da extração do ácido
húmico. Sendo este último composto caracterizado por apresentar maior
bioatividade em vegetais, dentre as frações constituintes das SH, colaborando para
a sua aplicação em modelos de cultivo. A alta bioatividade inerente ao AH (ácidos
húmicos) nos vegetais é resultante de mecanismos que favorecem a agregação de
complexos organominerais (OADES, 1984), contribuem para a solubilização de P
(fósforo) e diminuição da energia de fixação nos óxidos (SANTOS, 1984). Também
apresentam capacidade de adsorção de metais pesados (CANELLAS et al., 2002) e
servem de forte poder tampão da solução do solo (SIQUEIRA et al., 1990). Além de
servir como reserva de nutrientes às plantas (STEVENSON, 1994) podendo fornecer
estratégias para melhorar a qualidade do solo e restaurar sua sustentabilidade.
4.2 Substâncias Húmicas e Ácidos Húmicos
Para melhor compreensão dos ácidos húmicos é necessário entender
primordialmente as substâncias húmicas (SH). Elas representam o maior
componente da matéria orgânica do solo (65-70%) (ABBAS et al., 2009, ABBAS et
al., 2014), e é objeto de estudo de diversas áreas da agricultura como a química do
20
solo, fertilidade, fisiologia da planta assim como ciência do meio ambiente por causa
das múltiplas funções aplicadas por esses materiais que podem contribuir
beneficamente com o crescimento das plantas (TAN, 1998, NARDI et al., 2002,
BALDOTTO et al., 2014). É amplamente utilizada na suplementação de fertilizantes
químicos (ABBAS et al., 2014) com finalidade de reduzir o custo final bem como
melhorar o rendimento (HARRON et al., 2010, ABBAS et al., 2014).
Definem-se substâncias húmicas como compostos orgânicos condensados
(macromoléculas ou supramoléculas), produzidos pela ação microbiana onde são
formados agregados supramoleculares, organizados em associações de diversos
compostos orgânicos de baixa massa molecular, contendo domínios
predominantemente hidrofílicos (ácidos fúlvicos - AF), ou hidrofílico-hidrofóbicos
(ácidos húmicos- AH) (Baldotto et al ., 2014). A diferença entre substâncias não
húmicas e húmicas está vinculada a estrutura química de seus compostos, onde
aminoácidos, carboidratos, proteínas e ácidos orgânicos representam substancias
não húmicas, enquanto que as substâncias de estrutura química indefinida são
consideradas húmicas (STEVENSON, 1994). São substâncias consideradas
bioestimulantes por promoverem o desenvolvimento/ crescimento vegetal por meio
de pequenas quantidades (ZHANG e SCHMIDT, 1997, JANNIN et al., 2012).
São diversas as contribuições promovidas por este material em plantas, dentre elas
têm-se a promoção do crescimento radicular (VAUGHAN e MALCOM, 1985, NARDI
et al., 2002), maior aquisição de Fe pelas plantas (PINTON et al., 1999b, NARDI et
al., 2002) a complexação de metais onde aumenta-se a disponibilidade de
micronutrientes de hidróxidos pouco solúveis (STEVENSON et al., 1991, NARDI et
al.,s 2002), a promoção de entrada de nutrientes (VARANINI e PINTON, 1995,
NARDI et al., 2002), o aumento da respiração em plantas superiores (VAUGHAN e
MALCOM, 1985, NARDI et al., 2002), o aumento do conteúdo de clorofila (SLADKY,
1959, NARDI et al., 2002) e controle das propriedades químicas e biológicas da
rizosfera representando, desta forma, componente chave da fertilidade do solo
(NARDI et al., 2005, TREVISAN et al., 2009, AMERI et al., 2012). Notadamente, as
substâncias húmicas alteram o desenvolvimento das plantas (CHEN e AVAID, 1990;
NARDI et al., 2002; CANELLAS et al., 2002; CHEN et al., 2004, BALDOTTO et al.,
2014).
Um grupo predominante das substâncias húmicas são os ácidos húmicos (AH), que
são importantes componentes de fácil interação com contaminantes orgânicos e
inorgânicos (CANELLAS et al., 2010, JANNIN et al., 2012). Esta fração bioativa é
caracterizada por apresentar baixo peso molecular e, sua atividade biológica deriva
de sua estrutura química e peso molecular, sendo estas características, as
responsáveis pelo crescimento vegetal e realização de ligações iônicas (JANNIN et
al., 2012). Esses compostos de baixo peso molecular (AH) possuem alta capacidade
de ligar-se a metais por apresentarem grande número de grupos funcionais em sua
estrutura aromática (grupos carboxílicos e OH-fenólicos) que promovem a maior
assimilação de nutrientes e, consequentemente, melhora o metabolismo vegetal
atuando de forma simplástica (NARDI et al., 2002).
21
Estrutura química de ácido húmico proposta por Schulten (1995).
O mecanismo da atividade do ácido húmico em promover o crescimento vegetal
ainda é desconhecido, porém várias hipóteses foram geradas por diversos estudos
destacando, o aumento da permeabilidade da membrana celular, a promoção de
maior entrada de oxigênio, o auxílio na respiração, fotossíntese e entrada de
fosfatos bem como promovem elongação da célula da raiz (BALDOTTO et al., 2014).
Umas das funções destaques na utilização do AH é a promoção do desenvolvimento
radicular (AMERI et al., 2012) que envolvem formação de raízes laterais
(CANELLAS et al., 2002; TREVISAN et al., 2010b; BALDOTTO et al., 2011b; JINDO
et al., 2012; MORA et al., 2012; BALDOTTO et al., 2014), formação de raízes
adventícias (BALDOTTO et al., 2012; BALDOTTO e BALDOTTO, 2014a, b, c), o
alongamento radicular (MALIK e AZAM, 1985; SILVA et al., 2000; BALDOTTO et al.,
2014) e a formação de pelos radiculares (CANELLAS et al., 2011; SILVA et al.,
2011; BALDOTTO et al., 2014). Outras funções também importantes foram
observadas, por meio do uso do AH, como, modificações nas atividades de diversas
enzimas e conteúdo de metabólitos intracelulares, variação na síntese de pigmentos
e atividade tipo hormonal (GARCÍA, et al., 2016).
Também são atribuídas atuações a nível celular e molecular destes ácidos
orgânicos, como a estimulação da atividade e promoção da síntese das enzimas H+-
ATPases da membrana plasmática, num efeito semelhante ao auxínico (NARDI et
al., 1991; FAÇANHA et al., 2002; CANELLAS et al., 2002; JINDO et al., 2012;
BALDOTTO et al., 2014). Vale lembrar, que enzimas H+-ATPases são
transmembranares capazes de hidrolizar ATP (HAGER et al., 1991; Frias et al.,
1996), promovendo melhor rendimento energético para o vegetal (BALDOTTO et al.,
2014). Também foi observado o estímulo da síntese de ácidos nucleicos e das
atividade de várias enzimas (NANNIPIERI et al., 1983).
22
Na fisiologia, plantas como morango, uva e maçã, apresentaram maior atividade
fotossintética, incremento da clorofila total e estimulação da abertura estomatal,
respectivamente (NERI et al., 2002; CIMRIN e YLIMAZ, 2005; WU et al., 2008;
IFTIKHAR et al., 2017). Aumentos nas taxas de condutância estomática, de
fotossíntese líquida (LIU, 1998; AZCONA et al., 2011), de nutrição foliar relativo a
conteúdo de clorofila (BARAKAT et al., 2012, IFTIKHAR et al., 2017) e de
transpiração (IFTIKHAR et al., 2017) foram observados por vários autores que
estudaram o AH a nível de fisiológico.
Por estes motivos, estudos com aplicação de AH em plantas sob estresses abióticos
estão em avanço no meio científico devido a ambos fatores apresentarem efeitos
antagônicos nos vegetais. Mais especificamente, o estresse causado pela falta de
água é um dos principais fatores adversos que limitam o crescimento vegetal e a
produtividade da planta (HONG-BO et al., 2008) enquanto que o AH é conhecido
pela promoção do crescimento (TREVISAN et al., 2011, BALDOTTO et al., 2014).
Em vista disso, faz-se necessário a investigação da utilização do AH em plantas que
sofrem estes estresses.
4.3 Déficit hídrico
A água é essencial para todos os vegetais, estando presente na sua composição
(podendo representar até 90% da constituição física das plantas) bem como
participa como reagente em numerosas reações metabólicas (PIMENTEL, 2004) e, a
sua falta, pode afetar os aspectos do crescimento e desenvolvimento dos vegetais.
Ela é também a fonte do oxigênio molecular existente na atmosfera, que é produzido
na fotossíntese, assim como do hidrogênio para reduzir o CO2 a carboidrato
(PIMENTEL, 2004).
O termo estresse é definido como desvio significativo das condições ótimas para a
vida que induz mudanças e respostas em todos os níveis funcionais do organismo,
podendo ser reversíveis ou permanente (LARCHER, et al., 2000). Plantas estão
constantemente expostas aos estresses ambientais que exercem influência
desvantajosa (TAIZ e ZEIGER, 2002) sendo que a deficiência hídrica é considerada
uma das principais restrições ambientais que causa prejuízo à produção das culturas
(CHAVES e OLIVEIRA, 2004). A capacidade das plantas em resistir a este estresse
é de grande importância para o desenvolvimento da agricultura (SHAO et al., 2008)
e manejo ambiental.
O estresse abiótico causado pela deficiência de água é conhecido por promover
impacto negativo no desenvolvimento vegetal (CHAVES et al., 2002) pois, o
mecanismo de defesa da planta se resume em fechar os estômatos para diminuir a
perda de água por evapotranspiração porém, também reduz-se a assimilação de
CO2 para produção de carboidratos (TAIZ e ZEIGER, 2009). Naturalmente, plantas
podem apresentar déficit hídrico de curto prazo onde a transpiração foliar excede a
absorção de água pelas raízes, apresentando assim um balanço hídrico negativo
(SOUZA e CARDOSO, 2003; PIMENTEL e PEREZ, 2000), porém, a manutenção da
absorção de água pelas raízes ao longo de um período noturno com controle da
abertura estomática (diminuindo a transpiração) reverte este déficit hídrico (DH) de
curto prazo (BIANCHI et al., 2004). Durante períodos de deficiência hídrica, a
23
manutenção do crescimento da planta depende de sua capacidade de conservar a
turgescência das células, por meio do ajustamento osmótico (NIU et al., 2003).
Um dos grandes problemas enfrentados pela biologia vegetal é o prejuízo causado
pela deficiência hídrica que limita o crescimento das plantas devido a reduções do
equilíbrio na planta no controle da interação entre fotossíntese e respiração
(FLEXAS et al., 2006). Quando ocorre estresse hídrico severo, há a inibição da
fotossíntese em razão da maior resistência difusiva e da consequente redução na
assimilação do CO2 da atmosfera para o sítio de carboxilação (PEAK et al., 2004,
CHAVES et al., 2009, PINHEIRO e CHAVES, 2011). Esta resistência é imposta pela
de falta de água, que promove a redução do turgor celular das células-guardas
seguidas do fechamento dos poros estomáticos (PINHEIROS e CHAVES, 2011).
Fatores não estomáticos também podem estar envolvidos na inibição das taxas
fotossintéticas em situações de restrição hídrica, tais como problemas no transporte
de elétrons, na fotofosforilação (FLEXAS et al., 2006) e redução na síntese de ATP.
Esta última é considerada resposta inicial à deficiência hídrica, podendo causar
diminuição da capacidade de regeneração da ribulose bifosfato (RuBP) que reduz a
fotossíntese potencial da planta (LAWLOR e TEZARA, 2009; PINHEIRO e CHAVES,
2011, CATUCHI et al., 2012).
Segundo Bergamaschi et al. (2006), o déficit hídrico afeta quase todos os aspectos
relacionados ao desenvolvimento das culturas: reduz a área foliar (por diminuir o
crescimento ou pela senescência das folhas); reduz a fotossíntese (devido à
diminuição da área foliar, murchamento e enrolamento de folhas e fechamento dos
estômatos) e afeta vários outros processos como: brotação, polinização, absorção
de nutrientes e translocação de fotossintatos. Outros trabalhos relataram alterações
nas propriedades das membranas, aumento da respiração, inibição da fotossíntese,
menor produção de matéria seca, senescência prematura e redução na produção e
em seus componentes (UPADHYAY et al. 2011, PEREIRA et al. 2012, DUARTE et
al. 2013).
O estresse hídrico também pode ser ocasionado pela alta salinidade em que
se encontra a planta, sendo denominado como estresse salino. Estudos recentes
relataram maiores depósitos de sais no solo próximos a costas devido ao
agravamento do aquecimento global por meio do aumento dos níveis de mares e
tempestades (JAMES et al., 2012). Adicionalmente, na agricultura tem-se observado
maior salinização devido a baixa precipitação pluviométrica, alta evaporação,
irrigação mal conduzida, drenagem inadequada (DANTAS et al., 2006, LIMA et al.,
2011), intemperismo físico e químico de rochas, materiais geológicos e biológicos,
bem como atividades humanas (RENGASAMY, 2010). Mundialmente, cerca de 800
milhões de hectares de solo são impactados pela salinidade (RENGASAMY, 2010),
atingindo um terço de água irrigada no planeta (TAIZ; ZEIGER, 2013) e, em relação
a terras agricultáveis, cerca de 2 milhões de km2 (NEVES et al., 2010).
No Brasil, em sua maioria, solos salinos e sódicos ocorrem no Rio Grande do
Sul, na região do Pantanal Mato-grossense e, com predomínio na região semiárida
do Nordeste (RIBEIRO et al., 2003). Apesar de ser um país com grande potencial no
cultivo de cultivares, a aplicação excessiva de fertilizantes com índice salino elevado,
24
tais como cloreto de potássio, nitrato de amônia e formulações comerciais, de forma
indiscriminada e excessiva, pode induzir a um incremento da pressão osmótica na
solução do solo, prejudicando a germinação das sementes e o desenvolvimento de
plantas muito jovens (FIGUEIRÊDO, 2005; WANDERLEY, 2009).
A salinidade afeta as plantas de duas formas: aumenta o potencial osmótico
do solo, fazendo com que o vegetal consuma mais energia para absorver água e
outros elementos nutricionais; e por meio da toxidez de determinados elementos,
principalmente sódio, boro, bicarbonatos e cloretos, que em concentração elevada
causam distúrbios fisiológicos (BATISTA et al., 2002). As plantas respondem ao
estresse salino primeiramente, diminuindo seu potencial osmótico que acaba
limitando o crescimento da parte aérea devido à falta de água e, posteriormente, se
mantido, ocorre à fase iônica onde a velocidade da toxicidade e morte foliar se
encontra maior que a produção de novas folhas afetando a fotossíntese causando
redução do crescimento e produtividade (MUNNS; TESTER, 2008). Diante disto, o
estresse salino é considerado um dos maiores problemas abióticos por causar
diminuição na produção e rendimento de culturas (PATADE et al., 2011; SHOMEILI
et al., 2011; JAMES et al., 2012; PLAZEK et al, 2013; MUNNS; GILLIHAM, 2015).
O prejuízo na absorção de água é um dos fatores mais importantes no que se refere
ao prejuízo do crescimento das plantas sob alta salinidade (BHATT et al., 2008),
prejudicando diretamente sua fotossíntese, bem como seu crescimento (KUMAR et
al., 2014). Os problemas causados na fotossíntese ocorrem, principalmente, pela
diminuição da área foliar da planta, redução dos teores de clorofilas e condutância
estomática, além de prejudicar a eficiência do fotossistema II (FSII) (SENGAR et al.,
2013). Além disso, também são relatados aumento na produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs), desidratação celular (PLAZEK et al, 2013) e toxicidade
por íons causada pela diminuição na absorção de nutrientes (DEINLEIN et al., 2014;
RODRIGUES et al., 2014).
4.4 Ácidos húmicos e estresses hídricos
Estudos com ácidos húmicos (AH) vêm mostrando seu grande potencial na
promoção do desenvolvimento em plantas relacionado à parte fisiológica e
bioquímica. Embora tenham bastantes estudos na área da fisiologia, a literatura
encontra-se escassa quando se trata da investigação da atuação do AH em plantas
sob estresses hídricos. Estudos recentes apontaram efeito protetivo do AH em
plantas sob deficiência hídrica, como por exemplo, no arroz houve proteção da
permeabilidade da membrana celular e restabelecimento do nível hormonal de ABA
(ácido abscísico). Outros estudos também reportaram a estimulação das atividades
das enzimas da defesa antioxidante Superóxido dismutase (SOD) e Ascorbato
peroxidase (APX), (CORDEIRO et al., 2011; SCHIAVON et al., 2010;
VASCONCELOS et al., 2009) corroborando com Muscolo e colaboradores (2007)
que observaram a promoção da síntese de proteínas e enzimas em diversos órgãos
do vegetal com a aplicação deste ácido.
Quanto ao estresse hídrico causado pela salinidade, também foram observados
estudos relacionados a respostas mitigadoras promovidas pelo uso de AH em
plantas, dentre eles tem-se a indução de mecanismos de ajuste osmótico, como a
25
produção de prolina e glicina betaína no milho (HAJLAOU et al., 2010); incremento
do N e P, redução na salinidade do solo, aumento no crescimento e disponibilização
de nutrientes em plantas de feijão (AYDIN et al., 2012); aumento no conteúdo de
metabólitos orgânicos e redução da formação de EROs (espécies reativas de
oxigênio) na cevada (JAROSOVA et al., 2016). Apesar dos trabalhos citados acima,
estudos concentrados no uso de substâncias húmicas e suas frações, como
mitigadores de estresses salinos, são limitados na ciência (ÇIMRIN et al. 2010;
AYDIN et al. 2012; KHALESRO et al. 2015).
4.5 Milho
Para realização da investigação do AH em plantas estressadas pela deficiência da
água faz-se necessário à utilização de um organismo teste com interesse econômico
e de fácil analogia já que o assunto ainda é limitado. Neste sentido, o cereal milho foi
escolhido, por ser utilizado amplamente em diversos ensaios fisiológicos para
detecção de poluentes e na detecção das atividades biológicas das substâncias
húmicas, apresentando notável sensibilidade a estes compostos (TAN;
NOPAMORNBODI, 1979; SILVA et al., 1999; GRANT; OWENS, 2006; PALANIVELL
et al., 2013). Além disso, é um vegetal de fácil manipulação, rápida formação de
biomassa em curto período de tempo, com rápida resposta fisiológica e boa
adaptação a hidroponia, o que facilita a sua manipulação num pequeno espaço
físico.
O milho (Zea mays L.) constitui uma importante fonte de nutrientes para a população
mundial (HENG et al., 2009) e, é o principal cereal produzido no Brasil, com uma
área plantada de 14,2 milhões de hectares, em 2012, e produtividade média
nacional de 4,721 Mg ha-1 (IBGE, 2012, CHIEZA et al., 2017). Ele pertence ao
grupo de plantas com metabolismo fotossintético do tipo C4, que se caracteriza pelo
elevado potencial produtivo (BERGAMASHI et al., 2004) e é uma planta de ciclo
anual, pertencente à família gramineae, que apresenta baixo ponto de compensação
de CO2 , alta taxa fotossintética e baixo consumo de água para a formação de
matéria fresca (AZEVEDO NETO & TABOSA, 2000). É uma cultura considerada
sensível a deficiência hídrica (SHAO et al., 2008) e moderadamente sensível à
salinidade sofrendo redução de 7,4% na produção de matéria seca por unidade de
incremento de condutividade elétrica, embora esse efeito difira entre os cultivares
(MASS, 1993).
Estudos de tolerância à seca envolvendo o milho podem trazer melhorias no
crescimento e no rendimento da cultura em regiões com limitação hídrica, já que o
milho é conhecido por apresentar alta sensibilidade à falta de água (SHAO et al.,
2008). Reduções no seu crescimento em função de decréscimos da área foliar, da
biomassa e da transpiração geralmente são observados quando é aplicada a
restrição hídrica (BERGAMASCHI et al., 2007, WU et al., 2011). Na fase de
enchimento de grãos do milho é observado fechamento de estômatos, reduzindo a
taxa fotossintética e, consequentemente, a produção de fotoassimilados e sua
translocação para os grãos (EMPRAPA, 2008).
Diversos estudos reportaram diferentes respostas de cultivares de milho quando
submetidas ao estresse salino, considerando as diferentes exposições
26
(HAJIBAGHERI et al., 1987; ALBERICO; CRAMER, 1993; AZEVEDO NETO, 1997).
Estes estudos são de fundamental importância para trabalhos de seleção de
cultivares tolerantes, tanto no melhoramento clássico, como na engenharia genética,
para a obtenção de plantas transgênicas mais resistentes (WILLADINO et al.,1995).
