proposição de uma nova vacina para brucelose bovina usando uma abordagem biotecnológica

Proposição de uma Nova Vacina para Brucelose

Bovina Usando uma Abordagem Biotecnológica

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus Araraquara

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Departamento de Fármacos e Medicamentos - Laboratório de Biotecnologia

Denise Medeiros Selegato

Profa. Dra. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro

Sumário

Introdução

Proposição de um Processo Biotecnológico

para a Produção de Proteínas Imunogênicas

Objetivos

Revisão Bibliográfica Sobre a Vacinação Contra Brucelose Bovina

Conclusões

Mercado bovino:

1° lugar em exportação de carnes (bovinos, suínos e frangos);

Maior rebanho do mundo comercialmente: desenvolvimento e lucratividade na produção decarne e leite.

Mercado veterinário:

Bovinos representam maior porcentagem de participação e a maior lucratividade/espécie naprodução de insumos na indústria de produtos veterinários;

3° maior no mercado de produtos veterinários mundial;

Mercado de vacinas:

Mais de 50% do mercado veterinário é voltado para produtos biológicos e antimicrobianos;

Produção de imunobiológicos representa 30% do lucro total das indústrias.

Introdução

GOVERNO BRASILEIRO (2010), IBGE (2011), SINDAN (2012).

Objetivos

Propor um processo biotecnológico otimizado de

produção de ativos purificados para serem usados em uma vacina

contra brucelose bovina.

Vacina possua eficácia e segurança superiores às encontradas atualmente no

mercado.

Brucelose Bovina

Antropozoonose de distribuição universal e fácil contágio.

Causada pela infecção de Brucella abortus nas células dosistema mononuclear fagocitário (macrófagos).

Bactéria dissemina-se pelos órgãos mais irrigados dosanimais (fígado, baço e linfonodos) e no sistema reprodutorfeminino, por tropismo.

Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina

Principais Manifestações:

Aborto (1° gestação), esterilidade, retenção deplacenta, baixa produção de leite enatimortalidade de bezerros;

Orquite uni ou bilateral.

Lawinsky et al (2010), University of Georgia (2002).

Alta incidência e prevalência.

Mundo: no Mediterrâneo, Oriente Médio,África e América.

Brasil: casos vem diminuindo com programade vacinação compulsória.

Brucelose Bovina


TRANSMISSÃO

Transmissão: mucosa oro-faríngeana e mãe-feto.

Mais infectante em animais púberes e vacas prenhas.

MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006).

Problemas Sanitários e

Prejuízos Econômicos

Brucella abortus

Parasita intracelular facultativo;

Cocobacilo gram-negativo, não capsulado e imóvel;

Dois cromossomos circulares e ausência de plasmídeos efagos.

LPS:

o Principal componente da membrana externa;

o Cadeia O é a estrutura mais exposta da célula:

• Mais imunogênica: induz produção de IgG2 eIgG3, principais isótopos na defesa imunológicacontra a Brucella;

• Principal componente para testes de triagem.


MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Lawinsky et al (2010)..

Resposta Imunológica

Resposta Imune Inata:

o Estágio inicial da infecção;

o Diminuir a concentração bacteriana do organismo.

Resposta Imune Adaptativa (mediada por células):

o É a mais eficaz no curso da infecção, pois produzanticorpos bloqueadores (específico para oantígeno O do LPS).


MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Rivers et al (2006)..


Vacinas Atuais

Características B19 RB51

Animal Alvo Bovinos e Bubalinos

Proteção Cerca de 60% contra infecção e 70% contra aborto

Inocuidade - Pode provocar aborto em vacas prenhas.

- Patogênica para bovinos machos e humanos.

Restrição quanto ao Sexo Fêmeas

Proteção Cruzada B. abortus B. abortus, B. melitensis, B. suis e B. ovis

Cepa B. abortus cepa lisa 19 B. abortus RB51 cepa rugosa

Interferências no

Diagnóstico

Sim Não

Recomendação - Uso recomendado em fêmeas com 3 a 8 meses de vida.- Proteção de até 7 anos após vacinação, segundo

fabricante.

Uso recomendado somente quando B19 é ineficaz ou em vacas com mais de 8 meses de vida.

Observações Vacina mais utilizada no Brasil (PNCEBT). Vacina mais utilizada nos Estados Unidos, México e

países da América Latina.

Desvantagens

- Efetividade variável (depende de diversos fatores);- Interferir no diagnóstico tradicional;

- Causar o aborto e orquite;- Restrita ao sexo feminino;

- Ser possivelmente patogênica para humanos.

- Difícil homogeneização devido a estirpe ser mucóide.- Possibilidade de inversão em cepa ativa;

- Ser possivelmente patogênica para humanos;- Induzir o aborto e orquite;- Restrita ao sexo feminino.

MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Lundblad et at (2010).

Elimina as desvantagens presentes em vacinas de bactérias mortas ou atenuadas:

Não existe o risco de infecção do manipulador;

Não ocorre interferência no diagnóstico;

Não é restrita ao sexo feminino;

Diminui as chances de orquite ou aborto.

Tendências – Vacinas Subcelulares

Mostram eficácia inferior as vacinas vivas atenuadas, necessitando de:

Maior número de aplicações;

Fusão de duas proteínas imunodominantes;

Uso de mediadores de entrega;

Uso de adjuvantes imunogênicos.


MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Yang et at (2013).

Tendências – Vacinas DNA e RNA


Vacinas DNA Vacinas RNA

Características

Uso de plasmídeo bacterianocom promotor viral forte. Uso de vírus Semliki Forest (SFV).

Não ocorre expressão e purificação da proteína.

Plasmídeo é fabricado sem Ori. Possuem partículas virais suicidas formadas por RNA autoreplicável.

Mesmas vantagens que as vacinas subcelulares.

Rivers et al (2006).

Proposição de um Processo Biotecnológico

Processo de Upstream

Processo de Downstream

o Induz importante resposta imune celular;o Gene rplL (cromossomo I): 375 pb.

o Induz importante resposta imune celular e humoral;o Apresenta estabilidade termodinâmica e arranjo

decamérico estável, facilitando sua manipulação noprocesso industrial;

o Gene ribH (cromossomo I): 474 pb.

o DNA dupla fita com 2686 pb.o Marcadores de seleção: ampR e

lac Z inserido no MCS.

Pakzad et al (2009), Mallick et al (2009), Luo et al (2006).

Velikovsky et al (2003), Zhao et al (2009).

Lundblad et al (2010).

Processo de Upstream

Identificação do Alvo

Escolha do Vetor de Clonagem

Ribossomal L7/L12

Lumazina Sintetase

E. coli

o Amplo conhecimento de sua genética e fisiologia;

o Facilidade do controle do crescimento e expressãogênica;

o Elevada multiplicação plasmidial.

o BL21 (DE3);o DH5;o M15.

1. Amplificação dos gene ribH.2. Amplificação do gene rplL com a remoção do

códon de terminação;3. Fusão dos genes das proteínas recombinantes;4. Inserção do gene de fusão no vetor de

clonagem.

Velikovsky et al (2002), Mallick (2007 a), Mallick (2007 b), Velikovsky et al (2003), Zhao et al (2009), Luo et al (2006).

Luo et al (2006), Zhao et al (2009), NCBI.

Gene ribH Sequência de Primer

Enzima de Restrição

FO 5’-GGATCCATCGAGTTTCTC-3’ BamHI

RO-1 3’-GGGCCCCTAGTATCAGTT-5’ Xmal

Gene rplL Sequência de Primer Enzima de

Restrição

FL 5’- AAGCTTATGGCTGATCTCG-3’ HindIII

RL-2 3’-CCTAGGCTTGAGTTC-5’ BamHI

Escolha do Sistema Vivo de Expressão

Formação do Gene de Fusão

Tratamento com CaCl2.

Crescimento em meio de cultura com ampicilina.

Crescimento em meio ágar contendo IPTG e x-gal.

Crescimento em meio LB de 1-2 dias, à 37°C, com agitação.

o Kits comerciais de extração de plasmídeos: agentes quelantes, detergentes, etc.

o Liberação do gene de fusão por digestão com enzimas de restrição.

Choque térmico (mudança de temperatura de 37 para 42°C).

Maranhão et al (2003), Nascimento (1999).

Formação de Células

Competentes

Transformação

Seleção de Recombinantes

Fermentação

Extração do Gene de Fusão

o Marcadores de seleção (gene kan);o Sistema de repressão de indução (gene lac);

o Promotor T7;o Sequência de ligação do ribossomo (Shine

Dalgarno); o Ori FL e Ori ColE1;

Eletroporação

o Meio LB com kanamicina;

o Sequenciamento de clones;

o Hibridização in situ.

MAPA (2003), Davidson College (2003).

Escolha do Vetor de Expressão

TransformaçãoSeleção de

Recombinantes

Fonte: Adaptado de Luo et al (2006).

Merck (2008).

Cultivo das Células

Expressão da Proteína de

Fusão

Formação do Corpúsculo de Inclusão:

alto grau de pureza, pouca contaminação e proteção física contra

proteases.

Processo de Downstream

Clarificação e Rompimento

Celular

Purificação e Solubilização das

Proteínas Recombinantes

Caracterização das Proteínas

Testes de Atividade

Imunização

Determinação de Ac Específicos

Determinação da Proliferação de

Linfócitos

Determinação da Proliferação de IFN-

gama

Fonte: Mallick et al (2007).

Determinação da Produção de

Citocinas

¡ Novas estratégias são necessárias para prevenir a brucelose bovina, bem como diminuiras desvantagens nas vacinas de bactéria atenuada atualmente comercializadas.

¡ Apesar das proteínas isoladas não conferirem uma imunização suficientemente forte parasubstituição das vacinas de bactérias atenuadas, novos métodos de entrega dosantígenos ganham destaque, como (a) utilização de vacinas de DNA; (b) vacinas de RNA;(c) vacinas com mais de uma proteína imunogênica; (d) ou o acoplamento de proteínasantigênicas a lipossomas e outros carregadores.

¡ A combinação da proteína ribossomal L7/L12 (forte indutora de resposta celular) com alumazina sintetase (proteína estável com importante resposta celular e humoral) mostra-se promissora no desenvolvimento de vacinas subcelulares, seja na sua forma livre, ou porsistema de entrega.

Conclusões

Agradecimentos

proposição de uma nova vacina para brucelose bovina usando uma abordagem biotecnológica

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