Em sua maioria, pesquisadores relataram redução da matéria seca da raiz (CARPICI
et al., 2009) e redução na parte aérea e no desenvolvimento radicular (AZEVEDO e
TABOSA, 2000). Geralmente, reduções significativas no crescimento e na
produtividade das plantas de milho são obsevadas quando tratadas com soluções
salinas (CARVALHO et al., 2012; SILVA et al., 2014).
4.6 Investigação Biológicas
Diversas variáveis fisiológicas são utilizadas com o objetivo de explicar e entender
as diferenças de comportamento das espécies vegetais (ALVAREZ et al., 2012) sob
diferentes investigações. A análise de crescimento, por exemplo, é uma técnica que
detalha as mudanças morfofisiológicas da planta, em função do tempo, avaliando,
também, a produção fotossintética, por meio do acúmulo de matéria seca
(FALQUETO et al. 2009, CONCENÇO et al. 2011). É considerada uma análise
simples e de baixo custo onde podem ser realizadas avaliações periódicas da
quantidade de fitomassa produzida pela planta e suas estruturas (folhas, caules,
flores e grãos) e do tamanho da unidade fotossintetizadora (área foliar), durante o
desenvolvimento da planta (BENINCASA 2003, TAIZ e ZEIGER 2009, ALVAREZ et
al., 2012). A avaliação aferida ao final de seu crescimento permite avaliar a
contribuição de cada órgão no seu desenvolvimento total (BENINCASA, 2003 TAIZ e
ZEIGER, 2009). A variável mais utilizada é o índice de área foliar (IAF), que mensura
a intensidade de competição por luz entre plantas individuais, dentro de uma
população (TAIZ e ZEIGER 2009).
Grandes avanços na área de microeletrônica levaram ao desenvolvimento de
aparelhos complexos, como o IRGA (Infra-Red Gas Analyser), para mensurar os
processos fisiológicos de fotossíntese e respiração, ao mesmo tempo em que
avanços na área de processamento digital de dados simplificaram esses sistemas,
tornando as medições desses processos mais rápidas e precisas (HUNT, 2003).
Este equipamento (IRGA) mensura a troca gasosa, possibilitando uma avaliação
fisiológica e não destrutiva para o vegetal. Por meio desta análise é possível obter
variáveis inerentes ao processo de fotossíntese tais como: assimilação de carbono
(A), condutância (gs), transpiração, carbono interno (Ci) entre outras.
O estresse hídrico é caracterizado por envolver sutis alterações na estrutura
bioquímica das células, que parecem ser o resultado da acumulação de solutos
compatíveis e de proteínas específicas que podem ser rapidamente induzidas por
estresse osmótico (SHAO et al., 2005). Outro produto do déficit hídrico é a formação
de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo estas responsáveis pela inativação
de enzimas e danificação dos componentes celulares importantes, além de causar
degradação de fosfolipídios presentes na membrana (BARTOLI, 2012,
ABOGADALLAH, 2012). As EROs possuem alta reatividade e alta citotoxicidade,
pois em altas quantidades, interferem no ciclo de Calvin (inibindo a fixação de C) e,
27
portanto, não permitem a realização da fotossíntese, devido à oxidação do aparato
fotossintético.
As formas predominantes de EROs incluem radical superóxido (O2¯), dotado de
baixa capacidade oxidativa; peróxido de hidrogênio (H2O2) capaz de romper a
membrana nuclear e causar danos ao DNA e radical hidroxil (•OH) que possui baixa
capacidade de difusão, porém alta reatividade, provocando lesões em uma série de
moléculas em meio celular (SCANDALIOS, 2000). Radicais do tipo O2 e H2O2 não
são tão reativos, mas na presença de íons metálicos (ex.: Fe) eles ativam reações
que levam a formação de •OH na reação de Haber-Weiss (BOWLER et al., 1992).
Este •OH possui grande potencial oxidativo degradando macromoléculas levando a
sérios danos celulares (SCANDALIOS, 2000) tais como: peroxidação lipídica,
desnaturação protéica e mutação no DNA (BOWLER et al., 1992) causando
disfunções metabólicas irreparáveis e morte celular (SCANDALIOS,2000).
A planta pode reagir com o aumento da expressão de genes de enzimas com
funções antioxidantes e com a síntese de espécies sequestradoras dos ROS
(MUNNÉ-BOSCH, 2013). Muitas enzimas parecem estar envolvidas no mecanismo
de proteção à presença destes radicais livres, entre elas, as catalases, superóxido
dismutases, peroxidases, glutationa redutases (MUNNÉ-BOSCH et al., 2013). Tais
enzimas evidenciam a resposta da planta/organismo frente a um estresse por meio
da quantificação das suas atividades ou de suas dosagens.
A superóxido dismutase (SOD) é considerada a primeira linha de defesa com os
danos causados pelas ERO’s atuando na dismutação de O2•- em H2O2 (ALSCHER
et al., 2002), desta forma, interferindo na concentração das duas ERO’s envolvidas
na reação de Haber-Weiss, fazendo parte do mecanismo central de defesa dos
organismos, evitando a formação do radical •OH – ERO mais reativa (LEÓN et al.,
2002).
A ascorbato peroxidase (APX) é uma das principais enzimas envolvidas na
eliminação rápida de H2O2, por possuir alta afinidade com essa molécula,
removendo-a mesmo em baixas concentrações. Ao contrário da catalase, que atua
removendo o excesso de peróxido de hidrogênio (MITTLER, 2002). A APX é
responsável pela degradação do H2O2 utilizando o ascorbato como substrato e
agindo na defesa de tecidos fotossintéticos contra o estresse fotoxidativo. Pode ser
encontrada também no citosol das células não fotossintetizantes, atuando na
redução dos níveis de ERO’s (ASADA, 1999).
A GSH (glutationa reduzida ) é uma molécula importante dentro do sistema celular,
participando do ciclo ascorbato-glutationa (NOCTOR et al., 2002), ou da síntese de
fitoquelatinas (GRATÃO et al., 2005). As glutationas S-transferases são enzimas que
catalisam a conjugação de GSH à substratos hidrofóbicos eletrofílicos, como
xenobióticos (DIXON et al., 2002), sendo essas proteínas encontradas
preferencialmente no citoplasma (MARRS, 1996).
A enzima H+-ATPase, situada na membrana plasmática, tem como atividade a
clivagem de moléculas de ATP para geração de um gradiente eletroquímico que
fornece energia para os transportes secundários da célula, promovendo a força
28
necessária para a entrada e fluxo de íons e metabólitos na membrana (SZE, 1985;
CANELLAS et al., 2012). A enzima tem atividade influenciada por contextos
temporais e espaciais, bem como por mudanças químicas e ambientais e é
codificada por uma família de multigenes (NIU et al., 1996; HASEGAWA et al.,
2000).
A produção de EROS também pode iniciar o processo de peroxidação lipídica (LPO)
nas membranas celulares, formando hidroperóxidos de lipídeos (LOPEZ et al., 2005)
por meio da ação de radicais livres que capturam elétrons dos lipídios das
membranas celulares. A formação desses hidroperóxidos pode ser controlada pela
ação das GSTs (Glutationa-S-Transferase) (PRABHU et al., 2004). Este evento do
estresse oxidativo é considerado significativo por causar a diminuição da fluidez,
modificações de permeabilidade iônica e de outras funções associadas às
membranas (QUEIROZ et al., 1998). Respostas bioquímicas são geradas em razão
da diminuição da fluidez das membranas, tais como: interferência nas funções das
proteínas, a redução do suprimento de energia, a perda de compartimentalização, a
liberação acentuada de íons e outros eventos que rompem o metabolismo normal e
levam ao desbalanço e perda das funções essenciais (AZIZ e LARHER, 1998).
O potencial hídrico foliar (Ψ) e o teor relativo de água também são medidas usadas
na compreensão dos mecanismos envolvidos no controle do déficit hídrico pelo
vegetal. Estas medidas respondem o status hídrico do vegetal por meio da
mensuração de pecíolos foliares realizados pela bomba de Scholander, e o teor
relativo de água é avaliado pelo conteúdo de água presente em um disco circular
retirado da folha. Quando o conteúdo de água no substrato decresce, o potencial da
água na folha também decresce e, como consequência, o deficit hídrico se
desenvolve nas folhas, pois, as células guardas perdem turgor, causando
fechamento estomático (BIANCHI, 2004). Plantas que passaram por déficits hídricos
e acionaram mecanismos de tolerância, podem apresentar diferenças no potencial
de água na folha (GUIMARÃES et al., 2006).
A avaliação citogenética também é importante análise com o objetivo de investigar a
vulnerabilidade do material genético às agressões impostas pelo ambiente/fatores
por meio de agentes químicos, físicos e biológicos. Esses agentes capazes de
causar mudanças no DNA são chamados genotóxicos, e a ciência que estuda o
processo de indução de danos no DNA pela ação de tais agentes é conhecida como
mutagênese (ERDTMANN et al., 2003). O índice de genotoxicidade remete a
alterações cromossômicas que ocorrem durante a divisão celular e podem ser
passíveis de reparo (LEME e MARIN-MORALES, 2008, FERNANDES et al., 2009)
diferente da avaliação da mutagenicidade que não sofre reparos e é, portanto,
fixada.
A avaliação da mutagenicidade é realizada por meio da quantificação de
micronúcleos (MN) que são descritos por Fenech et al. (2000) como pequenas
massas de cromatina presentes no citoplasma morfologicamente semelhantes ao
núcleo principal que não são incorporados no núcleo principal durante o ciclo de
divisão celular. Apesar de originarem-se naturalmente, sua indução é indicativo da
exposição a agentes mutagênicos, sendo resultado de eventos de quebras
29
cromossômicas ou aneuploidias (HEDDLE et al., 1983; AL-SABTI; METCALFE,
1995; FENECH, 2000). A avaliação da genotoxicidade é realizada por meio da
quantificação de aberrações cromossômicas que são considerados indicadores de
instabilidade genômica, porém, podem sofrer reparo pela maquinaria do DNA da
célula (FENECH et al., 2003, MOROZESK et al., 2017).
Com relação à avaliação da citotoxicidade, é investigada a divisão celular (mitose)
por meio do índice mitótico (IM). A citotoxicidade é ferramenta importante que
averigua a normalidade em que ocorre a mitose nas células. A partir da análise das
células meristemáticas do Zea mays L., é possível determinar os potenciais
citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos de diversas amostras, tendo em vista a alta
sensibilidade desta espécie a compostos químicos.
5. REFERÊNCIAS
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CAPITULO 2 – RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS, CITOGENÉTICAS E
DO CRESCIMENTO EM PLANTULAS DE Zea mays L. SOB ESTRESSE SALINO
TRATADAS COM ÁCIDOS HÚMICOS EXTRAÍDOS DE LODO DE ESGOTO
SANITÁRIO.
Autores: Lívia Dorsch Rocha1, Ian Drumond Duarte1, Leonardo Vallandro Zanetti1,
Ian de Oliveira Martins1, Edvar Junior Roncetti Coelho1, Mariana Morozesk2, Marina
Marques Bonomo2, Marisa Narciso Fernandes2 e Silvia Tamie Matsumoto1*.
1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo, Av.
Fernando Ferrari, 514, 29075-910, Vitória, Espírito Santo, Brasil.
2 Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de São Carlos, Av.
Washington Luiz, Km 235, 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brasil.
Periódico a ser submetido: Environmental and Experimental Botany
43
44
RESUMO
Apesar de apresentar elevada carga orgânica, a produção incessante de resíduos
sólidos (lodo de esgoto sanitário) sem destinação apropriada tem causado preocupação
em todo o mundo. Uma alternativa final para este resíduo é a extração de substancias
húmicas ou de suas frações, bem como a extração de ácido húmico (AH) que é
conhecida por apresentar alta bioatividade em vegetais. Estes ácidos orgânicos
promovem melhor desenvolvimento e crescimento vegetal por meio de mecanismos a
níveis celulares até sistemáticos. Efeitos antagônicos aos do AH são observados em
plantas sob estresse salino despertando desta forma o interesse da investigação destes
fatores. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar as respostas à
aplicação de ácido húmico proveniente de lodo de esgoto (AH-LE- 2.0 mM C L-1) em
plântulas de milho estressada com NaCl (100mM) por meio da integração de análises
fisiológicas, bioquímicas, toxicogenéticas e do crescimento vegetal visando elucidar os
potenciais benefícios/ riscos da utilização deste ácido. Para isto, foi realizada
hidroponia em casa de vegetação com Zea mays L. crescendo em soluções
nutritivas com adição dos tratamentos e regulação constante da aeração e pH.
Elevados teores de carbono, nitrogênio e oxigênio foram observados na composição
elementar do AH, podendo constituir fonte de nutrientes para as plantas. Resultados
das taxas fotossintéticas e do crescimento vegetal do tratamento sob estresse salino
com AH apresentaram amenização das respostas negativas geradas pelo sal.
Adicionalmente, análises dos marcadores antioxidantes confirmaram o potencial
bioquímico do AH em estimular a defesa antioxidante, por meio de enzimas (SOD,
APX), metabólitos (GSH) e aminoácidos (prolina). Além disso, parâmetros foliares
refletiram maior hidratação celular e menor peroxidação (LPO) da membrana
plasmática seguida de menor extravasamento de eletrólitos. Resultados da análise
citogenética apontaram maior segurança a nível celular do uso do AH que não
apresentou potencial genotóxico, citotóxico e mutagênico. Por fim, a integração
destas análises permitiu indicar/sugerir o AH-LE como alternativa complementar em
plantas que sofrem estresse salino.
Palavras-chaves: material húmico • milho • análises biológicas • salinidade • estresse
abiótico.
45
ABSTRACT
Despite the high organic load, the incessant production of solid waste (sanitary
sewage sludge) without proper disposal has caused concern all over the world. A
final alternative for this residue is the extraction of humic substances or their
fractions, as well as the extraction of humic acid (HA), which is known to have high
bioactivity in vegetables. These organic acids promote better plant growth and growth
through mechanisms at the cellular until systematic levels. Effects antagonistic to
those of HA are observed in plants under salt stress, thus arousing the interest of
investigating these factors. In this context, the present study aimed to investigate the
responses to the application of humic acid from sewage sludge (AH-LE- 2.0 mM C L-
1) to seedlings of maize stressed with NaCl (100 mM) by integrating analyzes
physiological, biochemical, toxicogenic and plant growth in order to elucidate the
potential benefits / risks of using this acid. For this, hydroponics was performed in a
greenhouse with Zea mays L. growing in nutrient solutions with addition of treatments
and constant regulation of aeration and pH. High levels of carbon, nitrogen and
oxygen were observed in the elemental composition of the AH, and could be a
source of nutrients for the plants. Results of the photosynthetic and plant growth
rates of the treatment under salt stress with AH presented attenuation of the negative
responses generated by salt. In addition, analyzes of the antioxidant markers
confirmed the biochemical potential of AH in stimulating the antioxidant defense,
through enzymes (SOD, APX), metabolites (GSH) and amino acids (proline). In
addition, leaf parameters showed higher cellular hydration and lower peroxidation
(LPO) of the plasma membrane followed by lower electrolyte extravasation. Results
of the cytogenetic analysis indicated greater safety at the cellular level of the use of
AH that did not present genotoxic, cytotoxic and mutagenic potential. Finally, the
integration of these analyzes allowed to indicate / suggest the AH-LE as a
complementary alternative in plants that undergo saline stress.
Keywords: humic material • corn • biological analyzes • salinity • abiotic stress.
46
1. INTRODUÇÃO
O Brasil produz, anualmente, cerca de 150 a 220 mil toneladas de matéria seca de
LE (PEDROZA, 2010) sendo que apenas 37,9% da população urbana têm seu
esgoto devidamente coletado e tratado (SNIS, 2010). O lodo de esgoto sanitário
(LES) é definido como o resíduo gerado nos processos de tratamento de efluente
sanitário, constituindo-se de uma fonte de matéria orgânica e de nutrientes
(Resolução CONAMA 375/2006). A presença de elevada carga orgânica presente
neste resíduo sólido permite a possibilidade de extração de substâncias húmicas e
posterior extração do ácido húmico para sua aplicação em solos agricultáveis.
Um grupo predominante das substâncias húmicas são os ácidos húmicos (AH), que
são importantes componentes de fácil interação com contaminantes orgânicos e
inorgânicos (CANELLAS et al., 2010, JANNIN et al., 2012). Além disso, os AH são
conhecidos como promotores do crescimento vegetal por meio do aumento da
permeabilidade da membrana celular, maior entrada de oxigênio, respiração e
fotossíntese, entrada de fosfatos e elongação da célula da raiz (BALDOTTO et al.,
2014). Também são atribuídas atuações a nível celular e molecular destes ácidos
orgânicos como estimulação da atividade e promoção da síntese das enzimas H+-
ATPases da membrana plasmática, num efeito semelhante ao auxínico (NARDI et
al., 1991; FAÇANHA et al., 2002; CANELLAS et al., 2002; JINDO et al., 2012;
BALDOTTO et al., 2014). Na fisiologia, plantas como morango, uva e maçã,
apresentaram maior atividade fotossintética, incremento da clorofila total e
estimulação da abertura estomatal, respectivamente (NERI et al., 2002; CIMRIN e
YLIMAZ, 2005; WU et al., 2008; IFTIKHAR et al., 2017). Além de servir como reserva
de nutrientes às plantas (STEVENSON, 1994) constitui uma forma de reutilização,
representando uma alternativa para reciclagem agrícola.
O agravamento do aquecimento global vem aumentando o nível de mares e
tempestades, e contribuindo para maior depósito de sal no solo próximo a costas
(JAMES et al., 2012). Há mais de 800 milhões de hectares de solo em todo mundo
atingidos pela salinidade (RENGASAMY, 2010), atingindo um terço de água irrigada
no planeta (TAIZ; ZEIGER, 2013) e, em relação a terras agricultáveis, cerca de 2
milhões de km2 é atingido pela salinidade em todo o mundo (NEVES et al., 2010). O
prejuízo na absorção de água é um dos fatores mais importantes no que se refere
47
ao prejuízo do crescimento das plantas sob solos salinos (BHATT et al., 2008)
prejudicando de forma direta sua fotossíntese, bem como seu crescimento (KUMAR
et al., 2014). Além disso, também são relatados aumento na produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs), desidratação celular (PLAZEK et al, 2013) e toxicidade
por íons causada pela diminuição na absorção de nutrientes (DEINLEIN et al., 2014;
RODRIGUES et al., 2014). Em trabalhos com milho observa-se redução do seu
crescimento em função de decréscimos da área foliar, da biomassa e da
transpiração (BERGAMASCHI et al., 2007, WU et al., 2011). Estudos de tolerância à
seca envolvendo o milho podem trazer melhorias no crescimento e no rendimento da
cultura em regiões com limitação hídrica, já que o milho é conhecido pela sua alta
sensibilidade a este estresse (SHAO et al., 2008).
Trabalhos com ácidos húmicos vêm mostrando seu grande potencial na promoção
do desenvolvimento em plantas relacionados à parte fisiológica e bioquímica.
Hajlaou e colaboradores (2010) observaram redução de massa seca e indução de
mecanismos de ajuste osmótico, como a produção de prolina e glicina betaína em
milho com AH. Pinali e Kaplan (2003) também verificaram efeito mitigador com
aplicação deste ácido orgânico no milho corroborando desta forma com Serenella e
pesquisadores (2002) que observaram aumento na tolerância diante do estresse por
meio da aplicação do AH. Aydin e colaboradores (2012) relataram melhoras
significativas nas variáveis afetadas por estresse salino, tais como, incremento do N
e P na planta, redução na salinidade do solo, aumento no crescimento da planta,
permitindo que os nutrientes fossem incorporados na matriz AH e liberando-a para o
feijão. Apesar dos trabalhos citados acima mostrarem resultados favoráveis, estudos
concentrados no uso de substâncias húmicas e suas frações como mitigadores de
estresses salinos ainda são limitados na ciência (ÇIRIM et al. 2010; AYDIN et al.
2012; KHALESRO et al. 2015).
Neste contexto, a avaliação do composto ambiental pode ser realizada através da
aplicação de vários biomarcadores, em que variáveis fisiológicas são utilizadas com
o objetivo de explicar e entender as diferenças de comportamento das espécies
vegetais (ALVAREZ et al., 2012), bem como variáveis bioquímicas que refletem o
aumento da expressão de genes de enzimas com funções antioxidantes e com a
síntese de espécies sequestradoras dos EROs (MUNNÉ-BOSCH, 2013).
Adicionalmente, a avaliação de danos citogenéticos representa uma ferramenta
48
importante na avaliação toxicológica (CARITÁ e MARIN-MORALES, 2008; FENECH
et al., 2003) do composto.
Ao se tratar de efeitos antagônicos tanto os promovidos pelo estresse salino quanto
os pelo AH, foi percebido a necessidade da investigação a nível
fisiológico,bioquímico e citogenético em plântulas de milho que é considerado uma
espécie de grande importância agronômica. Neste contexto, o objetivo deste estudo
foi avaliar as respostas da planta quanto à atuação do ácido húmico derivado do
lodo de esgoto frente à salinidade.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Preparo das amostras
Amostras de lodo de esgoto doméstico bruto foram disponibilizadas pela empresa
responsável pelo saneamento no estado CESAN (Companhia Espírito Santense de
Saneamento, ABNT, 2004). A amostra foi pulverizada e estocada para extração de
SH e análise química.
2.2 Extração de substâncias húmicas
A substancias húmicas foram extraídas conforme protocolo recomendado pela
Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS) usando solução de 0.5 M L-
1 NaOH. Para a extração de ácido húmico foi necessário aplicar solução ácida de
HCl (6 M L-1) reduzindo o pH até o valor 1 provocando desta forma a precipitação do
AH. O mesmo foi lavado com água deionizada, dializado em membrana com poro 14
kDa e por fim liofilizado (MOROZESK, 2017).
2.3 Análise Elementar do Ácido Húmico
A concentração de 2.0 mM C L-1 de AH proveniente de lodo de esgoto sanitário (AH-
LE) foi escolhida seguindo trabalhos relativos ao vegetal milho e, consequentemente
a sua bioatividade quanto ao AH (ZANDONADI et al., 2013 CANELLAS et al., 2012;
DOBBSS et al., 2010). Para a determinação desta dose, foram necessários
mensurar percentuais de carbono total, hidrogênio total, nitrogênio total e oxigênio
49
total (AYUSO et al., 1996), usando-se o Analisador Elementar Automático (Leco,
CHN e S 932– Alemanha) (Tabela 1).
2.4 Ensaio Z.mays
Sementes de Z. mays (Híbrido Embrapa - BR 206) foram desinfetadas em solução
de NaClO (1,0 %) por 30 minutos, sendo posteriormente banhadas em água
destilada por 3 horas. As mesmas foram colocadas em papel-filtro umedecido,
protegido da luz com temperatura média de 28°C para a promoção da germinação.
Após cinco dias, plântulas de milho com aproximadamente 0,5 cm de raiz foram
selecionadas e transferidas para vasos contendo solução Hoagland (HOAGLAND E
ARNON, 1950) modificada para ¼ de força molar e, posteriormente foram então
adicionados os tratamentos seguindo o esquema de identificação à frente: ES:
estresse salino (NaCl 100 mM) com solução nutritiva; ES-AH: estresse salino (NaCl
100 mM) mais AH-LE (2.0 mM C L-1); AH-LE: ácido húmico (2.0 mM C L-1) e CN:
solução nutritiva. O experimento decorreu por 14 dias em casa de vegetação (Setor
de Botânica, -20° 16' 29.46"S e -40° 18' 17.04”, Departamento de Ciências
Biológicas) com temperatura média de 28 graus Celsius e umidade relativa de 78%.
O sistema de cultivo se deu em hidroponia com aeração (compressor de ar), onde
foram ajustados diariamente a condutividade (524 ±80 mS) e o pH (5,8 a 6,0).
2.5 Análises de Trocas Gasosas e Concentração Relativa de Clorofila
Medidas de variáveis relativas a trocas gasosas como: assimilação de CO2 (A, μmol
CO2 m-2 s-1), taxa de transpiração (E, mol H2O m-2 s-1), condutância estomática (gs,
mol H2O m-2 s-1), concentração subestomática de CO2 (Ci, μmol CO2 mol ar-1) foram
realizadas usando analisador de gases infravermelho portátil (IRGA), modelo LI 6400
(LI-COR, USA), em irradiância de 1000 μmol de fótons m-2 s-1. Como análise
complementar da fisiologia, foi mensurada a concentração relativa de clorofila sendo
realizada também na folha basal mais desenvolvida, por meio do medidor de clorofila
SPAD (Soil Plant Analysis Development) (SPAD-502, Minolta, Japão).
2.6 Parâmetros Foliares
2.6.1 Densidade Estomática
50
A densidade estomática (n˚ estômatos mm-2) foi realizada com o uso de adesivo
instantâneo universal éster de cianoacrilato (Super-Bonder, EUA) em uma lâmina
histológica. Amostras de folhas de milho de dez indivíduos foram retiradas e
armazenadas em álcool etílico 70% para fixação do material. Posteriormente, foram
realizadas impressões abaxiais e adaxiais do terço mediano da região internervural
em doze campos ópticos por indivíduo, sendo cinco indivíduos por tratamento.
2.6.2 Extravasamento de Eletrólitos (E.E.) (%)
Discos foliares de 1 cm de diâmetro, foram retirados por meio de um perfurador, de
folhas do 2º ou 3º nó, e lavados três vezes em água destilada. Posteriormente os
mesmos foram secos em papel absorvente e colocados em tubos contendo 20 mL
de água ultrapura a 25ºC por 6h sob agitação constante, para posterior análise da
condutividade elétrica (C1) com o auxílio de um condutivímetro portátil (Sanxin,
modelo SX723, China). Depois, os discos foram em colocados em tubos falcons a
90ºC por 2h e após este período, esperou-se o material atingir temperatura
ambiente. Frascos contendo apenas água foram utilizados como branco (B1) antes
da fervura e (B2) após a fervura. Após atingir o equilíbrio na temperatura, a
condutividade elétrica máxima foi medida (C2) e o extravasamento de eletrólitos
calculado pela fórmula: [(C1-B1) / (C2-B2)] 100. A análise de extravazamento de
eletrólitos é uma técnica de investigação da viabilidade das membranas e foi descrita
por Bajji et al. (2001).
2.6.3 Determinação do status hídrico da planta
O status hídrico da planta foi determinado medindo-se o potencial hídrico da planta
(Ψw) ao final do experimento, na antemanhã, utilizando uma bomba de pressão tipo
Scholander (SCHOLANDER et al., 1965) PMS Instrument, modelo 600, USA. A
determinação consistiu na coleta de amostras da 2ª ou 3ª folha completamente
expandida a partir do ápice do eixo ortotrópico com bom estado fitossanitário, sendo
retirada e colocada na câmara da bomba de pressão para ser aplicada pressão até a
exsudação de líquido pelo pecíolo da folha onde então é feita a leitura da pressão
aplicada (TURNER, 1981). Adicionalmente, o status hídrico da planta também foi
determinado por meio do teor relativo de água (TRA) da folha, conforme protocolo de
Cairo (1995). O TRA foi mensurado por meio da retirada de dois discos foliares de
aproximadamente 1 cm de diâmetro do centro do limbo foliar, evitando as nervuras.
51
Após a retirada dos discos, os mesmo foram imediatamente pesados em balança de
precisão de miligramas, para obtenção a massa da matéria fresca (MF). Logo após,
os discos foram submersos em água destilada para atingirem saturação hídrica, e
mantidos à aproximadamente 4ºC durante o período de 24 horas, em recipientes
escuros. Finalizado o período, os mesmos foram retirados da água, e enxugados
delicadamente com papel absorvente para serem pesados novamente para
obtenção da massa túrgida (MT). Por fim, os discos foram colocados na estufa e
observados diariamente até atingirem massa constante, onde se obteve a massa
seca (MS). O TRA foi calculado segundo a equação TRA = [(MF – MS) / (MT – MS)]
100, elaborada por Klar (1984).
2.7 Análises Quantitativas do Crescimento Vegetal
Após os 21 dias de condução experimental, foram coletadas aleatoriamente cinco
espécimes de Zea mays L. de cada repetição, a fim de mensurar a altura (cm), a
área foliar total (Area Meter, LI-COR 3100, USA), massa fresca (MF) e seca (MS)
(estufa 60º C) de todos os órgãos das plantas, altura parte aérea (cm), diâmetro do
caule (mm) e número de folhas (NF). (HUNT, 1978; ROCHA et al., 2009).
2.8 Análises Bioquímicas em Zea mays L.
Seis biomarcadores bioquímicos foram investigados com finalidade de verificar a
resposta do estresse oxidativo. As atividades das enzimas superóxido dismutase
(SOD) seguiram protocolo de McCord e Fridovich (1969), a glutationa reduzida
(GSH) seguiu White et al. (2003) com modificações por Gallagher et al. (1992), a
peroxidase do ascorbato (APX) foi conforme Nakano e Asada (1981), as ATPase
total/ H+-ATPase seguiramo metodologia de Gibbs e Somero (1989) com
adaptações (KULTZ E SOMERO, 1995; GONZALES et al., 2005). A taxa de
peroxidação lipídica (LPO) seguiu método de Fox (Ferrous Oxidation / Xylenol
Orange Method) baseada no protocolo de Jiang et al., (1991, 1992) e o teor do
aminoácido prolina também foi quantificado conforme Bates et al. (1973). Para a
avaliação das atividades das enzimas do estresse oxidativo extratos enzimáticos
foram preparados a partir de amostras de folha e raiz de Z. mays L. coletadas após
14 dias de exposição. A concentração de proteína total das amostras foi
determinada de acordo com o método de Bradford (1976) à 595 nm, utilizando
albumina bovina sérica para determinação da curva padrão em microplaca (Dynex
52
Technologies Ltd., EUA). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e
adaptados para microplaca (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA).
2.9 Análise Citogenética em Zea mays L.
A análise citogenética em Z. mays foi realizada conforme Morozesk et al. (2017)
seguindo o protocolo de Grant (1982) com modificações (LEME e MARIN-
MORALES, 2008). Sementes de milho foram germinadas em papel filtro após serem
esterilizadas em solução de NaClO 1%. Após 4 dias, 20 sementes com 1 cm de raiz
foram selecionadas e expostas aos tratamentos seguintes por 15 dias: ES-(NaCl 100
mM) com água destilada ES-AH- NaCl (100 mM) mais AH (2.0 mM C L-1); AH- (2.0
mM C L-1) e CN-água destilada, durante 72 horas segundo Morozesk e
colaboradores (2017). Após o aparecimento das radículas, lâminas foram
preparadas por meio das células meristamáticas encontradas na extremidade da
raiz, onde foram contadas mil por lâmina em microscópio de luz, totalizando 5
lâminas por tratamento para calcular os índices genotóxicos, mutagênicos e
mitóticos.
3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados quantitativos seguiram a distribuição normal e foram submetidos a uma
análise de variância (ANOVA) seguida do teste de média Tukey a 5%. Todas as
análises foram executadas pelo programa Infostat (versão para estudantes) e seus
dados foram reportados com valores da média ± erro padrão.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise Elementar CHN
Os resultados da análise de composição elementar dos ácidos húmicos estão
dispostos na Tabela 1. Foi realizada análise elementar dos elementos C (carbono),
H (hidrogênio), N (nitrogênio) e O (oxigênio) para posterior formação da
concentração de 2 mM C-1 escolhida conforme Dobbss et al. (2010), Canellas et al.
(2012) e Zandonadi et al. (2013). O teor de nitrogênio no ácido húmico proveniente
de lodo de esgoto sanitário (AH-LE) foi maior do que os valores quantificados no
vermicomposto, indicando maior grau de evolução destes materiais húmicos
53
(KONONOVA, 1982; ADANI et al., 2006). O teor de nitrogênio elevado encontrado
nos materiais húmicos, indica-os como uma fonte importante de compostos
nitrogenados (STEVENSON, 1994). Altos teores de oxigênio observados indicam a
predominância de grupos funcionais oxigenados nos ácidos húmicos, usualmente
classificados como carboxílicos (COOH), hidroxílas (OH), carbonilas (C=O),
metóxilas (OCH3) e ocasionalmente ésteres (COOR) e éteres (COC) (HAYES et al.,
1989; SILVA et al., 1999). As relações entre C/N são muitas vezes utilizadas para
monitorar as alterações estruturais das frações húmicas das substâncias húmicas de
diferentes fontes (ADANI et al., 2006), indicando o grau de incorporação do
nitrogênio e o grau de humificação na estrutura das substâncias húmicas
(STEVENSON, 1994; LU et al., 2000). A menor relação C / N em AH-LE foi devido a
altos níveis de nitrogênio nesses compostos, evidenciando seu potencial como uma
fonte nitrogenada importante como já enfatizado por Stevenson (1994) e por
Morozesk et al. (2017).
4.2 Análises De Trocas Gasosas e Teor Relativo de Clorofila
Sabe-se que a salinidade afeta a absorção de água e diversos processos
bioquímicos resultando na redução do crescimento do vegetal, particularmente
devido ao declínio nas taxas relacionadas à fotossíntese como, por exemplo, o efeito
negativo na assimilação de CO2 e excessivo decréscimo na entrada de nutrientes
(PARIDA e DAS, 2005; CHA-UM e KIRDMANEE, 2009, TURAN et al., 2011).
Resultados de trocas gasosas mostraram que os tratamentos controle (CN) e ácido
húmico (AH-LE) tiveram diferenças significativas na análise de variância dos dados
quanto aos parâmetros de assimilação de carbono (A: CN= 7,66 mmol CO2 mol-1
H2O e AH-LE= 5.73 mmol CO2 mol-1 H2O), condutância estomática (gs: CN=0,05 mol
H2O m-2 s-1 e AH-LE= 0,05 mol H2O m-2 s-1) e transpiração (E: CN= 1,0 mol H2O m-2
s-1 e AH-LE= 0,92 mol H2O m-2 s-1) com relação ao tratamento do estresse salino
(ES) (A: 3,2 mmol CO2 mol-1 H2O; gs: 0,03 mol H2O m-2 s-1, E: 0,54 mol H2O m-2 s-1)
que obteve resultados com taxas inferiores as do CN (tabela 2). Era esperado que o
sal interferisse causando um prejuízo na absorção de água e diminuindo a
capacidade fotossintética (KUMAR et al., 2014). No entanto, foi observado que a
adição do AH-LE no tratamento de estresse salino (ES-AH) possivelmente,
amenizou as taxas das trocas gasosas prejudicadas pelo estresse salino, tais como:
A (5,56 mmol CO2 mol-1 H2O), gs (0,04 mol H2O m-2 s-1) e E (0,81 mol H2O m-2 s-1)
54
(tabela 2). A melhora nas taxas de fotossíntese, promovidas pelos AH, podem ser
fundamentadas por meio da ativação da H+-ATPases que despolariza a membrana
plasmática ativando transportadores secundários, responsáveis pelo incremento da
absorção de macro e micronutrientes (BALDOTTO et al., 2014). Outra proposta
investigada, com o uso do AH, é o aumento da entrada de nutrientes, tais como N e
P em plantas de feijão (AYDIN et al., 2012) e N em plantas de milho, ambas plantas
estressadas pelo sal (KHALED et al., 2011), sendo estes elementos considerados
essenciais ao funcionamento do aparato fotossintético. HAGHIGHI et al. (2013)
investigando alfaces com aplicação de AH em solução nutritiva também concluiu que
o AH acelera a entrada de N e NO3- e o metabolismo do N por meio do aumento da
atividade da nitrato redutase resultando na produção de proteínas. Vale ressaltar
que níveis de metabólitos nitrogenados na planta estão diretamente associados com
as taxas de pigmentos fotossintéticos (DEBAEKE et al., 2006; ERTANI et al., 2013) e
um dos efeitos relacionados ao tratamento de plantas com material húmico é o
aumento no teor de clorofila (NARDI et al., 2002; ERTANI et al., 2013, IBRAHIM et
al., 2017). O aumento destes pigmentos podem influenciar diretamente as taxas
fotossintéticas das plantas por meio da maior absorção de luz com consequente
aumento do rendimento da etapa bioquímica. Por exemplo, nos alfaces houve
aumento da atividade fotossintética devido ao aumento do teor de clorofila e
condutância mesofílica com o uso de AH (HAGHIGHI et al., 2013), bem como em
plantas de tomate que apresentaram aumento de 63% no teor de clorofila com
aplicação de SH (SLADKY et al., 1959a, 1959b). Estes trabalhos corroboram com o
resultado do presente trabalho onde a quantificação do verde foi feita pelo
equipamento SPAD e tratamentos CN e AH-LE apresentaram maiores valores do
teor do verde (CN=22,6 e AH-LE= 23.4), estatisticamente diferente do ES (18,23)
que apresentou menores teores (tabela 2). Mais uma vez, foi possível observar
atenuação do estresse salino, quanto ao parâmetro do teor de clorofila relativo do
tratamento ES-AH (21,83) onde o AH-LE minimizou a queda desta variável.
Contudo, o estudo que melhor corrobora com o aumento da clorofila relativa é o
apresentado por Rocha et al. (2014) que investigando o arroz, nas mesmas
condições experimentais e em doses crescentes do mesmo AH-LE (proveniente do
lodo de esgoto), relataram elevado teores das clorofilas a e b e carotenóides
conforme dose crescente do ácido. Vale destacar que os carotenóides têm potencial
para melhorar a qualidade nutricional e o rendimento das plantas, além de
55
desempenhar um papel importante na eliminação de espécies reativas de oxigênio
(ERO) (DAVISON et al. 2002, MUCHATE et al., 2016). Enquanto que a clorofila é o
pigmento responsável pela absorção, transferência e conversão de energia luminosa
em energia química no processo de fotossíntese (GUO et al., 2005, JIANG et al.,
2007, FAN et al., 2014). Embora houvesse o incremento nos valores das variáveis
gs, E e A (no tratamento ES-AH), o mesmo não foi observado em relação ao
carbono interno (Ci), onde era esperado a sua redução devido ao processo de
carboxilação. O Ci localiza-se no mesófilo foliar e, é usado como substrato do
processo da fotossíntese. Seu aumento verificado nos tratamentos AH-LE e ES-AH
pode ser justificado, possivelmente, por uma limitação na maquinaria bioquímica da
fotossíntese ou pelo aumento na taxa de respiração provocado pelo AH (SYLTIE et
al., 1985, LIU et al., 1998). Em suma, o tratamento com AH-LE não gerou resultados
superiores estatisticamente, nas taxas de fotossíntese em relação ao CN como
relatado por Canellas et al. (2013) e Liu et al. (1998), no entanto foram observados a
minimização dos prejuízos causados pelo sal.
4.3 Parâmetros Foliares
4.3.1 Status hídrico do Z. mays
Resultados relativos ao status hídrico do milho apresentam-se na Tabela 3. O
potencial hídrico foliar (Ψ) é uma medida importante e sensível do estado hídrico da
planta em que varia de valores próximos de zero em plantas sem estresse, até
valores bem abaixo de zero ou igual ao potencial osmótico, em plantas com estresse
(HSIAO et al., 1973). É também usado para o entendimento dos mecanismos
envolvidos e os processos afetados no controle do déficit hídrico pela própria planta
(MARTINS et al., 2010). Para avaliar o grau de déficit hídrico de uma planta é
comum utilizar-se de variáveis relacionadas às folhas, como conteúdo relativo de
água foliar e o potencial hídrico, sendo este último o mais utilizado em estudos
fisiológicos (ANGELOCCI et al., 2002). No caso deste estudo, tratamentos CN (-0,72
MPa) e AH-LE (-0,62 MPa) tiveram resultados diferentes estatisticamente dos
tratamentos com sal - ES (-2,36 MPa) e ES-AH (-2,03 MPa) - que apresentaram
valores mais negativos de potencial hídrico, como esperado. Bono et al. (2001)
classificaram plantas de milho quanto ao potencial, em três intervalos
representativos das condições hídricas nos seguintes níveis: Ψ< -1,5MPa como alto
56
déficit, Ψ entre -1,5 e -0,8MPa como médio déficit e Ψ > - 0,8MPa como sem
condição de déficit hídrico. Conforme classificação de Bono, os tratamentos CN e
AH-LE estavam sem condição de déficit hídrico enquanto que os tratamentos ES e
ES-AH estavam em condições de alto déficit. Valores menores que -1,5 MPa podem
provocar condições limitantes de disponibilidade de água às plantas (BERGONCI et
al., 2000, MARTINS et al., 2010) prejudicando processos fisiológicos como a
fotossíntese. Quanto aos resultados do teor relativo de água (TRA) foi possível
observar resultados satisfatórios quanto ao uso do AH-LE, pois, o tratamento AH-LE
apresentou o melhor índice de TRA com 92,66%, diferindo estatisticamente do
tratamento ES (80,58%) que apresentou menor percentagem de água entre os
tratamentos. Adicionalmente, foi observada a minimização da perda de água no
tratamento de sal com AH (ES-AH: 86,4%) que estatisticamente teve similaridade
com o tratamento CN (86,4%) e apresentou valores atenuados quando comparado
ao ES. O seguinte resultado apontou grande minimização da desidratação celular
em plantas sob estresse salino, fato este que pode ser justificado pela síntese ou
menor degradação do ABA promovida pelo AH (GARCÍA et al., 2014, MORA et al.,
2014) já que este hormônio é um componente fundamental do mecanismo que
permite a planta satisfazer a demanda de água e otimizar o crescimento e
sobrevivência em resposta a deficiência hídrica (ZHANG e DAVIES, 1990) por meio
da modulação da expressão de um grande número de genes cujos produtos
protegem a célula dos efeitos negativo da desidratação (BRAY, 2000; LI et al.,
2014). Vários estudos relataram que a regulação da condutividade hidráulica
radicular (Lpr) via ABA está funcionalmente relacionada com o aumento na
expressão dos genes que codificam várias proteínas intrínsecas da membrana
plasmática (PIPs) das células de raiz denominados aquaporinas (QUINTERO et al.,
1999; BEAUDETTE et al., 2007; VANDELEUR et al., 2014) que são responsáveis
pela entrada de água na célula. Este aumento significativo na expressão gênica das
principais aquaporinas da membrana plasmática da raiz está associado ao aumento
da condutividade hidráulica da raiz causada pelo modelo de ácido húmico
(OLAETXEA et al., 2015). Ambos os parâmetros confirmaram a presença de um
estresse causado pela deficiência da água e, adicionalmente mostraram a
atenuação desta com o uso do AH-LE.
57
4.3.2 Tolerância Protoplasmática e Peroxidação da Membrana Plasmática
A integridade da membrana plasmática (MP) celular foi analisada por meio da
análise de extravasamento de eletrólitos onde membranas mais prejudicadas
extravasam mais íons. É uma variável importante para inferir sobre a integridade da
membrana plasmática (TARHANEN et al. 1999; MUNNÉ- BOSCH et al., 2002) na
avaliação de dano celular. O teste de significância (p>0,05) indicou que no
tratamento ES (23,64%) ocorreram danos às membranas celulares e diferiu
estatisticamente do tratamento AH-LE (92,66%) que demonstrou melhor integridade
da membrana plasmática (tabela 3). Os tratamentos ES-AH (83,4%) e CN (86,4%)
não diferiram entre si (tabela 3) e, baseado neste resultado, é possível observar
atuação do AH-LE na proteção da integridade da membrana plasmática bem como,
García et al. (2016) e Mohamed et al. (2017) estudando AH em arroz também
relataram. O extravasamento de eletrólitos (EE) é considerado confiável indicador
fisiológico do grau de injúria sob condições de estresse (GAO et al., 2011), assim
como quantificação da peroxidação da membrana (LPO), sendo estes dois
parâmetros complementares e inerentes a avaliação de danos em membranas
celulares. No presente estudo, resultados da LPO também corroboraram com os de
EE, indicando menor peroxidação lipídica nas células de folhas (2,18 nM/mg) e
raízes (3,21 nM/mg) do milho sob estresse salino e adição de AH-LE (ES-AH), onde
houve similaridade estatística com o CN (folha= 1,89 nM/mg, raiz= 2,02 nM/mg)
(tabela 4). O tratamento ES, como esperado, apresentou maior peroxidação dos
lipídeos da MP (folha=2,81 nM/mg, raiz= 5,47 nM/mg) e diferiu dos tratamentos CN e
ES-AH e AH-LE (folha= 2,21 nM/mg, raiz= 2,32 nM/mg) (tabela 4). Garcia et al.
(2012; 2014; 2016) também observaram mitigação dos danos causados por
estresses osmóticos nas MP por meio do uso de AH-LE. Vale lembrar que ácidos
húmicos, dependendo da concentração, podem interferir na expressão de genes que
codificam aquaporinas e controlar os níveis de espécies reativas de oxigênio e a
ocorrência de peroxidação lipídica, ou seja, estimulam os mecanismos de defesa
das plantas às situações de estresse (GARCÍA et al., 2012, GARCÍA et al., 2014,
BALDOTTO et al., 2014). Tartoura et al. (2014) investigando tomate sob estresse
salino, atribuiu ao AH o papel da estabilização da membrana plasmática, como
evidenciado pela redução do EE, LPO e produção de H2O2, por meio do aumento
da atividade da nitrato redutase (NR).
58
4.3.3 Densidade Estomática
Resultados sobre a densidade estomática abaxial e adaxial não mostrou diferenças
significativas entre os tratamentos CN, AH, ES e ES-AH (Tabela 3). Diferente de
Palanivell et al., 2013, no estudo com materiais húmicos com diferentes massas
moleculares observaram aumentos na quantidade de estômatos em plantas de
milho.
4.4 Análises do Crescimento Vegetal em Z. mays
Resultados do crescimento do milho encontram-se na Tabela 4. Em condições
salinas, as atividades fisiológicas e metabólicas das plantas são prejudicadas pelo
estresse osmótico, estresse iônico, desequilíbrios nutricionais, ou uma combinação
desses fatores (ASHRAF et al., 2004; SLAMA et al., 2015) que podem prejudicar o
crescimento do vegetal. Resultados da análise de crescimento do milho, por meio da
análise de variância (p>0,05), mostraram maior crescimento radicular (CR) no
tratamento CN (CR= 58 cm). Porém, tratamentos AH-LE (CR=32,4 cm) e ES-AH
(30,4 cm) tiveram similaridade estatística com o mesmo nível de significância e
diferenciando-se do tratamento ES que obteve a pior taxa de crescimento com
apenas 17 cm. Também foi observada maior massa seca radicular (MSR) nos
tratamento CN (0,32 g) e AH-LE (0,35 g) que diferiram estatisticamente dos
tratamentos ES (0,09 g) e ES-AH (0,21 g) que apresentaram menor massa seca.
Sabe-se que o NaCl diminui o crescimento de raízes (JAMAL et. al., 2011,
JAROSOVA et. al., 2016) enquanto que o ácido húmico é conhecido por promover
benefícios no desenvolvimento do sistema radicular (BALDOTTO et al., 2014). No
presente estudo, o tratamento com AH-LE não apresentou crescimento e massa
seca radicular melhor que o CN, contudo, quando adicionado sobre o tratamento
com estresse salino (ES-AH), observou-se aumento no comprimento e na massa
seca da raiz quando comparado ao tratamento ES. Estes dois fatores contribuem
para o aumento da área de superfície das raízes, possibilitando maior absorção de
água e de nutrientes (EYHERAGUIBEL et al., 2008, BALDOTTO et al., 2014). Outro
mecanismo relatado, com uso de AH, é o aumento na disponibilidade e assimilação
de nutrientes por meio da estimulação a exsudação de ácidos orgânicos e de
açúcares pelas raízes, alterando a química e a dinâmica microbiana da rizosfera
(CANELLAS et al., 2008b; PUGLISI et al., 2013, BALDOTTO et al., 2014). Quanto
59
aos resultados relacionados à parte aérea (PA) também foi observado maior altura
no tratamento AH-LE (33 cm) e CN (34 cm). Porém, o tratamento ES-AH (24 cm)
obteve leve crescimento em relação ao ES que apresentou menor altura com 21,2
cm. No caso da massa seca da parte aérea (MSPA), resultados mostraram maior
incremento no tratamento AH-LE (0,28 g), seguido do CN (0,34 g) que diferiram
estatisticamente do ES (0,13 g). Enquanto que o tratamento ES-AH (0,24 g) mostrou
leve aumento da MSPA quando comparado ao ES. Na variável sobre área foliar
(AF), tratamentos CN (97,71 mm2) e AH (88,09 mm2) apresentaram maior área e
diferiram significativamente dos tratamentos que sofreram estresse salino ES (33,93
mm2) e ES-AH (47,3 mm2). Tal resultado estava previsto, pois, folhas são órgãos
responsáveis pela maior transpiração de água pelas plantas, assim, a redução da
área foliar é um recurso adotado no sentido de reduzir a perda de água por
transpiração (OLIVEIRA et al., 2013). Na variável sobre número de folhas (NF), o
melhor resultado obtido foi no tratamento AH-LE (5,8), seguido do tratamento CN
(5,6), ES-AH com média de 5 folhas e o tratamento ES foi o que apresentou menor
quantidade de folha, com apenas 4. Com relação à biomassa, analisada por meio da
massa seca total (MST), tratamentos CN (0,88 g) e AH-LE (0,95 g) obtiveram
maiores massas diferente dos tratamentos com sal ES (0,35 g) e ES-AH (0,45 g) que
tiveram sua biomassa reduzida possivelmente devido à diminuição das taxas de
assimilação de CO2, gs e área foliar, apresentados em resultados anteriores, sendo
estes fatores limitantes para seu crescimento. No entanto, o tratamento ES-AH
mostrou incremento de massa, com diferença estatística do ES corroborando com a
atuação dos AH em promover aumento dos pigmentos de clorofilas (ROCHA et al.,
2014, KAYA et al., 2018) colaborando desta forma com o aumento da fotossíntese e,
consequente, elevação de biomassa. O diâmetro do caule (DC) (termo errado não
existe caule) não apresentou diferenças estatísticas entres os tratamentos. No geral
os parâmetros relativos ao crescimento vegetal mostraram atenuação, por meio do
uso do AH-LE, nos tratamentos que foram aplicados estresse salino. Os resultados
acima colaboram com a hipótese de que o AH favorece o crescimento vegetal
apresentando melhores rendimentos nas biomassas dos órgãos vegetais (MSR,
MSPA e MST) e maiores taxas de crescimento (altura da planta e comprimento
radicular) (CANELLAS et al. 2002; ZANDONADI et al. 2007, JANNIN et al., 2012)
apresentando efeito análogo às auxinas em estimular o crescimento de raízes e
partes aéreas (BALDOTTO et al., 2012; BALDOTTO; BALDOTTO, 2013). A
60
habilidade do AH em melhorar as taxas de crescimento pode ser justificada pelo
aumento da permeabilidade da membrana plasmática por meio da atividade de PM
H+ - ATPase na raiz (MORA et al., 2010), pela captação de potássio e fosfato, pelo
aumento nas taxas fotossíntese e taxas de respiração, pela síntese de proteínas e
hormônios e alongamento das células-raiz (BOHME e THI, 1997; NARDI et al., 2002,
CIRIM et al., 2010; SARUHAN et al., 2011, ZHNAG et al., 2013). O estresse salino é
reconhecido por dificultar numerosos atributos morfofisiológicos, como massa seca e
fresca da raiz e da PA, e taxa fotossintética, reduzindo o teor de clorofilas (ALI et al.,
2011b, ABBASI et al., 2012) assim como foi relatado neste estudo com o tratamento
ES que também apresentou taxas de crescimento reduzidas no milho (HAJLAOUI et
al., 2010, LIMA et al., 2011, ABBASI et al., 2012). Além de estimular o crescimento,
estudos recentes mostraram que AH promove o aumento da resistência da planta a
estresses (NARDI et al., 2002, ESRINGU et al., 2016, IBRAHIM et al., 2017). Nardi
et al. (2002), Buyukkeskin e Akinci (2011), Çelik et al. (2011), Tahir et al. (2011) e
Humintech (2012) relataram efeitos benéficos de substâncias húmicas no
crescimento, germinação de sementes, desenvolvimento de crescimento de raiz e a
absorção de macro e microelementos - além da afirmação de que 1 kg de AH pode
substituir por 1 tonelada de estrume.
4.5 Biomarcadores Bioquímicos em Raízes e Folhas de Zea mays L.
Resultados dos marcadores antioxidantes em raízes e folhas de milho se encontram
na Tabela 5. No combate ante o estresse osmótico e iônico, plantas desenvolveram
diferentes mecanismos bioquímicos e moleculares como indução de enzimas
antioxidantes e hormônios vegetais para combater os efeitos deletérios da produção
de ERO (espécies reativas de oxigênio) (PARIDA e DAS, 2005; ROY et al., 2014,
MUCHATE et al., 2016). As EROs são geradas intracelularmente pelas organelas
cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomas em células de plantas, e podem provocar
danos oxidativos sob estresse abiótico (MELONI et al., 2003, LOFTI et al., 2015).
São normalmente referidas como subprodutos de reações redox (KOVALCHUK et
al., 2010, BARBOSA et al., 2014) tais como a respiração aeróbica, fotossíntese e
fotorrespiração. São categorizadas em dois grupos, radicais livres (radicais
superóxido, radical hidroxilo, radical peridroxil e radicais alcoxi) e formas não-
radicais (moléculas de peróxido de hidrogênio e oxigênio singlet), ambas formas
prejudicam estruturalmente proteínas, lipídios, carboidratos e ácidos nucleicos (BIAN
61
et al., 2009) quando o equilíbrio entre a produção de EROs e a atividade
antioxidante é rompido a favor dos compostos oxidantes (KIM e KWAK, 2010). A
capacidade de acionar mecanismos de defesa antioxidantes pode prevenir o
acúmulo dessas EROs e o estresse oxidativo extremo (BHATTACHARJEE, 2010).
São diversos os marcadores bioquímicos envolvidos na resposta contra o estresse
oxidativo, e no presente trabalho foram investigadas as atividades do superóxido
dismutase (SOD), peroxidase de ascorbato (APX), glutationa reduzida (GSH), PM
H+- ATPase e ATPase total e do aminoácido prolina nas raízes e folhas de Zea
mays. Dados das raízes de milho mostraram maiores atividades da SOD no ES-AH
(3,34 U SOD/mg de prot), da APX nos tratamentos ES (10,94 mM Asc. Ac. mg Pt-1
min-1) e ES-AH (12,84 mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1) e da GSH no tratamento ES (2,67
mMmg Pt-1 min-1). Estudos recentes, igualmente, observaram aumento da atividade
da SOD e APX em raízes de arroz e milho (ROCHA et al., 2014, MOROZESK et al.,
2017) contrariando resultados relatados por Jarosova et al. (2016) na cevada. Garcia
et al. (2016) e Garcia et al. (2012) também verificaram elevação da SOD nas raízes
de arroz tratadas com AH. Em folhas, resultados significativos foram observados
quanto à atividade da SOD no estresse salino, onde o tratamento com maior
atividade foi o ES-AH (8,98 SOD/mg de prot) com diferença estatística com os
tratamentos ES (4,9 SOD/mg de prot) e AH-LE (4,02 SOD/mg de prot) que também
apresentaram aumento de atividade, porém menor quando comparada ao CN (2,64
SOD/mg de prot). Resultados similares descreveram o aumento da SOD em folhas
de plantas tratadas com AH (GARCIA et al., 2012, ROCHA et al., 2014, MOROZESK
et al., 2017, KAYA et al., 2018). Quanto a atividade da APX nas folhas de milho, não
foram verificadas diferenças entre os tratamentos, refutando deste modo, os
resultados obtidos por Lotfi et al. (2015) na planta canola. Aumentos da atividade da
GSH foram observados no ES-AH (0,67 mMmg Pt-1 min-1), seguido dos tratamentos
ES (0,48 mMmg Pt-1 min-1) e AH-LE (0,39 mMmg Pt-1 min-1). Ambos marcadores,
SOD e GSH apresentaram maior atividade nos tratamentos ES-AH sugerindo desta
forma, que o uso do AH-LE estimulou o desempenho da defesa antioxidante.
Jarosova et al. (2016) estudando o efeito do AH em cevada frente estresse salino,
também observou aumento da concentração da GSH no tratamento NaCl+AH. Vale
lembrar que a GSH (glutationa S-transferase ) é um metabólito importante dentro do
sistema celular que participa do ciclo ascorbato-glutationa (NOCTOR et al., 2002),
da síntese de fitoquelatinas (GRATÃO et al., 2005) e da redução de dissulfetos de
62
proteínas (NORDBERG e ARNÉR, 2001). Sabe-se que a ativação destas enzimas é
de extrema importância, pois, mediante a um estresse abiótico, a SOD como
primeira linha de defesa catalisa a dismutação de radicais superóxido para a
produção de H2O2 e O2 (BARBOSA et al., 2014) e modula seu nível em cloroplastos,
mitocôndrias, citosol e peroxissomos (MITTLER, 2002; BHATTACHARJEE, 2010).
Posteriormente, a APX participa na detoxificação por meio do ciclo ascorbato-
glutationa, no qual o H2O2 formado pela ação da SOD é reduzido pelo ascorbato
(MITTLER, 2002; LOCATO et al., 2010). A remoção de H2O2 por peroxidases requer
uma pequena molécula redutora para agir como um co-fator de regeneração
gerando água como produto da reação (MHAMDI et al., 2012). A sua alta afinidade
com o H2O2, permite a sua eliminação mesmo em baixas concentrações (LOCATO
et al., 2010; SHARMA et al., 2012). As enzimas H+-ATPases também foram
quantificadas quanto a suas atividades em raízes e folhas de milho e, maiores
valores foram observados nos tratamentos com AH-LE como o ES-AH (raiz = 18,84
mM Pi mg Pt_1 h_1, folha = 2,77 mM Pi mg Pt_1 h_1) e AH-LE (raiz = 8,77 mM Pi mg
Pt_1 h_1, folha = 8,77 mM Pi mg Pt_1 h_1). Este resultado vai ao encontro dos
resultados apresentados por Rocha et al. (2014) e Morozesk et al. (2017) que
verificaram aumento expressivo destas enzimas com utilização do AH. Aumentos
nas atividades da enzima ATPase total também foram observados, ratificando o
resultado apresentado acima, onde raízes do milho sob tratamento com AH
apresentaram-se com maior atividade nos tratamentos AH-LE (23,27 mM Pi mg Pt_1
h_1) e ES-AH (28 mM Pi mg Pt_1 h_1) (tabela 5). Em folhas, igualmente, maiores
valores foram encontrados nos tratamentos ES-AH (3,18 mM Pi mg Pt_1 h_1) e AH-LE
(2,31 mM Pi mg Pt_1 h_1) enquanto valores reduzidos encontraram-se nos
tratamentos ES e CN. As H+-ATPases têm papel central no balanço energético
celular e na promoção do enraizamento, uma vez que fornecem energia para os
transportadores de íons localizados na membrana plasmática e geram o gradiente
eletroquímico responsável pela polarização da membrana plasmática (DOBBSS et
al., 2010) tornando-a mais permeável. Conforme demonstrado em diversos estudos
(FAÇANHA et al., 2002; CANELLAS et al. 2002; ZANDONADI et al., 2007,
CANELLAS et al., 2010) os AH produzem estímulos sobre a atividade de hidrólise e
transporte de H+ das H+-ATPases. Vale ressaltar que o AH também promove o
aumento da energia celular induzindo a síntese H-ATPase e, consequentemente,
estimula o crescimento celular e a entrada de nutrientes nas plantas através da
63
formação de complexos solúveis com vários íons (CANELLAS et al., 2010). A prolina
é um aminoácido que induz a expressão de proteínas responsivas ao estresse salino
e pode melhorar a adaptação da planta (KHEDR et al., 2003, EL-SHARKAWY et al.,
2017). O acúmulo deste aminoácido é apontado como um índice fisiológico sensível
da resposta da planta a vários estresses abióticos (SHI et al., 1992, EL-SHARKAWY
et al., 2017) e também é considerado um mecanismo de adaptação, que regula a
permeabilidade da água das membranas nas células e influencia o movimento da
água entre os tecidos e órgãos (ASHRAF et al., 2004). No presente trabalho foi
observado acúmulo deste soluto nas raízes de milho de dois tratamentos salinos ES
(0,87 umol-1 MS) e ES-AH (1,22 umol-1 MS), sendo este último portador de maior
acúmulo. O mesmo resultado foi observado nas folhas de milho dos tratamentos ES
(0,95 umol-1 MS) e ES-AH (1,28 umol-1 MS). Estudos recentes também verificaram o
mesmo acúmulo diante do uso do AH em plantas estressadas (HAJLAOU et al.,
2010, AYDIN et al., 2012, JAROSOVA et al., 2016, KAYA et al., 2018). Ele
desempenha uma função importante como ajuste osmótico, desintoxicação de
espécies reativas de oxigênio, atua como antioxidante, estabilização de proteínas e
complexos protéicos (MUCHATE et al., 2016). No geral, foi possível observar a
redução dos danos oxidativos provocados pelo sal, por meio da modulação do
balanço oxidativo promovida pelo AH (JAROSOVA et al., 2016).
4.6 Avaliação Citogenética em Raízes de Zea mays L.
Dados de Z. mays com exposição aos tratamentos de AH-LE e sal para análise
citogenética se encontram na Tabela 6. Resultados sobre a avaliação citogenética
relativos a aberrações cromossômicas (AC) e micronúcleos (MN) que investigam a
genotoxicidade e mutagenicidade, respectivamente, não mostraram diferenças entre
os tratamentos refutando resultados obtidos por Morozesk et al. (2017). Rocha et al.
(2014) também não verificaram potenciais mutagênicos e genotóxicos no AH de
concentração similar. Quanto aos dados que avaliam a citotoxicidade, o tratamento
AH-LE apresentou maiores índices de divisão celular (IM) confirmando o potencial
do AH-LE em promover o crescimento. Tratamentos CN e ES-AH tiveram
similaridade estatística na análise de variância (p>0,05) diferentemente do ES que
apresentou menor IM. Em geral, o comprimento da raiz é correlacionado com índice
mitótico que reflete diretamente a proliferação a nível celular (SETH et al., 2008,
MOROZESK et al., 2017). Estes resultados ratificam a hipótese de que os AH
64
influenciam o crescimento de raízes de diferentes espécies de plantas (DOBBSS et
al., 2010) e ainda, permitem inferir o uso seguro deste AH-LE em relação ao material
genético.
5. CONCLUSÕES
O tratamento com estresse salino (ES) reduziu significativamente o crescimento da
planta como observado pela diminuição da altura da planta, da área da folha, do
comprimento de raiz, do peso seco dos órgãos vegetais. Tmabém foram verificados
redução nos teores relativos de água (TRA), no índice de estabilidade da membrana
(EE), na transpiração taxa (E), na taxa de assimilação de carbono (A), na
condutância estomática (gs) bem como aumento das atividades de marcadores
bioquímicos antioxidantes, superóxido dismutase (SOD), peroxidase do ascorbato
(APX), glutationa reduzida (GSH), peroxidação lipídica (LPO) e acúmulo de prolina a
100 mM de NaCl. Enquanto que a presença de AH-LE nas plantas sob estresse
salino amenizaram os efeitos desfavoráveis da salinidade no crescimento do milho
favorecendo a capacidade fotossintética, de crescimento e bioquímica das plantas
de milho contra o estresse oxidativo induzido por salinidade. Nenhum efeito
mutagênico e genotóxico foram relatados nos tratamentos, o que se permite
recomendar o uso deste ácido orgânico como alternativa em plantas de milho que
sofrem estresse por sal.
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87
CAPITULO 2 – INFLUÊNCIA DO ÁCIDO HÚMICO DE LODO DE ESGOTO
SANITÁRIO EM PLÂNTULAS DE Zea mays L. SOB REGIME DE DÉFICIT
HÍDRICO QUANTO AOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS, CITOGENÉTICOS,
FISIOLÓGICOS E DE CRESCIMENTO.
Autores: Lívia Dorsch Rocha1, Ian Drumond Duarte1, Leonardo Vallandro Zanetti1,
Edvar Júnior Roncetti Coelho1, Ian de Oliveira Martins1, Marisa Narciso Fernandes2 e
Silvia Tamie Matsumoto1.
1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo, Av.
Fernando Ferrari, 514, 29075-910, Vitória, Espírito Santo, Brasil.
2 Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de São Carlos, Av.
Washington Luiz, Km 235, 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brasil.
Periódico a ser submetido: Environmental and Experimental Botany
88
RESUMO
Lodo de esgoto é considerado um biossólido e, portanto, possui condições para a aplicação
na agricultura. O ácido húmico (AH) é uma fração da substancia húmica (SH) que apresenta
maior bioatividade quando comparado ao ácido fúlvico (AF) e humina. O déficit hídrico (DH)
é considerado a maior restrição na estabilidade da produtividade do vegetal promovendo
alterações na fisiologia que podem ser irreversíveis dependendo dos danos gerados em
resposta. O presente trabalho teve como objetivo investigar, por meio da integração de
análises fisiológicas, bioquímicas, citogenéticas e do crescimento vegetal, os possíveis
efeitos do AH-LE (2.0 mM C L-1) sobre a plântula de milho com imposição de restrição
hídrica promovida com o PEG 6000. O experimento ocorreu em casa de vegetação, por
meio de hidroponia com adição dos tratamentos e regulação constante da aeração e do pH,
onde plântulas de Zea mays L foram cultivadas por 14 dias crescendo em soluções
nutritivas como base. Resultados da fisiologia demonstraram que parâmetros relativos à
assimilação líquida, condutância estomática, concentração interna de CO2, transpiração,
biomassa e crescimento de raízes quando relacionados aos tratamentos aditivados com
ácido húmico, indicaram amenização do estresse hídrico mantendo taxas saudáveis na
fisiologia do milho. Quanto aos parâmetros bioquímicos, estimulação de compostos
antioxidantes tais como, SOD e APX foram observados, bem como a redução do
extravasamento de eletrólitos e da peroxidação lipídica da membrana plasmática. Maior
hidratação celular foi relatada por meio do teor relativo de água corroborando com maiores
atividades das enzimas H+-ATPases promovidas pelo ação do AH-LE. Análises
citogenéticas permitiram assegurar a utilização deste ácido orgânico já que não apresentou
potenciais genotóxicos ou mutagênicos diante dos tratamentos. Diante destes resultados, é
possível sugerir a utilização do ácido húmico em plantas, de forma complementar, como
mitigador de malefícios causados por deficiência hídrica.
Palavras-chaves: deficiência hídrica • milho • material húmico • lodo de esgoto • respostas
fisiológicas.
89
ABSTRACT
Sewage sludge is considered a biosolid and thus has conditions for application in
agriculture. Humic acid (AH) is a fraction of the humic substance (SH) that presents
higher bioactivity when compared to fulvic acid (FA) and humina. Water deficit (DH)
is considered the greatest constraint on plant productivity stability promoting changes
in physiology that may be irreversible depending on the damage generated in
response. The objective of the present work was to investigate the possible effects of
AH-LE (2.0 mM C L-1) on the maize seedling with the imposition of promoted water
restriction through the integration of physiological, biochemical, cytogenetic and plant
growth analyzes with PEG 6000. The experiment was carried out in a greenhouse by
means of hydroponics with addition of treatments and constant regulation of aeration
and pH, where seedlings of Zea mays L were cultivated for 14 days growing in
nutrient solutions as a base. Results of the physiology showed that parameters
related to liquid assimilation, stomatal conductance, CO2 internal concentration,
transpiration, biomass and root growth when related to humic acid additive
treatments indicated a decrease in water stress while maintaining healthy rates in
maize physiology. Regarding the biochemical parameters, stimulation of antioxidant
compounds such as, SOD and APX were observed, as well as the reduction of
electrolyte extravasation and lipid peroxidation of the plasma membrane. Increased
cell hydration was reported by the relative water content corroborating with higher
activities of the H + -ATPases enzymes promoted by the AH-LE action. Cytogenetic
analyzes allowed to ensure the use of this organic acid since it did not present
genotoxic or mutagenic potentials before the treatments. In view of these results, it is
possible to suggest the use of humic acid in plants, in a complementary way, as a
mitigator of malfunctions caused by water deficiency.
Key words: water deficiency • corn • humic material • sewage sludge • physiological
responses.
90
1. INTRODUÇÃO
O lodo de efluente sanitário é um resíduo sólido gerado durante os processos de
tratamento do esgoto sanitário (Resolução CONAMA 375/2006) e é conhecidamente
rico em matéria orgânica e nutrientes. Entretanto, pode apresentar patógenos,
metais pesados e outros poluentes que acabam o tornando grande problema para a
saúde pública e ambiental. A produção de lodo no Brasil está estimada em 150 a
220 mil toneladas de matéria seca por ano. Considerando que apenas 30% deste
resíduo é coletado e tratado, estima-se que sua geração real seja maior que 400 mil
toneladas por ano (SOARES, 2004, PEDROZA et al., 2010).
Apesar de problemático, o lodo de esgoto apresenta características orgânicas e
biológicas em sua composição que o enquadram como biossólido e, portanto, possui
condições para a aplicação na agricultura (ANDREOLI et al., 2006, PEDROZA et al.,
2010). Devido à alta carga de matéria orgânica (MO) este vem sendo utilizado como
insumo agrícola de diversas formas. Uma delas é por meio da extração de
substâncias húmicas (SH) e ou de suas frações referentes ao ácido húmico (AH),
ácido fúlvico (AF) e humina que vem se tornando prática comum na agricultura
(BALDOTTO et al., 2014).
Os ácidos húmicos em especial são considerados a fração mais bioativa das SH
apresentando maior rendimento e produtividade nos diferentes níveis de
organização dos vegetais interferindo em sua fisiologia, causando por exemplo, o
acúmulo de nutrientes foliares (BALDOTTO et al., 2009B; MORA et al., 2010;
JANNIN et al., 2012), a biossíntese de clorofilas (AMERI e TEHRANIFAR 2012;
JANNIN et al., 2012; AHMAD et al., 2013), da biossíntese de carotenoides (TEJADA
e GONZALEZ, 2003; BALDOTTO et al., 2009b), da presença de cloroplastos
(JANNIN et al., 2012) e do processo fotossintético (AMERI e TEHRANIFAR 2012;
JANNIN et al., 2012) que resultam no incremento dos teores de macro e
micronutrientes (BALDOTTO, 2014). Contudo os efeitos mais estudados dos AH
remetem-se ao sistema radicular, especificamente com relação à formação de raízes
laterais (CANELLAS et al., 2002, JINDO et al., 2012, MORA et al., 2012),
alongamento radicular (SILVA et al., 2000), formação de raízes adventícias
(BALDOTTO et al., 2012; BALDOTTO e BALDOTTO, 2014) e formação de pelos
radiculares (CANELLAS et al., 2011; SILVA et al., 2011). Esses fatores em especial
91
permitem o aumento da massa radicular e área de superfície das raízes,
proporcionando maior absorção de água e nutrientes (EYHERAGUIBEL et al., 2008),
contribuindo, por exemplo, na promoção da defesa ou melhoramento fisiológico de
uma planta.
O estresse causado pela deficiência hídrica é considerado a maior restrição na
produção e estabilidade das culturas de planta (HEINEMANN, 2010). A falta de água
em plantas provoca alterações nas propriedades das membranas, aumento da
respiração, inibição da fotossíntese, menor produção de matéria seca, senescência
prematura e redução na produção e em seus componentes (UPADHYAY et al. 2011,
PEREIRA et al. 2012, DUARTE et al. 2013). Ainda assim, plantas conseguem se
proteger apresentando respostas adaptativas como redução no teor de água,
diminuição do potencial hídrico foliar e a perda de turgor, fechamento dos estômatos,
diminuição de crescimento celular (JALEEL et al., 2009), desenvolvimento da área
radicular e raízes laterais. Apesar de possuir uso seguro na agricultura, pouco se
sabe sobre o efeito do AH sobre a deficiência hídrica. Contudo, GARCIA et al (2012)
verificaram que o AH protegeu a permeabilidade da membrana celular frente ao
estresse hídrico e ainda minimizou o efeito do estresse salino no crescimento do
feijão (AYDIN et al., 2012). Nesse aspecto, ASLI e NEUMANN (2010) propuseram
que AH podem se agrupar em raízes para afetar a transpiração e, promovendo
assim, alterações na condutividade hidráulica das raízes por meio do estresse
coloidal.
A sensibilidade das plantas à seca pode ser avaliada utilizando diferentes
parâmetros do estado fisiológico da planta, como por exemplo, o potencial hídrico,
os processos de troca gasosa e a concentração de pigmentos cloroplastídicos,
(CENTRITTO et al., 2003; BACELAR et al., 2007). Os princípios e as práticas da
análise quantitativa do crescimento vegetal têm como objetivo descrever e
interpretar o desempenho de determinada espécie crescendo em condições de
ambiente natural ou controlado (HUNT, 1990, PEIXOTO, 2011). O método tem como
objetivo estimar a produtividade biológica ou produtividade primária de comunidades
vegetais (PEIXOTO, 1998; PEIXOTO, 2002; CRUZ, 2007; PEIXOTO e PEIXOTO,
2009; TSUMANUMA, 2009, PEIXOTO, 2011) a fim de interpretar respostas e
utilidade da planta (HUNT et al., 2002). A avaliação de trocas gasosas, assimilação
92
líquida de CO2 e potencial hídrico são complementares e muitas vezes podem
indicar mecanismos de adaptações em sua fisiologia neste tipo de estudo.
O milho (Zea mays L.) é uma gramínea com alto índice nutritivo ocupando o primeiro
lugar no mundo de cereais cultivados em diversos ambientes e climas do planeta
(WERLE et al., 2011). Além disso, é utilizado como organismo teste eficiente, pois
possui sensibilidade a respostas fisiológicas, habilidade fisiológica na conversão de
compostos minerais em orgânicos (SEVERINO et al., 2005; CRUZ et al., 2008). A
relação do milho com as SH já foram observadas em diversos estudos que
demonstraram alta sensibilidade deste com a exposição à substancias húmicas
(PINTON et al. 1999; CANELLAS et al., 2002; QUAGGIOTTI et al., 2004;
PALANIVELL et al., 2013).
Nessa perspectiva, percebe-se a necessidade de estudos com aplicação de
biossólidos, como por exemplo, o AH, nos cultivos de vegetais com finalidade de
investigar sua ação em plantas. Tendo em vista a problemática da geração de
resíduos sólidos oriundo de esgotos sanitários, a utilização de lodo de esgoto como
biossólidos para a extração de AH apresenta-se como alternativa de destinação
final. Diante disto, o presente trabalho objetivou, por meio da integração de análises
fisiológicas, investigar os possíveis efeitos e interações do AH sobre o milho sob
déficit hídrico.
93
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Preparo das amostras
Amostras de lodo de esgoto foram fornecidas pela empresa de saneamento básico
do Espírito Santo CESAN, Companhia Espírito Santense de Saneamento (ABNT,
2004) para a extração de AH e posterior quantificação elementar (CHN) por meio do
analisador elementar automático (Leco, CHNS 932– Alemanha) que quantifica os
percentuais de carbono total, hidrogênio total, nitrogênio total e oxigênio total
(AYUSO et al., 1996) (Tabela 1). Após serem pulverizadas, foram realizadas as
extrações das substâncias húmicas alcalino solúveis pelo método recomendado pela
Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS) e posteriormente, foi
extraído o AH por meio da redução do pH da solução com HCl 6 mol -1. Em seguida,
lavados com água deionizada e dializados em membranas com poros 14 kDa e para
posterior liofilização. Para montagem do experimento foi preparada uma solução de
AH na concentração de 2.0 mM C L-1 seguindo literatura escolhida conforme Dobbss
et al. (2010), Canellas et al. (2012) e Zandonadi et al. (2013).
2.2 Condições Experimentais
2.2.1 Ensaio com Zea mays L.
Os experimentos foram realizados em casa de vegetação e laboratório no Setor de
Botânica (-20° 16' 29.46"S e -40° 18' 17.04” O), Departamento de Ciências
Biológicas, localizados no campus de Goiabeiras da Universidade Federal do
Espírito Santo (UFES), Vitória, ES, com temperatura média de 27°C. Sementes de
Zea mays L. (Híbrido Embrapa - BR 206) foram desinfetadas após imersão em
solução de NaClO (1,0 %) por 30 minuntos, sendo posteriormente banhadas em
água destilada por 3 horas. Após este processo, as sementes foram envoltas em
papel-filtro e dispostas em local úmido, protegido da luze com temperatura média de
28°C para a promoção da germinação. Cinco dias após a germinação, plântulas de
milho com aproximadamente 0,5 cm de raiz foram selecionadas e transferdias para
vasos contendo solução Hoagland (Hoagland e Arnon, 1950) modificada para ¼ de
força molar.
O experimento ocorreu durante 10 dias (MOROZESK et al., 2017). Durante o mesmo
as condições de pH das soluções foram mantidas na faixa de 5,8 a 6,0, sendo suas
94
condutividades elétricas mensuradas. Para a exposição das raízes de Zea mays aos
tratamentos, foram estabelecidos sistemas de hidroponia com aeração constante. A
exposição ocorreu em quatro tratamentos sendo que cada tratamento havia solução
nutritiva mais fatores do tipo PEG 6000 e/ou AH adicionados. Tratamentos sob
déficit foram adicionados PEG 6000 (valor de -0,96 MPa) seguindo Villela et al.
(1991) para sua aplicação. Vale ressaltar que o polietileno glicol (PEG) é utilizado
para simular os efeitos do estresse osmótico (MISRA et al., 2004). Para avaliar as
interações dos tratamentos déficit hídrico e ácido húmico, foram montados os
seguintes experimentos: DH-AH: déficit hídrico (PEG 6000) + AH-LE; DH–: déficit
hídrico (PEG 6000) sem AH-LE; AH-LE: solução nutritiva + ácido húmico e CN –:
solução nutritiva.
2.3 Análises de Trocas Gasosas
As análises de troca gasosa e assimilação líquida de CO2 foram realizadas com
auxílio de um analisador de gases infravermelho portátil (IRGA), modelo LI 6400 (LI-
COR, USA), em irradiância de 1000 μmol de fótons m-2 s-1. Foram avaliadas a
assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2 s-1), transpiração (E, mol H2O m-2 s-1),
condutância estomática (gs, mol H2O m-2 s-1), concentração intercelular de CO2 (Ci,
μmol CO2 mol ar-1).
2.4 Parâmetros Foliares
2.4.1 Densidade Estomática (%)
Para a análise quantitativa foram coletadas amostras de folha de dez indivíduos de
Zea mays L. sendo essas fixadas e armazenadas em álcool etílico 70% e
posteriormente realizadas impressões abaxiais, do terço mediano da região
internervural. A densidade estomática (mm2) foi realizada utilizando uma gota de
adesivo instantâneo universal éster de cianoacrilato (Super-Bonder, EUA) em uma
lâmina histológica. Doze campos ópticos aleatórios foram analisados por indivíduo,
totalizando 60 campos ópticos por tratamento.
2.4.2 Teor Relativo de Água nas Folhas (TRA)(%)
Para a avaliação do teor relativo de água foram retirados dois discos foliares de
aproximadamente 1 cm de diâmetro do centro do limbo foliar, evitando as nervuras,
95
e imediatamente pesadas em balança de precisão de miligramas, para obter a
massa da matéria fresca (MF). Em seguida, os discos foram acondicionados em
recipientes escuros e submersos em água destilada para atingirem saturação
hídrica, e mantidos à aproximadamente 4ºC durante o período de 24 horas. Após o
período, os discos foram retirados da água, eliminando-se o excesso de água com
papel absorvente e pesados imediatamente para a determinação da massa túrgida
(MT). Em seguida, obteve-se a massa seca (MS) por meio da secagem dos discos
em estufa até atingirem massa constante. O TRA foi calculado conforme Klar (1984),
por meio da equação: TRA = [(MF – MS) / (MT – MS)] 100.
2.4.3 Extravasamento de Eletrólitos (E.E.) (%)
Para avaliar a viabilidade das membranas usou-se a técnica do extravasamento de
eletrólitos (Bajji et al. 2001), onde discos foliares (1cm de diâmetro) de folhas do 2º
ou 3º nó a partir do ápice do eixo ortotrópico foram retirados com um perfurador e
lavados por três vezes em água destilada para a retirada do material extravazado do
corte. Após a lavagem dos discos, estes foram secos em papel absorvente e
colocados em tubos contendo 20 mL de água ultrapura a 25ºC por 6h sob agitação
constante, para posterior análise da condutividade elétrica (C1) com o auxílio de um
condutivímetro portátil (Sanxin, modelo SX723, China) e depois, tubos com os discos
foram colocados a 90ºC por 2h. Frascos semelhantes aos das amostras contendo
apenas água foram utilizados como branco (B1) antes da fervura e (B2) após a
fervura. Após o equilíbrio da temperatura, a condutividade elétrica máxima foi
medida (C2) e o extravasamento de eletrólitos calculado pela fórmula: [(C1-B1) /
(C2-B2)] 100.
2.4.4 Potencial da Água na folha na antemanhã (Ψw)
O potencial hídrico foliar (Ψw) foi determinado na antemanhã utilizando uma bomba
de pressão tipo Scholander (SCHOLANDER et al., 1965) PMS Instrument, modelo
600, USA. A determinação consistiu na coleta de amostras da 2ª ou 3ª folha
completamente expandida a partir do ápice do eixo ortotrópico com bom estado
fitossanitário, sendo retirada e colocada na câmara da bomba de pressão para ser
aplicada pressão até a exsudação de líquido pelo pecíolo da folha onde então é feita
a leitura da pressão aplicada (TURNER, 1981).
96
2.5 Análises Quantitativas Do Crescimento Vegetal
Após os 21 dias de condução experimental, foram coletadas aleatoriamente cinco
espécimes de Zea mays L. de cada repetição, a fim de mensurar a altura (cm), a
área foliar total (Area Meter, LI-COR 3100, USA), massa fresca (MF) e seca (MS)
(estufa 60º C) de todos os órgãos das plantas, altura parte aérea (cm), diâmetro do
caule (mm) e número de folhas (NF). Por meio dessas medidas foram obtidas
médias da razão de área foliar (AF) por número de folhas (AF/NF), área foliar
específica (AFE), razão de raiz parte aérea (MSR/MSPA); comprimento específico
da raiz (CR/MSR), alocação de massa na parte aérea (MSPA/MST) e alocação de
massa na raiz (MSR/MST) (HUNT, 1978; ROCHA et al., 2009). Como análise
complementar, também foi mensurada por meio do medidor de clorofila SPAD (Soil
Plant Analysis Development) (SPAD-502, Minolta, Japão) a concentração relativa de
clorofila sendo realizada também na folha basal mais desenvolvida.
2.6 Biomarcadores bioquímicos
2.6.1 Concentração de proteína
A concentração de proteína das amostras foi determinada pelo método de Bradford
(1976) adaptado para microplaca, onde 10 μL do homogeneizado foi adicionado em
200 μL de Coomassie Blue. Em seguida, foi realizada a leitura da absorbância a λ=
595 nm, utilizando-se, como padrão, curva de albumina sérica bovina.
2.6.2 Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD)
A atividade da SOD foi realizada por espectrofotometria com base no protocolo
descrito por McCord e Fridovich (1969), no qual o radical superóxido é gerado por
meio do sistema xantina/xantina oxidase e a redução do citocromo c foi monitorada a
550 nm. Foram pesados 0,3 g de amostra vegetal (folha e raiz) e adicionados 900 μL
de tampão fosfato com PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 mM. A mistura foi
homonegeneizada (ULTRA-TURRAX, IKA, China), centrifugada 10000 g por 10
minutos 4º C e o sobrenadante aliquotado para análise. Para leitura da atividade em
microplaca foram adicionados 10 μL do sobrenadante a 288 μL de meio de reação
(Xantina 50 μM, KCN 20 μM, Citocromo c 10 μM, EDTA 100 μM) em cada poço.
Para o branco, utilizou-se 2 μL de meio de reação. A leitura foi realizada durante um
minuto em intervalos de 15 segundos em espectrofotômetro (Biomete 3, Thermo
97
Eletron Corporation, EUA). O volume de xantina oxidase foi determinado a partir da
leitura do branco, com uma leitura a cada sete amostras lidas. A atividade
enzimática foi expressa por unidade de SOD, sendo que uma unidade de SOD
corresponde a quantidade de enzima necessária para inibir 50% da redução do
citocromo c por minuto por mg de proteína a 25 °C e pH 7,8.
2.6.3 Atividade da enzima peroxidase do ascorbato (APX)
A atividade da APX foi determinada pelo método descrito por Nakano e Asada
(1981) com adaptações, no qual a concentração de H2O2 dependente de ascorbato
foi determinada por uma diminuição do valor de absorbância a 290 nm, usando o
coeficiente de extinção molar 2,8 mmol-1 L cm-1. O extrato foi preparado com 0,3 g
de amostra vegetal (folha e raiz) e adicionados 900 μL de tampão fosfato (200 mM,
pH 7,0) com PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) a 1 mM. A mistura foi
homonegeneizada (ULTRA-TURRAX, IKA, China), centrifugada a 10000 g por 10
minutos a 4º C e o sobrenadante aliquotado para análise. Para leitura da atividade
em microplaca foram adicionados 2 μL do sobrenadante a 125 μL de tampão fosfato,
12 μL de ácido ascórbico, 96,9 μL de água destilada, 12,5 μL de H2O2. Para o
branco, utilizou-se 3,1 μL de água destilada. A leitura foi realizada durante três
minutos em intervalos de 15 segundos em espectrofotômetro (Biomete 3, Thermo
Eletron Corporation, EUA). A atividade específica foi expressa em μmol de ácido
ascórbico min-1 mg-1 de proteína.
2.6.4 Atividade da enzima Gultationa reduzida (GSH)
A quantificação da concentração de GSH foi realizada conforme White et al. (2003)
com modificações por Gallagher et al. (1992). A determinação da concentração de
GSH se dá pela separação dos dipeptídeos através de centrifugação e a posterior
reação dos complexos dipeptídicos com o 2,3 naftalenedicarboxialdeido (NDA), o
qual gera um complexo fluorescente que é medido a 528 nm após excitação a 472
nm. O extrato foi preparado com 0,3 g de amostra vegetal (raiz) e adicionados 900
μL de tampão de homogeneização (Tris-HCl 100 mM, EDTA 2 mM e MgCl2 x 6 H2O
5 mM) com PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) a 1 mM. A mistura foi
homonegeneizada (ULTRA-TURRAX, IKA, China), centrifugada a 10000 g por 10
minutos a 4º C e o sobrenadante aliquotado para análise. Para leitura da atividade,
inicialmente foram adicionados 20 μL do sobrenadante a 20 μL de ácido
98
sulfosalicílico (200 mM) em microplaca para centrifugação e incubados por 20
minutos. Após esse período, a placa foi centrifugada a 2500 rpm por 5 minutos. Em
seguida, 20 μL do sobrenadante foram transferidos para microplaca branca,
adicionados 180 μL de solução fluorescente (Tris-base 50 mM, NaOH 500 mM e 2,3-
naftalenedicarboxialdeído - NDA 10 mM) e a placa foi incubada por 30 minutos. Para
o branco, utilizou-se 20 μL de tampão de homogeneização. Utilizou-se, para
confecção da curva padrão, diferentes diluições de GSH (40, 20, 10, 5 e 2,5 nM). A
leitura foi realizada em espectrofotômetro (Biomete 3, Thermo Eletron Corporation).
A concentração de GSH foi expressa μM por mg de proteína.
2.6.5 Atividade da enzima H+-ATPase
A atividade da H+-ATPase foi determinada pelo método descrito por Gibbs e Somero
(1989) com adaptações de Kultz e Somero (1995) e Gonzales et al. (2005), no qual
os ensaio foi baseado na defosforilação do ATP para a oxidação do NADH, onde a
fração sensível ao NEM (inibidor da H+-ATPase) foi utilizada para avaliar a atividade
da H+-ATPase, com valor de absorbância a 340 nm. O extrato foi preparado com 0,2
g de amostra vegetal (folha e raiz) e adicionados 600 μL de tampão de
homogeneização (Sacarose 150 mM, Imidazol 50 mM, EDTA 10 mM), com
betamercaptanol. A mistura foi homonegeneizada (ULTRA-TURRAX, IKA, China),
centrifugada duas vezes a 3000 rpm por 7 minutos a 4º C e o sobrenadante
aliquotado para análise. Para leitura da atividade total da ATPase, foram
adicionados em microplaca 5 μL do sobrenadante a 200 μL de meio de reação
(Imidazol 30 mM, NaCl 45 mM, KCl 15mM, MgCl2 x 6 H2O 3mM, KCN 0,4 mM, ATP
1 mM, NADH 0,2 mM, PK 3 u/mL, LDH 3 u/mL, Frutose 1,6-difosfato 0,1 mM, PEP 2
mM). Para leitura da atividade da H+-ATPase, foram adicionados em microplaca 5
μL do sobrenadante a 200 μL de meio de reação e solução de NEM 2 mM. A leitura
foi realizada durante quinze minutos em intervalos de 30 segundos em
espectrofotômetro (Biomete 3, Thermo Eletron Corporation, EUA). A atividade
específica foi definida como a unidade da atividade da enzima por mg de proteína.
2.6.6 Taxa de Peroxidação de Lipídios (LPO)
A taxa de Peroxidação Lipídica foi realizada pelo método de FOX (Ferrous Oxidation
/ Xylenol Orange Method), com base no protocolo de Jiang et al. (1991, 1992). O
método baseia-se na rápida oxidação do Fe+2 mediada por peróxidos sob condições
99
ácidas e posterior formação do complexo Fe+3-laranja de xilenol, na presença do
estabilizador hidroxitolueno butilado, que absorve luz a 550-570 nm. Amostras de
aproximadamente 3g de tecido vegetal (raiz) foram homogeneizadas (ULTRA-
TURRAX®, IKA), centrifugada a 10000 g por 10 minutos a 4º C e o sobrenadante
aliquotado para análise. Para leitura da atividade em microplaca foram adicionados
60 μL do sobrenadante a 240 ul de meio de reação sob 15 μl de PBS; para o branco
foram adicionados 60 μL de tampão de homogeneização. A leitura foi realizada em
espectrofotômetro (Biomete 3, Thermo Eletron Corporation).
2.6.7 Determinação do Teor do Aminoácido Prolina
Foi pesado 0.5g de amostra vegetal para posterior trituração em solução aqousa de
ácido sulfosaliucílico 3%. Para folhas foi necessário 10mL de solução enquanto que
para as raízes 2mL de solução. O material, portanto, foi filtrado em membrana 11um
e foi adicionado ácido ninhidrínico e ácido acético glacial na proporção 1:1:1,
deixando a solução reagir por uma hora em banho a 100ºC. Após o período de
reação, foi feito o choque térmico em banho de gelo por 5 minutos e, posteriormente,
foi adicionado tolueno na proporção 3 solução : 2 tolueno. A solução foi agitada
vigorosamente com o devido cuidado por se tratar de ácidos fortes. A fase aquosa
foi aspirada (200 µL aliquotados em placa de 96 poços) e deixada à temperatura
ambiente por 20 minutos. A absorbância foi lida a 520nm onde o tolueno
representava o branco. O cálculo foi determinado pela equação, seguindo protocolo
da Bates et al. (1973): [(µg prolina/mL x mL tolueno) / 115.5 µg/µmole] / (g
amostra/5)
2.7 Ensaio Citogenético em Zea mays L.
Sementes de Z. mays foram germinadas em água destilada e posteriormente
submetidas por 15 dias as soluções tratantes: água Destilada (controle), AH,
polietilenoglicol (PEG) (estresse hidrico), Cloreto de sódio (NaCl) (estresse salino),
AH + PEG, AH + NaCl. Radículas de aproximadamente 1 cm foram coletadas e
fixadas em carnoy. Para a análise citogenética lâminas foram confeccionadas a
partir das regiões de meristemas onde essas foram coradas pela metodologia
convencional de Feulgen. Foram aferidos o índice de germinação, índice mitótico,
índice de aberrações cromossômicas (índice de genotoxicidade) e índice
mutagênico. A análise citogenética em Z. mays foi realizada conforme Morozesk et
100
al. (2017) seguindo o protocolo de Grant (1982) com modificações (LEME e MARIN-
MORALES, 2008).
2.6 Análises Estatísticas
Os dados quantitativos seguiram a distribuição normal e foram submetidos a uma
análise de variância (ANOVA) seguida do teste de média Tukey a 5%. Todas as
análises foram executadas pelo programa Infostat (versão para estudantes) e seus
dados foram reportados com valores da média ± erro padrão.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Análise Elementar CHN
Os resultados da análise de composição elementar dos ácidos húmicos estão
dispostos na Tabela 1. Foi realizada análise elementar dos elementos C (carbono),
H (hidrogênio), N (nitrogênio) e O (oxigênio) para avaliar o grau de humificação que
é estabelecido por meio destes elementos. As relações entre C/N são muitas vezes
utilizadas para monitorar as alterações estruturais das frações húmicas das
substâncias húmicas de diferentes fontes (ADANI et al., 2006), indicando o grau de
incorporação do nitrogênio e o grau de humificação na estrutura das substâncias
húmicas (STEVENSON, 1994; LU et al., 2000). A menor relação C / N em AH-LE foi
devido a altos níveis de nitrogênio nesses compostos, evidenciando seu potencial
como uma fonte nitrogenada importante como já enfatizado por Stevenson (1994) e
por Morozesk et al. (2017). O teor de nitrogênio no ácido húmico proveniente de lodo
de esgoto sanitário (AH-LE) foi maior do que os valores quantificados no
vermicomposto, indicando maior grau de evolução destes materiais húmicos
(KONONOVA, 1982; ADANI et al., 2006, MOROZESK et al., 2017). O alto teor de N
permite indica-lo como importante fonte de compostos nitrogenados (STEVENSON,
1994) bem como, elevados teores de oxigênio indicam a predominância de grupos
funcionais oxigenados nos ácidos húmicos, usualmente classificados como
carboxílicos (COOH), hidroxílas (OH), carbonilas (C=O), metóxilas (OCH3) e
ocasionalmente ésteres (COOR) e éteres (COC) (HAYES et al., 1989; SILVA et al.,
1999, MOROZESK et al., 2017).
101
3.2 Análises de Trocas Gasosas e Teor de Clorofila Relativo
Resultados de trocas gasosas se encontram na tabela 2. A falta de água na planta
prejudica o processo fotossintético, já que ela é requerida na liberação de prótons e
elétrons da etapa fotoquímica da fotossíntese, bem como na regulação da abertura
estomática, possibilitando a absorção de CO2 e a mobilização de fotoassimilados
(CHAVARRIA e SANTOS, 2012). Ao analisar respostas das trocas gasosas no milho
sob deficiência hídrica com adição de AH, na maioria dos parâmetros analisados,
pôde-se observar atenuação dos possíveis efeitos gerados por estresses hídricos.
Na variável A onde são mensurada as taxas de assimilação líquida de CO2, por
exemplo, maiores valores foram relatados no CN (A = 7,66 umol CO2 m-2 s-1), e DH-
AH (A = 5,14 umol CO2 m-2 s-1) em relação ao tratamento DH (A= 2,84 umol CO2 m
-2
s-1) e AH-LE (A = 5,73 umol CO2 m-2 s-1) (Tabela 2). Liu et al. (1998) também
verificaram incrementos nessa taxa por meio da aplicação de AH. Sabe-se que o
ácido húmico desempenha um papel ativo na estimulação do crescimento das
plantas por meio da promoção da fotossíntese, respiração e teor de clorofila (HEIL,
2005, XU et al., 2012, FAN et al., 2014). Já os maiores valores de condutância
estomática se encontraram nos controles CN (gs = 0,05 mol H2O m-2 s-1) e AH (gs =
0,05 mol H2O m-2 s-1) em comparação aos tratamentos DH (0,03 mol H2O m-2 s-1) e
DH-AH (0,04 mol H2O m-2 s-1). Vale ressaltar que plantas sob estresse hídrico
tendem a fechar os estômatos como forma de controle da perda de água, como
verificado por Xu et al. (2008), na variedade de milho chinesa sob deficiência hídrica.
Mesmo assim, resultados sobre gs indicaram leve elevação da condutância no
tratamento DH-AH (0,04 mol H2O m -2 s-1) comparado ao DH (0,03 mol H2O m -2 s-1)
(tabela 2), bem como, Lopez et al. (1993) e Reyes et al. (1993) também relataram
auxílio na abertura do estômato por meio da aplicação de AH, sendo este parâmetro
responsável pela permeabilidade da folha à difusão de água e CO2 e relacionado a
produtividade do vegetal (COSTA e MARENCO, 2007). No caso da transpiração (E),
o milho sob déficit hídrico apresentou menores taxas transpiratórias, sendo esse
efeito amenizado quando as plantas foram adubadas com AH-LE. Asli e Neumann
(2010) propuseram um mecanismo de ação, sugerindo que o AH pode se agrupar
em raízes afetando a condutividade hidráulica das raízes por meio do estresse
coloidal promovendo, dessa forma, um transporte de água mais eficiente. Em
resumo, o tratamento DH-AH, apesar de estar sob estresse hídrico, apresentou
102
valores promissores nas taxas de A, E e gs quando comparado ao DH permitindo-
nos inferir maior assimilação de CO2 conforme afirmação de SILVA et al. (2015) que
relatou também aumento da A em resposta ao aumento da E. A melhora nas taxas
de fotossíntese no tratamento com déficit hídrico, promovidas pelos AH, podem ser
justificadas pela ativação da H+-ATPases que despolariza a membrana plasmática
ativando transportadores secundários, responsáveis pelo incremento da absorção de
macro e micronutrientes (BALDOTTO et al., 2014). Na análise de carbono interno
(Ci), como esperado, plantas com restrição hídrica tendem a aumentar o Ci como
resposta fisiológica ao mecanismo de fechamento dos estômatos (ROUHI et al.
2007; SINGH et al. 2011), assim como observado nos tratamentos sob déficit hídrico
DH (Ci = 245,07 umol CO2 mol ar -1) e DH-AH (Ci = 200,96 umol CO2 mol ar -1). Vale
lembrar que aumentos na condutância podem gerar maior difusão de CO2 para a
câmara subestomática (NASCIMENTO et al., 2009, SILVA et al., 2015) e espera-se
sua redução após o processo de carboxilação. No entanto, apesar do AH-LE
apresentar incremento nas taxas A, E e gs, com relação ao Ci não foi verificado sua
diminuição, sugerindo uma limitação na maquinaria bioquímica da fotossíntese ou
aumento na taxa de respiração provocado pelo AH (SYLTIE et al., 1985, LIU et al.,
1998). Resultados sobre a análise do teor relativo de clorofila medido pelo
equipamento SPAD também revelaram minimização da redução do teor de clorofila
causado pelo estresse hídrico no tratamento DH-AH (21,26) (tabela 2). Tratamentos
AH (23,4) e CN (22,6) apresentaram maiores teores de clorofila diferindo
significativamente do tratamento DH (19,25). Rocha et al. (2014) trabalhando com o
mesmo ácido e nas mesmas condições experimentais, em arroz, também
observaram aumento nos teores das clorofila a e b e carotenoides, corroborando
com Haguigui et al. (2013) que observou 63% de aumento de clorofila com aplicação
de SH em tomates. Vale ressaltar que o aumento do teor de clorofila pode influenciar
diretamente nas taxas fotossintéticas (NARDI et al., 2002; ERTANI et al., 2013).
Uma das características investigadas no AH é a sua facilitação da entrada de N e
NO3- que acelera o metabolismo do N por meio do aumento da atividade da nitrato
redutase resultando na produção de proteínas (HAGHIGHI et al., 2013) e,
consequentemente, na síntese destes pigmentos fotossintéticos (DEBAEKE et al.,
2006; ERTANI et al., 2013). Diferente de Canellas et al. (2013) e Liu et al. (1998) que
verificaram altas taxas de fotossíntese líquida em Zea mays e Agrostis stolonifera, o
presente trabalho não apresentou taxas superiores no tratamento de AH comparado
103
ao CN, no entanto, foi observado no geral, efeito protetivo resultante do uso de AH-
LE aplicado ao DH, quanto as taxas fotossintéticas.
3.3 Parâmetros Foliares
3.3.1 Status hídrico de Zea mays L.
Resultados do status hídrico de Z. mays se encontram na tabela 3. Para avaliar o
grau de déficit hídrico de uma planta é comum utilizar-se de variáveis relacionadas
às folhas, como conteúdo relativo de água foliar e o potencial hídrico, sendo este
último o mais utilizado em estudos fisiológicos (ANGELOCCI et al., 2002). O
potencial hídrico foliar indica o estado energético do vegetal, cujos gradientes
justificam os fluxos da água no sistema substrato-planta-atmosfera (BERGONCI et
al., 2000, COSTA e MARENCO, 2007) de modo que, variações no potencial hídrico
da folha podem afetar a assimilação do carbono da planta (HSIAO, 1973, COSTA e
MARENCO, 2007). Na análise do potencial hídrico foliar (ψw), os tratamentos sob
deficiência hídrica DH-AH (-1,86 MPa) e DH (-2,25 MPa) apresentaram os maiores
valores como esperado, pois, o potencial de água da folha tende a diminuir com o
declínio da disponibilidade de água, levando à perda da turgescência e ao
fechamento estomático (MANSUR e BARBOSA 2000, SILVA et al., 2003) (tabela 3).
Tratamentos CN (-0,72 MPa) e AH (-0,62 MPa) apresentaram valores de potencial
menores e diferente estatisticamente dos tratamentos sob deficiência hídrica (tabela
3). Os resultados acima comprovam que houve deficiência hídrica no vegetal
segundo a classificação feita por Bono et al. (2001) onde plantas de milho com Ψ< -
1,5MPa estão sob alto déficit, Ψ entre -1,5 e -0,8MPa estão sob médio déficit e Ψ > -
0,8MPa estão em condições normais (sem condição de déficit hídrico). Foi
observado que as plântulas dos tratamentos com deficiência hídrica obtiveram
valores altíssimos de potenciais e, portanto, pode-se afirmar que ocorreu estresse
hídrico severo. Vale lembrar que valores menores que -1,5 MPa podem provocar
condições limitantes de disponibilidade de água às plantas (BERGONCI et al.,
2000b, MARTINS et al., 2010), podendo inclusive, provocar perda de água numa
taxa superior à sua capacidade de absorção e transporte, levando ao fechamento
dos estômatos e redução da fotossíntese (COSTA e MARENCO, 2007). Em relação
aos resultados sobre teor relativo (TRA) de água da folha, foi observada claramente
a atuação do AH húmico na hidratação celular. Tratamento AH (92,66%) apresentou
104
maior conteúdo de água e diferiu estatisticamente do DH (82,2%), enquanto que
tratamentos DH-AH (90,22%) e CN (86,4%) tiveram valores similares na estatística.
A proteção contra a desidratação celular relacionada ao uso do AH pode ser
atribuída a sua característica em promover a síntese ou menor degradação do ABA
(GARCÍA et al., 2014, MORA et al., 2014). Este hormônio vegetal é responsável pela
demanda de água e otimização do crescimento e sobrevivência em resposta a
deficiência hídrica (ZHANG e DAVIES, 1990) por meio da modulação da expressão
de um grande número de genes cujos produtos protegem a célula dos efeitos
negativos da desidratação (BRAY et al, 2000, LI et al., 2014). García et al. (2014)
trabalhando com arroz sob estresse salino concluiu que o AH protegeu o vegetal por
meio da sinalização via ABA independente e regulação dos genes OsTIPs que
regulam o transporte de substâncias como glicenol, uereia, H2O2 e NH4+ /NH3+ em
forma de metilamonia e formamido (HOLM et al., 2005; JAHN et al., 2004, GARCIA
et al., 2014). Na literatura, o funcionamento das aquaporinas é também regulado via
ABA independente (GARCÍA et al., 2014), sendo estas proteínas de canais
responsáveis pela regulação do fluxo de água transmembranar (SUGA et al., 2001,
GARCÍA et al., 2014). OLAETXEA et al. (2015) trabalhando com pepino e AH
observaram aumento significativo na expressão gênica das principais aquaporinas
da membrana plasmática da raiz associado ao aumento da condutividade hidráulica
da raiz. Em resumo, foi possível observar por meio destes dois parâmetros que
houve de fato estresse hídrico causado pela deficiência da água e, que o uso do AH
promoveu minimização dos efeitos gerados.
3.3.2 Tolerância Protoplasmática
A tolerância protoplasmática é mensurada a partir da medida do extravasamento de
eletrólitos onde membranas com maiores danos terão mais extravasamento. Essa
variável é importante na inferência sobre a integridade da membrana plasmática
(TARHANEN et al., 1999; MUNNÉ- BOSCH et al., 2002). Resultados baseados na
análise de extravasamento de eletrólitos indicaram, claramente, que o uso do AH
protege a integridade da membrana celular. Tratamentos CN (12,34%), AH (12,44%)
e DH-AH (14,16%) tiveram valores similares na estatística e diferiram
significativamente do tratamento que houve deficiência hídrica (DH= 24,8%) (tabela
3). O extravasamento de eletrólitos (EE) é considerado confiável indicador fisiológico
do grau de injúria sob condições de estresse (GAO et al., 2011) e, resultados
105
semelhantes foram publicados por García et al. (2016) e Mohamed et al. (2017)
estudando AH em arroz. Sabe-se que EE e LPO (peroxidação lipídica) são variáveis
que indicam injúrias na membrana celular em caso de estresse (TARTOURA et al.,
2014), e no presente estudo também houve quantificação da LPO, onde resultados
desta variável apontaram o AH como mantenedor da integridade da membrana
plasmática (MP). A maior peroxidação lipídica ocorreu em folhas (5,68 nM/mg) e
raízes (12,04 nM/mg) do tratamento com restrição hídrica (DH). Tratamentos CN
(folha= 0,36 nM/MG, raiz= 1,12 nM/mg) e AH-LE (fola= 1,77 nM/MG, raiz= 1,74
nM/mg) apresentaram valores similares na análise de variância e, significativamente
diferentes dos tratamentos sob deficiência hídrica que apresentaram maiores
peroxidação, conforme esperado. Contudo, o tratamento DH-AH (fola=2,44 nM/mg,
raiz= 9,32 nM/mg) apesar de possuir valor elevado de peroxidação da MP, quando
comparado ao DH o mesmo apresentou redução de danos haja vista estatística.
Sabe-se hoje, que as maiorias das lesões causadas por exposição a estresses estão
associadas a danos oxidativos ao nível celular (ALLEN, 1995), sendo estes
responsáveis à formação de ROS (espécies reativas de oxigênio), como o
superóxido, o radical hidroxilo, o peróxido de hidrogênio e o oxigênio singlete que
podem promover a peroxidação lipídica da membrana e, consequentemente, o
vazamento de membrana (ASHRAF et al., 2004). Tartoura et al. (2014) também
observou estabilização da MP por meio do aumento da atividade da nitrato redutase
(NT) que reduziu EE, LPO e produção de H2O2, investigando tomate sob estresse
salino com AH. O uso de AH como mitigador de estresses osmóticos tem sido
respaldado por trabalhos realizados por Garcia et al. (2012; 2014; 2016). Embora o
mecanismo pelo qual o AH promova redução de danos não esteja completamente
elucidado, diversos efeitos bioquímicos são relatados referentes ao uso deste ácido,
tais como aumento da permeabilidade da membrana celular com entrada de
nutrientes, aumento da atividade de antioxidantes e síntese de proteínas
(BALDOTTO et al., 2014). Em resumo, ambos parâmetros se complementaram e
indicaram maior proteção a integridade celular frente a deficiência hídrica.
3.3.3 Densidade Estomática
Resultados sobre a densidade estomática abaxial e adaxial não mostrou diferenças
significativas entre os tratamentos CN, AH, ES e ES-AH (tabela 3). Diferente de
Palanivell et al., 2013, no estudo com materiais húmicos com diferentes massas
106
moleculares, observaram aumentos na quantidade de estômatos e alterações no
mecanismo de abertura e fechamento estomático.
3.4 Análises Quantitativas do Crescimento Vegetal em Zea mays L.
Análises do crescimento vegetal são de grande importância para estudos de
organismos vegetais, pois permite, por meio de medidas, verificar a resposta da
planta diante das condições que foram determinadas. O crescimento vegetal pode
significar o reflexo de toda a fisiologia da planta durante o período observado.
Plantas com falta de água podem sofrer alterações nas propriedades das
membranas, aumento da respiração, inibição da fotossíntese, menor produção de
matéria seca, senescência prematura e redução na produção e em seus
componentes (UPADHYAY et al. 2011, PEREIRA et al. 2012, DUARTE et al. 2013).
Nos parâmetros relacionados ao crescimento vegetal o tratamento AH-LE obteve
maior taxa de crescimento de raiz (CR) com 45,8 cm, diferenciando-se
estatisticamente dos tratamentos CN (32,4 cm), DH (20,8 cm) e DH-AH (20,6 cm)
(tabela 4). Tal resultado foi acompanhado pela massa seca da raiz (MSR) onde
tratamento AH-LE (0,37 g) apresentou maior acúmulo de biomassa diferenciando-se
estatisticamente do tratamento DH (0,23 g) que obteve a menor (tabela 4), pois, é
conhecido o potencial de NaCl em diminuir o crescimento de raízes (JAMAL et. al.,
2011, JAROSOVA et. al., 2016). Tratamentos CN (0,3 g) e DH-AH (0,29 g) tiveram
similaridade estatística nesse parâmetro evidenciando-se assim uma melhora no
tratamento do déficit hídrico com AH-LE (tabela 4). Ambas variáveis corroboram com
o trabalho de Mora et al. (2012) que também relatou crescimento radicular com
consequente aumento da massa seca, sendo estes fatores contribuidores para o
aumento da massa radicular e da área de superfície das raízes, possibilitando maior
absorção de água e de nutrientes (EYHERAGUIBEL et al., 2008, BALDOTOO et al.,
2014).. Tendo em vista que o AH possui, conhecidamente, características
intrínsecas relacionadas ao desenvolvimento do sistema radicular que envolve
alongamento radicular (MALIK e AZAM, 1985; SILVA et al., 2000), formação de
raízes laterais (CANELLAS et al., 2002; TREVISAN et al., 2010b; BALDOTTO et al.,
2011b; JINDO et al., 2012; MORA et al., 2012) e formação de pelos radiculares
(CANELLAS et al., 2011; SILVA et al., 2011), o resultado se mostrou coerente
conforme a literatura. Outro resultado abordado na medida de crescimento foi à
altura da parte aérea (PA) onde o tratamento AH-LE apresentou maior altura (33
107
cm), com similaridade estatística com o CN (32,4 cm) e, diferenciando-se dos
tratamentos sob deficiência hídrica DH-AH (20,8 cm) e DH (20,6 cm). No parâmetro
de massa seca parte aérea (MSPA), resultados similares foram observados onde o
tratamento AH-LE (0,38 g) apresentou maior massa seguido de CN (0,34 g), DH-AH
(0,24 g) e DH que apresentou menor massa com 0,16 g (tabela 4). Mora et al. (2010)
também verificaram crescimento e desenvolvimento da parte aérea das plantas, em
resposta à aplicação radicular e foliar de ácidos húmicos. Baseado nestes
resultados, é possível perceber atenuação da perda de biomassa PA e do
crescimento do tratamento sob deficiência hídrica com a aplicação de AH-LE (DH-
AH). A área foliar (AF) também foi mensurada com intuito de analisar a parte
fotossinteticamente ativa da planta, tratamentos sem déficit hídrico (CN= 97,71 mm2,
AH= 95,69 mm2) apresentaram maiores áreas do que os tratamentos com déficit
hídrico (DH= 29,93 mm2, DH-AH=39,09 mm2). Reduções nos valores desta variável
podem ser interpretadas como mecanismo de proteção da planta, por meio da
diminuição da área de exposição direta à radiação solar, evitando danos ao aparato
fotossintético, reduzindo a perda de água e melhorando o desempenho fotossintético
da planta sob elevada irradiância (NAKAZONO et al, 2001; DUZ et al., 2004). A
análise da quantificação da massa seca total é uma ferramenta de uso no estudo do
comportamento das diversas cultivares que consideram que vários processos
fisiológicos afetam o desenvolvimento da planta e estão relacionados com este
parâmetro (BRANDELERO et al., 2002; BENICASA, 2003). Resultados da massa
seca total (MST) do milho apontaram maiores valores para o tratamento com AH-LE
(0,75 g) e CN (0,65 g). O tratamento DH (0,39 g) apresentou a menor biomassa,
porém, o mesmo tratamento com aplicação do AH (DH-AH= 0,53 g) revelou maior
produção de massa inferindo colaboração do AH-LE possivelmente, pela promoção
da maior permeabilidade da membrana celular, da entrada do oxigênio, da
respiração, da fotossíntese, entrada do fosfato, elongação da célula da raiz (CACCO
e DELL’AGNOLLA 1984, TÜRKMEN et al., 2004, AMERI et al., 2012) e quebra de
amidos que disponibilizam fotoassimilados (MERLO et al., 1991, NARDI et al., 2002).
Assim, a taxa de crescimento de uma espécie é determinada não apenas pela
capacidade de assimilação de carbono, mas por uma série de outros fatores como a
taxa de respiração, a eficiência na translocação de assimilados e na superfície foliar
da planta, que interagem de forma complexa resultando num acúmulo de biomassa
(MARENCO e LOPES, 2005). O parâmetro relacionado ao número de folhas (NF)
108
também evidenciou melhora dos efeitos promovidos pelo AH em restrição hídrica,
onde o maior número de folhas foi observado no tratamento AH-LE (5,8), seguido do
CN (5,6), DH-AH (5), enquanto o tratamento DH (4,6) apresentou a menor média
desta análise (tabela 4). O diâmetro do caule (DC) não apresentou diferenças
estatísticas entre os tratamentos. No geral, plantas sob tratamento com restrição
hídrica e aplicação do AH apresentaram-se menos afetadas quanto ao crescimento
vegetal, supostamente devido ao AH viabilizar maior entrada de nutrientes e induzir
mudanças na fisiologia da planta (GHOLAMI et al., 2013) bem como aumentar a
permeabilidade da membrana (Mora et al., 2010), a captação de potássio e fosfato,
as taxas de fotossíntese e respiração, a síntese de proteínas e hormônios e
alongamento das células-raiz (BOHME e THI, 1997; NARDI et al., 2002, CIRIM et al.,
2010; SARUHAN et al., 2011, ZHANG et al., 2013). Os resultados acima
colaboraram com a hipótese de que o AH favorece o crescimento vegetal
estimulando o crescimento de raízes e partes aéreas, apresentando efeito análogo
às auxinas (BALDOTTO et al., 2012a; BALDOTTO; BALDOTTO, 2013) e,
corroboraram com os trabalhos de Canellas et al. (2002), Zandonadi et al. (2007) e
Jannin et al., (2012) apresentando melhores rendimentos nas biomassas dos órgãos
vegetais (MSR, MSPA e MST) e taxas de crescimento (altura da planta e
comprimento radicular) com o uso de AH. Adicionalmente, trabalhos têm descrito o
aumento da resistência a estresses estimulado pelo AH (NARDI et al., 2002,
ESRINGU et al., 2016, IBRAHIM et al., 2017).
3.5 Biomarcadores Bioquímicos em Raízes e Folhas de Zea mays L.
O estresse causado pela restrição hídrica geralmente leva a produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs). As EROs são formadas como subproduto do
metabolismo aeróbico e participam de uma sofisticada rede de vias de sinalização
em plantas (BARBOSA et al., 2014). Plantas desenvolveram mecanismo robusto
para a inativação de EROs incluindo rotas de defesas enzimáticas e não-enzimáticas
para controlar seus efeitos deletérios (MUCHATE et al., 2016). Os mecanismos mais
comuns para desintoxicar EROs sintetizadas durante o estresse é por meio da
indução de enzimas que sequestram EROs, tais como superóxido dismutase (SOD),
peroxidase (POD), peroxidase de ascorbato (APX), catalase (CAT) e outros
compostos não enzimáticos como carotenóides, ácido ascórbico, tióis, proteína
solúvel e glutationa (5). No presente estudo, foram investigadas as atividades dos
109
marcadores bioquímicos do sistema antioxidante superóxido dismutase (SOD),
peroxidase de ascorbato (APX), glutationa reduzida (GSH), H+-ATPase e ATPase
total e do aminoácido prolina nas raízes e folhas de Zea mays. Quanto aos
resultados quantificados sobre a atividade da SOD tanto folha quanto raízes
apresentaram o mesmo perfil de resposta com maiores atividades nos tratamentos
que possuíam adição do ácido húmico AH-LE (raiz = 3,8 SOD/mg de prot, folha =
3,18 SOD/mg de prot) e DH-AH (raiz = 2,7 SOD/mg de prot, folha = ) diferenciando
dos tratamentos CN e DH estatisticamente (tabela 5). Estudos recentes também
relataram aumento da SOD em raízes (GARCIA et al., 2012, ROCHA et al.,
2014,GARCIA et al., 2016, MOROZESK et al., 2017) e folhas (GARCIA et al., 2012,
ROCHA et al., 2014, MOROZESK et al., 2017, KAYA et al., 2018) tratadas com AH.
A SOD é de extrema importância na defesa antioxidante, pois, é considerada
primeira linha de defesa contra as EROs, no sentido que catalisam a dismutação de
dois radicais O2 •- gerando H2O2 e O2 (BARBOSA et al., 2014) evitando, deste
modo, o risco de formação de OH• a partir do O2 •- (DUBEY, 2011; DINAKAR et al.,
2012). Também são responsáveis pela modulação do nível de H2O2 em cloroplastos,
mitocôndrias, citosol e peroxissomos (MITTLER et al., 2002; BHATTACHARJEE et
al., 2010). Atividades da APX se mostraram altas nos tratamentos AH-LE (raiz = 9,1
mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1, folha= 7,4 mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1), DH (raiz = 10,94
mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1, folha= 11,96 mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1) e DH-AH (raiz =
12,84 mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1, folha= 13,31 mM Asc. Ac. mg Pt-1 min-1) (tabela 5),
sendo estes dois últimos valores mais elevados na análise de significância (p<0,05).
É possível observar, mais uma vez, que tratamentos com AH podem contribuir para
o aumento da atividade da APX, tal como Lotfi et al. (2015) e Rocha et al., (2014)
relataram em seus estudos. As APX desempenham a mesma função de catalase, no
entanto, catalisam a remoção de H2O2 usando o ascorbato como um redutor
(MUCHATE et al., 2016) por meio do ciclo ascorbato-glutationa (MITTLER, 2002;
LOCATO et al., 2010). A sua alta afinidade com o H2O2 , permite a sua eliminação
mesmo em baixas concentrações (LOCATO et al., 2010; SHARMA et al., 2012).
Quanto à concentração da GSH, foram observados incrementos apenas no
tratamento AH-LE (0,6 mMmg Pt-1 min-1) nas raízes de milho (tabela 5) corroborando
com os trabalhos de Rocha et al., (2014) e Jarosova et al., (2016). A GSH (glutationa
S-transferase) é um importante metabólito que participa de diversas funções
intracelulares como: participa do ciclo ascorbato-glutationa (NOCTOR et al., 2002),
110
da redução de dissulfetos de proteínas gerados pela ação de compostos
antioxidantes (NORDBERG e ARNÉR, 2001) e da síntese de fitoquelatinas
(GRATÃO et al., 2005). Resultados das enzimas H+ATPase e ATPase total
indicaram maiores valores no tratamento DH-AH (raiz = 23,13 mM Pi mg Pt_1 h_1,
folha = 2,42 mM Pi mg Pt_1 h_1), (raiz = 26,4 mM Pi mg Pt_1 h_1, folha = 2,7 mM Pi mg
Pt_1 h_1) respectivamente (tabela 5). Resultados acima ratificaram a hipótese de que
o AH desempenha papel de um mecanismo fitohormonal que pode estimular
drasticamente a H+-ATPase em plantas (CANELLAS e OLIVARES 2014). Foram
reportados, também, em trabalhos com arroz e milho por Rocha et al., (2014) e
Morozesk et al., (2017) resultados semelhantes. Ressalta-se ainda, que o AH
estimula a atividade e promoção da síntese das enzimas H+-ATPases da membrana
plasmática, num efeito semelhante ao auxínico (NARDI et al., 1991; FAÇANHA et
al., 2002; CANELLAS et al., 2002; JINDO et al., 2012, BALDOTTO et al., 2014)
hipótese esta que justifica o bom desempenho no crescimento vegetal observado
neste estudo. É importante destacar o papel das H+ - ATPases no balanço
energético celular e na promoção do enraizamento, uma vez que fornecem energia
para os transportadores de íons localizados na membrana plasmática e geram o
gradiente eletroquímico responsável pela polarização da membrana plasmática
(DOBBSS, 2010). Outro marcador bioquímico importante na avaliação de danos
causados por restrição hídrica é o aminoácido prolina e seu acúmulo, sendo
considerado índice fisiológico sensível da resposta da planta a vários estresses
abióticos (SHI et al., 1992, AYDIN et al., 2012). O acúmulo de prolina é um
mecanismo de adaptação que regula a permeabilidade da água das membranas nas
células e influencia o movimento da água entre os tecidos e órgãos (ASHRAF et al.,
2004, AYDIN et al., 2012), levando ao crescimento melhorado das plantas (AYDIN et
al., 2012). Ele desempenha uma função importante como ajuste osmótico,
desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, atua como antioxidante,
estabilização de proteínas e complexos proteicos (MUCHATE et al., 2016). No
presente trabalho foi perceptível o aumento de prolina nos tratamentos DH-AH (raiz
= 0,61umol-1 MS, folha = 0,73 umol-1 MS) mesmo comparados ao DH (raiz = 1,08
umol-1 MS, folha = 0,73 umol-1 MS) que também mostrou elevação deste
aminoácido. O presente resultado foi corroborado por diversos estudos que também
observaram acúmulo de prolina com o uso de AH em plantas sob estresse
(HAJLAOU et al., 2010, AYDIN et al., 2012, JAROSOVA et al., 2016, KAYA et al.,
111
2018). A capacidade de acionar mecanismos de defesa antioxidantes pode prevenir
o acúmulo dessas EROs e o estresse oxidativo extremo (BHATTACHARJEE et al,,
2010) tal como, pôde ser observado neste estudo a minimização de danos
oxidativos com a ativação do aparato antioxidante.
3.6 Avaliação Citogenética em Raízes de Zea mays L.
Dados das análises citogenéticas em raízes de Z. mays se encontram na Tabela 6.
Não foram observados potenciais mutagênicos (MN) e genotóxicos (AC) entre os
tratamentos investigados e, portanto, não foi gerado danos ao material genético nas
células das raízes expostas. Determinado resultado também foi relatado por
Morozesk et al. (2017) e Rocha et al. (2014). No entanto, o índice mitótico, que
avalia a divisão celular, mostrou maiores valores nos tratamentos CN e AH com
diferenças estatística com os tratamentos sob deficiência hídrica DH e DH-AH.
Apesar do AH ser conhecido por promover o crescimento radicular (DOBBSS et al.,
2010), no presente estudo sua atuação no tratamento DH-AH não foi observada
possivelmente, devido ao estresse causado pela falta de água. Ainda assim, sugere-
se a utilização deste AH-LE já que o mesmo não causou prejuízos ao material
genético.
4. CONCLUSÕES
Análises de trocas gasosas, do crescimento vegetal, parâmetros foliares juntamente
com bioquímicas indicaram que o AH amenizou os efeitos fisiológicos gerados pela
deficiência hídrica onde se pôde notar a diferença, inclusive morfológica, no
desenvolvimento das plantas que se encontravam sob o estresse.
Em condições normais, onde o milho cresceu em solução nutritiva (AH), o ácido
húmico não promoveu melhoras no desenvolvimento do milho, possivelmente por
possuir características de adsorção e quelação que podem vir a interferir na
biodisponibilidade de alguns nutrientes presentes na solução nutritiva.
Algumas características específicas presentes no composto AH puderam ser
observadas, tanto em tratamento sob estresse hídrico quanto em condições normais,
em parâmetros como: redução do potencial hídrico foliar; elevação da massa seca
total e massa seca de raiz e folha e aumento das atividades das enzimas H+
ATPase e ATPase total.
112
Nenhum efeito mutagênico e genotóxico foram relatados nos tratamentos, o que se
permite recomendar o uso deste ácido orgânico como alternativa em plantas de
milho que possam sofrer com estresse hídrico.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), e à
Fundação de Amparo à pesquisa do Espírito Santo (FAPES) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de doutorado
concedidas.
.
113
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120
CONCLUSÃO GERAL
O seguinte trabalho mostrou segundo parâmetros de medidas do status hídricos que
a plântula de Z. mays estava de fato sofrendo deficiência hídrica tanto por meio do
PEG 6000 quanto pela presença de NaCl (100 mM). Consequências negativas foram
observadas nas taxas da fotossíntese acompanhada da redução de biomassa do
vegetal. Maiores danos às membranas também foram registrados por meio da maior
peroxidação lipídica e extravasamento de eletrólitos seguida de acúmulo de prolina.
Após a aplicação do AH-LE a estes dois tratamentos estressados com falta de água,
percebeu-se a mitigação de todos estes fatores bem como elevação das atividades
de substancias antioxidantes e de permeabilidade de membrana (H+-ATPases).
Além disso, análises toxicogenéticas não encontraram potencial mutagênico,
genotóxico e citotóxico no AH-LE. Em suma, o ácido húmico extraído de lodo de
esgoto é uma boa alternativa para geração de bioestimulantes que permitem a
remediação dos efeitos causados pela falta de água e, ainda, colabora com a
problemática causada pela alta produção de resíduos sólidos sem destinação.
121
Lsita de Tabelas Capítulo 1
Tabela 1. Caracterização do ácido húmico e do lodo de esgoto bruto. AH: ácido húmico; LES: lodo de esgoto sanitário. Valores expressos por média ± desvio padrão. NA: não aplicável.
(ROCHA et al., 2014)
AH - LES Lodo bruto
g Kg-1
Elementos
Carbono 280,00 ± 23,58 109,60 ± 1,30
Hidrogênio 41,45 ± 2 20,9 ± 3,23
Nitrogênio 43,37 ± 3,87 23,3 ± 0,28
Oxigênio 635 ± 28,33 NA Relações
C/N 64,59 ± 0,35 NA
H/C 1,49 ± 0,12 NA
O/C 22,86 ± 3,08 NA
Nutrientes
Nitrogênio
total
43,26 ± 0,04 22,47 ± 0,02
Fósforo 4,35 ± 0,10 3,16 ± 0,08
Potássio 0,03 ± 0,02 4,12 ± 0,01
Cálcio 2,86 ± 0,24 7,80 ± 0,27
Magnésio 1,56 ± 0,03 4,26 ± 0,03
Enxofre 11,37 ± 0,02 9,76 ± 0,04
Ferro 27960 ± 139,08 12420 ± 99,92
Cobre 820 ± 2,25 156 ± 2,89
Zinco 220 ± 5,29 544 ± 2,31
Manganês 40 ± 1,15 156 ± 4,62
Boro 1,77 ± 0,93 3,53 ± 0,13
122
Tabela 2. Tabela de análise de trocas gasosas e do teor relativo da clorofila do milho tratado por ácido húmico proveniente do lodo de esgoto frente a estresse salino. Onde: A: assimilação de carbono, gs: condutância estomática, E: transpiração, Ci: carbono interno e SPAD: teor da clorofila relativa; ES= estresse
salino (NaCl-100 mM); ES-AH: estresse salino com ácido húmico (AH-LE); CN=controle e AH-LE= ácido húmico (2 mM C-1). Valores são expressos em média ± erro padrão.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE ES ES-AH CV
A 7,66 ± 0,89 b 5,73 ± 0,71 b 3,2 ± 0,31 a 5,56 ± 0,42 ab 25,26
gs 0,05 ± 0,01 b 0,05 ± 0,0041 b 0,03 ± 0,0035 a 0,04 ± 0,0039 ab 21,8
E 1,0 ± 0,077 b 0,9 ± 0,044 b 0,54 ± 0,0048 a 0,81 ± 0,098 ab 19,04
Ci 155,39 ± 16,56 a 185,07 ± 16,8 ab 235,8 ± 5,48 b 217,22 ± 21,5 ab 18,25
SPAD 22,6 ± 0,35 b 23,4 ± 0,51 b 18,23 ± 0,3 a 21,83 ± 1,51 ab 6,67
Tabela 3. Parâmetros de trocas gasosas em folhas de Zea mays frente e estresse hídrico
tratado com ácido húmico proveniente do lodo de esgoto sanitário. Onde: ES= estresse salino (NaCl-100 mM); ES-AH: estresse salino com ácido húmico (AH-LE); CN=controle e AH-LE= ácido húmico (2 mM C-1). Valores são expressos em média ± erro padrão.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE
ES ES-AH CV
Ψ(-MPa) -0,72 ± 0,07 b -0,62 ± 0,1 b -2,36 ± 0,09 a -2,03 ± 0,18 a 18,32
DE adax 167,25 ± 19,94 a 146,55 ± 17,45 a 135,2 ± 7,95 a 144,8 ± 5,68 b 8,82
DE abax 179,04 ± 15,7 a 194,75 ± 17,4 a 179,8 ± 15,66 a 190 ± 25,78 a 18,98
TRA 86,4 ± 2,33 ab 92,66 ± 1,8 b 80,58 ± 1,85 a 83,4 ± 3,48 ab 6,36
E.E 12,34 ± 0,45 a 15,16 ± 1,7 a 23,64 ± 1,66 b 16,34 ± 0,61 a 16,53
Tabela 4: Análise do crescimento vegetal do milho tratado por ácido húmico frente a estresse salino. Onde: CR: comprimento da raiz; NF= número de folhas; DC: diâmetro do caule; AF: área foliar; MSR: massa seca radicular, MSPA: massa seca parte aérea; MST: massa seca total. Onde: ES= estresse salino (NaCl-100 mM); ES-AH: estresse salino com ácido húmico (AH-LE); CN=controle e AH-LE= ácido húmico (2 mM C-1). Valores são expressos em média ± erro padrão.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE ES ES-AH CV
CR (cm) 58 ± 2,28 c 32,4 ± 1,86 b 17 ± 2,59 a 30,4 ± 2,25 b 16,27
Altura (cm) 29 ± 1,45 b 33 ± 1,95 b 21,2 ± 0,97 a 21,6 ± 0,81 a 11,69
NF 5,6 ± 0,4 ab 5,8 ± 0,2 b 4,6 ± 0,24 a 5 ± 0 ab 10,86
DC (mm) 4,33 ± 0,27 a 4,09 ± 0,16 a 4 ± 0,28 a 3,66 ± 0,15 a 12,33
AF (mm2) 97,71 ± 2,52 b 88,09 ± 6,65 b 33,93 ± 8,22 a 47,3 ± 6,22 a 20,97
MSR (g) 0,32 ± 0,03 b 0,35 ± 0,02 c 0,09 ± 0,02 a 0,21 ± 0,02 b 16,27
MSPA (g) 0,34 ± 0,04 bc 0,38 ± 0,04 c 0,13 ± 0,02 a 0,24 ± 0,01 ab 22,33
MST (g) 0,67 ± 0,05 c 0,73 ± 0,02 c 0,23 ± 0,03 a 0,44 ± 0,02 b 14,85
123
Tabela 5: Análise bioquímica em Zea mays tratado com ácido húmico de lodo de esgoto
(AH-LE) sob estresse salino. Valores são expressos em média ± erro padrão.
Raiz Tratamentos Variáveis CN AH-LE ES ES-AH CV
Superóxido Dismutase 1,18 ± 0,23 a 1,87 ± 0,16 a 1,21 ± 0,07 a 3,34 ± 0,15 b 14,84
Ascorbato Peroxidase 6,52 ± 0,34 a 8,77 ± 0,39 b 10,94 ± 0,42 c 12,84 ± 0,69 c 8,46
Glutationa Reduzida 0,55 ± 0,06 a 0,6 ± 0,06 a 2,67 ± 0,47 b 1,11 ± 0,12 a 34,64
Lipoperoxidação 2,02 ± 0,4 a 2,32 ± 0,21 ab 5,47 ± 0,19 c 3,21 ± 0,12 b 13,41
H+ - ATPase 6,52 ± 0,34 a 8,77 ± 0,39 ab 10,94 ± 0,42 a 12,84 ± 0,69 b 7,97
ATPase Total 12,44 ± 0,4 a 23,27 ± 1,87 b 11,43 ± 0,75 a 23,93 ± 1,24 b 11,69
Prolina 0,22 ± 0,02 a 0,27 ± 0,05 a 0,87 ± 0,02 b 1,22 ± 0,06 c 11,24
Folha
Superóxido Dismutase 2,64 ± 0,03 a 4,02 ± 0,46 b 4,9 ± 0,12 b 8,98 ± 0,37 c 10,17
Ascorbato Peroxidase 6,68 ± 0,23 a 7,4 ± 0,45 a 6,96 ± 0,34 a 7,98 ± 0,75 a 11,52
Glutationa Reduzida 0,34 ± 0,07 a 0,39 ± 0,1 ab 0,48 ± 0,05 ab 0,67 ± 0,05 b 26,32
Lipoperoxidação 1,89 ± 0,09 a 2,21 ± 0,19 a 2,81 ± 0,11 b 2,18 ± 0,02 a 9,14
H+ - ATPase 0,84 ± 0,06 a 1,5 ± 0,07 b 0,76 ± 0,14 a 2,77 ± 0,23 c 12,65
ATPase Total 1,05 ± 0,1 a 2,31 ± 0,12 b 1,08 ± 0,11 b 3,18 ± 0,16 c 10,14
Prolina 0,21 ± 0,02 a 0,3 ± 0,05 a 0,95 ± 0,08 b 1,28 ± 0,06 c 14,16
Tabela 6: Resultados da análise citogenética em raízes de Zea mays tratadas com ácido húmico do lodo de esgoto e NaCl. Valores são expressos em média ± erro
padrão.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE ES ES-AH CV
IM 0,02 ± 0,0012 bc 0,03 ± 0,0026 c 0,01 ± 0,0012 a 0,02 ± 0,00067 b 15,02
AC 0,03 ± 0,03 a 0,17 ± 0,12 a 0,17 ± 0,07 a 0,1 ± 0,06 a 113,39
MN 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0
124
Lista de Tabelas Capítulo 2
Tabela 1. Caracterização do ácido húmico e do lodo de esgoto bruto. AH: ácido húmico; LES: lodo de esgoto sanitário.
Valores expressos por média ± desvio padrão. NA: não aplicável.
(ROCHA et al., 2014)
AH - LES Lodo bruto g Kg-1
Elementos
Carbono 280,00 ± 23,58 109,60 ± 1,30
Hidrogênio 41,45 ± 2 20,9 ± 3,23
Nitrogênio 43,37 ± 3,87 23,3 ± 0,28
Oxigênio 635 ± 28,33 NA Relações
C/N 64,59 ± 0,35 NA
H/C 1,49 ± 0,12 NA
O/C 22,86 ± 3,08 NA
Nutrientes
Nitrogênio
total
43,26 ± 0,04 22,47 ± 0,02
Fósforo 4,35 ± 0,10 3,16 ± 0,08
Potássio 0,03 ± 0,02 4,12 ± 0,01
Cálcio 2,86 ± 0,24 7,80 ± 0,27
Magnésio 1,56 ± 0,03 4,26 ± 0,03
Enxofre 11,37 ± 0,02 9,76 ± 0,04
Ferro 27960 ± 139,08 12420 ± 99,92
Cobre 820 ± 2,25 156 ± 2,89
Zinco 220 ± 5,29 544 ± 2,31
Manganês 40 ± 1,15 156 ± 4,62
Boro 1,77 ± 0,93 3,53 ± 0,13
125
Tabela 2. Tabela de análise de trocas gasosas e do teor relativo da clorofila do milho tratado por ácido húmico proveniente do lodo de esgoto frente a estresse salino. Onde: A: assimilação de carbono, gs: condutância estomática, E: transpiração, Ci: carbono interno e SPAD: teor da clorofila relativa; ES= estresse salino (NaCl-100 mM); ES-AH: estresse salino com ácido húmico (AH-LE); CN=controle e AH-LE=
ácido húmico (2 mM C-1). CV: coeficiente de variação.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE DH DH-AH CV
A 7,66 ± 0,89 b 5,73 ± 0,71 b 2,84 ± 0,57 a 5,14 ± 0,35 ab 32,58
gs 0,05 ± 0,01 b 0,05 ± 0,01 b 0,03 ± 3,60E-03 a 0,04 ± 0,0021 ab 23,58
Ci 155,39 ± 16,56 a 185,07 ± 16,8 a 245,07 ± 8,76 b 200,96 ± 6,94 ab 14,84
E 1,0 ± 0,09 b 0,91 ± 0,084 b 0,49 ± 0,074 a 0,75 ± 0,015 ab 20,39
SPAD 22,6 ± 0,35 b 23,4 ± 0,51 b 19,25 ± 0,8 a 21,26 ± 0,63 ab 4,76
Tabela 3. Parâmetros Foliares em Zea mays frente e estresse hídrico tratado com ácidos húmicos extraídos de lodo de esgoto sanitário. Onde: ES= estresse salino (NaCl-100 mM); ES-AH: estresse salino com ácido húmico (AH-LE); CN=controle e AH-LE= ácido húmico (2 mM C-1). Valores são expressos em média ± erro padrão. CV: coeficiente de variação.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE DH DH-AH CV
Ψ (-MPa) -0,72 ± 0,07 b -0,62 ± 0,1 b -2,25 ± 0,16 a -1,86 ± 0,1 a 18,64
DE adax 167,25 ± 19,94 a 146,55 ± 17,45 a 120,1 ± 13,91 a 121,7 ± 14,04 a 9,66
DE abax 179,04 ± 15,7 a 194,75 ± 17,4 a 149,21 ± 14,1 a 177,04 ± 15,2 a 10,27
TRA 86,4 ± 2,33 ab 92,66 ± 1,8 b 82,2 ± 2,79 a 90,22 ± 0,91 ab 6,36
E.E 12,34 ± 0,45 a 12,44 ± 0,32 a 24,86 ± 1,83 b 14,16 ± 1,25 a 16,02
Tabela 4: Análise do crescimento vegetal do milho tratado por ácido húmico frente a estresse salino. Onde: CR: comprimento da raiz; NF= número de folhas; DC: diâmetro do caule; AF: área foliar; MSR: massa seca radicular, MSPA: massa seca parte aérea; MST: massa seca total. Onde: ES= estresse salino (NaCl-100 mM); ES-AH: estresse salino com ácido húmico (AH-LE); CN=controle e AH-LE= ácido húmico (2 mM C-1). Valores são expressos em média ± erro padrão. CV: coeficiente
de variação.
Tratamentos
Variáveis CN AH DH DH-AH CV
NF 5,6 ± 0,4 ab 5,8 ± 0,2 b 4,6 ± 0,24 a 5 ± 0 ab 10,86
Raiz (cm) 32,4 ± 1,86 b 45,8 ± 1,39 c 16,4 ± 2,48 a 25,2 ± 1,39 b 13,72
Altura P.A. (cm) 29 ± 1,45 b 33 ± 1,95 b 20,6 ± 0,68 a 20,8 ± 0,86 a 11,52
DC (mm) 4,33 ± 0,27 a 4,09 ± 0,16 a 4,04 ± 0,28 a 3,66 ± 0,15 a 12,36
AF (mm2) 97,71 ± 2,52 b 95,69 ± 2,74 b 29,93 ± 4,55 a 39,09 ± 6,33 a 14,72
MS total (g) 0,65 ± 0,06 bc 0,75 ± 0,03 c 0,39 ± 0,02 a 0,53 ± 0,04 ab 16,06
MS raiz 0,3 ± 0,04 ab 0,37 ± 0,01 b 0,23 ± 0,02 a 0,29 ± 0,02 ab 17,99
MS PA 0,34 ± 0,04 bc 0,38 ± 0,04 c 0,16 ± 0,02 a 0,24 ± 0,03 ab 24,53
126
Tabela 5: Análise bioquímica em Zea mays tratado com ácido húmico de lodo de
esgoto (AH-LE) sob estresse salino. Valores são expressos em média ± erro padrão.
CV: coeficiente de variação.
Raiz Tratamentos Variáveis CN AH-LE DH DH-AH CV
Superóxido Dismutase 2,53 ± 0,13 a 3,8 ± 0,19 b 2,21 ± 0,19 a 5,11 ± 0,12 c 8,19
Ascorbato Peroxidase 6,52 ± 0,34 a 9,1 ± 10,65 b 10,94 ± 0,42 bc 12,84 ± 0,69 c 9,57
Glutationa Reduzida 0,32 ± 0,06 a 0,6 ± 0,08 b 0,38 ± 0,003 a 0,34 ± 0,03 a 22,46
H+ - ATPase 9,77 ± 0,61 a 18,6 ± 1,0 b 16,45 ± 2,3 bc 23,13 ± 0,23 c 7,07
ATPase Total 12,44 ± 0,4 a 23,27 ± 1,87 b 16,27 ± 1,25 a 26,4 ± 0,64 b 10,46
Prolina 0,22 ± 0,02 a 0,27 ± 0,05 a 0,61 ± 0,09 b 1,08± 0,08 c 20,74
Lipoperoxidação 1,12 ± 0,09 a 1,74 ± 0,11 a 12,04 ± 0,08 c 9,32± 0,38 b 5,89
Folha
Superóxido Dismutase 1,34 ± 0,15 a 3,18 ± 0,51 b 1,51 ± 0,11 a 2,7 ± 0,43 b 27,51
Ascorbato Peroxidase 6,68 ± 0,23 a 7,4 ± 0,45 b 11.96 ± 034 c 13,31 ± 0,17 c 6,87
Glutationa Reduzida 0,55 ± 0,06 a 0,56 ± 0,5 a 0,36 ± 0,12 a 0,47 ± 0,08 a 28,75
H+ - ATPase 0,84 ± 0,06 a 1,5 ± 0,07 b 1,65 ± 0,08 b 2,42 ± 0,16 c 10,8
ATPase Total 1,05 ± 0,1 a 1,94 ± 0,12 b 2,18 ± 0,1 b 2,7 ± 0,11 c 9,75
Prolina 0,21 ± 0,02 a 0,3 ± 0,05 a 1,08 ± 0,06 b 0,73 ± 0,08 c 15,96
Lipoperoxidação 0,63 ± 0,13 a 1,77 ± 0,54 ab 5,68 ± 0,23 c 2,44 ± 0,12 b 20,27
Tabela 6: Resultados da análise citogenética em raízes de Zea mays tratadas com ácido húmico do lodo de esgoto e NaCl. Valores são expressos em média ± erro padrão. CV: coeficiente de variação.
Tratamentos
Variáveis CN AH-LE DH DH-AH CV
IM 0,02 ± 0,0012 b 0,03 ± 0,0026 b 0,01 ± 0,00067 a 0,01 ± 0,00058 a 14,78
AC 0,03 ± 0,03 a 0,0017 ± 0,0012 a 0,2 ± 0,1 a 0,17 ± 0,09 a 111,61
MN 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,0013 ± 0,00088 a 0,00067 ± 0,00033 a 163,3